JP6324395B2 - 軟骨細胞を移植する方法 - Google Patents

Description

本出願は、２０１２年１０月２９日出願の米国特許出願第６１／７１９，９０２号の利益を主張し、その全体は引用により本明細書に組み込まれる。

本明細書には、幾つかの実施形態において、ａ）分離され且つ精製された、非変性のＩＩ型コラーゲンと、ｂ）ヒアルロナンと、ｃ）硫酸コンドロイチンとを含む、３成分マトリックス（ｔｒｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｍａｔｒｉｘ）が開示される。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に水を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは基本培地を更に含む。幾つかの実施形態において、基本培地はＭｅｄｉｕｍ １９９である。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンはウシ由来のＩＩ型コラーゲンである。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌ乃至約５ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの濃度は約３ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約３ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンの濃度は約１ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、硫酸コンドロイチンの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約３ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、硫酸コンドロイチンの濃度は約１ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、軟骨細胞、軟骨前駆細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、又はそれらの任意の組み合わせを更に含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に軟骨細胞を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に軟骨前駆細胞を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更にｉＰＳ細胞を含む。

本明細書には、幾つかの実施形態において、軟骨設計（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のための移植組成物を生成するためのプロセスが開示され、該プロセスは、ａ）酸を含む溶液中で、分離され且つ精製された非変性のＩＩ型コラーゲンを溶解する工程であって、ＩＩ型コラーゲンの終末濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌ乃至約５ｍｇ／ｍｌである、工程と、ｂ）酸を中和する工程と、ｃ）約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約３ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンを加える工程と、ｄ）３成分マトリックスが生成される、約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約３ｍｇ／ｍｌの硫酸コンドロイチンを加える工程とを含む。幾つかの実施形態において、酸は酢酸である。幾つかの実施形態において、酢酸は、約０．０１Ｍの濃度である。幾つかの実施形態において、酢酸は、ＮａＨＣＯ_３／ＨＥＰＥＳで中和される。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、Ｍｅｄｉｕｍ １９９を含む。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンは、約１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えられる。幾つかの実施形態において、硫酸コンドロイチンは、約１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えられる。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの終末濃度は約３ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、前記プロセスは、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、又はそれらの任意の組み合わせを、３成分マトリックスに加える工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記プロセスは、３成分マトリックスに軟骨細胞を加える工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記プロセスは、３成分マトリックスに軟骨前駆細胞を加える工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記プロセスは、３成分マトリックスにｉＰＳ細胞を加える工程を更に含む。

本明細書には、幾つかの実施形態において、必要とする被験体の内因性の軟骨増殖を誘発する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示されるような３成分マトリックスを被験体に移植する工程を含む。

本明細書には、幾つかの実施形態において、必要とする被験体の骨又は軟骨の欠損症を処置する方法が開示され、該方法は、骨又は軟骨の欠損症の部位にて、ｉ）本明細書に開示されるような３成分マトリックスと、ｉｉ）細胞の集まりとを含む、移植組成物を投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、細胞の集まりは、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、新たな組織が生成される。幾つかの実施形態において、新たな組織は、軟骨又は骨の表面を修復する。幾つかの実施形態において、新たな組織はＩＩ型コラーゲンを含む。幾つかの実施形態において、新たな組織は、通常の関節軟骨の表面領域、中間領域、及び深い領域の特徴を含む。幾つかの実施形態において、新たな組織の表面領域はラブリシンを含む。幾つかの実施形態において、新たな組織は、奇形腫、腫瘍細胞、変形の証拠、異常な構造的特徴、又は他の不適切な細胞型を含まない。幾つかの実施形態において、細胞の集まりは軟骨細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞の集まりは軟骨前駆細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞の集まりはｉＰＳ細胞を含む。幾つかの実施形態において、ｉＰＳ細胞は、軟骨細胞由来である。幾つかの実施形態において、軟骨前駆細胞は、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞である。幾つかの実施形態において、軟骨細胞は、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞である。

本明細書には、幾つかの実施形態において、必要とする被験体の軟骨関連の障害を処置する方法が開示され、該方法は、軟骨の損傷又は欠損症の部位に、請求項１に記載の３成分マトリックス、及び軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの任意の組み合わせの混合物を投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、軟骨関連の障害は、関節軟骨外傷、半月板損傷、軟骨形成（ｃｈｏｎｏｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）障害、関節炎、軟骨疾患、軟骨肉腫、軟骨軟化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、大腿骨頭すべり症、離断性骨軟骨炎、軟骨異形成症、肋軟骨炎、骨軟骨腫、脊椎症、骨軟骨症（ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｏｓｅｓ）、ティーツェ症候群、フランソワの皮膚軟骨角膜ジストロフィー（ｄｅｒｍｏｃｈｏｎｄｒｏｃｏｒｎｅａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、骨端異形成症、手根関連性（ｃａｒｐｏｔａｒｓａｌ）骨軟骨腫症、軟骨無形成症（ａｃｈｏｎｄｒｏｐａｓｉａ）、軟骨石灰化症、遺伝性軟骨種症、軟骨腫、軟骨無発生症、内軟骨種（ｅｃｈｏｎｄｒｏｍａｔａ）、軟骨低形成症（ｈｙｐｒｏｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ）、又はＫｅｕｔｅｌ症候群である。幾つかの実施形態において、軟骨関連の障害は関節炎である。幾つかの実施形態において、関節炎は骨関節炎である。幾つかの実施形態において、骨関節炎は、被験体の膝、指、手首、殿部、脊椎、肩、肘、つま先、足首、又は頚部に生じる。

本明細書には、幾つかの実施形態において、ａ）本明細書に開示されるような３成分マトリックスと、ｂ）軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの任意の組み合わせから選択される細胞とを含む、軟骨修復インプラントが開示される。幾つかの実施形態において、軟骨修復インプラントは、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸、アルギン酸塩、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸−ポリグリコール酸のコポリマー、ヒト真皮、シートなどの膜、スポンジなどの多孔体、メリヤス地、布地、不織布、綿、多孔質材料等のメッシュ、又はそれらの組み合わせから選択される生体基質を更に含む。

本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される、具体例を明記する後述の詳細な説明、及び以下の添付図面を参照することによって得られる。
図１は、Ｈ９由来の軟骨前駆体（ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、及び、成人のヒト軟骨細胞（ＣＨＯＮ−１及びＣＨＯＮ−２）由来の軟骨前駆体による組織修復を示す。アルシアンブルーとサフラニンＯの染色は、Ｈ９由来の軟骨前駆体と、成人のヒト軟骨細胞由来の軟骨前駆体との間で比較可能であった。空の骨軟骨欠損、又はマトリゲルのみで満たされた骨軟骨欠損において、弱い組織修復が見られた。 図２は、Ｈ９由来の軟骨前駆体（Ｈ９−Ｄ ＭＳＣ）、成人のヒト軟骨細胞（軟骨細胞）、多能性細胞由来の軟骨前駆体（ＩＰＳＣ）、及び成人のヒト間葉系幹細胞（成人のＭＳＣ）による組織修復を示す。細胞は、外科移植前にＩＩ型コラーゲン、硫酸コンドロイチン、及びヒアルロン酸の３成分マトリックスに埋め込まれた。 図３は、外科移植前にＩＩ型コラーゲン、硫酸コンドロイチン、及びヒアルロン酸の３成分マトリックスに埋め込まれた、Ｈ９由来の軟骨前駆体（Ｈ９由来のＭＳＣ）、成人のヒト軟骨細胞、多能性細胞由来の軟骨前駆体（軟骨細胞由来のＩＰＳＣ）、及び成人のヒト間葉系幹細胞（成人のヒトＭＳＣ）によって生じさせられた、組織の機械的剛性を示す。示される単位はニュートン／ｍｍである。 図４は、Ｈ９由来の軟骨前駆体、及び成人のヒト軟骨細胞由来の軟骨前駆体による組織修復を示す。細胞は、外科移植前にアルギン酸塩に埋め込まれた。

本明細書には、幾つかの実施形態において、ａ）分離され且つ精製された、非変性のＩＩ型コラーゲンと、ｂ）ヒアルロナンと、ｃ）硫酸コンドロイチンとを含む、３成分マトリックスが開示される。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に水を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは基本培地を更に含む。幾つかの実施形態において、基本培地はＭｅｄｉｕｍ １９９である。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンはウシ由来のＩＩ型コラーゲンである。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌ乃至約５ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの濃度は約３ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約３ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンの濃度は約１ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、硫酸コンドロイチンの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約３ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、硫酸コンドロイチンの濃度は約１ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの任意の組み合わせを更に含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に軟骨細胞を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に軟骨前駆細胞を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更にｉＰＳ細胞を含む。

本明細書には、幾つかの実施形態において、軟骨設計のための移植組成物を生成するためのプロセスが開示され、該プロセスは、ａ）酸を含む溶液中で、分離され且つ精製された非変性のＩＩ型コラーゲンを溶解する工程であって、ＩＩ型コラーゲンの終末濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌ乃至約５ｍｇ／ｍｌである、工程と、ｂ）酸を中和する工程と、ｃ）約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約３ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンを加える工程と、ｄ）３成分マトリックスが生成される、約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約３ｍｇ／ｍｌの硫酸コンドロイチンを加える工程とを含む。幾つかの実施形態において、酸は酢酸である。幾つかの実施形態において、酢酸は、約０．０１Ｍの濃度である。幾つかの実施形態において、酢酸は、ＮａＨＣＯ_３／ＨＥＰＥＳで中和される。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、Ｍｅｄｉｕｍ １９９を含む。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンは、約１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えられる。幾つかの実施形態において、硫酸コンドロイチンは、約１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えられる。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの終末濃度は約３ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、前記プロセスは、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、又はそれらの任意の組み合わせを、３成分マトリックスに加える工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記プロセスは、３成分マトリックスに軟骨細胞を加える工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記プロセスは、３成分マトリックスに軟骨前駆細胞を加える工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記プロセスは、３成分マトリックスにｉＰＳ細胞を加える工程を更に含む。

本明細書には、幾つかの実施形態において、必要とする被験体の内因性の軟骨増殖を誘発する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示されるような３成分マトリックスを被験体に移植する工程を含む。

本明細書には、幾つかの実施形態において、必要とする被験体の骨又は軟骨の欠損症を処置する方法が開示され、該方法は、骨又は軟骨の欠損症の部位にて、ｉ）本明細書に開示されるような３成分マトリックスと、ｉｉ）細胞の集まりとを含む、移植組成物を投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、細胞の集まりは、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、新たな組織が生成される。幾つかの実施形態において、新たな組織は、軟骨又は骨の表面を修復する。幾つかの実施形態において、新たな組織はＩＩ型コラーゲンを含む。幾つかの実施形態において、新たな組織は、通常の関節軟骨の表面領域、中間領域、及び深い領域の特徴を含む。幾つかの実施形態において、新たな組織の表面領域はラブリシンを含む。幾つかの実施形態において、新たな組織は、奇形腫、腫瘍細胞、変形の証拠、異常な構造的特徴、又は他の不適切な細胞型を含まない。幾つかの実施形態において、細胞の集まりは軟骨細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞の集まりは軟骨前駆細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞の集まりはｉＰＳ細胞を含む。幾つかの実施形態において、ｉＰＳ細胞は、軟骨細胞由来である。幾つかの実施形態において、軟骨前駆細胞は、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞である。幾つかの実施形態において、軟骨細胞は、Ｓｏｘにより形質導入した軟骨細胞である。

本明細書には、幾つかの実施形態において、必要とする被験体の軟骨関連の障害を処置する方法が開示され、該方法は、軟骨の損傷又は欠損症の部位に、請求項１に記載の３成分マトリックス、及び軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの任意の組み合わせの混合物を投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、軟骨関連の障害は、関節軟骨外傷、半月板損傷、軟骨形成障害、関節炎、軟骨疾患、軟骨肉腫、軟骨軟化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、大腿骨頭すべり症、離断性骨軟骨炎、軟骨異形成症、肋軟骨炎、骨軟骨腫、脊椎症、骨軟骨症、ティーツェ症候群、フランソワの皮膚軟骨角膜ジストロフィー、骨端異形成症、手根関連性骨軟骨腫症、軟骨無形成症、軟骨石灰化症、遺伝性軟骨種症、軟骨腫、軟骨無発生症、内軟骨種、軟骨低形成症、又はＫｅｕｔｅｌ症候群である。幾つかの実施形態において、軟骨関連の障害は関節炎である。幾つかの実施形態において、関節炎は骨関節炎である。幾つかの実施形態において、骨関節炎は、被験体の膝、指、手首、殿部、脊椎、肩、肘、つま先、足首、又は頚部に生じる。

本明細書には、幾つかの実施形態において、ａ）本明細書に開示されるような３成分マトリックスと、ｂ）軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの任意の組み合わせから選択される細胞とを含む、軟骨修復インプラントが開示される。幾つかの実施形態において、軟骨修復インプラントは、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸、アルギン酸塩、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸−ポリグリコール酸のコポリマー、ヒト真皮、シートなどの膜、スポンジなどの多孔体、メリヤス地、布地、不織布、綿、多孔質材料等のメッシュ、又はそれらの組み合わせから選択される生体基質を更に含む。

＜軟骨＞
関節軟骨は、可動関節（例えば膝、殿部、肩、等）における、対向した骨の表面を覆う硝子軟骨の一種である。関節軟骨は、骨の間にほぼ摩擦がない（ｎｅａｒ−ｆｒｉｃｔｉｏｎｌｅｓｓ）関節をもたらし、その一方で、関節が受ける圧縮力及び剪断力を吸収し且つ伝達するように機能する。更に、関節軟骨に関連した組織が１つの神経系（ａｎｅｕｒａｌ）であるため、これらの負荷の吸収と伝達の機能が健康な関節において痛みを伴うことなく生じる。

繊維軟骨は、滑車（ｐｕｌｌｙ）の周囲を包み込む特定の腱における包含物として、可動関節、恥骨結合関節、椎間板、関節円板において見出され、及び、骨の中への靭帯と腱の挿入部位にて見出される。Ｉ型及びＩＩ型コラーゲンの繊維の混合物で作られると、繊維軟骨は傷つけられ、その結果患部関節に疼痛を引き起こし得る。

用語「軟骨」は関節軟骨と繊維軟骨を含むことが、この適用の目的のために理解される。

＜３成分インプラント・マトリックス＞
本明細書には、医療用移植と細胞培養に役立つ新規な物質と、それらを作り且つ使用する方法が開示される。本発明の特徴及び利点と同様に、付加的な実施形態も、本明細書の記載から明白になる。

本明細書には、幾つかの実施形態において、３成分マトリックスが開示される。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、コラーゲン；ヒアルロナン；及び硫酸コンドロイチンを含む。幾つかの実施形態において、コラーゲンはＩＩ型コラーゲンである。幾つかの実施形態において、コラーゲンは非変性である。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に水を含む。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に、軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に間葉系幹細胞を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞を含む。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスはゲルである。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは成型固体である。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは液体である。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは基本培地を更に含む。幾つかの実施形態において、基本培地は、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、ＤＭＥＭ（例えば、ウシ胎仔血清により補足されたＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、ＨａｍのＦ−１２、又はそれらの任意の組み合わせである。幾つかの実施形態において、基本培地は軟骨細胞基本培地である。幾つかの実施形態において、基本培地は次の成分を含む：グリシン；Ｌ−アラニン；Ｌ−塩酸アルギニン；Ｌ−アスパラギン酸；Ｌ−塩酸システイン−Ｈ_２Ｏ；Ｌ−シスチン２ＨＣｌ；Ｌ−グルタミン酸；Ｌ−グルタミン；Ｌ−塩酸ヒスチジン−Ｈ_２Ｏ；Ｌ−ヒドロキシプロリン；Ｌ−イソロイシン；Ｌ−ロイシン；Ｌ−塩酸リジン；Ｌ−メチオニン；Ｌ−フェニルアラニン；Ｌ−プロリン；Ｌ−セリン；Ｌ−スレオニン；Ｌ−トリプトファン；Ｌ−チロシン・ジナトリウム塩脱水物（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）；Ｌ−バリン；アルファ−リン酸トコフェロール；アスコルビン酸；ビオチン；塩化コリン；Ｄ−パントテン酸カルシウム；葉酸；メナジオン（ビタミンＫ３）；ナイアシンアミド；ニコチン酸（ナイアシン）；パラアミノ安息香酸；塩酸ピリドキサール；塩酸ピリドキシン；リボフラビン；塩酸チアミン；ビタミンＡ（酢酸塩）；ビタミンＤ２（カルシフェロール）；ｉ−イノシトール；塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（無水）；硝酸第２鉄（Ｆｅｒｒｉｃ ｎｉｔｒａｔｅ）（Ｆｅ（ＮＯ_３）−９Ｈ_２Ｏ）；硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（無水）；塩化カリウム（ＫＣｌ）；重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）；塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；一塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｈ_２Ｏ）；２−デオキシ−Ｄ−リボース；硫酸アデニン；アデノシン５’−ホスファート；アデノシン５’−トリホスファート；コレステロール；Ｄ−グルコース（デキストロース）；グルタチオン（還元した（ｒｅｄｕｃｅｄ））；塩酸グアニン；ヒポキサンチン・ナトリウム；フェノールレッド；リボース；酢酸ナトリウム；チミン；Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）；ウラシル；及びキサンチン−Ｎａ。幾つかの実施形態において、基本培地はＭｅｄｉｕｍ １９９である。

幾つかの実施形態において、基本培地は、血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）（例えばＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及びＰＤＧＦ−ＡＡ）、脂質（例えばステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、酢酸アルファ−トコフェロール）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（例えばＢＭＰ−４又はＢＭＰ−６）、ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ヒドロコルチゾン、フィブロネクチン、ｂＦＧＦ、アルブミン、インスリン、ＦＢＳ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、ＩＩ型コラーゲン（例えば、分離され且つ精製された非変性のＩＩ型コラーゲン）を含む。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンは非変性である。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に、ＶＩ型、ＩＸ型、Ｘ型、ＸＩ型、及び／又はＸＩＩＩ型のコラーゲンを含む。

幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンは任意の適切なソースに由来する。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンは、哺乳動物以外の脊椎動物（例えばサメ）に由来する。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンは哺乳動物に由来する。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンはヒトに由来する。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンは非ヒト哺乳動物に由来する。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンは、ウシ由来、ウマ由来、又はブタ由来である。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンはウシ由来のＩＩ型コラーゲンである。

幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの濃度は約０．１ｍｇ／ｍｌ乃至約５０ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌ乃至約２５ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの濃度は約１ｍｇ／ｍｌ乃至約１０ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの濃度は約１ｍｇ／ｍｌ乃至約５ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲンの濃度は約３ｍｇ／ｍｌである。

ヒアルロナン（ヒアルロン酸又はＨＡとも呼ばれた）は、陰イオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである。それは、Ｄ−グルクロン酸とＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンからなり、交互の（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）β−１，４及びβ−１，３のグリコシド結合を介して結合される、二糖類上で構成される。ヒアルロナンの大きさは異なる。ヒアルロナンは、２５，０００の二糖類の繰り返しと共に見出された。それらは、インビボにて大きさが５，０００乃至２０，０００，０００Ｄａまで変動する。ヒト関節液における平均分子量は、３００万−４００万Ｄａであり、ヒト臍帯から精製したヒアルロナンは３，１４０，０００Ｄａである。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、高分子量のヒアルロナン（即ち、約１０００Ｄａより大きい）を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、低分子量のヒアルロナン（即ち、約１０００Ｄａ未満）を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約５００Ｄａ乃至約２０，０００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約５００乃至約５，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約８０，０００乃至約８００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約１０００乃至約１５，０００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約２０００乃至約１０，０００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約３０００乃至約７，５００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約４０００乃至約５，０００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約５０００乃至約２，５００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約６０００乃至約１，０００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約７０００乃至約９００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約８０００乃至約８００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約９０００乃至約７００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約１０，０００乃至約６００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約１５，０００乃至約５００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約２０，０００乃至約４００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約２５，０００乃至約３００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約３０，０００乃至約２００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約３５，０００乃至約２００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約４０，０００乃至約１００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、約５０，０００乃至約１００，０００Ｄａの大きさを持つヒアルロナンを含む。

幾つかの実施形態において、ヒアルロナンの濃度は約０．１ｍｇ／ｍｌ乃至約２５ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約１０ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約５ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ヒアルロナンの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約３ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、ヒアルロン酸の濃度は約１ｍｇ／ｍｌである。

硫酸コンドロイチンは、一連の交互の糖：Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及びＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）からなる硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。特定の例において、コンドロイチン鎖には、１００以上の個々の糖があり、その各々は、変更可能な位置と量で硫酸化され得る。硫酸コンドロイチンは軟骨の構造成分である。硫酸コンドロイチンの堅くパックされ（ｐａｃｋｅｄ）且つ高度に負荷した硫酸エステル基は、圧縮に対する軟骨の抵抗性の大半を提供する静電気反発を生じさせる。硫酸化の部位はコンドロイチン鎖の中で異なる。コンドロイチン硫酸Ａは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）糖の炭素４上で硫酸化される。コンドロイチン硫酸Ｃは、ＧａｌＮＡｃ糖の炭素６上で硫酸化される。硫酸コンドロイチンＤは、グルクロン酸の炭素２とＧａｌＮＡｃ糖の炭素６上で硫酸化される。硫酸コンドロイチンＥは、ＧａｌＮＡｃ糖の炭素４及び６の上で硫酸化される。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、任意の適切な硫酸コンドロイチンを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、硫酸コンドロイチンＡ、硫酸コンドロイチンＣ、硫酸コンドロイチンＤ、及び／又は硫酸コンドロイチンＥを含む。

幾つかの実施形態において、硫酸コンドロイチンの濃度は約０．１ｍｇ／ｍｌ乃至約２５ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、硫酸コンドロイチンの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約１０ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、硫酸コンドロイチンの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約５ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態において、硫酸コンドロイチンの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至約３ｍｇ／ｍｌである。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、天然の軟骨細胞の内部成長のための培地である。幾つかの実施形態において、マトリックスは更に、インビボでの移植前又は後に、軟骨細胞を含む。幾つかの実施形態において、マトリックスは、（例えば注射により）被験体への移植の直前に軟骨細胞を含浸される。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは追加の添加剤を更に含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスに含まれる追加の添加剤は、例えば、ｃｈｏｎｄｒｏｎｅｃｔｉｎ、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸カルシウム、ａｎｃｈｏｒｉｎ ＩＩ、バイグリカン（ｂｉｇｌｙｃａｎ）、デコリン、バーシカン、フィブロモジュリン、ルミカン、骨、軟骨細胞成長促進ホルモン、及び軟骨誘導因子（ＣＩＰ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−１、形質転換増殖因子［ベータ］（ＴＧＦβ）、ＴＧＦ−β１などの増殖因子、天然又は組み換え型のヒトＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニン（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｎ））、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ｂＦＧＦ、ＣＤＭＰ、又は他の骨格マトリックス分子などの骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）及び骨形成因子（ＢＭＰ）、同様に、血管内皮成長因子（ＥＧＦ／ＶＥＧＦ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク（ＰＴＨｒＰ）、及び血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）などのシグナル伝達ペプチドを含む。幾つかの実施形態において、上記に列挙した追加の添加剤の何れかをコード化する、又は上記に列挙した添加剤のインビボ産生を誘発又は促進することができる、核酸配列（例えば、哺乳動物の発現ベクター）が、３成分マトリックス材料に組み込まれる。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは活性薬剤を更に含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、抗菌剤（例えば、タウロリジン、タウルルタム、又はテトラサイクリン及びゲンタマイシンなどの抗生物質）を更に含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に、抗炎症剤を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更にＮＳＡＩＤを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、セレコキシブ、オキサプロジン、サルサレート、ジフルニサル、インドメタシン、メロキシカム、ケトロラク、ジクロフェナク、ナプロキセン、スリンダク、テノキシカム、エトドラク、ナブメトン、ピロキシカム、カルプロフェン、フルビプロフェン、イブプロフェン、アスピリン、パラセタモール、又はそれらの任意の組み合わせを更に含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、ステロイド（例えばコルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ソルメドロール、トリアムシノロン、ｋｅｎａｌｏｇ、セレストン、及びデポメドロール）を更に含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、疾患を修飾する抗リウマチ性薬物（ＤＭＡＲＤ）を更に含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、アバタセプト、アダリムマブ、アザチオプリン、クロロキン、水酸化クロロキン、シクロスポリンＡ、Ｄ−ペニシラミン、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、リツキシマブ、スルファサラジン、又はそれらの任意の組み合わせを更に含む。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、血管新生を予防又は減少する薬剤を更に含む。血管新生を予防又は減少する薬剤の例は、限定されないが、チロシンキナーゼ阻害剤（チロシンキナーゼ受容体Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の阻害剤、表皮由来の阻害剤など）、線維芽細胞由来又は血小板由来の増殖因子、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害剤、インテグリン遮断薬、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ペントサンポリサルフェート、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（アスピリンとイブプロフェンのような非ステロイド性の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、同様に、セレコキシブとロフェコキシブのような選択的なシクロオキシ−ゲナーゼ−２阻害剤を含む）、ステロイド抗炎症剤（コルチコステロイド、ミネラルコルチコイド、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレド（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄ）、ベタメタゾンなど）、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクワラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、血液造成阻害剤、トロポニン−１、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、及びＶＥＧＦに対する抗体を含む。

幾つかの実施形態において、本明細書に開示される３成分マトリックスは、アルギナートマトリックスほど炎症反応をあまり誘発しない。

＜細胞を培養する方法＞
本発明はまた、本明細書で開示されるような３成分マトリックス中で細胞を培養する工程を含む、細胞を培養する方法を提供し、該３成分マトリックスは、ａ）分離され且つ精製された、非変性のＩＩ型コラーゲンと、ｂ）ヒアルロナンと、ｃ）硫酸コンドロイチンとを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックス内の細胞は、組織培養容器中で培養される。幾つかの実施形態において、組織培養容器は組織培養グレードのプラスチックである。幾つかの実施形態において、プラスチックはポリスチレンである。幾つかの実施形態において、組織培養容器はガラスである。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは細胞培養培地を更に含む。幾つかの実施形態において、細胞培養培地は基本培地である。幾つかの実施形態において、基本培地は、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、ＤＭＥＭ（例えば、ウシ胎仔血清により補足されたＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、ＨａｍのＦ−１２、又はそれらの任意の組み合わせである。幾つかの実施形態において、基本培地は軟骨細胞基本培地である。幾つかの実施形態において、基本培地は次の成分を含む：グリシン；Ｌ−アラニン；Ｌ−塩酸アルギニン；Ｌ‐アスパラギン酸；Ｌ−塩酸システイン−Ｈ_２Ｏ；Ｌ−シスチン２ＨＣｌ；Ｌ−グルタミン酸；Ｌ−グルタミン；Ｌ−塩酸ヒスチジン−Ｈ_２Ｏ；Ｌ−ヒドロキシプロリン；Ｌ−イソロイシン；Ｌ−ロイシン；Ｌ−塩酸リジン；Ｌ−メチオニン；Ｌ−フェニルアラニン；Ｌ−プロリン；Ｌ−セリン；Ｌ−スレオニン；Ｌ−トリプトファン；Ｌ−チロシン・ジナトリウム塩脱水物；Ｌ−バリン；アルファ−リン酸トコフェロール；アスコルビン酸；ビオチン；塩化コリン；Ｄ−パントテン酸カルシウム；葉酸；メナジオン（ビタミンＫ３）；ナイアシンアミド；ニコチン酸（ナイアシン）；パラアミノ安息香酸；塩酸ピリドキサール；塩酸ピリドキシン；リボフラビン；塩酸チアミン；ビタミンＡ（酢酸塩）；ビタミンＤ２（カルシフェロール）；ｉ−イノシトール；塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（無水）；硝酸第２鉄（Ｆｅ（ＮＯ_３）−９Ｈ_２Ｏ）；硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（無水）；塩化カリウム（ＫＣｌ）；重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）；塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；一塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｈ_２Ｏ）；２−デオキシ−Ｄ−リボース；硫酸アデニン；アデノシン５’−ホスファート；アデノシン５’−トリホスファート；コレステロール；Ｄ−グルコース（デキストロース）；グルタチオン（還元した）；塩酸グアニン；ヒポキサンチン・ナトリウム；フェノールレッド；リボース；酢酸ナトリウム；チミン；Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）；ウラシル；及びキサンチン−Ｎａ。幾つかの実施形態において、基本培地はＭｅｄｉｕｍ １９９である。

幾つかの実施形態において、基本培地は、血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）（例えばＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及びＰＤＧＦ−ＡＡ）、脂質（例えばステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、酢酸アルファ−トコフェロール）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（例えばＢＭＰ−４又はＢＭＰ−６）、ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ヒドロコルチゾン、フィブロネクチン、ｂＦＧＦ、アルブミン、インスリン、ＦＢＳ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

＜使用方法＞
本明細書には、特定の実施形態において、必要とする被験体の内因性の軟骨増殖を誘発する方法が開示され、該方法は、本明細書に開示されるような３成分マトリックスを被験体に移植する工程を含み、該３成分マトリックスは、ａ）分離され且つ精製された、非変性のＩＩ型コラーゲンと、ｂ）ヒアルロナンと、ｃ）硫酸コンドロイチンとを含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは更に、軟骨細胞及び／又は軟骨前駆細胞を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、針で軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅｏｎｏｕｓ）領域に３成分を注入する工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、関節（例えば滑膜性関節）に３成分マトリックスを注入する工程を含む。幾つかの実施形態において、被験体には、軟骨の欠損症（例えば軟骨の変質又は欠如）がある。幾つかの実施形態において、被験体には軟骨関連疾患がある。幾つかの実施形態において、被験体には、変形性関節症、関節リウマチ、肋軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、又はその任意の組み合わせがある。幾つかの実施形態において、被験体には骨関節炎がある。幾つかの実施形態において、被験体には関節リウマチがある。幾つかの実施形態において、被験体には、身体外傷によって軟骨に引き起こされる損傷がある。

幾つかの実施形態において、本明細書に開示される３成分マトリックスが、軟骨組織を再生成する方法に使用される。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの任意の組み合わせを更に含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、骨又は軟骨の欠損症の領域に直接入れられる。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、追加の支持生体材料と共に、骨又は軟骨の欠損症の領域に入れられる。幾つかの実施形態において、新たな軟骨組織が形成される。幾つかの実施形態において、新たな軟骨組織は、骨又は軟骨の欠損症の組織を統合する。幾つかの実施形態において、新たな軟骨組織は、軟骨又は骨の表面を修復する。幾つかの実施形態において、新たな軟骨組織はＩＩ型コラーゲンを含む。幾つかの実施形態において、新たな軟骨組織は、通常の関節軟骨の表面領域、中間領域、及び深い領域の特徴を含む。幾つかの実施形態において、新たな軟骨組織の表面領域はラブリシンを含む。幾つかの実施形態において、新たな軟骨組織は、奇形腫、腫瘍細胞、変形の証拠、異常な構造的特徴、又は他の不適切な細胞型を含まない。

本明細書には、幾つかの実施形態において、軟骨関連の障害を処置する方法が開示され、該方法は、本明細書に記載されるような３成分マトリックスの、必要とする被験体の軟骨損傷又は欠損症の部位への投与を含む。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの任意の組み合わせを更に含む。幾つかの実施形態において、軟骨関連の障害は、関節軟骨外傷、半月板損傷、軟骨形成障害、関節炎、軟骨疾患、軟骨肉腫、軟骨軟化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、大腿骨頭すべり症、離断性骨軟骨炎、軟骨異形成症、肋軟骨炎、骨軟骨腫、脊椎症、骨軟骨症、ティーツェ症候群、フランソワの皮膚軟骨角膜ジストロフィー、骨端異形成症、手根関連性骨軟骨腫症、軟骨無形成症、軟骨石灰化症、遺伝性軟骨種症、軟骨腫、軟骨無発生症、内軟骨種、軟骨低形成症、又はＫｅｕｔｅｌ症候群である。幾つかの実施形態において、軟骨関連の障害は関節炎である。幾つかの実施形態において、関節炎は骨関節炎である。幾つかの実施形態において、骨関節炎は、被験体の膝、指、手首、殿部、脊椎、肩、肘、つま先、足首、又は頚部に生じる。

本明細書には、幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるような３成分マトリックスを含み、更に、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞、軟骨細胞由来のｉＰＳ細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含む、軟骨修復インプラントが開示される。幾つかの実施形態において、軟骨修復インプラントは追加の生体材料基質を更に含む。追加の生体材料の例は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸、アルギン酸塩（例えばカルシウム塩）、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸−ポリグリコール酸のコポリマー、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヒト真皮、又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、プロテオグリカンとグリコサアミノグリカンは硫酸化される。幾つかの実施形態において、追加の生体材料基質は、シートなどの膜、スポンジなどの多孔体、ニット、布地、不織布、綿などのメッシュなどである。幾つかの実施形態において、追加の生体材料は多孔質材料である。

幾つかの実施形態において、軟骨修復インプラントは、軟骨組織を形成し、軟骨性骨化を誘発する。幾つかの実施形態において、骨化はまた、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）などの、骨形成を促進する増殖因子によって促進される。

記載された軟骨治療材料の移植前に、処置される領域を準備することが望ましい。この目的のために、欠損症は、インプラントが血管新生等の危険性を減少させるために（特にその付着に関して）効果的になる（ｔａｋｅ）と確認するために準備されねばならない。一般的に、欠損症は、（領域から全ての欠陥のある軟骨を排除するために）前もって処置され、その後、清浄される。次に、様々な移植技術が、移植した材料（懸濁液、マトリックス、インビトロで再構築された軟骨）に応じて実施され得る。

一般的に、記載した軟骨治療材料の移植は、手術中に、生物分解性の縫合糸を介して、又は生物接着剤の適用によりインプラントを取り付けるなどの、当業者に既知の様々な外科技術を適用することにより、実行される。生物接着剤の例は、著しくは、フィブリン及び／又はトロンビンで作られた生物学的グルー、又は他の生体適合性材料を含む。より具体的に、再吸収可能な生体適合性フィルムは、生物学的又は生体適合性のグルーによって、処置される領域に付けられる。好ましい変異体において、フィルムは、軟骨の欠損症部位に置かれ、それ故、構築されるポケットは軟骨治療材料で満たされる。

幾つかの実施形態において、内因性の軟骨増殖を誘発する方法は、インプラントが投与される領域の関節鏡検査の（ａｔｈｒｏｓｃｏｐｉｃ）洗浄法及び／又は創面切除を更に含む。幾つかの実施形態において、損傷を受けた軟骨の一部又は全てが除去され、３成分マトリックス（例えば、軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を更に含む３成分マトリックス）が、その領域に移植される（例えば、注入される）。

幾つかの実施形態において、内因性の軟骨増殖を誘発する方法は、骨髄刺激技術（例えば微小骨折手術）を更に含む。幾つかの実施形態において、（ａ）損傷を受けた軟骨の一部又はすべてが必要な領域から除去され、下にある骨が部分的又は完全に露出し、（ｂ）微小骨折が（例えば突錐の使用により）軟骨下骨組織に作られ、及び（ｃ）３成分マトリックス（例えば、軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を更に含む３成分マトリックス）が、領域に移植される（例えば、注入される）。

幾つかの実施形態において、３成分マトリックス（例えば、軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を更に含む３成分マトリックス）は、任意の適切な針（例えば、１６ゲージの針、１７ゲージの針、１８ゲージの針、１９ゲージの針、２０ゲージの針、２１ゲージの針、２２ゲージの針、２３ゲージの針、２４ゲージの針、２５ゲージの針、２６ゲージの針、２７ゲージの針、２８ゲージの針、２９ゲージの針、又は３０ゲージの針）で注入される。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは２２ゲージの針で注入される。幾つかの実施形態において、３成分マトリックスは２５ゲージの針で注入される。

＜実施例１：軟骨細胞を含む３成分マトリックスの産生＞
３成分マトリックスを製造する典型的な方法は以下のとおりである。

第１に、ウシのＩＩ型コラーゲンを、０．０１Ｍ酢酸に溶解した。ウシのＩＩ型コラーゲン（１０ｍｇ）を、２．４ｍｌの１０ｍＭ酢酸Ｏ／Ｎに溶解した。３００μｌの１０倍のＭｅｄｉｕｍ １９９と、３００μｌのＮａＨＣＯ_３／ＨＥＰＥＳを、コラーゲン／酢酸の混合物に加えて中和した。

３３０μｌのヒアルロン酸（１０ｍｇ／ｍｌにてＨＡ）（１ｍｇ／ｍｌの終末濃度）を、混合物に加えた。

６０μｌの硫酸コンドロイチン（５０ｍｇ／ｍｌ、ウシ）を１ｍｇ／ｍｌの終末濃度まで混合物に加え、３成分マトリックスを形成した。

その後、軟骨細胞を３成分マトリックスに加えた。

＜実施例２：アルギン酸塩に埋め込まれた軟骨前駆体による骨軟骨欠損の処置＞
外科手術用ドリルを使用して、３ｍｍの骨軟骨欠損を、ウサギの大腿部の滑車の溝と顆に作成した。２つの異なる処置を使用して欠損症を修復した。対照として、１つの欠損症部位には何も移植しなかった。第１の処置において、成人のヒト軟骨細胞由来の軟骨前駆細胞ペレットをアルギン酸塩に埋め込み、その後、欠損症部位へ外科移植した。第２の処置において、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞ペレットをアルギン酸塩に埋め込み、その後、欠損症部位へ外科移植した。

塩化カルシウムに浸した外科手術用ガーゼを使用して、アルギン酸塩を欠損症部位に架橋結合した。

組織学的検査（図４）は、アルギン酸塩に埋め込んだ軟骨前駆体によって生成された組織修復が、アルギン酸塩に埋め込んだ成人のヒト軟骨細胞由来の軟骨前駆体によって生成されたものよりも劣っていることを示した。しかし、両方とも、何も移植しなかった欠損症よりも優れていた。

＜実施例３：マトリゲルに埋め込まれた軟骨前駆体による骨軟骨欠損の処置＞
外科手術用ドリルを使用して、３ｍｍの骨軟骨欠損を、ウサギの大腿部の滑車の溝と顆に作成した。４つの異なる処置を使用して欠損症を修復した。対照として、１つの欠損症部位には何も移植しなかった。第１の処置において、対照としてマトリゲルのみを欠損症部位へ外科移植した。第２の処置において、ドナー＃１からの、成人のヒト軟骨細胞由来の軟骨前駆細胞ペレットをマトリゲルに埋め込み、その後、欠損症部位へ外科移植した。第３の処置において、ドナー＃２からの、成人のヒト軟骨細胞由来の軟骨前駆細胞ペレットをマトリゲルに埋め込み、その後、欠損症部位へ外科移植した。第４の処置において、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞ペレットをマトリゲルに埋め込み、その後、欠損症部位へ外科移植した。

マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を摂氏４度で液体として維持し、移植後、摂氏３７度でゼラチン状となった。

組織学的検査（図１）は、マトリゲルに埋め込んだＨ９由来の軟骨前駆体によって生成された組織修復が、マトリゲルに埋め込んだ成人のヒト軟骨細胞由来の軟骨前駆体によって生成されたものと比較可能であることを示した。しかし、両方の処置は、何も移植しなかった欠損症、又はマトリゲルのみを移植した欠損症よりも優れていた。

＜実施例４：３成分マトリックスに埋め込まれた軟骨前駆体による骨軟骨欠損の処置＞
外科手術用ドリルを使用して、３ｍｍの骨軟骨欠損を、ウサギの大腿部の滑車の溝と顆に作成した。４つの異なる処置を使用して欠損症を修復した。全ての４つ処置（成人のヒト軟骨細胞、Ｈ９由来のＭＳＣ、軟骨細胞由来のｉＰＳＣ、及び成人のヒトＭＳＣ）において、ＩＩ型コラーゲン、硫酸コンドロイチン、及びヒアルロン酸からなる３成分マトリックスを使用した。

以下のプロトコルを、３成分マトリックスを構築するために使用した：
１）ウシのＩＩ型コラーゲン（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、０．０１Ｍ酢酸に溶解した（２．４ｍｌの１０ｍＭ酢酸、３００μｌの１０倍のＭｅｄｉｕｍ １９９、及び３００μｌのＮａＨＣＯ_３／ＨＥＰＥＳに、１０ｍｇのウシのＩＩ型コラーゲンを加えて、酢酸を中和する）；
２）３００μｇのヒアルロン酸を１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた；
３）６０μｇの硫酸コンドロイチン（ウシ）を１ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた；
４）ＩＩ型コラーゲンの終末濃度はおよそ３ｍｇ／ｍｌである。

組織学的検査（図２）は、３成分マトリックスに埋め込んだＨ９由来の軟骨前駆体によって生成された組織修復が、成人のヒト軟骨細胞由来の軟骨前駆体、多能性細胞由来の軟骨前駆体、及び成人のヒト間葉系幹細胞よりも、組織再生にて優れており、且つ優れた機械的性質（図３）を有していたことを示した。

＜実施例５：変形性関節症の処置において３成分マトリックスを使用する臨床研究＞
患者は、滑膜への、軟骨細胞（又はリン酸緩衝生理食塩水の対照）を備えた３成分マトリックスの単一の５ｍＬ注射を受け、１６週の訪問後に繰り返しの処置を受けることが可能となる。

研究のタイプ：介入

割当：無作為化

エンドポイント分類：安全性／有効性研究

介入モデル：並列の割当

マスキング：二重盲検（被験体、結果評価者（Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ａｓｓｅｓｓｏｒ））

第１の目的：処置

評価項目：

参加者の疼痛の評価。基線（０日目）と、１６週まで（２週、４週、８週、１２週、及び１６週）のすべての訪問に、平均スコアを使用した。ＷＯＭＡＣ Ｐａｉｎ Ｓｕｂｓｃａｌｅには０−４のスコア範囲があり、０＝疼痛が無い、４＝極端な疼痛、である。

参加者は、ＷＯＭＡＣ ＬＫ ３．１ Ａ１（Ｗａｌｋｉｎｇ Ｐａｉｎ）Ｓｕｂｓｃａｌｅを使用して、歩行中に自身が感じた疼痛を分類した。スケールは疼痛を、無し、穏やか、中度、重度、及び極端なものと評価する。

参加者の身体機能の評価を使用する、１６週の初期治療期間にわたる基線からの変化。基線（０日目）と、２６週まで（４週、８週、１２週、１８週、及び２６週）のすべての訪問に、平均スコアを使用した。ＷＯＭＡＣ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｃａｌｅには、過去４８時間以内にタスク（ｔａｓｋｓ）を完了する困難の程度を評価するための０−４のスコア範囲があり、０＝困難が無い、４＝極端に困難、である。

研究の資格を持つ年齢：４０歳以上；

研究の資格を持つ性別：両方

健康なボランティアの受け入れ：無し

包含基準：

試験の少なくとも３か月前に作られた、標的の膝の初期の変形性関節症（ＯＡ）の文書化した診断を持つ患者。

スクリーニングの、及び任意の基線評価の長くとも３か月前に得た標準のＸ線によって診断されるような、少なくとも１つの明確な骨増殖体及び測定可能な関節窩を伴う標的の膝の脛大腿区分におけるＯＡのＸ線写真術の証拠を持つ。

保存処置（例えば減量、物理療法、鎮痛薬）を行ったにもかかわらず標的の膝の疼痛が持続していた。

Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｉｎｄｅｘ Ｌｉｋｅｒｔ Ｓｃａｌｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１ （ＷＯＭＡＣ ＬＫ ３．１） Ａ１ （Ｗａｌｋｉｎｇ Ｐａｉｎ）Ｓｕｂｓｃａｌｅで２又は３のスコアによって実証されるような、標的の膝に疼痛がある。

Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｉｎｄｅｘ Ｌｉｋｅｒｔ Ｓｃａｌｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１ （ＷＯＭＡＣ ＬＫ ３．１） Ａ （Ｐａｉｎ）Ｓｕｂｓｃａｌｅにて平均スコアが１．５乃至３．５である。

反復相（Ｒｅｐｅａｔ Ｐｈａｓｅ）のための包含基準：研究者によって評価されるような、処置の第１過程中に、主要な安全性の懸念があってはならない；少なくとも１のＷＯＭＡＣ ＬＫ ３．１ Ａのスコアがなければならない。

除外基準：

スクリーニングの、及び任意の基線評価の長くとも３カ月前に得た標準のＸ線によって確認される、標的の膝の膝蓋大腿区分における、グレードＩＶの修飾したＫｅｌｌｇｒｅｎ−Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｇｒａｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを持つ。

標的の膝の臨床的に明白な緊張状態の流出（ｔｅｎｓｅ ｅｆｆｕｓｉｏｎ）を持つ。

スクリーニング前の９か月以内に標的の膝を含む任意の関節に関節内補充療法（ｖｉｓｃｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）があった。

関節に影響を及ぼす炎症性疾患又は他の疾病（例えば、関節リウマチ、代謝性骨疾患、乾癬、痛風、徴候的な軟骨石灰化症、及び活発な感染等）が付随している。

パラセタモールに反応せず、他の治療を必要とする、反対側の膝又は一方の殿部の徴候的なＯＡ。

トリのタンパク質及び／又はヒアルロナンベースの注射装置の任意の構成要素に対する、関連する過敏症を持つ。

＜実施例６：軟骨細胞を含む３成分マトリックスによる骨関節炎の処置＞
患者は、自身の膝に骨関節炎を患っている。石灰化軟骨を両膝から取り除く。外科医は、軟骨下骨に割れ目をもたらす。軟骨細胞を持つ３成分マトリックスを膝に注入する。患者は、軟骨細胞を含む３成分マトリックスの両膝への注入のため、４週、８週、及び１６週後に、医師の元へ戻る。膝の軟骨は再生する。

本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されている一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白であろう。多数の変形、変化、及び置換は、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構成がそれによって包含されることが、意図される。

Claims (14)

1. ３成分マトリックスであって：
   ａ）０．５ｍｇ／ｍｌ乃至５ｍｇ／ｍｌの濃度の、分離され且つ精製された、非変性のＩＩ型コラーゲン；
   ｂ）１ｍｇ／ｍｌ乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度のヒアルロナン；及び
   ｃ）０．２５ｍｇ／ｍｌ乃至３ｍｇ／ｍｌの濃度の硫酸コンドロイチン
   とを含む、３成分マトリックス。
2. 基本培地を含む、請求項１に記載の３成分マトリックス。
3. ＩＩ型コラーゲンはウシ由来のＩＩ型コラーゲンである、ことを特徴とする請求項１に記載の３成分マトリックス。
4. ＩＩ型コラーゲンの濃度は１ｍｇ／ｍｌ乃至５ｍｇ／ｍｌである、ことを特徴とする請求項１に記載の３成分マトリックス。
5. ＩＩ型コラーゲンの濃度は３ｍｇ／ｍｌである、ことを特徴とする請求項１に記載の３成分マトリックス。
6. Ｈ９由来の軟骨前駆細胞を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の３成分マトリックス。
7. ヒアルロナンの濃度は１ｍｇ／ｍｌである、ことを特徴とする請求項１に記載の３成分マトリックス。
8. 硫酸コンドロイチンの濃度は１ｍｇ／ｍｌである、ことを特徴とする請求項１に記載の３成分マトリックス。
9. 軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、軟骨細胞由来の人工多能性幹細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の３成分マトリックス。
10. 軟骨細胞、軟骨前駆細胞、及びそれらの組み合わせから選択される細胞を含む、請求項１に記載の３成分マトリックス。
11. 人工多能性幹細胞を含む、請求項１に記載の３成分マトリックス。
12. 個体の内因性の軟骨増殖の誘発に使用するための、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の３成分マトリックス。
13. 個体の骨又は軟骨の欠損症の処置に使用するための３成分マトリックスであって、組成物が骨又は軟骨の欠損症の部位に投与される、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の３成分マトリックス。
14. 軟骨修復インプラントであって：
    ａ）請求項１に記載の３成分マトリックス；
    ｂ）軟骨細胞、軟骨前駆細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、軟骨細胞由来の人工多能性幹細胞、Ｈ９由来の軟骨前駆細胞、Ｓｏｘ−９により形質導入した軟骨細胞、骨芽細胞、骨前駆細胞、又はそれらの任意の組み合わせから選択される細胞の集まり；及び
    ｃ）ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸、アルギン酸塩、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸−ポリグリコール酸のコポリマー、ヒト真皮、シートなどの膜、スポンジなどの多孔体、メリヤス地、布地、不織布、綿、多孔質材料等のメッシュ、及びそれらの組み合わせから選択される生体基質
    とを含む、軟骨修復インプラント。