JP6466930B2 - 光シート顕微鏡検査のための装置 - Google Patents

Description

本発明は、光シート顕微鏡検査のための装置に関する。このような装置は、光シートにより照明用ビーム経路を介して媒質中の試料キャリア上にある試料を照明するための照明用対物レンズを備えた照明光学系を含んでいる。これに関し、照明用対物レンズの光軸と光シートは１つの平面内にあり、この平面は、平らな基準面の法線に対してゼロとは異なる照明角度βを含み、この基準面に対して、ときには液体を入れるために側壁を備えた試料容器としても形成される試料キャリアが位置合わせされている。さらにこの装置は、検出用ビーム経路内に検出用対物レンズを備えた検出光学系を含んでいる。ここでも、検出用対物レンズの光軸が基準面の法線に対してゼロとは異なる検出角度δを含む。それだけでなくこの装置は、所定の厚さでの所定の材料からなる少なくとも１つの層を有する隔離層系を含んでおり、この層が、媒質を照明用対物レンズおよび検出用対物レンズから隔離している。この隔離層系は、基本面が、基準面と平行に位置合わせされており、かつ少なくとも照明用対物レンズおよび検出用対物レンズにとって照明または検出が可能な領域内では、この基本面で媒質と接触している。隔離層系は、最も単純な場合には、対物レンズを媒質から隔離している空気層であり得る。隔離層系は、それぞれ１つの空気層を伴う試料容器の底部（対物レンズがその下に配置されている場合）または相応のカバープレートもしくはカバーガラスであり、この空気層は、底部またはカバーガラスを対物レンズから隔離している。対物レンズが液浸対物レンズとして形成されている場合、カバーガラスまたは試料容器の底部との間には、空気の代わりに液浸媒質が存在している。最後にこの装置は、検出すべき光が隔離層系の界面を斜めに通過することで生じるような収差を低減するために、少なくとも１つの検出用補正レンズを備えた検出用補正レンズ系も含んでいる。通常は、照明用対物レンズおよび検出用対物レンズは２つの異なる対物レンズであるが、例えば（特許文献１）に記載されているようないわゆるダブル対物レンズとして形成してもよい。この場合、両方の対物レンズが１つの共通の構造ユニットにまとめられており、この場合、それぞれの光学系、つまり帰属のビーム経路およびその中に配置されている光学素子を備えた対物レンズは、幾つかの素子を分け合っている。

このような装置は、とりわけ、光シート面が検出の光軸とゼロとは異なる角度で交わっている光シートによって試料の照明が行われる生物試料調査で用いられる。これに関して通常は、光シートが、一般的に検出用対物レンズの光軸と一致している検出方向と、直角をなして交わる。ＳＰＩＭ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：選択的平面照明顕微鏡検査）とも呼ばれるこの技術により、空間的な撮影を比較的厚い試料でも比較的短い時間内に行うことができる。光切断と、切断面に垂直な方向での相対運動との組合せを基礎として、試料の画像表示を空間的に拡張することができる。

ＳＰＩＭ技術は蛍光顕微鏡検査で用いられるのが好ましく、この関連でＬＳＦＭ（Ｌｉｇｈｔ Ｓｈｅｅｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：光シート蛍光顕微鏡検査）とも呼ばれる。試料は、横方向には均一に照らし出され、この場合、光シートに垂直な方向で、選択的な、つまりわずかな焦点深度と結びついた結像が可能である。走査型共焦点レーザ顕微鏡検査または２光子顕微鏡検査のような他の確立された方法に対し、ＬＳＦＭ技術は複数の利点を有している。広視野での検出を行えるので、比較的大きな試料範囲を捕捉することができる。解像度は走査型共焦点レーザ顕微鏡検査の場合より少し低いが、しかしながらＬＳＦＭ技術では、侵入深度がより深いので比較的厚い試料を分析することができる。それだけでなく、試料が検出方向に対してゼロとは異なる角度で薄い光シートによってのみ照明されるので、この方法では試料の光負荷が最も小さく、これはなかでも試料の退色の危険を減少させる。

その際、例えば円柱レンズによって生成される静的な光シートも、あたかも静的な光シートも使用することができる。このあたかも静的な光シートは、試料を光線で高速に走査することで生成可能である。光線を、観察する試料に対して非常に高速に相対運動させ、その際に時間的に次々と何度も、相接するように並べることにより、光シート状の照明が生じる。その際、試料をセンサー上で最終的に結像させるカメラの積分時間を、積分時間内に走査が終了するように選択する。２次元のセンサーエリアを有するカメラの代わりに、検出光学系での新たな走査（リスキャン）と組み合わせたラインセンサーを使用してもよい。さらに検出を共焦点で行ってもよい。

ＳＰＩＭ技術は、文献ではこれまでに幾度も記載されており、つまり例えば（特許文献２）およびそれに基づく（特許文献３）に、または（非特許文献１）に記載されている。
光シート顕微鏡検査の主要用途の１つは、大きさが数百μｍ〜数ｍｍまでの中サイズの有機体のイメージングである。一般的には、これらの有機体はアガロースゲルに包埋されており、このアガロースゲルもまたガラスキャピラリ内にある。ガラスキャピラリが、水で満たされた試料チャンバに入れられ、かつ試料の一部分がキャピラリから押し出される。この場合、アガロース中の試料が光シートによって照明され、かつ蛍光が、光シートに対して垂直、したがって照明用対物レンズの光軸に対しても垂直に位置している検出用対物レンズにより、カメラ上に結像される。

しかしながら光シート顕微鏡検査のこの方式は幾つかの欠点を有している。１つには、調査すべき試料が比較的大きく、これらの試料が発生生物学に由来している。アガロースゲルで満たされた特殊な小さな円柱管内での試料の準備は、手間がかかり、実験室での平常のワークフローを妨げ、標準的な試料の準備および標準的な試料の保持とは両立し得ない。さらに、ガラスまたはプラスチックからなる小さな円柱管とアガロースゲルの間の避けられない屈折率差が、解像能力を低下させ得る光学収差を生じさせる。さらに試料準備および試料チャンバの寸法に基づき光シートが比較的厚く、したがって達成可能な軸方向の解像度が制限される。

この制限を少なくとも部分的には回避し得るように、近年では、照明用対物レンズおよび検出用対物レンズが、互いに垂直に位置しており、かつそれぞれ４５°の角度で上から試料に向けられているＳＰＩＭ構造が実現された。基準面として、例えば試料容器が置かれているテーブルの平面または別のたいていは水平な平面を用いる場合、照明角度βおよび検出角度δはそれぞれ４５°である。このような構造は、例えば（特許文献４）および（特許文献５）に記載されている。

このような構造の場合、試料は、例えばペトリ皿として形成された試料容器の底部上に存在する。ペトリ皿は水または栄養溶液で満たされており、照明用対物レンズおよび検出用対物レンズは液体に浸されている。この場合、水は浸漬液の機能も担っている。このアプローチは、比較的薄い光シートを生成できるので、軸方向での解像度が比較的高いという利点を提供する。この比較的高い解像度に基づき、この場合は比較的小さな試料も調べることができ、試料準備も比較的簡単になったとはいえ、なお標準規格には対応しておらず、蛍光顕微鏡検査での個々の細胞の調査にはペトリ皿もあまり使用されていない。このペトリ皿は、両方の対物レンズを皿の縁に当てずに皿内に浸せるよう、比較的大きくなければならない。生物学の多くの分野での標準規格であり、まさに蛍光顕微鏡検査による個々の細胞の分析でも用いられる、マルチウェルプレートとも呼ばれるマイクロタイタープレートは、プレート上でラスタ状に配置されている非常に小さなくぼみ内に対物レンズを浸せないので、この方法では使用できない。もう１つの欠点は、この構造により、短時間で数多くの試料を分析すること（ハイスループットスクリーニング）が簡単には可能でないことにある。なぜなら、様々な試料の汚染を回避するため、試料を交換する際に対物レンズを洗浄しなければならないからである。現況技術で知られているような装置ではさらに、焦点位置を変更するために試料と対物レンズの相対変位が必要である。これに対応する移動により、調査すべき試料の構成要素が浮上する可能性があり、最悪の場合それどころか完全に観察エリアから出る可能性がある。

これらの欠点を排除するための１つの手法は、一方の側ではβ＝δ＝４５°の配置を保ち続け、ただし試料は、取り囲んでいる媒質ともども周囲から隔絶してカプセル化するということにある。１つの可能性は、両方の対物レンズを上からではなく、倒立顕微鏡の方式に基づいて下から試料に向けることであり、その場合、照明および検出は、試料容器の透明な底部を通して行われる。この場合、（例えばペトリ皿またはスライドガラスの）この透明な容器底部は、底部と対物レンズの間にある液体層または空気層と一緒に隔離層系を形成する。試料容器が透明な蓋で覆われていれば、検出をさらに上からも同等に行うことができ、またはそのような蓋なしでも行うことができ、この場合には、カプセル化を保証するため隔離層系は空気層のみからなる。このやり方ですべての典型的な試料容器、例えばマイクロタイタープレート、ペトリ皿、およびスライドガラスも利用することができる。とりわけ、高いスループットで分析する際の試料の汚染も回避することができる。

しかしながら、この利点は、さらなる重大な欠点によって打ち消される。なぜなら、隔離層系、例えば隣接する空気層を有するカバーガラスまたは容器底部の使用に基づき、例えばＮＡ＝０．３の小さな開口数で既に、検出すべき光または照明光が界面を有する隔離層系を斜めに通過することに基づく球面収差およびコマのような極端な結像欠陥が生じ、したがって回転対称の標準対物レンズを利用する場合に正確なイメージングができなくなるからである。

（特許文献６）では、これらの欠点を排除するため、補正レンズまたはレンズ群の形態の補正手段を、照明用対物レンズおよび／または検出用対物レンズに組み込むことが提案された。そこでは補正レンズとして、なかでも円柱レンズまたは軸方向には配置されないレンズが提案されている。これらの補正レンズは、非球面または自由曲面を有するような素子も含むことができる。さらにスライドガラスに関しては、試料がその中に存在している媒質、例えば水または培養液に近似の屈折率を有する材料が使用され、さらなる欠陥を排除するため、照明光および／または検出光の位相面を操作するためのアダプティブ光学素子が提案されている。しかしながら、このような補正手段が形成され得るような具体的な提示はなされていない。加えてこの場合、提案された補正レンズは、対物レンズ内で最前でもフロントレンズの後ろに配置されており、これは既存の対物レンズへの追加装備を困難にする。

欧州特許第０８６６９９３号明細書 独国特許出願公開第１０２５７４２３号明細書 国際公開第２００４／０５２５５８号 国際公開第２０１２／１１０４８８号 国際公開第２０１２／１２２０２７号 独国特許出願公開第１０２０１３１０７２９７号明細書

２００９年に雑誌Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、３３６巻、６３頁において刊行されたジェー．フイスケンら（Ｊ．Ｈｕｉｓｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）の総説「発生生物学における選択的平面照明顕微鏡検査技術（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」

したがって本発明の課題は、照明光および検出光が、スライドガラス、試料容器の底部、またはカバーガラスを斜めに通過する際に生じる結像欠陥を、できるだけ単純な補正素子によって排除することであり、この補正素子は、既存の対物レンズのさらなる使用も可能にすることが有利である。それだけでなく、他の物体面に合焦する際に発生し得る球面収差も、対応する補正素子によって取り除かれることが好ましい。最後にこれらの補正素子により、試料容器またはカバーガラスと媒質との多数の組合せに対して同じ対物レンズを使用できることも達成されるのが好ましい。

本発明の基礎となる課題は、少なくとも１つの検出用補正レンズが、自由曲面レンズとして形成されており、検出用対物レンズと隔離層系との間に配置されることによって解決される。少なくとも１つの検出用補正レンズは、検出用対物レンズのフロントレンズであってもよい。いずれにしても、既に知られている対物レンズの本体と隔離層系との間の配置が可能であり、したがって基本的に、自由曲面レンズの形成を除けば追加装備が比較的少ない手間で可能である。これに関し、検出用対物レンズの既存のフロントレンズの片側または両側に、自由曲面によって影響を及ぼすことも可能である。

これに関し、少なくとも１つの検出用補正レンズの自由な面形状は、形状の方程式

によって表され、式中、ｋはいわゆる円錐定数であり、Ｒは、この面の頂点での仮想の円錐断面の半径、つまり頂点とすぐ近くにある焦点との間隔を表す。これに関しては頂点も、円錐断面の頂点も焦点も、光軸上にある。

レンズ表面の点は、ｚ方向に沿った光軸を有する座標系における座標ｘおよびｙによって表される。よってｘ^２＋ｙ^２は、この点と光軸との間隔を表す。関数ｚ（ｘ，ｙ）は、座標の組（ｘ，ｙ）の場合の、レンズ表面と、円錐断面の頂点で光軸に垂直に置かれた平面との間隔を表す。ｃ_ｍ，ｎは、ｘおよびｙにおける多項式の係数を表す。係数ｃ_ｍ，ｎ、円錐定数ｋ、および半径Ｒは、反復法によって決定され、これに関し、ｘ座標で偶数の指数を有するような係数だけがゼロとは異なる。ｚ軸は対物レンズの主光軸を表す。

この場合、隔離層系を斜めに通過することで引き起こされる結像欠陥を補正するためのベストポジションは、検出用対物レンズの前側部分内または検出用対物レンズの手前にあることが分かった。とりわけ、検出用対物レンズの物体側にある最初のレンズに、１つまたは２つのこのような自由曲面によって影響を及ぼしてもよい。斜めに通過された隔離層系は、主要な像欠陥として、まずはデフォーカスおよび球面収差のような回転対称の像欠陥を生成する。しかしながら、これらの像欠陥はたいてい、対物レンズ内の通常の回転対称レンズによって、または回転対称レンズの空気間隔によって既に補正することができる。さらに軸上コマおよび軸上非点収差ならびにより高次の像欠陥も生じるが、これらは前述の措置では補正できない。とはいえ、これらは、レンズの前側も裏側も適切に選択された自由曲面によって形づくられていれば、たった１つの自由曲面レンズにより、実質的に完全に補正することができる。これに関しｚ軸は、対物レンズの主光軸であり、つまり、厳密に言えば非対称の自由曲面を有する対物レンズはもう光軸を有さないので、自由曲面素子なしでの対物レンズの回転対称レンズの光軸である。

好ましい一形態では、検出用対物レンズがさらに、内焦と同時に、焦点変更時に生じる球面収差を補正するための検出用合焦機構を備えている。こうすることで、とりわけ開口数の高い対物レンズの場合に、対物レンズの像品質を非常に強く低下させ得る球面収差を補正することができる。これにより調整領域全体にわたって、回折限界での高い像品質が維持される。これに加え、検出用合焦機構が内焦のために設計されていることにより、試料と対物レンズの相対変位が回避され、これは、対物レンズおよびテーブルまたは試料容器を相対的に相互に変位させなくてよくなるので、光シート顕微鏡検査のための構成全体の構造を簡略化させる。これに関して好ましいのは、検出用対物レンズの開口数が少なくとも０．８、特に好ましくは少なくとも１．０であることである。検出用対物レンズでのこのような検出用合焦機構により、少なくとも１００μｍ×１００μｍ×１００μｍの物体側の試料体積内の任意の平面を、回折限界で結像することができる。

さらなる特に好ましい一実施形態では、球面収差の補正を対物レンズ内のレンズおよびその構成だけで補正しきれない場合か、またはこの基本補正の補完として、検出用合焦機構が、内焦と同時に、焦点変更時に生じる球面収差を補正するために、ビーム経路内に配置されているかまたはビーム経路内に取り付け可能な少なくとも１つの第１のアダプティブで光学的な検出用合焦素子を含んでいる。

検出用補正レンズが、媒質の特殊な配置、隔離層材料、および隔離層厚さに対し、収差を完全に補正する一方で、アダプティブで光学的な検出用合焦素子は、他の焦点位置への適合に役立つ。これに関し検出用補正レンズは、対物レンズの光軸に対して斜めに配置されたカバーガラスの効果を相殺するように形成されており、したがってこのレンズの後ろでは再びほぼ回転対称の関係が支配している。アダプティブで光学的な検出用合焦素子は、他の試料深さに合焦する際に問題となるデフォーカスおよび球面収差だけを取り除けばよい。

さらなる好ましい一形態では、検出用対物レンズが、検出用補正レンズの後ろに配置された第１の検出用レンズ群を備えており、この第１の検出用レンズ群は、物体側の像エリアを無限遠に結像し、検出用対物レンズはそれだけでなく好ましくはアフォーカルに形成された第２の検出用レンズ群を備えている。これに関し第１のアダプティブ光学素子は、第１の検出用レンズ群と第２の検出用レンズ群との間に配置されている。その際に好ましいのは、第１の検出用レンズ群の後ろに、このシステムの開口絞りがあることであり、開口絞りはこの場合、第１の検出用レンズ群によって無限遠に結像され、したがって物体側ではほぼテレセントリックなビーム経路が実現される。さらに、第１の検出用レンズ群の後ろのほぼコリメートされたビーム経路内には、アダプティブで光学的な検出用合焦素子が配置されている。第２の検出用レンズ群は、実質的にアフォーカルに形成されており、第１の検出用レンズ群と一緒に顕微鏡の基本対物レンズを成している。

検出用対物レンズと同様に、検出用補正レンズと同じ作用を有する少なくとも１つの照明用補正レンズを備えた照明用補正レンズ系も実現することができる。照明用補正レンズも自由曲面レンズとして形成されており、検出用補正レンズでも照明用補正レンズでも、片側を自由曲面として形成できるだけでなく、レンズの両側を自由曲面として形成してもよい。照明用対物レンズ内でも、内焦のための照明用合焦機構、ならびに検出用対物レンズ内の少なくとも１つのアダプティブで光学的な検出用合焦素子と同じ機能を有する少なくとも１つのアダプティブで光学的な照明用合焦素子が配置されるのが好ましい。検出用対物レンズの開口数に比べ、照明用対物レンズの開口数は著しく小さく、一般的にはＮＡ＝０．５以下である。したがって照明用対物レンズの場合、波面品質への要求は検出用対物レンズほど高くなく、これが補正素子への要求を低くしている。

特に好ましい一形態では、少なくとも１つのアダプティブで光学的な検出用合焦素子および少なくとも１つのアダプティブで光学的な照明用合焦素子が、それぞれ波面マニピュレータとして形成されており、この波面マニピュレータの各々が、好ましくは２つの、光軸に対して横に相互に可動の自由曲面を含んでいる。このような波面マニピュレータは、例えば独国特許第１０２０１２１０１２６２号明細書に記載されており、その開示をここで明示的に完全に援用し、とりわけ波面マニピュレータに対する様々な形態可能性に関して参照するよう指示する。

レンズの自由曲面には上で言及した式（１ａ）が適用される一方で、波面マニピュレータの自由曲面は、ここでは基本曲率が考慮され得ないので、純粋な多項式展開として表すことができる。明確に、式

を、たいていは同一の両方の自由曲面の決定に使用することができる。これに関し、ｎおよびｍにおいて、変位方向に平行な座標（ｘまたはｙのいずれか）の奇数の指数および変位方向に垂直な座標（ｙまたはｘのいずれか）の偶数の指数を有する多項式の項だけが、ゼロとは異なる。さらなる実施形態に関しては、一般性を制限することなく、変位方向がｙ軸に対応することを出発点とする。

最も単純な実施形態では、波面マニピュレータが正確に２つの自由曲面素子を含んでおり、これらの自由曲面素子が、光学的なシステム軸に対して横に変位する。すなわち一方の素子が正のｙ方向に沿って距離ｓだけ変位し、同時にもう一方の素子が逆に負のｙ方向に距離ｓだけ変位する。つまり両方の自由曲面素子は、正確に逆行して同じ分だけ互いに相対的に変位する。最も単純な場合には、両方の自由曲面素子が１つの平坦な側および１つの自由曲面からなっている。波面マニピュレータの素子の両方の自由曲面は、通常の場合には同一であり、したがって、ゼロポジションでは両方の自由曲面素子が、厳密に平行平面板へと相補的に補い合う。非近軸の効果を考慮するために、これとは相違することができる。

自由曲面素子のプロファイル関数は、素子の変位方向に平行な方向では、所望の波面変更の不定積分（第１の積分）によって、および変位方向に垂直な方向では、所望の波面変更作用に比例した関数によって与えられている関数により表すことができる。

純粋なデフォーカス作用は、例えば、自由曲面が３次の多項式

によって表される場合に達成することができ、これに関し、素子の横変位はｙ軸に沿って行われると仮定した。式中のパラメータｋは、プロファイル深さをスケーリングし、こうすることで横の変位距離ｓの単位当たりの達成可能な屈折力変化を規定する。

第一義的な球面収差を生成するための波面マニピュレータは、例えば、プロファイル関数

によって表すことができる。自由曲面素子を、より高次の他の波面欠陥に影響を及ぼすために設計することもできる。様々な欠陥を連続して除去するために、様々な種類の複数の波面マニピュレータを相前後して連結してもよい。さらなる詳細に関しては、既に挙げた独国特許第１０２０１２１０１２６２号明細書を参照されたい。

波面マニピュレータの好ましい一形態では、マニピュレータの相互に可動の自由曲面の間に浸漬媒質が入れられている。こうすることで、マニピュレータによる波面変更の所定の波長依存性、とりわけ例えば色消し作用を調整することができる。自由曲面素子の間の浸漬媒質の適合に関する詳細のために、再び独国特許第１０２０１２１０１２６２号明細書を参照されたく、その開示内容をここで完全に援用する。

波面マニピュレータの相互に可動の自由曲面の間に浸漬媒質が入れられている場合、互いに対して移動する自由曲面素子は、例えば弾性プラスチックフィルムからなるパッキンリング、蛇腹構造、またはその類似物により、液体を漏らさないよう封止されている。

波面マニピュレータの自由曲面が形成されている光学素子は、異常部分分散を有する材料から作製されるのが好ましく、それを補完してまたはその代わりに、存在する場合には浸漬媒質が、正常直線から逸脱する分散軌道を有している。つまり自由曲面素子は、屈折率分散が正常直線から逸脱している媒質から形成することができる。そのような材料には、例えばロングクラウンガラスまたはショートフリントガラスが属している。これにより、第二義的な色収差を的確に調整または補正することができる。このような第二義的な色欠陥は、複数のレンズによっても補正でき、普通はこれらのレンズの少なくとも１つが異常部分分散を有するようなガラスから形成されている場合にのみ補正することができる。しかしながら、このようなガラスは数多くの欠点および望ましくない特性を有している。とりわけ、このようなガラスは比較的高価であり、かつアルカリ性または酸含有の研磨剤および磨き剤に対して化学的に非常に弱いので加工しにくい。これとは違いここでは自由曲面素子を割安で耐酸性のノーマルガラスから形成することができ、その一方で自由曲面素子の間の浸漬媒質として有機炭化水素を使用することができ、有機炭化水素は、分散挙動が正常直線から逸脱しており、したがって第二義的な色欠陥を補正するのに適している。すなわち代替的な手法では、波面マニピュレータにより、第二義的なスペクトルの補正を、ノーマルガラス、つまりアッベダイヤグラムにおける正常直線上にあるようなガラスだけで達成することもできる。

上で既に言及したように、波面マニピュレータの観察者に面した側に配置されている検出用対物レンズの第２の検出用レンズ群は、様々な基本対物レンズおよび様々な顕微鏡の鏡筒システムを互いに自由に組み合わせられるようアフォーカルに形成されるのが好ましい。いわば「無限遠のインターフェイス」である。この場合、第２の検出用レンズ群がアフォーカルに形成されていれば、第２のレンズ群の後ろに、つまりこの第２の検出用レンズ群の物体に面していない側に、さらに第３の検出用レンズ群が配置されているのが好ましい。第３の検出用レンズ群は結像レンズ群として形成されており、３つすべてのレンズ群が一緒に、実像での中間像を生成し、この中間像は、視覚的に拡大して考察することができるか、またはデジタルカメラのような対応する検出機構によって撮影することができるかのいずれかである。

好ましいのは、第１の検出用レンズ群、検出用補正レンズ、および隔離層系の少なくとも１つ層が、条件
ｈ_１＝ｆ_ＦＧ・ｓｉｎσ_０＝ｎ_０・ｆ’_ＦＧ・ｓｉｎσ_０ （４）
を近似的に満たす光学系を形成することであり、この条件からの最大１０％の逸脱が認められており、許容可能である。式中ｈ_１は、波面マニピュレータでの開口ビームの入射高であり、σ_０は、光軸に対する周辺ビームのビーム傾斜角であり、ｆ_ＦＧ＝−ｎ_０＊ｆ’_ＦＧは、フロントレンズ群の前側の物体側の焦点距離であり、およびｎ_０は、物体とフロントレンズとの間の浸漬媒質の屈折率である。この条件は例えば、隔離層系の斜めのビーム通過を補正するための自由曲面レンズに至るまで球面レンズだけからなるフロントレンズ群によって満たすことができる。しかしながら、特に簡単かつ厳密には、第１の検出用レンズ群が上で言及した開口絞りの近傍で回転非球面レンズを含む場合にこの条件を満たすことができる。少なくとも１つの回転対称の非球面レンズの使用は、非常に高い開口度または大きな開口角を有する対物レンズの場合にとりわけ有利であり、かつこの場合、通常の開口欠陥、つまり球面収差の補正が補助されるだけでなく、方程式４で挙げたフロントレンズ群の正弦条件の遵守も補助される。この正弦条件は通常は、確かに顕微鏡対物レンズ全体に対して満たされている。なぜならさもないと、拡張された像エリアでの鮮明な結像ができないからである。ただし対物レンズの個々の部分群はこの条件を必ずしも満たさなくてよい。

これまで、とりわけ検出用対物レンズの形態に関連してなされた説明は、照明用対物レンズにも転用することができる。厳密に定義された光シート、例えばベッセルビームを生成し得るには、まずは同様に、補正された基本対物レンズが必要であり、この基本対物レンズは、瞳面の近傍で、現況技術から知られているような相応の位相マスクを内包している。照明用対物レンズ内でも、隔離層系を斜めに通過する光線に基づく収差が相殺されなければならず、これは本発明によれば、既に検出用対物レンズとの関連で説明したような、照明用補正レンズとしての自由曲面の補正レンズによって行うことができる。さらに、焦点面または物体面の変位のように、照明用対物レンズの法線方向もしくは主光軸に沿ってまたは境界プレートの法線方向に沿って光シートを試料中により深くまたはより浅く移動させるという課題がある。これは例えば、可動の自由曲面素子からなる波面マニピュレータだけで実現することができる。ただし、補正についての要求が比較的低い照明光学系では、別の焦点深度にリフォーカスするための別の光学手段、例えばエラストポリマーまたはその類似物からなるズームレンズ（Ｖａｒｉｏｌｉｎｓｅ）を使用することも考えられる。照明開口度が低ければ、照明用対物レンズ全体を変位するといった完全に従来型の解決策も確かな手段となり得る。

その代わりに、またはそれを補完して、検出用対物レンズまたは照明用対物レンズは、一方では隔離層系の斜めの光通過を相殺するための自由曲面レンズを備えることができ、もう一方では内焦のための古典的なメカニズム、ならびに上で既に言及した様々な浸漬媒質またはカバーガラスの厚さおよび材料に関連する補正機能のための古典的なメカニズムを有することができる。古典的なメカニズムとして、ここでは例えば、レンズもしくはレンズ群の軸方向の変位またはさらにレンズ間の空気空間の変更が考慮される。最大限可能な可変性を達成するには、適合の一方の部分を波面マニピュレータによって、および適合のもう一方の部分を軸方向のレンズ変位によって行うことがとりわけ有利であり得る。

検出用補正レンズまたは照明用補正レンズの機能は、どのみちシステム内、とりわけ対物レンズ内に内包されている１つのレンズによって担うことができ、この場合、そのレンズは高い基本屈折力を有することが好ましい。この場合、このレンズの球状または回転非球状の作用面まで、対応する自由曲面プロファイルが累積される。しかし補正レンズの機能を、別個の実質的に屈折力のない付加レンズを付け加えることで達成してもよい。これは、ビーム経路内の素子のアライメント要求がさほどクリティカルでなく、したがってこのシステムを比較的簡単に製造およびアライメントし得るという利点を有し得る。

さらに補正作用を複数のレンズに割り振ることもでき、これに対応してレンズの面形状は、球面形状からさほど逸脱しなくてよく、場合によっては比較的簡単に製造できる。素子のプリズム部分を分割し、平坦な面を有する別個のくさびによって具現することにより、補正レンズの形状を製造のために単純化することもできる。ただし好ましい手段は、とりわけアライメントが簡単になるという理由から、両側が自由曲面によって画定された検出用補正レンズまたは照明用補正レンズである。

上で挙げた、また以下でさらに説明する特徴が、提示した組合せだけでなく、他の組合せでまたは単独でも、本発明の範囲を超えることなく使用可能なことは自明である。
以下では、例えば本発明の本質を成す特徴も開示している添付の図面に基づいて、本発明をさらにより詳しく説明する。

光シート顕微鏡検査のための装置の基本的な構造を示す図。 検出用対物レンズの第１の実施形態の、波面マニピュレータのある位置を示す全体図。 検出用対物レンズの第１の実施形態の、波面マニピュレータのある位置を示す全体図。 検出用対物レンズの第１の実施形態の、波面マニピュレータのある位置を示す全体図。 図２ａに示した配置に対する検出用補正レンズの領域内のビーム軌道を詳細に示す図。 図２ｂに示した配置に対する検出用補正レンズの領域内のビーム軌道を詳細に示す図。 図２ｃに示した配置に対する検出用補正レンズの領域内のビーム軌道を詳細に示す図。 検出用対物レンズのもう１つの形態の、波面マニピュレータのある位置を示す図。 検出用対物レンズのもう１つの形態の、波面マニピュレータのある位置を示す図。 検出用対物レンズのもう１つの形態の、波面マニピュレータのある位置を示す図。 図４ａに示した波面マニピュレータの位置に対する検出用補正レンズの領域内のビーム軌道を詳細に示す図。 図４ｂに示した波面マニピュレータの位置に対する検出用補正レンズの領域内のビーム軌道を詳細に示す図。 図４ｃに示した波面マニピュレータの位置に対する検出用補正レンズの領域内のビーム軌道を詳細に示す図。

以下に説明する例は、明確に検出用対物レンズに関しているが、何の問題もなく照明用対物レンズにも転用できる。
図１では、最初に光シート顕微鏡検査のための装置の基本的な構造を示している。この装置は、媒質２中にある試料を収容するための試料容器１を含んでおり、この試料容器１は、平らな基準面４に対して位置合わせされている。この装置はさらに、光シートにより照明用ビーム経路を介して試料３を照明するための照明用対物レンズ５を備えた照明光学系を含んでいる。照明用対物レンズ５の光軸、より正確に言えば主光軸６と光シートは１つの平面内にあり、この平面は、基準面４の法線に対してゼロとは異なる照明角度βを含む。この装置はさらに、検出用ビーム経路内に検出用対物レンズ７を備えた検出光学系を含んでおり、この検出用対物レンズの光軸８が基準面４の法線に対してゼロとは異なる検出角度δを含む。この装置はさらに、所定の厚さでの所定の材料からなる少なくとも１つの層を有する隔離層系を含んでおり、この層が、媒質２を照明用対物レンズ５および検出用対物レンズ７から隔離している。この隔離層系は、少なくとも照明用対物レンズ５および検出用対物レンズ７にとって照明または検出が可能な領域内では、基準面４に平行に位置合わせされた基本面で媒質２と接触するように形成されている。

この例では、試料容器１は、上へ開いており、かつ媒質２で満たされたペトリ皿として形成されている。汚染を防止するためには、照明用対物レンズ５および検出用対物レンズ７を試料容器１の上方に配置することができ、この場合には媒質２の表面と対物レンズとの間の空気層だけが隔離層系を形成するか、または図１に示したように試料容器１の下方に配置することができるかのいずれかである。この場合は隔離層系が、１つには試料容器と対物レンズとの間の層から形成されており、ただしもう１つには試料容器１の透明な底部によって形成されており、この底部は、１．０とは異なる屈折率を有する材料から作製されている。検出用対物レンズ７および照明用対物レンズ５は、基準面４およびとりわけ試料容器１の底部に対して斜めに位置しているので、示されていない光源がその後ろにある照明用対物レンズ５から光が隔離層系を通り抜けて試料３へと導かれ、そして試料３から放射された、例えば散乱、反射、または蛍光励起された光が検出用対物レンズ７の方向に隔離層系を同様に斜めに通過する際に、強い収差が生じる。この収差を排除するため、光シート顕微鏡検査のためのこの装置は、検出すべき光が隔離層系の界面を斜めに通過することで生じるような収差を低減するための、少なくとも１つの検出用補正レンズ９を備えた検出用補正レンズ系を含んでいる。底部と対物レンズとの間の層は、例えば空気であり得る。媒質間での高い屈折率ジャンプに基づき、補正すべき回転非対称の欠陥は、互いに類似の屈折率を有する媒質を使用するのに比べて相対的に大きく、この場合には０．８〜１．０の間の開口数の実現は技術的に非常に手間がかかる。したがって、ペトリ皿の底部と対物レンズとの間には浸漬媒質、例えば水が存在するのが好ましい。媒質２が、底部によってまたは上から観察する場合の相応のカバーガラスによって浸漬媒質から隔離されている場合、他の浸漬媒質、例えば生物試料にとって生存を脅かす環境を意味するような浸漬媒質を使用することもできる。媒質２、カバーガラス、およびカバーガラスと対物レンズとの間の浸漬媒質に対し、類似の屈折率を有する材料を選択すれば、大きな開口数に対しても、比較的簡単に自由曲面によって補正を実現することができる。

照明用対物レンズ５は、ここでは概略的に示唆しただけであるが、一般的には同様に多数のレンズを含んでいる。示した例では、基準面４の法線に対する検出用ビーム経路の主光軸８の角度δ＝２６°であり、開口数での開口角は水中で±４０．５５°である。境界面の法線に対する照明用ビーム経路の角度は、開口数ＮＡ＝０．５での典型的な２２°の開口角で、β＝６４°である。試料容器１の容器底部の厚さは、典型的には０．１７ｍｍ〜０．５０ｍｍの間の範囲内であり、ただしこれとは相違することができる。

図１で示した例では、検出用補正レンズ系が、正確に１つの検出用補正レンズ９を含んでおり、この検出用補正レンズは自由曲面レンズとして形成されており、ここでは検出用対物レンズ７のフロントレンズである。しかしこの検出用補正レンズを別個の光学素子として実施し、検出用対物レンズ７と隔離層系との間に配置してもよい。対物レンズ内での配置も原理的には可能であり、その際、場合によっては、１つのレンズだけが表面に自由曲面を備えるので十分である。検出用対物レンズ７は、内焦と同時に、焦点変更時に生じ得る球面収差を補正するための検出用合焦機構を備えることが好ましい。この場合、検出用対物レンズ７の開口数は０．８以上であることが好ましい。

検出用対物レンズ７は、検出用補正レンズ９だけでなく、ビーム経路内にさらに、ここでは例示的に少なくとも１つの任意選択のアダプティブで光学的な検出用合焦素子を、検出用対物レンズ７の内焦と同時に、焦点変更時に生じる球面収差を補正するために含んでいる。照明用対物レンズ５も同じように形成することができる。アダプティブ光学素子はここでは、例えば独国特許第１０２０１２１０１２６２号明細書に記載したような波面マニピュレータ１０として形成されており、独国特許第１０２０１２１０１２６２号明細書の開示をここで再び明示的に参照するよう指示し、かつここで完全に援用する。これに関し、検出用対物レンズおよび照明用対物レンズ内の合焦素子が内焦のためだけに用いられるように、かつ焦点変更時に生じる球面収差の補正は対物レンズのその他のレンズによって既に行われているように設計することも可能である。

図２ａ〜図２ｃおよび図３ａ〜図３ｃに基づき、光シート顕微鏡検査のための装置の一部である検出用対物レンズ７の第１の実施形態をより詳しく説明する。類似の考察および調整が、照明用対物レンズ５にもなされ得る。図２ａ〜図２ｃに示した検出用対物レンズ７の場合、波面マニピュレータ１０として形成されているアダプティブで光学的な検出用合焦素子がビーム経路内に配置されている。図２ａ、図２ｂ、および図２ｃではそれぞれ同じ対物レンズが示されており、ただし波面マニピュレータ１０は異なる位置で示されており、したがって異なるビーム経路が生じている。図３ａ、図３ｂ、および図３ｃは、波面マニピュレータ１０のそれぞれの位置に応じたフロントレンズ領域内の対応する区間を示している。ここでは異なる焦点面が特に良く認識できる。

ここでは厚さ０．１７ｍｍの標準的なカバーガラスを通して検出が行われている。検出用対物レンズ７は、開口数ＮＡ＝１．０で倍率は４０倍である。この検出用対物レンズ７では浸漬媒質には水が規定されており、つまりカバーガラスおよび空気からなる隔離層系の代わりに、ここではカバーガラスおよび水からなる隔離層系を使用するのが望ましい。検出用対物レンズ７は、自由曲面レンズとして形成された検出用補正レンズ９を正確に１つ含んでいる。この検出用補正レンズが、２６°で斜めに通過されるカバーガラスの影響を相殺する。波面マニピュレータ１０は、２つの互いに対して横に移動可能な自由曲面素子を含んでおり、この自由曲面素子は、平均波長が５００ｎｍの際の、試料深さ±５０μｍ内のリフォーカスに適している。この対物レンズは、物体側の像エリアが直径２００μｍである。

図２ａ〜図２ｃには、それぞれ検出用対物レンズ７のメリジオナル断面が示されている。図２ａおよびこれに対応して図３ａでは、波面マニピュレータ１０は、物体側の焦点位置、焦点距離が５０μｍ短い位置にある。図２ｂおよびこれに対応して図３ｂは、波面マニピュレータ１０の真ん中のニュートラルな位置を示しており、図２ｃおよびこれに対応して図３ｃは、試料空間内で焦点位置が５０μｍ深く存在する位置を示している。総括すると、カバーガラスまたは試料容器１の底部から試料空間内の合焦面までの間隔は０．３５ｍｍ〜０．４５ｍｍの間の範囲内で変化する。それぞれの物体側の焦点位置の移動は、図３ａ〜図３ｃの部分拡大図の方が認識しやすい。

検出用対物レンズ７では、デフォーカス領域全体にわたり、結像品質が回折によって制限されている。検出用対物レンズ７は、検出用補正レンズ９および波面マニピュレータ１０に至るまで球面レンズだけを備えており、この球面レンズの表面は、球の方程式

の通常の頂点形状によって表すことができる。

光線束によって斜めに通過されたカバーガラスを補正するための検出用補正レンズ９は、前側にも裏側にも自由曲面を有しており、この両方の自由曲面は、方程式（１ａ）に対応して、球状のベース面と多項式展開の重なりとして表すことができる。波面マニピュレータの自由曲面は、方程式（１ｂ）によって表すことができる。検出用補正レンズ９は、ここでは検出用対物レンズ７のフロントレンズであり、検出すべき光によって斜めに通過されたカバーガラスの影響をほぼ完全に相殺する。ｚ軸は、検出用対物レンズ７の主光軸に相当し、ｘ軸は、図１およびその他の図のシート面に垂直に位置している。

下の表１では、図２ａ〜図２ｃ、図３ａ〜図３ｃに示した検出用対物レンズ７に関する光学的な設計データを示している。すべての光学素子は、屈折性のガラス素子として実施されている。

表１でのｙ半径は、ｙ−ｚ平面における頂点の半径である。半分の直径は、フリーの半直径、つまり、すべての光線束が真っ直ぐにビネットされずに光学系を通過し得る面の必要な直径の半分を表しており、ｍｍで示されている。

面には物体側から通しナンバーがつけられており、そのナンバーを左の欄に示している。試料は、「Ｗ２３」と表示した生理食塩水中に存在しており、この食塩水はカバーガラスと対物レンズとの間にも存在している。カバーガラスの物体側の面の面ナンバーは２である。レンズ面１６とレンズ面１８との間には、示されていない開口絞りが存在しており、検出用補正レンズ９は、物体側の面ナンバーとしては５であり、物体に面していない面ナンバーとしては６である。波面マニピュレータ１０の自由曲面は、ナンバー１５およびナンバー１９である。半径として「∞」の値が示されている場合、その球面はそれぞれ平坦面であり、この場合、非球面の場合には頂点での仮想の円錐断面の半径Ｒ＝０である。厚さはｍｍで示されており、ｙ半径もｍｍで示されている。自由曲面５、６、１５、および１９に至るまですべての面が、球状または平坦である。最後の欄での記述はディセンタリングタイプに関するものであり、自由曲面に関するディセンタリングデータＡＤＥ、ＢＤＥ、ＣＤＥ、ＸＤＥ、ＹＤＥ、ＺＤＥは別のところで表３に記載している。「Ｂａｓｉｃ Ｄｅｃｅｎｔｅｒ」は、そのときの面およびその後のすべての面に関し、係数などを決定するために考慮される座標系が、ディセンタリングデータ分だけ回転および傾斜していることを意味する。記述「Ｄｅｃｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｒｅｔｕｒｎ」は、ディセンタリングがそのときの面に対してのみ有効であり、次の面に関してはその前に有効であったディセンタリングに再び戻ることを意味しており、その順番は面のナンバリングに対応して規定される。設計のために考慮した波長での光学媒質の屈折率を、選択した幾つかの波長に関して表２に示している。表１での面１のディセンタリングデータの場合、ＡＤＥ＝２６．００であり、他のすべての値はゼロである。表１での面４の場合、ＡＤＥ＝−２６．００およびＹＤＥ＝−０．０７８８であり、他のすべての値はゼロである。

ナンバー５を有する自由曲面レンズの前側の物体に面した自由曲面の多項式係数は、以下の通りである。

表中、「Ｘ２Ｙ３」という書き方は、係数Ｃ_２，３、つまりｍ＝２、ｎ＝３などを表しており、「Ｙ」はｎ＝１およびｍ＝０を表している。「ＸＤＥ、．．．、ＣＤＥ」という記述は座標系のディセンタリングに関しており、迫高式である方程式（１ａ）または（１ｂ）によって対応する面が表される局所座標系が、全体座標系に対し、局所ｘ軸の周りを角度ＡＤＥ、局所ｙ軸の周りを角度ＢＤＥ、および局所ｚ軸の周りを角度ＣＤＥだけ回転しているということである。これに関し正号はそれぞれの局所軸の周りでの反時計回りの回転を、負号は時計回りの回転を意味している。

検出用補正レンズ９の後ろ側の自由曲面の多項式係数を表４に示している。

最後に表５には、面ナンバー１５および面ナンバー１９を有する波面マニピュレータ１０の両方の自由曲面の多項式係数を記している。

波面マニピュレータ１０の両方の自由曲面素子の横の移動範囲はそれぞれ０．６７ｍｍであり、これに関しては両方の素子が互いに対して常に厳密に逆行してシステムのｙ座標方向に沿って移動する。自由曲面素子が±０．６７ｍｍの範囲内で横に移動する、つまり互いに対して約１．４ｍｍの相対運動を実施する一方で、物体側の焦点は、ｚ軸に沿った長手方向に±５０μｍ移動する。図３ａと図３ｃとの間で焦点面は試料中により深く移動しており、したがってカバーガラスからの間隔は０．３５ｍｍから０．４５ｍｍへと広がっている。

第２の例示的実施形態が、図４ａ〜図４ｃでは概観において示されており、図５ａ〜図５ｃでは前側の領域に関して部分的に示されている。図２および図３に示した実施形態とは違い、ここで示した検出用対物レンズ７は、ペトリ皿の０．５ｍｍ厚の容器底部１３を通した光シート顕微鏡検査のために設計されている。ここでも検出用対物レンズ７の主光軸と基準面４の法線が２６°の角度を成している。この角度は、表１に関連して説明した第１の例示的実施形態の場合と同様に、機能することを具体的に説明するために恣意的に例として選択したにすぎない。同様に例えば３２°の比較的大きな入射角も可能である。ここに示した検出用対物レンズ７も、物体側の像エリアの直径が０．２ｍｍで、開口数ＮＡ＝１．０および倍率４０倍である。この検出用対物レンズ７では同様に浸漬媒質として水が規定されている。この検出用対物レンズ７も検出用補正レンズ９を含んでおり、この検出用補正レンズ９は、図２および図３に示した検出用補正レンズより明らかに大きな面傾斜角および自由曲面プロファイル深さを有している。検出用補正レンズ９は、２６°で斜めに通過されるペトリ皿の容器底部１３の影響を実質的に完全に相殺するために設計されている。しかしながらペトリ皿の底部は、第１の例示的実施形態で使用したカバーガラスより明らかに厚く、したがって残留欠陥影響が少し大きく残る。図４および図５に示した検出用対物レンズ７も、２つの互いに対して横に移動する自由曲面素子からなる波面マニピュレータ１０を含んでおり、この自由曲面素子は、平均波長が５００ｎｍの際の、試料深さ±５０μｍ内のリフォーカスに適している。これに関し、試料空間内のそれぞれ鮮明に合焦される平面の、容器底部１３の上面から測定した絶対焦点距離は、２．２ｍｍから２．３ｍｍまで変化する。

図４ａ〜図４ｃに示した検出用対物レンズ７は、図２ａ〜図２ｃに示した検出用対物レンズ７と同様に、検出用補正レンズ９の後ろに配置された第１の検出用レンズ群１１を含んでおり、検出用補正レンズ９は第１の検出用レンズ群１１の一部であってもよい。第１の検出用レンズ群１１は、物体側の像エリア１１を最終的に結像する。検出用対物レンズ７はさらに第２の検出用レンズ群１２を含んでおり、この第２の検出用レンズ群はアフォーカルに形成されるのが好ましく、したがってこの第２の検出用レンズ群には結像レンズ系を隣接させることができる。アダプティブで光学的な検出用合焦素子、波面マニピュレータ１０は、第１の検出用レンズ群１１と第２の検出用レンズ群１２との間に配置されている。波面マニピュレータ１０の相互に可動の自由曲面の間に浸漬媒質を入れることができ、ただし図２ａ〜図２ｃおよび図４ａ〜図４ｃに基づく両方の例では、これらの面の間に空気が存在している。

図４ａ〜図４ｃおよび図５ａ〜図５ｃに示した検出用対物レンズ７に関する光学的な設計データを表６に示している。

容器底部の物体側の面はここでも面ナンバー２である。ここでもレンズ面１６とレンズ面１８との間に、示されていない開口絞りが存在している。検出レンズ９の物体側の面は面ナンバー５であり、物体に面していない面は面ナンバー６である。波面マニピュレータ１０の自由曲面は、ここでも面ナンバー１５および面ナンバー１９である。半径として「∞」の値が示されている場合は平坦面である。厚さはｍｍで示されており、ｙ半径もｍｍで示されている。半開口（Ｓｅｍｉ−Ａｐｅｒｔｕｒ）は度で示されている。自由曲面５、６、１５、および１９に至るまですべての面が、球状または平坦である。使用される光学媒質の屈折率を、ここでも選択した幾つかの波長に関して表２に示している。ディセンタリングデータに関しては、表６での面１の場合、ＡＤＥ＝２６．００であり、他のすべての値はゼロである。面４の場合、ＡＤＥ＝−２６．００およびＹＤＥ＝−０．２３３であり、他のすべての値はゼロである。

検出用補正レンズ９の物体側の自由曲面の多項式係数を表７に示している。

検出用補正レンズの後ろ側の、物体に面していない自由曲面の多項式係数および傾斜角を表８に示している。

最後に、波面マニピュレータ１０の両方の同一の自由曲面の多項式係数を表９に示している。

１ 試料容器
２ 媒質
３ 試料
４ 基準面
５ 照明用対物レンズ
６ 光軸
７ 検出用対物レンズ
８ 光軸
９ 検出用補正レンズ
１０ 波面マニピュレータ
１１ 第１の検出用レンズ群
１２ 第２の検出用レンズ群
１３ 容器底部

Claims (14)

1. 光シート顕微鏡検査のための装置であって、
   光シートにより照明用ビーム経路を介して媒質（２）中の試料キャリア上にある試料（３）を照明するための照明用対物レンズ（５）を備えた照明光学系であり、該照明用対物レンズ（５）の光軸（６）と該光シートが１つの平面内にあり、該平面が、前記試料キャリアの底部によって形成された平らな基準面（４）の法線に対してゼロとは異なる照明角度（β）を含み、該基準面に対して該試料キャリアが位置合わせされている照明光学系を含んでおり、
   検出用ビーム経路内に検出用対物レンズ（７）を備えた検出光学系であり、該検出用対物レンズ（７）の光軸（８）が該基準面（４）の法線に対してゼロとは異なる検出角度（δ）を含む検出光学系を含んでおり、
   所定の厚さでの所定の材料からなる少なくとも１つの層を有する隔離層系であり、該隔離層系が、該媒質（２）を該照明用対物レンズ（５）および該検出用対物レンズ（７）から隔離しており、該隔離層系が、該基準面（４）と平行に位置合わせされ、かつ少なくとも該照明用対物レンズ（５）および該検出用対物レンズ（７）にとって照明または検出が可能な領域内では該媒質（２）と接触している基本面を含む、前記隔離層系を含んでおり、
   検出すべき光が該隔離層系の界面を斜めに通過することで生じるような収差を低減するために、少なくとも１つの検出用補正レンズを備えた検出用補正レンズ系を含んでいる、
   光シート顕微鏡検査のための装置において、
   該少なくとも１つの検出用補正レンズ（９）が、自由曲面レンズとして形成されており、検出用対物レンズ（７）と隔離層系との間に配置されているか、または該検出用対物レンズ（７）のフロントレンズであることを特徴とする装置。
2. 前記検出用対物レンズ（７）が、内焦と同時に、焦点変更時に生じる球面収差を補正するための検出用合焦機構を含んでおり、前記検出用対物レンズ（７）の開口数ＮＡが、好ましくは少なくとも０．８であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
3. 前記検出用合焦機構が、内焦と同時に、焦点変更時に生じる球面収差を補正するために、前記ビーム経路内に配置されているかまたは前記ビーム経路内に取り付け可能な少なくとも１つの第１のアダプティブで光学的な検出用合焦素子を含んでいることを特徴とする請求項２に記載の装置。
4. 前記検出用対物レンズ（７）が、前記検出用補正レンズ（９）の後ろに配置され、物体側の像エリアを無限遠に結像する第１の検出用レンズ群（１１）と、好ましくはアフォーカルに形成された第２の検出用レンズ群（１２）とを含んでおり、かつ前記少なくとも１つのアダプティブで光学的な検出用合焦素子が、第１の検出用レンズ群（１１）と第２の検出用レンズ群（１２）との間に配置されていることを特徴とする請求項３に記載の装置。
5. 照明光が前記隔離層系の界面を斜めに通過することで生じるような収差を低減するために、少なくとも１つの照明用補正レンズを備えた照明用補正レンズ系をさらに含んでおり、該照明用補正レンズが、自由曲面レンズとして形成されており、照明用対物レンズ（５）と隔離層系との間に配置されているか、または前記照明用対物レンズ（５）のフロントレンズである、請求項１乃至４いずれか１項に記載の装置。
6. 前記照明用対物レンズ（５）が、内焦と同時に、焦点変更時に生じる球面収差を補正するための照明用合焦機構を含んでおり、前記照明用対物レンズ（５）の開口数ＮＡが、好ましくは高くても０．６であることを特徴とする請求項５に記載の装置。
7. 前記照明用合焦機構が、内焦と同時に、焦点変更時に生じる球面収差を補正するために、前記ビーム経路内に配置されているかまたは前記ビーム経路内に取り付け可能な少なくとも１つのアダプティブで光学的な照明用合焦素子を含んでいることを特徴とする請求項６に記載の装置。
8. 前記照明用対物レンズ（５）が、前記照明用補正レンズの後ろに配置され、物体側の像エリアを無限遠に結像する第１の照明用レンズ群と、好ましくはアフォーカルに形成された第２の照明用レンズ群とを含んでおり、かつ前記少なくとも１つのアダプティブで光学的な照明用合焦素子が、第１の照明用レンズ群と第２の照明用レンズ群との間に配置されていることを特徴とする請求項６に記載の装置。
9. 前記少なくとも１つのアダプティブで光学的な検出用合焦素子および前記少なくとも１つのアダプティブで光学的な照明用合焦素子が、波面マニピュレータとして形成されており、該波面マニピュレータの各々が、好ましくは２つの、光軸に対して横に相互に可動の自由曲面を含んでいることを特徴とする請求項３乃至８のいずれか１項に記載の装置。
10. 前記波面マニピュレータの前記相互に可動の自由曲面の間に、それぞれ浸漬媒質が入れられていることを特徴とする請求項９に記載の装置。
11. 前記自由曲面が形成されている光学素子が、異常部分分散を有する材料から作製されているか、または浸漬媒質が、正常直線から逸脱する分散軌道を有しているか、
    前記自由曲面が形成されている前記光学素子が、異常部分分散を有する材料から作製され、かつ前記浸漬媒質が、正常直線から逸脱する分散軌道を有することを特徴とする請求項９または１０に記載の装置。
12. 第２の検出用レンズ群（１２）がアフォーカルに形成されている場合、前記第２の検出用レンズ群（１２）の後ろに、第３の検出用レンズ群が配置されており、該第３の検出用レンズ群が結像レンズ群として形成されており、かつ前記検出用対物レンズ（７）が、実像での中間像を生成するよう形成されていることを特徴とする請求項４乃至１１のいずれか１項に記載の装置。
13. 前記検出用補正レンズ（９）を備えた第１の検出用レンズ群（１１）、および前記隔離層系の前記少なくとも１つの層または照明用補正レンズを備えた第１の照明用レンズ群、および前記隔離層系の前記少なくとも１つの層が、条件
    ｈ_１＝ｆ_ＦＧ・ｓｉｎσ_０＝ｎ_０・ｆ’_ＦＧ・ｓｉｎσ_０
    を実質的に満たす光学系であり、
    式中、ｈ _１ は、波面マニピュレータでの開口ビームの入射高であり、σ _０ は、光軸に対する周辺ビームのビーム傾斜角であり、ｆ _ＦＧ ＝−ｎ _０ ＊ｆ’ _ＦＧ は、フロントレンズ群の前側の物体側の焦点距離であり、ｎ _０ は、物体とフロントレンズとの間の浸漬媒質の屈折率であることを特徴とする請求項４乃至１２のいずれか１項に記載の装置。
14. 前記第１の検出用レンズ群（１１）および前記第１の照明用レンズ群のうちの少なくとも一方が、非球面レンズを含むことを特徴とする請求項１３に記載の装置。