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JP6301265B2 - 合成二方向ｓｃｂｖ植物プロモーターのための方法および構築物 - Google Patents

合成二方向ｓｃｂｖ植物プロモーターのための方法および構築物 Download PDF

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Description

本出願は２０１１年１２月３０日に提出された米国特許仮出願第６１／５８２，１４８号明細書の出願日の利益を主張する。本出願は、２０１２年５月３日に提出された米国特許仮出願第６１／６４１，９５６号明細書の出願日の利益も主張する。
本発明は一般的には植物分子生物学の分野、さらに具体的にはトランスジェニック植物における複数の遺伝子の安定な発現の分野に関する。
多くの植物種は他の種由来のトランス遺伝子で形質転換して、農学的に望ましい形質または特徴を導入する、例えば、栄養価品質を改良する、収率を増加する、病害虫もしくは疾患抵抗性を与える、乾燥およびストレス耐性を増加する、園芸性質（例えば、色素沈着および成長）を改良する、除草剤抵抗性を分け与える、植物からの産業的に有用な化合物および／もしくは原料の生産を可能にする、ならびに／または医薬品の製造を可能にすることができる。植物細胞へのトランス遺伝子の導入およびトランス遺伝子の安定的に組み込まれたコピーを含有する繁殖性トランスジェニック植物のその後の回収を使用すれば、望ましい形質を有するトランスジェニック植物を産生することができる。
遺伝子発現の制御および調節は多数の機構を通じて起こることがある。遺伝子の転写開始は遺伝子発現の支配的な制御機構である。転写の開始は一般には転写される遺伝子の５’隣接または上流領域に位置するポリヌクレオチド配列により制御される。これらの配列は集団的にプロモーターと呼ばれる。プロモーターは一般に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生することができるようにＲＮＡポリメラーゼが転写を始めるためのシグナルを含有している。成熟ｍＲＮＡはリボソームにより翻訳され、それによりタンパク質を合成する。ＤＮＡ結合タンパク質はプロモーターＤＮＡと特異的に相互作用して、転写複合体の形成を促進し遺伝子発現過程を開始する。植物においてトランス遺伝子の発現を駆動するように機能する種々の真核生物プロモーターが植物から単離され特徴付けられている。環境刺激、養分利用性、または熱ショック、嫌気生活もしくは重金属の存在を含む悪条件に応答して遺伝子発現に影響を与えるプロモーターが単離され特徴付けられてきた。発生中にまたは組織もしくは器官特異的な様式で遺伝子発現を制御するプロモーターもある。さらに、植物においてトランス遺伝子の発現を駆動するように機能する細菌およびウイルスから単離された原核生物プロモーターが単離され特徴付けられてきた。
典型的な真核生物プロモーターは最小プロモーターおよび他のシスエレメントからなる。最小プロモーターは基本的に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、およびＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ）が結合して転写を開始することができるＴＡＴＡボックス領域である。しかし、大半の場合、ＴＡＴＡモチーフ以外の配列エレメントが正確な転写には必要である。そのような配列エレメント（例えば、エンハンサー）は、多くの場合、位置および／または配向非依存的な様式で近くの遺伝子の発現の全体的レベルを上昇させることが分かっている。一部のｐｏｌＩＩ遺伝子の転写開始部位（例えば、ＩＮＲ配列）近くの他の配列は、転写活性化にも寄与する因子に代わりの結合部位を提供し、あるいは機能的ＴＡＴＡエレメントを欠くプロモーターにおいて転写のための中核となるプロモーター結合部位さえ提供しうる。例えば、Zenzie-Gregoryら、(1992) J. Biol. Chem. 267: 2823〜30を参照されたい。
他の遺伝子調節エレメントには、特定のＤＮＡ結合因子と相互作用する配列が含まれる。これらの配列モチーフはシスエレメントと呼ばれることがあり、通常は位置および配向非依存性であるが、遺伝子コード配列の５’側もしくは３’側に、またはイントロン中に見出されることもある。そのようなシスエレメントは、組織特異的または発生特異的転写因子が個別にまたは組み合わせて結合するが、転写レベルでのプロモーターの時空間的発現パターンを決定しうる。上流のシスエレメント、続いて最小プロモーターの配置は、典型的には特定のプロモーターの極性を確立する。基礎研究と生物工学的応用の両方のためにクローニングされ広く使用されてきた植物中のプロモーターは、一般に一方向性であり、その３’末端（すなわち、下流に）に融合された１つの遺伝子のみを方向付ける。例えば、Xieら、(2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677〜9：米国特許第６，３８８，１７０号を参照されたい。
多くのシスエレメント（または「上流調節配列」）が植物プロモーターにおいて同定されてきた。これらのシスエレメントは、作動可能に連結された遺伝子に対して行使する制御の種類が広く異なる。一部のエレメントは環境応答（例えば、温度、湿度、および創傷）へ応答して作動可能に連結された遺伝子の転写を増加させるように作用する。他のシスエレメントは発生上の合図（例えば、発芽、種子成熟、および開花）または空間情報（例えば、組織特異性）に応答しうる。例えば、Langridgeら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219〜23を参照されたい。特定のプロモーターエレメントの制御の種類は典型的には、そのプロモーターの固有の性質であり、すなわちそのようなプロモーターの制御下にある異種遺伝子は、そのプロモーターエレメントが単離されたもとの天然の遺伝子の制御に従って発現される可能性が高い。これらのエレメントは典型的には、他のエレメントと交換されて、遺伝子発現に対するその特徴的固有の制御を維持することもある。
その遺伝子が同一のまたは相同なプロモーターにより制御されることが多い、代謝操作および形質スタッキングのためには植物に複数の遺伝子を導入する必要がある場合が多い。しかし、複数の導入されたトランス遺伝子がその遺伝子を駆動させる相同なプロモーターを有する場合には、相同性ベースの遺伝子サイレンシング（ＨＢＧＳ）が生じる可能性が高い。例えば、Molら、(1989) Plant Mol. Biol. 13:287〜94を参照されたい。ＨＢＧＳはトランスジェニック植物においては広範囲に起こることが報告されている。例えば、Vaucheret and Fagard (2001) Trends Genet. 17:29〜35を参照されたい。いくつかの機構がＨＢＧＳの現象を説明するために提唱されてきたが、その全てが、プロモーター中の配列相同性が反復遺伝子のサイレンシングをもたらす細胞認識機構を始動させるという特長を含む。例えば、Matzke and Matzke (1995) Plant Physiol. 107:679〜85; Meyer and Saedler (1996) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:23〜48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358〜63; Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950〜2; および Steimerら、(2000) Plant Cell 12:1165〜78を参照されたい。
トランスジェニック植物においてＨＢＧＳを回避する戦略は、機能的に等価であるが最小配列相同性を有する合成プロモーターの開発を伴う場合が多い。そのような合成プロモーターを作物植物においてトランス遺伝子を発現するために使用する場合、ＨＢＧＳを回避するまたは減少させるのに役立ちうる。例えば、Mourrainら、(2007) Planta 225(2):365〜79; Bhullarら、(2003) Plant Physiol. 132:988〜98を参照されたい。そのようなプロモーターは、ＤＮＡの新規のもしくは合成ストレッチにシスエレメントを導入することにより、または代わりに１つのプロモーターのドメインを他の異種プロモーターの機能的に等価のドメインで置き換える「ドメインスワッピング」により作製することができる。
したがって、トランスジェニック植物における育種または複数の世代を通じてトランス遺伝子の組換えまたは消失のリスクを効果的に最小限に抑えて、複数のトランス遺伝子を安定的に発現させるための構築物および方法の必要性が依然として存在する。
Ｕｂｉ１最小プロモーターを含む特定の合成プロモーターが本明細書に記載されている。実施形態では、Ｕｂｉ１最小プロモーターを含む合成プロモーターは、ＳＣＢＶプロモーターの少なくとも１つの配列エレメントまたはその機能的等価物をさらに含む。いくつかの実施例では、そのような合成プロモーター（「合成ＳＣＢＶプロモーター」）は、植物細胞において作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を制御することができるプロモーターであることが可能である。他の実施例では、合成ＳＣＢＶプロモーターは合成二方向ＳＣＢＶプロモーター、例えば、プロモーターに隣接している２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の植物細胞における転写を制御することができるＳＣＢＶプロモーターエレメントに関して反対方向に配向されている最小Ｕｂｉ１プロモーターエレメントヌクレオチド配列を含む核酸であってもよい。合成ＳＣＢＶ二方向プロモーターに含まれるように操作されうる追加のエレメントには、イントロン（例えば、アルコールデハイドロゲナーゼ（ＡＤＨ）イントロン）、エクソン、および／または上流プロモーター領域の全てもしくは一部が含まれる。ある特定の実施例では、合成二方向プロモーターは前述のいずれでも１つよりも多く含みうる。
本発明の特定の実施形態には、合成ＳＣＢＶプロモーターまたはその機能的等価物を含む細胞（例えば、植物細胞）が含まれる。例えば、特定の実施形態には、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターまたはその機能的等価物を含む細胞を含みうる。特定の実施形態に従った植物細胞は、細胞培養物、組織、植物部分、および／または植物全体に存在していてもよい。したがって、合成ＳＣＢＶプロモーターまたはその機能的等価物を含む細胞を有する植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物）がいくつかの実施形態に含まれる。
本発明の他の実施形態には、対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段が含まれる。対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段には、配列番号５の合成二方向ＳＣＢＶプロモーターが含まれる。
植物細胞および／または植物組織において複数の遺伝子を発現するための構築物および方法も提供される。提供される構築物は複数の遺伝子発現カセットに連結されている少なくとも１つの二方向プロモーターを含み、この二方向プロモーターはサトウキビ桿菌状ウイルス（Sugar Cane Bacilliform Virus）（ＳＣＢＶ）プロモーター由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、提供される構築物および方法は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１遺伝子由来の最小コアプロモーターエレメント、またはその機能的等価物、およびサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター由来のヌクレオチド配列エレメントに基づく二方向プロモーターを用いる。いくつかの実施形態では、提供される構築物および方法は３から２０の遺伝子の発現を可能にする。
一態様では、トウモロコシ（Zea mays）またはゼア・ラグジュリアンズ（Zea luxurians）のユビキチン−１遺伝子由来の最小コアプロモーターエレメントおよびサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。一実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは配列番号１に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。追加のまたは代わりの実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは、配列番号１および１６〜４０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。追加の実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは配列番号１またはその相補体を含む。追加の実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは基本的には、配列番号１またはその相補体からなる。別の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは、ユビキチン−１遺伝子由来のエクソンおよびユビキチン−１遺伝子由来のイントロンをさらに含む。追加の実施形態では、このエクソンはトウモロコシ（Zea mays）またはゼア・ラグジュリアンズ（Zea luxurians）のユビキチン−１遺伝子由来である。別の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のイントロンをさらに含む。別の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドはサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター由来の上流調節配列をさらに含む。別の実施形態では、サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーターおよびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列は、配列番号６に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列またはその相補体を含む。追加のまたは代わりの実施形態では、サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーターおよびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列は配列番号６またはその相補体を含む。追加の実施形態では、サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーターおよびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列は基本的には配列番号６またはその相補体からなる。
一実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは、上流調節配列（ＵＲＳ）、エンハンサーエレメント、エクソン、イントロン、転写開始部位、ＴＡＴＡボックス、熱ショックコンセンサスエレメント、ならびに翻訳ＳＴＡＲＴおよび／またはＳＴＯＰヌクレオチド配列を含む一覧から選択される少なくとも１つのエレメントをさらに含む。別の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは、上流調節配列（ＵＲＳ）、エンハンサーエレメント、エクソン、イントロン、転写開始部位、ＴＡＴＡボックス、熱ショックコンセンサスエレメント、翻訳ＳＴＡＲＴおよび／またはＳＴＯＰヌクレオチド配列、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるエレメントをさらに含む。別の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは、最小コアプロモーターエレメントに作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列をさらに含む。別の実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１遺伝子由来の最小コアプロモーターエレメントとサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドにおいて互いに関して逆相補的配向である。
別の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは、ユビキチン−１遺伝子由来のエクソン、ユビキチン−１遺伝子由来のイントロン、およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のイントロンを含む。追加のまたは代わりの実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは、サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結された対象の第二のコードヌクレオチド配列を含む。追加の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは、配列番号５に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列またはその相補体を含む。追加の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは配列番号５またはその相補体を含む。追加の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは基本的には、配列番号５またはその相補体からなる。さらなる実施形態では、エクソンまたはイントロンはトウモロコシ（Zea mays）またはゼア・ラグジュリアンズ（Zea luxurians）のユビキチン−１遺伝子由来である。
追加の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１遺伝子由来の最小コアプロモーターエレメントに作動可能に連結された対象の第一のコードヌクレオチド配列を含む。別の追加の実施形態では、提供される合成ポリヌクレオチドは、サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結した対象の第二のコードヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、トランスジェニック細胞を作製するための方法が提供され、この方法は、細胞を本明細書で提供されるポリヌクレオチドで形質転換することを含む。一実施形態では、細胞は植物細胞である。別の態様では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを含む植物細胞が提供される。別の態様では、本明細書で提供される植物細胞を含む植物が提供される。
別の態様では、植物細胞において対象のヌクレオチド配列を発現するための方法が提供され、この方法は、植物細胞に対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段に作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列を導入することを含む。一実施形態では、提供される方法は、植物細胞に（ａ）対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段に作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列、および（ｂ）対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段に作動可能に連結された対象の第二のヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含む。
一実施形態では、対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段は配列番号５またはその相補体を含む。別の実施形態では、対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段は配列番号５を含む。別の実施形態では、対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段は配列番号５の逆相補体を含む。別の実施形態では、核酸は、植物細胞のＤＮＡにおける所定の部位に、対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段に作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列を標的するように植物細胞に導入される。追加のまたは代わりの一実施形態では、対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段に作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ媒介組換えを利用して所定に部位に標的される。
いくつかの実施形態では、エクソンはゼア（Zea）属種のユビキチン−１遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、イントロンはゼア（Zea）属種のユビキチン−１遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、ゼア（Zea）属種はトウモロコシ（Zea mays）またはゼア・ラグジュリアンズ（Zea luxurians）である。
別の態様では、植物細胞および／または組織において複数の遺伝子を発現するための核酸構築物が提供される。核酸構築物は、（ａ）二方向プロモーター、および（ｂ）二方向プロモーターの逆末端に接する２つの遺伝子発現カセットを含み、二方向プロモーターはサトウキビ桿菌状ウイルス（ＳＣＢＶ）プロモーター由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列を含み、遺伝子発現カセットの少なくとも１つは翻訳スイッチを介して連結された２つ以上の遺伝子を含む。
一実施形態では、二方向プロモーターは少なくとも１つのエンハンサーを含む。別の実施形態では、二方向プロモーターはエンハンサーを含まない。別の実施形態では、核酸構築物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクターを含む。一実施形態では、二方向プロモーターは、上流調節配列（ＵＲＳ）、エンハンサーエレメント、エクソン、イントロン、転写開始部位、ＴＡＴＡボックス、熱ショックコンセンサスエレメント、およびそれらの組合せからなる群から選択されるエレメントを含む。別の実施形態では、二方向プロモーターはトウモロコシ（Zea mays）またはゼア・ラグジュリアンズ（Zea luxurians）のユビキチン−１遺伝子由来の最小コアプロモーターエレメントを含む。別の実施形態では、ユビキチン−１遺伝子由来のコアプロモーターエレメントおよびサトウキビ桿菌状ウイルス（ＳＣＢＶ）プロモーター由来のプロモーターヌクレオチド配列は互いに関して逆相補的配向である。追加のまたは代わりの一実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは、配列番号１に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％同一であるポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。追加のまたは代わりの一実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは配列番号１および１６〜４０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。追加の実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは配列番号１および１６〜３５からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。追加の実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは配列番号１および１６〜３０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。追加の実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは配列番号１および１６〜２５からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。追加の実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは配列番号１および１６〜２０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。追加の実施形態では、最小コアプロモーターエレメントは配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。
追加のまたは代わりの一実施形態では、二方向プロモーターは、ユビキチン−１遺伝子由来のエクソンおよび／またはユビキチン遺伝子由来のイントロンを含む。別の実施形態では、二方向プロモーターは、アルコールデハイドロゲナーゼ遺伝子由来のイントロンを含む。一実施形態では、核酸構築物はトランスジェニック植物中に安定的に形質転換される。一実施形態では、植物は単子葉植物である。別の実施形態では、植物は双子葉植物である。別の実施形態では、植物は単子葉植物ではない。別の実施形態では、植物は双子葉植物ではない。
追加のまたは代わりの実施形態では、二方向プロモーターは、ユビキチン遺伝子またはサトウキビ桿菌状ウイルス（ＳＣＢＶ）プロモーター由来の上流調節配列を含む。追加の実施形態では、二方向プロモーターはユビキチン遺伝子由来の上流調節配列を含む。別の実施形態では、二方向プロモーターはユビキチン遺伝子またはサトウキビ桿菌状ウイルス（ＳＣＢＶ）プロモーター由来の上流調節配列を含む。
追加の実施形態では、二方向プロモーターは配列番号５に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％同一である配列のポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。追加の実施形態では、二方向プロモーターは配列番号５のポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。追加の実施形態では、二方向プロモーターは配列番号６に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％同一であるポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。追加の実施形態では、二方向プロモーターは配列番号６のポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。
一実施形態では、両方の遺伝子発現カセットは翻訳スイッチを介して連結される２つ以上の遺伝子を含む。追加のまたは代わりの一実施形態では、翻訳スイッチは、配列内リボソーム進入部位（internal ribosome entry site）（ＩＲＥＳ）、選択的スプライシング部位、リボザイム切断部位、２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、２Ａ様ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、インテインをコードするポリヌクレオチド配列、プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、およびそれらの組合せからなる群から選択される。追加のまたは代わりの一実施形態では、翻訳スイッチはシス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）を含む。追加の実施形態では、ＣＨＹＳＥＬは２Ａまたは２Ａ様ペプチド配列である。別の実施形態では、翻訳スイッチの上流の遺伝子は翻訳停止コドンを含まない。別の実施形態では、核酸構築物は少なくとも４つの遺伝子の発現を可能にするまたは許容する。追加の実施形態では、４つの遺伝子全てがトランス遺伝子である。別の実施形態では、核酸構築物は３つから２０までの間の遺伝子の発現を可能にする。別の実施形態では、核酸構築物は４つから８つまでの間の遺伝子の発現を可能にする。追加のまたは代わりの一実施形態では、遺伝子はトランス遺伝子である。別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子発現カセットは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。追加の実施形態では、融合タンパク質は３つから５つの遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、二方向プロモーターからの遺伝子の発現は、一方向プロモーターと比べた場合、少なくとも４倍高い。いくつかの実施形態では、二方向プロモーターからの遺伝子の発現は、一方向プロモーターと比べた場合、３倍から１０倍高い。いくつかの実施形態では、二方向プロモーターからの遺伝子の発現は、一方向プロモーターと比べた場合、４倍から８倍高い。いくつかの実施形態では、選択マーカー遺伝子は、プロモーターから遠くの末端に（すなわち、別の遺伝子の下流の遺伝子発現カセットの３’末端に）置かれる。
別の態様では、植物細胞を本明細書に提供される核酸構築物で形質転換することを含むトランスジェニック植物を作製するための方法が提供される。別の態様では、細胞を本明細書に提供される核酸構築物で形質転換することを含むトランスジェニック細胞を作製するための方法が提供される。別の態様では、本明細書に提供される核酸構築物を含む植物細胞が提供される。追加のまたは代わりの一実施形態では、核酸構築物は植物細胞に安定的に形質転換される。別の態様では、本明細書に提供される核酸構築物を含むトランスジェニック植物が提供される。追加のまたは代わりの一実施形態では、核酸構築物はトランスジェニック植物の細胞に安定的に形質転換される。別の態様では、植物細胞および／または組織に本明細書に提供される核酸構築物を導入することを含む、植物細胞および／または組織において複数の遺伝子を発現するための方法が提供される。追加のまたは代わりの一実施形態では、植物細胞および／または組織は本明細書に提供される核酸構築物で安定的に形質転換される。別の態様では、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクターが提供される。一実施形態では、バイナリーベクターは本明細書に提供される核酸構築物を含む。別の実施形態では、バイナリーベクターは本明細書に提供される合成ポリヌクレオチドを含む。別の態様では、植物における複数のトランス遺伝子発現のための本明細書に提供される二方向プロモーターの使用が提供される。
図１は例となる（ノンスケール）トウモロコシＵｂｉ１（ＺｍＵｂｉ１）プロモーターを示しており、このプロモーターは転写開始部位（ＴＳＳ）の５’に位置するおよそ９００ｂｐ上流エレメントを含む。この上流エレメントは、ＴＡＴＡボックス（ＴＳＳのおよそ−３０ｂｐに位置する）、および２つの重複する熱ショックコンセンサスエレメント（ＴＳＳのおよそ−２００ｂｐに位置する）を含有する。このプロモーターは、ＴＳＳ領域の３’に約１１００ｂｐも含む。この３’領域は隣接リーダー配列（ＺｍＵｂｉ１エクソン）およびイントロンを含有する。 図２は提供される合成Ｕｂｉ１二方向プロモーターの例となる実施形態を示しており、このプロモーターはＺｍＵｂｉ１プロモーターの上流にクローニングされたｍｉｎＵｂｉ１Ｐ最小コアエレメントを含む。 図３はＹＦＰおよびＧＵＳ遺伝子発現カセットの例となる概略図を示しており、このカセットはそれぞれが合成Ｕｂｉ１二方向プロモーターに作動可能に連結している。 図４はｐＤＡＢ１０５８０１の代表的プラスミドマップを示している。 図５は、ＳＣＢＶプロモーターの上流にクローニングされたＭｉｎ−Ｕｂｉ１Ｐ最小コアエレメントを含む、例となるサトウキビ桿菌状ウイルス（ＳＣＢＶ）二方向プロモーターの概略図を示している。 図６は、ｐＤＡＢ１０５８０６の代表的プラスミドマップを示している。 図７は、それぞれが合成ＳＣＢＶ二方向プロモーターに作動可能に連結されているＹＦＰおよびＧＵＳ遺伝子発現カセットの例となる概略図を示している。 図８は、本明細書に提供される多重遺伝子構築物の例となる概略表示を示している。翻訳スイッチは特別な（垂直ダンベル）記号を使用して示されている。 図９は、ｐＤＡＢ１０８７０８およびｐＤＡＢ１０１５５６の代表的プラスミドマップを示している。 図１０Ａは配列番号１を示しており、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１最小コアプロモーター（ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ）の２１５ｂｐ領域を含む。図１０Ｂは配列番号２を示しており、トウモロコシ（Z. mays）ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ最小コアプロモーター（下線部）、トウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ１リーダー（ＺｍＵｂｉ１エクソン、太字）、およびトウモロコシ（Z. mays）Ｕｂｉ１イントロン（小文字）を含むポリヌクレオチドの逆相補体を含む。 図１１は配列番号３を示しており、例となる合成Ｕｂｉ１二方向プロモーターを含み、第一のｍｉｎＵｂｉ１Ｐの逆相補体、および第二のｍｉｎＵｂｉ１Ｐは下線が施されている。 図１１は配列番号３を示しており、例となる合成Ｕｂｉ１二方向プロモーターを含み、第一のｍｉｎＵｂｉ１Ｐの逆相補体、および第二のｍｉｎＵｂｉ１Ｐは下線が施されている。 図１２は配列番号４を示しており、合成Ｕｂｉ１二方向プロモーターにより駆動されるＹＦＰおよびＧＵＳ遺伝子発現カセットを含む例となる核酸を含む。 図１２は配列番号４を示しており、合成Ｕｂｉ１二方向プロモーターにより駆動されるＹＦＰおよびＧＵＳ遺伝子発現カセットを含む例となる核酸を含む。 図１２は配列番号４を示しており、合成Ｕｂｉ１二方向プロモーターにより駆動されるＹＦＰおよびＧＵＳ遺伝子発現カセットを含む例となる核酸を含む。 図１３は配列番号５を示しており、ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ最小コアプロモーターを含む例となるＳＣＢＶ二方向プロモーターを含み、このｍｉｎＵｂｉ１Ｐの逆相補体は下線が施されている。 図１３は配列番号５を示しており、ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ最小コアプロモーターを含む例となるＳＣＢＶ二方向プロモーターを含み、このｍｉｎＵｂｉ１Ｐの逆相補体は下線が施されている。 図１４は配列番号６を示しており、ＡＤＨ１エクソン６（下線部）、イントロン６（小文字）、およびエクソン７（太字）を含有するＳＣＢＶプロモーターを含む。 図１５は配列番号７を示しており、例となるＳＣＢＶ二方向プロモーターにより駆動されるＹＦＰおよびＧＵＳ遺伝子発現カセットを含む核酸を含む。 配列番号８はＹＦＰフォワードプライマー：５’−ＧＡＴＧＣＣＴＣＡＧ ＴＧＧＧＡＡＡＧＧ−３’を示している。配列番号９はＹＦＰリバースプライマー：５’−ＣＣＡＴＡＧＧＴＧＡ ＧＡＧＴＧＧＴＧＡＣ ＡＡ−３’を含む。配列番号１０はインベルターゼフォワードプライマー：５’−ＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡ ＣＧＡＣＴＴＧＴ−３’を含む。配列番号１１はインベルターゼリバースプライマー：５’−ＡＡＡＧＴＴＴＧＧＡ ＧＧＣＴＧＣＣＧＴ−３’を含む。配列番号１２はインベルターゼプローブ：５’−ＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣ ＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴ ＴＣＴＡＣＣ−３’を含む。配列番号１３はＡＡＤ１フォワードプライマー：５’−ＴＧＴＴＣＧＧＴＴＣ ＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡ−３’を含む。配列番号１４はＡＡＤ１リバースプライマー：５’−ＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴ ＣＡＣＣＴＴＧＡＣＴ ＧＡ−３’を含む。配列番号１５はＡＡＤ１プローブ：５’−ＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧ ＴＣＧＣＴＴＣＡＧＣ ＡＡＣＡ−３’を含む（表７も参照）。 図１５は配列番号７を示しており、例となるＳＣＢＶ二方向プロモーターにより駆動されるＹＦＰおよびＧＵＳ遺伝子発現カセットを含む核酸を含む。 配列番号８はＹＦＰフォワードプライマー：５’−ＧＡＴＧＣＣＴＣＡＧ ＴＧＧＧＡＡＡＧＧ−３’を示している。配列番号９はＹＦＰリバースプライマー：５’−ＣＣＡＴＡＧＧＴＧＡ ＧＡＧＴＧＧＴＧＡＣ ＡＡ−３’を含む。配列番号１０はインベルターゼフォワードプライマー：５’−ＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡ ＣＧＡＣＴＴＧＴ−３’を含む。配列番号１１はインベルターゼリバースプライマー：５’−ＡＡＡＧＴＴＴＧＧＡ ＧＧＣＴＧＣＣＧＴ−３’を含む。配列番号１２はインベルターゼプローブ：５’−ＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣ ＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴ ＴＣＴＡＣＣ−３’を含む。配列番号１３はＡＡＤ１フォワードプライマー：５’−ＴＧＴＴＣＧＧＴＴＣ ＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡ−３’を含む。配列番号１４はＡＡＤ１リバースプライマー：５’−ＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴ ＣＡＣＣＴＴＧＡＣＴ ＧＡ−３’を含む。配列番号１５はＡＡＤ１プローブ：５’−ＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧ ＴＣＧＣＴＴＣＡＧＣ ＡＡＣＡ−３’を含む（表７も参照）。 図１５は配列番号７を示しており、例となるＳＣＢＶ二方向プロモーターにより駆動されるＹＦＰおよびＧＵＳ遺伝子発現カセットを含む核酸を含む。 配列番号８はＹＦＰフォワードプライマー：５’−ＧＡＴＧＣＣＴＣＡＧ ＴＧＧＧＡＡＡＧＧ−３’を示している。配列番号９はＹＦＰリバースプライマー：５’−ＣＣＡＴＡＧＧＴＧＡ ＧＡＧＴＧＧＴＧＡＣ ＡＡ−３’を含む。配列番号１０はインベルターゼフォワードプライマー：５’−ＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡ ＣＧＡＣＴＴＧＴ−３’を含む。配列番号１１はインベルターゼリバースプライマー：５’−ＡＡＡＧＴＴＴＧＧＡ ＧＧＣＴＧＣＣＧＴ−３’を含む。配列番号１２はインベルターゼプローブ：５’−ＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣ ＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴ ＴＣＴＡＣＣ−３’を含む。配列番号１３はＡＡＤ１フォワードプライマー：５’−ＴＧＴＴＣＧＧＴＴＣ ＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡ−３’を含む。配列番号１４はＡＡＤ１リバースプライマー：５’−ＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴ ＣＡＣＣＴＴＧＡＣＴ ＧＡ−３’を含む。配列番号１５はＡＡＤ１プローブ：５’−ＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧ ＴＣＧＣＴＴＣＡＧＣ ＡＡＣＡ−３’を含む（表７も参照）。 図１６は、トウモロコシＴ０植物における二方向ＳＣＢＶプロモーター構築物（ｐＤＡＢ１０８７０８）により駆動される安定なＹＦＰ発現のためのウェスタンブロット解析を示している。代表的植物はＭｉｎ−Ｕｂｉ１Ｐ最小コアプロモーターエレメントにより駆動される葉中の安定なＹＦＰ発現を示した。産生されるタンパク質の量は百万分率（ｐｐｍ）として示されている。 図１７は、ＹＦＰの発現のみを駆動するＺｍＵｂｉ１プロモーターを含有する対照構築物（ｐＤＡＢ１０１５５６）からの安定なＹＦＰ発現のためのウェスタンブロット解析を示しており、ＧＵＳコード配列はこの構築物には含有されていない。産生されるタンパク質の量は百万分率（ｐｐｍ）として示されている。 図１８は、４つの遺伝子カセットスタックｐＤＡＢ１０５８４９（ＡＡＤ１−２Ａ−ＹＦＰプラスＣｒｙ３４−２Ａ−Ｃｒｙ３５）およびｐＤＡＢ１０５８６５（ＹＦＰ−２Ａ−ＡＡＤ１プラスＣｒｙ３４−２Ａ−Ｃｒｙ３５）の例となる構築物を示している。陰付き矢印は二方向プロモーターからの転写の方向を示している。Ｕｂｉ１−ｍｉｍＰは、トウモロコシＵｂｉ１プロモーターの転写開始部位の上流の２００ｎｔ配列を含む。ＳＣＢＶ−ＵＲＳは、コアプロモーターを除くＳＣＢＶプロモーターの上流調節配列を含む（矢印として示されている）。Ｕｂｉ１−ＩｎｔはトウモロコシＵｂｉ１プロモーターのイントロンを含む。 図１９は、４つの遺伝子カセットスタックの追加の例となる２つの構築物を示している。 図２０はプラスミドｐＤＡＢ１０５８１８およびｐＤＡＢ１０５７４８の代表的マップを示している。 図２１Ａ〜２１Ｅは、配列番号１６〜４０の追加の最小コアプロモーター（ｍｉｎ−Ｕｂｉ１ＰまたはＵｂｉ１−ｍｉｎＰ）を示している。 図２１Ａ〜２１Ｅは、配列番号１６〜４０の追加の最小コアプロモーター（ｍｉｎ−Ｕｂｉ１ＰまたはＵｂｉ１−ｍｉｎＰ）を示している。 図２１Ａ〜２１Ｅは、配列番号１６〜４０の追加の最小コアプロモーター（ｍｉｎ−Ｕｂｉ１ＰまたはＵｂｉ１−ｍｉｎＰ）を示している。 図２１Ａ〜２１Ｅは、配列番号１６〜４０の追加の最小コアプロモーター（ｍｉｎ−Ｕｂｉ１ＰまたはＵｂｉ１−ｍｉｎＰ）を示している。 図２１Ａ〜２１Ｅは、配列番号１６〜４０の追加の最小コアプロモーター（ｍｉｎ−Ｕｂｉ１ＰまたはＵｂｉ１−ｍｉｎＰ）を示している。 図２２はプラスミドｐＤＡＢ１０５８４１およびｐＤＡＢ１０５８４７の代表的マップを示している。 図２３はプラスミドｐＤＡＢ１０５８４０およびｐＤＡＢ１０５８４９の代表的マップを示している。 図２４はプラスミドｐＤＡＢ１０１９１７およびｐＤＡＢ１０８７１９の代表的マップを示している。 図２５はプラスミドｐＤＡＢ１０５８４４およびｐＤＡＢ１０５８４８の代表的マップを示している。 図２６はプラスミドｐＤＡＢ１０５８６５およびｐＤＡＢ１０８７２０の代表的マップを示している。 図２７は遺伝子発現カセットｐＤＡＢ１０８７１９についての核酸配列を示しており、それぞれの遺伝子およびエレメントが図示されている。 図２７は遺伝子発現カセットｐＤＡＢ１０８７１９についての核酸配列を示しており、それぞれの遺伝子およびエレメントが図示されている。 図２７は遺伝子発現カセットｐＤＡＢ１０８７１９についての核酸配列を示しており、それぞれの遺伝子およびエレメントが図示されている。 図２７は遺伝子発現カセットｐＤＡＢ１０８７１９についての核酸配列を示しており、それぞれの遺伝子およびエレメントが図示されている。 図２７は遺伝子発現カセットｐＤＡＢ１０８７１９についての核酸配列を示しており、それぞれの遺伝子およびエレメントが図示されている。 図２７は遺伝子発現カセットｐＤＡＢ１０８７１９についての核酸配列を示しており、それぞれの遺伝子およびエレメントが図示されている。 図２７は遺伝子発現カセットｐＤＡＢ１０８７１９についての核酸配列を示しており、それぞれの遺伝子およびエレメントが図示されている。 図２７は遺伝子発現カセットｐＤＡＢ１０８７１９についての核酸配列を示しており、それぞれの遺伝子およびエレメントが図示されている。 図２７は遺伝子発現カセットｐＤＡＢ１０８７１９についての核酸配列を示しており、それぞれの遺伝子およびエレメントが図示されている。 図２７は遺伝子発現カセットｐＤＡＢ１０８７１９についての核酸配列を示しており、それぞれの遺伝子およびエレメントが図示されている。 図２８は、Ｃｒｙ３４（図２８Ａ）、ＡＡＤ−１（図２８Ｂ）、およびＣｒｙ３５（図２８Ｃ）について試験された種々の構築物間の例となるタンパク質発現データを示している。 図２８は、Ｃｒｙ３４（図２８Ａ）、ＡＡＤ−１（図２８Ｂ）、およびＣｒｙ３５（図２８Ｃ）について試験された種々の構築物間の例となるタンパク質発現データを示している。 図２９は、フィアリジウム（Phialidium）属種ＳＬ−２００３由来の黄色蛍光タンパク質についての２つの例となる配列（ＰｈｉＹＦＰ、配列番号５１およびＰｈｉＹＦＰｖ３、配列番号５２）を示している。 図３０は、ｐＤＡＢ１０８７０６（ＺＭＵｂｉ二方向性（−２００））ｐＤＡＢ１０８７０７（ＺＭＵｂｉ二方向性（−９０））、ｐＤＡＢ１０８７０８（ＳＣＢＶ二方向性（−２００））およびｐＤＡＢ１０８７０９（ＳＣＢＶ二方向性（−９０））を含む、提供される合成Ｕｂｉ１二方向プロモーターおよび構築物の例となる実施形態を示している。ｐＤＡＢ１０１５５６（ＺｍＵｂｉ１−ＹＦＰ対照）、ｐＤＡＢ１０８７１５（最小プロモ-ターなしのＳＣＢＶ）およびｐＤＡＢ１０８７１６（最小プロモーターなしのＺＭＵｂｉ１）は一方向プロモーターを有する対照構築物として働く。 図３１Ａは、ＹＦＰタンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの例となる発現結果（Ｖ６）を示している。図３１Ｂは、ＹＦＰ ＲＮＡについて、図３０に示される７つの構築物からの例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。 図３２Ａは、ＧＵＳタンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの例となる発現結果（Ｖ６）を示している。図３２Ｂは、ＧＵＳ ＲＮＡについて、図３０に示される７つの構築物からの例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。 図３３Ａは、ＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの例となる発現結果（Ｖ６）を示している。図３３Ｂは、ＡＡＤ１ ＲＮＡについて、図３０に示される７つの構築物からの例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。 図３４Ａは、ＹＦＰタンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図３４Ｂは、ＹＦＰ ＲＮＡについて、図３０に示される７つの構築物からの相対的発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図３４Ａは、ＹＦＰタンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図３４Ｂは、ＹＦＰ ＲＮＡについて、図３０に示される７つの構築物からの相対的発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図３５Ａは、ＧＵＳタンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図３５Ｂは、ＧＵＳ ＲＮＡについて、図３０に示される７つの構築物からの相対的発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図３５Ａは、ＧＵＳタンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図３５Ｂは、ＧＵＳ ＲＮＡについて、図３０に示される７つの構築物からの相対的発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図３６Ａは、ＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図３６Ｂは、ＡＡＤ１ ＲＮＡについて、図３０に示される７つの構築物からの相対的発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図３６Ａは、ＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図３６Ｂは、ＡＡＤ１ ＲＮＡについて、図３０に示される７つの構築物からの相対的発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図３７Ａ、３７Ｂ、および３７Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、およびＧＵＳタンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの例となる発現結果（Ｖ１０）を示している。 図３７Ａ、３７Ｂ、および３７Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、およびＧＵＳタンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの例となる発現結果（Ｖ１０）を示している。 図３８Ａ、３８Ｂ、および３８Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｖ１０）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図３８Ａ、３８Ｂ、および３８Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｖ１０）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図３８Ａ、３８Ｂ、および３８Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｖ１０）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図３９Ａ、３９Ｂ、および３９Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの例となる発現結果（Ｒ３）を示している。 図３９Ａ、３９Ｂ、および３９Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの例となる発現結果（Ｒ３）を示している。 図４０Ａ、４０Ｂ、および４０Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｒ３）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図４０Ａ、４０Ｂ、および４０Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｒ３）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図４０Ａ、４０Ｂ、および４０Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についてｎｇ／ｃｍ２で、図３０に示される７つの構築物からの発現結果（Ｒ３）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図４１はｐＤＡＢ１０８７１７およびｐＤＡＢ１０８７１８を含む、Ｕｂｉ１プロモーターを使用する追加の多重トランス遺伝子構築物を示している。 図４２Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８（ＺＭＵｂｉ１−ＹＦＰ）、ｐＤＡＢ１０５８１８（ＺＭＵｂｉ１−Ｃｒｙ３４／ＺＭＵｂｉ１−Ｃｒｙ３５／ＺＭＵｂｉ１−ＡＡＤ１）、ｐＤＡＢ１０８７１７（ＹＦＰ／ＡＡＤ−１−ＺＭＵｂｉ１二方向性−Ｃｒｙ３４−Ｃｒｙ３５）、およびｐＤＡＢ１０８７１８（ＡＡＤ１／ＹＦＰ−ＺＭＵｂｉ１二方向性−Ｃｒｙ３４−Ｃｒｙ３５）、ｐＤＡＢ１０８７１９（ＹＦＰ／ＡＡＤ１−ＳＣＢＶ二方向性−Ｃｒｙ３４−Ｃｒｙ３５）およびｐＤＡＢ１０８７２０（ＡＡＤ１／ＹＦＰ−ＳＣＢＶ二方向性−Ｃｒｙ３４−Ｃｒｙ３５）からのＣｒｙ３４ ＲＮＡの例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。図４２Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３４タンパク質（ＬＣＭＳ）の例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。 図４３Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＡＡＤ１ ＲＮＡの例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。図４３Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）の例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。 図４４Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＹＦＰ ＲＮＡの例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。図４４Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＹＦＰタンパク質（ＬＣＭＳ）の例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。 図４５Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３５ ＲＮＡの例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。図４５Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３５タンパク質（ＥＬＩＳＡ）の例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。 図４６は、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＰＡＴ ＲＮＡの例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。 図４７Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３４ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図４７Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３４タンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図４７Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３４ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図４７Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３４タンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図４８Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＡＡＤ１ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図４８Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＡＡＤ１タンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図４８Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＡＡＤ１ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図４８Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＡＡＤ１タンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図４９Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＹＦＰ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図４９Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＹＦＰタンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図４９Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＹＦＰ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図４９Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＹＦＰタンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５０Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３５ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図５０Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３５タンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５０Ａは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３５ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。図５０Ｂは、同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３５タンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５１は、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＰＡＴ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃ、および５２Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５の例となるタンパク質発現結果（Ｖ１０）を示している。 図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃ、および５２Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５の例となるタンパク質発現結果（Ｖ１０）を示している。 図５３Ａ、５３Ｂ、５３Ｃ、および５３Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５のタンパク質発現結果（Ｖ１０）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５３Ａ、５３Ｂ、５３Ｃ、および５３Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５のタンパク質発現結果（Ｖ１０）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５３Ａ、５３Ｂ、５３Ｃ、および５３Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５のタンパク質発現結果（Ｖ１０）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５３Ａ、５３Ｂ、５３Ｃ、および５３Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５のタンパク質発現結果（Ｖ１０）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５４Ａ、５４Ｂ、５４Ｃ、および５４Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、およびｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５の例となるタンパク質発現結果（Ｒ３）を示している。 図５４Ａ、５４Ｂ、５４Ｃ、および５４Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、およびｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５の例となるタンパク質発現結果（Ｒ３）を示している。 図５５Ａ、５５Ｂ、５５Ｃ、および５５Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５のタンパク質発現結果（Ｒ３）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５５Ａ、５５Ｂ、５５Ｃ、および５５Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５のタンパク質発現結果（Ｒ３）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５５Ａ、５５Ｂ、５５Ｃ、および５５Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５のタンパク質発現結果（Ｒ３）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５５Ａ、５５Ｂ、５５Ｃ、および５５Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５のタンパク質発現結果（Ｒ３）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。 図５６は、ｐＤＡＢ１０８７１８およびｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、およびＡＡＤ１のタンパク質発現についてのウェスタンブロットの例となる結果である。
トランスジェニック産物の開発はますます複雑になっており、単一遺伝子座に複数のトランス遺伝子を集積する必要がある。伝統的に、それぞれのトランス遺伝子は通常、発現のための独自のプロモーターが必要であり、したがって、１つの遺伝子スタック内で異なるトランス遺伝子を発現するには複数のプロモーターが必要である。このせいで、遺伝子スタックのサイズが増えることに加えて、同じプロモーターを繰り返し使用して、同じ形質を制御する異なるトランス遺伝子の類似するレベルの発現パターンを得る場合が多くなる。同じプロモーターにより駆動される多重遺伝子構築物は、遺伝子サイレンシングを引き起こし、したがってトランスジェニック産物のフィールドでの効果が低くなることが知られている。プロモーター繰り返しに起因する過剰な転写因子（ＴＦ）結合部位は内在性ＴＦを枯渇させ、転写不活性化をもたらすことがある。トランス遺伝子のサイレンシングにより、トランス遺伝子を発現させる作製されたトランスジェニック植物の性能はおそらく望ましくない影響を受けることになる。トランス遺伝子内の繰り返し配列により遺伝子座内相同組換えが起こり、ポリヌクレオチドの再配置が生じることがある。
二方向プロモーター系を、プロモーターのどちらか１つのまたは両方の末端で遺伝子のバイシストロン性組織と、例えば、トーセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス由来の２Ａ配列の使用と組み合わせる方法および構築物が提供される。２Ａタンパク質は、わずか１６〜２０アミノ酸長であるが、ポリタンパク質をそれ自体のカルボキシ末端で切断する。２Ａまたは２Ａ様ペプチドの「自己切断」または「リボソームスキップ」特性を使用して、トランスジェニック植物において産生される人工的ポリタンパク質を加工することができる。一実施形態では、Ｃｒｙ３４とＣｒｙ３５遺伝子は１つの遺伝子発現カセットに融合され、ＹＦＰ（またはＰｈｉＹＦＰ）とＡＡＤ１遺伝子はもう１つの遺伝子発現カセットに融合されている（２Ａタンパク質遺伝子のコピーがそれぞれの組合せの２つの遺伝子間に置かれている単一オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する）。例えば、これらの遺伝子発現カセット（または遺伝子対）のそれぞれは二方向プロモーターのどちらかの末端に置かれ、単一のプロモーターを使用して４つのトランス遺伝子を駆動させることができる。したがって、本明細書に提供される構築物および方法は、同じプロモーターを繰り返して使用することを回避し商業的構築物のサイズを著しく減少させるのに有用である。さらに、４つ以上の遺伝子を１つのプロモーターで駆動させれば、単一形質を制御する遺伝子を同時発現させる能力も与えられる。
基礎研究または生物工学的応用のために使用される植物プロモーターは、一般に一方向性であり、その３’末端（下流）に融合されている１つの遺伝子のみに指令を与える。代謝工学および形質スタッキングのために植物に複数の遺伝子を導入することが必要であることが多く、したがって、複数の遺伝子の発現を駆動させるためには複数のプロモーターが典型的には将来のトランスジェニック作物に必要となる。配置されるプロモーターの数を節約し遺伝子集積のための同時共調節発現を可能にすることができる戦略を設計するのが望ましい。ある実施形態では、提供される二方向プロモーターは、ＲＮＡｉ、人工ｍｉＲＮＡ、またはヘアピンループＲＮＡ配列を含む、複数の転写単位の転写を駆動させることができる。
本明細書の実施形態は、トウモロコシユビキチン−１遺伝子（例えば、ＺｍＵｂｉ１）由来の一方向プロモーターおよびＳＣＢＶプロモーターを使用して、１つのプロモーターが２つの遺伝子（プロモーターのそれぞれの末端に１つ）の発現を指示することができるように合成二方向プロモーターを設計する工程を利用する。合成二方向プロモーターにより、当業者は、同じプロモーターの繰り返し使用を減らしトランスジェニック構築物のサイズを抑えながら植物細胞および植物にトランス遺伝子を積み重ねることが可能になりうる。さらに、単一の合成二方向プロモーターで２つの遺伝子の発現を調節すると、例えば、２つの遺伝子がそれぞれ宿主内の単一の形質に寄与する場合には有用になりうるような、同じ条件下で２つの遺伝子を同時発現する能力も与えられる。ＣａＭＶ３５プロモーター（Barfield and Pua (1991) Plant Cell Rep. 10(6〜7):308〜14; Xieら、(2001))、およびマンノピンシンターゼプロモーター（ｍａｓ）プロモーター(Veltenら、(1984) EMBO J.3(12):2723〜30; Langridgeら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219〜23）を含む、植物におけるプロモーターの二方向機能の使用はいくつかの場合に報告されている。
植物遺伝子における転写開始および遺伝子発現モジュレーションは、プロモーター内に集団的に配置されている種々のＤＮＡ配列エレメントにより指示される。真核生物プロモーターは、最小コアプロモーターエレメント（ｍｉｎＰ）、およびさらに上流の調節配列（ＵＲＳ）からなる。コアプロモーターエレメントは、転写の正確な開始を指示するのに十分な連続するＤＮＡ配列の最小ストレッチである。植物におけるコアプロモーターは、ＣＡＡＴおよびＴＡＴＡボックスなどの転写開始に関連するカロニカル領域も含む。ＴＡＴＡボックスエレメントは通常は、転写の開始部位のおよそ２０〜３５ヌクレオチド上流に位置している。
ｍｉｎＰの活性化はＵＲＳに依拠しており、このＵＲＳには様々なタンパク質が結合しそれに続いて転写開始複合体と相互作用する。ＵＲＳは、ＤＮＡ配列を含み、このＤＮＡ配列はＵＲＳを含むプロモーターの時空間的発現パターンを決定する。プロモーターの極性はｍｉｎＰの配向によって決定されることが多く、ＵＲＳは双極性である（すなわち、ＵＲＳはその配向とは無関係に機能する）。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ合成一方向極性プロモーターは、ｍｉｎＰをプロモーターの５’末端で反対配向に融合させることにより二方向プロモーターに変換しうる。例えば、Xieら、(2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677〜9を参照されたい。
いくつかの実施形態の特定の実施例では、元来トウモロコシ（Z. mays）近交系、Ｂ７３由来の改変されたトウモロコシＵｂｉ１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１）の最小コアプロモーターエレメント（ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ）を使用して、既に入手可能な二方向プロモーターに関して類のない発現制御特徴を与えるように植物において機能しうる合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを操作する。実施形態には、天然のＳＣＢＶプロモーター由来のヌクレオチド配列をさらに含む合成二方向ＳＣＢＶプロモーターが含まれる。特定の実施形態には、合成二方向ＳＣＢＶプロモーター中のＳＣＢＶおよびｍｉｎＵｂｉ１Ｐ配列エレメントに近接するイントロン（例えば、ＡＤＨイントロン）を含む合成二方向ＳＣＢＶプロモーターがさらに含まれうる。
始めはＢ７３由来のＺｍＵｂｉ１プロモーターは、トウモロコシゲノム内で転写開始部位の約８９９塩基５’側内、さらに転写開始部位の約１０９３塩基３’側内に位置している配列を含む。Christensenら、(1992) Plant Mol. Biol. 18(4):675〜89（B73 ZmUbi1遺伝子を記載している）。Ｂ７３に由来し、いくつかの例で使用される改変ＺｍＵｂｉ１プロモーターはおよそ２ｋｂプロモーターであり、ＴＡＴＡボックス、２つの重複する熱ショックコンセンサスエレメント、転写開始部位に直接隣接する８２または８３ヌクレオチド（基準鎖に応じて）リーダー配列（本明細書ではＺｍＵｂｉ１エクソンと呼ばれる）、および１０１５〜１０１６ヌクレオチドイントロンを含有する（例えば、図１参照）。ゼア（Zea）種およびトウモロコシ（Zea mays）遺伝子型に由来する他のトウモロコシユビキチンプロモーターバリアントは、ＴＡＴＡエレメントおよび上流熱ショックコンセンサスエレメントからなるｍｉｎＰエレメント近くに高い配列保存を示すことがある。したがって、本発明の実施形態は、合成二方向植物プロモーターを構築するための最小コアプロモーターエレメントとしてＺｍＵｂｉ１プロモーターのこの短い（約２００ｎｔ）高度に保存された領域（例えば、配列番号１）を使用することにより例証される。
開示されているある特定の略字は表１に収載されている。
本明細書で使用される場合、冠詞「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がはっきりと明確に他の方法で指示していなければ、複数の参照を含む。
本明細書で使用される場合、語句「戻し交配」とは、育種家が雑種子孫を親のうちの一方、例えば、Ｆ１雑種の親遺伝子型のうちの１つを有する第１世代雑種Ｆ１と再び交雑させる工程のことである。
本明細書で使用される場合、語句「イントロン」とは、転写されるが翻訳はされない遺伝子（または対象の発現されたヌクレオチド配列）に含まれる任意の核酸配列のことである。イントロンには、ＤＮＡの発現された配列内の非翻訳核酸配列、ならびにそこから転写されるＲＮＡ分子中の対応する配列が含まれる。
本明細書で使用される場合、語句「単離された」とは、構成成分内に化学的または機能的変化をもたらしつつ（例えば、核酸は、染色体内でこの核酸を残りのＤＮＡに連結している化学結合を切断することにより染色体から単離されることもある）、構成成分が天然に存在している生物の細胞内の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から実質的に分離されている、これとは別に産生された、またはこれから精製分離されている生物学的構成成分（核酸またはタンパク質を含む）のことである。「単離」された核酸分子およびタンパク質には、標準精製法により精製された核酸分子およびタンパク質が含まれる。語句「単離された」は、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質、およびペプチドも包含する。
本明細書で使用される場合、語句「遺伝子発現」とは、核酸転写単位のコードされた情報（例えば、ゲノムＤＮＡを含む）が、タンパク質の合成を含むことが多い、細胞の操作的、非操作的、または構造的部分に変換される過程のことである。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増加させるまたは減少させる作用因子への細胞、組織、または生物の曝露により影響を受けることがある。遺伝子の発現は、ＤＮＡからＲＮＡそしてタンパク質への経路における任意の場所でも調節されることがある。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解に作用する制御を通して、または産生された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区分化、もしくは分解を通して、またはそれらの組合せにより起こる。遺伝子発現は、限定せずに、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕもしくはｉｎ ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む、当技術分野で公知のどんな方法によってもＲＮＡレベル、またはタンパク質レベルで測定することが可能である。
本明細書で使用される場合、語句「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」（ＨＢＧＳ）とは、転写遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む総称のことである。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、プロモーターまたは転写された配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生のせいでそれぞれ転写阻害（転写遺伝子サイレンシング；ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（転写後遺伝子サイレンシング；ＰＴＧＳ）に起因することがある。それぞれの過程への異なる細胞構成成分の関与は、ｄｓＲＮＡ誘導ＴＧＳおよびＰＴＧＳがおそらく古代の共通な機構の多様化に起因することを示唆している。しかし、ＴＧＳとＰＴＧＳを厳密に比較するのは、その比較が一般に異なるサイレンシング遺伝子座の解析に依拠しているために困難であった。単一トランス遺伝子座は、異なる標的遺伝子のプロモーターと転写された配列に対応するｄｓＲＮＡの産生のせいで、ＴＧＳとＰＴＧＳの両方を始動させると説明することができる。例えば、Mourrainら、(2007) Planta 225:365〜79を参照されたい。ｓｉＲＮＡは相同な配列上でＴＧＳとＰＴＧＳを始動させる実際の分子である可能性が高く、ｓｉＲＮＡはこのモデルでは、トランス遺伝子配列のメチル化を内在性プロモーター内に広げることを通じて相同な配列のサイレンシングおよびメチル化をシスでおよびトランスで始動させると考えられる。
本明細書で使用される場合、語句「核酸分子」（または「核酸」または「ポリヌクレオチド」）とは、ヌクレオチドのポリマー形態のことであり、これにはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成形態のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方ならびに上記の混合ポリマーを含みうる。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはどちらかの種類のヌクレオチドの改変された形態のことでもよい。本明細書で使用される「核酸分子」は「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は通常、他の方法で指定されなければ、少なくとも１０塩基長である。この用語は未定長のＲＮＡまたはＤＮＡの分子のことでもよい。この用語には一本鎖形態および二本鎖形態のＤＮＡを含む。核酸分子は、天然に存在するおよび／または天然には存在しないヌクレオチド連鎖により互いに連結された天然に存在するおよび改変されたヌクレオチドのどちらかまたは両方を含んでいてもよい。
核酸分子は、当業者により容易に認識されるように、化学的に改変されても生化学的に改変されてもよく、または非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。そのような改変には、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間改変（例えば、無電荷連鎖、例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸、等；電荷連鎖、例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、等；ペンダント部分、例えば、ペプチド；介入物、例えば、アクリジン、ソラレン、等；キレート剤；アルキル化剤；および改変連鎖、例えば、アルファアノマー核酸、等）が含まれる。用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン、環状、および錠かけ型の立体構造を含む、任意のトポロジー立体構造も含まれる。
転写はＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進む。これにより、ＲＮＡは伸長している鎖の３’末端へのリボヌクレオチド−５’−三リン酸の連続付加（ピロリン酸の不可欠な除去と共に）により作られる。線形または環状核酸分子どちらでも、別々のエレメント（例えば、特定のヌクレオチド配列）は、そのエレメントから５’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合することになるのであれば、追加のエレメントに対して「上流」にあると呼んでもよい。同様に、別々のエレメントは、そのエレメントから３’方向の同じ核酸に結合しているまたは結合することになるのであれば、追加のエレメントに対して「下流」にあることになりうる。
本明細書で使用される場合、語句「塩基位置」とは、指定された核酸内の所与の塩基またはヌクレオチド残基の位置のことである。指定された核酸は、基準核酸とのアライメント（下参照）により定義してもよい。
本明細書で使用される場合、語句「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴヌクレオチドとその類似体が水素結合によりハイブリダイズする過程のことであり、水素結合には相補的塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合が含まれる。一般に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のどちらかである窒素塩基からなる。これらの窒素塩基はピリミジンとプリン間で水素結合を形成し、プリンへのピリミジンの結合は「塩基対合」と呼ばれる。さらに具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合する。「相補的」とは、２つの異なる核酸配列または同じ核酸配列の２つの異なる領域間で起こる塩基対合のことである。
本明細書で使用される場合、語句「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的の間で安定で特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性のことである。特異的にハイブリダイズ可能であるためにはオリゴヌクレオチドはその標的配列と１００％相補的である必要はない。標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチドの結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害し、特異的結合が望ましい条件下で、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは系の場合の生理的条件下で非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性が存在するとき、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。そのような結合は特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。
特定の程度の厳密性を生じるハイブリダイゼーション条件は、選択されたハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化することになる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ２＋濃度）はハイブリダイゼーションの厳密性に寄与するが、洗浄時間も厳密性に影響を与える。特定の程度の厳密性を達成するのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrookら、（ed.）、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、2nd ed.、vol. 1〜3、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989、chs. 9 and 11で考察されている。
本明細書で使用される場合、語句「厳密な条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的の間のミスマッチが５０％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「厳密な条件」には、さらに特定のレベルの厳密性が含まれる。したがって、本明細書で使用される場合、「中程度の厳密性」条件とは、５０％を超える配列ミスマッチを有する分子ではハイブリダイズしない条件であり、「高厳密性」の条件とは、２０％を超えるミスマッチを有する配列ではハイブリダイズしない条件であり、「超高厳密性」の条件とは、１０％を超えるミスマッチを有する配列ではハイブリダイズしない条件である。
特定の実施形態では、厳密な条件は、６５℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いた６５℃での４０分間の洗浄を含むことができる。
以下は代表的、非限定的ハイブリダイゼーション条件である。
超高厳密性：５×ＳＳＣバッファー中６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣバッファー中室温でそれぞれ１５分間の洗浄２回；および０．５×ＳＳＣバッファー中６５℃でそれぞれ２０分間の洗浄を２回。
高厳密性：５×〜６×ＳＳＣバッファー中６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣバッファー中室温でそれぞれ５〜２０分間の洗浄２回；および１×ＳＳＣバッファー中５５〜７０℃でそれぞれ３０分間の洗浄を２回。
中程度厳密性：６×ＳＳＣバッファー中室温から５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×〜３×ＳＳＣバッファー中室温から５５℃でそれぞれ２０〜３０分間の洗浄を少なくとも２回。
特定の実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、超高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。これらのおよび追加の実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、高厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。これらのおよび追加の実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、中程度厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合したままでいることができる。
本明細書で使用される場合、語句「オリゴヌクレオチド」とは、短い核酸ポリマーのことである。オリゴヌクレオチドは、さらに長い核酸セグメントを切断することによりまたは個々のヌクレオチド前駆体を重合することにより形成しうる。自動合成装置を使用すれば、最大数百塩基対長のオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるので、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用しうる。ＤＮＡで構成されているオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）は、小ＤＮＡ配列の増幅のための技法であるＰＣＲにおいて使用しうる。ＰＣＲでは、オリゴヌクレオチドは典型的には「プライマー」と呼ばれ、これによりＤＮＡポリメラーゼはオリゴヌクレオチドを伸長して相補鎖を複製することができる。
本明細書で使用される場合、語句「配列同一性」または「同一性」とは、２つの核酸またはポリペプチド配列が、特定された比較窓にわたって最大一致に整列された場合と同じである２つの配列中の残基を指しうるコンテキストのことである。
本明細書で使用される場合、語句「配列同一性の百分率」とは、比較窓にわたって２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較することにより決定される値のことであり、比較窓内の配列の一部は、２つの配列の最適アライメントの基準配列（付加も欠失も含まない）と比べた場合、付加または欠失（例えば、ギャップ）を含んでいてもよい。百分率は、同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して適合した位置の数を得て、適合した位置の数を比較窓内の位置の総数で割り、この結果に１００を掛けることにより計算されて配列同一性の百分率が得られる。
比較のために配列を整列させる方法は当技術分野では周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237〜44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151〜3; Corpetら、(1988) Nucleic Acids Res. 16:10881〜90; Huangら、(1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155〜65; Pearsonら、(1994) Methods Mol. Biol. 24:307〜31; Tatianaら、(1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247〜50に記載されている。配列アライメント法および相同性計算の詳細な検討は、例えば、Altschulら、(1990) J. Mol. Biol. 215:403〜10に見ることができる。
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Basic Local Alignment Search Tool (BLAST（商標）;Altschulら、(1990)）は、いくつかの配列解析プログラムに関連して使用するための、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、およびインターネット上を含むいくつかの供給源から入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の記載は、インターネット上のＢＬＡＳＴ（商標）についての「ヘルプ」セクションで入手可能である。核酸配列の比較では、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能はデフォルトパラメータを使用して用いてもよい。基準配列にはるかに大きな類似性を有する核酸配列であれば、この方法により評価される場合、百分率同一性の増加を示すことになる。
本明細書で使用される場合、語句「作動可能に連結された」とは、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係にある場合、第一の核酸配列は第二の核酸配列に作動可能に連結しているコンテキストのことである。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している。組換え的に産生される場合、作動可能に連結された核酸配列は一般に連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合は、同じリーディングフレーム内にある。しかし、エレメントは作動可能に連結されるのに近接している必要はない。
本明細書で使用される場合、語句「プロモーター」とは、一般に上流に（遺伝子の５’領域の方に）位置しているＤＮＡの領域であって、転写に必要な領域のことである。プロモーターは、それが制御している遺伝子の適切な活性化または抑圧を可能にしてもよい。プロモーターは転写因子により認識される特定の配列を含有しうる。これらの因子はプロモーターＤＮＡ配列に結合して、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素である、ＲＮＡポリメラーゼを動員することができる。
本明細書で使用される場合、語句「形質転換する」または「形質導入する」とは、ウイルスまたはベクターが核酸分子を細胞内に移す過程のことである。核酸分子を細胞ゲノムに取り込むことによりまたはエピソーム複製によりのいずれかで、細胞により核酸分子が安定的に複製される場合、細胞は、細胞内に「形質導入された」核酸分子により「形質転換」される。本明細書で使用される場合、用語「形質転換」は、核酸分子をそのような細胞内に導入することができる全ての技法を包含する。例には、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション；プラスミドベクターを用いた形質転換；エレクトロポレーション（Frommら、(1986) Nature 319:791〜3）；リポフェクション（Felgnerら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413〜7）；マイクロインジェクション（Muellerら、(1978) Cell 15:579〜85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入（Fraleyら、(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803〜7）；直接ＤＮＡ取り込み；ウィスカー媒介形質転換；および微粒子銃（Kleinら、(1987) Nature 327:70）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、語句「トランス遺伝子」とは、外来性核酸配列のことである。一例では、トランス遺伝子は遺伝子配列（例えば、除草剤耐性遺伝子）、産業的にまたは薬剤的に有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業上の形質をコードする遺伝子である。さらに別の例では、トランス遺伝子は、その発現により標的核酸配列の発現が阻害されるアンチセンス核酸配列である。トランス遺伝子は、それに作動可能に連結している調節配列（例えば、プロモーター）を含有していてもよい。いくつかの実施形態では、対象の核酸配列はトランス遺伝子である。しかし、他の実施形態では、対象の核酸配列は、その追加のゲノムコピーが望ましい内在性核酸配列、または宿主生物における標的核酸分子の配列に関してアンチセンス配向である核酸配列である。
本明細書で使用される場合、語句「ベクター」とは、細胞に導入され、それにより形質転換細胞を作製する核酸分子のことである。ベクターは、複製起点などの、ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列を含みうる。例には、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、または外来性ＤＮＡを細胞内に運ぶウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ベクターは、１つもしくは複数の遺伝子、アンチセンス分子、および／または選択可能マーカー遺伝子ならびに当技術分野で公知の他の遺伝要素も含むことができる。ベクターは、細胞を形質導入する、形質転換する、または感染させ、それにより細胞に核酸分子および／またはベクターにコードされたタンパク質を発現させうる。ベクターは、場合によって、核酸分子の細胞内への進入を達成するのに役立つ物質（例えば、リポソーム）を含みうる。
本明細書で使用される場合、語句「植物」には、植物細胞ならびに葉、茎、根、花、花粉、および種子などの植物組織を含むがこれらに限定されない植物および植物部分が含まれる。本発明で使用することができる植物の種類は一般に、被子植物（単子葉および双子葉植物）、裸子植物、シダ類および多細胞藻類を含む、変異誘発を受け入れられる高等および下等植物の種類と同じくらい幅広い。したがって、「植物」には双子葉植物および単子葉植物が含まれる。双子葉植物の例には、タバコ、シロイズナズナ（Arabidopsis）、ダイズ、トマト、パパイア、キャノーラ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウ、キマメ、エンドウマメ、アブラナ属（Brassica）、ヒヨコマメ、サトウダイコン、ナタネ、スイカ、メロン、コショウ、ピーナッツ、カボチャ（pumpkin）、ダイコン、ホウレンソウ、カボチャ（squash）、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、キュウリ、ナスおよびレタスが含まれる。単子葉植物の例には、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、カラスムギ、タマネギ、アワ、およびライコムギが含まれる。
本明細書で使用される場合、語句「植物物質」とは、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養物、または植物の他の任意の部分もしくは産物のことである。ある実施形態では、植物物質には子葉および葉が含まれる。
本明細書で使用される場合、語句「翻訳スイッチ」とは、すぐ下流の遺伝子の翻訳を可能にする遺伝子末端の機構のことである。翻訳スイッチの機構は、核酸レベルで（例えば、ウイルスもしくは真核生物配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、選択的スプライシング部位、またはリボザイム切断部位）またはペプチド／タンパク質レベルで（例えば、２Ａペプチド、２Ａ様ペプチド、インテインペプチド、またはプロテアーゼ切断部位）機能することができる。
核酸レベルでのまたはペプチド／タンパク質レベルでの翻訳スイッチのこれらの機構は当技術分野では周知である。例えば、 Z.Li, H. M. Schumacherら、(2010) J Biotechnol 145(1): 9〜16; Y.Chen, K. Perumalら、(2000) Gene Expr. 9(3):133〜143; T.D.Dinkova, H. Zepedaら、(2005) Plant J. 41(5): 722〜731; Y.L.Dorokhov, M.V. Skulachevら、(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(8): 5301〜5306; O.Fernandez-Miragall, and C. Hernandez (2011) PLoS One 6(7): e22617; E.Groppelli, G. J. Belshamら、(2007) J. Gen. Virol. 88(Pt 5): 1583〜1588; S.H.Ha, Y. S. Liangら、(2010) Plant Biotechnol J. 8(8): 928〜938; A.Karetnikov and K. Lehto (2007) J. Gen. Virol. 88(Pt 1): 286〜297; A.Karetnikov and K. Lehto (2008) Virology 371(2): 292〜308; M.A.Khan, H. Yumakら、(2009) J. Biol. Chem. 284(51): 35461〜35470; and D.C.Koh, S.M. Wongら、(2003) J. Biol. Chem. 278(23): 20565〜20573を参照されたい。前記文献の内容は本明細書によりその全体を参照によって組込まれている。改変されたインテインを含有する多重遺伝子発現構築物は、米国特許第７，０２６，５２６号および米国特許第７，７４１，５３０号ならびに米国特許出願公開第２００８／０１１５２４３号に開示されている。
本明細書で使用される場合、語句「選択可能マーカー」または「選択可能マーカー遺伝子」とは、例えば、植物細胞を選択剤から保護するまたは選択剤に対する抵抗性／耐性を与えるために、場合によって植物形質転換において使用される遺伝子のことである。機能的選択可能マーカーを受け入れる細胞または植物のみが、選択剤を有する条件下で分裂または増殖することができる。選択剤の例は、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびハイグロマイシンを含む抗生物質を含むことができる。これらの選択可能マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を与える酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）の遺伝子、ならびに関連抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン、およびＧ４１８の遺伝子、またはハイグロマイシンに対する抵抗性を与える酵素を発現するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）の遺伝子が含まれる。他の選択可能マーカー遺伝子は、Ｂａｒ（ＢＡＳＴＡ（登録商標）（グルホシネートアンモニウム）、またはホスフィノトリシン（ＰＰＴ）に対する抵抗性）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ、分岐鎖アミノ酸の合成の第１ステップを妨げるスルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）、およびスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する抵抗性）、グリホサート、２，４−Ｄを含む除草剤抵抗性、および金属抵抗性または感受性をコードする遺伝子を含むことができる。語句「マーカー陽性」とは、選択可能マーカー遺伝子を含むように形質転換された植物のことである。
様々な選択可能なまたは検出可能なマーカーを選ばれた発現ベクター中に取り込ませて、形質転換された植物、または形質転換体の同定および選択を可能にすることができる。例えば、ＤＮＡ塩基配列決定およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティング、ベクターから発現されたタンパク質、例えば、ホスフィノトリシン抵抗性を媒介する沈降タンパク質、またはレポーター遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼ、および同類の物などの他のタンパク質を検出するための免疫学的方法を含む、形質転換植物における選択マーカーの発現を確認するための多くの方法が利用可能である（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Third Edition、Cold Spring Harbor Press、N.Y.、2001参照）。
選択可能マーカー遺伝子は形質転換細胞または組織の選択のために利用される。選択可能マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子などの抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、ならびに除草剤化合物に対する抵抗性を与える遺伝子が含まれる。除草剤抵抗性遺伝子は一般に、除草剤に非感受性の改変された標的タンパク質または除草剤が機能することができる前に植物中で除草剤を分解するもしくは解毒する酵素をコードしている。例えば、グリホサートに対する抵抗性は、変異体標的酵素、５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子を使用することにより獲得されてきた。ＥＰＳＰＳの遺伝子および変異体は、米国特許第４，９４０，８３５号、米国特許第５，１８８，６４２号、米国特許第５，３１０，６６７号、米国特許第５，６３３，４３５号、米国特許第５，６３３，４４８号、および米国特許第６，５６６，５８７号に開示されている。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性は、それぞれの除草剤を解毒するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ、または２，４−ジクロロフェノキシアセテートモノオキシゲナーゼをコードする細菌遺伝子を使用することにより獲得されてきた。グルホシネート抵抗性／耐性のための酵素／遺伝子は、米国特許第５，２７３，８９４号、米国特許第５，２７６，２６８号、米国特許第５，５５０，３１８号、および米国特許第５，５６１，２３６号に開示されている。２，４−Ｄ抵抗性のための酵素／遺伝子は、米国特許第６，１００，４４６号および米国特許第６，１５３，４０１号、ならびに米国特許出願公開第２００９／００９３３６６号およびＷＯ２００７／０５３４８２に既に開示されている。ニトリラーゼに対する酵素／遺伝子は米国特許第４，８１０，６４８号に既に開示されている。
イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含む、他の除草剤は成長点または分裂組織を阻害することができ、これらの除草剤に対するアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の抵抗性／耐性の遺伝子は記載されている。ＡＨＡＳおよび変異体の遺伝子および変異体は、米国特許第４，７６１，３７３号、米国特許第５，３０４，７３２号、米国特許第５，３３１，１０７号、米国特許第５，８５３，９７３号、および米国特許第５，９２８，９３７号に開示されている。ＡＬＳの遺伝子および変異体は米国特許第５，０１３，６５９号および米国特許第５，１４１，８７０号に開示されている。
グリホサート抵抗性遺伝子には、それぞれ変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子（組み換え核酸の導入および／または天然のＥＰＳＰ遺伝子の様々な形態のｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発を介して）、ａｒｏＡ遺伝子およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子が含まれる。他のホスホノ化合物に対する抵抗性遺伝子には、グルホシネート（ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトミセス・ビリジクロモジェネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトミセス（Streptomyces）種由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）、およびピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（cyclohexone）（ＡＣＣアーゼ阻害因子コード遺伝子）が含まれる。アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の除草剤抵抗性／耐性遺伝子は、米国特許第５，１６２，６０２号および米国特許第５，４９８，５４４号に記載されている。
変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で入手可能であり、この変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｃｏｍａｉへの米国特許第４，７６９，０６１号、Ｋｕｍａｄａらへの欧州特許出願第０３３３０３３号、およびＧｏｏｄｍａｎらへの米国特許第４，９７５，３７４号で開示されており、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を与えるグルタミンシンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。ＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらへの欧州特許出願第０２４２２４６号に提供されている。DeGreefら、Bio/Technology 7:61(1989)も、ＰＡＴ活性をコードするキメラバー遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作製を記載している。セトキシジムおよびハロキシホップを含む、フェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソンに対する抵抗性を与える遺伝子の例は、Marshallら、Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992)により記載されているＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子である。グリホサート抵抗性を与えることができるＧＡＴ遺伝子は、ＣａｓｔｌｅらへのＷＯ２００５０１２５１５に記載されている。２，４−Ｄ、ｆｏｐおよびピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子はＷＯ２００５１０７４３７および米国特許出願第１１／５８７，８９３号に記載されている。
トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む、他の除草剤は光合成を阻害することができる。Przibilaら、Plant Cell 3:169 (1991)は、変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドを有するクラミドモナス（Chlamydomonas）の形質転換を記載している。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｓｔａｌｋｅｒへの米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受託番号５３４３５、ＡＴＣＣ受託番号６７４４１、およびＡＴＣＣ受託番号６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現はHayesら、Biochem. J. 285:173 (1992)により記載されている。
本発明の目的のために、選択可能マーカー遺伝子には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（Fraleyら、(1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1〜25）、シアナミドヒドラターゼ（Maier-Greinerら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4250〜4264）、アスパラギン酸キナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（Perlら、(1993) Bio/Technology 11:715〜718）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijnら、(1993) Plant Mol. Bio. 22:907〜912）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼおよび脱感作アスパルテード（aspartade）キナーゼ（Perlら、(1993) Bio/Technology 11:715〜718）、バー遺伝子（Tokiら、(1992) Plant Physiol. 100:1503〜1507；および Meagherら、(1996)、Crop Sci. 36:1367）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijnら、(1993) Plant Mol. Biol. 22:907〜912）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）（Southernら、(1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）（Shimizuら、(1986) Mol. Cell Biol. 6:1074）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（Kwokら、(1986) PNAS USA 4552）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（DeBlockら、(1987) EMBO J. 6:2513）、２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Buchanan-Wollatronら、(1989) J. Cell. Biochem. 13D:330）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Andersonら、米国特許第４，７６１，３７３号; Haughnら、(1988) Mol. Gen. Genet. 221:266）、５−エノールピルビル−シキミ酸−リン酸シンターゼ（ａｒｏＡ）（Comaiら、(1985) Nature 317:741）、ハロアリールニトリラーゼ（Stalkerら、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８７／０４１８１）、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（Parkerら、(1990) Plant Physiol. 92:1220）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌ Ｉ）（Guerineauら、(1990) Plant Mol. Biol. 15:127）、および３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）（Hirschbergら、(1983) Science 222:1346）をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
クロラムフェニコール（Herrera-Estrellaら、(1983) EMBO J. 2:987〜992）、メトトレキサート（Herrera-Estrellaら、(1983) Nature 303:209〜213; Meijerら、(1991) Plant Mol Bio. 16:807〜820 (1991)）、ハイグロマイシン（Waldronら、(1985) Plant Mol. Biol. 5:103〜108; Zhijianら、(1995) Plant Science 108:219〜227；および Meijerら、(1991) Plant Mol. Bio. 16:807〜820）、ストレプトマイシン（Jonesら、(1987) Mol. Gen. Genet. 210:86〜91）、スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnardら、(1996) Transgenic Res., 5:131〜137）、ブレオマイシン（Hilleら、(1986) Plant Mol. Biol. 7:171〜176）、スルホンアミド（Guerineauら、(1990) Plant Mol. Bio. 15:127〜136）、ブロモキシニル（Stalkerら、(1988) Science 242:419〜423）、２，４−Ｄ（Streberら、(1989) Bio/Technology 7:811〜816）、グルホサート（Shawら、(1986) Science 233:478〜481）、およびホスフィノトリシン（DeBlockら、(1987) EMBO J. 6:2513〜2518）に対する抵抗性をコードする遺伝子も含まれる。
選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の上記一覧は限定することを意図していない。いかなるレポーターまたは選択可能マーカー遺伝子も本発明に包含される。必要な場合には、そのような遺伝子は当技術分野で公知である方法により塩基配列決定することができる。
レポーターおよび選択可能マーカー遺伝子は、植物における最適発現のために合成される。すなわち、遺伝子のコード配列は植物における発現を増強するように改変されている。合成マーカー遺伝子は植物においてより高いレベルで発現されてより高い形質転換効率を生じるように設計されている。遺伝子の合成最適化のための方法は当技術分野で入手可能である。実際、いくつかの遺伝子は、植物における遺伝子産物の発現を増加するように最適化されている。
マーカー遺伝子配列は特定の植物種における発現のために最適化することが可能であり、またはあるいは植物科における最適発現のために改変することが可能である。植物の好ましいコドンは、対象の特定の植物種において最大量で発現されるタンパク質において最も使用頻度の高いコドンから決定しうる。例えば、ＥＰＡ０３５９４７２；ＥＰＡ０３８５９６２；ＷＯ９１／１６４３２； Perlakら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324〜3328; および Murrayら、(1989) Nucleic Acids Research 17: 477〜498;米国特許第５，３８０，８３１号；および米国特許第５，４３６，３９１号を参照されたい。このように、ヌクレオチド配列は任意の植物における発現に最適化することが可能である。遺伝子配列の全てまたは任意の部分は最適化するまたは合成であってもよいことが認識される。すなわち、完全に最適化されたまたは部分的に最適化された配列も使用しうる。
除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子：
Ａ．除草剤イミダゾリノンまたはスルホニル尿素に対するアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の抵抗性／耐性。ＡＨＡＳおよび変異体の遺伝子および変異体は、米国特許第４，７６１，３７３号、米国特許第５，３０４，７３２号、米国特許第５，３３１，１０７号、米国特許第５，８５３，９７３号、および米国特許第５，９２８，９３７号に開示されている。ＡＬＳの遺伝子および変異体は米国特許第５，０１３，６５９号および米国特許第５，１４１，８７０号に開示されている。
Ｂ．除草剤シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ、Ｄｉｃｌｏｆｏｐ、Ｆｅｎｏｘｙｐｒｏｐ、Ｆｌｕａｚｉｆｏｐ、Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐを含む）に対するアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）の抵抗性／耐性遺伝子は米国特許第５，１６２，６０２号および米国特許第５，４９８，５４４号に記載されている。
Ｃ．グルホサート抵抗性／耐性の遺伝子。５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸シンターゼ（ＥＳ３Ｐシンターゼ）の遺伝子は米国特許第４，７６９，６０１号に記載されている。５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）および変異体の遺伝子は米国特許第４，９４０，８３５号、米国特許第５，１８８，６４２号、米国特許第５，３１０，６６７号、米国特許第５，６３３，４３５号、米国特許第５，６３３，４４８号、および米国特許第６，５６６，５８７号に記載されている。
Ｄ．グルホシネート（ビアラホス、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ））抵抗性／耐性の遺伝子。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｐａｔ）の遺伝子は米国特許第５，２７３，８９４号、米国特許第５，２７６，２６８号、および米国特許第５，５５０，３１８号に記載されており、ビアラホス抵抗性の遺伝子（Ｂａｒ）は米国特許第５，５６１，２３６号、および米国特許第５，６４６，０２４号、米国特許第５，６４８，４７７号、および米国特許第７，１１２，６６５号に記載されている。グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）の遺伝子は米国特許第４，９７５，３７２号および欧州特許出願ＥＰ０３３３０３３ Ａ１に記載されている。
Ｅ．除草剤イソオキサゾール、ジケトニトリル、および／またはスルコトリオンおよびメソトリオンを含むトリケトンに対するヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）の抵抗性／耐性遺伝子は、米国特許第６，２６８，５４９号および米国特許第６，０６９，１１５号に記載されている。
Ｆ．２，４−Ｄ抵抗性／耐性の遺伝子。２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼの遺伝子は米国特許第６，１００，４４６号および米国特許第６，１５３，４０１号に記載されている。２，４−Ｄ抵抗性／耐性の追加の遺伝子はＵＳ２００９／００９３３６６およびＷＯ２００７／０５３４８２に開示されている。
Ｇ．除草剤イミダゾールおよび／またはトリアゾールに対するイミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼ（ＩＧＰＤ）の遺伝子は米国特許第５，５４１，３１０号に記載されている。除草剤Ｄｉｃａｍｂａに対するＤｉｃａｍｂａ分解酵素（オキシゲナーゼ、フェレドキシン、およびレダクターゼ）の遺伝子は米国特許第７，０２２，８９６号および米国特許第７，１０５，７２４号に開示されている。
Ｈ．トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む、光合成を阻害する除草剤の遺伝子。例えば、変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドでのクラミドモナス（Chlamydomonas）の形質転換を開示しているPrzibilaら、Plant Cell 3:169 (1991)を参照されたい。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子はＡＴＣＣ受託番号５３４３５、ＡＴＣＣ受託番号６７４４１、およびＡＴＣＣ受託番号６７４４２下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現はHayesら、Biochem. J. 285:173 (1992)により記載されている。
他の方法で具体的に説明されなければ、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。分子生物学の一般用語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrewら、(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); およびMeyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見ることができる。
本開示は、二方向プロモーターとして機能することができる合成ヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、合成二方向プロモーターは対象の１つまたは２つのヌクレオチド配列（複数可）に作動可能に連結されうる。例えば、合成二方向プロモーターは、対象のヌクレオチド配列（複数可）の少なくとも１つ（例えば、１つまたは両方）の転写を調節するように、対象の１つまたは２つのヌクレオチド配列（複数可）（例えば、プロモーターのそれぞれの末端に１つで２つの遺伝子）に作動可能に連結されうる。合成二方向プロモーターにＳＣＢＶプロモーター由来のＵＲＳを組み込むことにより、合成二方向プロモーターに作動可能に連結されている対象のヌクレオチド配列に関して特定の発現および調節パターン（例えば、ＳＣＢＶプロモーターの制御下の遺伝子により示されるような）を実現しうる。
本発明のいくつかの実施形態は、合成二方向プロモーターを操作するために一方向トウモロコシユビキチン−１遺伝子（ＺｍＵｂｉ１）由来の最小コアプロモーターエレメントを天然のプロモーターの分子コンテキストとは異なる分子コンテキストに組み込むことにより、本明細書では例証される。この最小コアプロモーターエレメントは本明細書では「ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ」と呼ばれ、およそ２００ｎｔ長である。ゼア（Zea）種およびトウモロコシ（Z.mays）遺伝子型由来のｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントの塩基配列決定および解析により、機能的ｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントは、配列番号１のｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントの、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、および／または少なくとも約１００％の配列同一性を共有するならば、転写開始因子としてその機能を保存するように高度に保存されていることが明らかにされた。本発明のいくつかの実施形態において有用でありうるｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントの特徴には、例えば、限定せずに、ヌクレオチド配列の前述の高度な保存、少なくとも１つのＴＡＴＡボックスの存在、および／または少なくとも１つ（例えば、２つ）の熱ショックコンセンサスエレメント（複数可）の存在が含まれうる。特定のｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントでは、１つよりも多い熱ショックコンセンサスエレメントはｍｉｎＵｂｉ１Ｐ配列内で重複していることがある。
いくつかの実施形態では、天然のプロモーターの分子前後関係とは異なる分子前後関係にｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントを組み込んで合成二方向プロモーターを操作する工程は、ＳＣＢＶプロモーターの残りの配列に関してｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントの配向を逆にしたままＳＣＢＶプロモーター核酸中にｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントを組み込むことを含みうる。したがって、合成ＳＣＢＶ二方向プロモーターは、ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ最小コアプロモーターエレメントがＳＣＢＶプロモーターヌクレオチド配列の３’に位置する対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるように、ＳＣＢＶプロモーターヌクレオチド配列の３’に位置しＳＣＢＶプロモーターヌクレオチド配列に関して逆配向であるｍｉｎＵｂｉ１Ｐ最小コアプロモーターエレメントを含みうる。例えば、ｍｉｎＵｂｉ１ＰエレメントはＳＣＢＶプロモーターの３’末端に逆配向で組み込まれてもよい。
合成二方向ＳＣＢＶプロモーターは、ｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントおよび天然のＳＣＢＶプロモーターのエレメントに加えて１つまたは複数の追加の配列エレメントも含みうる。いくつかの実施形態では、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターは、プロモーターＵＲＳ、エクソン（例えば、リーダーまたはシグナルペプチド）、イントロン、スペーサー配列、およびまたは前記のいずれかの１つまたは複数の組合せを含みうる。例えば、限定せずに、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターは、ＳＣＢＶプロモーター由来のＵＲＳ配列、ＡＤＨ遺伝子由来のイントロン、Ｕｂｉ１遺伝子由来のリーダーペプチドをコードするエクソン、Ｕｂｉ１遺伝子由来のイントロン、およびこれらの組合せを含みうる。
プロモーターＵＲＳを含む合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを含むそれらの例の一部では、ＵＲＳは合成プロモーターに特定の調節特性を与えるように選択しうる。公知のプロモーターは、作動可能に連結された遺伝子に対してプロモーターが行使する制御の種類（例えば、環境応答、発生の合図、および空間情報）が広く異なり、異種プロモーターに組み込まれたＵＲＳは典型的には、その天然のプロモーターおよび作動可能に連結された遺伝子（複数可）に関してＵＲＳが示す制御の種類を維持する。上記、Langridgeら、(1989)。特徴付けられ、いくつかの実施形態に従って合成二方向Ｕｂｉ１プロモーター内に含まれるＵＲＳを含有しうる真核生物プロモーターの例には、例えば、限定せずに、米国特許第６，４３７，２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）、米国特許第５，６４１，８７６号（イネアクチンプロモーター）、米国特許第６，４２６，４４６号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）、米国特許第６，４２９，３６２号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）、米国特許第６，２３２，５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）、米国特許第６，１７７，６１１号（構成的トウモロコシプロモーター）、米国特許第６，４３３，２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）、米国特許第６，４２９，３５７号（イネアクチン２プロモーター、およびイネアクチン２イントロン）、米国特許第５，８３７，８４８号（根特異的プロモーター）、米国特許第６，２９４，７１４号（光誘導性プロモーター）、米国特許第６，１４０，０７８号（塩誘導性プロモーター）、米国特許第６，２５２，１３８号（病原体誘導性プロモーター）、米国特許第６，１７５，０６０号（亜リン酸欠損誘導性プロモーター）、米国特許第６，３８８，１７０号（二方向プロモーター）、米国特許第６，６３５，８０６号（ガンマコイキシン（gamma-coixin）プロモーター）、および米国特許出願第０９／７５７，０８９号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）に記載されているプロモーターが含まれる。
追加の例となる原核生物プロモーターには、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebertら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745〜9）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導性プラスミド上に担持されている）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター（Lawtonら、(1987) Plant Mol. Biol. 9:315〜24）、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Odellら、(1985) Nature 313:810〜2）、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓ−プロモーター（Walkerら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624〜8）、スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144〜8）、Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandlerら、(1989) Plant Cell 1:1175〜83）、ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号、米国特許第５，３５２，６０５号、米国特許第５，３５９，１４２号、および米国特許第５，５３０，１９６号）、ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号、および米国特許第５，３７８，６１９号）、ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号）、ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号）、およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（ジェンバンク受託番号Ｖ０００８７； Depickerら、(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561〜73; Bevanら、(1983) Nature 304:184〜7）、および同類の物が含まれる。
いくつかの実施形態では、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターは、エクソンをさらに含みうる。例えば、実施例では、プロモーターに作動可能に連結されている対象のヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチドを標的にするまたは特定の細胞内位置および／または区画に輸送することが望ましいことがある。これらのおよび他の実施形態では、コード配列（エクソン）は、残りの合成二方向ＳＣＢＶプロモーター配列とポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の間で核酸分子に組み込まれうる。合成二方向ＳＣＢＶプロモーターが、組み込まれたコード配列にコードされたペプチドをポリペプチドのその残りの部分と機能的な関係にあるまま含むポリペプチド（またはプロモーターに作動可能に連結されている２つのポリペプチドコード配列のうちの１つもしくは両方）の発現を促進するように、これらのエレメントは当業者の裁量により配置しうる。特定の実施例では、リーダー、輸送、またはシグナルペプチド（例えば、Ｕｂｉ１リーダーペプチド）をコードするエクソンを組み込んでもよい。
合成二方向Ｕｂｉ１プロモーターに組み込まれているエクソンによりコードされうるペプチドには、例えば、限定せずに、ユビキチン（例えば、Ｕｂｉ１）リーダーペプチド、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２００８／１０５８９０号においてジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）の葉緑体ターゲティングについて例証されているように、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）（例えば、シロイズナズナ（A. thaliana）EPSPS CTP (Kleeら、(1987) Mol. Gen. Genet. 210:437〜42)、およびペチュニア（Petunia hybrida）EPSPS CTP (della-Cioppaら、(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873〜7)）が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態では、イントロンも合成二方向ＳＣＢＶプロモーターに、例えば、残りの合成二方向ＳＣＢＶプロモーター配列とプロモーターに作動可能に連結されている対象のヌクレオチド配列の間に組み込むことができる。いくつかの実施例では、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターに組み込まれたイントロンは、限定せずに、翻訳開始配列の上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在する翻訳リーダー配列として機能する５’ＵＴＲであってよい（そのような翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性、および／または翻訳効率に影響を与えうる）。翻訳リーダー配列の例には、トウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、などが含まれる。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225〜36. Non-limiting examples of 5'UTRs include GmHsp (米国特許第５，６５９，１２２号); PhDnaK (米国特許第５，３６２，８６５号); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590〜7);およびAGRtunos (ジェンバンク受託番号Ｖ０００８７；および Bevanら、(1983) Nature 304:184〜7）を参照されたい。特定の実施例では、Ｕｂｉ１および／またはＡＤＨイントロン（複数可）は合成二方向ＳＣＢＶプロモーターに組み込まれうる。
場合によって、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターに組み込みうる追加の配列には、例えば、限定せずに、３’非翻訳配列、３’転写終結領域、およびポリアデニル化領域が含まれる。これらは対象のヌクレオチド配列（例えば、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターに作動可能に連結されている対象の配列）の下流に位置する遺伝要素であり、ポリアデニル化シグナルを与えるポリヌクレオチドおよび／または転写、ｍＲＮＡプロセシング、もしくは遺伝子発現に影響を与えることができる他の調節シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルは植物中で機能して、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端にポリアデニル酸ヌクレオチドを付加させることができる。ポリアデニル化配列は、天然の遺伝子に、種々の植物遺伝子に、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子に由来してもよい。３’転写終結領域の非限定的例は、ノパリンシンターゼ３’領域（ｎｏｓ３’；Fraleyら、(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803〜7）である。様々な３’非翻訳領域の使用の例は、Ingelbrechtら、(1989) Plant Cell 1:671〜80に提供されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的例には、エンドウ（Pisum sativum）RbcS2遺伝子由来のシグナル(Ps.RbcS2-E9; Coruzziら、(1984) EMBO J. 3:1671〜9)およびAGRtu.nos（ジェンバンク受託番号Ｅ０１３１２）が含まれる。
いくつかの実施形態では、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターは、標的生物のゲノムにおける特定の遺伝子座へのプロモーターを含む核酸のターゲティングを促進する１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。例えば、宿主内のゲノムＤＮＡ配列（例えば、希少なまたは独特なゲノムＤＮＡ配列）のセグメントに相同な１つまたは複数の配列が含まれうる。いくつかの実施例では、これらの相同配列は、宿主ゲノムにおける相同ＤＮＡの部位に合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを含む核酸の組換えおよび組込みを導きうる。特定の実施例では、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターは、希少なまたは独特の位置の配列を認識する操作されたヌクレアーゼ酵素を利用して宿主ゲノムの希少なまたは独特な位置へのプロモーターを含む核酸のターゲティングを促進し、希少なまたは独特な位置での組込みを促進する１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。ヌクレアーゼ酵素として亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼを用いるそのような標的にされた組込みシステムは、米国特許出願第１３／０１１，７３５号に記載されている。
合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを含む核酸は、例えば、限定せずに、ＲＣＡ、ＰＣＲ増幅、ＲＴ−ＰＣＲ増幅、ＯＬＡ、およびＳＮｕＰＥを含む、当技術分野で公知の任意の技法を使用して産生しうる。これらのおよび他の等価な技法は当業者には周知であり、例えば、限定せずに、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、3rd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、2001; および Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、1998に詳細にさらに記載されている。
送達および／または形質転換。本開示は、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを含む核酸分子で細胞を形質転換するための方法も提供する。植物への核酸分子の導入のための当技術分野で公知の比較的多数の技法のいずれでも使用して、いくつかの実施形態に従って合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを含む核酸分子で植物を形質転換する、例えば、１つまたは複数の合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを宿主植物ゲノム内に導入し、および／またはプロモーターに作動可能に連結された対象の１つまたは複数の核酸分子（複数可）をさらに導入することができる。
植物の形質転換に適した方法には、ＤＮＡを細胞内に導入することができるいかなる方法でも、例えば、限定せずに、エレクトロポレーション（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号参照）、微粒子銃（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８８０号、米国特許第６，１６０，２０８号、米国特許第６，３９９，８６１号、および米国特許第６，４０３，８６５号参照）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換（例えば、米国特許第５，６３５，０５５号、米国特許第５，８２４，８７７号、米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許第５，９８１，８４０号、および米国特許第６，３８４，３０１号参照）、プロトプラスト形質転換（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号参照）が含まれる。前述の技法などの技法の適用を通じて、事実上どんな植物種の細胞も安定的に形質転換され、これらの細胞は当業者には公知の技法によりトランスジェニック植物に成長させうる。例えば、ワタ形質転換のコンテキストで特に有用でありうる技法は、米国特許第５，８４６，７９７号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，００４，８６３号、および米国特許第６，６２４，３４４号に記載されており、特にアブラナ属（Brassica）植物を形質転換するための技法は、例えば、米国特許第５，７５０，８７１号に記載されており、ダイズを形質転換するための技法は、例えば、米国特許第６，３８４，３０１号に記載されており、トウモロコシを形質転換するための技法は、例えば、米国特許第７，０６０，８７６号および米国特許第５，５９１，６１６号、ならびに国際ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６７２２に記載されている。
受容細胞への外来性核酸の送達を達成後、形質転換細胞は一般にさらなる培養および植物再生のために同定される。形質転換体を同定する能力を改善するために、形質転換体を生み出すのに使用される形質転換ベクターと一緒に選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を用いることを望む場合がある。この場合、潜在的形質転換細胞集団は、細胞を選択剤（複数可）に曝露することによりアッセイすることができる、または望ましいマーカー遺伝子形質を求めて細胞をスクリーニングすることが可能である。
選択剤への曝露を乗り切る細胞、またはスクリーニングアッセイにおいて陽性とスコア化された細胞は、植物の再生を支持する培地で培養してもよい。いくつかの実施形態では、どんな適切な植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）でも、成長調節物質などのさらなる物質を含むことにより改変しうる。組織は、植物再生取組みを始めるのに十分な組織が入手可能になるまで、または手動選択のラウンドの繰り返しに続いて、組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）成長調節物質を有する基礎培地で維持され、次に苗条形成の助けになる培地へ移されうる。培養物は十分な苗条形成が生じるまで定期的に移される。苗条が形成されると、根形成の助けになる培地へ移される。十分な根が形成されると、植物はさらなる成長と成熟のために土壌に移すことができる。
再生中の植物における合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを含む望ましい核酸分子の存在を確認するため、種々のアッセイを実施しうる。そのようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティングならびにＰＣＲなどの分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロット）によりまたは酵素機能によりタンパク質産物の存在を検出するなどの生化学的アッセイ；葉または根アッセイなどの植物部分アッセイ；ならびに全再生植物の表現型の解析が含まれる。
標的にされる組込み事象は、例えば、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、例えば、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングしうる。ＰＣＲ遺伝子型判定には、ゲノムに組み込まれた対象の核酸分子を含有すると予測される単離された宿主植物カラス組織由来のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、続いてＰＣＲ増幅産物の標準クローニングおよび配列解析が含まれるがこれらに限定されないと理解されている。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法はよく記載されており（例えば、Riosら、(2002) Plant J. 32:243〜53参照）、細胞培養物を含む、任意の植物種または組織型由来のゲノムＤＮＡに適用しうる。標的配列と導入された配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せは、ＰＣＲ増幅反応において順次使用されてもまたは多重化されてもよい。標的部位、導入された核酸配列、および／または前記２つの組合せにアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを作製しうる。したがって、ＰＣＲ遺伝子型判定戦略には、例えば、限定せずに、植物ゲノムにおける特定の配列の増幅、植物ゲノムにおける複数の特定の配列の増幅、植物ゲノムにおける非特異的配列の増幅、および前述のいずれかの組合せが含まれうる。当業者であれば、プライマーと増幅反応の追加の組合せを考案してゲノムを調べることができる。例えば、フォワードとリバースオリゴヌクレオチドプライマーのセットを、導入された核酸配列の境界の外側で標的に特異的な核酸配列（複数可）にアニールするよう設計しうる。
フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、導入された核酸分子に、例えば、そこに含まれる対象のヌクレオチド配列内のコード領域に対応する配列で、またはこの核酸分子の他の部分に特異的にアニールするように設計しうる。これらのプライマーは上記のプライマーと併せて使用しうる。オリゴヌクレオチドプライマーは所望の配列に従って合成することができ、市販されている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡから）。増幅に続いてクローニングおよび塩基配列決定を、または増幅産物の直接配列解析を実施してもよい。当業者であれば、ＰＣＲ遺伝子型判定中に生み出される増幅産物の解析のための代替方法を想定してもよい。一実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーはＰＣＲ増幅において用いられる。
本発明のいくつかの実施形態では、例えば、核酸構築物中に存在しうるような、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを含む細胞も提供される。特定の実施例では、いくつかの実施形態に従った合成二方向ＳＣＢＶプロモーターは、植物細胞および植物においてトランス遺伝子の発現を調節する調節配列として利用しうる。いくつかのそのような実施例では、対象のヌクレオチド配列（例えば、トランス遺伝子）に作動可能に連結されている合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを使用すれば、所与の数の対象のヌクレオチド配列の発現を調節するのに必要な相同プロモーターの数を減らし、および／または所与の数の対象のヌクレオチド配列を導入するのに必要な核酸構築物（複数可）のサイズを抑えられる。さらに、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを使用すれば、同じ条件（例えば、ＳＣＢＶプロモーターが活性である条件）下で対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の同時発現が可能になる。例えば、対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列がそれぞれ、対象のヌクレオチド配列を含むトランスジェニック宿主における単一の形質に寄与し、対象のヌクレオチド配列の同時発現がトランスジェニック宿主における前記形質の発現に有利に影響する場合には、そのような実施例は特に有用になりうる。
いくつかの実施形態では、１つもしくは複数の合成二方向ＳＣＢＶプロモーター（複数可）および／または対象のヌクレオチド配列（複数可）を含むトランスジェニック植物は、植物における対象のヌクレオチド配列（複数可）の発現により与えられる（例えば、導入される、増強される、または寄与される）１つまたは複数の望ましい形質を有しうる。そのような形質には、例えば、限定せずに、昆虫、他の有害生物、および病原体に対する抵抗性；除草剤に対する耐性；増強した安定性、収率、または貯蔵期間；環境耐性；薬剤生産；工業製品生産；ならびに栄養強化が含まれうる。いくつかの実施例では、望ましい形質は、対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結された合成二方向ＳＣＢＶプロモーターを含む核酸分子で植物を形質転換することにより与えられうる。いくつかの実施例では、望ましい形質は育種を介して後代植物として産生される植物に与えられ、その形質は、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターに作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列を含む親植物から植物に渡される合成二方向ＳＣＢＶプロモーターに作動可能に連結された１つまたは複数の対象のヌクレオチド配列により与えられうる。
いくつかの実施形態に従ったトランスジェニック植物は、本発明の核酸分子で形質転換される、または本発明の核酸分子で形質転換された植物で育種することができるどんな植物であってもよい。したがって、植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。いくつかの実施例において使用するための双子葉植物の非限定的例には、アルファルファ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ（pumpkin）、ダイコン、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ（squash）、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマト、およびスイカが含まれる。いくつかの実施例において使用するための単子葉植物の非限定的例には、トウモロコシ、タマネギ、イネ、モロコシ、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、オオムギ、ライコムギ、スイッチグラス、および芝草が含まれる。
いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物はいかなる方法で使用してもまたは栽培してもよく、そこでは合成二方向ＳＣＢＶプロモーターおよび／または作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列の存在が望ましい。したがって、そのようなトランスジェニック植物は、本発明に従った核酸分子で形質転換されることにより特に１つまたは複数の所望の形質を有するように操作されてもよく、当業者には公知のいかなる方法によって植え付けるおよび／または栽培してもよい。
本発明は特定の方法および実施形態を参照して説明されてきたが、本発明から逸脱することなく様々な改変および変化を加えられることは認識されるであろう。
以下の実施例はある特定の特長および／または実施形態を説明するために提供される。実施例は、本開示を例示される特定の特長または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
［実施例］
形質転換および発現
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換：ｐＤＡＢ１０８７０６バイナリーベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＤＡｔ１３１９２ターナリー（米国特許仮出願第６１／３６８９６５号）中に形質転換される。細菌コロニーは単離され、バイナリープラスミドＤＮＡは単離され制限酵素消化を介して確かめられる。
トウモロコシ形質転換：穂減菌および胚単離。トウモロコシ未熟胚を入手するため、トウモロコシ（Zea mays）（ｃ．ｖ．Ｂ１０４）の植物が温室で栽培され、自家または兄弟姉妹受粉されて穂を産生する。穂は受粉のおよそ９〜１２日後に収穫される。実験当日、穂は、５％次亜塩素酸ナトリウムを含有する家庭用漂白剤の２０％溶液中に浸漬され、２０〜３０分振盪され、続いて減菌水で３回すすがれることにより表面減菌される。減菌後、未熟接合体胚（１．５〜２．２ｍｍ）はそれぞれの穂から無菌で解体され、液体感染培養液（ＬＳ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、４．４３ｇｍ／Ｌ；Ｎ６ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍＬ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６８．５ｇｍ／Ｌ；グルコース、３６．０ｇｍ／Ｌ；２，４−Ｄ、１．５０ｍｇ／Ｌ）を含有するマイクロ遠心チューブに無作為に分配される。所与のセットの実験では、２〜３穂からのプールされた胚は処置ごとに使用される。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始：上記のバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）のグリセロールストックは、適切な抗生物質を含有するＡＢ最小培地プレート上に画線され、２０℃で３〜４日間増殖される。単一コロニーが摘み取られ、同じ抗生物質を含有するＹＥＰプレート上に画線され、２８℃で１〜２日間インキュベートされた。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養および共培養：実験当日、アグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーはＹＥＰプレートから摘み取られ、５０ｍＬ使い捨てチューブ中１０ｍＬの感染培養液に懸濁され、細胞密度は分光光度計を使用してＯＤ６００＝０．２〜０．４ｎｍに調整される。アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物は、胚解体が実施される間、室温で１００ｒｐｍの回転式振盪器の上に置かれる。サイズが１．５〜２．２ｍｍの未熟接合体胚は減菌されたトウモロコシ仁から単離され、１ｍＬの感染培養液に入れられ、同じ培養液で１度洗浄される。アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液（２ｍＬ）がそれぞれのチューブに添加され、チューブは約２０回反転され、次に１０〜１５分間振盪される。胚は共培養培地（ＭＳ Ｓａｌｔｓ、４．３３ｇｍ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物１００．０ｍｇ／Ｌ；Ｄｉｃａｍｂａ−３．３０ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇｍ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）、３．００ｇｍ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ＡｇＮＯ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ、１００μＭ）上に移され、盤状体を上にして配向され、２５℃、明所で３〜４日間インキュベートされる。
ＧＵＳおよびＹＦＰ／ＰｈｉＹＦＰ一過性発現：一過性ＹＦＰ／ＰｈｉＹＦＰおよびＧＵＳ発現は、形質転換された胚において、アグロバクテリウム（Agrobacterium）との３日間の共培養後に観察することができる。胚はＹＦＰフィルターおよび５００ｎｍ光源を使用して分光光度計（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）下で観察される。ＹＦＰ／ＰｈｉＹＦＰ発現を示す胚はＧＵＳ組織化学アッセイのために選択される。ＧＵＳ染色溶液はManiatisら、(1989)に記載される通りに調製され、胚は３７℃で２４時間、１ｍＬ溶液中でインキュベートされる。胚は顕微鏡下でＧＵＳ一過性発現について観察される。
カルス選択および推定事象の再生：共培養期間に続いて、胚は選択剤なしの静止培地（ＭＳ塩、４．３３ｇｍ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］５００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物１００．０ｍｇ／Ｌ；Ｄｉｃａｍｂａ、３．３０ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇｍ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ ２．３０ｇｍ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ＡｇＮＯ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移され、２８℃で７日間、明所でインキュベートされる。胚は、１００ｎＭハロキシホップを含有する、選択１培地（ＭＳ塩、４．３３ｇｍ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］５００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物 １００．０ｍｇ／Ｌ；Ｄｉｃａｍｂａ、３．３０ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇｍ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．３０ｇｍ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ＡｇＮＯ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）上に移され、２８℃で７日間、光強度５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で２４時間、明所でインキュベートされる。
増殖している胚形成カルスのある胚は、５００ｎＭハロキシホップを含有する、選択２培地（ＭＳ塩、４．３３ｇｍ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］５００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物 １００．０ｍｇ／Ｌ；Ｄｉｃａｍｂａ、３．３０ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇｍ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．３０ｇｍ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ＡｇＮＯ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）上に移され、２８℃でさらに１４日間、光強度５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で２４時間、明所でインキュベートされる。この選択ステップにより、トランスジェニックカルスはさらに増殖し分化する。カルス選択期間は３週間続く。増殖している胚形成カルスは、５００ｎＭハロキシホップを含有する、再生１培地（ＭＳ塩、４．３３ｇｍ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、３５０．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］２５０．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物 ５０．０ｍｇ／Ｌ；ＮＡＡ０．５００ｍｇ／Ｌ；ＡＢＡ２．５０ｍｇ／Ｌ；ＢＡ１．００ｍｇ／Ｌ；スクロース、４５．０ｇｍ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．５０ｇｍ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ＡｇＮＯ３、１．００ｍｇ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）上に移され、２８℃で７日間、光強度５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で２４時間、明所で培養される。苗条様の芽のある胚形成カルスは、５００ｎＭハロキシホップを含有する、再生２培地（ＭＳ塩、４．３３ｇｍ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０ｇｍ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍ Ｇ４３４（商標）３．００ｇｍ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）上に移される。培養物は、２８℃で７〜１０日間、光強度５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で２４時間光の下でインキュベートされる。一次根のある小苗条は、ＭＡＧＥＮＴＡ（商標）ボックス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中の苗条伸長および発根培地（ＭＳ塩、４．３３ｇｍ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０ｇｍ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍ Ｇ４３４（商標）３．００ｇｍ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移され、２８℃で７日間、１６／８時間明／暗下でインキュベートされる。推定トランスジェニック小植物はトランス遺伝子コピー数について分析され、温室に移される。
合成二方向ＳＣＢＶプロモーターおよびｐＤＡＢ１０８７０８ベクターの構築
トウモロコシユビキチン−１プロモーター（Ｕｂｉ１）の例となる概略図は図１に示されている。Ｕｂｉ１プロモーターはトウモロコシからクローニングされる。プロモーターを含有していたプラスミドは、高忠実度ＰＣＲ増幅システムを使用してＰＣＲ増幅される。トウモロコシＵｂｉ１プロモーターのおよそ２００ｎｔ領域がトウモロコシ（Zea mays）Ｕｂｉ１最小コアプロモーター（ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ）（配列番号１）として同定される。次に、配列番号１のｍｉｎＵｂｉ１Ｐは、当技術分野で一般的に知られているクローニング法を使用して、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１エクソン（ＺｍＵｂｉ１エクソン）およびトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１イントロン（ＺｍＵｂｉ１イントロン）を含むポリヌクレオチドに付加され、配列番号２のポリヌクレオチドを作製する。次に、得られたポリヌクレオチドは、トウモロコシＵｂｉ１プロモーター（Ｕｂｉ１ ＵＲＳを含む）を含む核酸の上流に逆配向でクローニングされて、配列番号３の合成二方向Ｕｂｉ１プロモーターを作製した。
レポーター遺伝子コード配列は、合成二方向Ｕｂｉ１プロモーターのそれぞれの末端の下流にクローニングされる。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）コード配列は、ｍｉｎＵｂｉ１Ｐ、ＺｍＵｂｉ１エクソン、およびＺｍＵｂｉ１イントロンプロモーターエレメントを含有するポリヌクレオチド断片の下流に挿入される。さらに、３−フレーム停止ポリヌクレオチド配列およびトウモロコシコンセンサスポリヌクレオチド配列を含有する下流リーダー配列がｍｉｎＵｂｉ１Ｐ、ＺｍＵｂｉ１、エクソン、およびＺｍＵｂｉ１イントロンプロモーターエレメント断片に付加される。ｕｉｄＡ（ＧＵＳ）コード配列も、ＹＦＰ配列に関して逆配向で合成二方向Ｕｂｉ１プロモーターの下流に挿入され、配列番号４の核酸を調製した。ＹＦＰおよびＧＵＳ遺伝子に作動可能に連結された合成二方向Ｕｂｉ１プロモーターを含む得られたポリヌクレオチドは、プラスミドｐＤＡＢ１０５８０１にクローニングされた。図４は、プラスミドｐＤＡＢ１０５８０１中の合成二方向Ｕｂｉ１プロモーターに関してＹＦＰおよびＧＵＳ発現カセットの配向を示している。
天然のＵｂｉ１プロモーター配列はプラスミドｐＤＡＢ１０５８０１の二方向Ｕｂｉ１プロモーターから取り外され、ＳＣＢＶプロモーターおよびＡＤＨイントロンを含有するＰＣＲ増幅された断片（配列番号６）で置き換えられる。こうして得られた例となる合成二方向ＳＣＢＶプロモーターは配列番号５として記載されている（図５も参照）。このＳＣＢＶプロモーターの付加によりベクターｐＤＡＢ１０５８０６は完成した（図６）。このベクターはＳＣＢＶ二方向プロモーターにより駆動されるＹＦＰおよびＧＵＳ遺伝子発現カセットを含有していた（配列番号７；図７も参照）。
プラスミドｐＤＡＢ１０５８０６由来のＧＵＳおよびＹＦＰ遺伝子発現カセットを含有したバイナリーベクターは、ＧＡＴＥＷＡＹ Ｌ−Ｒ ＣＬＯＮＡＳＥ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を介して完成する。得られたベクターｐＤＡＢ１０８７０８は、Ｔ鎖領域内にＧＵＳ、ＹＦＰ、およびＡＡＤ−１遺伝子発現カセットを含有していた（例えば、図９参照）。
合成二方向ＳＣＢＶプロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現
ｐＤＡＢ１０８７０８で形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）胚におけるＹＦＰおよびＧＵＳ一過性発現の代表的例が描かれうる。二方向ＳＣＢＶプロモーターの両側は作動可能に連結されたＹＦＰおよびＧＵＳコード配列の強力な発現を駆動することができる。ＹＦＰ発現レベルはＧＵＳ発現レベルに匹敵する。これらの所見により、二方向ＳＣＢＶプロモーターの両側が生物学的に機能的であることが確かめられる。さらに、合成二方向ＳＣＢＶプロモーターのｍｉｎＵｂｉ１Ｐエレメントは、ＹＦＰコード配列を駆動する一方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターのみを含有したバイナリープラスミド（ｐＤＡＢ１０１５５６）で形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）カルスと比べた場合、類似する発現レベルでＹＦＰを発現することができる。ＹＦＰまたはＧＵＳの発現は、バイナリー構築物で形質転換されておらず、ＹＦＰまたはＧＵＳコード配列を含有していなかった負の対照未熟胚では検出されない。
合成二方向ＳＣＢＶプロモーターに作動可能に連結された遺伝子の安定な発現
ＹＦＰコード配列を含有するｐＤＡＢ１０８７０８バイナリーベクターで安定的に形質転換されているトウモロコシ（Zea mays）カルス細胞の画像を観察することができる。これらの細胞は、選択２培地上でずっと増殖しているトウモロコシ（Z.mays）胚から得られる。胚の画像を作成するために使用される顕微鏡条件およびプロトコール。二方向ＳＣＢＶプロモーターはＹＦＰコード配列の強力な発現を駆動することができる。これらの結果により、二方向ＳＣＢＶプロモーターのＭｉｎ−Ｕｂｉ１Ｐ最小プロモーターエレメントは、安定的に形質転換されたトウモロコシ（Z.mays）カルス細胞においてレポーター遺伝子を発現することができることが確かめられる。ＹＦＰタンパク質の発現レベルは、ｙｆｐコード配列を駆動する一方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターを含有した対照バイナリーベクター（ｐＤＡＢ１０１５５６）で形質転換されたトウモロコシ（Z.mays）カルスにおけるＹＦＰ発現と比べると、類似している。ＹＦＰの発現は、バイナリー構築物で形質転換されておらず、ＹＦＰまたはＧＵＳコード配列を含有していなかった負の対照カルスでは検出されない。
リアルタイムＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲを使用するトランス遺伝子コピー数推定
トウモロコシ（Zea mays）胚は二方向ＳＣＢＶプロモーター、ｐＤＡＢ１０８７０８を含有するバイナリーベクターで形質転換されており、他の植物は対照バイナリーベクター、ｐＤＡＢ１０１５５６で形質転換されている。両セットのトウモロコシ（Z.mays）植物のゲノム内のＹＦＰトランス遺伝子の存在は、加水分解プローブアッセイを介して確認される。カルスから成長した安定的に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ（Z.mays）小植物が得られ、分析されて、ｐＤＡＢ１０８７０８バイナリーベクターおよびｐＤＡＢ１０１５５６対照バイナリーベクター由来の低コピー数（１〜２コピー）の完全長Ｔ鎖インサートを含有する事象を同定する。同定された小植物は温室に進めて栽培される。
Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０（商標）システムを使用して、ｐＤＡＢ１０８７０８バイナリーベクターで形質転換されている事象についてトランス遺伝子コピー数を決定する。この方法は、ＹＦＰ遺伝子におよび内在性トウモロコシ（Z.mays）基準遺伝子、インベルターゼ（ジェンバンク受託番号Ｕ１６１２３．１）に特異的なオリゴヌクレオチドを単回アッセイにおいて用いるバイプレックスＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応を利用する。コピー数および接合状態は、既知のコピー数標準と比べた場合、インベルターゼ特異的蛍光に対するＹＦＰ特異的蛍光の強度を測定することにより決定される。
ｐＤＡＢ１０８７０８バイナリーベクターで形質転換されているトウモロコシ（Z.mays）では、ＹＦＰ遺伝子特異的ＤＮＡ断片は、ＦＡＭ蛍光色素で標識されたプローブを含有するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて増幅され、インベルターゼはＨＥＸ蛍光で標識されたプローブを含有する第二のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて増幅される（表２）。ＰＣＲ反応混合物は表３に記載されている通りに調製され、遺伝子特異的ＤＮＡ断片は表４に記載されている条件に従って増幅される。試料のコピー数および接合状態は、既知のコピー数標準と比べた場合、基準遺伝子、インベルターゼに特異的な蛍光に対するレポーター遺伝子、ＹＦＰに特異的な蛍光の相対強度を測定することにより決定される。
ｐＤＡＢ１０８７０６：ｇＤＮＡの既知の関係を有する標準を得るために、ベクター、ｐＤＡＢ１０８７０８をトウモロコシ（Z.mays）Ｂ１０４ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）中に希釈することにより標準は作製される。例えば、トウモロコシ（Z.mays）Ｂ１０４ ｇＤＮＡの１コピーあたり１、２、および４コピーのベクターＤＮＡを有する試料が調製される。トウモロコシ（Z.mays）Ｂ１０４ｇＤＮＡ標準と混合されたｐＤＡＢ１０８７０６の１および２コピー希釈は、ヘミ接合性であることが分かっている対照トウモロコシ（Z.mays）事象およびホモ接合性であることが分かっている対照トウモロコシ（Z.mays）事象に対して検証される（トウモロコシ（Z.mays）事象２７８；ＰＣＴ国際特許出願第２０１１／０２２４６９ Ａ２参照）。ＡＡＤ１遺伝子に特異的であるオリゴヌクレオチドおよび内在性トウモロコシ（Z.mays）基準遺伝子、インベルターゼに特異的であるオリゴヌクレオチドを利用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）バイプレックスアッセイは、ＦＡＭ蛍光色素で標識されたプローブを含有する１つのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いてＡＡＤ１に遺伝子特異的ＤＮＡ断片を増幅し検出することにより、およびＨＥＸ蛍光で標識されたプローブを含有する第二のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いてインベルターゼに遺伝子特異的ＤＮＡ断片を増幅し検出することにより実施される（表２）。ＡＡＤ１ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応混合物は、表３に記載される通りに調製され、特異的断片は表４に記載される条件に従って増幅される。
反応ごとに発生する蛍光のレベルは、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（商標）熱サイクラーを製造業者の指示書に従って使用して解析された。ＦＡＭ蛍光部分は光学密度４６５／５１０ｎｍで励起され、ＨＥＸ蛍光部分は光学密度５３３／５８０ｎｍで励起された。コピー数は、４つの既知のコピー数標準の標的／基準値（ヌル、１コピー（ヘミ）、２コピー（ホモ）および４コピー）に対する未知の試料の標的／基準値（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（商標）により出力される）を比較することにより決定された。
二方向ＺｍＵｂｉ１プロモーター構築物（ｐＤＡＢ１０８７０６）を用いた形質転換を介して得られるトランスジェニック植物の、および対照一方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターＹＦＰ構築物（ｐＤＡＢ１０１５５６）を用いた形質転換を介して得られるトランスジェニック植物のトランス遺伝子コピー数解析からの結果は表５に示されている。ｙｆｐトランス遺伝子の１〜２コピーを有する植物だけが、さらなる発現解析のために温室に移された。
合成ＳＣＢＶプロモーターに作動可能に連結された遺伝子の全植物安定発現
低コピー数のバイナリープラスミドｐＤＡＢ１０８７０８を含有する全植物および低コピー数の対照バイナリープラスミドｐＤＡＢ１０１５５６を含有する植物は温室で栽培される。これらの植物は顕微鏡を使用して解析され、合成ＳＣＢＶ二方向プロモーターに作動可能に連結されたＹＦＰ発現カセットを含む例となる核酸構築物（ｐＤＡＢ１０８７０８）で安定的に形質転換されているＴ０トウモロコシ（Z. mays）植物においてＹＦＰ発現を示している画像を観察することができる。ｐＤＡＢ１０８７０８で形質転換されたトウモロコシ（Z. mays）胚から得られるトランスジェニックＴ０トウモロコシ植物の葉および根組織におけるＹＦＰの安定な発現の代表的例は良好なＹＦＰ発現を示している。二方向ＳＣＢＶプロモーターは葉組織でも根組織でもＹＦＰコード配列の強力な発現を駆動することができる。顕微鏡解析によれば、二方向ＳＣＢＶプロモーター中のＭｉｎ−ＵｂｉＰ１最小プロモーターエレメントが、ＹＦＰコード配列の発現を駆動する一方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターを含有する対照バイナリープラスミド（ｐＤＡＢ１０１５５６）で形質転換されたトウモロコシ（Z. mays）植物と比べて類似する発現レベルでＹＦＰ発現を駆動できることも確認される。これらの対照植物は、葉組織および根組織における安定なＹＦＰ発現を示している。
合成二方向ＳＣＢＶプロモーターに作動可能に連結された遺伝子のウェスタンブロット解析
全可溶性タンパク質：形質転換されたＴ０トウモロコシ植物は、Ｖ６発生段階で試料採取される。最も若い折り畳まれていない葉由来の４つの葉パンチの全てがマトリックスチューブに試料採取され、マトリックスボックスに置かれる。負の対照として、Ｖ６発生段階の２つの非形質転換Ｂ１０４トウモロコシ植物の４つの葉パンチはマトリックスチューブに試料採取される。鋼製ビーズが試料と一緒にマトリックスチューブに入れられ、次に４００μＬのＰＢＳＴがそれぞれのチューブに添加される。チューブは蓋をされ、タンパク質はＫｌｅｃｏ（商標）組織粉砕機内、５分間１５００ｒｐｍでビーズ叩打により抽出される。デブリは遠心分離によりペレット化される。
それぞれのチューブからの５μＬの試料は、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてＰＢＳＴを用いて２５μＬまで希釈された。これらの試料は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を製造業者の指示書に従って使用して全可溶性タンパク質について分析された。キット中に与えられたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準は２通りに分析され、その値の平均を使用して標準曲線を作成し、続いてこれを使用して試料ごとの全可溶性タンパク質を計算した。次に、試料ごとの全可溶性タンパク質はｍｇ／μＬに正規化された。
ＹＦＰ／ＰｈｉＹＦＰウェスタンブロット解析：９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、抽出されたタンパク質のそれぞれの５μＬ試料は、５μＬの２×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｂｕｆｆｅｒ＋２−β−メルカプトエタノールで希釈される。ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール）中の精製されたＹＦＰ／ＰｈｉＹＦＰの対照試料はＡｘｘｏｒａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入する。試料はＬａｅｍｍｌｉバッファーで１対１に希釈することにより同じプレートにおいて調製され、以下の濃度：０．５ｎｇ／μＬ、０．２５ｎｇ／μＬ、および０．１２５ｎｇ／μＬの標準曲線を作成する。試料は熱サイクラーにおいて９５℃で３０分間加熱され、次に４℃まで冷却される。次に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（商標）はＭＥＳ／ＳＤＳバッファーを使用して集められる。試料は室温まで温めさせておき、１０μＬの試料は２つのゲルのそれぞれのウェルに負荷される。さらに、標準曲線のために使用された精製ＹＦＰ／ＰｈｉＹＦＰの試料、およびタンパク質ラダーマーカーはゲルのウェルに負荷される。このゲルは、１５０Ｖおよび１５０ｍＡで９０分間電気泳動的にランされる。ラン後、ゲルケーシングは開かれ、タンパク質は、ｉＢｌｏｔ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してニトロセルロース膜に移される。タンパク質は、２０Ｖの電流を１０分間流すことによりゲルから膜に移される。ニトロセルロース膜ははずされ、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（商標）ブロッキングバッファー中に４℃で一晩置かれる。次に、ブロッキングバッファーは捨てられ、膜は表６に記載されるプロトコールを使用して処理される。
抗体結合は、製造業者の指示書に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ（商標）プラス化学発光検出システムを使用して検出された。フィルムは１０分および３０分曝露された。１０分曝露フィルムを使用してタンパク質を定量し、３０分過剰曝露フィルムを使用してＢ１０４および他の対照試料におけるタンパク質の非存在を確認した。膜は曝露フィルムの裏に貼られ、タンパク質はピクセル密度解析により定量された。精製されたタンパク質標準のピクセル密度を先ず使用して、試料中のタンパク質を定量するのに使用される標準曲線を作成した。膜は精製された標準においてもＰｈｉＹＦＰモノマーおよびダイマーのバンドを示したが、ＰｈｉＹＦＰモノマーのみを使用してタンパク質発現を定量した。次に、タンパク質の値をｎｇ／μＬに正規化した。ＰｈｉＹＦＰに対する正規化された全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）の比を、ｎｇ ＹＦＰ／ｍｇ ＴＳＰ、または代わりに百万分率（ｐｐｍ）の単位に計算した。
ＧＵＳウェスタンブロット解析：ＧＵＳタンパク質の発現は、以下の：１０μＬの抽出試料は２×Ｌａｅｍｍｌｉ＋２−β−メルカプトエタノールで１対１に希釈され、９５℃で３０分間変性され、次に１５μＬがゲル内に負荷される点を例外に、ＰｈｉＹＦＰに類似する方法で定量される。フィルム付の処理された膜（１分曝露）は、ピクセル密度解析のために膜で覆われる。
バイナリーベクター、ｐＤＡＢ１０８７０８で形質転換されたトウモロコシ（Z.mays）胚から得られる１２のトランスジェニックＴ０トウモロコシ植物のウェスタンブロット解析の結果は、図１６に示されている。二方向ＳＣＢＶプロモーターは、葉組織からＹＦＰおよびＧＵＳコード配列の強力な発現を示す。これらの所見により、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターから単離されＳＣＢＶプロモーターに融合されたＭｉｎ−ＵｂｉＰ１最小プロモーターエレメントが、ＹＦＰコード配列を駆動する一方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターを含有するバイナリープラスミド（ｐＤＡＢ１０１５５６、図１７参照）で形質転換されたトウモロコシ（Z. mays）カルスと比べて類似する発現レベルでＹＦＰを発現できることが確認される。
４遺伝子カセットスタックの構築
プラスミドｐＤＡＢ１０５８０６構築物は、単一ＳＣＢＶ二方向プロモーターにより駆動される４遺伝子カセットスタック（ＡＡＤ１−２Ａ−ＰｈｉＹＦＰおよびＣｒｙ３４（８Ｖ６）−２Ａ−Ｃｒｙ３５）を作製するための開始プラスミドとして使用される。プラスミドｐＤＡＢ１０５８０６の代表的マップは図６に示されており、これにはＳＣＢＶ二方向プロモーターが含有される。
プラスミドｐＤＡＢ１０５８４１由来のＡＡＤ１−２Ａ−ＰｈｉＹＦＰ断片（図２２）は、当技術分野で一般に知られているクローニング法を使用して、プラスミドｐＤＡＢ１０５８０６のＰｓｔＩおよびＳａｃＩ切断ベクター骨格にクローニングされる。これにより、中間プラスミドｐＤＡＢ１０５８４７が生じた（図２２）。プラスミドｐＤＡＢ１０５８４０から得られるＮｏｔＩ／ＸｂａＩ消化Ｃｒｙ３４（８Ｖ６）−２Ａ−Ｃｒｙ３５断片は、プラスミドｐＤＡＢ１０５８４７のＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ部位の間にクローニングされて、プラスミドｐＤＡＢ１０５８４９を構築する（図２３）。プラスミドｐＤＡＢ１０５８４９は、ＳＣＢＶ二方向プロモーターのそれぞれの側にＣｒｙ３４（８Ｖ６）−２Ａ−Ｃｒｙ３５およびＡＡＤ１−２Ａ−ＰｈｉＹＦＰ遺伝子カセットを含有する。
ＳＣＢＶ二方向プロモーターならびにプラスミドｐＤＡＢ１０５８４９由来の遺伝子発現カセットＣｒｙ３４（８Ｖ６）−２Ａ−Ｃｒｙ３５およびＡＡＤ１−２Ａ−ＰｈｉＹＦＰを含有するバイナリーベクターは、目的プラスミドｐＤＡＢ１０１９１７へのＧＡＴＥＷＡＹ Ｌ−Ｒ ＣＬＯＮＡＳＥ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により作製される（図２４）。得られたベクターｐＤＡＢ１０８７１９は、Ｔ−ＤＮＡ境界内にＣｒｙ３４（８Ｖ６）−２Ａ−Ｃｒｙ３５、ＡＡＤ１−２Ａ−ＰｈｉＹＦＰ、およびＰＡＴ遺伝子発現カセットを含有している（図２４）。
第二の４遺伝子カセットスタックの構築
プラスミドｐＤＡＢ１０５８４４由来のＰｈｉＹＦＰ−２Ａ−ＡＡＤ１断片（図２５）は、当技術分野で一般に知られているクローニング方法を使用して、プラスミドｐＤＡＢ１０５８０６のＰｓｔＩおよびＳａｃＩ切断ベクター骨格にクローニングされる。これにより、中間プラスミドｐＤＡＢ１０５８４８が生じた（図２５）。プラスミドｐＤＡＢ１０５８４０から得られるＮｏｔＩ／ＸｂａＩ消化Ｃｒｙ３４（８Ｖ６）−２Ａ−Ｃｒｙ３５断片は、プラスミドｐＤＡＢ１０５８４８のＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ部位の間にクローニングされて、プラスミドｐＤＡＢ１０５８４５を構築する（図２６）。プラスミドｐＤＡＢ１０５８６５は、ＳＣＢＶ二方向プロモーターのそれぞれの側にＣｒｙ３４（８Ｖ６）−２Ａ−Ｃｒｙ３５およびＰｈｉＹＦＰ−２Ａ−ＡＡＤ１遺伝子カセットを含有する。
ＳＣＢＶ二方向プロモーターならびにプラスミドｐＤＡＢ１０５８６５由来の遺伝子カセットＣｒｙ３４（８Ｖ６）−２Ａ−Ｃｒｙ３５およびＰｈｉＹＦＰ−２Ａ−ＡＡＤ１を含有するバイナリーベクターは、目的プラスミドｐＤＡＢ１０１９１７へのＧＡＴＥＷＡＹ Ｌ−Ｒ ＣＬＯＮＡＳＥ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により作製される（図２４）。得られたベクター、ｐＤＡＢ１０８７２０は、Ｔ−ＤＮＡ境界内にＣｒｙ３４（８Ｖ６）−２Ａ−Ｃｒｙ３５、ＰｈｉＹＦＰ−２Ａ−ＡＡＤ１、およびＰＡＴ遺伝子発現カセットを含有している（図２６）。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＤＡｔ１３１９２の形質転換
ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０バイナリーベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ターナリー株ＤＡｔ１３１９２内に形質転換される（米国特許仮出願第６１／３６８９６５号参照）。細菌コロニーは単離され、バイナリープラスミドＤＮＡは抽出され、制限酵素消化により検証される。
トウモロコシへの形質転換
穂減菌および胚単離：トウモロコシ未熟胚を入手するため、トウモロコシ（Zea mays）（ｃ．ｖ．Ｂ１０４）の植物が温室で栽培され、自家または兄弟姉妹受粉されて穂を産生する。穂は受粉のおよそ９〜１２日後に収穫される。実験当日、穂は、５％次亜塩素酸ナトリウムを含有する家庭用漂白剤の２０％溶液中に浸漬され、２０〜３０分振盪され、続いて減菌水で３回すすがれることにより表面減菌される。減菌後、未熟接合体胚（１．５〜２．２ｍｍ）はそれぞれの穂から無菌で解体され、液体感染培養液（ＬＳ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、４．４３ｇ／Ｌ；Ｎ６ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍＬ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６８．５ｇ／Ｌ；グルコース、３６．０ｇ／Ｌ；２，４−Ｄ、１．５０ｍｇ／Ｌ）を含有するマイクロ遠心チューブに無作為に分配される。所与のセットの実験では、２〜３穂からのプールされた胚は処置ごとに使用される。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養開始：上記のバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）株のグリセロールストックは、適切な抗生物質を含有するＡＢ最小培地プレート上に画線され、２０℃で３〜４日間増殖される。単一コロニーが摘み取られ、同じ抗生物質を含有するＹＥＰプレート上に画線され、２８℃で１〜２日間インキュベートされる。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養および共培養：実験当日、アグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーはＹＥＰプレートから摘み取られ、５０ｍＬ使い捨てチューブ中１０ｍＬの感染培養液に懸濁され、細胞密度は分光光度計を使用してＯＤ６００＝０．２〜０．４ｎｍに調整される。アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養物は、胚解体が実施される間、室温で１１５ｒｐｍの回転式振盪器の上に置かれる。サイズが１．５〜２．２ｍｍの未熟接合体胚は減菌されたトウモロコシ仁から単離され、１ｍＬの感染培養液に入れられ、同じ培養液で１度洗浄される。アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液（２ｍＬ）がそれぞれのチューブに添加され、チューブは約２０回反転され、次に１０〜１５分間振盪される。胚は共培養培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物１００．０ｍｇ／Ｌ；Ｄｉｃａｍｂａ ３．３０ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）、３．００ｇ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ＡｇＮＯ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ、１００μＭ）上に移され、盤状体を上にして配向され、２５℃、明所で３〜４日間インキュベートされる。
ＹＦＰ／ＰｈｉＹＦＰ一過性発現：一過性ＹＦＰ／ＰｈｉＹＦＰ発現は、形質転換された胚において、アグロバクテリウム（Agrobacterium）との３日間の共培養後に形質転換された胚において観察することができる。胚はＹＦＰフィルターおよび５００ｎｍ光源を使用して立体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）下で観察される。
カルス選択および推定事象の再生：共培養期間に続いて、胚は選択剤なしの静止培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］、５００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物、１００．０ｍｇ／Ｌ；Ｄｉｃａｍｂａ、３．３０ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）、２．３０ｇ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ＡｇＮＯ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移され、２８℃で７日間、光強度５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で２４時間、明所でインキュベートされる。胚は、３ｍｇ／Ｌ Ｂｉａｌａｐｈｏｓを含有する、選択１培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］、５００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物、１００．０ｍｇ／Ｌ；Ｄｉｃａｍｂａ、３．３０ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）、２．３０ｇ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ＡｇＮＯ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）上に移され、２８℃で７日間、光強度５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で２４時間、明所でインキュベートされる。
増殖している胚形成カルスのある胚は、５ｍｇ／Ｌ Ｂｉａｌａｐｈｏｓを含有する、選択２培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］、５００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物、１００．０ｍｇ／Ｌ；Ｄｉｃａｍｂａ、３．３０ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．３０ｇ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ＡｇＮＯ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）上に移され、２８℃でさらに１４日間、光強度５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で２４時間、明所でインキュベートされる。この選択ステップにより、トランスジェニックカルスはさらに増殖し分化する。カルス選択期間は３週間続きうる。増殖している胚形成カルスは、３ｍｇ／Ｌ Ｂｉａｌａｐｈｏｓを含有する、再生１培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、３５０．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］、２５０．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物、５０．０ｍｇ／Ｌ；ＮＡＡ、０．５００ｍｇ／Ｌ；ＡＢＡ、２．５０ｍｇ／Ｌ；ＢＡ、１．００ｍｇ／Ｌ；スクロース、４５．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．５０ｇ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ＡｇＮＯ３、１．００ｍｇ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）上に移され、２８℃で７日間、光強度５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で２４時間、明所で培養される。
苗条／芽のある胚形成カルスは、３ｍｇ／Ｌ Ｂｉａｌａｐｈｏｓを含有する、再生２培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；改変ＭＳ−Ｖｉｔａｍｉｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍｌ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍ Ｇ４３４（商標）、３．００ｇ／Ｌ；Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、２５０．０ｍｇ／Ｌ）上に移される。培養物は、２８℃で７〜１０日間、光強度５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で２４時間光の下でインキュベートされる。一次根のある小苗条は、苗条伸長および発根培地（phytatrayにおいて、ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｎ６ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ［１０００Ｘ］、１．００ｍＬ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；寒天５．５０ｇ／Ｌ）に移され、２８℃で７日間、９０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で１６／８時間明／暗下でインキュベートされる。健康な推定トランスジェニック小植物が選択され、次に２５℃でさらに２〜５日間、２００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１で１６／８時間明／暗においてインキュベートされ、トランス遺伝子コピー数について分析され、温室に移される。
一過性ＰｈｉＹＦＰ発現
ｐＤＡＢ１０８７１９で形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）胚由来のＰｈｉＹＦＰの一過性発現が実施される。二方向ＳＣＢＶプロモーターは、非形質転換胚がいかなるＰｈｉＹＦＰ蛍光も示さない、ＡＡＤ１−２Ａ−ＰｈｉＹＦＰ遺伝子発現カセットからＰｈｉＹＦＰを発現することができる。予想されるレベルのＹＦＰ／ＰｈｉＹＦＰ発現を示された、単一ＰｈｉＹＦＰコード配列を駆動する一方向トウモロコシ（Zea mays）（Ｚｍ）Ｕｂｉ１プロモーターを含有するバイナリープラスミドｐＤＡＢ１０５７４８（図２０）で形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）胚から、類似するレベルのＰｈｉＹＦＰ発現を観察することができる。ＰｈｉＹＦＰの一過性発現は、二方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターがＰｈｉＹＦＰ−２Ａ−ＡＡＤ１遺伝子発現カセットからＰｈｉＹＦＰを発現することができる、ｐＤＡＢ１０８７２０で形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）胚から観察することができる。
安定的に形質転換されたトウモロコシにおけるＰｈｉＹＦＰ発現
二方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターにより駆動される安定的に形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）カルスにおけるＰｈｉＹＦＰ発現：ＡＡＤ１−２Ａ−ＰｈｉＹＦＰ遺伝子発現カセットを含有するｐＤＡＢ１０８７１９バイナリーベクターで形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）胚は、良好なＰｈｉＹＦＰ発現を示す。二方向ＳＣＢＶプロモーターはＰｈｉｙｆｐの強力な発現を駆動することができる。これらの結果から、二方向ＳＣＢＶプロモーターのＭｉｎ−ＵｂｉＰ１最小プロモーターエレメントがレポーター遺伝子、例えば、ＰｈｉＹＦＰまたはＹＦＰを発現することができることが確認される。ＰｈｉＹＦＰタンパク質の発現レベルは、ＰｈｉＹＦＰコード配列を駆動する一方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターを含有した対照バイナリーベクター（ｐＤＡＢ１０５７４８）で形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）カルスと比べると、類似している。ＰｈｉＹＦＰの発現は、バイナリー構築物で形質転換されておらずＰｈｉＹＦＰコード配列を含有していなかった負の対照カルスでは検出されない。
ＰｈｉＹＦＰ−２Ａ−ＡＡＤ１遺伝子発現カセットを含有するｐＤＡＢ１０８７２０バイナリーベクターで形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）胚は、良好なＰｈｉＹＦＰ発現を示す。二方向ＳＣＢＶプロモーターはＰｈｉＹＦＰの強力な発現を駆動することができる。これらの結果から、二方向ＳＣＢＶプロモーターのＭｉｎ−ＵｂｉＰ１最小プロモーターエレメントがレポーター遺伝子、例えば、ＰｈｉＹＦＰまたはＹＦＰを発現することができることが確認される。
トランス遺伝子コピー数の推定
リアルタイムＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲを使用するトランス遺伝子コピー数推定：トウモロコシ（Zea mays）植物は二方向ＳＣＢＶプロモーターを含有するバイナリーベクター、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０で形質転換され、他の植物は対照バイナリーベクター、ｐＤＡＢ１０５７４８で形質転換される。ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０へのトランスジェニックなトウモロコシ（Z.mays）植物のゲノム内のコード配列（ＰｈｉＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｐａｔ）の存在は、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブアッセイにより確かめられる。対照ベクター、ｐＤＡＢ１０５７４８へのトランスジェニックな植物は、ＰｈｉＹＦＰ配列の存在について分析された。カルスから成長した安定的に形質転換されたトランスジェニックトウモロコシ（Z.mays）小植物が得られ、分析されて、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０バイナリーベクター、ならびにｐＤＡＢ１０５７４８対照バイナリーベクター由来の低コピー数（１〜２コピー）の完全長Ｔ鎖インサートを含有する事象を同定する。確認された小植物は温室に進めて栽培される。
Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０（商標）システムを使用して、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０バイナリーベクターで形質転換された事象についてトランス遺伝子コピー数を決定する。この方法は、前記コード配列におよび内在性トウモロコシ（Z.mays）基準遺伝子、インベルターゼ（ジェンバンク受託番号Ｕ１６１２３．１）に特異的なオリゴヌクレオチドを単回アッセイにおいて用いるバイプレックスＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応を利用した。コピー数および接合状態は、既知のコピー数標準と比べた場合、インベルターゼ特異的蛍光に対するコード配列特異的蛍光の強度を測定することにより決定される。
ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０バイナリーベクターで形質転換されたトウモロコシ（Z.mays）試料では、コード配列特異的ＤＮＡ断片は、ＦＡＭ蛍光色素で標識されたプローブを含有する１つのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて増幅され、インベルターゼはＨＥＸ蛍光で標識されたプローブを含有する第二のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて増幅される。ＰＣＲ反応混合物は、表８に記載される通りに調製され、遺伝子特異的ＤＮＡ断片は表９に記載される条件に従って増幅される。試料のコピー数および接合状態は、既知のコピー数標準と比べた場合、基準遺伝子、インベルターゼに特異的な蛍光に対するコード配列に特異的な蛍光の相対強度を測定することにより決定される。
標準は、ベクター（ｐＤＡＢ１０８７１９またはｐＤＡＢ１０８７２０）をトウモロコシ（Z.mays）Ｂ１０４ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に希釈して、ベクター：ｇＤＮＡの既知の関係を用いて標準を得ることにより作製される。例えば、トウモロコシ（Z.mays）Ｂ１０４ ｇＤＮＡの１コピーあたり１、２、および４コピーのベクターＤＮＡを有する試料が調製される。トウモロコシ（Z.mays）Ｂ１０４ ｇＤＮＡ標準と混合されたベクターの１および２コピー希釈は、ヘミ接合性であることが分かっている対照トウモロコシ（Z.mays）事象およびホモ接合性であることが分かっている対照トウモロコシ（Z.mays）事象に対して検証される（トウモロコシ（Z.mays）事象２７８；ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ２０１１／０２２４６９ Ａ２参照）。コード配列遺伝子に特異的であるオリゴヌクレオチドおよび内在性トウモロコシ（Z.mays）基準遺伝子、インベルターゼに特異的であるオリゴヌクレオチドを利用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）バイプレックスアッセイは、ＦＡＭ蛍光色素で標識されたプローブを含有する１つのＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いてコード配列の遺伝子特異的ＤＮＡ断片を増幅し検出することにより、およびＨＥＸ蛍光で標識されたプローブを含有する第二のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いてインベルターゼの遺伝子特異的ＤＮＡ断片を増幅し検出することにより実施される。表７に従って、コード配列ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応混合物は、表８に記載される通りに調製され、特異的断片は表９に記載される条件に従って増幅される。
反応ごとに発生する蛍光のレベルは、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（商標）熱サイクラーを製造業者の指示書に従って使用して解析される。ＦＡＭ蛍光部分は光学密度４６５／５１０ｎｍで励起され、ＨＥＸ蛍光部分は光学密度５３３／５８０ｎｍで励起される。コピー数は、４つの既知のコピー数標準の標的／基準値（例えば、ヌル、１コピー（ヘミ）、２コピー（ホモ）および４コピー）に対する未知の試料の標的／基準値（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（商標）により出力される）を比較することにより決定することができる。
二方向ＺｍＵｂｉ１プロモーター構築物（ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０）を用いた形質転換を介して得られるトランスジェニック植物の、および対照一方向ＳＣＢＶプロモーターＰｈｉＹＦＰ構築物（ｐＤＡＢ１０５７４８）を用いた形質転換を介して得られるトランスジェニック植物のトランス遺伝子コピー数解析からの結果は表１０にまとめられている。全てのトランス遺伝子の１〜２コピーを有する植物だけが、さらなる発現解析のために温室に移される。
トウモロコシＴ０植物における安定なＰｈｉＹＦＰ発現
二方向ＳＣＢＶプロモーターにより駆動されるトウモロコシ（Zea mays）Ｔ０植物における安定なＰｈｉＹＦＰ発現：ＡＡＤ１−２Ａ−ＰｈｉＹＦＰ遺伝子発現カセットを含有するｐＤＡＢ１０８７１9バイナリーベクターで形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）胚を観察することができる。二方向ＳＣＢＶプロモーターは、苗条組織でも根組織でもＰｈｉＹＦＰの強力な発現を駆動させることができる。この結果から、二方向ＳＣＢＶプロモーターのＭｉｎ−ＵｂｉＰ１最小プロモーターエレメントは、レポーター遺伝子、例えば、ＰｈｉＹＦＰまたは２Ａ配列を使用してａａｄ１とバイシストロン性に融合されているＹＦＰを発現することができることが確認される。ＰｈｉＹＦＰタンパク質の発現レベルは、ＰｈｉＹＦＰコード配列を駆動する一方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターを含有する対照バイナリーベクター（ｐＤＡＢ１０５７４８）で形質転換されたトウモロコシ（Z.mays）胚に類似している。ＰｈｉＹＦＰの発現は、バイナリー構築物で形質転換されておらずＰｈｉＹＦＰコード配列を含有していない負の対照植物では検出されない。
ＰｈｉＹＦＰ−２Ａ−ＡＡＤ１遺伝子発現カセットを含有するｐＤＡＢ１０８７２０バイナリーベクターにトランスジェニックなトウモロコシ（Zea mays）Ｔ０植物の葉および根組織におけるＰｈｉｙｆｐ発現が観察できる。二方向ＳＣＢＶプロモーターはＰｈｉＹＦＰの強力な発現を駆動させることができる。この結果から、二方向ＳＣＢＶプロモーターのＭｉｎ−ＵｂｉＰ１最小プロモーターエレメントは、レポーター遺伝子、例えば、ＰｈｉＹＦＰまたは２Ａ配列もしくは２Ａ様配列を使用してａａｄ１に融合されているＹＦＰを発現することができることが確認される。
Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、およびＡＡＤ１タンパク質解析
植物は、１鋼製ビーズ、続いてＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ（０．６ｍＬ）が添加されている１．５ｍＬ円錐チューブ中のマトリックスボックスのカラム１〜１０に試料採取される。次に、このボックスは、Ｇｅｎｏ Ｇｒｉｎｄｅｒにおいて１５００ｒｐｍで５分間試料粉砕のためにビーズ叩打され、次に４℃で７分間、３７００ｒｐｍで遠心分離される。
Ｃｒｙ３４／３５ ＥＬＩＳＡアッセイ：別個の９６ディープウェルプレートにおいて、抽出物の試料はＰＢＳＴ＋１％ｂｌｏｔｔｏ中、１：２００で希釈される。次に、希釈された試料の２５μＬ容積２つは抗Ｃｒｙ３４および抗Ｃｒｙ３５（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）が整列されている別個の９６ウェルプレートに移される。それぞれのプレートの１１および１２カラムにおいて、ＰＢＳＴ＋１％ｂｌｏｔｔｏ中プレート標準濃度のＣｒｙ３４およびＣｒｙ３５が添加される（２５μＬ）。次に、プレートは室温で１時間振盪しながらインキュベートされる。次に、プレートはＰＢＳＴで洗浄される（３×３００μＬ）。その後、ＳｕｌｆｏＴＡＧコンジュゲート抗Ｃｒｙ３４および抗Ｃｒｙ３５の２５μＬ溶液がそれぞれのウェルに添加され、室温で１時間振盪しながらインキュベートされる。次に、プレートはＰＢＳＴで洗浄される（３×３００μＬ）。次に、１５０μＬ容積のＲｅａｄバッファーＴ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）が添加され、プレートはＳＥＣＴＯＲ（登録商標）６０００リーダー上で即時に読み取られる。試料中のタンパク質の濃度は、同じプレートから産生されるそれぞれのタンパク質について標準曲線を使用して計算することができる。
ＡＡＤ−１ ＥＬＩＳＡアッセイ：別個の９６ディープウェルプレートにおいて、抽出物の試料はＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ中、１：２０で希釈される。次に、希釈された試料の２００μＬ容積２つは抗ＡＡＤ１（Ａｃａｄｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣにより提供される）で被覆されている別個の９６ウェルプレートに移される。それぞれのプレートの１１および１２カラムにおいて、ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ中プレート標準濃度のＡＡＤ１が添加される（２００μＬ）。次に、ビオチン化された抗ＡＡＤ１の５０μＬ容積がそれぞれのウェルに添加され、プレートは室温で１時間振盪しながらインキュベートされる。次に、プレートはＰＢＳＴで洗浄される（５×３００μＬ）。その後、ステプタビジン（steptavidin）アルカリホスフェートコンジュゲート溶液の１００μＬ溶液がそれぞれのウェルに添加され、室温で３０分間振盪しながらインキュベートされる。次に、プレートはＰＢＳＴで洗浄される（５×３００μＬ）。次に、１００μＬ容積の基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ＰＮＰＰ）が添加され、室温で４５分間振盪しながらインキュベートされる。その後、プレートはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上、Ａ４０５で読み取られる。試料中のタンパク質の濃度は、同じプレートから作成される標準曲線を使用して計算することができる。
トウモロコシＴ０植物のタンパク質解析
二方向トウモロコシ（Zea mays）ＳＣＢＶプロモーター構築物（ｐＤＡＢ１０８７１９）により駆動されるトウモロコシＴ０植物のタンパク質解析がこの実施例で行われる。
Ｃｒｙ３４−２Ａ−Ｃｒｙ３５遺伝子発現カセットを含有するｐＤＡＢ１０８７１９で形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）胚から得られた１２のトランスジェニックＴ０トウモロコシ植物の代表的ＥＬＩＳＡ解析は表１１にまとめられている。二方向ＳＣＢＶプロモーターは、葉においてＣｒｙ３４とＣｒｙ３５コード配列の両方の強力な発現を駆動しうる。これらの所見により、構築物ｐＤＡＢ１０８７１９中の単一ＳＣＢＶ二方向プロモーターは、複数の遺伝子（例えば、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、およびＡＡＤ１）を発現できることが明らかにされている。
二方向トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター構築物（ｐＤＡＢ１０８７２０）により駆動されるトウモロコシＴ０植物のタンパク質解析：Ｃｒｙ３４−２Ａ−Ｃｒｙ３５遺伝子発現カセットを含有するｐＤＡＢ１０８７２０で形質転換されたトウモロコシ（Zea mays）胚から得られた９のトランスジェニックＴ０トウモロコシ植物の代表的ＥＬＩＳＡ解析は表１２にまとめられている。二方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターは、葉においてＣｒｙ３４とＣｒｙ３５コード配列の両方の強力な発現を駆動しうる。
二方向プロモーター構築物により駆動されるＴ１植物の遺伝子発現：構築物あたり１０から１２の単一コピー事象が、対照構築物ｐＤＡＢ１０８７１６は１つの事象のみを有することを除いて、解析のために選択される。Ｖ６段階について５つの植物／事象が試験され、Ｖ１０〜１２および／Ｒ３段階について３つの植物／事象が試験される。タンパク質アッセイは、ＬＣＭＳまたはＥＬＩＳＡを使用して実施される。
本実施例において使用される構築物は図３０に示されている。ｐＤＡＢ１０８７０８（ＳＣＢＶ二方向性（−２００））およびｐＤＡＢ１０８７０９（ＳＣＢＶ二方向性（−９０））は、トウモロコシＵｂｉ１二方向プロモーター（ｐＤＡＢ１０８７０６［ＺＭＵｂｉ二方向性（−２００））およびｐＤＡＢ１０８７０７（ＺＭＵｂｉ二方向性（−９０））］を有する構築物に加えて、本発明の代表的二方向プロモーターを有する構築物であり、ｐＤＡＢ１０１５５６（ＺｍＵｂｉ１−ＹＦＰ対照）、ｐＤＡＢ１０８７１５（最小プロモーターのないＳＣＢＶ）、およびｐＤＡＢ１０８７１６（最小プロモーターのないＺＭＵｂｉ１）は一方向プロモーターを有する対照構築物として働く。
ＹＦＰタンパク質（ＬＣＭＳ）についての７つの構築物からの例となる発現結果（Ｖ６）（ｎｇ／ｃｍ２）は図３１Ａに示されている。ＹＦＰ ＲＮＡについての７つの構築物からの例となる相対的発現結果（Ｖ６）は図３１Ｂに示されている。
ＧＵＳタンパク質（ＬＣＭＳ）についての７つの構築物からの例となる発現結果（Ｖ６）（ｎｇ／ｃｍ２）は図３２Ａに示されている。ＧＵＳ ＲＮＡについての７つの構築物からの例となる相対的発現結果（Ｖ６）は図３２Ｂに示されている。
ＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についての７つの構築物からの例となる発現結果（Ｖ６）（ｎｇ／ｃｍ２）は図３３Ａに示されている。ＡＡＤ１ ＲＮＡについての７つの構築物からの例となる相対的発現結果（Ｖ６）は図３３Ｂに示されている。
ＹＦＰタンパク質（ＬＣＭＳ）についての７つの構築物からの発現結果（Ｖ６）（ｎｇ／ｃｍ２）の統計解析は図３４Ａに示されている。ＹＦＰ ＲＮＡについての７つの構築物からの相対的発現結果（Ｖ６）の統計解析は図３４Ｂに示されている。平均値および統計結果は収載されている。
ＧＵＳタンパク質（ＬＣＭＳ）についての７つの構築物からの発現結果（Ｖ６）（ｎｇ／ｃｍ２）の統計解析は図３５Ａに示されている。ＧＵＳ ＲＮＡについての７つの構築物からの相対的発現結果（Ｖ６）の統計解析は図３５Ｂに示されている。平均値および統計結果は収載されている。
ＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についての７つの構築物からの発現結果（Ｖ６）（ｎｇ／ｃｍ２）の統計解析は図３６Ａに示されている。ＡＡＤ１ ＲＮＡについての７つの構築物からの相対的発現結果（Ｖ６）の統計解析は図３６Ｂに示されている。平均値および統計結果は収載されている。
図３７Ａ、３７Ｂ、および３７Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、およびＧＵＳタンパク質（ＬＣＭＳ）についての７つの構築物からの例となる発現結果（Ｖ１０）（ｎｇ／ｃｍ２）を示している。
図３８Ａ、３８Ｂ、および３８Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についての７つの構築物からの発現結果（Ｖ１０）（ｎｇ／ｃｍ２）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。
図３９Ａ、３９Ｂ、および３９Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についての７つの構築物からの例となる発現結果（Ｒ３）（ｎｇ／ｃｍ２）を示している。
図４０Ａ、４０Ｂ、および４０Ｃは、それぞれＹＦＰ、ＧＵＳ、およびＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）についての７つの構築物からの発現結果（Ｒ３）（ｎｇ／ｃｍ２）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。
この結果により、本発明のＳＣＢＶ二方向プロモーターとトウモロコシＵｂｉ１二方向プロモーターの両方がＧＵＳおよびＹＦＰの強力な発現を駆動することができることが示されている。トウモロコシＵｂｉ１二方向プロモーターからのＹＦＰ発現は、一方向トウモロコシＵｂｉ１駆動ＹＦＰに類似している。ＳＣＢＶ二方向プロモーターからのＹＦＰ発現は、一方向トウモロコシＵｂｉ１駆動ＹＦＰまたはトウモロコシＵｂｉ１二方向プロモーターよりも有意に高い。しかし、この違いはＶ１０段階では有意性は少なくなる。この結果により、二方向転写はＧＵＳ発現（ＹＦＰ発現のない、最小プロモーターを欠く構築物と比べたＧＵＳ発現）に有意な効果を及ぼさないことも示唆される。ＳＣＢＶ二方向プロモーターは、トウモロコシＵｂｉ１二方向プロモーターと比べて有意に高いＧＵＳ発現も提供する。
１つの単一プロモーターから４つのトランス遺伝子を駆動させるための二方向プロモーターと２Ａバイシストロン性配列の組合せ（Ｔ１データ）
二方向プロモーター構築物により駆動されるＴ１植物の遺伝子発現：構築物あたり１０から１２の単一コピー事象が、対照構築物が構築物あたり４または５事象を有することを除いて、解析のために選択される。Ｖ６段階について５つの植物／事象が試験され、Ｖ１０〜１２および／Ｒ３段階について３つの植物／事象が試験される。タンパク質アッセイは、ＬＣＭＳまたはＥＬＩＳＡを使用して実施される。
ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０は図１９に示されている。ｐＤＡＢ１０５７４８およびｐＤＡＢ１０５８１８は図２０に示されている。ｐＤＡＢ１０８７１７およびｐＤＡＢ１０８７１８を含む、Ｕｂｉ１プロモーターを使用する追加の多重トランス遺伝子構築物は図４１に示されている。
６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８（ＺＭＵｂｉ１−ＹＦＰ）、ｐＤＡＢ１０５８１８（ＺＭＵｂｉ１−Ｃｒｙ３４／ＺＭＵｂｉ１−Ｃｒｙ３５／ＺＭＵｂｉ１−ＡＡＤ１）、ｐＤＡＢ１０８７１７（ＹＦＰ／ＡＡＤ−１−ＺＭＵｂｉ１二方向性Ｃｒｙ３４−Ｃｒｙ３５）、ｐＤＡＢ１０８７１８（ＡＡＤ１／ＹＦＰ−ＺＭＵｂｉ１二方向性Ｃｒｙ３４−Ｃｒｙ３５）、ｐＤＡＢ１０８７１９（ＹＦＰ／ＡＡＤ１−ＳＣＢＶ二方向−Ｃｒｙ３４−Ｃｒｙ３５）およびｐＤＡＢ１０８７２０（ＡＡＤ１／ＹＦＰ−ＳＣＢＶ二方向−Ｃｒｙ３４−Ｃｒｙ３５）からのＣｒｙ３４ ＲＮＡの例となる相対的発現結果（Ｖ６）が図４２Ａに示される。同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３４タンパク質（ＬＣＭＳ）の例となる相対的発現結果（Ｖ６）が図４２Ｂに示される。
６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＡＡＤ１ ＲＮＡの例となる相対的発現結果（Ｖ６）が図４３Ａに示される。同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＡＡＤ１タンパク質（ＬＣＭＳ）の例となる相対的発現結果（Ｖ６）が図４３Ｂに示される。
６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＹＦＰ ＲＮＡの例となる相対的発現結果（Ｖ６）が図４４Ａに示される。同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＹＦＰタンパク質（ＬＣＭＳ）の例となる相対的発現結果（Ｖ６）が図４４Ｂに示される。
６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３５ ＲＮＡの例となる相対的発現結果（Ｖ６）が図４５Ａに示される。同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３５タンパク質（ＥＬＩＳＡ）の例となる相対的発現結果（Ｖ６）が図４５Ｂに示される。
図４６は、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＰＡＴ ＲＮＡの例となる相対的発現結果（Ｖ６）を示している。
６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３４ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析が図４７Ａに示される。同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３４タンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析が図４７Ｂに示される。平均値および統計結果は収載されている。
６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＡＡＤ１ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析が図４８Ａに示される。同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＡＡＤ１タンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析が図４８Ｂに示される。平均値および統計結果は収載されている。
６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＹＦＰ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析が図４９Ａに示される。同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＹＦＰタンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析が図４９Ｂに示される。平均値および統計結果は収載されている。
６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３５ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析が図５０Ａに示される。同じ６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３５タンパク質の発現結果（Ｖ６）の統計解析が図５０Ｂに示される。平均値および統計結果は収載されている。
図５１は、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＰＡＴ ＲＮＡの発現結果（Ｖ６）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。
図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃ、および５２Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５の例となるタンパク質発現結果（Ｖ１０）を示している。
図５３Ａ、５３Ｂ、５３Ｃ、および５３Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５のタンパク質発現結果（Ｖ１０）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。
図５４Ａ、５４Ｂ、５４Ｃ、および５４Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５の例となるタンパク質発現結果（Ｒ３）を示している。
図５５Ａ、５５Ｂ、５５Ｃ、および５５Ｄは、６つの構築物、ｐＤＡＢ１０５７４８、ｐＤＡＢ１０５８１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのそれぞれＹＦＰ、ＡＡＤ１、Ｃｒｙ３４、およびＣｒｙ３５のタンパク質発現結果（Ｒ３）の統計解析を示している。平均値および統計結果は収載されている。
図５６は、ｐＤＡＢ１０８７１８、ｐＤＡＢ１０８７１７、ｐＤＡＢ１０８７１９およびｐＤＡＢ１０８７２０からのＣｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、およびＡＡＤ１のタンパク質発現についてのウェスタンブロットの例となる結果を示している。
この結果により、単一プロモーター駆動構築物における４つのトランス遺伝子全てが良好な発現レベルで機能的であることが明らかにされている。Ｕｂｉ１二方向スタックにおける３つの遺伝子（Ｃｒｙ３４／Ｃｒｙ３５／ＡＡＤ１）は、単一Ｕｂｉ１駆動遺伝子スタック（ＤＥｘＴ）により与えられる発現レベルに類似する強力な発現レベルを示している。
多くの例となる態様および実施形態を上で考察してきたが、当業者であればある種の改変、置換、追加およびそれらの部分的組合せを認識するであろう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲および今後導入される特許請求の範囲は、その真の精神および範囲内であるような改変、置換、追加および部分的組合せを全て含むと解釈されることが意図されている。

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
トウモロコシ（Zea mays）またはゼア・ラグジュリアンズ（Zea luxurians）のユビキチン−１遺伝子由来の最小コアプロモーターエレメントおよびサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列を含む合成ポリヌクレオチド。
［２］
最小コアプロモーターエレメントが配列番号１に少なくとも７５％同一であるポリヌクレオチド配列またはその相補体を含む、上記［１］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［３］
最小コアプロモーターエレメントが配列番号１またはその相補体を含む、上記［１］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［４］
ユビキチン−１遺伝子由来のエクソンおよびユビキチン−１遺伝子由来のイントロンをさらに含む、上記［１］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［５］
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のイントロンをさらに含む、上記［１］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［６］
サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター由来の上流調節配列を含む、上記［１］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［７］
サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーターおよびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列が配列番号６またはその相補体を含む、上記［５］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［８］
上流調節配列（ＵＲＳ）、エンハンサーエレメント、エクソン、イントロン、転写開始部位、ＴＡＴＡボックス、熱ショックコンセンサスエレメント、翻訳ＳＴＡＲＴおよび／またはＳＴＯＰヌクレオチド配列、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるエレメントをさらに含む、上記［１］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［９］
最小コアプロモーターエレメントに作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列をさらに含む、上記［１］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［１０］
トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１遺伝子由来の最小コアプロモーターエレメントとサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列がポリヌクレオチドにおいて互いに関して逆相補的配向である、上記［１］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［１１］
上流調節配列（ＵＲＳ）、エンハンサーエレメント、エクソン、イントロン、転写開始部位、ＴＡＴＡボックス、熱ショックコンセンサスエレメント、翻訳ＳＴＡＲＴおよび／またはＳＴＯＰヌクレオチド配列、ならびにそれらの組合せからなる群から選択されるエレメントをさらに含む、上記［９］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［１２］
ユビキチン−１遺伝子由来のエクソン、ユビキチン−１遺伝子由来のイントロン、およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のイントロンを含む、上記［１０］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［１３］
配列番号５またはその相補体を含む、上記［１１］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［１４］
トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１遺伝子由来の最小コアプロモーターエレメントに作動可能に連結された対象の第一のコードヌクレオチド配列を含む、上記［９］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［１５］
サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結されている対象の第二のコードヌクレオチド配列を含む、上記［１４］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［１６］
上記［１］に記載のポリヌクレオチドで細胞を形質転換することを含む、トランスジェニック細胞を作製するための方法。
［１７］
上記［９］に記載のポリヌクレオチドで細胞を形質転換することを含む、トランスジェニック細胞を作製するための方法。
［１８］
細胞が植物細胞である、上記［１６］に記載の方法。
［１９］
細胞が植物細胞である、上記［１７］に記載の方法。
［２０］
上記［１］に記載のポリヌクレオチドを含む植物細胞。
［２１］
上記［９］に記載のポリヌクレオチドを含む植物細胞。
［２２］
上記［２０］に記載の植物細胞を含む植物。
［２３］
上記［２１］に記載の植物細胞を含む植物。
［２４］
対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段に作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列を植物細胞内に導入することを含む、植物細胞において対象のヌクレオチド配列を発現するための方法。
［２５］
（ａ）対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段に作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列、および
（ｂ）対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段に作動可能に連結された対象の第二のヌクレオチド配列
を含む核酸を植物細胞内に導入することを含む、上記［２４］に記載の方法。
［２６］
エクソンがトウモロコシ（Zea mays）またはゼア・ラグジュリアンズ（Zea luxurians）のユビキチン−１遺伝子由来である、上記［４］に記載の合成ポリヌクレオチド。
［２７］
対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段が配列番号５またはその相補体を含む、上記［２５］に記載の方法。
［２８］
核酸が、対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段に作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列を植物細胞のＤＮＡの所定の部位に標的するように、植物細胞内に導入される、上記［２５］に記載の方法。
［２９］
対象の２つの作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写を開始するための手段に作動可能に連結された対象のヌクレオチド配列が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ媒介組換えを利用して所定の部位に標的される、上記［２８］に記載の方法。
［３０］
（ａ）サトウキビ桿菌状ウイルス（ＳＣＢＶ）プロモーター由来の機能的プロモーターヌクレオチド配列を含む、二方向プロモーター、および
（ｂ）二方向プロモーターの向き合っている末端に２つの遺伝子発現カセット
を含み、
遺伝子発現カセットの少なくとも１つが翻訳スイッチを介して連結された２つ以上の遺伝子を含む、
植物細胞および／または組織において複数の遺伝子を発現するための核酸構築物。
［３１］
二方向プロモーターが少なくとも１つのエンハンサーを含む、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［３２］
核酸構築物がアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクターを含む、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［３３］
二方向プロモーターが、上流調節配列（ＵＲＳ）、エンハンサーエレメント、エクソン、イントロン、転写開始部位、ＴＡＴＡボックス、熱ショックコンセンサスエレメント、およびそれらの組合せからなる群から選択されるエレメントを含む、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［３４］
二方向プロモーターが、トウモロコシ（Zea mays）またはゼア・ラグジュリアンズ（Zea luxurians）のユビキチン−１遺伝子由来の最小コアプロモーターエレメントを含む、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［３５］
最小コアプロモーターエレメントが、配列番号１に少なくとも７５％同一であるポリヌクレオチド配列またはその相補体を含む、上記［３４］に記載の核酸構築物。
［３６］
二方向プロモーターが、ユビキチン−１遺伝子由来のエクソンおよび／またはユビキチン遺伝子由来のイントロンを含む、上記［３４］に記載の核酸構築物。
［３７］
二方向プロモーターがユビキチン遺伝子またはサトウキビ桿菌状ウイルス（ＳＣＢＶ）プロモーター由来の上流調節配列を含む、上記［３４］に記載の核酸構築物。
［３８］
二方向プロモーターが配列番号５のポリヌクレオチドまたはその相補体を含む、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［３９］
二方向プロモーターが配列番号６のポリヌクレオチドまたはその相補体を含む、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［４０］
両方の遺伝子発現カセットが翻訳スイッチを介して連結された２つ以上の遺伝子を含む、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［４１］
翻訳スイッチが、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、選択的スプライシング部位、２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、２Ａ様ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、インテインをコードするポリヌクレオチド配列、プロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド配列、およびそれらの組合せからなる群から選択される、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［４２］
翻訳スイッチの上流の遺伝子が翻訳停止コドンを含まない、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［４３］
少なくとも４つの遺伝子の発現を可能にする、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［４４］
３つから２０までの間の遺伝子の発現を可能にする、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［４５］
４つから８つまでの間の遺伝子の発現を可能にする、上記［４４］に記載の核酸構築物。
［４６］
二方向プロモーターからの遺伝子の発現が、一方向プロモーターと比べた場合、少なくとも４倍高い、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［４７］
二方向プロモーターからの遺伝子の発現が、一方向プロモーターと比べた場合、３倍から１０倍高い、上記［３０］に記載の核酸構築物。
［４８］
上記［３０］に記載の核酸構築物で植物細胞を形質転換することを含む、トランスジェニック植物を作製するための方法。
［４９］
上記［３０］に記載の核酸構築物で細胞を形質転換することを含む、トランスジェニック細胞を作製するための方法。
［５０］
上記［３０］に記載の核酸構築物を含む植物細胞。
［５１］
核酸構築物が植物細胞に安定的に形質転換されている、上記［５０］に記載の植物細胞。
［５２］
上記［３０］に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック植物。
［５３］
核酸構築物がトランスジェニック植物の細胞に安定的に形質転換されている、上記［５２］に記載のトランスジェニック植物。
［５４］
上記［３０］に記載の核酸構築物を植物細胞および／または組織中に導入することを含む、植物細胞および／または組織において複数の遺伝子を発現させるための方法。
［５５］
植物細胞および／または組織が上記［３０］に記載の核酸構築物で安定的に形質転換されている、上記［５４］に記載の方法。
［５６］
上記［３０］に記載の核酸構築物を含む、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクター。
［５７］
上記［１］の合成ポリヌクレオチドを含む、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクター。

Claims (19)

  1. 配列番号５のヌクレオチド配列を含む二方向プロモーターを含む二本鎖核酸分子であって、
    二方向プロモーターの第一の鎖は、最小コアプロモーターエレメントを含み、
    二方向プロモーターの第二の鎖は、機能的プロモーターヌクレオチド配列を含み、
    最小コアプロモーターエレメントと機能的プロモーターヌクレオチド配列とが、二方向プロモーターにおいて互いに関して逆相補的配向である、二本鎖核酸分子。
  2. 最小コアプロモーターエレメントが配列番号１であり、機能的プロモーターヌクレオチド配列が配列番号６である、請求項１に記載の二本鎖核酸分子。
  3. 最小コアプロモーターエレメントに作動可能に連結された第一の遺伝子カセットをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の二本鎖核酸分子。
  4. 機能的プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結されている第二の遺伝子カセットをさらに含み、第一の遺伝子カセットと第二の遺伝子カセットとが、核酸分子における二方向プロモーターの逆末端にある、請求項３に記載の二本鎖核酸分子。
  5. 少なくとも１つの遺伝子発現カセットが翻訳スイッチを介して連結された２つ以上の遺伝子を含む、請求項４に記載の二本鎖核酸分子。
  6. 両方の遺伝子発現カセットが翻訳スイッチを介して連結された２つ以上の遺伝子を含む、請求項５に記載の二本鎖核酸分子。
  7. 翻訳スイッチが、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、選択的スプライシング部位、２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、２Ａ様ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、インテインをコードするポリヌクレオチド配列およびプロテアーゼ切断部位をコードするポリヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項５に記載の二本鎖核酸分子。
  8. 翻訳スイッチの上流の遺伝子が翻訳停止コドンを含まない、請求項７に記載の二本鎖核酸分子。
  9. 二方向プロモーターが３つから２０までの間の遺伝子の発現を可能にする、請求項５に記載の二本鎖核酸分子。
  10. 二方向プロモーターが少なくとも４つの遺伝子の発現を可能にする、請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
  11. 二方向プロモーターが４つから８つまでの間の遺伝子の発現を可能にする、請求項６に記載の二本鎖核酸分子。
  12. 二方向プロモーターからの遺伝子の発現が、一方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターと比べた場合、３倍から１０倍高い、請求項４に記載の二本鎖核酸分子。
  13. 二方向プロモーターからの遺伝子の発現が、一方向ＺｍＵｂｉ１プロモーターと比べた場合、少なくとも４倍高い、請求項４に記載の二本鎖核酸分子。
  14. 請求項３〜６のいずれかに記載の核酸分子で細胞を形質転換することを含む、トランスジェニック細胞を作製するための方法。
  15. 細胞が植物細胞である、請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項３〜６のいずれかに記載の核酸分子を含む植物細胞。
  17. 核酸分子が植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項１６に記載の植物細胞。
  18. 請求項１７に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。
  19. 分子が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換のためのバイナリーベクターである、請求項３〜６のいずれかに記載の核酸分子。
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