JP6403190B2 - マイクロ流路構造体及び粒子の分離方法 - Google Patents

Description

本発明は、マイクロ流路構造体及びそのマイクロ流路構造体を用いた粒子の分離方法に関する。

診断医療、生化学研究、精密機械産業及び食品・化粧品製造等の様々な分野において、粒子をサイズによって分離する技術は必須とされており、この技術によれば、例えば、血液分析を行う際に白血球と赤血球を分離することや、血液中に存在する癌細胞を分離して選抜し、癌を早期発見することが可能となる。さらに、ｉＰＳ細胞等を用いた幹細胞生物学研究や再生医療において、特定の分化段階にある細胞を選抜する必要があり、また、単分散微粒子等の機能性マテリアルの合成等においてもサイズによる微粒子分離が必要であることからも、当該技術は必須とされている。

ここで、従来、粒子を分離する技術としては、マイクロ流路を用いた手法が提案されており、マイクロメートルサイズの粒子を分離可能とすることが期待されている。かかる分離の原理としては、磁場や電場を利用する手法、重力や遠心力を用いる手法、又は、流路内層流を利用する手法等が挙げられるが、これらの中でも特に、流路内層流を利用する手法では、単純に粒子の懸濁液を導入することにより粒子がサイズに基づき分離されることから、有用であると期待されている。

近年、このようなマイクロ流路構造体として、例えば下記非特許文献１〜３に記載されたものが知られている。下記非特許文献１に記載された構造では、狭隘部（ピンチ部）を有する流路内における粒子位置の差異を利用し、粒子をサイズに基づき分離することが図られている。下記非特許文献２に記載された構造では、一の主流路及び複数の分岐流路（枝流路）に粒子懸濁液を導入すると共に、分岐流路への流体導入量を制御することで、粒子をサイズに基づき分離することが図られている。下記非特許文献３に記載された構造では、流路内に複数のピラーを設置し、これらピラー間の距離や位相差を制御することによって粒子をサイズに基づき分離することが図られている。

また、下記特許文献１では、第一・第二分離流路が交差部でのみ互いに連通しており、流路に対する電位等の印加によって複数の物質を含む流体から目的物質を分離するデバイスおよび物質分離方法が記載されている。下記特許文献２では、所定の場所に配置された３Ｄストラクチャー表面に細胞親和性物質をコートすることで、目的細胞をある一定方向にローリングさせて目的細胞を分離する技術が記載されている。

特開２００８−１１９６７８号公報 国際公開第２０１３／０４９８６０号パンフレット

「アナリティカルケミストリー（Anal. Chem.）」，２００４，７６（１８），５４６５−５４７１ 「ラボ オン ア チップ（Lab Chip）」,２００５，５，１２３３−１２３９ 「サイエンス（Science）」，２００４，Ｖｏｌ．３０３ Ｎｏ．５６７３，９８７−９９０

ところで、上述したようなマイクロ流路構造体としては、前述（非特許文献１〜３）のように、例えば様々な分野にてマイクロメートルサイズ等の粒子を自由に分離可能とすることが期待される中、その分離精度（分離性能）が高いものが望まれている。

なお、特許文献１に記載のデバイスは、サイズに基づいた分離法ではなく、電場等の駆動力の印加に対する移動度の差を利用して物質を濃縮しているに過ぎない。さらに、電場等を印加しやすいよう第一・第二分離流路は同一平面上ではなく、延在方向に直交する方向にずれて配設され交差部で互いに連通しているが、サイズ分離に基づいた分離の場合同一平面上に互いの流路が配置されていることが必須であることからも全く異なる技術である。

また、特許文献２に記載の分離方法は、サイズに基づく分離とは原理が全く異なり、また一部サイズの違いを利用した分離に関する記載はあるが、原理や機構については一切記載が無く、また分離サイズを自由に設定可能な概念に関する記載もない。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、粒子をサイズに基づいて精度よく分離することが可能なマイクロ流路構造体及びそれを用いた分離方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するため、本発明に係るマイクロ流路構造体は、流体中の粒子をサイズに基づき分離するためのマイクロ流路構造体であって、所定方向における一方側から他方側へ前記流体を流通させる本体部と、本体部に流体を流入する入口部と、本体部から流体を流出させる出口部と、を備え、本体部は、所定方向に対し傾斜する第１傾斜方向に沿って延びると共に、本体部内に並設された複数の主流路と、上記の所定方向に対し第１傾斜方向とは反対側に傾斜する第２傾斜方向に沿って延びると共に、本体部内において主流路と交差するように並設された複数の枝流路と、を有し、主流路と複数の枝流路とは、本体部の同一平面上に存在し、所定方向に対する第１傾斜方向の傾斜角は、０°よりも大きく、４５°よりも小さい角度を有することを特徴とする。

このマイクロ流路構造体では、本体部において流体が全体的には所定方向に流れる中で、主流路及び枝流路の交差部にて非対称な流量分配が生じ、小さな粒子は枝流路に進入する一方、大きな粒子は主流路をそのまま流通する。このことが、複数の主流路及び複数の枝流路において繰り返され、その結果、大きな粒子については主流路が傾斜する側へと流通させながら、小さな粒子については枝流路が傾斜する側へと流通させることが可能となる。すなわち、複数の主流路及び複数の枝流路でもって粒子を連続的に分離させ、粒子を精度よく分離することが可能となる。

また、このマイクロ流路構造体において、複数の主流路における任意の主流路の幅と、その任意の主流路の任意の長さに対して第２傾斜方向側に設けられた枝流路の本数とによって、任意の主流路から第２傾斜方向側の枝流路へ導入する粒子のサイズが設定されると好適である。つまり、主流路の幅と、その主流路の任意の長さに対して第２傾斜方向側に設けられた枝流路の本数とを制御することで、主流路及び枝流路の交差部にて所望の流量分配を生じさせることができ、ある設定値よりも小さな粒子は枝流路に進入する一方、設定値よりも大きな粒子は主流路をそのまま流通する。このことが、複数の主流路及び複数の枝流路において繰り返され、その結果設定値よりも大きな粒子については主流路が傾斜する側へと流通させながら、設定値よりも小さな粒子については枝流路が傾斜する側へと流通させることが可能となる。すなわち、複数の主流路及び複数の枝流路で粒子を所望のサイズに基づいて連続的に精度よく分離することができる。

また、このマイクロ流路構造体において、複数の主流路における任意の主流路と任意の主流路に交差する一つの枝流路との交差部の中心である交差点Ａｐと、交差点Ａｐから所定方向の他方側へ延びる延長線と、任意の主流路に隣接し、且つ延長線に交差する他の主流路の中心線との交点である交差点Ｂｐと、交差点Ａｐを通る枝流路と交差点Ｂｐを通る他の主流路との交差部の中心である交差点Ｃｐと、を結ぶ三角形において、他の主流路における交差点Ｂｐと交差点Ｃｐとの間において第２傾斜方向側の枝流路の本数ｎは、２≦ｎ＜３３５６を満たす態様とすることができる。

また、このマイクロ流路構造体において、主流路と枝流路とは直交しており、主流路の幅Ｗ_０、主流路の第２傾斜方向側に設けられた枝流路の本数ｎ、枝流路の幅Ｗ_２、主流路の第２傾斜方向側で互いに隣接する枝流路同士の間隔ｄ、上記の所定方向に対する第１傾斜方向の傾斜角θ、及び枝流路の長さＬが以下の式１を満たすと共に、Ｌ＞Ｗ_０である態様とすることができる。

また、このマイクロ流路構造体において、主流路の幅は、流体中の粒子によって閉塞しない幅に設定されている態様とすることができる。

また、このマイクロ流路構造体の一態様として、本体部は、上記の所定方向における一方側に設けられ主流路及び枝流路に接続された第１境界流路と、主流路の並設方向に沿う一方側及び他方側の少なくとも何れかに設けられ、所定方向に沿って延びる第２境界流路とを有し、入口部は、第１境界流路に接続され粒子の懸濁液を導入する第１入口ポートと、第１境界流路に接続されバッファ液を導入する第２入口ポートとを有し、出口部は、流体を導出する複数の出口ポートを有し、出口ポートは、複数の主流路のうちの一部、及び複数の枝流路のうちの一部に接続されていると共に、主流路の並設方向に沿う方向に隣接して並ぶように設けられており、複数の出口ポートのうち第１傾斜方向側の端に位置する出口ポートに最も近接して開口した一端を有する主流路の他端が第１境界流路に開口している態様とすることができる。

また、このマイクロ流路構造体の具体的態様として、本体部は、所定方向における一方側に設けられ主流路及び枝流路に接続された第１境界流路を有し、入口部は、第１境界流路に接続され粒子の懸濁液を導入する第１入口ポートを有することが好適である。

このとき、入口部は、第１境界流路に接続されバッファ液を導入する１又は複数の第２入口ポートをさらに有することが好適である。この場合、導入したバッファ液によって、懸濁液ひいては粒子の流れを制御することが可能となる。さらに粒子の分離精度を高めるためには、入口部の第２入口ポートの少なくとも１つが第１入口ポートよりも第１傾斜方向側に配置されていることが好ましい。

また、出口部は、流体を導出する複数の出口ポートを有し、出口ポートは、複数の主流路のうちの一部及び複数の枝流路のうちの一部に接続されていると共に、主流路の並設方向に沿う方向に隣接して並ぶように設けられていることが好適である。この場合、例えば、複数の出口ポートのうち一部の出口ポートからはより大きな粒子を導出させて回収すると共に、他部の出口ポートからはより小さな粒子を導出させて回収することが可能となる。

また、好ましいとして、主流路及び枝流路の少なくとも一方は、その流路断面が矩形形状を呈する場合がある。さらにまた、好ましいとして、本体部は、主流路の並設方向に沿う方向の一方側及び他方側の少なくとも何れかに設けられ所定方向に沿って延びる第２境界流路を有する場合がある。

また、本発明は、上記のいずれかのマイクロ流路構造体を用いて流体中の粒子をサイズに基づき分離する粒子の分離方法である。

この分離方法において、入口部は、粒子の懸濁液を導入する第１入口ポートと、バッファ液を導入する第２入口ポートとを有し、第１入口ポートから導入される粒子の懸濁液の流量１．０に対し、第２入口ポートから導入されるバッファ液の流量が０．５以上とすることができる。

この粒子の分離方法において、入口部は、粒子の懸濁液を導入する第１入口ポートと、バッファ液を導入する第２入口ポートとを有し、第１入口ポートから粒子の懸濁液を導入し、複数の第２入口ポートを第１入口ポートの一方、及びまたは両側に設ける態様とすることができる。

また、上記の粒子が細胞であり、上記のマイクロ流路構造体を用いて流体中の細胞をサイズに基づき分離する態様とすることができる。

また、上記の粒子が細胞である場合において、血液又は細胞含有液をマイクロ流路構造体の入口部に導入する工程と、マイクロ流路構造体の出口部の一部から分離した細胞を採取する工程と、を含む態様とすることができる。

本発明によれば、粒子をサイズに基づいて精度よく分離することが可能となる。

一実施形態に係るマイクロ流路構造体を示し、概略正面側から見た斜視図である。 図１のマイクロ流路構造体における粒子の動きを説明する拡大図である。 一実施形態に係るマイクロ流路構造体の変形例を概略的に示す正面図である。 図１のマイクロ流路構造体において分離される粒子のサイズを説明する概略図である。 主流路幅Ｗ_０と枝流路本数ｎとで分離される粒子のサイズが制御可能であることを説明する概略図である。 第１傾斜角１５°の主流路を有し、主流路の第２傾斜方向側の枝流路本数ｎを変化させたマイクロ流路構造体による粒子分離実験の結果を示すグラフである。 第１傾斜角３０°の主流路を有し、主流路の第２傾斜方向側の枝流路本数ｎを変化させたマイクロ流路構造体による粒子分離実験の結果を示すグラフである。 第１傾斜角１５°の主流路を有し、主流路の第２傾斜方向側の枝流路本数ｎが一定のマイクロ流路構造体による血球分離実験の結果を示すグラフである。 第１傾斜角３０°の主流路を有し、主流路の第２傾斜方向側の枝流路本数ｎが一定の場合のマイクロ流路構造体による血球分離実験の結果を示すグラフである。 第１傾斜角４５°の主流路を有し、マイクロ流路構造体による粒子分離実験の結果を示すグラフである。 第１傾斜角４５°の主流路を有し、マイクロ流路構造体による血球分離実験の結果を示すグラフである。

以下、添付図面を参照して、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、以下の説明において、同一又は相当要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、左、右、上、下の語は図示する方向に基づいており便宜的なものである。

図１は一実施形態に係るマイクロ流路構造体を示す概略正面図であり、図２は図１のマイクロ流路構造体における粒子の動きを説明する拡大図である。また、図３は、本実施形態に係るマイクロ流路構造体の変形例の概略を示す正面図である。また、図４は図１のマイクロ流路構造体において分離される粒子のサイズを設定する概略図である。また、図５は主流路幅と枝流路本数ｎとで分離される粒子のサイズが制御可能であることを説明する概略図である。図１，２に示すように、本実施形態のマイクロ流路構造体１は、懸濁液中の粒子をサイズに基づき精度よく分離するものであって、いわゆる微粒子分級のための水力学的アレイフィルトレーションを構成する。

本明細書中、流体とは、粘性、密度、温度、ｐＨ、浸透圧比、イオン性など特に限定されるものではないが、例えば水、高分子含有液体、血漿、血液、体液、細胞含有液、培養液、タンパク液、生理食塩液などが挙げられ、再生医療への展開の観点からより好ましくは血液、細胞含有液や培養液であり、最も好ましくは血液及び細胞含有液である。

また、マイクロ流路構造体１に適用可能な粒子としては、特に限定されるものではないが、例えば、合成微粒子、磁気ナノ粒子、蛍光粒子、血球、細胞（動植物細胞、生細胞、死細胞、抗原特異性Ｔ細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、幹細胞、肝細胞、癌細胞、腫瘍細胞、希少細胞、グリア細胞、神経細胞、等々を含む）、ＤＮＡ、タンパク質、ウイルス、細胞核、ミトコンドリア、葉緑体、リソソーム、及び微生物等が挙げられる。

このマイクロ流路構造体１は、本体部２、入口部３及び出口部４を備えている。本体部２は、全体的な流れとして、所定方向Ａにおける一方側（図示上側）から他方側（図示下側）へ流体を流通させる。この本体部２は、所定方向Ａに長尺の板状外形を有しており、例えば、長手方向の長さが４ｃｍとされ、短手方向の長さが１．５ｃｍとされている。

この本体部２は、当該本体部２内にて平面的に構成されるように画設された流路として、主流路５、枝流路６、側部境界流路（第２境界流路）７及び入口側境界流路（第１境界流路）８を有している。主流路５は、所定方向Ａに対して傾斜する第１傾斜方向Ｂに沿って、枝流路６と同一平面上で直線状に延在している。換言すると、主流路５は、所定方向Ａに延びながら、下流側に行くに従って本体部２の短手方向の一側部側（図示右側）へ傾斜している。

所定方向Ａに対する第１傾斜方向Ｂの傾斜角θは、粒子を精度よく分離させるために好ましいとして、０°よりも大きく４５°よりも小さい角度とされている。この理由については、後述する。主流路５は、本体部２における上流側（所定方向Ａの一方側）の端部及び短手方向の両側部以外の領域にて、一例として一定間隔で並設されている。ここでの主流路５は、一例として、その流路断面が矩形形状を呈している。また、主流路５の幅Ｗ_０は、流体中の粒子によって閉塞しない幅である。

なお、主流路５の本数は任意に設定可能であるが、例えば、後述の変形例に係るマイクロ流路構造体１Ａ（図４参照）のように、主流路５同士の間隔が一定で、分離精度の観点から、第１傾斜方向Ｂ側の端に位置する出口ポート１２_６に最も近接して開口した端部（一端）５ａを有する主流路５の他端５ｂが、入口側境界流路８に開口する態様では、入口側境界流路（第１境界流路）８に開口している主流路５が４本以上存在することが好ましく、さらに分離精度向上させるためには６本以上、最も好ましくは１０本以上であることが好ましい。

枝流路６は、所定方向Ａに対し第１傾斜方向Ｂとは反対側に傾斜する第２傾斜方向Ｃに沿って、直線状に延在している。換言すると、枝流路６は、所定方向Ａに延びながら、下流側に行くに従って本体部２の短手方向の他側部側（図示左側）へ傾斜している。

枝流路６は、主流路５から分岐して隣接する主流路５を繋ぐように延びる分岐流路を構成する。具体的には、枝流路６は、本体部２における上流側の端部及び短手方向の両側部以外の領域にて、主流路５と交差されており、全ての枝流路６が主流路５と完全に交差されていなくとも良く、枝流路６の一部が主流路５と交差された状態でも良い。但し、分離精度と効率の観点からすると、主流路５と枝流路６とは完全に交差していることがより好ましい。

主流路５と複数の枝流路６が本体部２の同一平面上に存在するとは、概略平面状の部材の一面に主流路５と枝流路６とが設けられていることを意味する。従って、立体である一つの部材の一面側から他面側に亘って各流路が設けられている状態や、複数の部材に各流路が設けられ、流路が対面している状態を意味しない。主流路５の深さとそれに直接接続された枝流路６の深さとは、実質的に一致しているのが好ましい。深さは本体部２内全てで一定でなく段階的に変動しても良いが、製造上の観点から全て一定であることがより好ましい。

なお、主流路５及び枝流路６の流路断面の形状は特に限定されるものではなく、例えば半円弧形状としてもよい。しかし、主流路５から枝流路６へ導入される流量を精度良く制御する上で、主流路５及び枝流路６の少なくとも一方は、その流路断面が矩形形状を呈することが好ましく、より好ましくは主流路５及び枝流路６の両方が矩形形状を呈することである。

また、枝流路６は、主流路５と必ずしも直交していなくともよいが、直交している方がサイズに基づいた分離設計が容易であるためより好ましい。加えて、枝流路６は本体部２において常に一定間隔で並設されていなくともよく、例えば段階的に間隔が変動してもよいが、製造容易の点からすると一定間隔の方がより好ましい。

側部境界流路７は、本体部２の境界領域の流路を構成するものであり、主流路５の並設方向に沿う一方側及び他方側の両方に設けられ、所定方向Ａに沿って延びる流路である。具体的には、本体部２の短手方向の両側部にて所定方向Ａに沿って直線状に延在している。側部境界流路７は、主流路５及び枝流路６に接続されて連通されている。ここでの側部境界流路７は、主流路５及び枝流路６と同様に、その流路断面が矩形形状を呈している。なお、側部境界流路７は、主流路５及び枝流路６の少なくとも一方に対し連通されない場合もある。また、本実施形態に係る側部境界流路７は、主流路５の並設方向に沿う一方側及び他方側の両方に設けられているが、どちらか一方側にのみ設けるようにしてもよい。

入口側境界流路８は、所定方向Ａにおける一方側に設けられ主流路５及び枝流路６に接続された流路であり、具体的には、本体部２における上流側の端部に設けられ、主流路５と枝流路６と側部境界流路７とに接続されて連通されている。

入口部３は、本体部２に流体を流入するものであり、本体部２の所定方向Ａの一方側に設けられている。この入口部３は、第１入口ポート９と、複数（ここでは、２つ）の第２入口ポート１０，１１と、を有している。第１入口ポート９は、粒子の懸濁液を導入する導入口である。第１入口ポート９は、入口側境界流路８において、短手方向の中央部他側部寄りの位置に接続されて連通されている。また、第１入口ポート９は、直線状に延びる導入流路９ｘを含んでいる。

第２入口ポート１０，１１は、バッファ液を導入する導入口である。これら第２入口ポート１０，１１は、第１入口ポート９を短手方向に挟むように配設されている。具体的には、第２入口ポート１０は、入口側境界流路８において第１入口ポート９よりも他側部側の位置に接続されて連通されていると共に、第２入口ポート１１は、入口側境界流路８において第１入口ポート９よりも一側部側の位置に接続されて連通されている。また、第２入口ポート１０は、直線状に延びる導入流路１０ｘを含んでいる一方、第２入口ポート１１は、下流側に向かって分岐（ここでは、四分岐）する導入流路１１ｘを含んでいる。なお、本実施形態では、第１入口ポート９の両側に第２入口ポート１０，１１を設ける態様にて説明するが、第１入口ポート９の一方側にのみ第２入口ポート１０または第２入口ポート１１を設ける態様であっても良い。

また、第１入口ポート９、第２入口ポート１０、１１の入口側境界流路８へ接続される位置は特に限定するものではないが、例えば第２入口ポート１０ｘは出口ポート１２_１、第１入口ポート９ｘは出口ポート１２_２、第２入口ポート１１ｘ（ここでは四分岐）の４つが夫々出口ポート１２_３、１２_４、１２_５、１２_６、から所定方向Ａに対して対面に位置することで、本体部２を流れる流体が入口部３から出口部４に向って均等に流れやすくなる為好ましい。

出口部４は、バッファ液を含む懸濁液としての流体を本体部２から流出させるものであり、本体部２の所定方向Ａの他端側に設けられている。この出口部４は、複数（ここでは、６つ）の出口ポート１２_１〜１２_６を有している。複数の出口ポート１２_１〜１２_６は、流体を分けて導出する導出口であって、流体中に分散した粒子をサイズ毎に分離して導出可能にする。

また、複数の出口ポート１２_１〜１２_６は、場合によっては複数の出口ポート１２_１〜１２_６の導出先で統合し、回収出口の穴数を低減させることで、製造し易くかつ効率よく回収することもできる。加えて、複数の出口ポート１２_１〜１２_６（ここでは６つ）の導出先の流路幅、深さや長さを調節することによって各出口からの流量比を制御し、粒子の分離精度や効率を設定することも可能である。

これらの出口ポート１２_１〜１２_６は、本体部２の短手方向（主流路５の並設方向に沿う方向）に隙間なく隣接して並ぶように配設されており、複数の主流路５のうちの一部及び複数の枝流路６のうちの一部にそれぞれ接続されている。

次に、所定方向Ａ、主流路５の第１傾斜方向Ｂ、及び枝流路６の第２傾斜方向Ｃと粒子のサイズの制御との相関について説明する。なお、以下の説明において、主流路５の第１傾斜方向Ｂが所定方向Ａに対して短手方向の一側部側（図示右側）を向く場合、つまり、第１傾斜方向Ｂが所定方向Ａを基準にして第２傾斜方向Ｃとは反対側を向く場合、第１傾斜方向Ｂの傾斜角（以下、「第１傾斜角」という）θは正であり、所定方向Ａと同方向の場合は“０°”、所定方向Ａを基準にして第２傾斜方向Ｃと同じ側を向く場合は第１傾斜角θは負であることを前提として説明する。

第１傾斜角θは、粒子の懸濁液を導入する第１入口ポート９とバッファ液を導入する第２入口ポート１０、１１の入口側境界流路８へ導入される流量が等しい場合、第１傾斜角θが小さい方（０°に近い方）が、粒子は主流路５へ流れ易いため、小さい粒子の出口は、第１傾斜角θが大きい場合に比べて第１傾斜方向Ｂ寄りの出口ポートへシフトする。

しかし、このような場合においても、第２入口ポート１１の入口側境界流路８へ導入される流量を、第１入口ポート９及びバッファ液を導入する第２入口ポート１０に対して相対的に大きくすることで、小さい粒子の出口を第２傾斜方向Ｃ寄りの出口ポートへシフトさせることができる。但し、第１傾斜角θが０°以下の場合、主流路５が第２傾斜方向Ｃ側に延伸するため、何れの入口ポート９、１０、１１の流量を制御しても全ての粒子が第２傾斜方向Ｃ寄りの出口ポートから導出されて分離ができない。従って、第１傾斜角θは０°よりも大きいことが好ましい。

一方で、第１傾斜角θが０°より大きい場合、粒子は枝流路６へ流れ易くなるため、枝流路６の幅より小さい粒子は枝流路６へ導入され易くなり、大きい粒子の出口は第２傾斜方向Ｃ寄りの出口ポートへシフトする。しかし、第２入口ポート１０の入口側境界流路８へ導入される流量を第１入口ポート９及び第２入口ポート１１に対して相対的に大きくすることで、大きい粒子の出口を第１傾斜方向Ｂ寄りの出口ポートへシフトさせることができる。但し、第１傾斜角θが４５°以上になると第２入口ポート１０の流量を大きくしても枝流路６への粒子の導入を抑制できなくなるため、枝流路６の幅より小さい粒子の大部分が枝流路６へ導入されるようになり、全ての粒子が第２傾斜方向Ｃ寄りの出口ポートから導出され分離できない。

以上より、所定方向Ａに対する第１傾斜角θは、０°よりも大きく４５°よりも小さいことが必要である。また、第１傾斜角θが小さいほど本体部２が所定方向Ａに長くなるため、製造し難くなると同時に大量処理の目的で複数のマイクロ流路構造体１を並列化した場合にスペースの有効利用が難しくなる。従って、第１傾斜角θは５°以上、４０°以下がより好ましく、さらに好ましくは１０°以上３５°以下、最も好ましくは１５°以上３０°以下である。

なお、大きい粒子を第１傾斜方向Ｂ寄りの出口ポートから導出して分離精度を上げるためには、図３に示された変形例に係るマイクロ流路構造体１Ａが好ましい。マイクロ流路構造体１Ａの場合、複数の出口ポート１２_１〜１２_６のうち、第１傾斜方向Ｂ側の端に位置する出口ポート１２_６に最も近接して開口した一端５ａを有する主流路５の他端５ｂが、入口側境界流路（第１境界流路）８に開口している。

次に、図４、及び図５を参照して、サイズに基づいた粒子の分離について説明する。なお、上記のマイクロ流路構造体１とマイクロ流路構造体１Ａとの基本的な原理は同じであるため、以下の説明ではマイクロ流路構造体１に基づいて説明する。

サイズに基づいた粒子の分離は、主流路５の幅Ｗ_０（図５（ａ）参照）と、主流路５の第２傾斜方向Ｃ側に設けられた枝流路６の本数ｎ（図５（ｂ）参照）とによって設定される。具体的には、複数の主流路５、及び複数の枝流路６が同じ条件（幅や形など）で形成されていると仮定する。ここで、複数の主流路５のうち、任意の主流路５を基準の主流路５として特定し、さらに、基準の主流路５の任意の長さを基準長さＤｂとして特定する。さらに、基準の主流路５の基準長さＤｂに対して第２傾斜方向Ｃ側に設けられた枝流路６の本数ｎを設定することでサイズに基づいた粒子の分離が可能になる。なお、基準の主流路５の基準長さＤｂに対しての第２傾斜方向Ｃ側に設けられた枝流路６の本数ｎとは、基準の主流路５に全ての枝流路６が交差している場合、基準長さＤｂの範囲で主流路５に交差する枝流路６の本数ｎと考えることもできる。

ここで、例えば、主流路５を流れる流体が層流である場合、主流路５を流れる流体の速度分布は図４に示す様に放物線を示す。この時、枝流路６に導入される粒子Ｐｓの最大半径をＷ_１、主流路５を流れる流量をＱ_０、枝流路６への導入流量Ｑ_１とするとき、Ｑ_０に対するＱ_１の比は放物線の面積Ｓ_１＋Ｓ_２に対するＳ_１の比に等しいといえる。すなわち、Ｑ_０：Ｑ_１＝Ｓ_１＋Ｓ_２：Ｓ_１である。ここで、Ｓ_１を０からＷ_１までを範囲とした放物線の積分値とし、Ｓ_１＋Ｓ_２を０からＷ_０までを範囲とした放物線の積分値とし、Ｑ_０を１００％とした時にＱ_１へ導入される割合をＱ_１％とすると、以下の（式Ｉ）が導出される。

例えばマイクロ流路構造体１において、本体部２を流れる流体が入口部３から出口部４に向って均等に流れるとした場合、図４において枝流路６を流れる流量Ｑ₁は、粒子が任意のある主流路５から第２傾斜方向Ｃ側の次の主流路５へ到達するために最低通過しなければならない枝流路６の本数ｎに反比例することと言える。すなわち、以下の（式ＩＩ）が成り立つ。

これは、例えば主流路５の幅Ｗ_０が一定の場合、枝流路６の幅に関係なく主流路５の第２傾斜方向Ｃ側に設けられた枝流路本数ｎが多いほど一つの枝流路６への導入量が少なくなるため、枝流路６へ導入される粒子のサイズは小さくなり、逆に主流路５へ接続される枝流路本数ｎが少ないほど一つの枝流路６への導入量が多くなり、枝流路６へ導入される粒子は大きくなることを表す。

さらに例を挙げると、主流路５へ接続される枝流路本数ｎが一定の場合、主流路５の幅Ｗ_０が大きいほど一つの枝流路６への導入量が多くなるため、枝流路６へ導入される粒子は大きくなり、逆に主流路５の幅Ｗ_０が小さいほど枝流路６へ導入される粒子は小さくなる。従って、Ｑ_０を１００％とした時に式Ｉと式ＩＩより、式ＩＩＩが導出される。

この式ＩＩＩにより、主流路５から枝流路６へ導入される粒子のサイズは主流路幅Ｗ_０と主流路５へ接続される枝流路本数ｎによって自由に設定可能と言える。但し、設計上設定した主流路幅Ｗ_０や枝流路本数ｎは製造技術上ある誤差範囲を持って製造されることに加え、実質的な適用範囲が存在し、その範囲内で式ＩＩＩは成立する。例えば、式ＩＩＩから算出されたｎに対して、実際の製造上の精度からｎの値は１０％程度の誤差範囲を持っているため、式ＩＩＩから算出されたｎはｎ×０．９以上、ｎ×１．１以下の自然数の範囲となる。

主流路５を流れる流体が層流を形成する限り主流路５内の速度分布は放物線を描き式ＩＩＩが成立する。一般的にマイクロ流路内ではレイノルズ数が約１．０以下の層流であるため主流路幅Ｗ_０は特に限定されないが、層流を形成するための主流路幅Ｗ_０の範囲について説明する。

主流路５へ導入される流体の導入圧力Ｐを０．１〜１．０気圧とする。これは実際に流体を流す際に主流路５の端点間に生じる圧力差の最小、最大範囲を反映している。

初めに導入圧力０．１気圧とし、流体は水とし、粘度μ＝１（ｍＰａ・ｓｅｃ）、比重ρ＝１×１０^３（ｋｇｍ^−３）とする。流路は計算上円管とする。円管の直径ｄ_５（ｍ）、主流路５の長さＬ_５は主流路幅Ｗ_０である円管直径ｄ_５のおよそ１，０００倍（Ｌ_５＝１，０００ｄ_５）であるため、円管直径ｄ_５、円管の長さＬ_５＝１０００ｄ_５の流路を流れる流量は、ハーゲンポアズイユの式より、ΔＰ＝１２８×μ×Ｌ×Ｑ／（π×ｄ_５ ^４）であることから、流量Ｑ＝７８．１２５×π×ｄ_５ ^３（ｍ^３／ｓｅｃ）である。

これを円管断面積で除して平均線速度ｖに換算するとｖ＝３１２．５ｄ_５（ｍ／ｓｅｃ）となる。この時のレイノルズ数Ｒｅ＝ρ×ｖ×ｄ_５／μより、Ｒｅ＝３．１２５×１０^８×ｄ_５ ^２である。層流となる最大のレイノルズ数２，０００とすると、この時の円管直径ｄ_５＝２．５ｍｍより、主流路幅Ｗ_０は２．５ｍｍ未満であることが好ましい。実際に用いられる矩形流路において、主流路幅２５μｍ、主流路深さ２０μｍの場合のレイノルズ数Ｒｅ＝０．１９６、円管直径２５μｍのレイノルズ数Ｒｅ＝０１９５であり、矩形形状と円管形状でレイノルズ数に大きな乖離はなく、共に層流の範囲内である。

また、ここで主流路５の長さＬ_５＝１，０００ｄ_５としたが、例えば主流路長（Ｌ_５）が短い５００ｄ_５の時、レイノルズ数２，０００未満となる主流路幅は１．８ｍｍ未満であり、逆に主流路長が長い２，０００ｄ_５の時は３．６ｍｍ未満となる。さらに、粒子懸濁液を導入する流量を２倍にした場合、導入圧力Ｐ＝０．２気圧となり、Ｌ_５＝２，０００ｄ_５の時のレイノルズ数２，０００未満の主流路幅Ｗ_０は２．５ｍｍ未満、Ｌ_５＝１，０００ｄ_５の時は１．８ｍｍ未満、Ｌ_５＝５００ｄ_５の時は１．３ｍｍ未満となる。想定される最大導入圧力Ｐ＝１．０気圧の時、Ｌ_５＝２，０００ｄ_５の時のレイノルズ数２，０００未満の主流路幅Ｗ_０は１．１ｍｍ未満、Ｌ_５＝１，０００ｄ_５の時は０．８ｍｍ未満、Ｌ_５＝５００ｄ_５の時は０．６ｍｍ未満となる。

主流路幅Ｗ_０の下限は、実用上の観点からすると流体中を流れる粒子の最大直径より大きい必要がある。すなわち、Ｗ_０≧２Ｗ_１であることが好ましい。以上より、主流路幅Ｗ_０は２Ｗ_１以上３．６ｍｍ未満が層流であるために好ましく、より好ましくは２Ｗ１以上２．５ｍｍ未満、さらに好ましくは２Ｗ１以上１．１ｍｍ未満、最も好ましくは２Ｗ１以上０．８ｍｍ未満である。この範囲内であれば式ＩＩＩを満たす。

前述に加えて、例えばＷ_０＝１００Ｗ_１の様に分離する最大粒子半径のサイズに対して著しく主流路幅Ｗ_０が大きい場合、大量処理の目的で複数のマイクロ流路構造体を並列化した際にスペースを有効利用できないため好ましくない。よって、２Ｗ_１≦Ｗ_０＜１００Ｗ_１すなわち任意の主流路５に接続された枝流路本数ｎは２以上３，３５６未満（２≦ｎ＜３３５６）であることが好ましく、さらに好ましくは２Ｗ_１≦Ｗ_０＜８０Ｗ_１つまりｎは２以上２，１５１未満、最も好ましくは２Ｗ_１≦Ｗ_０＜５０Ｗ_１つまりｎは２以上８４５未満である。

さらに枝流路本数ｎについて詳述する。最初に、例えば、図５（ｂ）に示されるように、複数の主流路５における任意の主流路５と、この主流路５に交差する一つの枝流路６との交差部のおおよその中心点を交差点Ａｐ（図５（ｂ）参照）として特定する。次に、交差点Ａｐから所定方向Ａの他方側へ延びる延長線Ａｒと、任意の主流路５に隣接し、且つ延長線Ａｒに交差する他の主流路５の中心線との交点である交差点Ｂｐを特定する。次に、交差部Ａｐを通る枝流路６と交差部Ｂｐを通る他の主流路５との交差部のおおよその中心である交差点Ｃｐを特定し、交差点Ａｐ，Ｂｐ，Ｃｐを直線で結んで三角形Ｔを特定する。ここで、他の主流路５における交差点Ｂｐと交差点Ｃｐとの間において第２傾斜方向Ｃ側に設けられた枝流路の本数ｎは、上記の枝流路本数ｎに相当する。

さらに、枝流路６の幅Ｗ_２は任意に設定可能であるが、枝流路６に導入したい粒子の最大直径よりも大きい幅に設定することが好ましく、主流路幅Ｗ_０よりも小さい幅であることが好ましい。また使用する製造装置のスペックに因るが、例えば流路の幅に対する流路の深さの比をいうアスペクト比が２未満である必要がある場合、枝流路６の幅は深さの２分の１以上である必要がある。つまり枝流路６の幅Ｗ_２は、２Ｗ_０以上かつ枝流路の深さをアスペクト比で除した値以上であることが好ましい。

前述した枝流路６と主流路５が直交する場合、図５（ｂ）で示すように枝流路６の長さＬ、第１傾斜角θ、主流路５の第２傾斜方向Ｃ側に設けられた枝流路６の本数ｎ、枝流路６の幅Ｗ_２、主流路５の第２傾斜方向Ｃ側で互いに隣接する枝流路６同士の間隔ｄ、枝流路本数ｎ、とすると三角関数より、以下の式ＩＶが成り立つ。

この時のＬは主流路幅Ｗ_０よりも大きいと好ましい。例えば血球のような数十ミクロンのサイズを分離するような場合、本体部２のサイズ全体をコンパクトにし、複数の本体部２を併用する場合でもスペースを有効利用する観点で、Ｌは、約１ｃｍ未満程度であることが好ましい。

上述の実施形態のマイクロ流路構造体１の材質としては、好ましいものとして、シリコーンゴムの一種であるＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を用いることができ、この場合、例えばプラズマを用いて活性化させることによって他の部材（ガラス等）に容易に接合させることが可能となる。なお、マイクロ流路構造体１の材質としては、特に限定されるものではなく、例えば、ＰＤＭＳ／ガラスの他に、アクリル等の各種ポリマー材料、シリコン、セラミクス、金属（ステンレス等）を用いることができ、或いは、これらの材料を単体で又は組み合わせて用いることも可能である。

また、マイクロ流路構造体１は、一例として、ソフトリソグラフィ（つまり、フォトリソグラフィプロセスでパターニングした微細構造を鋳型とするモールディング）によって作製することができる。なお、マイクロ流路構造体１の作製方法としては、限定されるものではなく、例えば、その他のモールディング、エンボッシング、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、電子線直接描画、機械加工等を用いることができる。

上述のマイクロ流路構造体１では、以下に例示するように、微細な流路内に形成された層流を用いつつ、細胞を正確・簡便かつ効率的に分離可能となる。なお、変形例に係るマイクロ流路構造体１Ａも実質的に同様の作用、効果を奏する。

図１に示すように、血液又は細胞含有液を第１入口ポート９から連続的に導入すると共に、バッファ液を第２入口ポート１０，１１から連続的に導入する。これにより、本体部２において全体的な流れは所定方向Ａとなるが、各交差点（各格子点又は各分岐点とも称す）では、非対称な流量分配が生じる。そのため、図２に示すように、血液又は細胞含有液中の小さな細胞ＰＳについては、Ｓ字運動で流動する。具体的には、枝流路６から主流路５に進入し該主流路５を流れた後に再び、枝流路６に進入する。一方、血液又は細胞含有液中の大きな細胞Ｐ_Ｂについては、枝流路６へ進入することなく、主流路５をそのまま直進する。

より具体的には、図４に示すように、例えば、枝流路６へ引き抜かれて流入する流体幅Ｗ_１よりも細胞半径ｒ_ｐが大きい（ｒ_ｐ＞Ｗ_１となる）細胞Ｐ_Ｂは、各分岐点において枝流路６に導入されることなく主流路５を直進する。一方で、細胞半径ｒ_ｐが流体幅Ｗ_１以下の（ｒ_ｐ≦Ｗ_１となる）細胞Ｐ_Ｓは、各分岐点においてＳ字運動で流動することとなる。

なお、例えば、主流路５及び枝流路６の傾斜角度及び本数密度比をそれぞれ一定の値とした上で、主流路５の幅を増加させると、枝流路６へ引き抜かれて流入する流体幅Ｗ_１を増加させることができ、より大きな粒子を枝流路６へ分画させることができる。また、例えば、主流路５及び枝流路６の傾斜角度及び流路幅をそれぞれ一定の値とした上で、枝流路６の本数密度比を増加させると、枝流路６へ引き抜かれて流入するＷ_１を減少させることができ、より小さな粒子のみを枝流路６へ分画させることができる。このように主流路５の流路幅、並びに、主流路５及び枝流路６の本数密度比等を適宜設定し、流体幅Ｗ_１を増減させることにより、分離する粒子のサイズを制御することができる。

ちなみに、理論的には、例えば、主流路５の幅が２５μｍ、主流路５及び枝流路６の本数密度比が１：４０である場合、Ｗ１はおよそ２．５μｍとなり、直径５μｍより小さい粒子Ｐ_Ｂは枝流路６へと分離されると考えられる。

このことが、複数の主流路５及び複数の枝流路６において繰り返され、その結果、図２に示すように、ある一定の大きさの細胞Ｐ_Ｂについては、全体の流れから分離され、主流路５でもって図示右下方向（主流路５が傾斜する側）へと流通し、小さい細胞Ｐ_Ｓから分離される。そして、複数の出口ポート１２_１〜１２_６の中の図示右側（出口ポート１２_６、出口ポート１２_５，１２_６、若しくは出口ポート１２_４〜１２_６）から導出される。

これと同時に、小さな細胞Ｐ_Ｓについては、全体の流れから分離され、枝流路６でもって左下方向（枝流路６が傾斜する側）へと流通し、大きい細胞Ｐ_Ｂから分離される。そして、複数の出口ポート１２_１〜１２_６の中の図示左側（出口ポート１２_１、出口ポート１２_１，１２_２、若しくは出口ポート１２_１〜１２_３）から導出される。

より高処理量で粒子を分離する場合は、２次元的な並列化に加えて、マイクロ流路構造体１を３次元的に積層することによって高処理量実現の可能性が期待できる。

また、マイクロ流路構造体１を用いて粒子の分離を行う場合、第１入口ポート９ｘから入口側境界流路（第１境界流路）８へ導入される粒子の懸濁液の流量を１．０とした時に、第２入口ポート１０ｘ、１１ｘ（ここでは四つ）の各入口ポートから入口側境界流路（第１境界流路）８へ導入されるバッファ液の流量が０．５以上であることが好ましく、より分離精度を向上するには１１ｘの各流量を１．０以上にすることが好ましく、分離精度に加えて分離効率もより向上するには、１０ｘ、１１ｘ全ての各流量を１．０以上とすることが好ましい。

また、例えば異物が混入している流体や、血液の様な凝集しやすい流体中の粒子を分離する場合、異物や凝集物が主流路５や枝流路６に導入されないよう、入口側境界流路８に粗いフィルターの様な機能が付与されていることが好ましい。特に形状や構造が限定されるものではないが、具体的には柱のようなピンを立てたメッシュ構造が用いられる。

ちなみに、上記実施形態は、一例としてサイズに基づき２種類の粒子を分離したが、例えば主流路５及び枝流路６の傾斜格子構造を適宜設定することにより、３種類以上の粒子を多段階的に分離することも可能である。また、例えば左右線対称な傾斜格子構造を用いることにより、分離する粒子を効率的に濃縮することも可能となる。このような点においても、上記実施形態では、診断医療等で必要となる量の細胞を効率的に分離、回収可能となる。

以上、本実施形態、及び変形例に係るマイクロ流路構造体１、１Ａを説明したが、これらのマイクロ流路構造体１、１Ａ、及び、これらを用いた粒子の分離方法によれば、本体部２において流体が全体的には所定方向Ａに流れる中で、主流路５及び枝流路６の交差部にて非対称な流量分配が生じ、小さな粒子は枝流路６に進入する一方、大きな粒子は主流路５をそのまま流通する。このことが、複数の主流路５及び複数の枝流路６において繰り返され、その結果、大きな粒子については主流路５が傾斜する側へと流通させながら、小さな粒子については枝流路６が傾斜する側へと流通させることが可能となる。すなわち、複数の主流路５及び複数の枝流路６でもって粒子を連続的に分離させ、粒子を精度よく分離することが可能となる。

また、本実施形態では、複数の主流路５における任意の主流路５の幅Ｗ_０と、その任意の主流路５の任意の長さ（基準長さ）Ｄｂに対して第２傾斜方向Ｃ側に設けられた枝流路６の本数とによって、任意の主流路５から第２傾斜方向Ｃ側の枝流路６へ導入する粒子のサイズが設定されるので好適である。つまり、主流路５の幅Ｗ_０と、その主流路Ｗ_０の任意の長さ（基準長さ）Ｄｂに対して第２傾斜方向Ｃ側に設けられた枝流路６の本数ｎとを制御することで、主流路５及び枝流路６の交差部にて所望の流量分配を生じさせることができ、ある設定値よりも小さな粒子は枝流路６に進入する一方、設定値よりも大きな粒子は主流路５をそのまま流通する。このことが、複数の主流路５及び複数の枝流路６において繰り返され、その結果設定値よりも大きな粒子については主流路５が傾斜する側へと流通させながら、設定値よりも小さな粒子については枝流路６が傾斜する側へと流通させることが可能となる。すなわち、複数の主流路５及び複数の枝流路６で粒子を所望のサイズに基づいて連続的に精度よく分離することができる。

また、本実施形態に係る粒子の分離方法では、第１入口ポート９から導入される粒子の懸濁液の流量１．０に対し、第２入口ポート１０，１１から入口側境界流路（第１境界流路）８へ導入されるバッファ液の流量が０．５以上とすることができる。なお、本実施形態では、第２入口ポート１０，１１を第１入口ポート９の両側に設けていたが、どちらか一方だけであってもよい。

また、分離される粒子を細胞として細胞を分離する方法（粒子の分離方法）とすることもできる。この細胞を分離する方法において、血液又は細胞含有液をマイクロ流路構造体１，１Ａの入口部３に導入する工程と、マイクロ流路構造体１，１Ａの出口部４の一部から分離した細胞を採取する工程と、を含む態様とすることもできる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

なお、本発明において、主流路幅と枝流路本数とを制御することで、分離される粒子のサイズを自由に設定可能であるが、特に、前述の主流路幅の範囲内であれば層流となるため、式ＩＩＩが成立して枝流路本数の制御によって粒子のサイズを設定可能である。したがって以下の実施例は代表の一つとして主流路幅２５μｍでの結果を示すこととする。なお、各実施例、比較例に係るマイクロ流路構造体の仕様は、表１に示した。

［実施例１］
上述の実施形態に対応したマイクロ流路構造体１（実施例１）を用いて、蛍光粒子の分離実験を行った。ここで、主流路５の第１傾斜角θ１５°、主流路５の流路幅（主流路幅）２５μｍ、枝流路６の流路幅（枝流路幅）１５μｍ、枝流路の間隔２０μｍとした。主流路５及び枝流路６の流路深さ（高さ）は、ともに２５μｍとした。主流路５及び枝流路６は互いに常に直交するように形成し、枝流路本数ｎは３５、１００の間で変化させた。以上より、任意の主流路５に交差する枝流路本数ｎ、つまり任意の主流路５の第２傾斜方向側に設けられた枝流路本数ｎを３５、１００の間で変化させる実験を行った。

実施例１に係るマイクロ流路構造体１に対し、第１入口ポート９から懸濁液を２０μＬ／ｍｉｎで連続的に導入すると共に、その両側の第２入口ポート１０，１１からバッファ液を２０μＬ／ｍｉｎ及び８０μＬ／ｍｉｎでそれぞれ連続的に導入した。粒子としては直径３．０μｍ、及び直径９．９μｍの蛍光粒子を用い、一部直径４．８μｍの蛍光粒子も用いた。バッファ液としては０．５％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液（オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を用いた。その結果を図６に示す。なお、図６は、粒子分離実験の結果を示すグラフである。

図６において、枝流路本数ｎが３５の場合の結果、及び枝流路本数ｎが１００の場合の結果を表している。なお、横軸の数字のそれぞれは、出口ポート１２_１〜１２_６に対応している（図７〜図１１において同様）。

まず、枝流路本数ｎ３５の場合、上述の式ＩＩＩに基づいて分離される粒子サイズが直径５．０μｍとなるように設定し、本実験によって検証した。本実験の結果、図６に示すように、５．０μｍよりも小さい４．８μｍの粒子は出口２及び３から約８０％導出され、９．９μｍの粒子は出口５から７０％以上導出されており、設定したサイズに応じた粒子の分離が認められた。

次に、同じ条件で、枝流路本数ｎのみを１００に変更し、分離される粒子サイズが直径３．０μｍとなるように設定して実験した。その結果、図６に示すように、ほぼ同サイズの３．０μｍの粒子は出口２及び３より９０％以上導出され、４．８μｍの粒子は出口４及び５から約７６％導出され、９．９μｍの粒子は出口６から約８４％導出されており、３種類の粒子が夫々に異なる出口から分離可能であった。

［実施例２］
主流路５の傾斜角θ３０°、枝流路本数ｎ４１と１００を用いた以外は実施例１と同様の実験を行った。実施例２の結果を図７に示す。

まず、枝流路本数ｎが４１の場合、上述の式ＩＩＩに基づいて分離される粒子サイズが直径４．５μｍとなるように設定して実験した。その結果、図７に示すように、４．５μｍよりも小さい３．０μｍの粒子は出口１から約９２％導出され、９．９μｍの粒子は出口５及び６から９９％以上導出されており、設定したサイズに応じた粒子の分離が認められた。次に、同じ条件で、枝流路本数ｎのみを１００に変更し、分離される粒子サイズが直径３．０μｍとなるように設定して実験した。その結果、図７に示すように、分離される粒子サイズは直径３．０μｍとなり、ほぼ同サイズの３．０μｍの粒子は出口２及び３より１００％導出され、９．９μｍの粒子は出口５及び６から１００％導出され、２種類のサイズの粒子が夫々に異なる出口から分離可能であった。

［実施例３］
主流路５の傾斜角θ１５°、枝流路本数ｎが１９３にすると共に、分離される粒子サイズが直径２．１μｍとなるように設定されたマイクロ流路構造体１（実施例３）を用い、調製血液及び末梢血液を用いた血球分離実験を行った。実施例３の実験結果の詳細を説明する前に、「調製血液の作製」、「末梢血液」、及び「血球回収率の算出」の説明を先に行う。

（調製血液の作製）
健常人（健常ヒト）新鮮末梢血液に抗凝固剤としてＡＣＤ−Ａ(acid citrate dextrose-A)を血液：ＡＣＤ−Ａ＝８：１となるように添加し十分に転倒混和した。密度勾配遠心分離媒体であるＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケア社製）１５ｍＬを５０ｍＬ遠沈管に添加し、その上にＤ−ＰＢＳ（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline）溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で２倍希釈したＡＣＤ−Ａ添加末梢血液３０ｍＬを明瞭な界面ができるよう慎重に重層した。アクセル、ブレーキなしで８００ｘｇ、１５分間遠心後、単核球が豊富なバフィーコート層を約７ｍＬ採取し、別の遠沈管に移した。バフィーコート層をさらにアクセル、ブレーキありで１，４３０ｘｇ、１０分間遠心後、上清約６．２ｍＬを除去した。残渣の細胞浮遊液を３０μｍのメッシュに通液させて、ＡＣＤ−Ａ添加末梢血液と１：１で混和し、調製血液とした。必要量の調製血液を０．５％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）添加Ｄ−ＰＢＳ溶液で５倍希釈した。

（末梢血液）
健常人（健常ヒト）新鮮末梢血液に抗凝固剤としてＡＣＤ−Ａ(acid citrate dextrose-A)を血液：ＡＣＤ−Ａ＝８：１となるように添加し十分に転倒混和し、末梢血液とした。

（血球分離）
作製したマイクロ流路構造体１の入口部３における第１入口ポート９から、５倍希釈した調製血液又は末梢血液をシリンジポンプを用いて導入し、その両側の第２入口ポート１０，１１から０．５％ＢＳＡ添加Ｄ−ＰＢＳ溶液を導入した。各々の導入速度は、入口ポート９，１０については１５μＬ／ｍｉｎ、入口ポート１１については６０μＬ／ｍｉｎであった。出口１，２と、出口３，４と、出口５，６と、から回収された溶液を各々一つの容器に回収し、回収細胞溶液を得た。

（血球回収率の算出）
多項目自動血球分析装置（Ｓｙｓｍｅｘ社製、型式ＸＳ−８００ｉ）を用い、調製血液、５倍希釈した調製血液と回収細胞溶液との白血球濃度、赤血球濃度、及び血小板濃度を測定した。各検体中の白血球数、赤血球数及び血小板数は、各濃度に溶液の容量を掛けて算出した。次に、白血球中のリンパ球比率、単球比率及び顆粒球比率を測定した。各検体について抗ヒトＣＤ４５−ＦＩＴＣ抗体と抗ヒトＣＤ１４―ＰＥ抗体とで染色後溶血処理を行い、フローサイトメトリー（ベックマンコールター社製、型式Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００）でＣＤ１４陽性細胞比率を測定した。各検体の単球数は、白血球数 × ＣＤ１４陽性比率で算出される。各出口（出口１,２、出口３，４、出口５，６）から回収した溶液中の赤血球回収率、血小板回収率、白血球回収率、リンパ球回収率及び単球回収率は、下記式（Ａ）〜（Ｅ）より算出した。

・赤血球回収率（％）＝（回収細胞溶液の赤血球濃度×回収細胞溶液の容量）／（５倍希釈血液の赤血球濃度×シリンジポンプから吐出した５倍希釈血液の容量）×１００・・・式（Ａ）
・血小板回収率（％）＝（回収細胞溶液の血小板濃度×回収細胞溶液の容量）／（５倍希釈血液の血小板濃度×シリンジポンプから吐出した５倍希釈血液の容量）×１００・・・式（Ｂ）
・白血球回収率（％）＝回収細胞溶液の白血球数／５倍希釈血液の白血球数×１００・・・式（Ｃ）
・リンパ球回収率（％）＝回収細胞溶液のリンパ球数／５倍希釈血液のリンパ球数×１００・・・式（Ｄ）
・単球回収率（％）＝回収細胞溶液の単球数／５倍希釈血液の単球数×１００・・・式（Ｅ）

実施例３の血球分離実験の結果を図８に示す。グラフは出口１，２をまとめたものを出口１に、出口３，４をまとめたものを出口３に、出口５，６をまとめたものを出口５に示した。

調製血液の血球分離の結果、直径約６〜２０μｍの白血球は約１００％出口５，６から回収され、厚み２〜３μｍの赤血球と直径２〜３μｍの血小板は出口５，６からの回収率は夫々２．６％と１．２％であった。また赤血球及び血小板は、出口１〜４から殆ど回収され、各々回収率は約８８％と約９６％であった。すなわち、サイズの小さい赤血球や血小板のみが枝流路６へ引き抜かれ、直径の大きい白血球は主流路５を直進し、出口１〜４からは赤血球及び血小板が回収され、出口５，６からは高純度かつ高回収率で白血球が得られ、白血球と赤血球・血小板の分離が確認できた。

次に末梢血の血球分離の結果、白血球は約９３％出口５，６から回収され、赤血球と血小板の出口５，６からの回収率は夫々０．０％と０．０％と高効率な白血球分離が確認できた。また赤血球及び血小板は、出口１〜４から殆ど回収され、各々回収率は約１００％と約７５％であり、白血球と赤血球・血小板の分離が確認できた。

［実施例４］
主流路５の傾斜角θ３０°、枝流路本数ｎが４１にすると共に、分離される粒子サイズが直径４．５μｍとなるように設定した以外は、実施例３と全く同じマイクロ流路構造体１（実施例４）を用い、実施例３と同様の血球分離実験を行った。結果を図９に示す。グラフは出口１，２をまとめたものを出口１に、出口３，４をまとめたものを出口３に、出口５，６をまとめたものを出口５に示した。

調製血液の血球分離の結果、白血球の中でも直径約１２〜２０μｍとサイズの大きい単球は出口５〜６から約７３％回収され、厚み２〜３μｍの赤血球と直径２〜３μｍの血小板は出口１〜２から夫々９８％と１００％回収された。また白血球の中でも直径６〜１４μｍサイズの小さいリンパ球は、出口１〜４から約７７％回収された。すなわち、分離サイズ４．５μｍよりもはるかに大きい単球は出口５〜６からは高純度かつ高回収率で得られ、赤血球・血小板・リンパ球と単球の分離が確認できた。

次に末梢血液の血球分離の結果、単球は約９０％出口５〜６から回収され、赤血球と血小板の出口１〜４からの回収率は夫々約９５％と約８４％回収された。リンパ球は出口１〜４から約９４％回収された。すなわち、分離サイズ４．５μｍよりもはるかに大きい単球は出口５〜６のみから高純度かつ高回収率で得られ、赤血球・血小板・リンパ球と単球の分離が確認できた。

［比較例１］
主流路５の傾斜角θ４５°、枝流路本数ｎを１４とした以外は、実施例１と同様の実験を行った。比較例１の結果を図１０に示す。図１０に示すように、傾斜角θが４５°の場合、分離される粒子サイズとして設定した直径が、８．２μｍにもかかわらず、８．２μｍよりも大きい９．９μｍの粒子も出口１及び２から約７６％導出されており、設定したサイズに応じた粒子の分離が認められなかった。

［比較例２］
主流路５の傾斜角θ４５°、枝流路本数ｎを１４とした以外は、実施例３の調製血液を用いた実験と同様の実験を行った。比較例２の結果を図１１に示す。図１１に示すように、傾斜角４５°の場合、分離されるサイズとして設定した直径が８．２μｍにもかかわらず、直径８．２μｍよりも大きい単球も出口１及び２から５７％導出されており、設定したサイズに応じた細胞の分離が認められなかった。

１、１Ａ…マイクロ流路構造体、２…本体部、３…入口部、４…出口部、５…主流路、６…枝流路、７…側部境界流路（第２境界流路）、８…入口側境界流路（第１境界流路）、９…第１入口ポート、１０，１１…第２入口ポート、１２_１、１２_２、１２_３、１２_４、１２_５、１２_６…出口ポート、Ａ…所定方向、Ｂ…第１傾斜方向、Ｃ…第２傾斜方向。

Claims (11)

1. 流体中の粒子をサイズに基づき分離するためのマイクロ流路構造体であって、
   所定方向における一方側から他方側へ前記流体を流通させる本体部と、
   前記本体部に前記流体を流入する入口部と、
   前記本体部から前記流体を流出させる出口部と、を備え、
   前記本体部は、
   前記所定方向に対し傾斜する第１傾斜方向に沿って延びると共に、前記本体部内に並設された複数の主流路と、
   前記所定方向に対し前記第１傾斜方向とは反対側に傾斜する第２傾斜方向に沿って延びると共に、前記本体部内において前記主流路と交差するように並設された複数の枝流路と、を有し、
   前記主流路と前記複数の枝流路とは、前記本体部の同一平面上に存在し、
   前記所定方向に対する前記第１傾斜方向の傾斜角は、０°よりも大きく４５°よりも小さい角度を有し、
   前記主流路は、前記第１傾斜方向に沿って直線状に延在する壁面によって画設されており、前記枝流路は、前記第２傾斜方向に沿って直線状に延在する壁面によって画設されている、マイクロ流路構造体。
2. 前記複数の主流路における任意の前記主流路の幅と、前記任意の主流路の任意の長さに対して前記第２傾斜方向側に設けられた前記枝流路の本数とによって、前記任意の主流路から前記第２傾斜方向側の前記枝流路へ導入する前記粒子のサイズが設定される請求項１記載のマイクロ流路構造体。
3. 前記複数の主流路における任意の前記主流路と前記任意の主流路に交差する一つの前記枝流路との交差部の中心である交差点Ａｐと、
   前記交差点Ａｐから前記所定方向の前記他方側へ延びる延長線と、前記任意の主流路に隣接し、且つ前記延長線に交差する他の前記主流路の中心線との交点である交差点Ｂｐと、
   前記交差点Ａｐを通る前記枝流路と前記交差点Ｂｐを通る前記他の主流路との交差部の中心である交差点Ｃｐと、を結ぶ三角形において、
   前記他の主流路における前記交差点Ｂｐと前記交差点Ｃｐとの間において前記第２傾斜方向側の前記枝流路の本数ｎは、２≦ｎ＜３３５６を満たす請求項１または２記載のマイクロ流路構造体。
4. 前記主流路と前記枝流路とは直交しており、前記主流路の幅Ｗ０、前記主流路の前記第２傾斜方向側に設けられた前記枝流路の本数ｎ、前記枝流路の幅Ｗ２、前記主流路の前記第２傾斜方向側で互いに隣接する前記枝流路同士の間隔ｄ、前記所定方向に対する前記第１傾斜方向の傾斜角θ、及び前記枝流路の長さＬが式１を満たすと共に、Ｌ＞Ｗ０である請求項１〜３のいずれか一項記載のマイクロ流路構造体。
   
5. 前記主流路の幅は、流体中の粒子によって閉塞しない幅に設定されている請求項１〜４の何れか一項記載のマイクロ流路構造体。
6. 前記本体部は、前記所定方向における前記一方側に設けられ前記主流路及び前記枝流路に接続された第１境界流路と、前記主流路の並設方向に沿う一方側及び他方側の少なくとも何れかに設けられ、前記所定方向に沿って延びる第２境界流路とを有し、
   前記入口部は、前記第１境界流路に接続され前記粒子の懸濁液を導入する第１入口ポートと、前記第１境界流路に接続されバッファ液を導入する第２入口ポートとを有し、
   前記出口部は、前記流体を導出する複数の出口ポートを有し、
   前記出口ポートは、前記複数の主流路のうちの一部、及び複数の前記枝流路のうちの一部に接続されていると共に、前記主流路の並設方向に沿う方向に隣接して並ぶように設けられており、
   前記複数の出口ポートのうち前記第１傾斜方向側の端に位置する出口ポートに最も近接して開口した一端を有する前記主流路の他端が前記第１境界流路に開口している請求項１〜５の何れか一項記載のマイクロ流路構造体。
7. 請求項１〜６の何れか一項記載のマイクロ流路構造体を用いて流体中の粒子をサイズに基づき分離する粒子の分離方法。
8. 前記入口部は、前記粒子の懸濁液を導入する第１入口ポートと、バッファ液を導入する第２入口ポートとを有し、
   前記第１入口ポートから導入される前記粒子の懸濁液の流量１．０に対し、前記第２入口ポートから導入される前記バッファ液の流量が０．５以上とする請求項７記載の粒子の分離方法。
9. 前記入口部は、前記粒子の懸濁液を導入する第１入口ポートと、バッファ液を導入する第２入口ポートとを有し、
   前記第１入口ポートから前記粒子の懸濁液を導入し、複数の前記第２入口ポートを前記第１入口ポートの一方、または両側に設ける請求項７または８記載の粒子の分離方法。
10. 前記粒子が細胞である請求項７〜９のいずれか一項記載の粒子の分離方法。
11. 血液又は細胞含有液を前記マイクロ流路構造体の前記入口部に導入する工程と、前記マイクロ流路構造体の前記出口部の一部から分離した細胞を採取する工程と、を含む請求項１０記載の粒子の分離方法。