JP6396303B2 - アルブミン結合を含有するタンパク質の分離方法 - Google Patents

Description

本発明は、アルブミン結合ドメイン、ＡＢＤに結合するポリペプチドを利用する分離方法に関する。本明細書に開示されたポリペプチドは、さまざまな産業的用途および薬学的用途、例えば分離技術の親和性リガンドとして、または分子診断法の検出剤としての使用を有する。

血清アルブミンは、哺乳動物の血清中で最も豊富なタンパク質（ヒトでは、３５〜５０ｇ／ｌ、すなわち０．５３〜０．７５ｍＭ）であり、そしてin vivoで血清アルブミンに結合可能となる担体分子にペプチドまたはタンパク質を共有結合させるいくつかの戦略は、例えば、特許文献１、特許文献２およびDennis ら（非特許文献１）に記載されている。特許文献２は、とりわけ、他のタンパク質の半減期を高めるため連鎖球菌Ｇタンパク質（ＳｐＧ）から誘導されたアルブミン結合ペプチドまたはタンパク質の使用を記載している。この着想は、細菌から誘導されたアルブミン結合ペプチド／タンパク質を、血液から迅速に除去されることがわかっている治療上興味深いペプチド／タンパク質に融合させることにある。生成された融合タンパク質は、in vivoで血清アルブミンに結合し、そしてそのより長い半減期から利益をもたらし、それにより、融合した治療上興味深いペプチド／タンパク質の正味の半減期を高める。血清アルブミンの半減期は、動物の大きさに正比例しており、ここで、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は１９日の半減期を有し、そしてウサギ血清アルブミンは、約５日の半減期を有する（非特許文献２）。

連鎖球菌Ｇタンパク質（ＳｐＧ）は、特定の連鎖球菌株の表面上に存在する二官能性受容体であり、ＩｇＧおよび血清アルブミンの両方に結合可能である（非特許文献３）。その構造は高度に反復性であり、いくつかの構造的および機能的に異なるドメイン（非特許文献４）、より正確には、３つのＩｇ−結合ドメインおよび３つの血清アルブミン結合ドメインがある（非特許文献５）。ＳｐＧ中の３つの血清アルブミン結合ドメインのうちの１つの構造は決定されており、３−ヘリックスバンドルフォールドを示す（非特許文献６、非特許文献７）。４６アミノ酸モチーフがＡＢＤ（アルブミン結合ドメイン）として定義され、その後、Ｇ１４８−ＧＡ３（Ｇタンパク質関連のアルブミン結合のためのＧＡおよび連鎖球菌の菌株から誘導されたＧ１４８）とも呼ばれている。

ヒト血清アルブミンに対して非常に改善された親和性を有するＧＡ３−Ｇ１４８の人工変異体（非特許文献８；特許文献３）、および低下した免疫刺激性を有する改変された高親和性変異体（特許文献４）が開発された。後者の動機となったのは、ＧＡ３−Ｇ１４８内にいくつかのＴ細胞およびＢ細胞エピトープが実験的に確認されており（非特許文献９）、そのためこのドメインそれ自体が、ヒトに投与する医薬組成物中の使用にあまり適していないという事実であった。本明細書の全体を通じて、ＧＡ３−Ｇ１４８だけでなく、例えば特許文献５および特許文献６に示されたそのさまざまな改変された誘導体を、まとめて「ＡＢＤ」と呼ぶ。したがって、本開示において、「ＡＢＤ」は、これらの種類のアルブミン結合ポリペプチドを表しており、特定のアミノ酸配列を有する特定のポリペプチドというわけではない。

アルブミン結合ドメインを治療組成物または診断用組成物に組み込むことへの興味が高まるにつれて、例えば原核生物系もしくは真核生物系の組換え発現によって、またはＡＢＤへの直接的化学結合によって産生された、ＡＢＤに共有結合した分子を単離するための安価でありかつ効率的な精製戦略の必要性が増大している。組換え発現されたタンパク質の精製に関する一般的な戦略には、一般的に用いられる親和性タグ、例えばポリヒスチジンタグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−タグまたはＦＬＡＧ−タグが含まれ、そしてそれぞれのタグ用に特別に開発された商業的な樹脂を用いて典型的な親和性分離を実施することになるであろう。しかし、ある種の用途、特に治療用物質として用いられる分子については、最終生成物は均質でなければならない。例えば、酵素または化学切断によってタグを除去することが必要となるため、均質な生成物を得るには完全な切断を確実に行う必要があり、つまり、不完全に切断された生成物を除去する際に収率の損失をこうむる必要がある。これらの問題はいずれも、生成物の製造費用を高めることになる。したがって、より興味深い戦略とは、ＡＢＤ部分それ自体を精製タグとして用いることであろう。この一例は、組換えアルブミンを固体支持体に結合させることであろう（例えば非特許文献１０；非特許文献１１）。粗溶質から、ＡＢＤタグを含む化合物をアルブミンによって捕捉し、非特異的に吸着された混在物質を除去し、そしてその後、アルブミンとの特異的であるが可逆的な相互作用を阻害することによってＡＢＤ−標識化合物を回収する。しかし、アルブミンは、さまざまなタンパク質、脂肪酸、ステロール、イオンなどに対するいくつかの相互作用部位を有する大きな天然の担体分子であり、そのため、特異的成分および非特異的成分のバックグラウンド結合により、回収された試料が汚染されることがある。組換えヒトアルブミンが開発されているという事実にもかかわらず、組換えヒトアルブミンは、特にアルブミン結合マトリックスの反復使用に適用が必要となるであろう定置洗浄（cleaning in place）の標準手順と適合しないため、治療用物質の大規模生産において親和性リガンドとして含めるにはなお高価である。さらにまた、アルブミンに対して非常に高い親和性を有するＡＢＤ変異体を含む分子を回収するには、より苛酷な溶離条件が必要となることがある。このような条件は、ＡＢＤ−標識分子にとっても好ましくないことがある。

モノクローナル抗体およびＦｃ−融合タンパク質の工業生産では、ＩｇＧのＦｃ部分に対するプロテインＡの天然の親和性のため、黄色ブドウ球菌からのプロテインＡが、親和性リガンドとして長い間使用されてきた。プロテインＡは、その全体としてだけでなく、その個々のＦｃ−結合ドメインが、その後、改善された性質を有する改変された親和性リガンドの合理的なデザインのための出発点として役立っている。導入については、Prot Eng（非特許文献１２）およびNat Biotech（非特許文献１３）中のNord Kおよび共同研究者による論文を参照のこと。

ＷＯ０１／４５７４６ ＷＯ９１／０１７４３ ＷＯ２００９／０１６０４３ ＷＯ２０１２／００４３８４ ＷＯ２００９／０１６０４３ ＷＯ２０１２／００４３８４

Dennis et al, J Biol Chem 277:35035-43, 2002 McCurdy et al, J Lab Clin Med 143:115, 2004 Bjoerck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987 Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986 Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987 Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996 Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002 Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008 Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003 Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008 Andersen et al, J Biol Chem 286:5234-41, 2011 Nord et al, Prot Eng 8:601-608; 1995 Nord et al, Nat Biotech 15:772-777; 1997

本開示の目的は、ＡＢＤを含むタンパク質分子、例えばＡＢＤが融合部分である融合タンパク質の精製、分離および／またはクロマトグラフィーのための新たな方法を提供することである。さらに、本開示の目的は、バイオテクノロジーにおいて、例えばタンパク質の精製および分離用途においてＡＢＤ結合剤の使用を提供する。

これらの目的および本開示から当業者に明らかである他の目的は、下に開示された１つまたはそれ以上のさまざまな本発明の態様によって達成することができる。

したがって、第１の態様において、本開示は、液体中に存在する少なくとも１つのＡＢＤ含有分子を液体中の他の成分から分離する方法であって、親和性分離ステップを含み、そのステップにおいて、親和性リガンドとして、ＡＢＤ結合モチーフＢＭを含むＡＢＤ結合ポリペプチドを使用し、このモチーフが、
ｉ）ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩ Ｘ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０ Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｄ
（配列中、互いに独立して、
Ｘ_２は、Ｆ、ＩおよびＬから選択され；
Ｘ_３は、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ｆ、Ｉ、ＬおよびＹから選択され；
Ｘ_７は、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_１０は、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は、Ｆ、Ｈ、Ｌ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１８は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_２０は、Ｈ、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ_２１は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２５は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２８は、ＤおよびＥから選択される）
および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列
選択されるアミノ酸配列からなる方法を提供する。

親和性クロマトグラフィーの当業者に理解されるように、開示された分離方法は、ＡＢＤを含む分子、すなわち「ＡＢＤ含有分子」の除去および／または精製に用いてもよい。このような分子は、特に１つの融合部分が１つまたはそれ以上のＡＢＤドメインを含み、そして他の融合部分が他の機能、例えば生物学的活性な機能、例えば治療または診断上の機能を有する融合タンパク質であってもよい。

本方法は、親和性分離ステップを含み、このステップで、上に定義されたポリペプチドを用いる。ＡＢＤ結合ポリペプチドのより具体的な変異体および実施態様を、以下に示す。したがって、本発明は、親和性分離の方法における本明細書に記載されたポリペプチドの使用を提供する。適切には、本方法は、分離デバイスを含む。分離デバイスには、例えばクロマトグラフィー媒体、膜、セルロース、シリカ、アガロース、ポリアクリルアミド、磁性ビーズ、二相系および分離に一般に用いられる他のこのような物質から選択される固体支持体が適切に含まれてもよい。一実施態様において、本明細書に定義されたポリペプチドは、分離デバイスの固体支持体に結合されている。このようにして得た分離デバイスは、それに結合された本明細書に定義されたポリペプチドを有しており、説明および請求項を通じて「親和性マトリックス」または「樹脂」と呼ばれ、そしてその特定の実施態様は、実施例において「抗ＡＢＤアガロース」と呼ばれる。

液体からＡＢＤ含有分子を精製するには、精製されるＡＢＤ含有分子を含む液体を、マトリックスに対してＡＢＤ含有分子の結合をもたらす条件下でこのような親和性マトリックスに適切に適用する。その後、マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合は維持されるが、マトリックスに結合したほとんどの、理想的にはすべての他のタンパク質および混在物質が洗い流されるような条件下で親和性マトリックスを洗浄する。溶離ステップでは、回収されうる「ＡＢＤ含有分子画分」を意味するＡＢＤ含有分子富化画分中に、ＡＢＤ含有分子がマトリックスから放出されるようにマトリックスを処理する。

反対に、分離の目的が、ＡＢＤ含有分子の除去である場合、いくつかの除外事項を伴って、本質的に上と同じステップに適切に従う。マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合をもたらす条件下で、除去されるＡＢＤ含有分子を含む液体を親和性マトリックスに適切に適用する。その後、マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合が維持されるが、ほとんどの、理想的にはすべての他のタンパク質がフロースルー中に回収されるような条件下で親和性マトリックスを洗浄し、したがって回収される、ＡＢＤ含有分子含量が実質的に減少した「減損された画分（depleted fraction）」が得られる。したがって、ＡＢＤ含有分子でなく、上の精製方法で捨てられた液体の成分を、その代わりに貯留し、そしてさらに使用および／または処理してもよい。

本発明の方法のさらなる別法として、「減損された画分」および「ＡＢＤ含有分子画分」を同じ分離運転から回収してもよい。その場合、もう一度、マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合をもたらす条件下で、ＡＢＤ含有分子を含む液体を親和性マトリックスに適切に適用する。その後、マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合が維持されるが、ほとんどの、理想的にはすべての他のタンパク質がフロースルー中に回収されるような条件下で親和性マトリックスを洗浄する。このようにして得られた、ＡＢＤ含有分子含量が実質的に減少した「減損された画分」が回収される。溶離ステップでは、回収される「ＡＢＤ含有分子画分」を意味するＡＢＤ含有分子富化画分中に、ＡＢＤ含有分子がマトリックスから放出されるようにマトリックスを処理する。

一実施態様において、開示された分離法は、バッチ構成で実施される。別の実施態様において、本方法は、カラム構成で実施される。さらに別の実施態様において、本方法は、拡大床吸着を用いて実施される。開示された方法を、バッチモードでの結合、続いてカラム構成での洗浄および溶離のようなハイブリッド構成を用いて実施することも可能である。親和性クロマトグラフィーの熟練技術者は、利用可能な別法を知っており、そして不必要な努力なしにそれらを実施することができる。

本明細書に開示されたＡＢＤ結合ポリペプチドは、一連の特徴を示し、これにより、例えば、固体支持体に結合されたときに、このＡＢＤ結合ポリペプチドは、ＡＢＤを含む分子を精製するための親和性リガンドとして適したものとなっている。例えば、親和性リガンドとしてのヒトアルブミンの使用と比較すると、開示されたＡＢＤ結合ポリペプチドの使用は、以下の利点を示す：
・リガンド結合マトリックスｍｌ当たりのより高い精製能力。
・例えば０．５Ｍ水酸化ナトリウムを用いた定置洗浄の反復手順との適合性、それによりＡＢＤ結合ポリペプチドは、治療用物質の大規模生産に有用となる。
・より温和な溶離条件、例えばより高いｐＨでの溶離の使用可能性、それによりＡＢＤを含むより広い範囲さまざまな分子の精製が可能となる。

本開示の文脈において、用語「試料」および「液体」は、同じ意味で用いてもよい。いずれの用語も、例えば関与する液体の体積または他の特性に関してなんら制限を意味しない。液体は、小さな体積、例えば分析目的ではより大きな体積のアリコートなど；または、代わりに、ラージスケールの分離および／もしくは精製方法に用いられる供給物もしくは液体であってもよい。

本明細書に開示された方法は、１つまたはそれ以上の異なる精製段階で有用であってもよい。したがって、それは、任意の中間体精製ステップまたは最終的な仕上げステップにおいて、第１の捕捉ステップのいずれか１つまたはより以上で限定されることなく用いてもよい。

ＡＢＤ部分が標的タンパク質のどこで位置するかに関係なく、本明細書に記載されたＡＢＤ結合ポリペプチドを含む樹脂を利用する本開示の方法を用いる標的タンパク質の精製が良好に達成できることは、当業者に理解されるであろう。したがって、ＡＢＤ部分は、標的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に配置されてもよい。あるいは、標的タンパク質は、両側に他のタンパク質部分が隣接するＡＢＤ部分を含む融合タンパク質であってもよい。

本開示の文脈において、「ＡＢＤ」は、連鎖球菌Ｇタンパク質およびその誘導体からの３−ヘリックスアルブミン結合ドメインのことをいう。特に、「ＡＢＤ」は、ＧＡ３−Ｇ１４８（Johanssonら、前出、参照により本明細書に組み込まれる）またはアルブミンに対して改善された親和性を有するＧＡ３−Ｇ１４８の変異体（ＷＯ２００９／０１６０４３、参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに低下した免疫刺激性を有する高親和性変異体（ＷＯ２０１２／００４３８４、参照により本明細書に組み込まれる）のことをいう。換言すれば、本開示において、「ＡＢＤ」は、引用文献に記載されたアルブミン結合ポリペプチドの種類を表しており、特定のアミノ酸配列を有する特定のポリペプチドというわけではない。

ある種の関連した配列、開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドの上の定義は、いくつかの異なる選択実験においてＡＢＤとの相互作用に関して選択された、親骨格の多数のランダムポリペプチド変異体の統計解析に基づく。特定されたＡＢＤ結合モチーフ、すなわち「ＢＭ」は、親骨格の標的結合領域に相当し、この領域は、３ヘリクッスバンドルタンパク質ドメイン内の２つのアルファヘリックスを構成する。親骨格において、２つのＢＭヘリックスの多様なアミノ酸残基は、抗体の定常Ｆｃ部分との相互作用のための結合表面を構成する。本発明では、結合表面残基のランダムな変化およびその後の変異体の選択により、Ｆｃ相互作用能力を、ＡＢＤとの相互作用の能力で置き換えている。

当業者によって理解されるように、任意のポリペプチドの機能、例えば本開示の分離方法に使用するためのポリペプチドのＡＢＤ結合能力は、ポリペプチドの三次構造によって決まる。したがって、その機能に影響を及ぼすことなく、ポリペプチド中のアミノ酸配列に少しの変更を加えることが可能である。したがって、本発明は、生成した配列がｉ）によって定義された配列と少なくとも８９％同一であるようなＢＭの修飾された変異体を含むポリペプチドを用いる方法および使用を包含する。本発明の一実施態様において、上記のＢＭの修飾された変異体は、ｉ）によって定義された配列と９３％同一であるようなものである。さらに別の実施態様において、上記ＢＭ変異体は、ｉ）によって定義された配列と９６％同一である。

いくつかの実施態様では、このような変更は、開示された分離方法に使用されたＡＢＤ結合ポリペプチドの配列のすべての位置で行ってもよい。別の実施態様において、このような変更は、非可変位置だけで行われるのではなく、骨格アミノ酸残基としても表される。そのような場合、可変位置、すなわち、配列ｉ）中の「Ｘ」で表される位置では、変更が許されていない。例えば、アミノ酸残基のある種の機能性群（例えば疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基は、同じ機能性群からの別のアミノ酸残基に交換できる可能性がある。

「％同一性」という用語は、全体に用いられるように、以下のように算出してもよい。CLUSTAL Wアルゴリズム（Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)）を用いてクエリー配列を標的配列に整列させる。整列した配列の最も短いものに相当するウィンドウ上で比較を行う。整列した配列の最も短いものは、いくつかの場合、標的配列であってもよい。他の場合、クエリー配列は、整列した配列の最も短いものを構成してもよい。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列中で同一の対応関係を有するクエリー配列の位置のパーセンテージを％同一性として報告する。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２は、ＦおよびＬから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２は、Ｆである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２は、Ｌである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_３は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、ＴおよびＶから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_３は、Ｈ、Ｋ、ＲおよびＶから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_３は、Ｈ、ＫおよびＶから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_３は、ＫおよびＲから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_３は、Ｋである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_３は、Ｒである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_３は、Ｖである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_４は、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、ＶおよびＷから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_４は、Ｈ、Ｌ、ＮおよびＶから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_４は、Ｖである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_４は、Ｎである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_４は、Ｈである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_４は、Ｌである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_４は、Ａ、Ｌ、Ｎ、ＶおよびＷから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_４は、Ａ、Ｎ、ＶおよびＷから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_４は、Ａ、ＮおよびＷから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_６は、ＦおよびＬから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_６は、Ｆである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_６は、Ｌである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_７は、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_７は、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_７は、Ｋ、Ｑ、ＲおよびＳから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_７は、ＫおよびＲから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_７は、Ｋである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_７は、Ｒである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１０は、Ｈ、Ｋ、ＮおよびＲから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１０は、Ｈ、ＫおよびＮから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１０は、Ｋ、ＮおよびＲから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１０は、ＫおよびＲから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１０は、Ｎである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１０は、Ｋである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１０は、Ｒである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１０は、Ｈである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１１は、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、ＴおよびＹから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１１は、Ａ、Ｆ、ＴおよびＹから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１１は、Ｔである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１１は、Ａである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１１は、Ｙである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１１は、Ｆである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１１は、Ａ、Ｌ、ＴおよびＹから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１１は、ＴおよびＹから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１６は、Ｔである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１７は、Ｆ、ＨおよびＬから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１７は、ＦおよびＨから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１７は、ＨおよびＬから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１７は、Ｆである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１７は、Ｈである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１７は、Ｌである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１８は、Ｄ、Ｈ、Ｉ、ＫおよびＱから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１８は、Ｄ、ＨおよびＱから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１８は、ＨおよびＱから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１８は、Ｈである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１８は、Ｑである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_１８は、Ｄである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２０は、ＫおよびＲから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２０は、ＨおよびＲから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２０は、Ｒである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２０は、Ｋである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２１は、ＩおよびＬから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２１は、Ｉである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２１は、Ｌである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２５は、Ｉ、ＬおよびＶから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２５は、ＶおよびＩから選択される。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２５は、Ｉである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２５は、Ｖである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２５は、Ｌである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２６は、Ｋである。

一実施態様において、配列ｉ）のＸ_２８は、Ｄである。

一実施態様において、配列ｉ）は、以下のとおり定義され：互いに独立して、
Ｘ_２は、ＦおよびＬから選択され；
Ｘ_３は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、ＶおよびＷから選択され；
Ｘ_６は、ＦおよびＬから選択され；
Ｘ_７は、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_１０は、Ｈ、Ｋ、ＮおよびＲから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_１６は、Ｔであり；
Ｘ_１７は、Ｆ、ＨおよびＬから選択され；
Ｘ_１８は、Ｄ、Ｈ、Ｉ、ＫおよびＱから選択され；
Ｘ_２０は、ＨおよびＲから選択され；
Ｘ_２１は、ＩおよびＬから選択され；
Ｘ_２５は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２６は、Ｋであり；そして
Ｘ_２８は、Ｄである。

一実施態様において、配列ｉ）は、以下のとおり定義され：互いに独立して、
Ｘ_２は、ＦおよびＬから選択され；
Ｘ_３は、Ｈ、Ｋ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_４は、Ｈ、Ｌ、ＮおよびＶから選択され；
Ｘ_６は、ＦおよびＬから選択され；
Ｘ_７は、Ｋ、Ｒ、ＱおよびＳから選択され；
Ｘ_１０は、Ｈ、ＫおよびＮから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｆ、ＴおよびＹから選択され；
Ｘ_１６は、Ｔであり；
Ｘ_１７は、Ｆ、ＨおよびＬから選択され；
Ｘ_１８は、Ｄ、ＨおよびＱから選択され；
Ｘ_２０は、Ｒであり；
Ｘ_２１は、ＩおよびＬから選択され；
Ｘ_２５は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２６は、Ｋであり；そして
Ｘ_２８は、Ｄである。

ＡＢＤ結合ポリペプチドのサブクラスを定義するより具体的な実施態様において、配列ｉ）は、８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのうちの少なくとも４つを満たす：
Ｉ．Ｘ_２は、ＦおよびＬから選択される；
ＩＩ．Ｘ_６は、ＦおよびＬから選択される；
ＩＩＩ．Ｘ_１６は、Ｔである；
ＩＶ．Ｘ_２０は、ＨおよびＲから選択される；
Ｖ．Ｘ_２１は、ＩおよびＬから選択される；
ＶＩ．Ｘ_２５は、ＩおよびＶから選択される；
ＶＩＩ．Ｘ_２６は、Ｋである；および
ＶＩＩＩ．Ｘ_２８は、Ｄである。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドのいくつかの例において、配列ｉ）は、８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのうちの少なくとも５つを満たす。より具体的には、配列ｉ）は、８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのうちの少なくとも６つ、８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのうちのこのような少なくとも７つ、例えば８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのすべてを満たしてもよい。

以下、実験区分に詳細に説明するように、ＡＢＤ結合ポリペプチド変異体の選択が、多くの個々のＡＢＤ結合モチーフ（ＢＭ）配列の同定につながった。これらの配列は、配列ｉ）の個々の実施態様を構成する。個々のＡＢＤ結合モチーフの配列を、図１に配列番号：１〜５２として示す。この態様のいくつかの実施態様において、配列ｉ）は、配列番号：１〜５２のいずれか１つから選択される。より具体的には、配列ｉ）は、配列番号：１〜７のいずれか１つから、例えば配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４から選択してもよい。特に、配列ｉ）は、配列番号：１であってもよい。本開示のいくつかの実施態様において、上に定義されたＢＭは、３−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインの「一部を形成する」。これは、ＢＭの配列を、最初の３−ヘリックスのバンドルドメインの配列に「挿入」または「移植」して、最初のドメインにおいてＢＭが類似の構造モチーフと置き換えられることを意味するものとして理解される。例えば、理論によって拘束されることを望むわけではないが、ＢＭは、３−ヘリックスのバンドルの３つのヘリックスのうちの２つを構成すると考えられ、したがって、任意の３−ヘリックスのバンドル内で、このような２−ヘリックスモチーフを置換することができる。当業者に理解されるように、３−ヘリックスバンドルドメインのうちの２つのヘリックスを２つのＢＭヘリックスによって置き換えることは、ポリペプチドの基本構造に影響を及ぼさないように実施しなければならない。すなわち、本発明のこの実施態様によるポリペプチドのＣα主鎖の全体的な折り畳みは、例えば同じ順序で二次構造の同じ要素を有するなど、それが一部を形成する３−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインのものと実質的に同じである。したがって、本発明のこの実施態様によるポリペプチドが最初のドメインと同じ折り畳みを有する場合、本発明によるＢＭは、３−ヘリックスバンドルドメインの「一部を形成し」、基本的な構造特性、例えば類似のＣＤスペクトルを生じるそれらの性質は共有されることを意味する。当業者は、関連性のある他のパラメータに詳しい。

したがって、特定の実施態様において、ＡＢＤ結合モチーフ（ＢＭ）は、３−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する。例えば、ＢＭは、上記３−ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で、相互に連結するループにより２つのアルファヘリックスを本質的に構成してもよい。特定の実施態様において、上記３−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、細菌の受容体タンパク質のドメインから選択される。このようなドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌からのプロテインＡの５つの異なる３−ヘリックスドメイン、例えばドメインＢ、およびそれらの誘導体である。いくつかの実施態様では、３−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、タンパク質Ｚの変異体であり、それはブドウ球菌のプロンテインＡのドメインＢから誘導される。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドが３−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する実施態様において、ＡＢＤ結合ポリペプチドは、
ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ Ｘ_ａＸ_ｂＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＸ_ｄＱ；
（配列中、
［ＢＭ］は、上に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフであり；
Ｘ_ａは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_ｂは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_ｃは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_ｄは、ＡおよびＳから選択される）
および
ｉｖ）ｉｉｉ）によって定義された配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。

上に議論したように、その三次構造および機能にほとんど影響を及ぼすことなく上のアミノ酸配列と比較して少しの変更を含んでいるポリペプチドの使用もまた、本開示の範囲内にある。したがって、いくつかの実施態様において、配列ｉｖ）は、ｉｉｉ）によって定義される配列と少なくとも８３％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも８７％、例えば少なくとも８９％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の同一性を有する。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドの一実施態様において、配列ｉｉｉ）のＸ_ａは、Ａである。別の実施態様において、配列ｉｉｉ）のＸ_ａは、Ｓである。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドの一実施態様において、配列ｉｉｉ）のＸ_ｂは、Ｎである。別の実施態様において、配列ｉｉｉ）のＸ_ｂは、Ｅである。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドの一実施態様において、配列ｉｉｉ）のＸ_ｃは、Ａである。別の実施態様において、配列ｉｉｉ）のＸ_ｃは、Ｓである。さらに別の実施態様において、配列ｉｉｉ）のＸ_ｃは、Ｃである。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドの一実施態様において、配列ｉｉｉ）のＸ_ｄは、Ａである。別の実施態様において、配列ｉｉｉ）のＸ_ｄは、Ｓである。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドの一実施態様において、配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａは、Ａであり；Ｘ_ｂは、Ｎであり；Ｘ_ｃは、Ａであり、そしてＸ_ｄは、Ａである。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａは、Ａであり；Ｘ_ｂは、Ｎであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり、そしてＸ_ｄは、Ａである。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｓであり、そし
てＸ_ｄは、Ｓである。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり、そしてＸ_ｄはＳである。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ａであり、そしてＸ_ｄは、Ａである。

開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａは、Ｓであり；Ｘ_ｂは、Ｅであり；Ｘ_ｃは、Ｃであり、そしてＸ_ｄは、Ａである。

なおさらなる実施態様において、上のＡＢＤ結合ポリペプチドの定義の配列ｉｉｉ）は、配列番号：５３〜１０４から、特に配列番号：５３〜５９から選択される。さらなる実施態様において、配列ｉｉｉ）は、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５および配列番号：５６から選択される。特に、配列ｉｉｉ）は、配列番号：５３であってもよい。

また、さらなる実施態様において、
ｖ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
（配列中、［ＢＭ］は、上に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフであり、そしてＸ_ｃは、ＳおよびＣから選択される）および
ｖｉ）ｖ）によって定義された配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、上に定義されたようなＡＢＤ結合ポリペプチドの開示された分離方法における使用が提供される。

別の実施態様において、
ｖｉｉ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；
（配列中、［ＢＭ］は、上に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフであり、そしてＸ_ｃは、ＡおよびＣから選択される）および
ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）によって定義された配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、上に定義されたようなＡＢＤ結合ポリペプチドの開示された分離方法における使用が提供される。

あるいは、
ｉｘ）ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；（配列中、［ＢＭ］は、上に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフであり、そしてＸ_ｃは、ＡおよびＣから選択される）および
ｘ）ｉｘ）によって定義される配列に少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、上に定義されたようなＡＢＤ結合ポリペプチドの開示された分離方法における使用が提供される。

上に議論したように、その三次構造および機能にほとんど影響を及ぼすことなく上のアミノ酸配列と比較して少しの変更を含んでいるポリペプチドの使用もまた、本開示の範囲内にある。したがって、いくつかの実施態様において、上に定義されたようなＡＢＤ結合ポリペプチドは、例えば、ｖ）、ｖｉｉ）またはｉｘ）によって定義された配列と少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％同一である配列を有してもよい。

いくつかの実施態様では、ＡＢＤ結合モチーフは、
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部を形成してもよい。

一実施態様において、開示された分離方法に使用するためのＡＢＤ結合ポリペプチドは、
ｘｉ）ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；（配列中、［ＢＭ］は、上に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフである）および
ｘｉｉ）ｘｉ）に定義された配列と少なくとも８４％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む。

再び、その三次構造および機能にほとんど影響を及ぼすことなく上のアミノ酸配列と比較して少しの変更を含んでいるポリペプチドの使用もまた、本開示の範囲内にある。したがって、いくつかの実施態様において、上に定義されたようなＡＢＤ結合ポリペプチドは、例えば、ｘｉ）によって定義された配列と少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％同一である配列を有してもよい。

このようなポリペプチドの配列ｘｉ）は、配列番号：１０５〜１５６のいずれか１つから選択してもよい。特に、配列ｘｉ）は、配列番号：１０５〜１１１のいずれか１つから選択してもよく、例えば、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７および配列番号：１０８から選択してもよい。このポリペプチドの特定の実施態様において、配列ｘｉ）は、配列番号：１０５である。

開示された分離方法に使用するためのポリペプチドは、単量体または多量体の形態であってもよい。一実施態様において、ＡＢＤ結合ポリペプチドは、少なくとも２つのＡＢＤ結合ポリペプチド単量体単位を含み、それらのアミノ酸配列が同一または異なってもよい多量体の形態で存在する。ポリペプチドの多量体の形態は、増強された結合性を有することができる点で、好都合でありうる。

一実施態様において、上記ＡＢＤ結合ポリペプチド単量体単位は、一緒に共有結合される。特定の実施態様において、ＡＢＤ結合ポリペプチド単量体単位は、融合タンパク質として発現される。

ポリペプチドは、知られている有機化学的方法を用いて共有結合によって結合してもよいし、またはポリペプチドの組換え発現のための系において１つもしくはそれ以上の融合ポリペプチドとして発現してもよいし、または直接もしくはリンカー、例えばアミノ酸リンカーを介して他のいずれかのやり方で結合してもよい。

一実施態様において、上記ＡＢＤ結合ポリペプチドは、二量体の形態である。可能な多量体の形態には、三量体の形態も含まれる。ポリペプチドの多量体の形態は、適した数の上に定義されたようなポリペプチド配列を含んでもよい。

本開示の範囲から逸脱することなくポリペプチドを特定の用途に合わせるために、本明細書に開示された任意の態様によるＡＢＤ結合ポリペプチドにさまざまな修飾および／または付加を行うことができることは、当業者に理解されるであろう。例えば、本明細書に開示された任意のＡＢＤ結合ポリペプチドは、さらなるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を含んでもよい。このようなポリペプチドは、ポリペプチド鎖のまさに最初のおよび／またはまさに最後の位置で、すなわちＮ末端および／またはＣ末端でさらなるアミノ酸残基を有するポリペプチドとして理解しなければならない。したがって、ＡＢＤ結合ポリペプチドは、任意の適した数のさらなるアミノ酸残基、例えば少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基を含んでもよい。それぞれのさらなるアミノ酸残基は、例えば、ポリペプチドの産生、精製、インビボまたはインビトロでの安定化、結合、または検出を改善するために、個々に、またはまとめて加えてもよい。このようなさらなるアミノ酸残基は、化学結合のために加えられた１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよく、それにより、例えば、ＡＢＤ結合ポリペプチドを樹脂またはマトリックス、例えばセファロースベースの樹脂またはスルホリンクカップリング（SulfoLink coupling）樹脂に結合可能にすることができる。この一例は、さらなるアミノ酸残基として、または多くのさらなるアミノ酸残基の１つとしてシステイン残基の付加である。一実施態様において、本明細書に開示されたＡＢＤ結合ポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端で、例えばＣ末端でシステイン残基を含む。一実施態様において、上記システインは、Ｃ末端のさらなるトリペプチドＶＤＣの一部である。一実施態様において、上記システインは、孤立Ｃ末端Ｃ（lone C-terminal C）である。

特に特定の一実施態様において、ＡＢＤ結合ポリペプチドは、上に定義されたような２つのＡＢＤ結合ドメインの二量体の他にＣ末端システイン残基を含む。

また、このようなさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えば、Ｈｉｓ_６タグまたは「ｍｙｃ」（ｃ−ｍｙｃ）タグもしくは「ＦＬＡＧ」タグを、タグに特異的な抗体との相互作用のため、またはＨｉｓ_６−タグの場合、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）との相互作用のために提供することができる。

上で議論したようなさらなるアミノ酸を、化学的結合（知られている有機化学的方法を用いる）によって、または他のいずれかの手段、例えば融合タンパク質としてのＡＢＤ結合ポリペプチドの発現によってＡＢＤ結合ポリペプチドに結合してもよい。

本発明をさまざまな例示的実施態様に関して説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、その要素を同等物で置換できることは、当業者によって理解される。さらに、本発明の必須の範囲から逸脱することなく、特定の状況または分子を本発明の教示に適合させるために多くの改変を行うことができる。したがって、本発明は、本発明を実施するために企図された任意の特定の実施態様に限定されることなく、本発明は、添付の特許請求の範囲内に帰属するすべての実施態様を含むものとする。

選択およびスクリーニングに用いた、または本発明の説明に関する融合タンパク質に用いた、本発明のＡＢＤ結合ポリペプチドに含まれるＡＢＤ結合モチーフの例（配列番号：１〜５２）、本発明による４９マーのＡＢＤ結合ポリペプチドの例（配列番号：５３〜１０４）、本発明による５８マーのＡＢＤ結合ポリペプチドの例（配列番号：１０５〜１５６）のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ドメイン変異体の配列（配列番号：１５７〜１６２）のリストである。 図１Ａの続き。 図１Ｂの続き。 図１Ｃの続き。 図１Ｄの続き。 図１Ｅの続き。 実施例１に記載したような、２μｇ／ｍｌのビオチン化ＰＥＰ０７９１１で検定されたＺ変異体の選択に関するＥＬＩＳＡの反応を示す。吸光度をＥＬＩＳＡプレート上の陽性対照からのシグナルで割ることによって反応を標準化した。 実施例１に記載したとおり実施したブロッキングＥＬＩＳＡアッセイのＺ変異体の選択のための反応を示す。Ｚ変異体のペリプラズム調製は、１０×過剰のＨＳＡを添加してまたはそれを添加することなく０．２μｇ／ｍｌのＰＥＰ０７９１１に対して試験した。黒色のバーは、ＨＳＡなしの試料に相当し、そして灰色のバーは、ブロッキング剤として加えたＨＳＡを含む試料に相当する。 実施例３に記載されたカラム研究Ｉからの結果を示す。図中のバーは、表１に明記された異なる洗浄および溶離ステップ後、ＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂のそれぞれから遊離された試料の相対量を表す。 実施例３に記載されたカラム研究ＩＩからの結果を示す。図５Ａは、それぞれ０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０または０．５Ｍ ＨＡｃ、ｐＨ２．５による（ａ）第１のまたは（ｂ）第２の溶離の後、ＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂のそれぞれから、または参照として含まれたＨＳＡ−セファロース樹脂から遊離された試料の相対量を表す。 実施例３に記載されたカラム研究ＩＩからの結果を示す。図５Ｂは、図５ＡのＺ変異体結合樹脂から溶出された対応する画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。「Ｍ」とは、Novex Sharp Pre-stained Protein標準（インビトロゲン；Ｍｗ：２１６、１６０、１１０、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、３．５ｋＤａ）のことをいい、そして「装填試料」とは、最初に各Ｚ変異体結合樹脂に装填されたＰＥＰ０８５１５を含む細菌抽出物のことをいう。Ｚ変異体結合樹脂からの溶出液２０μｌ、タンパク質標準または細菌抽出物５μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのそれぞれを１レーンに装填した。 実施例３に記載されたカラム研究ＩＩからの結果を示す。図５Ｃは、図５ＡでＨＳＡセファロース樹脂から溶出された対応する画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーン１：０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０（ｐＨ３（ａ））による第１の溶離。レーン２：０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０（ｐＨ３（ｂ））による第２の溶離。レーン３：０．５Ｍ ＨＡｃ、ｐＨ２．５（ｐＨ２．５（ａ））による第１の溶離。レーン４：０．５Ｍ ＨＡｃ、ｐＨ２．５（ｐＨ２．５（ｂ））による第２の溶離。それぞれの溶出液２０μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに装填した。「Ｍ」とは、Novex Sharp Pre-stained Protein標準の（インビトロゲン；Ｍｗ：２１６、１６０、１１０、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、３．５ｋＤａ）ことをいい、５μｌを装填した。 実施例４に記載したとおり実施した、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓと結合したＥＡＨ−セファロース樹脂上でのＡＢＤ−融合タンパク質の親和性精製からのクロマトグラムを示す（実線）。参照のため、ＨＳＡと結合したセファロース樹脂上での同一試料の精製（破線）が含まれた。試料注射地点を矢印で示す。ＡおよびＢは、それぞれＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓ結合樹脂およびＨＳＡ結合樹脂からのフロースルー画分を示し、そしてＣおよびＤは、それぞれからの溶出画分を示す。溶離は、線形ｐＨ勾配がｐＨ５．５からｐＨ２．３の範囲で実施した。ｐＨ（点線）は、ＨＰＬＣ系の内蔵ｐＨメーターによってモニターした。 実施例４に示し、そしてさらに記載したとおり、反復アルカリインキュベーションを実施した後に測定されたＥＡＨ−セファロース樹脂に結合したＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓ（実線）の動的結合能力を示す。参照のため、セファロース樹脂に結合したＨＳＡ（破線）の結合能力が含まれた。 実施例７に記載したとおり実施した抗ＡＢＤアガロース上でのＡＢＤ−融合タンパク質ＰＥＰ１０９８６の親和性精製からのクロマトグラムを示す。試料注射地点を矢印によって示す。２８０ｎｍの吸光度シグナルを示す（実線）。ＦＴおよびＥは、それぞれ、フロースルー画分および溶出画分のことをいう。溶離を０．１Ｍ ＨＡｃ、ｐＨ２．９で実施し、そしてｐＨ（点線）をＨＰＬＣ系の内蔵ｐＨメーターによってモニターした。 実施例７に記載した精製から選択された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーン１：カラムに装填された清澄化された細菌抽出物、レーン２：画分Ｅ１、レーン３：画分Ｅ２およびレーン４：画分Ｅ３。「Ｍ」は、Novex Sharp Pre-stained Protein標準（インビトロゲン；Ｍｗ：２１６、１６０、１１０、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、３．５ｋＤａ）のことをいう。各試料５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのそれぞれのレーンに装填したが、但し、レーン２には１．２５μｌを装填した。 実施例８に記載したとおり実施した、抗ＡＢＤアガロース上のＡＢＤ−融合タンパク質ＰＥＰ０３９７３の親和性精製からのクロマトグラムを示す。試料注射地点を、矢印によって示す。２８０ｎｍの吸光度シグナルを示す（実線）。ＦＴおよびＥは、それぞれフロースルー画分および溶出画分のことをいう。溶離を０．１Ｍ ＨＡｃ、ｐＨ２．９で実施し、そしてｐＨ（点線）を、ＨＰＬＣ系の内蔵ｐＨメーターによってモニターした。 実施例８に記載した精製から選択された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーン１：カラムに装填された清澄化された細菌抽出物、レーン２およびレーン３：フロースルー、レーン４：画分Ｅ１、レーン５：画分Ｅ２、レーン６：画分Ｅ３、レーン７：画分Ｅ４、レーン８：画分Ｅ５。「Ｍ」は、Novex Sharp Pre-stained Protein標準（インビトロゲン；Ｍｗ：２１６、１６０、１１０、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、３．５ｋＤａ）のことをいう。各試料５μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのそれぞれのレーンに装填した。 実施例９に記載したとおり実施した抗ＡＢＤアガロース上でのＡＢＤ−融合タンパク質ＰＥＰ０６５４８の親和性精製からのクロマトグラムを示す。試料注射地点を、矢印によって示す。２８０ｎｍの吸光度シグナルを示す（実線）。ＦＴおよびＥは、それぞれ、フロースルー画分および溶出画分のことをいう。溶離を０．１Ｍ ＨＡｃ、ｐＨ２．９で実施し、そしてｐＨ（点線）を、ＨＰＬＣ系の内蔵ｐＨメーターによってモニターした。 実施例９に記載した精製から選択された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーン１：カラムに装填された清澄化された細菌抽出物、レーン２：画分Ｅ１。「Ｍ」は、Novex Sharp Pre-stained Protein標準（インビトロゲン；Ｍｗ：２１６、１６０、１１０、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、３．５ｋＤａ）のことをいう。レーンＭおよびレーン１に５μｌを装填し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン２に５．８μｌを装填した。 実施例１０に記載したとおり実施した抗ＡＢＤアガロース上のＡＢＤ−融合タンパク質ＰＥＰ１７０８１の精製のクロマトグラムを示す。２８０ｎｍの吸光度シグナル（実線）および導電率（点線）を示す。試料注射地点を、矢印によって示す。ＦＴおよびＥは、それぞれ、フロースルー画分および溶出画分のことをいう。 実施例１１に記載した異なる精製段階から選択された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーンＭ：Novex Sharp Pre-stained Protein標準、インビトロゲン（２１６、１６０、１１０、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、３．５ｋＤａ）５μｌ。レーン１：抗ＡＢＤアガロースカラム上に装填された清澄化され、熱処置されたE. coli溶解物５μｌ。レーン２：抗ＡＢＤアガロースカラムからのフロースルー５μｌ（図１１ＡのＦＴ）。レーン３：抗ＡＢＤアガロースカラムからの溶出貯留物３．６μｌ（図１１ＡのＥ）。レーン４：ＲＰＣ（逆相クロマトグラフィー）によってさらに精製され、そして緩衝液交換されたＰＥＰ１７０８１ １２μｌ。 実施例１１で記載したとおり実施した、抗ＡＢＤアガロース上での、そのＣ末端でタンパク質ホルモンに融合したＡＢＤ０３５（配列番号：１５９）を含むタンパク質１の親和性精製からのクロマトグラムを示す。試料注射地点を、矢印によって示す。２８０ｎｍの吸光度シグナル（実線）および導電率（点線）を示す。ＦＴ、ＷおよびＥは、それぞれ、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分のことをいう。第１の洗浄ステップ、Ｗ１を４ＣＶのＴＳＴで実施し、そして第２の洗浄ステップ、Ｗ２を３ＣＶの５ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ、ｐＨ ５．５で実施した。 実施例１１に記載した精製から選択された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーン１〜３：ＳＥＣ精製タンパク質：（１）１０μｇ、（２）５μｇおよび（３）１μｇ。レーン４：抗ＡＢＤアガロースカラムに装填されたタンパク質試料、すなわち、ＴＳＴ中で１：１０希釈されたＳＥＣ精製タンパク質。レーン５：２０倍濃縮されたＦＴ。レーン６：６０倍濃縮されたＷ１。レーン７、８および９：溶出タンパク質：それぞれ（７）１０μｇ、（８）５μｇおよび（９）１μｇ。「Ｍ」でマークされたレーンは、タンパク質分子量マーカー（Ｍｗ：２００、１１６．３、９７．４、６６．３、５５．４、３６．５、３１、２１．５、１４．４、６、３．５、２．５ｋＤａ）で装填した。矢印は、混在タンパク質の弱いバンドを示しており、これはＳＥＣのみによって精製した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では認識できたが、抗ＡＢＤアガロース樹脂上の精製によって有効に除去された。 実施例１２に記載したとおり実施した、抗ＡＢＤアガロース上での、そのＮ末端でペプチドホルモンに融合したＡＢＤ０３５（配列番号：１５９）を含むタンパク質２の親和性精製からのクロマトグラムを示す。試料注射地点を、矢印によって示す。２８０ｎｍ（実線）の吸光度シグナルおよび導電率（点線）を示す。ＦＴ、ＷおよびＥは、それぞれ、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分のことをいう。第１の洗浄ステップ、Ｗ１を８ＣＶのＴＳＴで実施し、そして第２の洗浄ステップ、Ｗ２を、３ＣＶの５ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ、ｐＨ５．５で実施した。 実施例１２に記載した精製から選択された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。レーン１：抗ＡＢＤアガロースカラムに装填されたタンパク質試料。レーン２：ＦＴ。レーン４〜６：洗浄画分。レーン７〜１３：図１３Ａでマークされた二重ピーク内の溶出タンパク質画分。二重ピーク内の第１のピークに相当する画分をレーン７〜１０に装填した。「Ｍ」でマークされたレーンは、タンパク質分子量マーカー（Ｍｗ：２００、１１６．３、９７．４、６６．３、５５．４、３６．５、３１、２１．５、１４．４、６、３．５、２．５ｋＤａ）で装填した。

実施例
特記した場合を除いて、本研究の全体を通じて以下の物質を用いた：
・大腸菌（Escherichia coli）株XL1-Blue（アジレント・テクノロジー（Agilent Technologies）、カタログ番号２００２６８）
・ＷＯ２００９／０１６０４３またはＷＯ２０１２／００４３８４に記載されたとおり本質的に産生されたアルブミン結合ドメインＡＢＤ００１（配列番号：１５７）、Ｃ−ＡＢＤ００１（配列番号：１５８）、ＡＢＤ０３５（配列番号：１５９）、ＰＰ０１３（配列番号：１６０）、ＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６１）およびＰＥＰ０７９１１（配列番号：１６２）。

実施例１
ＡＢＤ結合Ｚ変異体の選択およびスクリーニング
物質および方法
標的タンパク質のビオチン化：ＥＺ−リンクマレイミドＰＥＧ２−ビオチン（EZ-Link Maleimide PEG2-Biotin）（ピアース（Pierce）、カタログ番号２１９０１）を用いて、Ｎ末端システインを有するＡＢＤ００１（Ｃ−ＡＢＤ００１；配列番号：１５８）およびＰＥＰ０７９１１（配列番号：１６２）を、ビオチン化した。簡潔に言えば、タンパク質を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５に溶解した。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を２０ｍＭの最終濃度まで加え、試料を回転混合により３４℃で１時間インキュベートした。使い捨てのＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）、カタログ番号１７−０８５１−０１）を用いて、緩衝液を結合緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に交換した。５倍（５×）モル過剰のＥＺ−リンクマレイミドＰＥＧ２−ビオチン（EZ-Link Maleimide PEG2-Biotin）（結合緩衝液に溶解した）をタンパク質試料に加え、回転混合により室温（ＲＴ）で２時間インキュベーションを進行させた。その後のＰＢＳ（１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）への緩衝液交換は、ＰＤ−１０カラムを用いて実施した。ＰＥＰ０７９８６（配列番号：１６１）は、Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin）（ピアース（Pierce）、カタログ番号２１３２７）を１０×モル過剰で用いて、製造元の推奨に従って室温で３０分間ビオチン化した。その後のＰＢＳへの緩衝液交換は、透折カセット（Slide-a-lyzer 3.5 K、3500 MWCO、ピアース、カタログ番号６６３３３）を用いて製造元の説明書に従って実施した。

ＡＢＤ結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：Groenwallら（J Biotechnol, 128:162-183, 2007）に記載されたとおり本質的にファージミドｐＡＹ０２０４７中に作製されたファージ上に示されたタンパク質Ｚのランダム変異体のライブラリーを用いてＡＢＤ結合ポリペプチドを選択した。ライブラリー、Ｚｌｉｂ００４Ｎａｉｖｅ．Ｉは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ結合分子Ｚ０３６３９（Gunneriusson et al, Protein Eng 12:873-878, 1999に記載されており、ここでは、ＺＴａｑＳ１−１と表された）を融合パートナーとして利用する。ライブラリーは、１．４×１０^１０の変異体の実測サイズを有した。

２０ｌファーメンター中でファージストックを調製した。ファージミドライブラリーＺｌｉｂ００４Ｎａｉｖｅ．Ｉを含有するグリセロールストックからの細胞を、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンで補充されたＴＳＢ−ＹＥ（トリプシンダイズブイヨン−酵母エキス；３０ｇ／ｌＴＳＢ、５ｇ／ｌ酵母エキス）２０ｌに接種した。培養液をファーメンター（ベラーチ・バイオテクニーク（Belach Bioteknik）、ＢＲ２０）中３７℃で増殖させた。細胞が光学濃度（ＯＤ）０．７〜０．８に達したとき、１０×モル過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ニュー・イングランド・バイオラボ（New England Biolabs）、カタログ番号Ｎ０３１５Ｓ）を用いて培養液約２．６ｌを感染させた。細胞を３０分間インキュベートし、その後、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、発現誘導のため）、２５μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１２．５μｇ／ｍｌカルベニシリンで補充されたＴＳＢ−ＹＥを用いてファーメンターを２０ｌまで充填し、細胞を３０℃で２２時間増殖させた。培養液中の細胞を１５９００ｇで遠心分離して沈殿させ、培地中に残っているファージ粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ（ポリエチレングリコール／塩化ナトリ）中で２回沈澱させ、濾過し、そして前出、Groenwallらに記載されたとおり、ＰＢＳおよびグリセロールに溶解した。ファージストックを、使用前に−８０℃で保存した。

選択は、ビオチン化ＡＢＤの異なる変異体に対して３つのサイクルで実施した。ファージストック調製、選択手順および選択サイクルの間のファージの増幅は、ＷＯ２００９／０７７１７５中に別の標的に対する選択に関して記載されたとおり本質的に実施した。０．１％ゼラチンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で補充されたＰＢＳを、選択緩衝液として用い、そして標的−ファージ複合体を、ダイナビーズ（Dynabeads）^(R)Ｍ−２８０ストレプトアビジン（ダイナル（Dynal）、カタログ番号１１２．０６）によって直接捕捉した。ＡＢＤ０．２５μｇ当たり１ｍｇのビーズを用いた。E. coli菌株XL1-Blueをファージ増幅に用いた。選択は、３つのトラック：ＰＥＰ０７９１１を用いる１つのトラック、Ｃ−ＡＢＤ００１を用いる１つのトラック、およびＣ−ＡＢＤ００１とＰＥＰ０７９８６とを交互にする１つのトラックに分けた３つのサイクルで実施した。選択のサイクル１では、異なる選択トラックに１００ｎＭのＰＥＰ０７９１１またはＣ−ＡＢＤ００１を用い、そしてＰＢＳＴ０．１％（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で補充されたＰＢＳ）による２回の洗浄を実施した。その後の２つのサイクルでは、標的濃度を下げ、かつ洗浄回数を増やして、厳密性を高めた。１つの標的のみを用いる選択トラックについては、サイクル２および３において、それぞれ５０ｎＭ、続いて２５ｎＭのＰＥＰ０７９１１またはＣ−ＡＢＤ００１を用いた。標的を交換するトラックでは、サイクル２において７５ｎＭのＰＥＰ０７９８６を用い、そしてサイクル３において４０ｎＭのＣ−ＡＢＤ００１を用いた。すべてのトラックについて、サイクル２および３では、ＰＢＳＴ０．１％を用いてそれぞれ４回および８回の洗浄を実施した。洗浄後、結合したファージを、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）５００μｌで溶離し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０μｌ、ｐＨ８．０およびＰＢＳ ４５０μｌで直ちに中和した。最後の選択サイクルでは、すべてのトラックを０．５ＭのＨＡｃ、ｐＨ４．０で最初に溶離し、続いて上記のようにグリシン−ＨＣｌで溶離した。種々の溶出液を、その後、別々に処理した。

Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：選択されたＺ変異体分子が、ＡＢＤの種々の変異体と実際に相互作用できることを検証するため、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ディープウェルプレート（ヌンク（Nunc）、カタログ番号２７８７５２）中、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．１ｍＭのＩＰＴＧで補充されたＴＳＢ−ＹＥ培地１ｍｌに選択からの単一コロニーを接種することによってＺ変異体を産生した。プレートを３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって沈殿させ、ＰＢＳＴ０．０５％４００μｌ中で再懸濁し、そして−８０℃で凍結して細胞の周辺質画分を遊離した。凍結した試料を、その後、水浴中で解凍し、そして凍結融解を８回繰り返した。ＰＢＳＴ０．０５％４００μｌを試料に加え、そして細胞を遠心分離によって沈殿させた。周辺質上清は、ＡＱＨＤＥＡＬＥ−［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＹＶ−［Ｚ０３６３９］−ＹＶＰＧとして表されるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ結合分子Ｚ０３６３９への融合物としてＺ変異体を含んだ。Ｚ＃＃＃＃＃は、個々の５８アミノ酸残基Ｚ変異体に相当する。

ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（コスター（Costar）、カタログ番号３６９０）を、Ｚ変異体に特異的な抗体（アフィボディ（Affibody）、カタログ番号２０．１０００．０１．０００５）４μｇ／ｍｌを含む５０μｌ／ウェルのコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）でコートし、そして４℃で一夜インキュベートした。抗体溶液を捨て、そしてウェルをＰＢＳＣ（０．５％カゼインで補充されたＰＢＳ；シグマ（Sigma）、カタログ番号Ｃ８６５４）１００μｌにより室温で２時間ブロックした。ブロッキング溶液を捨て、そしてウェルに周辺質溶液５０μｌを加え、そしてゆっくり振盪しながら室温で１．５時間インキュベートした。上清を捨て、そしてウェルをＰＢＳＴ０．０５％で４回洗浄した。次いで、ビオチン化ＰＥＰ０７９８６またはＰＥＰ０７９１１ ５０μｌを、ＰＢＳＣ中２μｇ／ｍｌの濃度で、各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、続いて上記のように洗浄した。ＰＢＳＣ中で１：３００００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ；サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific）、カタログ番号Ｎ１００）を、ウェルに加え、そしてプレートを４５分間インキュベートした。上記のように洗浄した後、イムノピュアＴＭＢ（ImmunoPure TMB）基質（サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific）、カタログ番号３４０２１）５０μｌをウェルに加え、そしてプレートを製造元の推奨に従って処理した。マルチウェルプレートリーダー、ビクター^３（Victor³）（パーキンエルマー（Perkin Elmer））を用いて、ウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定した。

陽性対照として、無関係であるが、明記されておりかつ標的タンパク質に結合しているＺ変異体を含み、そして上のように発現された周辺質画分を、５μｇ／ｍｌのこのビオチン化された標的タンパク質に対して検定した。陰性対照として、同じ周辺質調製物をＰＥＰ０７９８６またはＰＥＰ０７９１１に対して検定した。ＰＥＰ０７９８６またはＰＥＰ０７９１１に対してプラスの吸光度値を有するクローンについてシークエンシングを実施した。

シークエンシング：標準ＰＣＲプログラムならびにプライマーＡＦＦＩ−２１（５’−ｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔｇｔｔｇｔｇｔｇ；配列番号：１６３）およびＡＦＦＩ−２２、（５’−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ：配列番号：１６４）を用いて単一コロニーから２ステップでＰＣＲフラグメントを増幅した。増幅されたフラグメントのシークエンシングは、ビオチン化オリゴヌクレオチドＡＦＦＩ−７２（５’−ビオチン−ｃｇｇａａｃｃａｇａｇｃｃａｃｃａｃｃｇｇ；配列番号：１６５）およびBigDye^(R)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ、カタログ番号４３３６９１９）を使用し、製造元のプロトコールに従って用いて実施した。シークエンシング反応物は、Magnatrix 8000（マグネティックバイオソリューション（Magnetic Biosolution））を用いて磁性ストレプトアビジンコーティングビーズ（Detach Streptavidin Beads、Nordiag、カタログ番号２０１２−０１）への結合によって精製し、そしてABI PRISM^(R) 3130xl Genetic Analyzer（ＰＥアプライドバイオサイエンシズ（PE Applied Biosystems））上で分析した。

ブロッキングＥＬＩＳＡ：最初のＥＬＩＳＡ画面からのクローンのサブセットについて、それらの標的との結合がＨＳＡの存在に影響を受けるかどうか明らかにするため、ＥＬＩＳＡブロッキングアッセイにかけた。選択されたＺ変異体については、上と同じ周辺質画分を用いた。ＥＬＩＳＡブロッキングアッセイは、標的ステップで以下のプロトコール改変を導入してＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイとして実施した：ＨＳＡを標的タンパク質と混合した後、アッセイプレートに添加した。０．２μｇ／ｍｌのビオチン化ＰＥＰ０７９１１の１０×モル過剰のＨＳＡと混合し、次いで、室温で１５分間インキュベートして複合体形成させた後、プレートに添加した。陽性対照として、無関係な標的タンパク質を結合する分子を含有し、かつ上のように発現させた周辺質画分を、５μｇ／ｍｌのビオチン化された特定の標的タンパク質に対して検定した。陰性対照として、同じ周辺質調製物を、ビオチン化ＰＥＰ０７９１１に対して検定した。ブランクとして、周辺質調製物の代わりにＰＢＳＣを加え、そしてビオチン化ＰＥＰ０７９１１を標的として加えた。すべての対照は、上と同じ方法でＨＳＡを添加した試料および添加してない試料として調製した。

結果
ＡＢＤ結合Ｚ変異体のファージディスプレイ選択：ビオチン化ＡＢＤの異なる変異体に対するファージディスプレイ選択の３つのサイクル後、個々のクローンを得た。ファージ粒子収率（ファージ粒子アウト（out）／ファージ粒子イン（in））は、各サイクルで増加し、標的結合クローンの富化を示している。

Ｚ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：３つの選択サイクル後に得られたクローンを９６ウエルプレート中で産生し、そしてＥＬＩＳＡにおいてＡＢＤ結合活性についてスクリーニングした。ＰＥＰ０７９１１に対して検定した陽性クローンの選択の結果（シグナルは、陰性対照の少なくとも２×に相当する）を図２に示す。無関係なタンパク質に特異的な対照分子により、特定のタンパク質に対する陽性シグナルを得たが、ＰＥＰ０７９８６またはＰＥＰ０７９１１に対してはシグナルが得られなかった。

ブロッキングＥＬＩＳＡ：Ｚ変異体が天然リガンドＨＳＡとオーバーラップ結合部位を有するかどうか調べるため、ＰＥＰ０７９８６またはＰＥＰ０７９１１に対して陽性であるクローンを、ＨＳＡを含むブロッキングアッセイにかけた。試験したすべてのクローンについて、ＰＥＰ０７９１１に対する結合シグナルは、ＨＳＡの存在によって完全に消失し、バックグラウンドと同じレベルに達した（図３）。陽性対照の結合は、過剰のＨＳＡの添加によって影響を受けず、そしてブランクはバックグラウンドシグナルを示さなかった。

シークエンシング：ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいてＡＢＤに対して陽性の吸光度値を有するクローンについてシークエンシングを実施した。各変異体に固有の識別番号＃＃＃＃＃を与え、そして個々の変異体をＺ＃＃＃＃＃と称した。５８アミノ酸残基長のＺ変異体のアミノ酸配列を図１に、そして配列番号：１０５〜１５６として配列リストに記載した。これらのＺ変異体の推測されたＡＢＤ結合モチーフをＢＭ＃＃＃＃＃と表し、図１に、そして配列番号：１〜５２として配列リストに記載した。これらのＺ変異体のそれぞれの中に完全な３−ヘリックスバンドルを構成すると予測される４９アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列をＰ＃＃＃＃＃と表し、図１に、そして配列番号：５３〜１０４として配列リストで記載した。

実施例２
ＡＢＤ結合Ｚ変異体のクローニングおよび産生
物質および方法
Ｚ変異体のサブクローニング：７つのＡＢＤ結合Ｚ変異体のＤＮＡ、Ｚ０６６０８（配列番号：１０７）、Ｚ０６６２０（配列番号：１１０）、Ｚ０６６３８（配列番号：１０６）、Ｚ０６６５０（配列番号：１０８）、Ｚ０６６７７（配列番号：１０５）、Ｚ０６６７８（配列番号：１０９）およびＺ０６６９５（配列番号：１１１）を、ライブラリーベクターｐＡＹ０２０４７から増幅した。標準分子生物学的手法を用いて、他の標的を結合するＺ変異体についてＷＯ２００９／０７７１７５に詳細に記載されたとおり、Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグおよびＣ末端Ｃｙｓを有する二量体Ｚ変異体分子を作製するためのサブクローニング戦略を適用した。Ｚ遺伝子フラグメントは、発現ベクターｐＡＹ０１４４９にサブクローニングしてコードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱ−［Ｚ＃＃＃＃＃］［Ｚ＃＃＃＃＃］−ＶＤＣを生成した。

培養および精製：E. coli BL21(DE3)細胞（ノバゲン（Novagen））を、それぞれ個々のＺ変異体の二量体遺伝子フラグメントを含むプラスミドを用いて形質転換し、そして５０μｇ／ｍｌのカナマイシンで補充されたＴＳＢ＋ＹＥ培地（酵母エキス入りトリプシンダイズブイヨン）１ｌ中、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝１で、ＩＰＴＧを加え、０．１７ｍＭの最終濃度でタンパク質発現を誘導し、そして培養液をさらに５時間３７℃でインキュベートした。細胞を遠心分離によって集めた。

各細胞沈殿物４．８ｇを、２９Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ^(R)（メルク（Merck）、カタログ番号１．０１６５４．０００１）で補充された変性結合緩衝液（denaturing binding buffer）（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、８Ｍ尿素、ｐＨ７．４）３０ｍｌ中に再懸濁し、そして撹拌しながら室温で１時間インキュベートして発現タンパク質を遊離させた。細胞残屑を遠心分離によって除去し、そして各上清を１ｍｌのHis GraviTrap IMACカラム（ＧＥヘルスケア、カタログ番号１１−００３３−９９）に適用した。変性結合緩衝液、天然結合緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）および洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄することによって混在物質を除去し、そしてＡＢＤ結合Ｚ変異体を、溶離緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で続いて溶離した。精製された各ＡＢＤ結合Ｚ変異体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって１０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３に移した。NanoDrop^(R)ND-1000分光光度計を用いて２８０ｎｍで吸光度を測定し、それぞれのタンパク質の吸光係数を用いてタンパク質濃度を決定した。ＡＢＤ結合Ｚ変異体を凍結乾燥し、そしてクーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって最終生成物の純度を分析した。精製された各ＡＢＤ結合Ｚ変異体の同一性を、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を用いて確認した。

結果
培養および精製：７つのＡＢＤ結合Ｚ変異体Ｚ０６６０８（配列番号：１０７）、Ｚ０６６２０（配列番号：１１０）、Ｚ０６６３８（配列番号：１０６）、Ｚ０６６５０（配列番号：１０８）、Ｚ０６６７７（配列番号：１０５）、Ｚ０６６７８（配列番号：１０９）およびＺ０６６９５（配列番号：１１１）を、Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグおよびＣ末端Ｃｙｓを有する二量体として作製し、E. coli中で適切に発現させた。細菌ペレット４．８ｇからのＩＭＡＣ精製タンパク質の量は、分光測光法により２８０ｎｍで吸光度を測定することによって決定され、種々のＡＢＤ結合Ｚ変異体について３ｍｇから１９ｍｇの範囲であった。

それぞれの最終的なタンパク質産生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、これらがそれぞれのＡＢＤ結合Ｚ変異体を主に含むことを示した。各ＡＢＤ結合Ｚ変異体の正確な分子量は、ＨＰＬＣ−ＭＳによって確認した。

実施例３
ＡＢＤ結合Ｚ変異体の結合および溶離特性の評価
本実施例では、実施例１および２に記載されたとおり選択および産生された一連のＡＢＤ結合ポリペプチドの結合および溶離特性を、それぞれ、スピンカラムを用いた小規模フォーマットで研究した。

物質および方法
樹脂へのＡＢＤ結合Ｚ変異体の結合：実施例２に記載されたとおり産生されたフォーマットＨｉｓ_６−（Ｚ＃＃＃＃＃）_２−Ｃｙｓの凍結乾燥されたそれぞれのＡＢＤ結合Ｚ変異体Ｚ０６６０８、Ｚ０６６２０、Ｚ０６６３８、Ｚ０６６５０、Ｚ０６６７７、Ｚ０６６７８およびＺ０６６９５ １ｍｇを還元緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．５）中で再懸濁し、そして室温で２時間インキュベートした。還元されたタンパク質溶液を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて５０ｍＭ ＤＴＴを含むカップリング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）に移し、次いで、スルホリンクカップリングレジン（SulfoLink Coupling Resin）（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、カタログ番号２０４０１）０．２ｍｌの部分と混合した。この手順により、ＡＢＤ結合Ｚ変異体のＣ末端システイン残基のチオール基と樹脂のヨードアセチル基との間の部位特異的反応が可能となり、共有結合性のチオエーテル結合が形成される。結合反応は、製造元の説明書に従って実施した。結合度は、樹脂ｍｌ当たり結合したＡＢＤ結合Ｚ変異体のｍｇとして定義され、以下のように決定した：結合したＡＢＤ結合Ｚ変異体の量は、２８０ｎｍでの吸光度の分光光度測定によって得られた濃度に基づいて、試料の最初の量から未結合の物質の量を引いて算出した。次いで、結合したＡＢＤ結合Ｚ変異体のｍｇでの量を、スルホリンクカップリングレジン（SulfoLink Coupling Resin）の体積で割った。

カラム研究Ｉ：純粋な試料を用いたＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂の評価：樹脂に結合した７つのＡＢＤ結合Ｚ変異体のそれぞれの結合、洗浄および溶離の性質を試験するため、ＡＢＤ融合タンパク質ＰＥＰ０８５１７の以前に精製された試料を用いることによって第１のカラム研究を実施した。ＰＥＰ０８５１７は、そのＮ末端でタンパク質Ｚのサイトカイン結合変異体に融合したアルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号：１６０）を含む。樹脂の０．１ｍｌ部分を試験管に移し、そして結合緩衝液中２ｍｇ／ｍｌでＰＥＰ０８５１７の純粋な試料０．１ｍｌを加えた。管を、回転輪上、室温で１時間インキュベートした。各試料−樹脂混合物を、空のスピンカラムに移した。未結合タンパク質を遠心分離（フロースルー、ＦＴ）によって集めた。その後、表１に明記された種々の溶液０．１ｍｌを加えて洗浄し、続いて結合したＰＥＰ０８５１７分子を溶離した。各洗浄および溶出画分を遠心分離によって集めた。

集めた画分を、分光光度計において２８０ｎｍで吸光度を測定することによって分析した。

カラム研究ＩＩ：細菌抽出物を用いたＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂の評価：カラム研究Ｉからの４つのＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂の結合性、洗浄性および溶離性をさらに試験するため第２のカラム研究を実施した。これらの樹脂のリガンドは、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６０８）_２−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６３８）_２−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−ＣｙｓおよびＨｉｓ_６−（Ｚ０６６５０）_２−Ｃｙｓであった。ＨＳＡセファロース（製造元による説明書に従って、ＣＮＢｒ活性化セファロース４ファーストフローに遊離アミンを介してヒト血清アルブミン結合した、ＧＥヘルスケア、カタログ番号１７−０９８１）で充填されたさらなるカラムを参照として含んだ。E. coliペレットから超音波処理および遠心分離によって調製された清澄化細菌抽出物を、本実験の試料として用いた。ＰＥＰ０８５１５（そのＮ末端でタンパク質ＺのＰＤＧＦＲβ（血小板由来増殖因子受容体ベータ（Platelet Derived Growth Factor Receptor beta））の結合変異体に融合したアルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号：１６０）を含む）約０．５ｍｇを含む細菌抽出物０．１７ｍｌを、それぞれ個々にＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂またはＨＳＡセファロースで充填されたスピンカラムに移した。フロースルーを遠心分離によって集め、そしてカラムに２回、再適用した。表２に明記された種々の溶液を加えて細菌宿主タンパク質を除去し、続いて、結合したＰＥＰ０８５１５分子を溶離した。洗浄および溶出画分を遠心分離によって集め、そして分光光度計において２８０ｎｍで吸光度を測定することによって、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

結果
ＡＢＤ結合ポリペプチドの結合効率：スルホリンクカップリングレジン（SulfoLink Coupling Resin）に対する各ＡＢＤ結合ポリペプチドの結合度を表３に示す。

カラム研究Ｉ：純粋な試料を用いたＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂の評価：表１に明記された種々の洗浄および溶離ステップ後、７つのＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂のそれぞれから遊離され、そして２８０ｎｍで吸光度を測定することによって決定された、試料ＰＥＰ０８５１７の量を図４に示す。

研究した条件下で、それぞれＡＢＤ結合Ｚ変異体（Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６０８）_２−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６３８）_２−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６５０）_２−Ｃｙｓ）およびＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓと結合した樹脂は、非常に望ましい溶離
プロファイルを示しており、試料適用および洗浄中の試料漏出が少なく、大部分の試料がｐＨ２．５の緩衝液による溶離で遊離された。

ｐＨ４で多くの試料を溶離したＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂はなかった。興味深いことに、いくつかの樹脂、例えばＨｉｓ_６−（Ｚ０６６０８）_２−Ｃｙｓは、ｐＨ２．５の緩衝液（「（ｂ）ｐＨ２．５」）の２回目の添加でほとんどの試料を溶離したが、例えばＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓは、最初のｐＨ２．５の緩衝液の添加（「（ａ）ｐＨ２．５」）で多くの試料を溶離しており、親和性リガンドＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓでは、他の候補と比較してより高い溶離ｐＨを使用できることを示している。

カラム研究ＩＩ：細菌抽出物を用いたＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂の評価：さらなる結合、洗浄および溶離の研究のため、親和性リガンドＨｉｓ_６−（Ｚ０６６０８）_２−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６３８）_２−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６５０）_２−ＣｙｓおよびＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓを含む、カラム研究Ｉからの４つの良好な性能を発揮するＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂を選択し、ここでは、ＰＥＰ０８５１５を含む細菌抽出物を試料として用いた。表２に明記された種々の異なる溶離ステップの後、４つのＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂のそれぞれから、または参照として含まれたＨＳＡ−セファロース樹脂から遊離され、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定されたＰＥＰ０８５１５の量を、図５Ａに示す。

同じ溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、図５Ｂに示す。２つの分析からの結果は十分に一致しており、すなわち、ある種の親和性リガンドについて、高い吸光度測定値の溶出画分からＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の太いバンドも得られており、そしてより低い吸光度測定値の画分についてその逆も同じであった。カラム研究Ｉ中のとおり、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓと結合した樹脂は、より高いｐＨの溶離範囲（「ｐＨ３（ａ）」および「ｐＨ３（ｂ）」）で、その結合タンパク質の大部分を遊離した。

すべての溶出試料の純度は、一般に非常に高かったが（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から算定して９５％を超える）、種々のＡＢＤ結合Ｚ変異体については僅かな違いを観察することができた。

ＨＳＡセファロース樹脂（図５Ｃに示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）との比較では、ＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂は、吸光度の測定値およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断してより高い結合能力およびより望ましい溶離性を有すると考えられる。能力の違いは、リガンド密度の違いによるはずがない；実際、ＨＳＡセファロース上の結合ＨＳＡ分子の数は、ＡＢＤ結合Ｚ変異体結合樹脂と比較して約１．５〜２．２倍高かった。

実施例４
実施例３に示した結果に基づくＡＢＤ結合Ｚ変異体のさらなる特徴づけおよびカラム研究
クロマトグラフィー系に連結するカラムにおけるさらなる特徴づけおよび研究のためＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓを選択した。

物質および方法
円偏光二色性分析による融点の測定：Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの融点（Ｔｍ）を決定するため円偏光二色性（ＣＤ）分析を実施した。精製した試料をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。可変温度測定（ＶＴＭ）を実施し、その際、２０℃から９０℃までの試料の加熱中、５℃／分の温度勾配で２２０ｎｍの吸光度をモニターした。温度プロットに対するＣＤシグナルの遷移の中間点からＴｍを決定した。ＣＤ測定は、光路長１ｍｍのセルを用いてJasco J-810分光偏光計（ジャスコスカンジナビアＡＢ（Jasco Scandinavia AB））において実施した。

溶離ｐＨのクロマトグラフィー研究：Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓを、活性化ＥＡＨ−セファロース４Ｂ上に固定化した（ＧＥヘルスケア、カタログ番号１７−０５６９−０１）。活性化および固定化を製造元の説明書に従って実施し、そして実施例３に記載したとおり結合度を決定した。活性化ＥＡＨセファロースは、親和性リガンドのＣ末端システインを介して部位特異的結合を可能にするヨードアセチル基を含む。樹脂０．４３ｍｌをTricorn 5/50カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。参照として、ＨＳＡセファロース（実施例３参照）０．４７ｍｌを同じ種類のカラムに充填した。

AEKTAexplorer 10クロマトグラフィー系（ＧＥヘルスケア）を用いて溶離実験を実施した。２つのカラムを系に取り付け、ＰＢＳで平衡にした。ＰＥＰ０８５１９（そのＮ末端でタンパク質ＺのＴａｑポリメラーゼ結合変異体に融合したアルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号：１６０）を含む）１ｍｇを含む試料２ｍｌを各カラムに装填し、続いてＰＢＳおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ５．５で洗浄した。結合したタンパク質を、ｐＨ５．５からｐＨ２．３の範囲の線形ｐＨ勾配（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ５．５および０．１Ｍクエン酸ナトリウム、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ２．３を用いる）によって１６カラム体積（ＣＶ）にわたって溶離した。AEKTAexplorer系の内蔵ｐＨメーターによってｐＨをモニターした。

ＡＢＤ結合ポリペプチドの結合能力および耐アルカリ性のクロマトグラフィー研究：本実験では、前節に記載されたクロマトグラフィー研究に用いた、Tricorn 5/50カラムに充填されたＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓ樹脂およびＨＳＡセファロース樹脂について動的結合能力および耐アルカリ性を試験した。

本実験は、AEKTAexplorer 10クロマトグラフィー系を用いて実施した。２つのカラムを系に取り付け、ＰＢＳで平衡にした。この能力研究では、カラムから出る溶液の２８０ｎｍでの吸光度が最初の試料の吸光度の１０％に達するまで（すなわち１０％ブレークスルー）、ＰＢＳ中に０．２５ｍｇ／ｍｌのＰＥＰ０８５１９を含む試料を流量０．２ｍｌ／分（滞留時間２．４分に相当する）で各カラムに装填した。デッドボリューム（すなわち、親和性リガンドを含まないカラムに試料を通すことによって測定した管およびカラム体積）を試料体積から引いた。結合したタンパク質を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ２．３で溶離した。次いで、カラムをＰＢＳで再び平衡にした。

この能力運転後、１ｍｌ／分の流量で５ＣＶの０．２Ｍ ＮａＯＨ、続いて流量なしでインキュベーション期間を適用することによってカラムをアルカリ処理にかけた。アルカリの総インキュベーション時間は、２５分であった。カラムの中和は、１ｍｌ／分で５ＣＶのＰＢＳによる洗浄、上記のような新たな能力測定によって実施した。

さらに２回のアルカリ処理、続いて能力測定を上のように実施したが、ＮａＯＨ濃度を０．５Ｍまで高め、そして最後のアルカリ処理では、インキュベーション時間を２時間まで延長した。

結果
円偏光二色性分析：Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの融点は、５４℃であると決定された。

ＡＢＤ結合Ｚ変異体の溶離ｐＨのクロマトグラフィー研究：活性化ＥＡＨセファロース樹脂に対するＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの結合度は、樹脂ｍｌ当たりポリペプチド２．８ｍｇであると決定された。

図６に示すように、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓ樹脂を含むカラムからのＡＢＤ−融合分子ＰＥＰ０８５１９の溶離は、ＨＳＡセファロース樹脂のカラムからよりも、勾配中でより早期に（すなわちより高いｐＨで）に現れ、それはまた、フロースルー中に現れるより大きな画分ではより低い結合能力を示した。

Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓカラムからの溶出ピークのピーク最大値のｐＨは、３．３であったが、ＨＳＡセファロースカラムの対応するｐＨは、２．６であった。

ＡＢＤ結合Ｚ変異体の結合能力および耐アルカリ性のクロマトグラフィー研究：動的結合能力は、１０％ブレークスルーまでに装填された試料の量を測定することによって決定した。Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓカラムの動的結合能力は、樹脂ｍｌ当たり３．０ｍｇのＰＥＰ０８５１９であると決定された。ＨＳＡセファロースカラムの対応する能力は、樹脂ｍｌ当たり０．５ｍｇと決定された。実施例３中のとおり、固定化ＨＳＡ分子の数は、それらのそれぞれの樹脂上のＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓ分子の数の２倍であると推定されるため、能力の違いをリガンド密度の違いによって説明することはできない。

各アルカリインキュベーション後に動的結合能力を再測定した。結果を図７に示す。Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓカラムは、すべてのインキュベーション後、その最初の能力を維持した。これは、比較的苛酷なアルカリ条件に対する高い耐性を示しており、そしてそれはカラムの反復使用を可能にする定置洗浄（ＣＩＰ）手順にとって重要な特徴である。対照的に、参照として含まれたＨＳＡセファロースカラムでは、０．２Ｍ ＮａＯＨで２５分後にその能力のほとんどが失われた。

実施例５
異なる樹脂に固定化されたＡＢＤ結合Ｚ変異体のカラム研究
本実施例では、ＡＢＤ結合Ｚ変異体Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓを４つの異なるタイプの樹脂に固定化し、そして結合能力および耐アルカリ性をクロマトグラフィー的に評価した。

物質および方法
異なる樹脂に対するＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの結合：凍結乾燥したＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓ（実施例２に記載したとおり産生した）４ｍｇを０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３ １ｍｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３に溶解した。試料の半分をＮＨＳ活性化セファロース４ファーストフロー（NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow）（ＧＥヘルスケア、カタログ番号１７−０９０６）０．６７ｍｌに固定化し、そして試料の半分をＣＮＢｒ活性化セファロース４ファーストフロー（CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow）（ＧＥヘルスケア、カタログ番号１７−０９８１）０．６７ｍｌに固定化した。両結合反応は、製造元による説明書に従って実施した。

凍結乾燥されたＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓ ２ｍｇを、０．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．５に溶解し、そして２時間インキュベートした。ＤＴＴを、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去し、そして還元されたポリペプチドをスルホリンクカップリングレジン（SulfoLink Coupling Resin）０．６７ｍｌと混合した。結合反応は、製造元による説明書に従って実施した。

本実験で評価した第４の樹脂は、実施例４に記載されたＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓで固定化されたＥＡＨセファロースであった。

各樹脂に対する結合度は、実施例３で記載されたとおり決定した。

４つのＡＢＤ結合樹脂の結合能力および耐アルカリ性のクロマトグラフィー研究：４つのＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓ結合樹脂をTricorn 5/50カラムに充填した。動的結合能力を試験し、その後、樹脂を０．５Ｍ ＮａＯＨに２時間、続いて第２の動的結合能力試験にかけた。能力試験およびアルカリインキュベーションは、実施例４に記載されたとおり実施した。

結果
異なる樹脂に対するＡＢＤ結合Ｚ変異体Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの結合：本実験で評価した４つの異なる樹脂のそれぞれに対するＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの固定化の程度を、表５に示す。

４つのＡＢＤ結合樹脂の結合能力および耐アルカリ性のクロマトグラフィー研究：４つの樹脂のそれぞれに対するＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの結合後に決定された動的結合能力を表６に示す。

２つのヨードアセチル結合樹脂、スルホリンクカップリングレジン（SulfoLink Coupling Resin）およびアクチベイテッドＥＡＨセファロース（Activated EAH Sepharose）の動的結合能力は、それぞれ樹脂ｍｌ当たり試料２．３ｍｇおよび３．４ｍｇと決定された。しかし、親和性リガンドのモル当たり結合できる試料のモル量を比較したとき、これらの樹脂は、同じ動的結合能力を示す（試料１．４ｍｏｌ／Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓリガンドのｍｏｌ）。換言すれば、スルホリンク樹脂に結合したＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓでは、ＥＡＨセファロース樹脂に結合したＨｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓと比較して、二量体内の２つのＺ分子は、それぞれより高度に試料分子を結合する。

２つのアミン結合樹脂、すなわちＮＨＳ活性化セファロースおよびＣＮＢｒ活性化セファロースの動的結合能力は、２つのヨードアセチル結合樹脂よりも低かった。これは、ヨードアセチル樹脂への結合に用いたような、単一システインによる部位特異的固定化のため、ＡＢＤ結合Ｚ変異体の結合部位が、移動相中の試料分子に対してより接近可能となることを示している。

ＮＨＳ樹脂が、親和性リガンドをより接近可能にすることによって能力を理論的に改善するスペーサーアームを保持する事実にもかかわらず、ＮＨＳ樹脂の動的結合能力は、ＣＮＢｒ樹脂と比較して半分未満であった。

０．５Ｍ ＮａＯＨで２時間アルカリ処理した後の４つの異なる樹脂の動的結合能力を表７に示す。ヨードアセチル結合樹脂の動的結合能力は、アルカリインキュベーションによって影響を受けなかったが、アミン結合樹脂の能力は約１０％低下した。

実施例６
抗ＡＢＤアガロースの製造
本実施例は、二量体フォーマットで、Ｃ末端Ｃｙｓを有するＡＢＤ結合Ｚ変異体Ｚ００６６７７、すなわち（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓのより大規模な産生、およびスルホリンク樹脂上でのその後の固定化を記載する。

物質および方法
培養および精製：ＡＢＤ結合Ｚ変異体Ｚ０６６７７を、発現がＴ７プロモーターによって調節される発現ベクターに二量体としてサブクローニングした。さらなるＮ末端アミノ酸配列ＧＳＳＬＱおよびさらなるＣ末端アミノ酸配列ＶＤＣを有するＡＢＤ結合ポリペプチドを発現させた。したがって、発現されたポリペプチドは、配列ＧＳＳＬＱ−［Ｚ０６６７７］［Ｚ０６６７７］−ＶＤＣを有する。E. coli BL21(DE3)細胞（ノバゲン（Novagen））をプラスミドで形質転換し、そして５０μｇ／ｍｌのカナマイシンで補充されたＴＳＢ＋ＹＥ培地（酵母エキス入りトリプシンダイズブイヨン）２０ｌ中３７℃で培養した。ＯＤ６００＝１で、最終濃度０．１７ｍＭのＩＰＴＧを加えてタンパク質発現を誘導し、そして培養物を３７℃でさらに５時間インキュベートした。遠心分離によって細胞を集めた。

実施例４および実施例５でわかったように、Ｈｉｓ_６−（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓは、耐アルカリ性であることが立証された。高濃度のＮａＯＨは、細胞破壊および精製の両方に貢献しているため、この性質は、（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの精製に利用され、そしてE. coli宿主タンパク質の大部分は、高いｐＨで変性するが、（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓは溶液中に残る。

Ultra-Turrax T-50 basic（IKA WERKE）を使用して、細胞ペレット１６５ｇを０．５Ｍ ＮａＯＨ １．２ｌ中に再懸濁した。懸濁液を撹拌下、室温で１時間インキュベートし、次いで−２０℃で凍結した。凍結試料を解凍し、２Ｍ ＨＣｌおよびＴｒｉｓ塩基３００ｍｌを最終濃度２０ｍＭまで添加することによってｐＨ８．２に滴定した。細胞残屑、変性したタンパク質およびＤＮＡを、遠心分離によって除去した。清澄化試料に、８００ｍｌ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４．６ｇのＤＴＴ］およびベンゾナーゼ（Benzonase）^(R)（メルク、カタログ番号１．０１６５４．０００１）を、１０Ｕ／ｍｌの最終濃度まで加え、室温で１時間インキュベーションを進行させた。その後、硫酸アンモニウム３００ｇを１Ｍ濃度まで加え、試料を撹拌下、室温で４０分間インキュベートした。硫酸アンモニウムを添加した後に沈殿したタンパク質を遠心分離によって除去し、続いてNalgeneボトルトップフィルター（０．４５μｍ）を通して濾過した。

アセトニトリル（ＡＣＮ）を、２％（ｖ／ｖ）の濃度まで試料に加えた。AEKTAexplorer 100クロマトグラフィー系（ＧＥヘルスケア）を使用して、SOURCE 30 RPC（ＧＥヘルスケア）１２５ｍｌで充填されたFineLine 35カラム（ＧＥヘルスケア）上に試料を装填した。カラムを、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含むミリＱ水中２％ＡＣＮで洗浄し、続いて４％ＡＣＮを含む同一の緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質を、１５ＣＶにわたってＡＣＮ４％から２５％までＡＣＮ濃度を高めることによって溶離した。溶出画分を集め、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳによって分析した。関連画分を貯め、セファデックスＧ−２５（ＧＥヘルスケア）５００ｍｌで充填されたＸＫ−５０カラム（ＧＥヘルスケア）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、それを結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）に移した。緩衝液を交換した試料を、分光測光法により２８０ｎｍで吸光度を測定し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、いくつかの異なる量の（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓを装填し、その後、クマシーブルー（Comassie Blue）で染色して分析した。

樹脂に対するＡＢＤ結合ポリペプチド（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの結合：結合緩衝液中３．４ｍｇ／ｍｌの濃度で（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓを含む試料に、ＤＴＴを２０ｍＭの濃度まで添加し、続いて撹拌下、室温で１時間インキュベーションすることによってこの試料を還元した。セファデックスＧ−２５ ５００ｍｌで充填され、結合緩衝液で予め平衡にしたＸＫ−５０カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによってＤＴＴを除去した。還元された（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓをスルホリンクカップリングレジン（SulfoLink Coupling Resin）（サーモサイエンティフィック、カタログ番号２０４０４）と、樹脂ｍｌ当たり６ｍｇの（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの比率で混合した。その後の結合反応は、製造元による説明書に従って実施したが、タンパク質−樹脂混合物のインキュベーションは、１５分から３５分まで延長した。結合効率は、未結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって推定した。

結果
培養および精製：精製した二量体ＡＢＤ結合Ｚ変異体（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓを分光光度計において２８０ｎｍで吸光度を測定することによって、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓはトリプトファンが欠如しており、２８０ｎｍでの吸光度の測定値が低かった。したがって、Ｚ変異体分子の濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から推定し、それにはいくつかの異なる量の（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓが含まれた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの目視検査により、（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの濃度は、純度約９５％で３．４ｍｇ／ｍｌまでと推定された。

樹脂に対するＡＢＤ結合ポリペプチド（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓの結合：リガンド密度は、結合反応の未結合タンパク質画分において実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを視覚的に調べることによって（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓ５．８ｍｇ／スルホリンクカップリングレジンｍｌと推定された。

製造された（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓ結合樹脂は、さらに「抗ＡＢＤアガロース」と呼ばれ、そして以下の実施例では、様々なサイズおよび機能の異なるタンパク質との融合において異なるアルブミン結合ドメイン部分に対する結合に関して樹脂の広い適用性を示すために使用された。ＡＢＤ部分が標的タンパク質のどこに位置するかに関係なく、精製が成功することが示されている。換言すれば、ＡＢＤ部分は、Ｎ末端に、Ｃ末端に、またはいずれかの側に他のタンパク質部分が隣接するように融合タンパク質内にさえ配置されてもよい。

実施例７
抗ＡＢＤアガロースを用いるＰＥＰ１０９８６の精製
本実施例では、そのＮ末端でタンパク質Ｚのサイトカイン結合変異体に融合したアルブミン結合ドメイン（ＰＰ０１３、配列番号：１６０）を含むＰＥＰ１０９８６（１２．５ｋＤａ）を、抗ＡＢＤアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。

物質および方法
可溶性のＰＥＰ１０９８６を内部に有するペレット状のE. coli細胞を、ベンゾナーゼ（Benzonase）^(R)２０Ｕ／ｍｌで補充されたＴＳＴ−緩衝液（Ｔｒｉｓ、生理食塩水、Ｔｗｅｅｎ：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）中に懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。クロマトグラフィーは、AEKTAexplorer 100系を用いて実施した。清澄化された試料を、抗ＡＢＤアガロース（実施例６に記載されたとおり製造した）１００ｍｌで充填され、ＴＳＴで予め平衡にしたＸＫ−５０カラムに適用した。カラムを８ＣＶのＴＳＴ、続いて８ＣＶの５ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ ｐＨ５．５で洗浄した。結合したタンパク質を、３ＣＶの０．１Ｍ ＨＡｃ（ｐＨ２．９）を適用することによって溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＭＳによるさらなる分析のため、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。

抗ＡＢＤアガロース樹脂の頑健性およびアルカリ安定性を調べるため、上と同じカラムを用いて、数回の精製、それぞれ続いて０．５Ｍ ＮａＯＨの２〜３カラム体積のＣＩＰ（定置洗浄）サイクルを、その後に実施した。

結果
抗ＡＢＤアガロース樹脂におけるＰＥＰ１０９８６の精製からのクロマトグラムを図８Ａに示し、そして選択された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図８Ｂに示す。図８Ｂ中のそれぞれレーン２、３および４に対応する溶出画分Ｅ１、Ｅ２およびＥ３を貯めた。ＰＥＰ１０９８６の正確な質量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって検証し、そして純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断して９５％より高いと推定された。分光光度分析により、貯留物には、精製されたＰＥＰ１０９８６ ９０８ｍｇが含まれており、収率約９０％に相当した。

本実施例中と同じカラムを用いる、ＰＥＰ１０９８６および他のＡＢＤ融合分子のさらなる精製、それぞれ続いて２〜３カラム体積の０．５Ｍ ＮａＯＨのＣＩＰ（定置洗浄）サイクルによって、抗ＡＢＤアガロース樹脂の頑健性およびアルカリ安定性が確認された。２３ＣＩＰサイクル後、能力の有意な低下は、まだ観察されなかった。

実施例８
抗ＡＢＤアガロースを用いるＰＥＰ０３９７３の精製
本実施例では、そのＮ末端でタンパク質ＺのＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）結合変異体に融合した野生型アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ００１、配列番号：１５７）を含むＰＥＰ０３９７３（１２．４ｋＤａ）を、抗ＡＢＤアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。

物質および方法
可溶性のＰＥＰ０３９７３を内部に有するペレット化E. coli細胞を、２０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ^(R)で補充されたＴＳＴ−緩衝液中に懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。AEKTAexplorer 100系を用いてクロマトグラフィーを実施した。清澄化された試料を、抗ＡＢＤアガロース（実施例６に記載したとおり製造した）１００ｍｌで充填され、ＴＳＴで予め平衡にしたＸＫ−５０カラムに適用した。カラムを、５ＣＶのＴＳＴ、続いて３ＣＶの５ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ ｐＨ５．５により洗浄した。結合したタンパク質を、３ＣＶの０．１Ｍ ＨＡｃ（ｐＨ２．９）を適用することによって溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＭＳによるさらなる分析のためフロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。

結果
抗ＡＢＤアガロース樹脂上でのＰＥＰ０３９７３の精製からのクロマトグラムを図９Ａに示し、そして選択された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図９Ｂに示す。図９Ｂ中のそれぞれレーン５、６および７に対応する溶出画分Ｅ２、Ｅ３およびＥ４を貯めた。ＰＥＰ０３９７３の正確な質量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって検証し、そして純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断して９５％より高いと推定された。分光光度分析によれば、貯留物は、精製されたＰＥＰ０３９７３ １０３６ｍｇを含んでおり、収率約９７％に相当した。

実施例９
抗ＡＢＤアガロースを用いるＰＥＰ０６５４８の精製
本実施例では、ＴＮＦ−α（ＴＮＦアルファ）に結合しているタンパク質Ｚの変異体の２つの部分（すなわち二量体）にＮ末端で融合したアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ０３５、配列番号：１５９、Ｃ末端伸長ＶＤＣを有する）を含むＰＥＰ０６５４８（２０．３ｋＤａ）を、抗ＡＢＤアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。また、ＰＥＰ０６５４８は、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグおよびＣ末端システイン残基を含む。

物質および方法
可溶性のＰＥＰ０６５４８を内部に含むペレット化されたE. coli細胞を、２７Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ^(R)で補充されたＴＳＴ−緩衝液中で懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。ＤＴＴを２０ｍＭの最終濃度まで添加し、続いて室温で３０分間インキュベーションしてＰＥＰ０６５４８試料分子のＣ末端システインを還元した。クロマトグラフィーは、AEKTAexplorer 100系を用いて実施した。清澄化および還元された試料を、抗ＡＢＤアガロース９ｍｌで充填され、ＴＳＴで予め平衡にしたＸＫ−１６カラムに適用した。この抗ＡＢＤアガロースのバッチは、樹脂ｍｌ当たり約２．３ｍｇの（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓのより低いリガンド密度を除いて、本質的に実施例６に記載したとおり調製した。カラムを、５．５ＣＶのＴＳＴ、続いて３．３ＣＶの５ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ ｐＨ５．５で洗浄した。結合したタンパク質を、２．９ＣＶの０．１Ｍ ＨＡｃ ｐＨ２．９を適用することによって溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＭＳによるさらなる分析のため画分を集めた。

結果
抗ＡＢＤアガロース樹脂上でのＰＥＰ０６５４８の精製からのクロマトグラムを図１０Ａに示し、溶出画分Ｅ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図１０Ｂに示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断して、純度は９５％より高いと推定された。４０ｋＤａ付近のバンドが、試料分子のＣ末端システイン間の反応によって形成された二量体から誘導されたのは、ほぼ確実である。また、ＰＥＰ０６５４８、および二量体変異体の小さい方の部分の正確な質量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析で確認された。

吸光度測定によれば、樹脂ｍｌ当たり３．７ｍｇの精製されたＰＥＰ０６５４８、すなわち（Ｚ０６６７７）_２−Ｃｙｓリガンド当たりの約１つのＰＥＰ０６５４８分子が得られた。

実施例１０
抗ＡＢＤアガロースを用いるＰＥＰ１７０８１の精製
本実施例では、フォーマットＺ−ＰＥＰ０７９８６−Ｚにおけるタンパク質Ｚのサイトカイン結合部分の２つの部分に融合したアルブミン結合ドメイン（ＰＥＰ０７９８６、配列番号：１６１）を含むＰＥＰ１７０８１（１８．６ｋＤａ）を、抗ＡＢＤアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。その後の精製も記載する。

物質および方法
可溶性のＰＥＰ１７０８１を内部に含むペレット化されたE. coli細胞を、ＴＳＴ−緩衝液中に懸濁した。細胞を、水浴中の熱処理（８３℃、１０分）、続いて氷上での冷却よって破壊した。ベンゾナーゼ^(R)を１５Ｕ／ｍｌの最終濃度まで加えて核酸によって生じた粘度を低減した。細胞残屑を、遠心分離および濾過（０．４５μｍフィルター）によって除去した。

第１の精製ステップは、AEKTApurifier 100系を用いる抗ＡＢＤアガロース親和性クロマトグラフィーによって実施した。清澄化された試料を、抗ＡＢＤアガロース２５ｍｌで充填され、２×ＴＳＴ（すなわちすべての成分を二倍の濃度で含むＴＳＴ緩衝液）で予め平衡にしたＸＫ−２６カラムに適用した。カラムを、５ＣＶの２×ＴＳＴ、続いて８ＣＶの５ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ、ｐＨ５．５で洗浄した。結合したタンパク質を、３ＣＶの０．１Ｍ ＨＡｃ（ｐＨ２．９）を適用することによって溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＭＳによるさらなる分析のため画分を集めた。

第２の精製ステップは、AEKTAexplorer 100系を用いてＲＰＣによって実施した。抗ＡＢＤアガロースカラムから溶出されたタンパク質を１０％の最終濃度までアセトニトリルで補充し、そしてSOURCE 15 RPC（ＧＥヘルスケア）２４ｍｌで充填され、ミリＱ水中の１０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（溶媒Ａ）で予め平衡にしたＨＲ−１６カラム（ＧＥヘルスケア）に装填した。カラムを３．９ＣＶの溶媒Ａで洗浄した。結合した物質を、ミリＱ水中の８０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）の濃度を増大させて５０％溶媒Ｂで終了する１５ＣＶの線形勾配で溶離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＭＳによるさらなる分析のため画分を集めた。

第３の精製および緩衝液交換ステップは、AEKTAexplorer 100系を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって実施した。ＲＰＣカラムから溶出された選択画分を貯め、そしてセファデックスＧ−２５（ＧＥヘルスケア）５００ｍｌで充填されたＸＫ−５０カラム上で緩衝液を１×ＰＢＳに交換した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＭＳによってさらなる分析のため画分を集めた。

結果
抗ＡＢＤアガロース樹脂上でのＰＥＰ１７０８１の精製からのクロマトグラムを図１１Ａに示し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図１１Ｂに示す。

E. coli細胞の熱処理は、細胞破壊ステップおよび精製ステップの両方として作用した。ＰＥＰ１７０８１は、熱に抵抗性であるが、他の多くのE. coliタンパク質はそうではなく、そのため、加熱すると沈澱する。結果として、抗ＡＢＤアガロースカラムに装填された物質は、比較的純粋であった（レーン１、図１１Ｂ）。

大多数のＰＥＰ１７０８１は、抗ＡＢＤアガロース樹脂に結合し、これは、フロースルー試料中のＰＥＰ１７０８１の明らかな欠如によって示される（レーン２、図１１Ｂ）。吸光光度法によれば、溶出された貯留物は、３３０ｍｇのＰＥＰ１７０８１を含み、樹脂ｍｌ当たり１３ｍｇのＰＥＰ１７０８１の結合能力および９５％を超える収率に相当した。溶出されたＰＥＰ１７０８１の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断して９５％より高いと推定された（レーン３、図１１Ｂ）。ＲＰＣおよびＳＥＣによる緩衝液交換後に、さらなる純度の増加が得られた（レーン４、図１１Ｂ）。ＰＥＰ１７０８１の正確な質量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって検証した。

実施例１１
抗ＡＢＤアガロースを用いるタンパク質ホルモンの精製
本実施例では、タンパク質ホルモンにそのＣ末端で融合したアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ０３５、配列番号：１５９）を含むタンパク質１（２２．６ｋＤａ；ｐＩ１０）を、抗ＡＢＤアガロースが充填されたカラムを用いてAEKTAexplorer系において精製した。

物質および方法
タンパク質１を、封入体（inclusion body）の形態で、大腸菌中で発現させた。封入体の可溶化および再折たたみ後、緩衝液交換および精製のため、物質をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に３回かけた。ＴＳＴ中で１：１０希釈されたＰＢＳ中の８ｍｇのＳＥＣ精製タンパク質１を、抗ＡＢＤアガロース１０〜１２ｍｌで充填され、ＴＳＴで予め平衡にしたＸＫ１６／２０カラム（ＧＥヘルスケア）に０．５ｍｌ／分で装填した。カラムを、１ｍｌ／分の流速で、４ＣＶのＴＳＴで洗浄し、続いて５ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ、ｐＨ５．５でさらに３ＣＶ洗浄した。結合したタンパク質を、３ＣＶの０．１Ｍ ＨＡｃ、ｐＨ２．９で溶離し、次いで、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９でｐＨ７に中和した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるさらなる分析のため、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。４〜１２％のBis-Tris NuPAGEゲル（インビトロゲン）は、非還元で運転し、そしてタンパク質をシンプリーブルー（Simply Blue）（ライフテクノロジーズ）で染色した。溶離後、カラムをＴＳＴで再び平衡にし、そして３ＣＶの０．５Ｍ ＮａＯＨ、続いて３ＣＶのＴＳＴにより定置（ＣＩＰ）洗浄した。精製の間、樹脂をＴＳＴ＋２０％のエタノール中に保存した。

結果
抗ＡＢＤアガロース樹脂上でのタンパク質１の精製からのクロマトグラムを図１２Ａに示し、そして選択画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図１２Ｂに示す。抗ＡＢＤアガロースカラム上に装填されたＳＥＣ精製タンパク質１の純度は、高かった。しかし、混在タンパク質の弱いバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で認めることができた。図１２Ｂの矢印を参照のこと。これらの混在物質を、抗ＡＢＤアガロースカラム上の精製によって効果的に排除した。６０倍濃縮された洗浄ステップからの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、そして混在物質を示した（ならびにタンパク質１の漏出；レーン６、図１２Ｂ）。溶出タンパク質試料では混在物質が認められなかった（レーン７〜９、図１２Ｂ）。溶出試料の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から判断して９８％より高いと推定された。溶出されたタンパク質１の正確な質量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって検証された。

ＳＥＣ精製タンパク質１の最初の８ｍｇのうち、抗ＡＢＤアガロースカラムからの溶出画分中に５．４ｍｇを集め、収率約６８％となった。レーン５（図１２Ｂ）に装填されたフロースルー試料にはタンパク質が検出されなかったが、ＴＳＴで洗浄すると、タンパク質１のいくらかの漏出ならびに二量体の除去および混在タンパク質があった。

実施例１２
抗ＡＢＤアガロースを用いるペプチドホルモンの精製
本実施例では、ペプチドホルモンにそのＮ末端で融合したアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ０３５、配列番号：１５９）を含むタンパク質２（９．５ｋＤａ、ｐＩ６．６）を、Pichia Pinkで発現させ、そして抗ＡＢＤアガロースで充填されたカラムを用いるAEKTAexplorer系において一段階で精製した。

物質および方法
分泌されたタンパク質２を含むPichia Pink上清１００ｍｌを凍結乾燥し、そしてＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）２ｍｌ中で再懸濁し、その後、ＴＳＴ２００ｍｌで希釈した。抗ＡＢＤアガロース１０〜１２ｍｌで充填され、ＴＳＴで予め平衡にしたＸＫ１６／２０カラムにおいて１ｍｌ／分で試料を装填した。カラムを８ＣＶのＴＳＴで洗浄し、５ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ、ｐＨ５．５でさらに３ＣＶ洗浄した。培地からの混在タンパク質が高密度であるため、４ＣＶのＴＳＴの通常の洗浄を増やした。結合したタンパク質を、３ＣＶの０．１Ｍ ＨＡｃ、ｐＨ２．９で溶離し、次いで、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９でｐＨ４に調整した。溶離後、カラムをＴＳＴで再び平衡にし、続いてＣＩＰ、そしてＴＳＴ＋２０％エタノール中に貯蔵した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるさらなる分析のため、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。

結果
抗ＡＢＤアガロース樹脂上でのタンパク質２の精製からのクロマトグラムを図１３Ａに示し、そして選択された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図１３Ｂに示す。抗ＡＢＤアガロースカラムから溶出ピークは、タンパク質２を３〜５ｍｇ含み、収率約７５％（ウェスタンブロットから推定する）に相当した。溶出されたタンパク質２の正確な質量は、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって検証した。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、続いてシンプリーブルー染色から判断して９８％より高いと推定された。混在培地タンパク質は、溶出画分中に検出できなかった（レーン７〜１３、図１３Ｂ）。タンパク質２は、ゲル上に含まれる分子量標準によって示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で移動がより小さいことが理解される。

実施態様の項目別に挙げたリスト
１．液体中に存在する少なくとも１つのＡＢＤ含有分子を、液体中の他の成分から分離する方法であって、親和性分離のステップを含み、このステップにおいて、親和性リガンドとして、ＡＢＤ結合モチーフＢＭを含むＡＢＤ結合ポリペプチドを使用し、このモチーフが、
ｉ）ＥＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＡＸ_６Ｘ_７ＥＩＸ_１０Ｘ_１１ＬＰＮＬＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＱＸ_２０Ｘ_２１ＡＦＩＸ_２５Ｘ_２６ＬＸ_２８Ｄ
（配列中、互いに独立して、
Ｘ_２は、Ｆ、ＩおよびＬから選択され；
Ｘ_３は、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_４は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
Ｘ_６は、Ｆ、Ｉ、ＬおよびＹから選択され；
Ｘ_７は、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_１０は、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_１１は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ_１６は、ＮおよびＴから選択され；
Ｘ_１７は、Ｆ、Ｈ、Ｌ、ＳおよびＴから選択され；
Ｘ_１８は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
Ｘ_２０は、Ｈ、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ_２１は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
Ｘ_２５は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、ＶおよびＹから選択され；
Ｘ_２６は、ＫおよびＳから選択され；
Ｘ_２８は、ＤおよびＥから選択される）
および
ｉｉ）ｉ）に定義された配列と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる方法。

２．項目１に記載の方法であって、
ａ）親和性マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合をもたらす条件下で、上記液体を、上記ＡＢＤ結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと；
ｂ）親和性マトリックスに結合してない物質を除去するため親和性マトリックスを洗浄するステップと；
ｃ）任意の結合したＡＢＤ含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてＡＢＤ含有分子の富化含量を含むＡＢＤ含有分子画分を得るステップと；
ｄ）上記ＡＢＤ含有分子画分を回収するステップと
を含む方法。

３．項目１に記載の方法であって、
ａ）親和性マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合をもたらす条件下で、上記液体を、上記ＡＢＤ結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと；
ｂ）親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にＡＢＤ含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと；
ｃ）上記減損された画分を回収するステップと
を含む方法。

４．項目１に記載された方法であって、
ａ）親和性マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合をもたらす条件下で、上記液体を、上記ＡＢＤ結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに提供するステップと；
ｂ）親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にＡＢＤ含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと；
ｃ）結合したＡＢＤ含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてＡＢＤ含有分子含量を含むＡＢＤ含有分子画分を得るステップと；
ｄ）上記ＡＢＤ含有分子画分および上記減損された画分を回収するステップと
を含む方法。

５．バッチ、カラム、拡大床およびそれらの混合物から選択される構成で実施される、項目１〜４のいずれか１項目に記載の方法。
６．カラム構成で実施される、項目５に記載の方法。
７．バッチ構成で実施される、項目５に記載の方法。
８．配列ｉ）のＸ_２がＦおよびＬから選択される、項目１〜７のいずれか１項目に記載の方法。
９．配列ｉ）のＸ_２がＦである、項目８に記載の方法。
１０．配列ｉ）のＸ_２がＬである、項目８に記載の方法。
１１．配列ｉ）のＸ_３がＨ、Ｋ、Ｒ、ＴおよびＶから選択される、項目１〜１０のいずれか１項目に記載の方法。
１２．配列ｉ）のＸ_３がＨ、Ｋ、ＲおよびＶから選択される、項目１１に記載の方法。
１３．配列ｉ）のＸ_３がＫおよびＲから選択される、項目１２に記載の方法。
１４．配列ｉ）のＸ_３がＫである、項目１３に記載の方法。
１５．配列ｉ）のＸ_３がＲである、項目１３に記載の方法。
１６．配列ｉ）のＸ_４がＡ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、ＶおよびＷから選択される、項目１〜１５のいずれか１項目に記載の方法。
１７．配列ｉ）のＸ_４がＨ、Ｌ、ＮおよびＶから選択される、項目１６に記載の方法。
１８．配列ｉ）のＸ_４がＶである、項目１７に記載の方法。
１９．配列ｉ）のＸ_６がＦおよびＬから選択される、項目１〜１８のいずれか１項目に記載の方法。
２０．配列ｉ）のＸ_６がＦである、項目１９に記載の方法。
２１．配列ｉ）のＸ_６がＬである、項目１９に記載の方法。
２２．配列ｉ）のＸ_７がＫ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択される、項目１〜２１のいずれか１項目に記載の方法。
２３．配列ｉ）のＸ_７がＫ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択される、項目２２に記載の方法。
２４．配列ｉ）のＸ_７がＫ、Ｑ、ＲおよびＳから選択される、項目２３に記載の方法。
２５．配列ｉ）のＸ_７がＫおよびＲから選択される、項目２４に記載の方法。
２６．配列ｉ）のＸ_７がＫである、項目２５に記載の方法。
２７．配列ｉ）のＸ_７がＲである、項目２５に記載の方法。
２８．配列ｉ）のＸ_１０がＨ、Ｋ、ＮおよびＲから選択される、項目１〜２７のいずれか１項目に記載の方法。
２９．配列ｉ）のＸ_１０がＨ、ＫおよびＮから選択される、項目２８に記載の方法。
３０．配列ｉ）のＸ_１０がＫ、ＮおよびＲから選択される、項目２８に記載の方法。
３１．配列ｉ）のＸ_１０がＮである、項目２９または３０に記載の方法。
３２．配列ｉ）のＸ_１０がＫおよびＲから選択される、項目３０に記載の方法。
３３．配列ｉ）のＸ_１０がＫである、項目３２に記載の方法。
３４．配列ｉ）のＸ_１０がＲである、項目３２に記載の方法。
３５．配列ｉ）のＸ_１１がＡ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、ＴおよびＹから選択される、項目１〜３４のいずれか１項目に記載の方法。

３６．配列ｉ）のＸ_１１がＡ、Ｆ、ＴおよびＹから選択される、項目３５に記載の方法。３７．配列ｉ）のＸ_１１がＴである、項目３６に記載の方法。
３８．配列ｉ）のＸ_１６がＴである、項目１〜３７のいずれか１項目に記載の方法。
３９．配列ｉ）のＸ_１７がＦ、ＨおよびＬから選択される、項目１〜３８のいずれか１項目に記載の方法。
４０．配列ｉ）のＸ_１７がＦおよびＨから選択される、項目３９に記載の方法。
４１．配列ｉ）のＸ_１７がＨおよびＬから選択される、項目３９に記載の方法。
４２．配列ｉ）のＸ_１７がＦである、項目４０に記載の方法。
４３．配列ｉ）のＸ_１７がＨである、項目４０または４１に記載の方法。
４４．配列ｉ）のＸ_１７がＬである、項目４１に記載の方法。
４５．配列ｉ）のＸ_１８がＤ、Ｈ、Ｉ、ＫおよびＱから選択される、項目１〜４４のいずれか１項目に記載の方法。
４６．配列ｉ）のＸ_１８がＤ、ＨおよびＱから選択される、項目４５に記載の方法。
４７．配列ｉ）のＸ_１８がＨおよびＱから選択される、項目４６に記載の方法。
４８．配列ｉ）のＸ_１８がＨである、項目４７に記載の方法。
４９．配列ｉ）のＸ_１８がＱである、項目４７に記載の方法。
５０．配列ｉ）のＸ_２０がＨおよびＲから選択される、項目１〜４９のいずれか１項目に記載の方法。
５１．配列ｉ）のＸ_２０がＫおよびＲから選択される、項目１〜４９のいずれか１項目に記載の方法。
５２．配列ｉ）のＸ_２０がＲである、項目５０または５１に記載の方法。
５３．配列ｉ）のＸ_２０がＫである、項目５１に記載の方法。
５４．配列ｉ）のＸ_２１がＩおよびＬから選択される、項目１〜５３のいずれか１項目に記載の方法。
５５．配列ｉ）のＸ_２１がＩである、項目５４に記載の方法。
５６．配列ｉ）のＸ_２１がＬである、項目５４に記載の方法。
５７．配列ｉ）のＸ_２５がＩ、ＬおよびＶから選択される、項目１〜５６のいずれか１項目に記載の方法。
５８．配列ｉ）のＸ_２５がＶおよびＩから選択される、項目５７に記載の方法。
５９．配列ｉ）のＸ_２５がＩである、項目５８に記載の方法。
６０．配列ｉ）のＸ_２５がＶである、項目５８に記載の方法。
６１．配列ｉ）のＸ_２６がＫである、項目１〜６０のいずれか１項目に記載の方法。
６２．配列ｉ）のＸ_２８がＤである、項目１〜６１のいずれか１項目に記載の方法。

６３．配列ｉ）が８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのうちの少なくとも４つを満たす：
Ｉ．Ｘ_２は、ＦまたはＬから選択される；
ＩＩ．Ｘ_６は、ＦまたはＬから選択される；
ＩＩＩ．Ｘ_１６は、Ｔである；
ＩＶ．Ｘ_２０は、ＨまたはＲから選択される；
Ｖ．Ｘ_２１は、ＩまたはＬから選択される；
ＶＩ．Ｘ_２５は、ＩまたはＶから選択される；
ＶＩＩ．Ｘ_２６は、Ｋである；および
ＶＩＩＩ．Ｘ_２８は、Ｄである
項目１〜６２のいずれか１項目に記載の方法。

６４．配列ｉ）が８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのうちの少なくとも５つを満たす、項目６３に記載の方法。
６５．配列ｉ）が８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのうちの少なくとも６つを満たす、項目６４に記載の方法。
６６．配列ｉ）が８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのうちの少なくとも７つを満たす、項目６５に記載の方法。
６７．配列ｉ）が８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのすべてを満たす、項目６６に記載の方法。
６８．配列ｉ）が配列番号：１〜５２から選択される、項目１〜６７のいずれか１項目に記載の方法。
６９．配列ｉ）が配列番号：１〜７から選択される、項目６８に記載の方法。
７０．配列ｉ）が配列番号：１〜４から選択される、項目６９に記載の方法。
７１．配列ｉ）が配列番号：１である、項目７０に記載の方法。
７２．上記ＡＢＤ結合モチーフが３−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、項目１〜７１のいずれか１項目に記載の方法。
７３．上記ＡＢＤ結合モチーフが上記３−ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で相互接続するループにより２つのヘリックスの一部を本質的に形成する、項目７２に記載の方法。
７４．上記３−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインが細菌受容体ドメインから選択される、項目７２〜７３のいずれか１項目に記載の方法。
７５．上記３−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインが黄色ブドウ球菌からのプロテインＡのドメインまたはその誘導体から選択される、項目７４に記載の方法。

７６．項目１〜７５のいずれか１項目に記載の方法であって、上記ＡＢＤ結合ポリペプチドが、
ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ Ｘ_ａＸ_ｂＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＸ_ｄＱ；
（配列中、
［ＢＭ］は、項目１および８〜７１のいずれか１項目に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフであり；
Ｘ_ａは、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ_ｂは、ＮおよびＥから選択され；
Ｘ_ｃは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ_ｄは、ＡおよびＳから選択される）
および
ｉｖ）ｉｉｉ）によって定義された配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。

７７．配列ｉｉｉ）のＸ_ａがＡである、項目７６に記載の方法。
７８．配列ｉｉｉ）のＸ_ａがＳである、項目７６に記載の方法。
７９．配列ｉｉｉ）のＸ_ｂはがＮである、項目７６〜７８のいずれか１項目に記載の方法。
８０．配列ｉｉｉ）のＸ_ｂがＥである、項目７６〜７８のいずれか１項目に記載の方法。８１．配列ｉｉｉ）のＸ_ｃがＡである、項目７６〜８０のいずれか１項目に記載の方法。８２．配列ｉｉｉ）のＸ_ｃがＳである、項目７６〜８０のいずれか１項目に記載の方法。８３．配列ｉｉｉ）のＸ_ｃがＣである、項目７６〜８０のいずれか１項目に記載の方法。８４．配列ｉｉｉ）のＸ_ｄがＡである、項目７６〜８３のいずれか１項目に記載の方法。８５．配列ｉｉｉ）のＸ_ｄがＳである、項目７６〜８３のいずれか１項目に記載の方法。８６．配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａがＡであり；Ｘ_ｂがＮであり；Ｘ_ｃがＡであり、そしてＸ_ｄがＡである、項目７６に記載の方法。
８７．配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａがＡであり；Ｘ_ｂがＮであり；Ｘ_ｃがＣであり、そしてＸ_ｄがＡである、項目７６に記載の方法。
８８．配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａがＳであり；Ｘ_ｂがＥであり；Ｘ_ｃがＳであり、そしてＸ_ｄがＳである、項目７６に記載の方法。
８９．配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａがＳであり；Ｘ_ｂがＥであり；Ｘ_ｃがＣであり、そしてＸ_ｄがＳである、項目７６に記載の方法。
９０．配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａがＳであり；Ｘ_ｂがＥであり；Ｘ_ｃがＣであり、そしてＸ_ｄがＡである、項目７６に記載の方法。
９１．配列ｉｉｉ）中、Ｘ_ａがＳであり；Ｘ_ｂがＥであり；Ｘ_ｃがＡであり、そしてＸ_ｄがＡである、項目７６に記載の方法。
９２．配列ｉｉｉ）が配列番号：５３〜１０４のいずれか１つから選択される、項目９１に記載の方法。
９３．配列ｉｉｉ）が配列番号：５３〜５９のいずれか１つから選択される、項目９２に記載の方法。
９４．配列ｉｉｉ）が配列番号：５３〜５６のいずれか１つから選択される、項目９３に記載の方法。
９５．配列ｉｉｉ）が配列番号：５３である、項目９４に記載の方法。

９６．項目１〜７６のいずれか１項目に記載の方法であって、上記ＡＢＤ結合ポリペプチドが、
ｖ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＳＱＡ Ｐ；
（配列中、［ＢＭ］は、項目１および８〜７１のいずれか１項目に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフであり、そしてＸ_ｃは、ＳおよびＣから選択される）および
ｖｉ）ｖ）によって定義された配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む方法。

９７．項目１〜７６のいずれか１項目に記載の方法であって、上記ＡＢＤ結合ポリペプチドが、
ｖｉｉ）ＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＳＥＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；
（配列中、［ＢＭ］は、項目１および８〜７１のいずれか１項目に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフであり、そしてＸ_ｃは、ＡおよびＣから選択される）および
ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）によって定義された配列と少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。

９８．項目１〜７６のいずれか１項目に記載のＡＢＤ結合ポリペプチドであって、上記ＡＢＤ結合ポリペプチドが、
ｉｘ）ＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＡＮＬＬＸ_ｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＡＱＡ Ｐ；（配列中、［ＢＭ］は、項目１および８〜７１のいずれか１項目に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフであり、そしてＸ_ｃは、ＡおよびＣから選択される）および
ｘ）ｉｘ）によって定義される配列に少なくとも８３％の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む方法。

９９．項目７５に記載された方法であって、ＡＢＤ結合ポリペプチドが、
ＡＤＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＳＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＤＡＱＱＮＮＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫＬＮＥＳＱＡＰＫ；
ＡＱＨＤＥ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＮＫＦＮＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＥＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＫＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫＬＮＤＳＱＡＰＫ；
ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ；および
ＡＥＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＫＡＱＡＰＫ
（配列中、［ＢＭ］は、項目１および８〜７１のいずれか１項目に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフである）
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。

１００．項目１〜９９のいずれか１項目に記載の方法であって、上記ＡＢＤ結合ポリペプチドが、
ｘｉ）ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；（配列中、［ＢＭ］は、項目１および８〜７１のいずれか１項目に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフである）および
ｘｉｉ）ｘｉ）に定義された配列と少なくとも８４％の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。

１０１．配列ｘｉ）が配列番号：１０５〜１５６のいずれか１つから選択される、項目１００に記載の方法。
１０２．配列ｘｉ）が配列番号：１０５〜１１１のいずれか１つから選択される、項目１０１に記載の方法。
１０３．配列ｘｉ）が配列番号：１０５〜１０８のいずれか１つから選択される、項目１０２に記載の方法。
１０４．配列ｘｉ）が配列番号：１０５である、項目１０３に記載の方法。
１０５．上記ＡＢＤ結合ポリペプチドが、多量体の形態で存在し、少なくとも２つのＡＢＤ結合ポリペプチド単量体単位を含み、それらのアミノ酸配列が同一または異なってもよい項目１〜１０４のいずれか１項目に記載の方法。
１０６．上記ＡＢＤ結合ポリペプチド単量体単位が一緒に共有結合される、項目１０５に記載の方法。
１０７．ＡＢＤ結合ポリペプチド単量体単位が融合タンパク質として発現される、項目１０５に記載の方法。
１０８．上記ＡＢＤ結合ポリペプチドが、ポリペプチドのＣ末端で、例えばＣ末端でシステイン残基を更に含む、項目１〜１０７のいずれか１項目に記載の方法。

Claims (14)

1. 液体中に存在する少なくとも１つのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）含有分子であって、ＡＢＤが配列番号１６１および１６２から選択されるアミノ酸配列を含む分子を、液体中の他の成分から分離する方法であって、親和性分離のステップを含み、該ステップにおいて、親和性リガンドとして、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）結合モチーフ（ＢＭ）を含むＡＢＤ結合ポリペプチドを使用し、該モチーフが、
   ｉ）ＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ６Ｘ７ＥＩＸ１０Ｘ１１ＬＰＮＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０Ｘ２１ＡＦＩＸ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｄ
   （配列中、互いに独立して、
   Ｘ２は、Ｆ、ＩおよびＬから選択され；
   Ｘ３は、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
   Ｘ４は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；
   Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、ＬおよびＹから選択され；
   Ｘ７は、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
   Ｘ１０は、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され；
   Ｘ１１は、Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹから選択され；
   Ｘ１６は、ＮおよびＴから選択され；
   Ｘ１７は、Ｆ、Ｈ、Ｌ、ＳおよびＴから選択され；
   Ｘ１８は、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され；
   Ｘ２０は、Ｈ、ＫおよびＲから選択され；
   Ｘ２１は、Ｉ、ＬおよびＶから選択され；
   Ｘ２５は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、ＶおよびＹから選択され；
   Ｘ２６は、ＫおよびＳから選択され；
   Ｘ２８は、ＤおよびＥから選択される）
   および
   ｉｉ）ｉ）に定義された配列と少なくとも８９％の同一性を有するアミノ酸配列
   から選択されるアミノ酸配列からなる方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、
   ａ）親和性マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合をもたらす条件下で、前記液体を、前記ＡＢＤ結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと；
   ｂ）親和性マトリックスに結合してない物質を除去するため親和性マトリックスを洗浄するステップと；
   ｃ）任意の結合したＡＢＤ含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてＡＢＤ含有分子の富化含量を含むＡＢＤ含有分子画分を得るステップと；
   ｄ）前記ＡＢＤ含有分子画分を回収するステップと
   を含む方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、
   ａ）親和性マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合をもたらす条件下で、前記液体を、前記ＡＢＤ結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと；
   ｂ）親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にＡＢＤ含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと；
   ｃ）前記減損された画分を回収するステップと
   を含む方法。
4. 請求項１に記載された方法であって、
   ａ）親和性マトリックスに対するＡＢＤ含有分子の結合をもたらす条件下で、前記液体を、前記ＡＢＤ結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに提供するステップと；
   ｂ）親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にＡＢＤ含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと；
   ｃ）結合したＡＢＤ含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてＡＢＤ含有分子含量を含むＡＢＤ含有分子画分を得るステップと；
   ｄ）前記ＡＢＤ含有分子画分および前記減損された画分を回収するステップと
   を含む方法。
5. 配列ｉ）が８つの条件Ｉ〜ＶＩＩＩのうちの少なくとも４つを満たす：
   Ｉ．Ｘ２は、ＦまたはＬから選択される；
   ＩＩ．Ｘ６は、ＦまたはＬから選択される；
   ＩＩＩ．Ｘ１６は、Ｔである；
   ＩＶ．Ｘ２０は、ＨまたはＲから選択される；
   Ｖ．Ｘ２１は、ＩまたはＬから選択される；
   ＶＩ．Ｘ２５は、ＩまたはＶから選択される；
   ＶＩＩ．Ｘ２６は、Ｋである；および
   ＶＩＩＩ．Ｘ２８は、Ｄである
   請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 配列ｉ）が配列番号：１〜５２から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 配列ｉ）が配列番号：１〜７から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＡＢＤ結合モチーフが黄色ブドウ球菌からのプロテインＡのドメインまたはその誘導体から選択される３−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＡＢＤ結合ポリペプチドが、
   ｉｉｉ）Ｋ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳ ＸａＸｂＬＬＸｃ ＥＡＫＫＬ ＮＤＸｄＱ；
   （配列中、
   ［ＢＭ］は、請求項１および５〜７のいずれか１項に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフであり；
   Ｘａは、ＡおよびＳから選択され；
   Ｘｂは、ＮおよびＥから選択され；
   Ｘｃは、Ａ、ＳおよびＣから選択され；
   Ｘｄは、ＡおよびＳから選択される）
   および
   ｉｖ）ｉｉｉ）によって定義された配列と少なくとも８１％の同一性を有するアミノ酸配列
   から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
10. 配列ｉｉｉ）が配列番号：５３〜１０４のいずれか１つから選択される、請求項９に記載の方法。
11. 配列ｉｉｉ）が配列番号：５３〜５９のいずれか１つから選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＡＢＤ結合ポリペプチドが、
    ｘｉ）ＶＤＡＫＹＡＫ−［ＢＭ］−ＤＰＳＱＳＳＥＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ；（配列中、［ＢＭ］は、請求項１および５〜７のいずれか１項に定義されたようなＡＢＤ結合モチーフである）および
    ｘｉｉ）ｘｉ）に定義された配列と少なくとも８４％の同一性を有するアミノ酸配列
    から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
13. 配列ｘｉ）が配列番号：１０５〜１５６のいずれか１つから選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 配列ｘｉ）が配列番号：１０５〜１１１のいずれか１つから選択される、請求項１３に記載の方法。