JP6412509B2

JP6412509B2 - ポリペプチドの組換え生産のためのアミノ酸栄養要求性除去原核生物株の使用

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Publication number: JP6412509B2
Application number: JP2015558428A
Authority: JP
Inventors: エアハルトコペツキ; クリスティアンシャンツ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-02-22
Filing date: 2014-02-19
Publication date: 2018-10-24
Anticipated expiration: 2034-02-19
Also published as: TW201444975A; US10155970B2; TWI628281B; WO2014128135A1; CN110541018A; CN105026575A; AR094716A1; ES2688044T3; EP2959006B1; HRP20181414T1; JP2016507243A; PL2959006T3; SI2959006T1; EP2959006A1; US20150376674A1; SG11201505916XA

Description

本発明は、組換えポリペプチド生産の分野に属する。より正確には、既知組成最小増殖培地中で栄養要求性除去（cured）原核生物株を使用する、非グリコシル化ポリペプチドの組換え生産のための方法を、本明細書において報告する。

発明の背景
近年、治療用ポリペプチドの生産は着実に増加しており、治療用ポリペプチドは、近い将来に様々な疾患の治療に利用可能な最大の治療薬群になる可能性が高い。治療用ポリペプチドの効果は、特異的な標的認識および／または結合機能などのその特異性から生じる。

物質、特にポリペプチドを生産するために、細胞培養物が発酵工程において用いられる。細胞培養物が遺伝的に改変されておらず、それ自身の代謝産物を形成する工程と、生物が、ポリペプチドなどのそれ自身の物質を大量に産生するか、または外来物質を産生するように遺伝的に改変されている工程とが区別される。物質を産生する生物に、その生物の生存を保証し、所望の標的化合物の産生を可能にする栄養培地が供給される。特定の宿主の最適な培養を可能にするこれらの目的のために、多くの培養培地が公知である。

治療用ポリペプチドの組換え生産のために、組換え細胞の培養において既知組成最小増殖培地を使用することは、有利である。これは、生産された治療用ポリペプチドの下流の処理および精製の容易な開発を可能にし、原材料の違いが最小限であるために頑強な生産工程を提供し、かつ物品のコストを削減する。

既知組成最小増殖培地は遊離アミノ酸を含まず、既知組成最小増殖培地の利用可能な成分から必要なアミノ酸を産生するための無傷の代謝経路を有する原栄養性細胞株を使用することが必要とされる。

例えば、大腸菌 (E.coli) が宿主細胞株として用いられる場合、一般的にはMG1655、W3110、またはBL21などの野生型株が使用される。これらの株は良好な増殖特性を示すが、産物力価は劣っている。

非定方向突然変異誘発および選択によって得られた変異原核生物株は、野生型株と比較した場合に、そのゲノムDNAにおいて重大な違いを示す。変異株は、得られ得る最大産物力価に基づいて選択されている。変異株はいくつかの栄養要求性を有するため、既知組成最小増殖培地での培養に使用することができない。変異株は、その栄養要求性を補完するためにアミノ酸の供給を必要とし、結果として培養コストが増大する。

米国特許第5,932,439号（特許文献1）は、組換えタンパク質の生産のための大腸菌K-12株を報告している。

米国特許第5,932,439号

栄養要求性原核生物株からその栄養要求性のうちの1つまたは複数を除去することにより、該栄養要求性除去株は既知組成最小増殖培地において増殖することができ、除去された栄養要求性に対応する物質をそれ以上この培地に添加する必要はない。高価な物質である場合、物品のコストの削減を達成することができ、組換えポリペプチドをより経済的に生産することができる。

除去された栄養要求性に対応する物質の非存在下で既知組成最小増殖培地において増殖する能力の回復に加えて、得られ得る産物力価が非除去株と比較して維持され得るか、またはさらに増加し得ることが見出された。さらに、栄養要求性除去原核生物株を用いて得られ得る産物力価は、対応する原栄養性野生型株で得られ得る産物力価よりも高いことが見出された。

この理論によって縛られるわけではないが、本明細書において報告されるアミノ酸栄養要求性除去原核生物株は、そのような欠失および除去が行われていない対応する原栄養性野生型株と比較して、異なる代謝および代謝フラックスを有すると想定される。したがって、原核生物株におけるある特定の酵素の不活性化および再活性化は、その株の全代謝に検出可能な／明白な効果を及ぼし、これは、例えば対応する原栄養性野生型株と比較した場合のそのような株の生産性の増加において見られ得る。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の点を特徴とするアミノ酸栄養要求性除去原核生物株である：
‐必須アミノ酸代謝経路における少なくとも1つの欠損が除去されていること、および
‐該株が、該栄養要求性除去原核生物株において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない既知組成最小増殖培地中で増殖し得ること。

1つの態様において、栄養要求性除去原核生物株は栄養要求性除去大腸菌株である。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の点を特徴とするアミノ酸栄養要求性除去原核細胞である：
‐必須アミノ酸代謝経路における少なくとも1つの欠損が除去されていること、および
‐該細胞が、該栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない既知組成最小増殖培地中で増殖し得ること。

1つの態様において、栄養要求性除去原核細胞は栄養要求性除去大腸菌細胞である。

本明細書において報告される栄養要求性除去原核生物株／原核細胞は、治療用ポリペプチドの組換え生産のための方法において使用することができ、ここで、栄養要求性非除去株／細胞と比較して、少なくとも1つのアミノ酸残基の補充は必要でない。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐親原核細胞のアミノ酸栄養要求性を除去する核酸を該親原核細胞のゲノムに導入することによって得られた、ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む（組換え）原核細胞を、既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含む、（組換え）原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐少なくとも1つのアミノ酸について栄養要求性である原核細胞から少なくとも1つのアミノ酸栄養要求性を除去する段階、
‐ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む該アミノ酸栄養要求性除去（組換え）原核細胞を既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含む、（組換え）原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む（組換え）原核細胞を既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、該（組換え）原核細胞がアミノ酸栄養要求性除去原核細胞である、
（組換え）原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法である。

ポリペプチドを生産するための全方法の1つの態様において、栄養要求性除去原核細胞は、少なくとも1つのさらなる（非除去）アミノ酸栄養要求性を有する。この栄養要求性は、関心対象のポリペプチド（該ポリペプチド）をコードする1つまたは複数の核酸の導入後の組換え体／形質転換体の選択のために使用され得る。

ポリペプチドを生産するための全方法の1つの態様において、アミノ酸栄養要求性除去原核細胞の増殖は、同じ培養条件下および同じ増殖培地中での非除去原核細胞（親細胞）と比較して、増殖培地へのより少ないアミノ酸の補充を必要とする。

ポリペプチドを生産するための全方法の1つの態様において、既知組成最小増殖培地は、栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない。

ポリペプチドを生産するための全方法の1つの態様において、栄養要求性除去原核細胞の培養は、栄養要求性非除去原核細胞（親／親細胞）の培養に必要とされるものよりも1つまたは2つまたは3つまたは4つ少ないアミノ酸の、増殖培地への補充を必要とする。

ポリペプチドを生産するための全方法の1つの態様において、栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸は、培養中に添加されない。

ポリペプチドを生産するための全方法の1つの態様において、培養は、栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸の非存在下で行われる。

ポリペプチドを生産するための全方法の1つの態様において、原核細胞は大腸菌細胞である。

ポリペプチドを生産するための全方法の1つの態様において、該ポリペプチドは、全長抗体鎖、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、scFv、scFab、または前記のうちの1つと非抗体ポリペプチドとのコンジュゲートである。

ポリペプチドを生産するための全方法の1つの態様において、該ポリペプチドは、scFvまたはscFabと細胞傷害性物質とのコンジュゲートである。

本明細書において報告される1つの局面は、ポリペプチドの（組換え）生産のためのアミノ酸栄養要求性除去原核生物株の使用である。

1つの態様において、
‐アミノ酸栄養要求性除去原核生物株において、必須アミノ酸代謝経路における少なくとも1つの欠損が除去されており、かつ
‐アミノ酸栄養要求性除去株は、該栄養要求性除去原核生物株において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない既知組成最小増殖培地中で増殖し得る。

1つの態様において、前記ポリペプチドは、全長抗体鎖、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、scFv、scFab、または前記のうちの1つと非抗体ポリペプチドとのコンジュゲートである。

1つの態様において、前記ポリペプチドは、scFvまたはscFabと細胞傷害性物質とのコンジュゲートである。

全局面の1つの態様において、栄養要求性除去原核生物株は非溶原株である。溶原株は一時的 (temporal) バクテリオファージに感染しており、言い換えれば非溶原株はバクテリオファージを含まない。

全局面の1つの態様において、除去は、アミノ酸栄養要求性のみを標的化する定方向除去である。

全局面の1つの態様において、除去は、栄養要求性アミノ酸の合成に必要な1つまたは複数の酵素の導入である。

全局面の1つの態様において、原核生物株は遺伝子型thi-1、ΔompT、ΔpyrFを有する。
[本発明1001]
‐親原核細胞のアミノ酸栄養要求性を除去する（cure）核酸を該親原核細胞のゲノムに導入することによって得られた、ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む原核細胞を、既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含む、原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法。
[本発明1002]
栄養要求性除去原核細胞の培養が、親の栄養要求性非除去原核細胞の培養に必要とされるものよりも1つまたは2つまたは3つまたは4つ少ないアミノ酸の、増殖培地への補充を必要とすることを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
栄養要求性除去原核細胞が、少なくとも1つのさらなるアミノ酸栄養要求性を有することを特徴とする、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸が、培養中に添加されないことを特徴とする、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
培養が、栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸の非存在下で行われることを特徴とする、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
原核細胞が大腸菌細胞であることを特徴とする、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
ポリペプチドが、全長抗体鎖、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、scFv、scFab、または前記のうちの1つと非抗体ポリペプチドとのコンジュゲートであることを特徴とする、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
ポリペプチドが、scFvまたはscFabと細胞傷害性物質とのコンジュゲートであることを特徴とする、本発明1007の方法。

発明の詳細な説明
大規模組換えポリペプチド生産工程の開発における1つの目的は、培養における培地成分の必要量、すなわち消費量を削減することである。特に、アミノ酸などの高価な培地成分の消費の削減は、物品のコストを考えると有利である。

この目的は、高価なアミノ酸の供給を回避するために、およびそれと共に関心対象のポリペプチドの組換え生産のコストを削減するために、アミノ酸栄養要求性株からそのアミノ酸栄養要求性のうちの少なくとも1つ、いくつか、またはすべてを除去することによって達成された。加えて、既知組成培地を使用することができ、これは工程の安定性の改善をもたらし、かつ下流処理 (DSP) を容易にする。

したがって、既知組成最小増殖培地中で栄養要求性除去原核生物株を使用する、非グリコシル化ポリペプチドの組換え生産のための方法を、本明細書において報告する。

栄養要求性原核生物株からその栄養要求性のうちの1つまたは複数を除去することにより、該栄養要求性除去株は既知組成最小増殖培地において増殖することができ、除去された栄養要求性に対応する物質をそれ以上この培地に添加する必要はないことが見出された。例えばアミノ酸などの高価な物質である場合、物品のコストの削減を達成することができ、組換えポリペプチドをより経済的に生産することができる。

除去された栄養要求性に対応する物質の非存在下で既知組成最小増殖培地において増殖する能力の回復に加えて、得られ得る産物力価が維持され得るか、またはさらに増加し得ることが見出された。さらに、栄養要求性除去原核生物株を用いて得られ得る産物力価は、対応する原栄養性野生型株で得られ得る産物力価よりも高いことが見出された。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐親原核細胞のアミノ酸栄養要求性を除去する核酸を該親原核細胞のゲノムに導入することによって得られた、ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む原核細胞を、既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含む、原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐少なくとも1つのアミノ酸について栄養要求性である原核細胞から少なくとも1つのアミノ酸栄養要求性を除去する段階、
‐ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む該アミノ酸栄養要求性除去原核細胞を既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含む、原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む（組換え）原核細胞を既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該（組換え）原核細胞がアミノ酸栄養要求性除去原核細胞であり、
該アミノ酸栄養要求性除去原核細胞の増殖が、同じ培養条件下および同じ増殖培地中での非除去原核細胞（親細胞）と比較して、該増殖培地へのより少ないアミノ酸の補充を必要とし、かつ
該既知組成最小増殖培地が、該栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない、
（組換え）原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法である。

「アミノ酸栄養要求性原核細胞」とは、例えば、対応する生合成経路のタンパク質をコードする構造遺伝子を含む遺伝子座内の変異または欠失によって、必須アミノ酸を合成することができない原核細胞である。それぞれのアミノ酸を培養培地に添加しなければ、細胞は増殖することができない。栄養要求性は、任意のアミノ酸に対するものであってよい。原核細胞はまた、2つ以上のアミノ酸に対して栄養要求性であってもよい。したがって、1つの態様において、アミノ酸栄養要求性原核細胞は、少なくとも2つのアミノ酸に対して栄養要求性である。別の態様において、アミノ酸栄養要求性原核細胞は、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個のアミノ酸に対して栄養要求性である。さらなる態様において、アミノ酸栄養要求性原核細胞は、少なくとも2個かつ最大5個まで、または最大10個まで、または最大15個までのアミノ酸に対して栄養要求性である。別の態様において、アミノ酸栄養要求性原核細胞は、2〜5個のアミノ酸、または2〜3個のアミノ酸、または2個のアミノ酸、または3個のアミノ酸、または4個のアミノ酸に対して栄養要求性である。1つの態様において、（アミノ酸）栄養要求性除去細胞は、少なくとも1つのアミノ酸栄養要求性、または少なくとも2つのアミノ酸栄養要求性、または少なくとも3つのアミノ酸栄養要求性、または1つ〜3つのアミノ酸栄養要求性、または2つのアミノ酸栄養要求性を有する。

アミノ酸栄養要求性原核細胞は、1つの態様において、細菌細胞である。

1つの態様において、細胞は、エシェリキア属 (Escherichia) 細胞、またはバチルス属 (Bacillus) 細胞、またはラクトバチルス属 (Lactobacillus) 細胞、またはコリネバクテリウム属 (Corynebacterium) 細胞、または酵母細胞（サッカロミセス属 (Saccharomyces)、カンジダ属 (Candida)、またはピキア属 (Pichia)）である。さらなる態様において、細胞は、大腸菌細胞、または枯草菌 (Bacillus subtilis) 細胞、またはラクトバチルス・アシドフィルス (Lactobacillus acidophilus) 細胞、またはコリネバクテリウム・グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) 細胞、またはピキア・パストリス (Pichia pastoris) 酵母細胞である。

本明細書において報告される方法において使用することのできる原核細胞は、1つまたは複数のアミノ酸栄養要求性を含み得る。例えば、ロイシン生合成経路の欠損した大腸菌細胞は、LeuB6欠損細胞13-6、χ148、χ156、χ2224、χ462、χ463、χ474、χ478、χ515、χ65、χ697、χ760、2000k MSE248、342-167、342MG、679-680、A586、A592、A593、AA100、AA7852、AA787、AB1102、AB1111、AB1115、AB1122、AB1129、AB113、AB1132、AB1133、AB114、AB1157、AB1157-D、AB1314、AB1330、AB1331、AB1881、AB1884、AB1885、AB188、CP78、CP79、CR34 Thy-、CR34 Thy- SR、CR34/308、CR34/313、CR34/399、CR34/43、CR34/454、CR34/500、CR34/7a、CS130、CS312、CS419、CS425、CS426、CS460、CS471、CS472、CS50、CS81、CS85、CSR06、CSR603、CSR603/pDR1996、CT28-3b、DA10、DA11、DB1161、DB1257、DE1878、DE1882、DE2345、DF225、DF41、JRG94、JS10 C600r-m-、T6R、P678SSR pro-、PA20SR、PA200 SR、PA201 SR、PA214SRT6R、PA265 SR、PA309、PDE70、PA340、PA340/T6、PA360、PA414、PAM161、PAM162、PAM163、PAM164、PAM660、PAT84、PB349、PB69、PC1、PC2、PC3、PC5、PC6、PC8、PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5、PJ C600 (= CRSR)、W208 SR AzR、W2660、LAM-、W945his、WA2127、WA2379、WA2548、WA2552、WA2574、WA2899、WA921、WA946、WA960、Y10、Y46、Y53、Y70、YYC100より選択され得る。

1つの態様において、原核細胞は大腸菌K12細胞または大腸菌B細胞である。

「増殖」という用語は、培養における生細胞密度の変化を指す。この変化は、継時的変化であり得る。生細胞密度は、578 nmで光学密度を決定することによって決定され得る。

1つの態様において、増殖とは、ある期間における生細胞密度の増加である。1つの態様において、その期間とは、接種後の0〜30時間の培養の期間である。

「同じ」という用語は、第2の値が第1の値の+/- 20%の範囲内にあることを意味する。培養条件に関して、「同じ」という用語は、培養時間、培養容積、培養温度、播種細胞密度、通気速度、pH値、撹拌機のスピード、供給速度（適用可能である場合）等を指す。培養培地に関して、「同じ」という用語は、第2の培地が、第1の培地と比較して、最大で5つの成分が異なることを意味する（異なる = 存在または非存在）。

1つの態様において、同じ培養条件とは同一の培養条件である。1つの態様において、同じ培養培地とは同一の培養培地である。

原核細胞を培養する方法およびまたアミノ酸栄養要求性原核細胞を培養する方法は、当業者に公知である（例えば、Riesenberg, D., et al., Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991) 380-384) を参照されたい）。

培養は任意の方法を用いたものであってよい。1つの態様において、培養は、バッチ培養、流加培養、灌流培養、半連続培養、または完全なもしくは部分的な細胞保持を伴う培養である。

1つの態様において、培養は高細胞密度培養である。「高細胞密度培養」という用語は、培養した原核細胞の乾燥細胞重量が、培養のある時点で少なくとも10 g/Lである培養法を意味する。1つの態様において、乾燥細胞重量は、培養のある時点で、少なくとも20 g/L、または少なくとも50 g/L、または少なくとも100 g/L、または100 g/L超である。そのような高細胞密度状態に到達させるためには、培養中に添加する供給溶液および／または調整溶液の容積をできるだけ小さくしなければならない。乾燥細胞重量を決定する方法は、例えば、Riesenberg, D., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 34 (1990) 77-82において報告されている。

提供される培地中の栄養素は、培養中に代謝され、制限を回避するために補充しなければならない。

実験番号1と実験番号2の比較から、栄養要求性除去株CSPZ-6を用いた場合に、同じ培養条件下で、その親株であるCSPZ-2を用いた場合よりも高い力価が達成され得る、すなわち、栄養要求性除去株が増加した生産性（容積測定による生産性、時空収率）を有することがわかる。

実験番号2と実験番号5の比較から、栄養要求性除去株CSPZ-6が、組換え生産のためにアミノ酸プロリンおよびロイシンの添加を必要としないことがわかる。プロリンおよびロイシンの非存在下において、匹敵するかまたはさらにはわずかに増加した産物力価が達成され得る。

実験番号5と実験番号6の比較から、栄養要求性除去株CSPZ-6を用いた場合に、同じ培養条件下で、対応する野生型株 (MG1655 (ΔpyrF)) を用いた場合よりも高い力価が達成され得ることがわかる。

また、栄養要求性除去株CSPZ-6を用いて得られ得る産物力価を、対応する別の野生型株W3110 (66C5 = W3110 ΔpyrF) を用いて得られ得る産物力価と比較した。

実験番号7と実験番号8の比較から、栄養要求性除去株CSPZ-6を用いた場合に、同じ培養条件下で、対応する野生型株 (W3110) を用いた場合よりも高い力価が達成され得ることがわかる。

実験番号7と実験番号9の比較から、改善された培養条件（温度の上昇）を、対応する野生型株 (W3110) に対して使用するが、栄養要求性除去株CSPZ-6に対して使用しない場合でさえ、栄養要求性除去株を用いた場合に野生型株を用いた場合よりも高い力価が達成され得ることがわかる。

また、栄養要求性除去株CSPZ-6を用いて得られ得る産物力価を、対応する別の野生型株BL-21 (CSPZ-14 = BL-21 ΔpyrF) を用いて得られ得る産物力価と比較した。

実験番号10と実験番号11の比較から、栄養要求性除去株CSPZ-6を用いた場合に、同じ培養条件下で、対応する野生型株 (BL-21) を用いた場合よりも高い力価が達成され得ることがわかる。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の点を特徴とするアミノ酸栄養要求性除去原核生物株である：
‐必須アミノ酸代謝経路における少なくとも1つの欠損が除去されていること、
‐該株が、該栄養要求性除去原核生物株において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない既知組成最小増殖培地中で増殖し得ること、ならびに
‐該栄養要求性除去株の生産性が、親の栄養要求性非除去株の生産性と比較して、および対応する野生型株（対応する遺伝子型）と比較して、改善されていること。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む（組換え）原核細胞を既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該（組換え）原核細胞がアミノ酸栄養要求性除去原核細胞である、
（組換え）原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法である。

1つの態様において、アミノ酸栄養要求性除去原核細胞の増殖は、同じ培養条件下および同じ増殖培地中での非除去原核細胞（親細胞）と比較して、増殖培地へのより少ないアミノ酸の補充を必要とする。

1つの態様において、既知組成最小増殖培地は、栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない。

1つの態様において、栄養要求性除去原核細胞の培養は、栄養要求性非除去原核細胞（親細胞）の培養に必要とされるものよりも1つまたは2つまたは3つまたは4つ少ないアミノ酸の、増殖培地への補充を必要とする。

1つの態様において、栄養要求性除去原核細胞は、少なくとも1つのさらなる（非除去）アミノ酸栄養要求性を有する。

1つの態様において、栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸は、培養中に添加されない。

1つの態様において、培養は、栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸の非存在下で行われる。

1つの態様において、原核細胞は大腸菌細胞である。

1つの態様において、培養物の接種の30時間後における生細胞密度は、非除去原核細胞の培養よりも栄養要求性除去株の培養においてより高い。

1つの態様において、
‐ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む原核細胞を既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該原核細胞がアミノ酸栄養要求性除去原核細胞であり、
該アミノ酸栄養要求性除去原核細胞の増殖が、同じ培養条件下および同じ増殖培地中での非除去原核細胞と比較して、増殖培地へのより少ないアミノ酸の補充を必要とし、かつ
該既知組成最小増殖培地が、該栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない、
原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法である。

具体的態様
1. 以下の点を特徴とする、アミノ酸栄養要求性除去原核生物株：
‐必須アミノ酸代謝経路における少なくとも1つの欠損が除去されていること、および
‐該株が、該栄養要求性除去原核生物株において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない既知組成最小増殖培地中で増殖し得ること。
2. 栄養要求性除去原核生物株が栄養要求性除去大腸菌株である、項目1記載の株。
3. 以下の点を特徴とする、アミノ酸栄養要求性除去原核細胞：
‐必須アミノ酸代謝経路における少なくとも1つの欠損が除去されていること、および
‐該細胞が、該栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない既知組成最小増殖培地中で増殖し得ること。
4. 栄養要求性除去原核細胞が栄養要求性除去大腸菌細胞である、項目3記載の株。
5. ‐親原核細胞のアミノ酸栄養要求性を除去する核酸を該親原核細胞のゲノムに導入することによって得られた、ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む（組換え）原核細胞を、既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含む、（組換え）原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法。
6. ‐少なくとも1つのアミノ酸について栄養要求性である原核細胞から少なくとも1つのアミノ酸栄養要求性を除去する段階、
‐ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む該アミノ酸栄養要求性除去（組換え）原核細胞を既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含む、（組換え）原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法。
7. ‐ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む（組換え）原核細胞を既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含み、
該（組換え）原核細胞がアミノ酸栄養要求性除去原核細胞である、
（組換え）原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法。
8. 栄養要求性除去原核細胞が、少なくとも1つのさらなる（非除去）アミノ酸栄養要求性を有することを特徴とする、項目5〜7のいずれか1つに記載の方法。
9. アミノ酸栄養要求性除去原核細胞の増殖が、同じ培養条件下および同じ増殖培地中での非除去原核細胞（親細胞）と比較して、増殖培地へのより少ないアミノ酸の補充を必要とすることを特徴とする、項目5〜8のいずれか1つに記載の方法。
10. 既知組成最小増殖培地が、栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まないことを特徴とする、項目5〜9のいずれか1つに記載の方法。
11. 栄養要求性除去原核細胞の培養が、栄養要求性非除去原核細胞（親／親細胞）の培養に必要とされるものよりも1つまたは2つまたは3つまたは4つ少ないアミノ酸の、増殖培地への補充を必要とすることを特徴とする、項目5〜10のいずれか1つに記載の方法。
12.栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸が、培養中に添加されないことを特徴とする、項目5〜11のいずれか1つに記載の方法。
13. 培養が、栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸の非存在下で行われることを特徴とする、項目5〜12のいずれか1つに記載の方法。
14. 原核細胞が大腸菌細胞であることを特徴とする、項目5〜13のいずれか1つに記載の方法。
15. ポリペプチドが、全長抗体鎖、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、scFv、scFab、または前記のうちの1つと非抗体ポリペプチドとのコンジュゲートであることを特徴とする、項目5〜14のいずれか1つに記載の方法。
16. ポリペプチドが、scFvまたはscFabと細胞傷害性物質とのコンジュゲートであることを特徴とする、項目5〜15のいずれか1つに記載の方法。
17. ポリペプチドの（組換え）生産のためのアミノ酸栄養要求性除去原核生物株の使用。
18. 以下の点を特徴とする、項目17記載の使用：
‐アミノ酸栄養要求性除去原核生物株において、必須アミノ酸代謝経路における少なくとも1つの欠損が除去されていること、かつ
‐アミノ酸栄養要求性除去株は、該栄養要求性除去原核生物株において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸を含まない既知組成最小増殖培地中で増殖し得ること。
19. 栄養要求性除去原核生物株が栄養要求性除去大腸菌株であることを特徴とする、項目1〜18のいずれか1つに記載の株または方法または使用。
20. ポリペプチドが、全長抗体鎖、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、scFv、scFab、または前記のうちの1つと非抗体ポリペプチドとのコンジュゲートであることを特徴とする、項目1〜19のいずれか1つに記載の株または方法または使用。
21. ポリペプチドが、scFvまたはscFabと細胞傷害性物質とのコンジュゲートであることを特徴とする、項目1〜20のいずれか1つに記載の株または方法または使用。
22. 栄養要求性除去原核生物株が非溶原株であることを特徴とする、項目1〜21のいずれか1つに記載の株または方法または使用。
23. 除去が、アミノ酸栄養要求性のみを標的化する定方向除去であることを特徴とする、項目1〜22のいずれか1つに記載の株または方法または使用。
24. 除去が、栄養要求性アミノ酸の合成に必要な1つまたは複数の酵素の導入であることを特徴とする、項目1〜23のいずれか1つに記載の株または方法または使用。
25. 原核生物株が遺伝子型thi-1、ΔompT、ΔpyrFを有することを特徴とする、項目1〜24のいずれか1つに記載の株または方法または使用。

以下の実施例、配列、および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲において記載される。本発明の精神から逸脱することなく、記載される手順に修正を加えることができることが理解される。

配列の一覧
SEQ ID NO: 01 ヒトインターフェロン由来配列。
SEQ ID NO: 02 ヘキサ-ヒスチジン親和性タグ。
SEQ ID NO: 03 IgAプロテアーゼ切断部位。
SEQ ID NO: 04 テトラネクチンアポリポタンパク質A-I融合ポリペプチドアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 05 IgAプロテアーゼ切断後に得られた、N末端伸長型テトラネクチンアポリポタンパク質A-I融合ポリペプチドアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 06 親和性タグおよびIgAプロテアーゼ切断を含まない、テトラネクチンアポリポタンパク質A-I融合ポリペプチドアミノ酸配列（N末端短縮型融合ポリペプチド）。

親株CSPZ-2（菱形）と栄養要求性除去株CSPZ-6（三角形）との増殖の比較。親株CSPZ-2（菱形）と栄養要求性除去株CSPZ-6（三角形）との産物収量の比較。 A：L-ロイシン濃度の傾向プロット（CSPZ-2：菱形；CSPZ-6：三角形）。B：L-プロリン濃度の傾向プロット（CSPZ-2：菱形；CSPZ-6：三角形）。アミノ酸を補充したおよび補充していない培地における、栄養要求性除去株と野生型株との増殖の比較（L-ロイシンおよびL-プロリンを補充したCDMにおけるCSPZ-6：三角形；CDMにおけるCSPZ-6：四角形；CDMにおけるMG1655派生株：「X」）。アミノ酸を補充したおよび補充していない培地における、栄養要求性除去株と野生型株との産物収量の比較（L-ロイシンおよびL-プロリンを補充したCDMにおけるCSPZ-6：三角形；CDMにおけるCSPZ-6：四角形；CDMにおけるMG1655派生株：「X」）。アミノ酸を補充していない培地における、栄養要求性除去株CSPZ-6（菱形）と野生型株66C5（四角形）との増殖の比較。アミノ酸を補充していない培地における、栄養要求性除去株CSPZ-6（菱形、通常温度）、野生型株66C5（四角形、通常温度）、および上昇した温度での野生型株66C5（三角形）の増殖の比較。アミノ酸を補充していない培地における、栄養要求性除去株CSPZ-6（菱形）と野生型株66C5（四角形）との産物収量の比較。アミノ酸を補充していない培地における、栄養要求性除去株CSPZ-6（菱形、通常温度）、野生型株66C5（四角形、通常温度）、および上昇した温度での野生型株66C5（三角形）の産物収量の比較。アミノ酸を補充していない培地における、栄養要求性除去株CSPZ-6（菱形）と野生型株BL21との増殖の比較。アミノ酸を補充していない培地における、栄養要求性除去株CSPZ-6（菱形）と野生型株BL21（四角形）との産物収量の比較。栄養要求性除去株CSPZ-6（菱形）と野生型株MG1655派生体（三角形）との増殖の比較。栄養要求性除去株CSPZ-6（菱形）と野生型株MG1655派生体（三角形）との産物収量の比較。

材料および方法
組換えDNA技法：
Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989に記載されているように、標準的方法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。

実施例1
栄養要求性の除去
大腸菌K12株CSPZ-2（leuB、proC、trpE、thi-1、ΔpyrF）から、遺伝子leuB、proC、proBA、およびtrpEにおけるその遺伝的欠陥を除去した。これは、大腸菌染色体遺伝子の定方向遺伝子操作のための方法を使用することによって行った（Gene Bridges、Heidelberg, Germany；http://www.genebridges.com；例えば、WO 99/29837、WO 01/04288、US 6,355,412を参照されたい）。詳細には、以下の段階的変化を生じた。

leuB遺伝子座の修復：
大腸菌CSPZ-2は、遺伝子座leuBにおいてTCGからTTGへの点変異を有し、これは対応する3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼの286位においてセリンからロイシンへのアミノ酸交換をもたらし、そのためこの酵素は欠損している。したがってこの株は、L-ロイシンを補充していない培養培地において増殖することができない。隣接配列を有する、野生型Ser286をコードするオリゴヌクレオチドを用いて、株CSPZ-2におけるゲノム変異を交換して、L-プロリンを補充したM9培地プレート上で増殖することができ、L-ロイシンを必要としない除去株CSPZ-3 （CSPZ-2 leuB⁺）を作製した。

proC (b0386) およびproBA（b0242およびb0243）遺伝子座の修復：
株CSPZ-3は、M9最小培地において増殖するには、プロリンの補充をなお必要とする。proC遺伝子座のPCR増幅により、およそ2.4 kbの断片が得られた。大腸菌K12（野生型株）では、1,024 bp断片が予測される (Blattner, F.R., et al., Science 277 (1997) 1453-1474)。PCR産物の配列決定から、ゲノムへのIS186 (1,335 bp) 転位によるproC遺伝子座の破壊が明らかになった。proBA遺伝子座をPCRによって特徴づけたが、増幅はできず、proBAオペロンが存在しないことが示唆された。

大腸菌株MG1655ゲノムDNAから増幅されたPCR産物をRed/ET組換えに使用して、proC遺伝子座における欠損を除去した。

連続的段階において、Red/ET組換えによりproBAオペロンをゲノムのinfA‐serW遺伝子間領域に挿入し、CSPZ-4において原栄養性表現型を回復させた。組込みは、組込み部位のPCR増幅および配列決定によって、ならびにM9最小培地寒天プレート上へのプレーティングによって検証した。プロリン原栄養性の栄養要求性除去株をCSPZ-5と命名した。

trpE (b1264) 遺伝子座の修復：
親株CSPZ-2のtrpE遺伝子座のDNA配列決定から、Glu139、Glu 140、およびArgl41の喪失をもたらす9ヌクレオチドの欠失が明らかになった。この変異はトリプトファン栄養要求性表現型を生じることはないが、酵素活性に栄養を及ぼし、増殖の低下を招く可能性がある。したがって、Red/ET組換えにより、変異したtrpE遺伝子座を野生型遺伝子座によって交換した。trpE遺伝子の回復の成功を配列決定によって確認し、得られた株をCSPZ-6と命名した。

実施例2
発現プラスミドの作製
テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合ポリペプチド
組換え手段により、テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合ポリペプチドを調製した。発現される融合ポリペプチドのN末端からC末端方向へのアミノ酸配列は、以下の通りである：
‐アミノ酸メチオニン(M)、
‐CDLPQTHSL (SEQ ID NO: 01) のアミノ酸配列を有するインターフェロン配列の断片、
‐GSリンカー、
‐HHHHHH (SEQ ID NO: 02) のアミノ酸配列を有するヘキサ-ヒスチジンタグ、
‐GSリンカー、
‐VVAPPAP (SEQ ID NO: 03) のアミノ酸配列を有するIgAプロテアーゼ切断部位、および
‐SEQ ID NO: 04のアミノ酸配列を有するテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I。

上記のテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合ポリペプチドは前駆体ポリペプチドであり、IgAプロテアーゼを用いたインビトロでの酵素的切断により、該前駆体ポリペプチドからテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合ポリペプチドが放出された。

前記前駆体ポリペプチドをコードする融合遺伝子は、公知の組換え方法および技法を用いて、適切な核酸セグメントの連結により構築した。化学合成によって作製された核酸配列は、DNA配列決定によって検証した。テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-Iの生産用の発現プラスミドは、以下の通りに調製した。

大腸菌発現プラスミドの作製
a) プラスミド5816
プラスミド4980 (4980-pBRori-URA3-LACI-SAC) は、大腸菌においてコア-ストレプトアビジンを発現させるための発現プラスミドである。これは、プラスミド1966（1966-pBRori-URA3-LACI-T-反復；EP-B 1 422 237において報告されている）に由来する3142 bp長のEcoRI/CelIIベクター断片と、コア-ストレプトアビジンをコードする435 bp長のEcoRI/CelII断片のライゲーションにより作製した。

コア-ストレプトアビジン大腸菌発現プラスミドは、以下のエレメントを含む：
‐大腸菌における複製のための、ベクターpBR322に由来する複製起点（Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90によると、2517〜3160 bp位に相当する）、
‐大腸菌pyrF変異株（ウラシル栄養要求性）の補完によりプラスミド選択を可能にする、オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼをコードするサッカロミセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisie) のURA3遺伝子 (Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124)、
‐以下を含むコア-ストレプトアビジン発現カセット：
‐Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152による合成リボソーム結合部位を含むT5ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433、およびStueber, D., et al.（上記を参照されたい）によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター）、
‐コア-ストレプトアビジン遺伝子、
‐バクテリオファージ由来の2つの転写ターミネーター、λ-T0ターミネーター (Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414) およびfdターミネーター (Beck E. and Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58)、
‐大腸菌に由来するlacIリプレッサー遺伝子 (Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769)。

テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I前駆体ポリペプチドを発現させるための最終的な発現プラスミド5816は、単一の隣接するEcoRIおよびCelIIエンドヌクレアーゼ切断部位を用いてプラスミド4980からコア-ストレプトアビジン構造遺伝子を切り出し、EcoRI/CelII制限部位が隣接している該前駆体ポリペプチドをコードする核酸を、3142 bp長のEcoRI/CelII-4980ベクター断片に挿入することにより調製した。

b) プラスミド5830
プラスミド5830は、トリペプチドQKKをコードするコドンがcaa aaa aag（プラスミド5816）からcag aag aag（プラスミド5830）に変化していることを除いて、プラスミド5816と同一である。

c) プラスミド5836
短縮型のテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合タンパク質を発現させるためのコード融合遺伝子は、公知の組換え方法および技法を用いて、適切な核酸セグメントの連結により構築した。化学合成によって作製された核酸配列は、DNA配列決定によって検証した。SEQ ID NO: 06の融合タンパク質の生産用の発現プラスミドは、以下の通りに調製することができる。

プラスミド4980 (4980-pBRori-URA3-LACI-SAC) は、大腸菌においてコア-ストレプトアビジンを発現させるための発現プラスミドである。これは、プラスミド1966（1966-pBRori-URA3-LACI-T-反復；EP-B 1 422 237において報告されている）に由来する3142 bp長のEcoRI/CelIIベクター断片と、コア-ストレプトアビジンをコードする435 bp長のEcoRI/CelII断片のライゲーションにより作製した。

コア-ストレプトアビジン大腸菌発現プラスミドは、以下のエレメントを含む：
‐大腸菌における複製のための、ベクターpBR322に由来する複製起点（Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90によると、2517〜3160 bp位に相当する）、
‐大腸菌ΔpyrF変異株（ウラシル栄養要求性）の補完によりプラスミド選択を可能にする、オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼをコードするサッカロミセス・セレビシエのURA3遺伝子 (Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124)、
‐以下を含むコア-ストレプトアビジン発現カセット：
‐Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152による合成リボソーム結合部位を含むT5ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433、およびStueber, D., et al.（上記を参照されたい）によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター）、
‐コア-ストレプトアビジン遺伝子、
‐バクテリオファージ由来の2つの転写ターミネーター、λ-T0ターミネーター (Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414) およびfdターミネーター (Beck E. and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58)、
‐大腸菌に由来するlacIリプレッサー遺伝子 (Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769)。

短縮型テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合タンパク質を発現させるための最終的な発現プラスミド5836は、単一の隣接するEcoRIおよびCelIIエンドヌクレアーゼ切断部位を用いてプラスミド4980からコア-ストレプトアビジン構造遺伝子を切り出し、EcoRI/CelII制限部位が隣接している該融合タンパク質をコードする核酸を、3142 bp長のEcoRI/CelII-1プラスミド断片に挿入することにより調製した。

d) プラスミド3036
IgA-プロテアーゼの組換え生産用の発現プラスミド3036は、ベクターOripBR-URA3-EK-IFN（例えばUS 6,291,245を参照されたい）に基づいている。プラスミド3036は、lacIリプレッサー遺伝子およびIgAプロテアーゼタンパク質をコードする標的遺伝子の存在により、OripBR-URA3 -EK-IFNとは異なる。lacIリプレッサー遺伝子は、プラスミドpUHAl (Stueber, D., et al, In: Immunological Methods IV (1990) 121-152) に由来した。これは、Mullis, K.B. and Faloona, F.A. (Methods Enzymology 155 (1987) 335-350) によって記載されている方法に従ってポリメラーゼ連鎖反応法 (PCR) により増幅し、プラスミド3036前駆体中にクローニングした。淋菌 (Neisseria gonorrhoeae) 由来のIgA-プロテアーゼタンパク質をコードする標的遺伝子を、PCRにより作製し、発現ベクター中にクローニングした。

IgA-プロテアーゼ発現プラスミド3036は、以下のエレメントを含む：
‐大腸菌における複製のための、ベクターpBR322に由来する複製起点（Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90によると、2517〜3160 bp位に相当する）、
‐大腸菌ΔpyrF変異株（ウラシル栄養要求性）の補完によりプラスミド選択を可能にする、オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼをコードするサッカロミセス・セレビシエのURA3遺伝子 (Rose, M., et al., Gene 29 (1984) 113-124)、
‐以下を含むIgA-プロテアーゼ発現カセット：
‐Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152による合成リボソーム結合部位を含むT5ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433、およびStueber, D., et al.（上記を参照されたい）によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター）、
‐IgA-プロテアーゼのオープンリーディングフレーム（淋菌、GenBankアクセッション番号P09790）、
‐バクテリオファージ由来の2つの転写ターミネーター、λ-T0ターミネーター (Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414) およびfdターミネーター (Beck E. and Zink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58)、
‐大腸菌に由来するlacIリプレッサー遺伝子 (Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769)。

実施例3
栄養要求性補完アミノ酸ロイシンおよびプロリンを補充した既知組成最小増殖培地での培養による融合ポリペプチドの発現
WO 2012/028526において報告されているテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合タンパク質を発現させるために、大腸菌栄養要求性 (pyrF) の補完により抗生物質を用いずにプラスミド選択を可能にする大腸菌宿主／ベクター系を使用した（EP 0 972 838およびUS 6,291,245を参照されたい）。

大腸菌K12株であるCSPZ-2（leuB、proC、trpE、thi-1、ΔpyrF）およびCSPZ-6（thi-1、ΔpyrF）を、エレクトロポレーションにより、発現プラスミド5816（実施例2を参照されたい）で形質転換した。形質転換された大腸菌細胞を、まず寒天プレート上で37℃にて増殖させた。このプレートから拾い上げたコロニーを3 mLローラー培養に移し、光学密度が1〜2（578 nmで測定）になるまで37℃で増殖させた。次いで、長期貯蔵のために、1000μLの培養物を1000μLの滅菌86%グリセロールと混合し、-80℃で直ちに凍結した。

このクローンの正確な産物発現を、小規模振盪フラスコ実験においてまず検証し、SDS-Pageで解析してから、10 L発酵槽に移した。

予備培養：
予備培養のために、既知組成培地 (CDM) を使用した：
NH4Cl 1.0 g/L、K2HPO4*3H2O 18.3 g/L、クエン酸1.6 g/L、グリシン0.78 g/L、L-アラニン0.29 g/L、L-アルギニン0.41 g/L、L-アスパラギン*H2O 0.37 g/L、L-アスパラギン酸0.05 g/L、L-システイン*HCl*H2O 0.05 g/L、L-ヒスチジン0.05 g/L、L-イソロイシン0.31 g/L、L-ロイシン0.38 g/L、L-リジン*HCl 0.40 g/L、L-メチオニン0.27 g/L、L-フェニルアラニン0.43 g/L、L-プロリン0.36 g/L、L-セリン0.15 g/L、L-スレオニン0.40 g/L、L-トリプトファン0.07 g/L、L-バリン0.33 g/L、L-チロシン0.51 g/L、L-グルタミン0.12 g/L、Na-L-グルタミン酸*H2O 0.82 g/L、グルコース*H2O 5.0 g/L、微量元素溶液5 mL/L、MgSO4*7H2O 0.86 g/L、チアミン*HCL 17.5 mg/L。

微量元素溶液は、MnSO4*H2O 1.28 g/1、ZnSO4*7H2O 1.70 g/L、H3BO3 0.30 g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.18 g/L、CoCl2*6H2O 0.25 g/L、CuSO4*5H2O 0.22 g/L、EDTA 0.75 g/Lを含む。

予備培養のために、4つの整流装置を備えた1000 mL三角フラスコ中のCDM 300 mLに、初代シードバンクアンプルのうちの0.9 mLを接種した。培養は、7〜13の光学密度 (578 nm) が得られるまで、ロータリーシェーカー上で37℃および170 rpmにて9時間行った。次いで、バッチ培地に接種するために、この予備培養物100 gを10 Lバイオオリアクターに移した。

アミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンを伴う発酵（実験番号1および実験番号2）:
10 L Biostat C, DCU3発酵槽 (Sartorius、Melsungen, Germany) 中での発酵のために、以下のバッチ培地を使用した：KH2PO4 4.73 g/L、(NH4)2HPO4 7.47 g/L、K2HPO4*3H2O 14.94 g/L、クエン酸2.07 g/l、L-メチオニン1.22 g/L、L-プロリン4.08 g/L、L-ロイシン2.57 g/L、クエン酸鉄アンモニウム0.08 g/L、NaHCO3 0.82 g/L、微量元素溶液7.3 mL/L、MgSO4*7H2O 1.42 g/L、チアミン*HCl 20.9 mg/L、グルコース*H2O 29.3 g/L、ビオチン0.2 mg/L、1.2 mL/L Synperonic 10%消泡剤。

微量元素溶液は、1 N HCl溶液中に可溶化されたFeSO4*7H2O 10 g/L、ZnSO4*7H2O 2.25 g/L、MnSO4*H20 2.13 g/L、CuSO4*5H20 1.0 g/L、CoCl2*6H2O 0.42 g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3 g/L、H3BO3 0.50 g/L、チアミン-HCL 2.0 g/Lを含む。

供給物1溶液は、700 g/Lグルコース*H2O、KH2PO4 8.43 g/L、およびK2HPO4*3H2O 22.38 g/Lを含んだ。

供給物2は、585 g/L L-プロリンおよび150.3 g/L MgSO4*7H2Oを含む。

全成分を脱イオン水中に溶解した。

pH調整用のアルカリ溶液は、11.25 g/L L-メチオニン、51.5 g/L L-プロリン、および56.25 g/L L-ロイシンを補充した12.5 % (w/v) のNH3水溶液であった（WO 2012/028522を参照されたい）。

無菌バッチ培地4.2 Lおよび予備培養物由来の接種材料100 mLから出発して、バッチ発酵を、37℃、pH 6.9±0.2、800 mバール背圧、および初期通気速度10 L/分で実施した。溶存酸素の相対値 (pO2) は、撹拌機のスピードを1500 rpmまで増加させることによって、発酵期間を通して50%に維持した。溶存酸素値の急増によって示される初期補充グルコースの枯渇後、温度を25℃に変化させ、その15分後に、発酵は両方の供給物（それぞれ50 g/hおよび13 g/h）の開始により流加モードに入った。供給物2の速度は一定に維持し、供給物1の速度は、8.5時間以内に50 g/hから最終的に160 g/hまでという所定の供給プロファイルを用いて段階的に増加させる。二酸化炭素の排気濃度が2%を超えるレベルとなった時点で、通気速度を5時間以内に10 L/分から20 L/分からまで一定に増加させた。光学密度が150の時点で、組換えテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-1融合タンパク質の発現を、2.4 g IPTGの添加により誘導した。

発酵の最後に、細胞質内で可溶性に発現されたテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-1融合タンパク質を、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体に移行させるが、これは収集前に発酵槽中の全培養ブロスを1時間にわたり50℃に加熱する加熱段階を用いて行った（例えば、EP-B 1 486 571を参照されたい）。その後、発酵槽の内容物をフロースルー遠心分離機（13,000 rpm、13 L/h）で遠心分離し、さらに処理するまで、収集したバイオマスを-20℃で貯蔵した。合成されたテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-1融合タンパク質は、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体 (IB)の形態で、不溶性細胞残屑画分においてのみ見出された。

産物形成の解析：
1つは誘導前に、および他のものはタンパク質発現の誘導後の所定の時点において、発酵槽から採取された試料を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析する。すべての試料から、同量の細胞（OD_標的 = 5）を5 mLのPBS緩衝液中に再懸濁し、氷上で超音波処理により破壊する。次いで、100μLの各懸濁液を遠心分離し（15,000 rpm、5分間）、各上清を回収し、別々のバイアルに移す。これは、可溶性と不溶性の発現標的タンパク質を識別するためである。各上清（= 可溶性）画分に300μL、および各ペレット（= 不溶性）画分に400μLのSDS試料緩衝液 (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685) を添加する。試料を激しい混合下で95℃にて15分間加熱して、試料中の全タンパク質を可溶化しかつ還元する。室温まで冷却した後、各試料5μLを4〜20% TGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲル (Bio-Rad) に移す。加えて、5μLの分子量標準物質（Precision Plus Protein Standard、Bio-Rad）、および公知の産物タンパク質濃度（0.1μg/μL）を有する3つの量（0.3μL、0.6μL、および0.9μL）の定量化標準物質をゲル上に配置する。

電気泳動を200 Vで60分間実行し、その後ゲルをGelDOC EZ Imager (Bio-Rad) に移し、UV照射により5分間処理した。Image Lab解析ソフトウェア (Bio-Rad) を用いて、ゲル画像を解析した。3つの標準物質を用いて、線形回帰曲線を係数＞0.99を用いて算出し、そこから元の試料中の標的タンパク質の濃度を算出した。

精製された脂質化TN-ApoA1の活性を、8日間放射活性排出アッセイにおいて測定した。PMA（ホルボールミリスチン酸酢酸）により、細胞 (THP-1) をマクロファージに分化させた。これらの細胞にアセチル化LDLおよび³H-標識コレステロールを負荷した。上清を廃棄し、細胞を平衡培地と共に5時間インキュベートして、非特異的に結合したコレステロールを除いた。その後18時間にわたり、細胞からの³H-標識コレステロールの排出を可能にする脂質化TN-ApoA1を添加しておいた。上清中および細胞溶解物中の放射活性を測定した。

結果：
上記の発酵工程を用いて、L-ロイシンおよびL-プロリンに対して栄養要求性である親株CSPZ-2において、および栄養要求性除去株CSPZ-6において、テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-1を発現させた。後者の株はもはやアミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンの供給を必要としないにもかかわらず、この栄養要求性除去株の性能を、株CSPZ-2と性能を直接比較するために、補充した発酵培地を用いて試験した。

同じ培地および発酵工程を使用したにもかかわらず、栄養要求性除去株は親株よりも速く増殖している（図1を参照されたい）。

同じ培地および発酵工程を使用したにもかかわらず、栄養要求性除去株は親株よりもより多くの産物をより速く発現している（図2を参照されたい）。

アミノ酸ロイシンおよびプロリンの濃度傾向からわかるように（図3Aおよび3Bを参照されたい）、栄養要求性除去株は、代謝経路が無傷であるために、今ではL-ロイシンおよびL-プロリンを代謝することができる。したがって、栄養要求性除去株の増殖は、適用された流加工程のグルコース制限培養条件下でより速い。

驚いたことに、栄養要求性除去株は、アミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンを補充した同じ既知組成発酵培地において、親株よりも顕著により優れた性能を有した。増殖は、含まれるアミノ酸を代謝する可能性によって加速され、これはまた産物形成を高め得る。これによる結論は、原栄養要求性大腸菌生産株を使用することである。

実施例4
栄養要求性補完アミノ酸ロイシンおよびプロリンを補充した既知組成最小増殖培地での培養によるIgAプロテアーゼの発現
IgA-プロテアーゼ (106 kDa) を発現させるために、大腸菌栄養要求性 (PyrF) の補完により抗生物質を用いずにプラスミド選択を可能にする大腸菌宿主／ベクター系を使用した（EP 0 972 838およびUS 6,291,245を参照されたい）。

大腸菌K12株であるCSPZ-2（leuB、proC、trpE、thi-1、ΔpyrF）およびCSPZ-6（thi-1、ΔpyrF）を、エレクトロポレーションにより、発現プラスミド3036で形質転換した。形質転換された大腸菌細胞を、まず寒天プレート上で37℃にて増殖させた。このプレートから拾い上げたコロニーを3 mLローラー培養に移し、光学密度が1〜2（578 nmで測定）になるまで37℃で増殖させた。次いで、長期貯蔵のために、1000μLの培養物を1000μLの滅菌86%グリセロールと混合し、-80℃で直ちに凍結した。このクローンの正確な産物発現を、小規模振盪フラスコ実験においてまず検証し、SDS-Pageで解析してから、10 L発酵槽に移した。

予備培養：
予備培養のために、既知組成培地 (CDM) を使用した：
NH4Cl 1.0 g/L、K2HPO4*3H2O 18.3 g/L、クエン酸1.6 g/L、グリシン0.78 g/L、L-アラニン0.29 g/L、L-アルギニン0.41 g/L、L-アスパラギン*H2O 0.37 g/L、L-アスパラギン酸0.05 g/L、L-システイン*HCl*H2O 0.05 g/L、L-ヒスチジン0.05 g/L、L-イソロイシン0.31 g/L、L-ロイシン0.38 g/L、L-リジン*HCl 0.40 g/L、L-メチオニン0.27 g/L、L-フェニルアラニン0.43 g/L、L-プロリン0.36 g/L、L-セリン0.15 g/L、L-スレオニン0.40 g/L、L-トリプトファン0.07 g/L、L-バリン0.33 g/L、L-チロシン0.51 g/L、L-グルタミン0.12 g/L、Na-L-グルタミン酸*H2O 0.82 g/L、グルコース*H2O 6.0 g/L、微量元素溶液0.5 mL/L、MgSO4*7H2O 0.86 g/L、チアミン*HCl 17.5 mg/L。

微量元素溶液は、0.5 M HCl中に溶解されたFeSO4*7H2O 10.0 g/L、ZnSO4 * 7H2O 2.25 g/L、MnSO4 * H20 2.13 g/L、H3BO3 0.50 g/L、(NH4)6Mo7O24 * 4H2O 0.3 g/L、CoCl2*6H2O 0.42 g/L、CuSO4 * 5H20 1.0 g/Lを含む。

予備培養のために、4つの整流装置を備えた1000 mL三角フラスコ中のCDM 220mLに、初代シードバンクアンプルのうちの1.0 mLを接種した。培養は、11〜13の光学密度 (578 nm) が得られるまで、ロータリーシェーカー上で37℃および170 rpmにて9時間行った。等量の細胞を用いて10 Lバイオリアクターのバッチ培地に接種するために、接種容量をV_接種 = 100 mL * 5 / OD_PCを用いて算出したが、これは予備培養物の光学濃度に依存する。

アミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンを伴う発酵（実験番号3および実験番号4）:
10 L Biostat C, DCU3発酵槽 (Sartorius、Melsungen, Germany) 中での発酵のために、発酵の最後に加熱段階を行わなかったこと以外は、実施例3に記載されたのと同じ工程を実施した。

産物形成の解析：
1つは誘導前に、および他のものはタンパク質発現の誘導後の所定の時点において、発酵槽から採取された試料を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析する。すべての試料から、同量の細胞（OD_標的 = 10）を5 mLのPBS緩衝液中に再懸濁し、氷上で超音波処理により破壊する。次いで、100μLの各懸濁液を遠心分離し（15,000 rpm、5分間）、各上清を回収し、別々のバイアルに移す。これは、可溶性と不溶性の発現標的タンパク質を識別するためである。各上清（= 可溶性）画分に100μL、および各ペレット（= 不溶性）画分に200μLのSDS試料緩衝液 (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685) を添加する。試料を激しい混合下で95℃にて15分間加熱して、試料中の全タンパク質を可溶化しかつ還元する。室温まで冷却した後、各試料5μLを4〜20% TGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲル (Bio-Rad) に移す。加えて、5μLの分子量標準物質（Precision Plus Protein Standard、Bio-Rad）、および公知の産物タンパク質濃度（0.1μg/μL）を有する3つの量（0.3μL、0.6μL、および0.9μL）の定量化標準物質をゲル上に配置する。

結果：
上記の発酵工程を用いて、L-ロイシンおよびL-プロリンに対して栄養要求性である親株CSPZ-2において、および栄養要求性除去株CSPZ-6において、IgAプロテアーゼを発現させた。後者の株はもはやアミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンの供給を必要としないにもかかわらず、補充した発酵培地におけるこの栄養要求性除去株の性能を、親株CSPZ-2と性能を直接比較するために試験した。

アミノ酸を補充したバッチ培地における栄養要求性除去株の増殖は、親株と比較して顕著により速かった。

実施例5
既知組成最小増殖培地における栄養要求性除去大腸菌株および野生型株MG1655の培養
栄養要求性除去株の1つの明白な利点は、原栄養性表現型であるために、既知組成培地での培養中に、さらなる高価なアミノ酸を供給する必要がないことである。このことは、この工程のための物品のコストを劇的に削減する。試験のため、栄養要求性除去株CSPZ-6を用いた同一の発酵を、単にアミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンを培地および供給物から排除して行った。栄養要求性除去株が、同様に原栄養性である野生型大腸菌株に勝る顕著な利点を有することを実証するため、同じ発酵工程におけるK12株MG1655（抗生物質を用いない選択系に適合させるためにpyrF遺伝子が欠失している）の増殖および産物形成を調査した。

大腸菌K12株であるCSPZ-6（thi-1、ΔpyrF）およびMG1655派生体（ΔpyrF、ΔompT）を、エレクトロポレーションにより、発現プラスミド5816（実施例2を参照されたい）で形質転換した。形質転換された大腸菌細胞を、まず寒天プレート上で37℃にて増殖させた。このプレートから拾い上げたコロニーを3 mLローラー培養に移し、光学密度が1〜2（578 nmで測定）になるまで37℃で増殖させた。次いで、長期貯蔵のために、1000μLの培養物を1000μLの滅菌86%グリセロールと混合し、-80℃で直ちに凍結した。

微量元素溶液は、MnSO4*H2O 1.28 g/L、ZnSO4*7H2O 1.70 g/L、H3BO3 0.30 g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.18 g/L、CoCl2*6H2O 0.25 g/L、CuSO4*5H2O 0.22 g/L、EDTA 0.75 g/Lを含む。

予備培養のために、4つの整流装置を備えた1000 mL三角フラスコ中のCDM 300 mLに、初代シードバンクアンプルのうちの0.9 mLを接種した。培養は、6〜13の光学密度 (578 nm) が得られるまで、ロータリーシェーカー上で37℃および170 rpmにて9時間行った。次いで、バッチ培地に接種するために、この予備培養物100 gを10 Lバイオオリアクターに移した。

アミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンを伴わない発酵（実験番号5および実験番号6）:
10 L Biostat C, DCU3発酵槽 (Sartorius、Melsungen, Germany) 中での発酵のために、以下のバッチ培地を使用した：KH2PO4 4.73 g/L、(NH4)2HPO4 7.47 g/L、K2HPO4*3H2O 14.94 g/L、クエン酸2.07 g/L、L-メチオニン1.22 g/L、クエン酸鉄アンモニウム0.08 g/L、NaHCO3 0.82 g/L、微量元素溶液7.3 mL/L、MgSO4*7H2O 1.42 g/L、チアミン*HCl 20.9 mg/L、グルコース*H2O 29.3 g/L、ビオチン0.2 mg/L、1.2 mL/L Synperonic 10%消泡剤。

供給物2は、150.3 g/L MgSO4*7H2Oのみを含む。

全成分を脱イオン水中に溶解した。

pH調整用のアルカリ溶液は、11.25 g/L L-メチオニンを補充した12.5 % (w/v) のNH3水溶液であった。

無菌バッチ培地4.2 Lおよび予備培養物由来の接種材料100 mLから出発して、バッチ発酵を、37℃、pH 6.9±0.2、800 mバール背圧、および初期通気速度10 L/分で実施した。溶存酸素の相対値 (pO2) は、撹拌機のスピードを1500 rpmまで増加させることによって、発酵期間を通して50%に維持した。溶存酸素値の急増によって示される初期補充グルコースの枯渇後、温度を25℃に変化させ、その15分後に、発酵は両方の供給物（それぞれ50 g/hおよび13 g/h）の開始により流加モードに入った。供給物2の速度は一定に維持し、供給物1の速度は、8.5時間以内に50 g/hから最終的に160 g/hまでという所定の供給プロファイルを用いて段階的に増加させる。二酸化炭素の排気濃度が2%を超えるレベルとなった時点で、通気速度を5時間以内に10 L/分から20 L/分からまで一定に増加させた。光学密度が150の時点で、組換えテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-1融合タンパク質の発現を、2.4 g IPTGの添加により誘導した。発酵の最後に、細胞質内で可溶性に発現されたテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-Iを、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体に移行させるが、これは収集前に発酵槽中の全培養ブロスを1時間にわたり50℃に加熱する加熱段階を用いて行った（例えば、EP-B 1 486 571を参照されたい）。その後、発酵槽の内容物をフロースルー遠心分離機（13,000 rpm、13 l/h）で遠心分離し、さらに処理するまで、収集したバイオマスを-20℃で貯蔵した。合成されたテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合タンパク質は、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体 (IB)の形態で、不溶性細胞残屑画分においてのみ見出された。

結果：
上記の発酵工程を用いて、栄養要求性除去株CSPZ-6、およびK12野生型株MG1655を表す原栄養性MG1655派生株において、テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-Iを発現させた。いずれの株もアミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンの供給を必要とせず、その結果としてそれらを培地および供給物から排除した。このことは、この工程のための物品のコストを明らかに削減する。

栄養要求性除去株および野生型株はいずれも、高濃度のL-ロイシンの増殖阻害効果がないために、アミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンを伴わない培地においてより速く増殖している（実施例3を参照されたい）。栄養要求性除去株の最終的な光学密度は、これらのアミノ酸を欠いているこの培地において十分に改善されるのに対して、野生型株の増殖は、産物形成の誘導後および発酵の後期において顕著に低下する（図4を参照されたい）。

誘導物質添加後の最初の数時間以内の栄養要求性除去株の産物形成は、アミノ酸を補充した発酵培地においてより速いにもかかわらず、最終的な収量は、アミノ酸を添加していない発酵と比較してほぼ同じである（図5を参照されたい）。したがって、培地からアミノ酸を除くことはかなりのコストを節約するものの、産物収量は減少しない。原栄養性野生型大腸菌MG1655派生株は、増殖量および産物の収量が顕著に不足している。

まとめ：
栄養要求性除去株は、たとえアミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンを補充しなくても、同じ既知組成発酵培地において原栄養性野生型大腸菌株よりもより良好な性能を示した。したがって、MG1655または実施例6においてさらに見られ得るような近縁のW3110 (Vijayendran, C., et al., J. Biotechnol. 128 (2007) 747-761) のような原栄養性野生型大腸菌株を使用する代わりに、既知組成最小増殖培地における培養を可能にし、そのような既知組成最小増殖培地を使用する利点から恩恵を受けるために、高生産性大腸菌株からそのアミノ酸栄養要求性を除去することは有益である。

実施例6
既知組成最小増殖培地における栄養要求性除去大腸菌株および野生型株W3110の培養
栄養要求性除去株CSPZ-6が、原栄養性野生型大腸菌株W3110（抗生物質を用いない選択系に適合させるためにpyrF遺伝子が欠失している）に勝る顕著な利点を有することを実証するため、同じ発酵工程における増殖および産物形成を調査した。

大腸菌K12株であるCSPZ-6（thi-1、ΔpyrF）および66C5（＝W3110 ΔpyrF派生体）を、エレクトロポレーションにより、発現プラスミド5830（実施例2を参照されたい）で形質転換した。形質転換された大腸菌細胞を、まず寒天プレート上で37℃にて増殖させた。このプレートから拾い上げたコロニーを3 mLローラー培養に移し、光学密度が1〜2（578 nmで測定）になるまで37℃で増殖させた。次いで、長期貯蔵のために、1000μLの培養物を1000mLの滅菌86%グリセロールと混合し、-80℃で直ちに凍結した。

微量元素溶液は、0.5 M HCl中に溶解されたFeSO4*7H2O 10.0 g/L、ZnSO4*7H2O 2.25 g/L、MnSO4*H20 2.13 g/L、H3BO3 0.50 g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3 g/L、CoCl2*6H2O 0.42 g/L、CuSO4*5H20 1.0 g/Lを含む。

予備培養のために、4つの整流装置を備えた1000 mL三角フラスコ中のCDM 300 mLに、初代シードバンクアンプルのうちの0.9 mLを接種した。培養は、4〜9の光学密度 (578 nm) が得られるまで、ロータリーシェーカー上で32℃および170 rpmにて8時間行った。等量の細胞を用いて10 Lバイオリアクターのバッチ培地に接種するために、接種容量をV_接種 = 100 mL * 5 / ODPCを用いて算出したが、これは予備培養物の光学濃度に依存する。

アミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンを伴わない発酵（実験番号7および実験番号8）:
10 L Biostat C, DCU3発酵槽 (Sartorius、Melsungen, Germany) 中での発酵のために、以下のバッチ培地を使用した：KH2PO4 1.58 g/L、(NH4)2HPO4 7.47 g/L、K2HPO4*3H2O 13.32 g/L、クエン酸2.07 g/L、L-メチオニン1.22 g/L、NaHCO3 0.82 g/L、微量元素溶液7.3 mL/L、MgSO4*7H2O 0.99 g/L、チアミン*HCl 20.9 mg/L、グルコース*H2O 29.3 g/L、ビオチン0.2 mg/L、1.2 mL/L Synperonic 10%消泡剤。

微量元素溶液は、0.5 M HCl溶液中に可溶化されたFeSO4*7H2O 10 g/L、ZnSO4*7H2O 2.25 g/L、MnSO4*H20 2.13 g/L、CuSO4*5H20 1.0 g/L、CoCl2*6H2O 0.42 g/L、(NH4)6Mo7O24 * 4H2O 0.3 g/L、H3BO3 0.50 g/Lを含む。

供給物1溶液は、700 g/L グルコース*H2O、12.3 g/L MgSO4*7H2O、および0.1 g/L FeSO4*7H2Oを含んだ。

供給物2は、KH2PO4 52.7 g/L、K2HPO4*3H2O 139.9 g/L、および(NH4)2HPO4 132.1 g/Lを含む。

全成分を脱イオン水中に溶解した。

無菌バッチ培地4.2 Lおよび予備培養物由来の接種材料100 mLから出発して、バッチ発酵を、31℃、pH 6.9±0.2、800 mバール背圧、および初期通気速度10 L/分で実施した。溶存酸素の相対値 (pO2) は、撹拌機のスピードを1500 rpmまで増加させることによって、発酵期間を通して50%に維持した。溶存酸素値の急増によって示される初期補充グルコースの枯渇後、温度を25℃に変化させ、その15分後に、発酵は両方の供給物（それぞれ60 g/hおよび14 g/h）の開始により流加モードに入った。供給物2の速度は一定に維持し、供給物1の速度は、7時間以内に60 g/hから最終的に160 g/hまでという所定の供給プロファイルを用いて段階的に増加させる。二酸化炭素の排気濃度が2%を超えるレベルとなった時点で、通気速度を5時間以内に10 L/分から20 L/分からまで一定に増加させた。光学密度が120の時点で、組換えテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合タンパク質の発現を、2.4 g IPTGの添加により誘導した。発酵の最後に、細胞質内で可溶性に発現されたテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-Iを、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体に移行させるが、これは収集前に発酵槽中の全培養ブロスを1時間にわたり50℃に加熱する加熱段階を用いて行った（例えば、EP-B 1 486 571を参照されたい）。その後、発酵槽の内容物をフロースルー遠心分離機（13,000 rpm、13 L/h）で遠心分離し、さらに処理するまで、収集したバイオマスを-20℃で貯蔵した。合成されたテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合タンパク質は、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体 (IB)の形態で、不溶性細胞残屑画分においてのみ見出された。

結果：
上記の発酵工程を用いて、栄養要求性除去株CSPZ-6、およびK12野生型株W3110を表す原栄養性株66C5において、テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-Iを発現させた。いずれの株もアミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンの供給を必要とせず、その結果としてそれらを培地および供給物から排除した。このことは、この工程のための物品のコストを削減する。

驚いたことに、野生型株66C5は原栄養性であり、等量の細胞を接種したにもかかわらず、同じ既知組成培地および同じ培養条件下において、栄養要求性除去株CSPZ-6と比較して、初めから極めてゆっくりと増殖した（図6を参照されたい）。その結果として、過剰供給および培地中のグルコース蓄積を回避するために、グルコース供給速度を適応させなければならなかった。また、両株の間で、最終的な光学密度は大きく異なる。栄養要求性除去株は300超に達したのに対して、野生型株は143を達成したにすぎず、発酵は増殖の停滞によって終了した。バッチ期（37℃）および流加期（30℃）の温度を上昇させて、株66C5を用いた発酵を繰り返したが（実験番号9）、増殖量はそれほど改善され得なかった（図7を参照されたい）。

同じ既知組成培地および同じ条件下において培養した場合、野生型株66C5の増殖は栄養要求性除去株CSPZ-6の増殖に大きな遅れを取ったため、産物形成もまたはるかにより低かった（図8を参照されたい）。栄養要求性除去株は、31時間の発現後に最終的に22.6 g/Lを達成したのに対して、野生型株66C5の発酵は、増殖の停滞のために38時間の培養後に終了し、その結果として産物収量はわずかに2.3 g/Lと定量された。比生産性もまた、より低かった（21.9 mg/OD 対 71.1 mg/OD）。バッチ期（37℃）および流加期（30℃）の温度を上昇させて、野生型株66C5を用いた発酵を繰り返したが、産物収量は6.9 g/Lまで改善され得るにすぎなかった（図9を参照されたい）。原栄養性野生型大腸菌株は、栄養要求性除去株と直接比較して顕著に不足している。

まとめ：
栄養要求性除去株CSPZ-6は、メチオニン以外のアミノ酸を補充していない同じ既知組成発酵培地において、原栄養性野生型大腸菌株W3110派生体よりもはるかにより良好な性能を有した。したがって、例えばMG1655またはW3110などの原栄養性野生型大腸菌株を使用する代わりに、培養に既知組成最小培地を使用し、そのような培地を使用する利点から恩恵を受けるために、大腸菌株からそのアミノ酸栄養要求性を除去することは有益である。

実施例7
既知組成培地における栄養要求性除去株CSPZ-6および原栄養性野生型株BL21 ΔpyrF派生体の培養
栄養要求性除去株CSPZ-6が、原栄養性野生型大腸菌B株BL21（抗生物質を用いない選択系に適合させるためにpyrF遺伝子が欠失している、CSPZ-14と命名）に勝る顕著な利点を有することを実証するため、同じ発酵工程における増殖および産物形成を調査した。

大腸菌K12株CSPZ-6（thi-1、ΔpyrF）および大腸菌B株CSPZ-14（= BL21ΔpyrF派生体）を、エレクトロポレーションによりプラスミド番号5836（実施例2を参照されたい）で形質転換して、短縮型テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合タンパク質誘導体を発現させた。形質転換された大腸菌細胞を、まず寒天プレート上で37℃にて増殖させた。このプレートから拾い上げたコロニーを3 mLローラー培養に移し、光学密度が1〜2（578 nmで測定）になるまで37℃で増殖させた。次いで、長期貯蔵のために、1000μLの培養物を1000μLの滅菌86%グリセロールと混合し、-80℃で直ちに凍結した。このクローンの正確な産物発現を、小規模振盪フラスコ実験においてまず検証し、SDS-Pageで解析してから、10 L発酵槽に移した。

予備培養のために、4つの整流装置を備えた1000 mL三角フラスコ中のCDM 300 mLに、初代シードバンクアンプルのうちの0.9 mLを接種した。培養は、4〜9の光学密度 (578 nm) が得られるまで、ロータリーシェーカー上で32℃および170 rpmにて8時間行った。次いで、バッチ培地に接種するために、この予備培養物100 gを10 Lバイオオリアクターに移した。

アミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンを伴わない発酵（実験番号10および実験番号11）:
10 L Biostat C, DCU3発酵槽 (Sartorius、Melsungen, Germany) 中での発酵のために、以下のバッチ培地を使用した：
KH₂PO₄ 1.58 g/L、(NH₄)₂HPO₄ 7.47 g/L、K2HPO4*3H2O 13.32 g/L、クエン酸2.07 g/L、L-メチオニン1.22 g/L、NaHCO₃ 0.82 g/L、微量元素溶液7.3 mL/L、MgSO₄*7H₂O 0.99 g/L、チアミン*HCl 20.9 mg/L、グルコース*H₂O 29.3 g/L、ビオチン0.2 mg/L、1.2 mL/L Synperonic 10%消泡剤。

微量元素溶液は、0.5 M HCl溶液中に可溶化されたFeSO4*7H2O 10 g/L、ZnSO4*7H2O 2.25 g/L、MnSO4*H20 2.13 g/L、CuSO4*5H20 1.0 g/L、CoCl2*6H2O 0.42 g/L、(NH4)6Mo7O24*4H2O 0.3 g/L、H3BO3 0.50 g/Lを含む。

供給物1溶液は、700 g/L グルコース*H2O、7.4 g/L MgSO₄*7H₂O、および0.1 g/L FeSO4*7H2Oを含んだ。

供給物2は、KH₂PO₄ 52.7 g/L、K2HPO4*3H2O 139.9 g/L、および(NH4)2HPO4 66.0 g/Lを含む。

全成分を脱イオン水中に溶解した。

pH調整用のアルカリ溶液は、11.25 g/L L-メチオニンを補充した12.5 % (w/v) のNH₃水溶液であった。

無菌バッチ培地4.2 Lおよび予備培養物由来の接種材料100 mLから出発して、バッチ発酵を、31℃、pH 6.9±0.2、800 mバール背圧、および初期通気速度10 L/分で実施した。溶存酸素の相対値 (pO2) は、撹拌機のスピードを1500 rpmまで増加させることによって、発酵期間を通して50%に維持した。溶存酸素値の急増によって示される初期補充グルコースの枯渇後、温度を25℃に変化させ、その15分後に、発酵は両方の供給物（それぞれ60 g/hおよび14 g/h）の開始により流加モードに入った。供給物2の速度は一定に維持し、供給物1の速度は、7時間以内に60 g/hから最終的に160 g/hまでという所定の供給プロファイルを用いて段階的に増加させる。二酸化炭素の排気濃度が2%を超えるレベルとなった時点で、通気速度を5時間以内に10 L/分から20 L/分からまで一定に増加させた。光学密度がおよそ150の時点で、組換えテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合タンパク質の発現を、2.4 g IPTGの添加により誘導した。発酵の最後に、細胞質内で可溶性に発現されたテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-Iを、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体に移行させるが、これは収集前に発酵槽中の全培養ブロスを1時間にわたり50℃に加熱する加熱段階を用いて行った（例えば、EP-B 1 486 571を参照されたい）。その後、発酵槽の内容物をフロースルー遠心分離機（13,000 rpm、13 L/h）で遠心分離し、さらに処理するまで、収集したバイオマスを-20℃で貯蔵した。合成されたテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合タンパク質は、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体 (IB)の形態で、不溶性細胞残屑画分においてのみ見出された。

電気泳動を200 Vで60分間実行し、その後ゲルをGelDOC EZ Imager (Bio-Rad) に移し、UV照射により5分間処理した。Image Lab解析ソフトウェア(Bio-Rad) を用いて、ゲル画像を解析した。3つの標準物質を用いて、線形回帰曲線を係数＞0.99を用いて算出し、そこから元の試料中の標的タンパク質の濃度を算出した。

精製された脂質化短縮型TN-ApoA1の活性を、8日間放射活性排出アッセイにおいて測定した。PMA（ホルボールミリスチン酸酢酸）により、細胞 (THP-1) をマクロファージに分化させた。これらの細胞にアセチル化LDLおよび³H-標識コレステロールを負荷した。上清を廃棄し、細胞を平衡培地と共に5時間インキュベートして、非特異的に結合したコレステロールを除いた。その後18時間にわたり、細胞からの³H-標識コレステロールの排出を可能にする脂質化短縮型TN-ApoA1を添加しておいた。上清中および細胞溶解物中の放射活性を測定した。

結果：
上記の発酵工程を用いて、栄養要求性除去株CSPZ-6において、および大腸菌B野生型株BL21を表す原栄養性株CSPZ-14において、短縮型テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合タンパク質を発現させた。いずれの株もアミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンの供給を必要とせず、その結果としてそれらを培地および供給物から排除した。このことは、この工程のための物品のコストを削減する。

驚いたことに、野生型株でありBL21派生体であるCSPZ-14は原栄養性であり、発酵物に等量の細胞を接種したにもかかわらず、同じ既知組成培地および同じ培養条件下において、栄養要求性除去株CSPZ-6と比較して、初めから顕著によりゆっくりと増殖した（図10を参照されたい）。その結果として、グルコース供給は1.2時間遅く開始したが、供給速度の増加は匹敵する発酵と同じプロファイルに従った。両株の間で、最終的な光学密度は大きく異なる。栄養要求性除去株は、最後の加熱段階の前に266という光学密度に達したのに対して、野生型株の光学密度は、33時間の時点での最大値から、発酵の終了時（47時間）のわずか143にまで減少した。

産物形成は、いずれの培養においても、およそ150の光学密度の時点で2.4 g IPTGを添加することにより誘導した。同じ既知組成培地および同じ条件下において培養した場合、株CSPZ-6での19.5時間と比較して、株CSPZ-14の増殖は低下したために、22.2時間の時点でこのODに達した。CSPZ-14の産物形成速度は有意により低く、よって最終的な収量は、23時間の発現後にわずか9.6 g/Lに達したにすぎない（図11を参照されたい）。これと比較して、栄養要求性除去株は、誘導発現の24時間後に33.8 g/Lの融合タンパク質をもたらした。比生産性もまた、より低かった（67.1 mg/OD 対 135.7 mg/OD）。原栄養性野生型大腸菌株は、栄養要求性除去株と直接比較して顕著に不足している。

まとめ：
栄養要求性除去株CSPZ-6は、メチオニン以外のアミノ酸を補充していない同じ既知組成発酵培地において、原栄養性野生型大腸菌株CSPZ-14（BL21 ΔpyrF派生体）よりもはるかにより良好な性能を有した。したがって、例えばMG1655、W3110、またはBL21などの原栄養性野生型大腸菌株を使用する代わりに、既知組成最小培地において大腸菌株を培養し、そのような培地を使用する利点から恩恵を受けるために、大腸菌株からそのアミノ酸栄養要求性を除去することは有益である。

実施例8
既知組成培地における栄養要求性除去株CSPZ-6および原栄養性野生型株MG1655の培養
栄養要求性除去株CSPZ-6が原栄養性野生型株大腸菌K12株MG1655（抗生物質を用いない選択系に適合させるためにpyrF遺伝子が欠失している、CSPZ-9と命名）に勝る顕著な利点を有することを実証するため、2つの株の間の同じ発酵工程における増殖およびIgA-プロテアーゼ産物形成を調査した。

大腸菌K12株であるCSPZ-6（thi-1、ΔpyrF）およびCSPZ-9（＝MG1655 ΔpyrF派生体）を、エレクトロポレーションによりプラスミド3036で形質転換して、IgA-プロテアーゼを発現させた。形質転換された大腸菌細胞を、まず寒天プレート上で37℃にて増殖させた。このプレートから拾い上げたコロニーを3 mLローラー培養に移し、光学密度が1〜2（578 nmで測定）になるまで37℃で増殖させた。次いで、長期貯蔵のために、1000μLの培養物を1000μLの滅菌86%グリセロールと混合し、-80℃で直ちに凍結した。このクローンの正確な産物発現を、小規模振盪フラスコ実験においてまず検証し、SDS-Pageで解析してから、10 L発酵槽に移した。

予備培養のために、4つの整流装置を備えた1000 mL三角フラスコ中のCDM 220 mLに、初代シードバンクアンプルのうちの0.9 mLを接種した。培養は、10〜12の光学密度 (578 nm) が得られるまで、ロータリーシェーカー上で37℃および170 rpmにて8時間行った。等量の細胞を用いて10 Lバイオリアクターのバッチ培地に接種するために、接種容量をV_接種 = 100 mL * 5 / OD_PCを用いて算出したが、これは予備培養物の光学濃度に依存する。

アミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンを伴わない発酵（実験番号12および実験番号13）:
10 L Biostat C, DCU3発酵槽 (Sartorius、Melsungen, Germany) 中での発酵のために、以下のバッチ培地を使用した：
KH₂PO₄ 1.58 g/L、(NH₄)₂HPO₄ 7.47 g/L、K2HPO4*3H2O 13.32 g/L、クエン酸2.07 g/L、L-メチオニン1.22 g/L、NaHCO₃ 0.82 g/L、微量元素溶液7.3 mL/L、MgSO₄*7H₂O 0.99 g/L、チアミン*HCl 20.9 mg/L、グルコース*H₂O 29.3 g/L、ビオチン0.2 mg/L、1.2 mL/L Synperonic 10%消泡剤。

全成分を脱イオン水中に溶解した。

無菌バッチ培地4.2 Lおよびそれぞれの接種容量から出発して、バッチ発酵を、31℃、pH 6.9±0.2、800 mバール背圧、および初期通気速度10 L/分で実施した。溶存酸素の相対値 (pO2) は、撹拌機のスピードを1500 rpmまで増加させることによって、発酵期間を通して50%に維持した。溶存酸素値の急増によって示される初期補充グルコースの枯渇後、温度を25℃に変化させ、その15分後に、発酵は両方の供給物（それぞれ60 g/hおよび14 g/h）の開始により流加モードに入った。供給物2の速度は一定に維持し、供給物1の速度は、7時間以内に60 g/hから最終的に160 g/hまでという所定の供給プロファイルを用いて段階的に増加させる。二酸化炭素の排気濃度が2%を超えるレベルとなった時点で、通気速度を5時間以内に10 L/分から20 L/分からまで一定に増加させた。光学密度がおよそ150の時点で、組換えIgA-プロテアーゼの発現を、2.4 g IPTGの添加により誘導した。光学密度の顕著な減少はないにもかかわらず、発酵は最長48時間まで行う。最後に、培養ブロスを4〜8℃まで冷却し、発酵槽容器内で一晩貯蔵する。翌日、発酵槽の内容物をフロースルー遠心分離機（13,000 rpm、13 L/h）で遠心分離し、さらに処理するまで、収集したバイオマスを-20℃で貯蔵した。合成されたIgA-プロテアーゼは、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体 (IB)の形態で、不溶性細胞残屑画分においてのみ見出される。

産物形成の解析：
1つは誘導前に、および他のものはタンパク質発現の誘導後の所定の時点において、発酵槽から採取された試料を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析する。すべての試料から、同量の細胞（OD_標的 = 10）を5 mLのPBS緩衝液中に再懸濁し、氷上で超音波処理により破壊する。次いで、100μLの各懸濁液を遠心分離し（15,000 rpm、5分間）、各上清を回収し、別々のバイアルに移す。これは、可溶性と不溶性の発現標的タンパク質を識別するためである。各上清（= 可溶性）画分に100μL、および各ペレット（= 不溶性）画分に200μLのSDS試料緩衝液 (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685) を添加する。試料を激しい混合下で95℃にて15分間加熱して、試料中の全タンパク質を可溶化しかつ還元する。室温まで冷却した後、各試料5μLを4〜20% TGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲル (Bio-Rad) に移す。加えて、5μLの分子量標準物質（Precision Plus Protein Standard、Bio-Rad）、および公知の産物タンパク質濃度（0.15μg/μL）を有する3つの量（0.3μL、0.6μL、および0.9μL）の定量化標準物質をゲル上に配置する。

電気泳動を200Vで60分間実行し、その後ゲルをGelDOC EZ Imager (Bio-Rad) に移し、UV照射により5分間処理した。Image Lab解析ソフトウェア (Bio-Rad) を用いて、ゲル画像を解析した。3つの標準物質を用いて、線形回帰曲線を係数＞0.99を用いて算出し、そこから元の試料中の標的タンパク質の濃度を算出した。

再折りたたみされ、かつ精製されたIgA-プロテアーゼの活性は、前駆体ポリペプチドである上記の分子テトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合ポリペプチドを用いて試験し、このIgAプロテアーゼを用いたインビトロでの酵素的切断により、該前駆体ポリペプチドからテトラネクチン‐アポリポタンパク質A-I融合ポリペプチドが放出された。切断活性は予測の範囲内であった。

結果：
上記の発酵工程を用いて、栄養要求性除去株CSPZ-6において、および大腸菌K12野生型株MG1655を表す原栄養性株CSPZ-9において、IgA-プロテアーゼタンパク質を発現させた。いずれの株もアミノ酸L-ロイシンおよびL-プロリンの供給を必要とせず、その結果としてそれらを培地および供給物から排除した。このことは、この工程のための物品のコストを劇的に削減する。

野生型株でありMG1655派生体であるCSPZ-9は、同じ既知組成培地および同じ培養条件下において、発酵の早い時期には栄養要求性除去株CSPZ-6と比較してより速い増殖を示した。接種の24時間後、光学密度はほぼ同じであった。しかしその後、両株の光学密度は驚くほど異なった。株CSPZ-9の増殖は培養の30時間後に顕著に減速し、供給物1の連続供給の結果として、培地中のグルコース濃度は16 g/Lまで上昇した。したがって、培養の37時間後に発酵を終了した。代謝産物の解析から、増殖速度の顕著な低下による、培地中のアンモニア、グルタミン酸、鉄、マグネシウム、および酢酸の濃度の顕著な上昇が明らかになった。両株の間で、最終的な光学密度は大きく異なる。除去株は362に達したのに対して、野生型株の光学密度は、24時間の時点での256という最大値から、発酵の終了時（37時間）のわずか177にまで減少した（図12を参照されたい）。

およそ150の光学密度の時点での2.4 g IPTGの添加によるタンパク質発現の誘導後、野生型株CSPZ-9と比較して、株CSPZ-6を用いた場合に、有意により多くのIgA-9roteaseが産生される（図13を参照されたい）。

まとめ：
栄養要求性除去株CSPZ-6は、他のアミノ酸を補充していない同じ既知組成発酵培地において、原栄養性野生型大腸菌株CSPZ-9（MG1655 ΔpyrF派生体）と比較して改善された増殖特性を示した。したがって、MG1655、W3110、またはBL21由来の原栄養性野生型大腸菌株派生体を使用する代わりに、既知組成最小培地において大腸菌株を培養できるようにし、そのような培地を使用する利点から恩恵を受けるために、高生産性大腸菌株からそのアミノ酸栄養要求性を除去することは有用である。

Claims

‐親原核細胞のアミノ酸栄養要求性を除去する（cure）核酸を該親原核細胞のゲノムに導入することによって、少なくとも1つのアミノ酸について栄養要求性である原核細胞から少なくとも1つのアミノ酸栄養要求性を除去する段階、
‐ポリペプチドをコードする1つまたは複数の核酸を含む、該アミノ酸栄養要求性除去原核細胞を、既知組成最小増殖培地中で培養する段階、および、該原核細胞もしくは該原核細胞のペリプラズムから、または該培地から該ポリペプチドを回収する段階
を含む、原核細胞において該ポリペプチドを生産するための方法であって、
栄養要求性除去原核生物株を用いたときの産物力価が、対応する原栄養性野生型株で得られ得る産物力価よりも高い、方法。
栄養要求性除去原核細胞の培養が、親の栄養要求性非除去原核細胞の培養に必要とされるものよりも1つまたは2つまたは3つまたは4つ少ないアミノ酸の、増殖培地への補充を必要とすることを特徴とする、請求項1記載の方法。
栄養要求性除去原核細胞が、少なくとも1つのさらなるアミノ酸栄養要求性を有することを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸が、培養中に添加されないことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
培養が、栄養要求性除去原核細胞において除去された栄養要求性に対応するアミノ酸の非存在下で行われることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
原核細胞が大腸菌細胞であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
ポリペプチドが、全長抗体鎖、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、scFv、scFab、または前記のうちの1つと非抗体ポリペプチドとのコンジュゲートであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
ポリペプチドが、scFvまたはscFabと細胞傷害性物質とのコンジュゲートであることを特徴とする、請求項7記載の方法。