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JP6363600B2 - 修飾第ｘ因子ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

修飾第ｘ因子ポリペプチドおよびその使用 Download PDF

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JP6363600B2 JP2015524250A JP2015524250A JP6363600B2 JP 6363600 B2 JP6363600 B2 JP 6363600B2 JP 2015524250 A JP2015524250 A JP 2015524250A JP 2015524250 A JP2015524250 A JP 2015524250A JP 6363600 B2 JP6363600 B2 JP 6363600B2
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Description

関連出願
優先権の利益は、２０１２年７月２５日に提出された「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題する米国仮特許出願第６１／７４１，８０６号に対して主張される。
本出願は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題する、本明細書と共に同日に提出された、米国特許出願第１３／８１５，７６８号に関し、これは、米国仮出願第６１／７４１，８０６号に対する優先権を主張する。
上記出願のそれぞれの主題は、その全体が参照によって組み込まれる。
電子的に提供される配列表の参照による組み込み
配列表の電子バージョンは本明細書と共に提出され、この内容はそれらの全体が参照によって組み込まれる。電子ファイルは、サイズが１．６８メガバイトであり、４９４１ＳＥＱＰＣ１．ｔｘｔという名称である。
技術分野
修飾治療用タンパク質が提供される。特に、第Ｘ因子チモーゲン、第Ｘａ因子および他の形態の第Ｘ因子を含む修飾第Ｘ因子ポリペプチド、およびその使用が提供される。
背景
止血は出血の停止につながる複雑な生理学的プロセスである。血小板、血漿タンパク質、および血管内皮細胞はこのプロセスの３つの構成成分であり、それぞれが、組織傷害の直後に起こり、通常の状況下で、血餅の迅速な形成をもたらす事象において重要な役割を果たす。これの中心は、特定の血漿タンパク質（または凝固因子）が、別の以前に活性化された凝固因子により「カスケード」において連続して活性化され、トロンビンの迅速な産生をもたらす一連のタンパク質分解事象である凝固カスケードである。次に、このカスケードにおいて産生された多量のトロンビンは、血餅形成のために必要とされるフィブリンペプチドにフィブリノーゲンを切断するように機能する。第Ｘ因子（ＦＸ）は、出血障害を処置するための治療薬として提案されており、凝固経路におけるその中心の役割のために、他の凝固因子治療薬よりも有利である。ＦＸでの最近の処置は、安全なアプローチであると考えられるので、非活性化チモーゲンの治療上の使用に基づいている。改善されたＦＸ治療薬または代替のＦＸ治療薬が必要とされている。
概要
未修飾ＦＸポリペプチドと比較して、改変した特性または活性、たとえば、増加した補因子（ＦＶａ）依存性、増加した半減期、阻害因子（たとえばアンチトロンビンＩＩＩ）に対する増加した耐性および／または改変したグリコシル化を示す修飾または変異体第Ｘ因子（ＦＸ）ポリペプチドが、本明細書において提供される。本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドは、上記特性または活性のいずれか、または全てを示し得る。修飾ＦＸポリペプチドは、その成熟、チモーゲン、活性または活性化または触媒活性形態であり得る。
たとえば、修飾ＦＸポリペプチドの活性ＦＸ（ＦＸａ）形態が、アミノ酸置換を含まない修飾ＦＸポリペプチドと同じであるＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも２倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、および一般的に少なくとも５０倍増加したＦＶａ補因子依存性を示すように、未修飾ＦＸポリペプチドにおいてアミノ酸置換を含む修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸の配列を有するか、またはそのチモーゲン、活性または触媒活性形態であり、または配列番号：１３４と少なくとも７５％配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するか、またはそのチモーゲン、活性または触媒活性形態である。１つの例において、未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むチモーゲンＦＸポリペプチド、または配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むチモーゲンＦＸポリペプチドと少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列であり得る。別の例において、未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含む活性ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチド、または配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むＦＸａと少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列である。さらなる例において、未修飾ＦＸａポリペプチドは、上記活性ＦＸａに関して触媒活性である。未修飾ＦＸポリペプチドのいずれかは、配列番号：１３４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性、またはそのチモーゲン、活性または触媒活性形態を有し得る。
上記されている、および本明細書における修飾ＦＸポリペプチドの特定の例において、修飾ＦＸポリペプチドの成熟またはチモーゲン形態は、別のセリンプロテアーゼからの異種活性化ペプチドを含まない。他の例において、本明細書において、修飾ＦＸポリペプチドの成熟またはチモーゲン形態は、修飾活性化ペプチドを含まない。本明細書におけるさらなる例において、修飾ＦＸポリペプチドのＦＸａ形態またはその触媒活性部分は、別のセリンプロテアーゼからの異種活性化ペプチドまたは修飾活性化ペプチドを含むチモーゲンＦＸポリペプチドから産生されない。修飾ＦＸポリペプチドは、単離されていてもよく、実質的に精製されていてもよく、または精製されていてもよい。
未修飾ＦＸポリペプチドにおいてアミノ酸置換を含む単離された修飾活性第Ｘ因子（ＦＸａ）ポリペプチドであって、修飾ＦＸポリペプチドの活性ＦＸ（ＦＸａ）形態は、アミノ酸置換を含まない修飾ＦＸポリペプチドと同じであるＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、および一般的に少なくとも５０倍増加したＦＶａ補因子依存性のような、増加した補因子依存性を示す、単離された修飾活性第Ｘ因子（ＦＸａ）ポリペプチドもまた、本明細書において提供される。修飾ＦＸａは、一般的に、活性化ペプチドを含まない。未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むＦＸａと少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列、またはその触媒活性形態を含む活性ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドであり得る。
増加した補因子依存性を示す本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドの例において、補因子依存性は、未修飾ポリペプチドと比較して、少なくとも７５倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍またはそれ以上増加している可能性がある。
配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして位置１９６での天然アミノ酸残基、または未修飾ＦＸポリペプチドにおいてアミノ酸残基１９６に対応する残基が、中性極性アミノ酸残基で置換されているポリペプチドは、本明細書において提供されるかかる修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドに含まれる。例えば、中性極性アミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）およびチロシン（Ｙ）から選択され、一般的にセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）である。対応するアミノ酸残基（すなわち、配列番号：４に記載されているもの以外のＦＸポリペプチドにおける位置１９６に対応するアミノ酸残基）は、配列番号：１３４のポリペプチドと未修飾ＦＸポリペプチドのアラインメントにより同定される。これは図３において例示されている。例えば、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして位置１９６に対応する位置でのＳでのアミノ酸置換または位置１９６に対応する位置でのＴでのアミノ酸置換、または１９６に対応する位置でのＳまたはＴを含まない未修飾ＦＸポリペプチドにおいて対応するアミノ酸残基での同じアミノ酸置換を含む修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。特定の例において、修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして位置１９６に対応する位置でのＳでのアミノ酸置換、または位置１９６に対応する位置でのＳを含まない未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む。
本明細書において提供される、または上記されている修飾ＦＸポリペプチドまたは単離されたＦＸポリペプチドの例において、ポリペプチドは、軽鎖においてまたは重鎖のプロテアーゼドメインにおいてさらなるアミノ酸置換を含むことができる。他の例において、位置１９６での上記アミノ酸置換は、ポリペプチドにおける修飾のみである。したがって、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドは、同じ形態の未修飾ＦＸａポリペプチド、例えば、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸の配列を有する未修飾ポリペプチド、またはそのチモーゲン、活性または触媒活性形態と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のみのアミノ酸置換を含み得る。
本明細書における例において、さらなるアミノ酸置換は、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして位置１９５または１９７に対応する位置でのイソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖａｌａｎｉｎｅ）（Ｖ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）での置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換に対応しない。さらなるアミノ酸置換は、改変したグリコシル化、阻害因子に対する増加した耐性および／または増加した触媒活性をもたらす、与える、または生じることができる。例えば、阻害因子に対する増加した耐性は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する増加した耐性であり得る。
本明細書において特定の例において、本明細書に記載されているまたは上記されている修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドのいずれかは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、２１１、２１４、２１６、２１８、２１９、２７３、２７６、３０６、３２６、３３２、３３８、４２０および４２４から選択される位置に対応するアミノ酸位置でアミノ酸置換を有し、対応するアミノ酸位置は、配列番号：１３４に記載されているポリペプチドと未修飾ＦＸポリペプチドのアラインメントにより同定される。例えば、アミノ酸置換は、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置２１１に対応する位置でのＳ；位置２１４に対応する位置でのＤ；位置２１４に対応する位置でのＡ；位置２１４に対応する位置でのＳ；位置２１６に対応する位置でのＲ；位置２１６に対応する位置でのＫ；位置２１６に対応する位置でのＡ；位置２１６に対応する位置でのＳ；位置２１８に対応する位置でのＲ；位置２１８に対応する位置でのＫ；位置２１８に対応する位置でのＡ；位置２１９に対応する位置でのＨ；位置２７３に対応する位置でのＡ；位置２７３に対応する位置でのＥ；位置２７６に対応する位置でのＡ；位置２７６に対応する位置でのＥ；位置３０６に対応する位置でのＥ；位置３２６に対応する位置でのＳ；位置３２６に対応する位置でのＴ；位置３２６に対応する位置でのＶ；位置３２６に対応する位置でのＱ；位置３２６に対応する位置でのＮ；位置３２６に対応する位置でのＭ；位置３２６に対応する位置でのＫ；位置３２６に対応する位置でのＹ；位置３２６に対応する位置でのＥ；位置３２６に対応する位置でのＤ；位置３３２に対応する位置でのＡ；位置３３２に対応する位置でのＤ；位置３３２に対応する位置でのＥ；位置３３２に対応する位置でのＳ；位置３３２に対応する位置でのＧ；位置３３８に対応する位置でのＡ；位置３３８に対応する位置でのＳ；位置３３８に対応する位置でのＮ；位置３３８に対応する位置でのＲ；位置３３８に対応する位置でのＶ；位置３３８に対応する位置でのＹ；位置３３８に対応する位置でのＭ；位置４２０に対応する位置でのＡ；位置４２０に対応する位置でのＥ；位置４２４に対応する位置でのＡ；または位置４２４に対応する位置でのＥでのアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換であり得る。
例えば、上記のものを含む、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２１４に対応する位置でのＤ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２１４に対応する位置でのＡ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２１４に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２１６に対応する位置でのＲ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２１６に対応する位置でのＫ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２１６に対応する位置でのＡ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２１６に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２１８に対応する位置でのＲ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２１８に対応する位置でのＫ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２１８に対応する位置でのＡ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２７３に対応する位置でのＥ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２７３に対応する位置でのＡ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２７６に対応する位置でのＡ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置２７６に対応する位置でのＥ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３０６に対応する位置でのＥ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３２６に対応する位置でのＥ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３２６に対応する位置でのＤ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３２６に対応する位置でのＭ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３２６に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３２６に対応する位置でのＱ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＡ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＤ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＥ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＧ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３８に対応する位置でのＡ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３８に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置４２０に対応する位置でのＡ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置４２０に対応する位置でのＥ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置４２４に対応する位置でのＡ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置４２４に対応する位置でのＥ；または位置１９６に対応する位置でのＳ、位置４２０に対応する位置でのＥおよび位置４２４に対応する位置でのＥでのアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含むＦＸポリペプチドである。
上記のものを含む、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドにおいて、修飾ＦＸポリペプチドは、非天然グリコシル化部位の導入によりグリコシル化を改変するアミノ酸置換を含み得る。例えば、非天然グリコシル化部位は、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置５１に対応する位置でのＮ；位置５６に対応する位置でのＮおよび位置５８に対応する位置でのＳ；位置６２に対応する位置でのＮおよび位置６４に対応する位置でのＳ；位置６５に対応する位置でのＮおよび位置６７に対応する位置でのＳ；位置６７に対応する位置でのＮ；位置７３に対応する位置でのＮおよび位置７５に対応する位置でのＳ；位置７５に対応する位置でのＮおよび位置７７に対応する位置でのＳ；位置７７に対応する位置でのＮおよび位置７９に対応する位置でのＳ；位置７８に対応する位置でのＮおよび位置８０に対応する位置でのＳ；位置８２に対応する位置でのＳ；位置８３に対応する位置でのＮ；位置８２に対応する位置でのＮおよび位置８４に対応する位置でのＳ；位置８５に対応する位置でのＮおよび位置８７に対応する位置でのＳ；位置８６に対応する位置でのＮおよび位置８８に対応する位置でのＳ；位置９５に対応する位置でのＮおよび位置９７に対応する位置でのＳ；位置１１４に対応する位置でのＮ；位置１１９に対応する位置でのＮおよび位置１２１に対応する位置でのＳ；位置１２２に対応する位置でのＳ；位置２１５に対応する位置でのＮおよび位置２１７に対応する位置でのＳ；位置２４３に対応する位置でのＮおよび位置２４５に対応する位置でのＳ；位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置２９３に対応する位置でのＮおよび位置２９５に対応する位置でのＳ；位置３８８に対応する位置でのＮ；位置３８９に対応する位置でのＮおよび位置３９１に対応する位置でのＳ；位置４２８に対応する位置でのＮおよび位置４３０に対応する位置でのＳ；または位置４２９に対応する位置でのＮおよび位置４３１に対応する位置でのＳでのアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換により導入され得る。
例えば、上記のものを含む、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置５１に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置５６に対応する位置でのＮおよび位置５８に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置５８に対応する位置でのＮおよび位置６０に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置６２に対応する位置でのＮおよび位置６４に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置６５に対応する位置でのＮおよび位置６７に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置６７に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置７３に対応する位置でのＮおよび位置７５に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置７５に対応する位置でのＮおよび位置７７に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置７７に対応する位置でのＮおよび位置７９に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置７８に対応する位置でのＮおよび位置８０に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置８２に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置８３に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置８２に対応する位置でのＮおよび位置８４に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置８５に対応する位置でのＮおよび位置８７に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置８６に対応する位置でのＮおよび位置８８に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置９５に対応する位置でのＮおよび位置９７に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置１１４に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１４に対応する位置でのＮ、位置２１１に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１９に対応する位置でのＮおよび位置１２１に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１４に対応する位置でのＮ、位置１１９に対応する位置でのＮおよび位置１２１に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１４に対応する位置でのＮ、位置１１９に対応する位置でのＮ、位置１２１に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１９に対応する位置でのＮ、位置１２１に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置１２２に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１５に対応する位置でのＮおよび位置２１７に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２４３に対応する位置でのＮおよび位置２４５に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１９に対応する位置でのＮ、位置１２１に対応する位置でのＳ、位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨ、位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１９に対応する位置でのＮ、位置１２１に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨ、位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１４に対応する位置でのＮ、位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１４に対応する位置でのＮ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨ、位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２６４に対応する位置でのＮ、位置２６６に対応する位置でのＳおよび位置３８８に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２９３に対応する位置でのＮおよび位置２９５に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３８８に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１９に対応する位置でのＮ、位置１２１に対応する位置でのＳおよび位置３８８に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１４に対応する位置でのＮ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨおよび位置３８８に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨ、位置２６４に対応する位置でのＮ、位置２６６に対応する位置でのＳおよび位置３８８に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１１９に対応する位置でのＮ、位置１２１に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨおよび位置３８８に対応する位置でのＮ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置３８９に対応する位置でのＮおよび位置３９１に対応する位置でのＳ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置４２８に対応する位置でのＮおよび位置４３０に対応する位置でのＳ；または位置１９６に対応する位置でのＳ、位置４２９に対応する位置でのＮおよび位置４３１に対応する位置でのＳでのアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む修飾ＦＸポリペプチドである。
１つの例において、配列番号：１３７−１５７、１６９、２０５−２０８、２１４−２４３および２４６−２６５のいずれかにおいて記載されているアミノ酸の配列、または配列番号：１３７−１５７、１６９、２０５−２０８、２１４−２４３および２４６−２６５のいずれかにおいて記載されているアミノ酸の配列のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を含む修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。別の例において、配列番号：１３７−１５７、１６９、２０５−２０８、２１４−２４３および２４６−２６５のいずれかの残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖および残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むアミノ酸の配列、または配列番号：１３７−１５７、１６９、２０５−２０８、２１４−２４３および２４６−２６５のいずれかの残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖および残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むアミノ酸の配列のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を含む修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。さらなる例において、配列番号：１３７−１５７、１６９、２０５−２０８、２１４−２４３および２４６−２６５のいずれかの残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖および残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むアミノ酸の配列、または配列番号：１３７−１５７、１６９、２０５−２０８、２１４−２４３および２４６−２６５のいずれかの残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖および残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むアミノ酸の配列のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を含む修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。さらなる例において、修飾を含み、触媒活性を示す上記形態のいずれかの触媒活性形態を含む修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。
配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして１９８、２０２、２１１、２１４、２１７、２１９、３２７および／または３３８である天然アミノ酸残基、またはアミノ酸残基１９８、２０２、２１１、２１４、２１７、２１９、３２７および／または３３８に相当する残基での未修飾ＦＸポリペプチドにおいてアミノ酸置換を含み、それにより修飾ＦＸポリペプチドはＦＶａ依存性触媒活性を示す修飾第Ｘ因子（ＦＸ）ポリペプチドが、本明細書において提供される。かかる例において、対応するアミノ酸残基は、たとえば図３において例示されている、配列番号：１３４のポリペプチドと未修飾ＦＸポリペプチドのアラインメントにより同定される。未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸の配列を有するか、またはそのチモーゲン、活性または触媒活性形態であり、または配列番号：１３４と少なくとも７５％配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するか、またはそのチモーゲン、活性または触媒活性形態である。１つの例において、未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むチモーゲンＦＸポリペプチド、または配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むチモーゲンＦＸポリペプチドと少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列であり得る。別の例において、未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含む活性ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチド、または配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むＦＸａと少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列である。さらなる例において、未修飾ＦＸａポリペプチドは、上記活性ＦＸａに関して触媒活性である。未修飾ＦＸポリペプチドのいずれかは、配列番号：１３４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性、またはそのチモーゲン、活性または触媒活性形態を有し得る。かかる修飾ＦＸポリペプチドは、単離されていてもよく、または実質的に精製されていてもよい。
例えば、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置２０２に対応する位置でのＳ；位置２１１に対応する位置でのＳ；位置２１４に対応する位置でのＤ；位置２１４に対応する位置でのＡ；位置２１４に対応する位置でのＳ；位置２１７に対応する位置でのＳ；位置２１９に対応する位置でのＨ；位置３２７に対応する位置でのＡ；位置３２７に対応する位置でのＬ；位置３３８に対応する位置でのＡ；位置３３８に対応する位置でのＳ；位置３３８に対応する位置でのＮ；位置３３８に対応する位置でのＲ；位置３３８に対応する位置でのＶ；位置３３８に対応する位置でのＹおよび位置３３８に対応する位置でのＭでのアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む。
本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドの特定の例において、修飾ＦＸポリペプチドは、位置２１１に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨでのアミノ酸置換、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む。例えば、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨ；位置１９７に対応する位置でのＡ、位置２１４に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨ；または位置１９５に対応する位置でのＬ、位置２１１に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨでのアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含むものを含む。
本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドの他の例において、修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置３２７に対応する位置でのＡおよび位置３３８に対応する位置でのＡでのアミノ酸置換；または位置３２７に対応する位置でのＬおよび位置３３８に対応する位置でのＭでのアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む。例えば、位置２００に対応する位置でのＶ、位置３２７に対応する位置でのＬおよび位置３３８に対応する位置でのＭでのアミノ酸置換；または位置２００に対応する位置でのＶ、位置３２７に対応する位置でのＬ、位置３３４に対応する位置でのＡおよび位置３３８に対応する位置でのＭでのアミノ酸置換を含む修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。
配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置１９７に対応する位置でのＳ；位置２００に対応する位置でのＡ；位置２００に対応する位置でのＶ；位置３２６に対応する位置でのＳ；位置３２６に対応する位置でのＴ；位置３２６に対応する位置でのＶ；位置３２６に対応する位置でのＮ、位置３２６に対応する位置でのＭ；位置３２６に対応する位置でのＫ；位置３２６に対応する位置でのＹ；位置３２７に対応する位置でのＡ；位置３２７に対応する位置でのＬ；位置３３４に対応する位置でのＡ；位置３３４に対応する位置でのＴ；位置３３４に対応する位置でのＮ；位置３３６に対応する位置でのＥ；位置３３８に対応する位置でのＡ；位置３３８に対応する位置でのＳ；位置３３８に対応する位置でのＮ；位置３３８に対応する位置でのＲ；位置３３８に対応する位置でのＶ；位置３３８に対応する位置でのＹ；および／または位置３３８に対応する位置でのＭ、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換であり、それにより、修飾ＦＸポリペプチドがＦＶａ依存性触媒活性を示す、未修飾ＦＸポリペプチドにおいてアミノ酸置換を含む修飾第Ｘ因子（ＦＸ）ポリペプチドが、本明細書において提供される。かかる例において、対応するアミノ酸残基は、たとえば図３において例示される、配列番号：１３４のポリペプチドと未修飾ＦＸポリペプチドのアラインメントにより同定される。未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸の配列を有するか、またはそのチモーゲン、活性または触媒活性形態であり、または配列番号：１３４と少なくとも７５％配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するか、またはそのチモーゲン、活性または触媒活性形態である。１つの例において、未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むチモーゲンＦＸポリペプチド、または配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および、配列番号：１３４の残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むチモーゲンＦＸポリペプチドと少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列であり得る。別の例において、未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含む活性ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチド、または配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むＦＸａと少なくとも７５％配列同一性を示すアミノ酸の配列である。さらなる例において、未修飾ＦＸａポリペプチドは、上記活性ＦＸａに関して触媒活性である。未修飾ＦＸポリペプチドのいずれかは、配列番号：１３４と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性、またはそのチモーゲン、活性または触媒活性形態を有し得る。かかる修飾ＦＸポリペプチドは、単離されていてもよく、または実質的に精製されていてもよい。
本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドのかかる例において、修飾ＦＸポリペプチドはまた、アミノ酸置換、位置１９６に対応する位置でのＳ、位置１９６に対応する位置でのＩ；位置１９６に対応する位置でのＬ；位置１９６に対応する位置でのＴ；位置３２６に対応する位置でのＡおよび／または位置３２６に対応する位置でのＱを含み得る。
ＦＶａ依存性触媒活性を示すものを含む本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドは、非天然グリコシル化部位の導入によりグリコシル化を改変するアミノ酸置換を含み得る。例えば、非天然グリコシル化部位は、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置５１に対応する位置でのＮ；位置５６に対応する位置でのＮおよび位置５８に対応する位置でのＳ；位置６２に対応する位置でのＮおよび位置６４に対応する位置でのＳ；位置６５に対応する位置でのＮおよび位置６７に対応する位置でのＳ；位置６７に対応する位置でのＮ；位置７３に対応する位置でのＮおよび位置７５に対応する位置でのＳ；位置７５に対応する位置でのＮおよび位置７７に対応する位置でのＳ；位置７７に対応する位置でのＮおよび位置７９に対応する位置でのＳ；位置７８に対応する位置でのＮおよび位置８０に対応する位置でのＳ；位置８２に対応する位置でのＳ；位置８３に対応する位置でのＮ；位置８２に対応する位置でのＮおよび位置８４に対応する位置でのＳ；位置８５に対応する位置でのＮおよび位置８７に対応する位置でのＳ；位置８６に対応する位置でのＮおよび位置８８に対応する位置でのＳ；位置９５に対応する位置でのＮおよび位置９７に対応する位置でのＳ；位置１１４に対応する位置でのＮ；位置１１９に対応する位置でのＮおよび位置１２１に対応する位置でのＳ；位置１２２に対応する位置でのＳ；位置２１５に対応する位置でのＮおよび位置２１７に対応する位置でのＳ；位置２４３に対応する位置でのＮおよび位置２４５に対応する位置でのＳ；位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置２９３に対応する位置でのＮおよび位置２９５に対応する位置でのＳ；位置３８８に対応する位置でのＮ；位置３８９に対応する位置でのＮおよび位置３９１に対応する位置でのＳ；位置４２８に対応する位置でのＮおよび位置４３０に対応する位置でのＳ；または位置４２９に対応する位置でのＮおよび位置４３１に対応する位置でのＳでのアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換により導入され得る。
例えば、位置１１９に対応する位置でのＮ、位置１２１に対応する位置でのＳ、位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨ；位置１１４に対応する位置でのＮ、位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨ；位置１１４に対応する位置でのＮ、位置１１９に対応する位置でのＮ、位置１２１に対応する位置でのＳ、位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳおよび位置２１９に対応する位置でのＨ；位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨ、位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置１１９に対応する位置でのＮ、位置１２１に対応する位置でのＳ、位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨ、位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置１１４に対応する位置でのＮ、位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨ、位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置１１９に対応する位置でのＮ、位置１２１に対応する位置でのＳ、位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨおよび位置３８８に対応する位置でのＮ；位置１１４に対応する位置でのＮ、位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨおよび位置３８８に対応する位置でのＮ；または位置１９６に対応する位置でのＳ、位置２１１に対応する位置でのＳ、位置２１９に対応する位置でのＨ、位置２６４に対応する位置でのＮ、位置２６６に対応する位置でのＳおよび位置３８８に対応する位置でのＮでのアミノ酸置換を含む修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。
非天然グリコシル化部位の導入によりグリコシル化を改変するアミノ酸置換を含むが、ＦＶａ依存性触媒活性を維持しているか、または示す修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。例えば、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置５１に対応する位置でのＮ；位置５６に対応する位置でのＮおよび位置５８に対応する位置でのＳ；位置６２に対応する位置でのＮおよび位置６４に対応する位置でのＳ；位置６５に対応する位置でのＮおよび位置６７に対応する位置でのＳ；位置６７に対応する位置でのＮ；位置７３に対応する位置でのＮおよび位置７５に対応する位置でのＳ；位置７５に対応する位置でのＮおよび位置７７に対応する位置でのＳ；位置７７に対応する位置でのＮおよび位置７９に対応する位置でのＳ；位置７８に対応する位置でのＮおよび位置８０に対応する位置でのＳ；位置８２に対応する位置でのＳ；位置８３に対応する位置でのＮ；位置８２に対応する位置でのＮおよび位置８４に対応する位置でのＳ；位置８５に対応する位置でのＮおよび位置８７に対応する位置でのＳ；位置８６に対応する位置でのＮおよび位置８８に対応する位置でのＳ；位置９５に対応する位置でのＮおよび位置９７に対応する位置でのＳ；位置１１４に対応する位置でのＮ；位置１１９に対応する位置でのＮおよび位置１２１に対応する位置でのＳ；位置１２２に対応する位置でのＳ；位置２１５に対応する位置でのＮおよび位置２１７に対応する位置でのＳ；位置２４３に対応する位置でのＮおよび位置２４５に対応する位置でのＳ；位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；位置２９３に対応する位置でのＮおよび位置２９５に対応する位置でのＳ；位置３８８に対応する位置でのＮ；位置３８９に対応する位置でのＮおよび位置３９１に対応する位置でのＳ；位置４２８に対応する位置でのＮおよび位置４３０に対応する位置でのＳ；または位置４２９に対応する位置でのＮおよび位置４３１に対応する位置でのＳでのアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換により導入される非天然グリコシル化部位を含む修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。
単離されたまたは実質的に精製された形態を含む修飾ＦＸポリペプチドの中で、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のみのアミノ酸置換を含むものが、本明細書において提供される。１つの例において、配列番号：１６４、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９−１８１、１８３−１９０、１９２−２０３、２０５−２０９、２１３、２５９−２６１および２６３−２６５のいずれかにおいて記載されているアミノ酸の配列、または配列番号：１６４、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９−１８１、１８３−１９０、１９２−２０３、２０５−２０９、２１３、２５９−２６１および２６３−２６５のいずれかにおいて記載されているアミノ酸の配列のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を有する修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。別の例において、配列番号：１６４、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９−１８１、１８３−１９０、１９２−２０３、２０５−２０９、２１３、２５９−２６１および２６３−２６５のいずれかの残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖および残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むアミノ酸の配列、または配列番号：１６４、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９−１８１、１８３−１９０、１９２−２０３、２０５−２０９、２１３、２５９−２６１および２６３−２６５のいずれかの残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖および残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むアミノ酸の配列のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を有する修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。さらなる例において、配列番号：１６４、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９−１８１、１８３−１９０、１９２−２０３、２０５−２０９、２１３、２５９−２６１および２６３−２６５のいずれかの残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖および残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むアミノ酸の配列、または配列番号：１６４、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９−１８１、１８３−１９０、１９２−２０３、２０５−２０９、２１３、２５９−２６１および２６３−２６５のいずれかの残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖および残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むアミノ酸の配列のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を有する修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。さらなる例において、上記ポリペプチドのいずれかの触媒活性形態であり、アミノ酸置換を含み、触媒活性を示す修飾ＦＸポリペプチドが、本明細書において提供される。
本明細書において提供される例において、修飾ＦＸポリペプチドは、ＦＸａ形態または触媒活性断片のとき、アミノ酸置換を含まない同じＦＸａポリペプチドと比較して、増加したＦＶａ補因子依存性を示す、ものを含む。例えば、補因子依存性は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１２００倍または１５００倍増加されている。
本明細書において提供される例において、修飾ＦＸポリペプチドは、活性ＦＸ（ＦＸａ）形態または触媒活性的に（ｃａｔａｂｌｙｉｔｉｃａｌｌｙ）活性な断片において、アミノ酸置換を含まない同じＦＸａポリペプチドと比較して、阻害因子、たとえばアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）またはＴＦＰＩに対する増加した耐性を示す、ものを含む。阻害因子耐性は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、４０００倍、４５００倍、５０００倍、５５００倍または６０００倍増加している。
本明細書において提供される例において、修飾ＦＸポリペプチドは、活性ＦＸ（ＦＸａ）形態または触媒活性的に活性な断片において、アミノ酸置換を含まない同じＦＸａの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％またはそれ以上の触媒活性を示す、ものを含む。１つの例において、触媒活性はＦＶａの存在下である。別の例において、触媒活性はＦＶａの非存在下である。
本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドの例において、修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして位置１９５に対応する位置でのロイシン（Ｌ）でのアミノ酸置換、または未修飾ＦＸポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換をさらに含み得る。
本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドの例において、修飾ポリペプチドは、ヒトポリペプチドであってよく、また非ヒトポリペプチドであってよい。いくつかの例において、修飾ＦＸポリペプチドはチモーゲンポリペプチドである。他の例において、修飾ＦＸポリペプチドは、活性であるまたは活性化されている、例えば、修飾ＦＸポリペプチドは、重鎖における活性化ペプチドを欠くまたは含まない。かかる例において、活性化は、ＴＦ／ＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａテナーゼ(tenase)複合体またはラッセルクサリヘビ蛇毒(Russell's Viper Venom)ＦＸ活性化因子によるタンパク質分解性の切断によって達成され得る。いくつかの例において、修飾ＦＸポリペプチドは二重鎖ポリペプチドである。他の例において、修飾ＦＸポリペプチドは一本鎖ポリペプチドである。
本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドの例において、一次配列のみが修飾されている。本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドのいずれかの他の例において、ポリペプチドは、化学修飾または翻訳後修飾をさらに含み得る。例えば、修飾ＦＸポリペプチドは、グリコシル化されている、カルボキシル化されている、ヒドロキシル化されている、硫酸化されている、リン酸化されている、アルブミン化されている、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分にコンジュゲートされている。本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドまたは単離された修飾ＦＸポリペプチドのさらなる例において、ポリペプチドはキメラタンパク質または融合タンパク質である。
上記されているものまたは本明細書において他に記載されているものを含む、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子が、本明細書において提供される。かかる核酸分子を含むベクターもまた、本明細書において提供される。ベクターは、原核生物ベクター、ウイルスベクター、または真核ベクターであり得る。ベクターは、哺乳動物ベクターであり得る。例において、ベクターがウイルスベクターである場合、それは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはサイトメガロウイルスベクターであり得る。
上記核酸分子またはベクターのいずれかを含む単離細胞もまた、本明細書において提供される。細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞は、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）または２９３細胞またはＣＨＯ細胞であり得る。細胞は、修飾ＦＸポリペプチドを発現することができる。したがって、本明細書において提供される細胞によって産生される修飾ＦＸポリペプチドもまた、本明細書において提供される。
薬学的に許容される媒体中に本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチド、本明細書において提供される核酸または本明細書において提供されるベクターのいずれかを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。医薬組成物は、局所的投与、全身投与、または局所投与用に製剤されていてよい。例えば、製剤は、経口投与、経鼻投与、経肺投与、頬側投与、経皮投与、皮下投与、十二指腸内投与、経腸投与、非経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与用に製剤されている。いくつかの例において、医薬組成物は、徐放性用に製剤されている組成物であり得る。他の例において、医薬組成物は、単一投薬量投与用に製剤されている。本明細書において提供される組成物は、活性ＦＸａであり、活性化ポリペプチドを含まないアミノ酸置換を含む修飾ＦＸポリペプチドにおけるあらゆるものを含む。組成物は医薬組成物であり得る。
ａ）配列番号：１３４に記載されているアミノ酸の配列１−１３９、または配列番号：１３４のアミノ酸１−１３９の配列と少なくとも７５％配列同一性を示し、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を有する軽鎖、および配列番号：１３６−２６５のいずれかのアミノ酸１４３−４４８の配列、または配列番号：１３６−２６５のいずれかのアミノ酸１４３−４４８の配列と少なくとも７５％配列同一性を示し、未修飾ＦＸポリペプチドと比較して、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を有する重鎖を含む修飾ＦＸチモーゲンを含む組成物を提供すること；ｂ）チモーゲンの活性化切断によりポリペプチドから活性化ペプチドを取り出し、それにより修飾ＦＸａポリペプチドを産生すること、による、修飾活性第Ｘ因子（ＦＸａ）ポリペプチドを産生する方法が、本明細書において提供される。方法において使用されるＦＸチモーゲンは、配列番号：４−１３３、１３６−２６５および４１７−５４６のいずれかにおいて記載されているポリペプチドをコードする核酸、または配列番号：４−１３３、１３６−２６５および４１７−５４６のいずれかと少なくとも７５％配列同一性を有し、未修飾ＦＸポリペプチドと比較して、アミノ酸置換を含むアミノ酸の配列を有するポリペプチドをコードする核酸の発現により産生される修飾ＦＸチモーゲンを含む。本明細書において提供される方法において、活性化ペプチドの取り出しによる活性化切断は、インビボまたはインビトロにおいて達成され得る。例えば、活性化切断は、ＴＦ／ＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａテナーゼ複合体から選択される活性化因子またはラッセルクサリヘビ蛇毒ＦＸ活性化因子によって達成され得る。本明細書において提供される方法は、組成物から活性化因子を取り出す工程を含むことができる。本明細書における方法はまた、組成物から活性化ペプチドを取り出す工程を含むことができる。
本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドのいずれか、または本明細書において提供される医薬組成物のいずれかを対象に投与することにより、疾患または状態、すなわち出血障害を処置する方法が、本明細書において提供される。方法において使用される修飾ＦＸポリペプチドは、アミノ酸置換を含むそのチモーゲン、ＦＸａまたは触媒活性部分であり得る。本明細書における方法において、ポリペプチドまたは医薬組成物での処置は、疾患または状態と関連する症状を改善または緩和する。本明細書において提供される方法はまた、出血障害と関連する症状における変化について対象をモニタリングすることも含む。
出血障害を処置する本明細書において提供される方法において、出血障害は先天性出血障害または後天性出血障害である。例えば、出血障害は、凝固因子の欠損による障害、凝固因子に対する後天性阻害因子の存在による障害、血液疾患、出血性障害、フォン・ヴィレブランド病、ビタミンＫアンタゴニストを有する抗凝固薬治療に由来する障害、遺伝的血小板障害、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症、ガンマ−カルボキシラーゼ欠損症、外傷と関連する出血、損傷、血栓症、血小板減少症、卒中(stoke)、血液凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症または貯蔵プール欠損症であり得る。例において、出血障害が、凝固因子の欠損によるか、または凝固因子に対する後天性阻害因子の存在による場合、凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩ因子、第ＩＩ因子またはフォン・ヴィレブランド因子である。例において、出血障害が、凝固因子の欠損による場合、凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子であり得る。例えば、出血障害は、血友病Ａ、血友病Ｂまたは血友病Ｃである。
本明細書における方法の例において、出血障害が凝固因子の欠損による場合、障害は家族性多発性凝固因子欠損症（ＦＭＦＤ）である。本明細書における例において、出血障害が凝固因子に対する後天性阻害因子の存在による場合、凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、および第ＸＩＩ因子である。かかる例において、後天性阻害因子は自己抗体である。例えば、出血障害は後天性血友病である。本明細書における方法の例において、出血障害が遺伝的血小板障害である場合、それは、チェディアック・ヒガシ症候群、ハーマンスキー・パドラック症候群、トロンボキサンＡ２機能障害、グランツマン血小板無力症、およびベルナール・スーリエ症候群であり得る。本明細書における他の例において、障害が、ビタミンＫアンタゴニストを有する抗凝固薬治療に由来する場合、ビタミンＫアンタゴニストは、ヘパリン、五糖類、ワルファリン、小分子抗血栓薬およびＦＸａ阻害因子であり得る。
本明細書における方法の他の例において、障害は、血栓症、血小板減少症、卒中および血液凝固障害である。本明細書における方法のさらなる例において、出血障害は、外傷、手術または創傷に由来する。かかる例において、例えば、出血は、急性関節血症、慢性血友病性関節症、血腫、血尿症、中枢神経系出血、消化管出血、または脳出血として見られる。他の例において、出血は抜歯による。本明細書における他の例において、出血障害が手術による場合、手術は、心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳外科手術、血管手術、口腔外科、または臓器移植手術である。例えば、移植手術は、骨髄、心臓、肺、膵臓、または肝臓の移植による。
出血障害を処置ための方法の本明細書における例において、修飾ＦＸポリペプチドは、未修飾ＦＸポリペプチドと比較して、増加した半減期を示すことができる。例えば、増加した半減期は、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した耐性によって、または導入された非天然グリコシル化部位のグリコシル化による高グリコシル化(hyperglycosylation)によって達成される。
出血障害を処置ための方法の本明細書における例において、方法はまた、１つまたは複数のさらなる凝固因子を投与することを含み得る。例えば、１つまたは複数のさらなる凝固因子は、血漿精製凝固因子または組換え凝固因子、ビタミンＫ、ビタミンＫ誘導体、およびプロテインＣ阻害因子などの凝血促進薬、血漿、血小板、赤血球またはコルチコステロイドであり得る。
本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドのいずれかの医薬用途もまた、本明細書において提供される。１つの例において、出血障害を処置することにおける使用のための、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドのいずれかが、本明細書において提供される。他の例において、出血障害の処置のための医薬の製造における、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドのいずれかを含む医薬組成物の使用が、本明細書において提供される。本明細書において提供される医薬用途において、修飾ＦＸポリペプチドは、アミノ酸置換を含むそのチモーゲン、ＦＸａまたは触媒活性形態である。
出血障害を処置するための本明細書において提供される使用または使用のためのポリペプチドにおいて、出血障害は先天性出血障害または後天性出血障害である。例えば、出血障害は、凝固因子の欠損による障害、凝固因子に対する後天性阻害因子の存在による障害、血液疾患、出血性障害、フォン・ヴィレブランド病、ビタミンＫアンタゴニストを有する抗凝固薬治療に由来する障害、遺伝的血小板障害、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症、ガンマ−カルボキシラーゼ欠損症、外傷と関連する出血、損傷、血栓症、血小板減少症、卒中、血液凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症または貯蔵プール欠損症であり得る。例において、出血障害が、凝固因子の欠損によるか、または凝固因子に対する後天性阻害因子の存在による場合、凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩ因子、第ＩＩ因子またはフォン・ヴィレブランド因子である。例において、出血障害が、凝固因子の欠損による場合、凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子であり得る。例えば、出血障害は、血友病Ａ、血友病Ｂまたは血友病Ｃである。
出血障害を処置するための本明細書において提供される使用または使用のためのポリペプチドの例において、出血障害が凝固因子の欠損による場合、障害は家族性多発性凝固因子欠損症（ＦＭＦＤ）である。本明細書における例において、出血障害が、凝固因子に対する後天性阻害因子の存在による場合、凝固因子は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、および第ＸＩＩ因子である。かかる例において、後天性阻害因子は自己抗体である。例えば、出血障害は後天性血友病である。本明細書において提供される使用または使用のためのポリペプチドの例において、出血障害が遺伝的血小板障害である場合、それは、チェディアック・ヒガシ症候群、ハーマンスキー・パドラック症候群、トロンボキサンＡ２機能障害、グランツマン血小板無力症、およびベルナール・スーリエ症候群であり得る。本明細書における他の例において、障害が、ビタミンＫアンタゴニストを有する抗凝固薬治療に由来する場合、ビタミンＫアンタゴニストは、ヘパリン、五糖類、ワルファリン、小分子抗血栓薬およびＦＸａ阻害因子であり得る。
出血障害を処置するための本明細書において提供される使用または使用のためのポリペプチドの他の例において、障害は、血栓症、血小板減少症、卒中および血液凝固障害である。さらなる例において、出血障害は、外傷、手術または創傷に由来する。かかる例において、例えば、出血は、急性関節血症、慢性血友病性関節症、血腫、血尿症、中枢神経系出血、消化管出血、または脳出血として見られる。本明細書における他の例において、出血は抜歯による出血である、本明細書における他の例において、出血障害が手術によるとき、手術は、心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳外科手術、血管手術、口腔外科、または臓器移植手術である。例えば、移植手術は、骨髄、心臓、肺、膵臓、または肝臓の移植による。
出血障害を処置するための本明細書において提供される使用または使用のためのポリペプチドの本明細書における例において、修飾ＦＸポリペプチドは、未修飾ＦＸポリペプチドと比較して、増加した半減期を示すことができる。例えば、増加した半減期は、ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した耐性によって、または導入された非天然グリコシル化部位のグリコシル化による高グリコシル化によって達成される。
包装材料および包装材料内に含有される本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドのいずれかを含む医薬組成物のいずれかを含む製品が、本明細書において提供される。本明細書において提供される製品の例において、修飾ＦＸポリペプチドは、出血障害の処置のために有効であり、包装材料は、修飾ＦＸポリペプチドが出血障害の処置に使用されることを示すラベルを含む。本明細書における医薬組成物のいずれか、組成物の投与のためのデバイスを含み、投与のための説明書を含んでいてもよいキットも、本明細書において提供される。
図１は、ジスルフィド結合により連結された軽鎖および重鎖を含む第Ｘ因子チモーゲン形態の構造的描写である（Venkateswarluら, Biophysical Journal 82:1190-1206 (2002)から採用）。突然変異誘発に対して標的化されるアミノ酸残基は強調されている。 配列番号：１３４に記載されている成熟ヒトチモーゲンを基準にして、軽鎖は１３０アミノ酸（配列番号：１３４の残基１−１３９に対応する）であり、重鎖は３０６アミノ酸（配列番号：１３４の残基１４３−４４８に対応する）である。軽鎖は、γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）−リッチドメイン（配列番号：１３４の残基１−３９に対応する）、次に、短い疎水性スタック(stack)（配列番号：１３４の残基４０−４５に対応する）および２つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン：ＥＧＦ１（配列番号：１３４のアミノ酸４６〜８４に対応する）およびＥＧＦ２（配列番号：１３４のアミノ酸８５〜１２８に対応する）を含む。重鎖は、重鎖のアミノ末端で５２アミノ酸残基活性化を含む。重鎖はまた、配列番号：１３４のＩｌｅ１９５に対応する残基で始まる触媒ドメインを含む。ＦＸの軽鎖および重鎖は、配列番号：１３４に記載されているアミノ酸残基を基準にして（軽鎖の）Ｃｙｓ１３２および（重鎖の）Ｃｙｓ３０２間のジスルフィド結合により連結されているままである。 ＦＸの活性第Ｘ因子（ＦＸａ）形態は、第Ｘ因子チモーゲン形態の構造的特徴を含むが、重鎖部分は活性化ペプチドを欠いており、したがって配列番号：１３４に記載されている成熟第Ｘ因子において疎水性残基Ｉｌｅ１９５−Ｇ１９８に対応する新規Ｎ−末端で開始する触媒ドメインのみ（キモトリプシン様セリンプロテアーゼドメインとも称される；配列番号：１３４の残基１９５−４４８に対応する）を含む。ＦＸａのコンホメーションはまた、配列番号：１３４に記載されている残基に対応する触媒ドメインの内部においてＩｌｅ１９５およびＡｓｐ３７８のα−ＮＨ２基間の塩橋の形成によってＦＸチモーゲンと異なる。塩橋形成は、活性化ドメインの再配列、触媒作用のために必要とされるオキシアニオンホールの形成、および基質結合部位の形成（Ｓ１−Ｓ４）を含む触媒ドメイン構造の数多くの変化と関連する。広範な基質特異性に寄与するエキソサイト（ｅｘｏｓｉｔｅ）領域における残基もまた、暴露される。触媒残基Ｈｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２およびＳｅｒ３７９は、活性プロテアーゼの活性部位触媒３残基(catalytic triad)を構成する。残基を並び替えるコンホメーション変化はまた、ヘパリンに結合するヘパリン結合残基を暴露し、阻害因子ＡＴ−ＩＩＩによる認識を容易にする。
図２は、血液凝固カスケードを示す。図２Ａは、ＦＸａの非依存性産生に関する血液凝固の内因性経路および外因性経路ならびに凝固形成のためにトロンビンおよびフィブリンを生成する共通経路への経路の収束を表している。これらの経路は相互接続している。図は、１つまたは複数のペプチド結合の切断によってチモーゲンが活性型プロテアーゼに転換される活性化カスケードに関与する分子の順序を示す。次いで活性型プロテアーゼは、カスケードにおける次のチモーゲン分子のための活性化プロテアーゼとして作用し、最終的に凝固形成をもたらす。図は、ＦＸａの活性がトロンビンおよびフィブリンの最終産生のためにＦＶａの存在により調節されることを示す（ＦＶａ依存性活性）。ＦＸａ単独はまた、低いレベルでトロンビン活性化することができる（ＦＶａ非依存性活性）。図２Ａは、ＦＶａと独立して果たすことができる凝固経路外の他のＦＸａ活性をさらに示す。図２Ｂは、同じ経路を示し、凝固を阻害することができるアンチトロンビン（ＡＴ−ＩＩＩ）を含む経路の調節因子をさらに示す。
図３は、配列番号：１３４に記載されている成熟ヒトＦＸと他のＦＸポリペプチドの例示的なアラインメントを示す。「＊」は、アラインされた残基が同一であることを意味し、「：」は、アラインされた残基が同一でないが、類似であり、アラインされた位置で保存的アミノ酸残基を含むことを意味し、「．」は、アラインされた残基が類似であり、アラインされた位置で半保存的アミノ酸残基を含むことを意味する。アミノ酸置換についての例示的な非限定的な対応する位置は強調により示される。例えば、図３Ａは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：４０４に記載されているホオジロテナガザル(white-cheeked Gibbon)のアラインメントを示す。図３Ｂは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：４０５に記載されているヒヒＦＸのアラインメントを示す。図３Ｃは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：４０６に記載されているアカゲザルＦＸのアラインメントを示す。図３Ｄは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：４０７に記載されているダスキーティティサル(Dusky titi monkey)ＦＸのアラインメントを示す。図３Ｅは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：４０８に記載されているゾウＦＸのアラインメントを示す。図３Ｆは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：４０９に記載されているマウスＦＸのアラインメントを示す。図３Ｇは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：４１０に記載されているウサギＦＸのアラインメントを示す。図３Ｈは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：４１１に記載されているラットＦＸのアラインメントを示す。図３Ｉは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：４１２に記載されているイヌＦＸのアラインメントを示す。図３Ｊは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：１３５に記載されているＦＸ変異体Ｉ１９５Ｌのアラインメントを示す。図３Ｋは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸと配列番号：５４９におけるアミノ酸残基４１−４８８として記載されているＦＸ変異体活性化ペプチド（Ａｐ）１５２Ｔのアラインメントを示す。
詳細な説明
概要
Ａ．定義
Ｂ．止血および第Ｘ因子機能
１．凝固経路
ａ．組織因子（外因性）凝固経路
ｂ．内因性凝固経路
ｃ．共通経路
２．第Ｖ因子非依存性活性
ａ．トロンビン活性化
ｂ．炎症および細胞増殖
ｉ．エフェクター細胞プロテアーゼ受容体−１（ＥＰＲ−１）
ｉｉ．プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）
３．第Ｘ因子阻害因子
Ｃ．第Ｘ因子構造および活性化
１．プロセッシングおよび構造
２．活性化
３．生物製剤としてのＸおよびＸａ因子
Ｄ．修飾第Ｘ因子ポリペプチド
Ｅ．第Ｘ因子ポリペプチドの産生
１．ベクターおよび細胞
２．発現系
ａ．原核生物発現
ｂ．酵母
ｃ．昆虫および昆虫細胞
ｄ．哺乳動物細胞
ｅ．植物
２．精製
３．融合タンパク質
４．ポリペプチド修飾
５．ヌクレオチド配列
Ｆ．修飾第Ｘ因子活性の評価
１．インビトロアッセイ
２．非ヒト動物モデル
３．臨床アッセイ
Ｇ．製剤および投与
１．製剤
ａ．投薬量
ｂ．剤形
２．修飾ＦＶＸポリペプチドの投与
３．修飾ＦＶＸポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子療法）
Ｈ．治療上の使用
Ｉ．併用療法
Ｊ．製品およびキット
Ｋ．実施例
Ａ．定義
他に特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、発明（複数可）が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書における全開示を通して言及される全ての特許、特許出願、公開出願、および刊行物、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、データベース、ウェブサイト、ならびに他の出版物は、他に特に述べられない限り、それらの全体が参照によって組み込まれる。本明細書における用語について、複数の定義がある場合、このセクションにおける定義が優先される。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスが参照される場合、そのような識別子は、変化し得、また、インターネット上の特定の情報は移り変わり得るが、等価な情報は、インターネットを検索することによって見出すことができることを理解されたい。それに対する参照は、そのような情報の有用性および公的な普及を証明する。
本明細書において使用されるように、凝固経路または凝固カスケードは、不溶性フィブリン血餅の形成に至る、一連の活性化事象を指す。凝固カスケードまたは凝固経路において、セリンプロテアーゼの不活性タンパク質（チモーゲンとも呼ばれる）は、１つまたは複数のペプチド結合の切断によって活性プロテアーゼに変換され、次いで、これは、カスケードにおける次のチモーゲン分子のための活性化プロテアーゼとして働く。カスケードの最終タンパク質分解工程において、フィブリノーゲンは、トロンビンによってフィブリンにタンパク質分解によって切断され、次いで、これは、傷害の部位で架橋して、血餅を形成する。
本明細書において使用されるように、「止血」は、器官または身体部分における出血または血流の停止を指す。止血という用語は、血管傷害の後の失血を予防するための血液凝血から続く組織修復の後の血餅の溶解の全プロセスを包含することができる。
本明細書において使用されるように、「凝血」または「凝固」は、不溶性フィブリン血餅の形成を指すまたは血液の凝固因子が、凝固カスケードにおいて相互作用し、不溶性フィブリン血餅の形成を最終的にもたらすプロセスを指す。
本明細書において使用されるように、「プロテアーゼ」は、共有結合性のペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。これらの名称は、チモーゲン形態ならびにその活性化単鎖形態、活性化二重鎖形態、および活性化多重鎖形態を含む。明確にするために、プロテアーゼに対する言及は、全ての形態を指す。プロテアーゼは、たとえば、それらの活性部位の触媒活性および標的基質のペプチド結合を切断するメカニズムに依存して、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼを含む。
本明細書において使用されるように、セリンプロテアーゼまたはセリンエンドペプチダーゼは、酵素の活性部位におけるセリン残基の存在によって特徴づけられるペプチダーゼのクラスを指す。セリンプロテアーゼは、原核生物および真核生物における消化酵素として機能するだけではなく、血液凝血および炎症を含む体内における広範囲の機能に参加する。セリンプロテアーゼによる切断のメカニズムは、セリンによる、標的ペプチド結合の求核攻撃に基づく。システイン、トレオニン、もしくはアスパラギン酸と結合した水分子または金属もまた、この役割を果たすことができる。セリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸の一列に並んだ側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通の触媒３残基を形成する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合するくぼみとして形づくられる。
本明細書において使用されるように、第Ｘ因子（ＦＸ）またはＦＸポリペプチドは、活性形態のとき、プロトロンビンに対する触媒活性（すなわちプロトロンビン合成活性）を示すセリンプロテアーゼポリペプチドを指す。ＦＸは、凝固経路の一員であるセリンプロテアーゼであり、具体的には、一般的な凝固経路における第１のセリンプロテアーゼである。ＦＸは、前駆体ポリペプチド（たとえば配列番号：２に記載されている）から細胞において処理され、プロペプチド領域を含むポリペプチドを生じ、これは、結局は切断され、シグナル配列およびプロペプチドを欠いている成熟ポリペプチド（たとえば配列番号：１３４に記載されている）を産生する。分泌ＦＸポリペプチドは二重鎖ポリペプチドである。ＦＸポリペプチドは、不活性チモーゲンまたは活性第Ｘ因子（ＦＸａ）を含む。活性ＦＸａは、活性化ペプチドを欠いている。ＦＸａは、その補因子第Ｖａ因子へ活性ＦＸ（ＦＸａ）が結合すると非常に増加する触媒活性を示すＦＸの形態である。ＦＸａ活性はまた、Ｃａ＋＋およびリン脂質の包含により増強される。本明細書において提供されるように、ＦＸａ形態の、ＦＶａ補因子の存在下で完全に活性な形態において、プロトロンビンに対する触媒活性を示すチモーゲン様形態へのコンホメーション変化をもたらす変異が、導入され得る。したがって、本明細書においてＦＸまたはＦＸポリペプチドへの言及は、全ての形態を含み、これは、それらの前駆体、単一の一本鎖および二本鎖形態、例えば、成熟形態、チモーゲン形態、ＦＸａ形態、例えば、チモーゲン様形態、またはそれらの触媒活性部分を含む。
ＦＸへの言及は、ヒトＦＸポリペプチド、例えば、配列番号：２に記載されている前駆体ポリペプチド、および一本鎖および二本鎖形態、例えば、成熟形態、チモーゲン形態、ＦＸａ形態、例えば、チモーゲン様形態、またはそれらの触媒活性形態を含む。例えば、シグナル配列およびプロペプチド領域を欠いている成熟ＦＸは、配列番号：１３４に記載されている。そのチモーゲン形態は、１３０アミノ酸軽鎖（配列番号：１３４の残基１−１３９に対応する）および３０６アミノ酸重鎖（配列番号：１３４の残基１４３−４４８に対応する）を含む二重鎖形態である。そのＦＸａ形態は、１３０アミノ酸重鎖（配列番号：１３４の残基１−１３９に対応する）および重鎖（配列番号：１３４のアミノ酸残基１９４−４４８に対応する）を含む二重鎖形態、またはその触媒活性形態である。述べられているように、ＦＸはまた、補因子ＦＶａの非存在下でチモーゲンのようであるＦＸａを含む修飾形態を含む。
ＦＸに対する言及はまた、その変異体、たとえば対立遺伝子変異体および種変異体、スプライス変異体によってコードされる変異体、および他の変異体、例えば、配列番号：２に記載されている前駆体ポリペプチドと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド、またはそれらの成熟形態、チモーゲン形態またはＦＸａ形態を含む。かかる変異体は、ＦＶａ結合、触媒活性、プロトロンビン結合、プロトロンビナーゼ活性および／または血液凝固活性を含むが、これらに限定されない１つ以上のＦＸ活性を示す、その任意のＦＸａ形態、または触媒部分を含む。活性は、天然型または野生型第Ｘ因子の活性と比較して、減少または増加され得る。例えば、ＦＸポリペプチドは、ＦＸａ形態または触媒活性部分が、天然型または野生型ＦＸａポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％またはそれ以上を示すポリペプチドを含む。例示的な変異体は、ヒト（配列番号：２に記載されており、配列番号：１によってコードされる前駆体プレプロペプチド；および配列番号：１３４に記載されている成熟形態）、キタホオジロテナガザル（Northern White-Cheeked Gibbon）（配列番号：３９３に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０４に記載されている成熟形態）、アヌビスヒヒ(Olive Baboon)（配列番号：３９４に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０５に記載されている成熟形態）、アカゲザル（配列番号：３９５に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０６に記載されている成熟形態）、ダスキーティティサル（配列番号：３９６に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０７に記載されている成熟形態）、アフリカゾウ(African elephant)（配列番号：３９７に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０８に記載されている成熟形態）、マウス（配列番号：３９８に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０９に記載されている成熟形態）、ウサギ（配列番号：３９９に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４１０に記載されている成熟形態）、ラット（配列番号：４００に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４１１に記載されている成熟形態）、イヌ（配列番号：４０１に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４１２に記載されている成熟形態）、ブタ（配列番号：４０２に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４１３に記載されている成熟形態）、およびウシ（配列番号：４０３に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４１４に記載されている成熟形態）を含むが、これらに限定されない種変異体を含む。例示的な変異体はまた、配列番号：５４７−５５２に記載されている変異体を含むが、これらに限定されないヒトＦＸの対立遺伝子変異体を含む（Cargillら (1999) Nat. Gen., 22:231-238）。
本明細書において使用されるように、前駆体ＦＸポリペプチドは、分泌のためのタンパク質を標的化するＮ−末端シグナルペプチドおよびプロペプチドを含むＦＸポリペプチドの非分泌形態を指す。シグナルペプチドは、小胞体において開裂される。例示的なＦＸ前駆体ポリペプチドは、配列番号：２に記載されているポリペプチド、またはその対立遺伝子もしくは種変異体または他の変異体、たとえば配列番号：３９３−４０３または５４７−５５２に記載されているものである。
本明細書において使用されるように、「プロ領域」、「プロペプチド」、または「プロ配列」は、切断されて、成熟タンパク質を産生する領域またはセグメントを指す。プロ領域は、成熟した生物学的活性ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸の配列であり、少数のアミノ酸ほどの小さなものとすることができるまたは多重ドメイン構造とすることができる。ＦＸポリペプチドにおいて、プロペプチド領域は、一般的に約９個のアミノ酸であるが、種に依存して変化し得る（たとえば、より長く、またはより短く）。ＦＸにおいて、プロペプチド配列は、タンパク質の翻訳後修飾において機能し、細胞からのタンパク質の分泌前に開裂される。例えば、プロペプチドは、小胞体におけるビタミンＫ−依存性カルボキシラーゼによるγ−カルボキシル化のための認識要素である。該反応は、Ｇｌａドメインにおけるグルタミン酸残基のγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）への変換により起こる。この修飾は、血中のチモーゲンの最適なＣａ２＋−媒介活性化のために必要とされる。例えば、ｇｌａ残基は、第Ｘ／Ｘａ因子がカルシウム依存的にリン脂質（すなわち細胞表面）に結合することを可能にし、これは、プロトロンビナーゼ複合体のアッセンブリーのために必要条件である。例示的なプロペプチドまたはプロ領域は、配列番号：２のアミノ酸３２−４０に対応する。
本明細書において使用されるように、ＦＸのプロペプチド形態は、シグナルペプチドを欠くが、プロペプチドを保持しているタンパク質である。例えば、配列番号：２に記載されているヒトＦＸに対する例示で、プロペプチドは、配列番号：２のアミノ酸３２−４０に対応する９個のアミノ酸プロペプチドである。したがって、ＦＸの例示的なプロペプチド形態は、配列番号：２のアミノ酸３２−４８８として記載されているヒトＦＸ、またはその対立遺伝子変異体および種変異体を含む変異体である。
本明細書において使用されるように、「成熟ＦＸポリペプチド」は、シグナル配列およびプロペプチド配列を欠くＦＸポリペプチドを指す。プロペプチドは、ポリペプチドの分泌の前に、トランスゴルジ装置(trans-Golgi apparatus)におけるタンパク質分解切断により除去される。例示的な成熟ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されており、その変異体、たとえば、種変異体および対立遺伝子変異体も含む。例えば、例示的なかかる変異体は、配列番号：４０４−４１４のいずれかにおいて記載されている。成熟ＦＸポリペプチドは、一般的に、二重鎖ポリペプチドを産生するための鎖内タンパク質分解前のＦＸの一本鎖形態を示す。
本明細書において使用されるように、チモーゲンは、通常、血漿中で存在するＦＸポリペプチドの二重鎖不活性形態を示す。二重鎖形態は、軽鎖が重鎖から開裂されるように、重鎖および軽鎖間の残基Ａｒｇ１４０−Ａｒｇ１４２（配列番号：１３４に記載されている残基に対応する）を除去する鎖内切断によって産生される。これは、循環への分泌中または該分泌後に起こる。チモーゲンは、重鎖のＮ−末端での活性化ペプチドの存在のために、活性形態よりも大型である。ＦＸについて、チモーゲンは、γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）−リッチドメインおよび２つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインを含む軽鎖を含む。重鎖は、アミノ酸（たとえば配列番号：１３４におけるＣｙｓ１３２およびＣｙｓ３０２）間のジスルフィド結合により軽鎖に連結される。重鎖は、Ｎ−末端で５２個のアミノ酸残基活性化ペプチド（たとえば配列番号：１３４におけるアミノ酸残基Ｓｅｒ１４３からＡｒｇ１９４）を含む。重鎖はまた、セリンプロテアーゼドメイン（たとえば配列番号：１３４の残基Ｉｌｅ１９５からＬｙｓ４４８）を含み、これは触媒３残基を有するセリンプロテアーゼドメイン（たとえば配列番号：１３４におけるＨｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２およびＳｅｒ３７９、およびキモトリプシンナンバリングによってＨｉｓ５７、Ａｓｐ１０２およびＳｅｒ１９５に対応する）を含む。チモーゲン形態は、一般的に、不活性であり、活性化ペプチドセグメントを除去する触媒切断によって活性ポリペプチドに変換され得る。したがって、チモーゲンは、活性化因子の作用によってタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質である。
本明細書において使用されるように、活性化ペプチドは、触媒機構を遮蔽し、したがって、触媒中間体の形成を予防することによって（つまり基質結合部位を立体的に閉鎖することによって）、タンパク質分解活性を抑制するように機能するＦＸ重鎖のＮ−末端で存在するセグメントを指す。例示的なＦＸ活性化ペプチドは、配列番号：１３４におけるアミノ酸残基Ｓｅｒ１４３からＡｒｇ１９４に対応する成熟ＦＸポリペプチドの重鎖のＮ−末端での５２個のアミノ酸残基活性化ペプチドである。
本明細書において使用されるように、修飾活性化ペプチドは、未修飾第Ｘ因子ポリペプチドまたは天然第Ｘ因子ポリペプチドの活性化ペプチドと比較して、例えば、１つまたは複数のアミノ酸差異の存在によって、ＦＸポリペプチドに対して天然ではない活性化ペプチドを指す。１つまたは複数のアミノ酸差異は、１つもしくは複数のアミノ酸置換（交換）、アミノ酸挿入、もしくはアミノ酸欠失などのようなアミノ酸突然変異とすることができるまたは、挿入もしくは欠失およびその任意の組合せとすることができる。例えば、修飾活性化ペプチドは、未修飾または天然ＦＸポリペプチドの活性化ペプチドと比較して（たとえば配列番号：１３４におけるＳｅｒ１４３からＡｒｇ１９４として記載されているアミノ酸残基の配列と比較して）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０またはそれ以上のアミノ酸差異を有することができるものである。例示的なアミノ酸修飾は、未修飾または天然（たとえば野生型）ＦＸポリペプチドにおいて存在しないプロテアーゼ処理部位をもたらす修飾である。例えば、修飾は、天然型または野生型ＦＸポリペプチドの別のプロテアーゼからの異種活性化ペプチドでの置換を含む。
本明細書において使用されるように、修飾活性化ペプチドを含まない修飾ＦＸポリペプチドへの言及は、ポリペプチドの活性化ペプチドが未修飾第Ｘ因子ポリペプチドまたは天然第Ｘ因子ポリペプチドの活性化ペプチドと比較して異なっていないことを意味する。例えば、修飾ＦＸポリペプチドが活性化ペプチドを含む態様において、それは、天然型または野生型活性化ペプチドを含む。したがって、修飾活性化ペプチドを含まない本明細書における修飾ＦＸポリペプチドへの言及は、そこにおける修飾（たとえばアミノ酸置換）が軽鎖または重鎖のプロテアーゼドメインのみ、一般的に重鎖のプロテアーゼドメインのみであることを意味する。
本明細書において使用されるように、活性ＦＸ（ＦＸａ）または活性化ＦＸは、重鎖がＮ−末端活性化ペプチドを含まないＦＸポリペプチドの二重鎖形態を指す。ＦＸａは、活性化ペプチドを除去する重鎖の切断により活性化される。したがって、ＦＸａは、ジスルフィド結合によって連結された２つの鎖からなるヘテロダイマーである。ヒトＦＸについて、軽鎖は、約１６，０００ダルトンの分子量を有し、配列番号：１３４のアミノ酸の配列１−１３９からなり、重鎖は、約３８，０００ダルトンの分子量を有し、セリンプロテアーゼドメインを作り上げる配列番号：１３４のアミノ酸残基Ｉｌｅ１９５からＬｙｓ４４８からなる。ＦＸの活性化は、活性化ペプチドを放出するＡｒｇ１９４−Ｉｌｅ１９５結合の切断によって起こる。活性化は、外因性第Ｘａｓｅ因子複合体（第ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体）または内因性第Ｘａｓｅ因子複合体（ＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ複合体）により成し遂げられる。活性化は、一般的に、リン脂質およびカルシウムイオンの存在を必要とする。活性化はまた、ラッセルクサリヘビ毒（ＲＶＶ−Ｘ）により成し遂げることができる。ＦＸａは、触媒活性、ＦＶａ結合、ヘパリン結合、プロトロンビン結合、プロトロンビナーゼ活性および／または血液凝固活性を示す。本明細書における目的上、ＦＸａへの言及は、活性化ペプチドを欠いており、触媒活性、ＦＶａ結合、ヘパリン結合、プロトロンビン結合、プロトロンビナーゼ活性および／または血液凝固活性のようなＦＸａ活性を示すことができる任意のＦＸ二重鎖形態を指す。したがって、ＦＸａへの言及は、飽和濃度のＦＶａの存在下で、ＦＸａ活性を示すチモーゲン様ＦＸａポリペプチドを含む。
本明細書において使用されるように、ＦＸａポリペプチドの「触媒活性部分」は、触媒３残基（たとえば配列番号：１３４におけるＨｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２およびＳｅｒ３７９、およびキモトリプシンナンバリングによるＨｉｓ５７、Ａｓｐ１０２およびＳｅｒ１９５に対応する）を含むが、配列番号：１３４のアミノ酸残基Ｉｌｅ１９５からＬｙｓ４４８に対応する重鎖の全長を含まない重鎖のアミノ酸の隣接する部分を含む活性ＦＸａポリペプチドを指す。触媒活性部分はまた、ＦＸａの軽鎖のすべてまたは一部を含み得る。ＦＸａポリペプチドの触媒活性部分は、完全長ＦＸａと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の活性、たとえば、少なくとも１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上の活性を示す。本明細書において修飾ＦＸａまたはその触媒活性部分への言及は、触媒活性部分が修飾（たとえばアミノ酸置換）を含むことを意味すると理解される。
本明細書において使用されるように、ラッセルクサリヘビ毒（ＲＶＶ−Ｘ）は、具体的に第Ｘ因子を特異的に活性化するＶｉｐｅｒａ ｒｕｓｓｅｌｌｉ（ラッセルクサリヘビ）の毒メタロプロテアーゼを指す（Takeyaら (1992) J Biol. Chem., 267:14109-14117）。ＲＶＶ−Ｘは、約７９，０００ダルトンの分子量を有し、ジスルフィド結合された重鎖および軽鎖を含む。ＲＶＶ−Ｘは、第Ｘ因子活性化のためにリン脂質を必要とせず、活性化の増強のための外因性Ｃａ２＋およびアミノ末端Ｇｌａドメインの存在を必要としない。ＲＶＶ−Ｘの活性は、ＥＤＴＡの存在下で阻害される。ヘビ毒プロテアーゼの精製された調製物は、知られており利用でき（たとえばCatalog No. RVVX-2010, Haematologic Technologies, Inc.; Catalog No. ab62233; Abcam, Cambridge, MA参照）、その配列も知られている（たとえばTakeyaら (1992) J Biol. Chem., 267:14109-14117およびUniprot No. Q7LZ61、Q4PRD1およびQ4PRD2参照）。
本明細書において使用されるように、「チモーゲン様」タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質分解切断により活性化されているが、補因子の非存在下で、チモーゲンと関連する特性、たとえば、低い活性または活性なし、またはコンホメーションまたはそのコンホメーションと似ている生じる活性またはタンパク質のチモーゲン形態の生じる活性をまだ示すタンパク質を指す。例えば、本明細書において提供される修飾ＦＸａポリペプチドについて、ＦＶａ補因子に結合しないとき、ＦＸａの二重鎖活性化形態はチモーゲン様タンパク質である。それは非常に低い活性を示す。ＦＶａに結合すると、ＦＸａの二重鎖活性化形態は、コンホメーション変化または「コンホメーション平衡」におけるシフトを受け、凝固因子としての完全な活性を獲得する。
本明細書において使用されるように、ＦＸに関する「野生型」または「天然」は、自然界においてヒトおよび他の動物を含む生物において存在する対立遺伝子変異体を含む天然ＦＸ遺伝子または天然に存在するＦＸ遺伝子を指す。言及が野生型または天然ＦＸａポリペプチドに対する場合、これは、ＦＸａポリペプチドの活性部分または触媒活性部分であると理解される。種に無関係の野生型第Ｘ因子に対する言及は、任意の種の野生型第Ｘ因子を包含するように意図される。コード前駆体ポリペプチド、その断片、ならびにシグナルペプチドおよびプロペプチドを欠く成熟形態、ならびにその任意の翻訳前または翻訳後処理形態または修飾形態などのようなその処理形態が、野生型ＦＸポリペプチドの中に含まれる。グリコシル化、カルボキシル化およびヒドロキシル化による修飾を含むが、これらに限定されない、翻訳後修飾されるものもまた、天然ＦＸポリペプチドの中に含まれる。天然ＦＸポリペプチドはまた、チモーゲンを含む二重鎖分泌形態および活性形態、ならびにその任意の処理形態またはアイソフォームをも含む。例えば、ヒトは、天然ＦＸを発現する。野生型ヒトＦＸのアミノ酸配列は、配列番号：２に記載されており、本明細書に記載されているその成熟、チモーゲン、活性および触媒活性形態、および配列番号：５４７−５５２に記載されている対立遺伝子変異体およびその成熟、チモーゲン、活性および触媒活性形態を含む。キタホオジロテナガザル（配列番号：３９３に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０４に記載されている成熟形態）、アヌビスヒヒ（配列番号：３９４に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０５に記載されている成熟形態）、アカゲザル（配列番号：３９５に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０６に記載されている成熟形態）、ダスキーティティサル（配列番号：３９６に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０７に記載されている成熟形態）、アフリカゾウ（配列番号：３９７に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０８に記載されている成熟形態）、マウス（配列番号：３９８に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４０９に記載されている成熟形態）、ウサギ（配列番号：３９９に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４１０に記載されている成熟形態）、ラット（配列番号：４００に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４１１に記載されている成熟形態）、イヌ（配列番号：４０１に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４１２に記載されている成熟形態）、ブタ（配列番号：４０２に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４１３に記載されている成熟形態）、およびウシ（配列番号：４０３に記載されている前駆体プレプロペプチドおよび配列番号：４１４に記載されている成熟形態）。
本明細書において使用されるように、種変異体は、マウスおよびヒトなどのような異なる哺乳動物種を含む様々な種の中のポリペプチドにおける変異体を指す。
本明細書において使用されるように、対立遺伝子変異体は、同じ種のメンバーの中のタンパク質における変異を指す。
本明細書において使用されるように、スプライス変異体は、２つ以上の種類のｍＲＮＡをもたらす、ゲノムＤＮＡの転写一次産物のディファレンシャルプロセシング(differential processing)によって産生される変異体を指す。
本明細書において使用されるように、対応する残基は、アライメントされた場所に存在する残基を指す。関連ポリペプチドまたは変異ポリペプチドは、当業者らに知られている任意の方法によってアライメントされる。そのような方法は、典型的に、マッチを最大限にし、マニュアルアライメントを使用するならびに入手可能な多数のアライメントプログラム（たとえばＢＬＡＳＴＰ）および当業者らに知られている他のものを使用することによるなどのような方法を含む。ＦＸポリペプチドの配列をアライメントすることによって、当業者は、指標として、保存された同一のアミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定することができる。典型的には、ポリペプチドのアミノ酸が記載されている配列におけるアミノ酸に対応するという記述は、標準アラインメントアルゴリズム、たとえばＧＡＰアルゴリズムを使用して同一性または相同性を最大化する（保存されたアミノ酸がアライメントされる）ように、ポリペプチドと記載されている配列とのアラインメント時に、同定されるアミノ酸を指す。例えば、図３に記載されているアラインメントを基準にして、配列番号：１３４に記載されている成熟ヒトＦＸの軽鎖におけるアミノ酸残基Ｈｉｓ８は、配列番号：４０４に記載されているホオジロヒヒ(white-cheeked baboon)におけるＡｓｎ８に対応する。別の例において、配列番号：１３４に記載されている成熟ヒトＦＸの重鎖におけるＡｓｐ１６４は、配列番号：４１１に記載されているラットＦＸにおけるＡｓｐ１６１に対応する。
本明細書において使用されるように、ドメイン（典型的に、３またはそれ以上、一般に、５または７またはそれ以上のアミノ酸の配列）は、構造的におよび／または機能的に分子の他の部分と異なり、同定可能である、タンパク質またはコード核酸などのような分子の部分を指す。たとえば、ドメインは、１つもしくは複数の構造モチーフから構成されるタンパク質内で、独立して折り畳まれた構造を形成することができるおよび／またはタンパク質分解活性などのような機能的活性により認識される、ポリペプチド鎖のそれらの部分を含む。タンパク質は、１つまたは２つ以上の異なるドメインを有することができる。たとえば、ドメインは、プロテアーゼドメインまたはｇｌａドメインを定めるモチーフに対する相同性などのような、関連するファミリーメンバーに対する、その中の配列の相同性によって、同定する、定める、または区別することができる。他の例において、ドメインが、タンパク質分解活性など、その機能によってまたはＤＮＡ結合、リガンド結合、および二量体化などのような、生体分子と相互作用する能力によって区別することができる。ドメインは、ドメインが、独立してまたは他の分子に融合して、たとえばタンパク質分解活性またはリガンド結合などのような活性を実行することができるように、独立して、生物学的機能または生物学的活性を示すことができる。ドメインは、アミノ酸の線状配列またはアミノ酸の非線状配列とすることができる。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含有する。そのようなドメインは、知られており、当業者らによって同定することができる。本明細書における例証のために、定義は、提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは、当技術分野における技術の範囲内に十分にあることが理解されたい。必要に応じて、適切なソフトウェアを、ドメインを同定するために利用することができる。
本明細書において使用されるように、プロテアーゼドメインまたは触媒活性ドメインは、触媒活性を与えるドメインである。プロテアーゼのプロテアーゼドメインに対する言及は、これらのタンパク質のいずれかの単鎖形態、二重鎖形態、および多重鎖形態を含む。タンパク質のプロテアーゼドメインは、たとえば触媒中心などのような、そのタンパク質分解活性に必要とされる、そのタンパク質の必須の特性を全て含有する。ＦＸに関して、プロテアーゼドメインは、触媒トライアドを含めて、キモトリプシン／トリプシンファミリープロテアーゼドメインと、相同性および構造的特徴を共有する。たとえば、配列番号：１３４に記載されているＦＸポリペプチドにおいて、プロテアーゼドメインは、配列番号：１３４のアミノ酸位置Ｉｌｅ１９５からＬｙｓ４４８に対応し、触媒トライアド残基（たとえば配列番号：１３４におけるＨｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２およびＳｅｒ３７９、キモトリプシンナンバリングによってＨｉｓ５７、Ａｓｐ１０２およびＳｅｒ１９５に対応する）を含む。
本明細書において使用されるように、ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインは、タンパク質、たとえば、Ｇｌａを形成するためのビタミンＫ依存性カルボキシル化による、グルタミン酸残基、一般に、全てではないが、ほとんどのグルタミン酸残基の翻訳後修飾を含有するビタミンＫ依存性タンパク質の部分を指す。Ｇｌａドメインは、カルシウムイオンの高親和性結合および負電荷リン脂質への結合を担う。典型的に、Ｇｌａドメインは、ビタミンＫ依存性タンパク質の成熟形態のＮ−末端で始まり、保存芳香族残基で終わる。二重鎖に切断されると、Ｇｌａドメインは軽鎖中である。成熟ＦＸを基準にして、Ｇｌａドメインは、配列番号：１３４において記載される例示的なポリペプチドのアミノ酸位置１〜３９に対応する。Ｇｌａドメインは、十分に知られており、それらの場所は、特定のポリペプチドにおいて同定することができる。様々なビタミンＫ依存性タンパク質のＧｌａドメインは、Ｎ−末端の疎水性残基の、細胞表面膜上の負電荷リン脂質との相互作用を媒介する疎水性パッチへのクラスタリングを含めて、配列相同性、構造的相同性、および機能的相同性を共有する。例示的な他のＧｌａ含有ポリペプチドは、ＦＩＸ、ＦＶＩＩ、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、成長停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）およびプロテインＺを含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用されるように、上皮成長因子（ＥＧＦ）ドメイン（ＥＧＦ−１またはＥＧＦ−２）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）配列の特異的な３０〜４０のアミノ酸部分に対して配列相同性を共有する、タンパク質の部分を指す。ＥＧＦドメインは、ジスルフィド結合に関与することが示された（ＥＧＦにおいて）、６つのシステイン残基を含む。ＥＧＦドメインの主な構造は、Ｃ−末端の短い二本鎖シートへのループが後続する二本鎖ベータシートである。ＦＸは、２つのＥＧＦドメイン：ＥＧＦ−１およびＥＧＦ−２を含有する。これらのドメインは、配列番号：１３４において記載される成熟ＦＸポリペプチドの、アミノ酸位置４６〜８４および８５〜１２８にそれぞれ対応する。二重鎖形態に切断されたとき、ＥＧＦドメインは軽鎖中である。
本明細書において使用されるように、「未修飾ポリペプチド」または「未修飾ＦＸ」およびその文法的な変化形は、本明細書において提供される修飾のために選択される出発ポリペプチドを指す。出発ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に存在する野生型形態であり得る。例示的な未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているヒトＦＸ、およびそのチモーゲンまたはＦＸａ二本鎖形態である。さらに、出発ポリペプチドは、それが、天然野生型アイソフォームと異なるように、改変するまたは変異させることができるが、それにもかかわらず、本明細書において産生される、引き続いて修飾されるポリペプチドと比較して、出発未修飾ポリペプチドと本明細書において呼ばれる。したがって、未修飾参照タンパク質と比較して、特定の活性または特性における望ましい増加または減少を有するように修飾された、当技術分野において知られている既存のタンパク質は、出発未修飾ポリペプチドとして選択し、使用することができる。たとえば、グリコシル化を改変するための１つまたは複数のアミノ酸残基における変化などのように、１つまたは複数の単一アミノ酸変化によってその天然形態から修飾され、望ましい特性における増加または減少のいずれかを有するタンパク質は、同じまたは異なる特性のさらなる修飾のための、本明細書において未修飾と呼ばれる、標的タンパク質とすることができる。
本明細書において使用されるように、「修飾第Ｘ因子ポリペプチド」および「修飾第Ｘ因子」は、未修飾第Ｘ因子ポリペプチドと比較して、１つまたは複数のアミノ酸差異を有するＦＩＸポリペプチドのあらゆる形態、たとえばＦＸチモーゲンまたはＦＸａを含むＦＸポリペプチドを指す。１つまたは複数のアミノ酸差異は、１つもしくは複数のアミノ酸置換（交換）、アミノ酸挿入、もしくはアミノ酸欠失などのようなアミノ酸突然変異とすることができるまたは全ドメインの挿入もしくは欠失およびその任意の組合せとすることができる。典型的に、修飾ＦＸポリペプチドは、未修飾ＦＸポリペプチドと比較して、一次配列における１つまたは複数の修飾を有する。たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドは、未修飾ＦＸポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸差異を有することができる。任意の修飾は、結果として生じるポリペプチドが、たとえば触媒活性、タンパク質分解活性、血栓活性または凝固活性などのような、天然ＦＸポリペプチドと関連する、少なくとも１つのＦＸ活性を示す限り、企図される。
本明細書において使用されるように、ＦＸポリペプチドの「特性」は、物理的または構造的特性、たとえば三次元構造、ｐＩ、半減期、コンホメーション、および他のそのような物理的特徴を指す。
本明細書において使用されるように、ＦＸポリペプチドの「活性」または「ＦＸ活性」または「ＦＸａ活性」は、活性第Ｘａ因子形態のポリペプチドによって示される任意の活性を指す。そのような活性は、インビトロおよび／またはインビボにおいて試験することができ、凝固活性もしくは血液凝固活性、凝血促進活性、プロトロンビン活性化を達成するためのなどのようなタンパク質分解または触媒活性；抗原性（抗ＦＸ抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力）；ＦＶａ、プロトロンビン、ヘパリンに結合する能力および／またはリン脂質に結合する能力を含むが、これらに限定されない。活性は、たとえば、インビトロにおいてまたはインビボにおいて凝固を測定することによって、承認されるアッセイを使用して、インビトロにおいてまたはインビボにおいて評価することができる。そのようなアッセイの結果は、ポリペプチドが、インビボにおけるポリペプチドの活性に相互に関連し得る活性を示すことを示し、インビボ活性は、生物学的活性と呼ぶことができる。ＦＸの修飾形態の機能性または活性を決定するためのアッセイは、当業者らに知られている。ＦＸポリペプチドの活性を評価するための例示的なアッセイは、血液凝固活性を評価するためのプロトロンボプラスチン時間（ＰＴ）アッセイもしくは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイ、または触媒活性もしくはタンパク質分解活性を評価するための、以下の実施例に記載されているような合成基質を使用する発色アッセイを含む。
本明細書において使用されるように、「少なくとも１つの活性を示す」または「少なくとも１つの活性を保持する」は、同じ条件下で同じ形態の未修飾ＦＸポリペプチドと比較した、修飾ＦＩＸポリペプチドによって示されるＦＸ活性を指す。典型的に、活性は、ポリペプチドのＦＸａ形態またはその触媒活性部分の活性である。とえば、二重鎖形態の修飾ＦＸａポリペプチドの活性は、同じ実験条件下で、二重鎖形態の未修飾ＦＸａポリペプチドと比較され、２つのポリペプチドの間の唯一の差異は、研究中の修飾である。典型的に、同じ形態の未修飾ＦＸポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持するまたは示す修飾ＦＸポリペプチドは、インビボにおいて投与された場合、修飾ＦＸポリペプチドが、凝血促進治療薬として治療的に有効となるのに十分な量の活性を保持する。修飾ＦＸポリペプチドは、同じ形態における未修飾ＦＸポリペプチドと比較して、増加したまたは減少した活性を示すことができる。一般に、修飾ＦＸポリペプチドは、未修飾ＦＸポリペプチドの活性の０．５％〜５００％、たとえば凝血促進薬としての治療的効能を示す同じ形態の未修飾ＦＸポリペプチドの活性の少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、もしくはそれ以上またはその前後を示すとき、活性を示す。必要であれば、凝血促進薬としての治療的効能を維持するために必要とされる活性の量は、経験的に決定することができる。典型的に、活性の０．５％〜２０％、０．５％〜１０％、０．５％〜５％の保持は、インビボにおいて凝血促進薬としての治療的効能を保持するのに十分である。保持されることとなる特定のレベルは、ポリペプチドの意図される使用についての関数であり、経験的に決定することができる。活性は、たとえば、本明細書において記載されるものなどのようなインビトロアッセイまたはインビボアッセイを使用して、測定することができる。
本明細書において使用されるように、ＦＸに関する「触媒活性」または「タンパク質分解活性」は、ＦＸａ形態、またはその触媒活性部分が、基質のタンパク質分解性の切断を触媒する能力を指す。そのような活性を評価するためのアッセイは、当技術分野において知られている。アッセイは、基質との安定なアシル酵素中間体の形成をモニターまたは評価するアッセイ、触媒活性と相関するＦＸａの阻害因子への結合を評価するアッセイ、およびＦＸａ基質（たとえばプロトロンビン）または合成基質の切断を直接的に評価するアッセイを含む。たとえば、ＦＸのタンパク質分解活性は、フルオレセイン−モノ−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＦＭＧＢ）またはＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＸａ（メトキシカルボニル−Ｄ−シクロヘキシルグリシル−グリシル(gylcyl)−アルギニン−パラ−ニトロアニリドアセテート）などのような発色基質または蛍光基質を使用して、エコチンなどのようなタイトバインディング可逆性阻害因子を使用して、またはＦＸａ基質プロトロンビンを使用して測定することができる。触媒活性の評価は直接的または間接的であってよい。例えば、触媒活性は、合成基質Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ（Ｈ−Ｄ−ＣＨＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）に対する活性化トロンビンの活性をモニタリングすることによって、本明細書の実施例４において例示されているとおりＦＸａ基質の下流活性の切断をモニタリングすることにより評価することができる。例示的なアッセイは実施例において記載されている。触媒活性を評価するためのアッセイは、ＦＶａの存在または非存在下で行うことができ、また、リン脂質またはＣａ２＋の存在または非存在下で行うこともできる。触媒活性は、触媒効率またはｋｃａｔ／ｋｍとして示すことができ、これは、プロテアーゼが基質を開裂する効率の尺度であり、当業者によく知られている定常状態下で測定される。
本明細書において使用されるように、「凝固活性」または「血液凝固活性」または「凝血促進活性」は、ポリペプチドが凝固を達成する能力を指す。血液凝固活性を評価するためのアッセイは、当業者らに知られており、プロトロンボプラスチン時間（ＰＴ）アッセイまたは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを含む。
本明細書において使用されるように、プロトロンビナーゼ活性は、基質プロトロンビンに対する特定の触媒活性を指し、プロトロンビン（第ＩＩ因子）からトロンビン（第ＩＩａ因子）へ変換する活性である。活性は、例えば、切断反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分解産物のタンパク質分析によって、直接的に評価することができる。活性はまた、発色または蛍光放出部分を切断時にモニタリングすることにより合成基質を使用して評価することができる。活性はまた、基質または合成基質（たとえばＰｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ（Ｈ−Ｄ−ＣＨＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）に対するトロンビンの活性をモニタリングすることにより間接的に評価することができる。プロトロンビナーゼ活性を評価するためのアッセイは、ＦＶａの存在または非存在下で行うことができ、また、リン脂質またはＣａ２＋の存在または非存在下で行うこともできる。
本明細書において使用されるように、「凝固の阻害因子」は、凝固または血餅形成を阻害または防止するように作用するタンパク質または分子を指す。凝固の阻害または防止は、インビボまたはインビトロにおいて観察することができ、プロトロンボプラスチン時間（ＰＴ）アッセイまたは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを含むがこれらに限定されない当分野で知られている方法を使用してアッセイすることができる。
本明細書において使用されるように、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴまたはＡＴ−ＩＩＩ）は、セリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）である。ＡＴ−ＩＩＩは、分泌の間に切断されて、４３２アミノ酸の成熟アンチトロンビン（配列番号：５５４）を放出する、４６４のアミノ酸残基（配列番号：５５３）を含有する前駆体タンパク質として合成される。
本明細書において使用されるように、「ＡＴ−ＩＩＩの阻害効果」または「ＡＴ−ＩＩＩによる阻害」は、ＦＸポリペプチドのＦＸａ形態、またはその触媒活性またはチモーゲン様形態の触媒または血液凝固活性を阻害するアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴまたはＡＴ−ＩＩＩ）の能力を指す。ＡＴ−ＩＩＩによる阻害は、阻害因子へのＦＸポリペプチドまたは修飾ＦＸポリペプチドの結合を評価することによって、アッセイすることができる。阻害因子へのポリペプチドの結合を決定するためのアッセイは、当技術分野において知られている。加えて、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー機器などのような表面プラズマ共鳴もまた、ＡＴ−ＩＩＩまたは他の阻害因子へのＦＸポリペプチドの結合を測定するために使用することができる。しかしながら、ＡＴ−ＩＩＩなどのような共有結合性の阻害因子について、結合速度(on-rate)のみをＢＩＡｃｏｒｅを使用して測定することができる。阻害活性はまた、ＡＴ−ＩＩＩの存在下でＦＸａの触媒活性または血液凝固活性を評価することにより評価することができる。たとえばＡＴ−ＩＩＩなどのような共有結合性の阻害因子について、阻害についての二次速度定数も測定することができる。たとえば、ＡＴ−ＩＩＩによる阻害はまた、ＦＸａの阻害についての二次速度定数（ｋａｐｐ）を決定することにより評価することができる。阻害反応は、一般的に、ＡＴ−ＩＩＩの完全活性のために必要とされるヘパリンの存在下で行われる。例えば、一般的に、ＡＴ−ＩＩＩは、Ｋ０．５（すなわちＦＸａの触媒活性の５０％阻害のために必要とされるＡＴ−ＩＩＩのモル濃度）が８０ｎＭ未満、一般的に７０ｎＭ未満、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ以下であるとき、阻害効果を示す。例えば、ＡＴ−ＩＩＩは、血漿ＦＸａおよび野生型ＦＸａに対して約２ｎＭのＫ０．５を示す。別の例において、ＡＴ−ＩＩＩは、ｋａｐｐ（Ｍ−１ｓ−１）が１．０ｘ１０６以上、一般的に２．０ｘ１０６以上、３．０ｘ１０６、４．０ｘ１０６、５．０ｘ１０６、６．０ｘ１０６、７．０ｘ１０６、８．０ｘ１０６、９．０ｘ１０６、１．０ｘ１０７、２．０ｘ１０７またはそれ以上であるとき、阻害効果を示す。例えば、ＡＴ−ＩＩＩは、血漿ＦＸａおよび野生型ＦＸａに対してそれぞれ約１．４ｘ１０７および９．７ｘ１０６のｋａｐｐを示す。
本明細書において使用されるように、「ＡＴ−ＩＩＩに対する増加した耐性」または「ＴＦＰＩに対する増加した耐性」のような阻害因子に対する増加した耐性は、未修飾ＦＸポリペプチドなどのような参照ポリペプチドと比較した、ＡＴ−ＩＩＩ、ＴＦＰＩまたは他の阻害因子のような阻害因子の阻害効果に対するポリペプチドの感受性の減少についての任意の量を指す。修飾ＦＸポリペプチドに対する阻害因子、例えば、ＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩの阻害効果を決定するためのアッセイは、阻害因子（たとえばＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩ）の存在下で行われ、参照または未修飾ＦＸポリペプチドに対する同じ阻害因子（たとえばＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩ）の阻害効果と比較される。たとえば、修飾ＦＸポリペプチドが、ＡＴ−ＩＩＩの存在下または非存在下においてその基質プロトロンビンを切断する能力を測定することができ、ＡＴ−ＩＩＩが反応を阻害する程度を決定することができる。これは、ＡＴ−ＩＩＩの存在下または非存在下において、未修飾ＦＸポリペプチドがプロトロンビンを切断する能力と比較することができる。同様のアッセイをＴＦＰＩで行うことができる。阻害因子に対する増加した耐性を示す修飾ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドと比較して、たとえば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の阻害因子の効果に対する耐性の増加を示す。阻害に対する耐性は、修飾ＦＸの阻害活性 対 未修飾ＦＸポリペプチドの阻害活性の比率として決定することができる。例えば、Ｋ０．５は、決定することができ、Ｋ０．５値（Ｋ０．５変異体／Ｋ０．５野生型）の比率として示される野生型ＦＸａと比較して修飾ＦＸポリペプチドの阻害因子耐性（たとえばＡＴ−ＩＩＩ耐性またはＴＦＰＩ耐性）の程度の表現である。１．０より大きい比率は、修飾ＦＸポリペプチドが阻害因子（たとえばＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩ）に対する増加した耐性を示すことを意味する。別の例において、ｋａｐｐは、決定することができ、ｋａｐｐ値（ｋａｐｐ野生型／ｋａｐｐ変異体）の比率として示される野生型ＦＸａと比較して修飾ＦＸポリペプチドの阻害因子耐性（たとえばＡＴ−ＩＩＩ耐性またはＴＦＰＩ耐性）の程度の表現である。１．０より大きい比率は、修飾ＦＸポリペプチドが阻害因子、たとえばＡＴ−ＩＩＩおよび／またはＴＦＰＩに対する増加した耐性を示すことを意味する。
本明細書において使用されるように、補因子は、他の特定のタンパク質または分子に結合して、活性複合体を形成するタンパク質または分子を指す。いくつかの例では、補因子への結合が、最適なタンパク質分解活性に必要とされる。たとえば、第Ｖａ因子（ＦＶａ）は、ＦＸａの補因子である。ＦＶａへのＦＸａまたはＦＸａのチモーゲン様形態の結合は、その基質に対するＦＸａのタンパク質分解活性の増加をもたらすコンホメーション変化を誘発する。
本明細書において使用されるように、第Ｖａ因子（ＦＶａ）は、ＦＸａに対して補因子として機能する非酵素的に活性な凝固因子を示す。第Ｖ因子は、活性化血小板の表面上でトロンビンにより活性化される一本鎖ポリペプチドであり、カルシウムにより互いに非共有的に結合される二重鎖ポリペプチドであるＦＶａを生じる。ＦＶａはＦＸａに結合し、プロトロンビナーゼ複合体を形成し、これはリン脂質およびＣａ２＋の存在化でプロトロンビンからトロンビンに変換する。インビボにおいて、これは、一般的に、細胞表面上で起こる。トロンビンを活性化するためのＦＸａの活性がＦＶａの存在下で非常に増加されるため、ＦＶａはＦＸａに対する補因子である。
本明細書において使用されるように、「ＦＶａ非依存性活性」は、ＦＶａの非存在下でのＦＸａの活性を指す。
本明細書において使用されるように、「ＦＶａ依存性活性」は、ＦＶａの存在下でのＦＸａの活性を指す。
本明細書において使用されるように、「補因子依存性」または「相対的補因子依存性」は、ＦＶａの非存在下と比較してＦＶａの存在下でより良いＦＸａ活性を提供することを指し、ＦＶａ非依存性活性に対するＦＶａ依存性活性の比率として示すことができる。典型的に、ＦＸａは、完全な活性が補因子の存在に依存するように、補因子の非存在下よりも補因子の存在下で有意に良い活性を示す。例えば、活性ＦＸａとその活性化補因子ＦＶａとの関連性は、補因子の非存在と比較して、活性（たとえば触媒活性）において２，０００倍よりも大きい増加をもたらす。
本明細書において使用されるように、増加した補因子依存性は、未修飾ＦＸポリペプチドのような参照ポリペプチドと比較して、修飾ＦＸポリペプチドの増加した補因子依存性の任意の量を指す。増加した補因子依存性を示す修飾ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドと比較して、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の補因子への増加した依存度を指す。増加した補因子依存性は、修飾を含まない参照ポリペプチドまたは未修飾ＦＸポリペプチドに対する修飾ＦＸポリペプチドの補因子依存性（ＦＶａ依存性活性／ＦＶａ非依存性活性）の比率として決定することができる。たとえば、修飾ＦＸポリペプチドは、未修飾ＦＸポリペプチドと比較して、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上増加した補因子依存性を示すとき、増加した補因子依存性を示す。
本明細書において使用されるように、グリコシル化部位は、炭水化物部分を付加することができる、ポリペプチドにおけるアミノ位置を指す。典型的に、グリコシル化タンパク質は、炭水化物部分の付加のために、アスパラギンまたはセリンなどのような１つまたは複数のアミノ酸残基を含有する。
本明細書において使用されるように、天然グリコシル化部位は、炭水化物部分が野生型ポリペプチドにおいて付加されるアミノ酸位置を指す。ＦＸにおいて４つの天然グリコシル化部位：配列番号：１３４を基準にして残基Ｔｈｒ１５９、Ｔｈｒ１７１、Ａｓｎ１８１およびＡｓｎ１９１に対応する２つのＯ−グリコシル化部位および２つのＮ−グリコシル化部位がある。
本明細書において使用されるように、非天然グリコシル化部位は、野生型ポリペプチドにおいて存在しない、修飾ポリペプチドにおいて炭水化物部分が付加されるアミノ酸位置を指す。非天然グリコシル化部位は、アミノ酸置換によってＦＸポリペプチドの中に導入することができる。Ｏ−グリコシル化部位は、たとえば、天然残基のセリンまたはトレオニンとのアミノ酸置換によって、生成することができる。Ｎ−グリコシル化部位は、たとえば、モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓを確立することによって、生成することができ、ここで、Ｘａａは、プロリンではない。アミノ酸修飾によるこのコンセンサス配列の生成は、たとえば、天然アミノ酸残基のアスパラギンとの単一アミノ酸置換、天然アミノ酸残基のセリン、トレオニン、もしくはシステインとの単一アミノ酸置換、または天然残基のアスパラギンとの第１のアミノ酸置換および天然残基のセリン、トレオニン、もしくはシステインとの第２のアミノ酸置換を含む二重アミノ酸置換を含むことができる。
本明細書において使用されるように、「グリコシル化のレベル」は、例えば、グリコシル化が可能である宿主細胞における発現時に、グリカンにより占有され得るグリコシル化部位の数を指す。
本明細書において使用されるように、グリコシル化のレベルを基準にしての増加は、未修飾または野生型ＦＸポリペプチドを基準にしてグリカンにより占有され得るグリコシル化部位の数が多数あることを示す。グリコシル化のレベルの増加を示す修飾ポリペプチドは、未修飾または野生型ＦＸポリペプチドと比較してグリカンにより占有されるグリコシル化部位の数が多数あるとき、高グリコシル化され得る。
本明細書において使用されるように、「生物学的活性」は、化合物、組成物、または他の混合物のインビボ投与に際して結果として生じる、化合物のインビボ活性または生理学的応答を指す。したがって、生物学的活性は、そのような化合物、組成物、および混合物の治療的効能および医薬活性を包含する。生物学的活性は、そのような活性を試験するまたは使用するために設計されるインビトロ系において観察することができる。したがって、本明細書における目的上、ＦＸポリペプチドの生物学的活性は、血液凝固活性を包含する。
本明細書において使用されるように、用語「評価する」およびその文法的な変化形は、ポリペプチドの活性についての絶対値を得るという意味でおよびまた活性のレベルを示す指数、比、百分率、視覚的値、または他の値を得るという意味でも、定量的決定および定質的決定を含むように意図される。評価は、直接的または間接的なものであってもよい。たとえば、ポリペプチドによる基質の切断の検出は、産物の直接的な測定によるものとすることができるまたは切断された基質の結果として生じる活性を決定することによって間接的に測定することができる。
本明細書において使用されるように、「成熟ナンバリング」または「標準ナンバリング」は、成熟ＦＸポリペプチドに基づく残基のナンバリングを指す。本明細書における目的上、成熟ナンバリングは、配列番号：１３４に記載されている成熟ＦＸの残基のナンバリングに基づく。
本明細書において使用されるように、「キモトリプシンナンバリング」は、配列番号：５５６の成熟キモトリプシンポリペプチドのナンバリングに基づくアミノ酸残基のナンバリングを指す。たとえば第Ｘ因子のプロテアーゼドメインなどのような他のセリンプロテアーゼのプロテアーゼドメインのアラインメントは、三次元モデリングおよび一般的なセリンプロテアーゼの構造の重ね合わせに由来する配列照合パターン基づいてキモトリプシンを用いてなすことができる。（たとえばGreer, J., Proteins Struct. Funct. Genet. 7 (1990) 317-334参照）。そのような場合、キモトリプシンのアミノ酸に対応する第Ｘ因子のアミノ酸は、キモトリプシンアミノ酸のナンバリングが与えられる。配列番号：１３４において記載されるＦＸポリペプチドの重鎖のプロテアーゼドメインに対応するアミノ酸位置１９５〜４４８の対応するキモトリプシンナンバーは、表１において提供される。配列番号：１３４において記載される配列と比較したアミノ酸位置は、標準のフォントとし、それらの位置のアミノ酸残基は、太字とし、対応するキモトリプシンナンバーは、イタリック体とする。たとえば、成熟キモトリプシン（配列番号：５５６）との成熟第ＦＸ因子（配列番号：１３４）のアライメントに際して、第Ｘ因子におけるアミノ酸位置１９５でのイソロイシン（Ｉ）は、Ｉ１６のキモトリプシンナンバリングが与えられる。続くアミノ酸は、それに応じてナンバリングされる。残基が、プロテアーゼにおいて存在するが、キモトリプシンにおいて存在しない場合、アミノ酸残基は文字表記が与えられる（たとえば、成熟ナンバリングによる残基３３０は、キモトリプシンナンバリングによる残基１４６Ａである）。
本明細書において使用されるように、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）およびその混合物を含むその類似体を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖とすることができる。蛍光または放射ラベルなどの検出可能なラベルなどを用いて所望によりラベルされるプローブまたはプライマーを指す場合、一本鎖分子が、企図される。そのような分子は、典型的に、それらの標的が、統計的にユニークとなるような長さであるまたはライブラリーのプロービングもしくはプライミングのために低コピー数（典型的に５未満、一般に３未満）のものとする。一般に、プローブまたはプライマーは、対象の遺伝子と相補的なまたは同一の配列の少なくとも１４、１６、または３０の連続ヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上の核酸長とすることができる。
本明細書において使用されるように、ペプチドは、２〜４０のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。
本明細書において使用されるように、本明細書において提供されるアミノ酸の様々な配列において生じるアミノ酸は、それらの知られている３文字または１文字の略語に従って同定される（表２）。様々な核酸断片において生じるヌクレオチドは、当技術分野においてルーチン的に使用される標準的な１文字を用いて命名される。
本明細書において使用されるように、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２つまたはそれ以上のアミノ酸を含有する。本明細書における目的上、アミノ酸は、２０の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体（つまりα−炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
J. Biol. Chem., 243:3557-3559 (1968)に記載、および米国特許法施行規則§§１．８２１〜１．８２２に採用される標準的なポリペプチド命名法に合わせて、アミノ酸残基についての略語を表２に示す。
本明細書における式によって表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への従来の方向に、左から右への配向を有することに留意されたい。さらに、語句「アミノ酸残基」は、対応の表（表２）において列挙されるアミノ酸ならびに米国特許法施行規則§§１．８２１〜１．８２２において言及されるものおよび参照によって本明細書において組み込まれるものなどのような修飾アミノ酸および例外的なアミノ酸を含むように、広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始まりまたは終わりのダッシュは、１つまたは複数のアミノ酸残基のさらなる配列に対する、ＮＨ２などのようなアミノ末端基に対する、またはＣＯＯＨなどのようなカルボキシル末端基に対するペプチド結合を示すことに留意されたい。
本明細書において使用されるように、「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ疎水性コンセンサススケールを使用して疎水性であると決定されるあらゆるアミノ酸を含む。例示的なものは、天然疎水性アミノ酸、たとえばイソロイシン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、メチオニン、アラニン、グリシン、システインおよびチロシン（Eisenbergら, (1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17:109-120）である。非天然疎水性アミノ酸も含まれる。
本明細書において使用されるように、「酸性アミノ酸」は、天然アミノ酸中で、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基を含む。非天然酸性アミノ酸も含まれる。
本明細書において使用されるように、「極性アミノ酸」は、側鎖が水性（すなわち水）環境に存在することが好ましいように親水性であるアミノ酸を指す。かかるアミノ酸は、一般的に、タンパク質の表面上に位置する。かかるアミノ酸は、一般的に、水との水素結合に関与することができる酸素または窒素を含有する官能基、たとえば酸、アミド、アルコールまたはアミンを有する極性側鎖を有するものを含むとき、分類される。例示的なかかるアミノ酸は、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）およびＴｙｒ（Ｙ）である。Ｃｙｓ（Ｃ）およびＴｒｐ（Ｗ）はまた、弱い極性と考えられる。
本明細書において使用されるように、極性および中性アミノ酸は、中性側鎖を含む極性アミノ酸である。置換のための例示的なかかるアミノ酸残基は、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）またはＴｙｒ（Ｙ）である。
本明細書において使用されるように、「天然アミノ酸」は、ポリペプチドにおいて生じる２０種のＬ−アミノ酸を指す。
本明細書において使用されるように、「非天然アミノ酸」は、表２において列挙される天然アミノ酸のうちの１つではない、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物を指す。したがって、非天然アミノ酸は、たとえば、２０種の天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、アミノ酸のＤ−立体異性体を含むが、これらに限定されない。例示的な非天然アミノ酸は、当業者らに知られており、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド中に含むことができる。
本明細書において使用されるように、アミノ酸の適した保存的交換は、当業者に知られており、結果として生じる分子の生物学的活性を改変することなく、一般になされ得る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須の領域における単一アミノ酸の交換が生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する（たとえば、Watsonら Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub.co., p. 224を参照されたい）。かかる交換は、以下の表３に記載される交換に従ってなされ得る：
他の交換もまた許容可能であり、経験的にまたは知られている保存的交換に従って決定されてもよい。
本明細書において使用されるように、ＤＮＡコンストラクトは、自然界において見出されない様式で組み合わせられ、並べられたＤＮＡのセグメントを含有する一本鎖もしくは二本鎖、線状、または環状のＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
本明細書において使用されるように、ＤＮＡセグメントは、特定の性状を有する、より大きなＤＮＡ分子の部分である。たとえば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミドまたはプラスミド断片などのような、より長いＤＮＡ分子の部分であり、５’から３’方向に読み取られる場合、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
本明細書において使用されるように、ポリヌクレオチドという用語は、５’端から３’端に読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドベースの一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然源から単離する、インビトロにおいて合成する、または天然分子および合成分子の組合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチド（「ｎｔ」と省略）または塩基対（「ｂｐ」と省略）により本明細書において示される。ヌクレオチドという用語は、状況が可能にする場合、一本鎖分子および二本鎖分子に使用される。この用語が、二本鎖分子に適用される場合、用語は、全長を表すために使用され、塩基対という用語と等価であることが理解されるであろう。二重鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖はわずかに長さが異なることがあり得、そしてその端がずれることがあり得、したがって、二重鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対になることができるとは限らないことが当業者らによって認識されるであろう。そのような対でない端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えないであろう。
本明細書において使用されるように、「一次配列」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の配列を指す。
本明細書において使用されるように、２つのタンパク質または核酸の間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列の間の関連性を指す。類似性は、残基の配列の同一性および／または相同性の程度ならびにそこに含有される残基に基づくものとすることができる。タンパク質または核酸の間の類似性の程度を評価するための方法は、当業者らに知られている。たとえば、配列類似性を評価するためのある方法において、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、配列の間で最大のレベルの同一性が得られるようにアライメントされる。「同一性」は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が一様である程度を指す。アミノ酸配列のアライメントおよびある程度のヌクレオチド配列のアラインメントはまた、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存的な差異および／または頻繁な交換を考慮することができる。保存的な差異は、含まれる残基の物理化学的特性を保存する差異である。アラインメントは、全体的（配列の全体の長さにわたるおよび全ての残基を含む、比較される配列のアラインメント）または局所的（最も類似する１つまたは複数の領域のみを含む配列の部分のアラインメント）なものとすることができる。
本明細書において使用されるように、用語「相同性」および「同一性」は、区別なく使用されるが、タンパク質についての相同性は、保存的アミノ酸変化を含むことができる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は、最も高度な程度のマッチが得られるように、アライメントされる（たとえばComputational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carilloら (1988) SIAM J Applied Math 48:1073を参照されたい）。
本明細書において使用されるように、「配列同一性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較における、同一のアミノ酸（またはヌクレオチド塩基）の数を指す。相同性ポリペプチドは、所定の数の同一アミノ酸残基または相同性アミノ酸残基を指す。相同性は、同一残基と同様に、保存的なアミノ酸交換を含む。配列同一性は、それぞれのサプライヤーによって確立されるデフォルトギャップペナルティーを用いて使用される標準的なアライメントアルゴリズムプログラムによって決定することができる。相同性核酸分子は、所定の数の同一ヌクレオチドまたは相同性ヌクレオチドを指す。相同性は、同一残基と同様に、コードアミノ酸を変化させない交換（つまり「サイレント交換」）を含む。実質的に相同性の核酸分子は、典型的に、中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーで、核酸の全長に沿ってまたは対象の完全長核酸分子の少なくとも約７０％、８０％、もしくは９０％に沿ってハイブリダイズする。ハイブリダイズする核酸分子におけるコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子もまた、企図される。（タンパク質の相同性の決定のために、保存的アミノ酸は、同一のアミノ酸と同様にアライメントすることができ、この場合、同一性の百分率および相同性百分率は、変わる）。任意の２つの核酸分子が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％「同一の」ヌクレオチド配列を有する（または任意の２つのポリペプチドが、そのようなアミノ酸配列を有する）かどうかは、「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどのような、知られているコンピューターアルゴリズムを使用して、たとえば、Pearsonら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)におけるデフォルトパラメーターを使用して、決定することができる（他のプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, Jら, Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ［Atschul, S.Fら, J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994), and Carilloら SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)を含む）。たとえば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎデータベースのＢＬＡＳＴ機能は、同一性を決定するために使用することができる。他の市販で入手可能なまたは公的に入手可能なプログラムは、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧ）「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を含む。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性のパーセントは、たとえば、ＧＡＰコンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することによって決定することができる（たとえば、Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)によって改訂されたNeedlemanら J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)）。手短かに言えば、ＧＡＰのプログラムは、２つの配列のうちの短い方のシンボルの総数によって割った、類似する、アライメントされたシンボル（つまりヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）単項比較マトリックス（同一の場合には１および同一でない場合には０という値を含有する）ならびにSchwartz and Dayhoff, eds. , Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)によって記載されるGribskovら Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)の加重比較マトリックス；（２）それぞれのギャップに対する３．０のペナルティーおよびそれぞれのギャップにおけるそれぞれのシンボルに対するさらなる０．１０のペナルティー；ならびに（３）エンドギャップに対するペナルティーなし、を含むことができる。
そのため、本明細書において使用されるように、用語「同一性」は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較を表す。１つの非限定的な例では、「〜に少なくとも９０％同一の」は、参照ポリペプチドと比較した、９０〜１００％の同一性パーセントを指す。９０％またはそれ以上のレベルでの同一性は、例証目的と仮定して、１００アミノ酸の試験および参照ポリヌクレオチド長が比較され、試験ポリペプチドにおけるアミノ酸の多くとも１０％（つまり１００のうち１０）が参照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示す。類似する比較は、試験ポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチドの間でなすことができる。そのような差異は、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布した点突然変異として表され得る、またはそれらは最大に許容できる、たとえば１０／１００のアミノ酸差異（約９０％の同一性）まで、様々な長さの１つまたは複数の場所にクラスター形成し得る。差異は、核酸またはアミノ酸の交換、挿入、または欠失として定義される。約８５〜９０％以上の相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよびギャップパラメーターセットに非依存性であるはずであり、そのような高度なレベルの同一性は、ソフトウェアに頼ることなく容易に評価できることが多い。
本明細書において使用されるように、用語「実質的に同一の」または「類似する」は、当業者らによって理解されるように、状況により変わるが、当業者らは、そのようなものを評価することができることもまた理解されたい。
本明細書において使用されるように、配列のアライメントは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における対応する位置をアライメントするための相同性（類似性および／または同一性）の使用を指す。典型的に、５０％またはそれ以上の同一性によって関係する２つまたはそれ以上の配列が、アライメントされる。配列のアライメントセットは、対応する位置でアライメントされる２つまたはそれ以上の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列とアライメントされる、ＥＳＴおよび他のｃＤＮＡなどのような、ＲＮＡに由来するアライメント配列を含むことができる。
本明細書において使用されるように、「特異的にハイブリダイズする」は、標的核酸分子への核酸分子（たとえばオリゴヌクレオチド）の相補的塩基対合によるアニーリングを指す。当業者らは、特定の分子の長さおよび組成などのような、特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロパラメーターおよびインビボパラメーターに精通している。インビトロハイブリダイゼーションに特に関連するパラメーターは、アニーリング温度および洗浄温度、緩衝液組成、ならびに塩濃度をさらに含む。非特異的結合核酸分子を除去するための例示的な洗浄条件は、高ストリンジェンシーでは０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、中ストリンジェンシーでは０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃である。等価なストリンジェンシー条件は、当技術分野において知られている。当業者は、特定の適用に適切な標的核酸分子への核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、これらのパラメーターを容易に調整することができる。
本明細書において使用されるように、単離もしくは精製タンパク質またはその触媒活性タンパク質の言及は、タンパク質が由来する組織の細胞に由来する細胞性物質または他の混入タンパク質が実質的にないまたは化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質が実質的にないことを意味する。調製物は、そのような純度を評価するために当業者らによって使用される薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのような標準的な分析方法によって決定されるように、容易に検出可能な不純物がそれらにないまたは十分に純粋であり、さらなる精製が、物質のタンパク質分解活性および生物学的活性などのような物理的特性および化学的特性を検出可能に変化させないであろうと思われる場合、実質的に不純物がないと決定することができる。実質的に純粋なポリペプチドを産生するためのタンパク質の精製のための方法は、当業者らに知られている。
細胞性物質が実質的にないという用語は、タンパク質が単離されるまたは組換えで産生される細胞の細胞性構成成分からタンパク質が分離されている、タンパク質の調製物を含む。一実施形態では、細胞性物質が実質的にないという用語が、約３０％未満（乾燥重量による）の非プロテアーゼタンパク質（本明細書において混入タンパク質とも呼ばれる）、一般に、約２０％未満の非プロテアーゼタンパク質または１０％の非プロテアーゼタンパク質または約５％未満の非プロテアーゼタンパク質を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。プロテアーゼタンパク質またはその活性部分が、組換えで産生される場合、それもまた、実質的に培養培地がない、すなわち、培養培地は、プロテアーゼタンパク質調製物の容量の２０％、１０％、または５％未満、その前後、またはそれと等しい。
本明細書において使用されるように、化学的前駆体または他の化学物質が実質的にないという用語は、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている、プロテアーゼタンパク質の調製物を含む。この用語は、約３０％（乾燥重量による）、２０％、１０％、５％以下、またはそれ未満の化学的前駆体または非プロテアーゼ化学物質もしくは構成成分を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。
本明細書において使用されるように、組換えＤＮＡ法を使用することによる組換え法による産生は、クローニングＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現させるための、分子生物学のよく知られている方法の使用を指す。
本明細書において使用されるように、ベクター（またはプラスミド）は、その発現または複製のいずれかのために細胞の中に異種核酸を導入するために使用される別個のエレメントを指す。ベクターは、典型的にエピソームのままであるが、ゲノムの染色体の中への遺伝子またはその部分の統合を達成するように設計することができる。細菌人工染色体、酵母人工染色体、および哺乳動物人工染色体などのような人工染色体であるベクターもまた企図される。そのような媒体の選択および使用は、当業者らによく知られている。
本明細書において使用されるように、発現は、核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。核酸が、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核生物宿主細胞または真核生物宿主生物が選択される場合、ｍＲＮＡのスプライシングなどのようなプロセシングを含むことができる。
本明細書において使用されるように、発現ベクターは、ＤＮＡ断片の発現を達成することができる、プロモーター領域などのような調節配列と作動可能に連結されるＤＮＡを発現することができるベクターを含む。そのようなさらなるセグメントは、プロモーター配列およびターミネーター配列を含むことができ、所望により、１つまたは複数の複製開始点、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含むことができる。発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに一般に由来するまたは両方のエレメントを含有することができる。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞の中への導入に際してクローニングＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターなどのような組換えＤＮＡコンストラクトまたは組換えＲＮＡコンストラクトを指す。適切な発現ベクターは、当業者らによく知られており、真核細胞および／または原核細胞において複製可能なベクターならびにエピソームのままのベクターまたは宿主細胞ゲノムの中に統合するベクターを含む。
本明細書において使用されるように、ベクターはまた、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」を含む。ウイルスベクターは、細胞の中に外因性遺伝子を移入する（媒体またはシャトルとして）ように外因性遺伝子に作動可能に連結される、操作されたウイルスである。
本明細書において使用されるように、アデノウイルスは、ヒトにおいて結膜炎および上気道感染症を引き起こすＤＮＡ含有ウイルスのグループのいずれかを指す。
本明細書において使用されるように、裸のＤＮＡは、ワクチンおよび遺伝子療法に使用することができるヒストンなしのＤＮＡを指す。裸のＤＮＡは、形質転換またはトランスフェクションと呼ばれる遺伝子移入プロセスの間に細胞から細胞に移される遺伝物質である。形質転換またはトランスフェクションにおいて、レシピエント細胞によって取り込まれる精製ＤＮＡまたは裸のＤＮＡは、レシピエント細胞に、新しい特徴または表現型を与えるであろう。
本明細書において使用されるように、操作可能にまたは作動可能に連結は、ＤＮＡセグメントを指す場合、セグメントが、意図される目的に一致して機能するように、たとえば、転写がプロモーターにおいて開始し、コードセグメントを通ってターミネーターに進むように配置されることを意味する。
本明細書において使用されるように、タンパク質の活性または遺伝子もしくは核酸の発現を調整する作用物質は、タンパク質の活性を減少させるもしくは増加させるまたは他の場合には改変するまたはいくつかの様式において、細胞における核酸の発現をアップレギュレートするもしくはダウンレギュレートするまたは改変する。
本明細書において使用されるように、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異なるポリペプチドに作動可能に連結されたポリペプチドを指す。本明細書において提供されるキメラタンパク質または融合タンパク質は、１つもしくは複数の修飾ＦＸポリペプチドもしくはその部分ならびに任意の１つもしくは複数の転写／翻訳制御シグナルについての１つもしくは複数の他のポリペプチド、シグナル配列、局在化のためのタグ、精製のためのタグ、免疫グロブリンＧのドメインの一部、および／または標的作用物質を含むことができる。キメラＦＸポリペプチドはまた、他のポリペプチドと交換されるポリペプチドのそれらの内因性ドメインまたは内因性領域を有するものをも含む。これらのキメラタンパク質または融合タンパク質は、融合タンパク質として組換え手段によって産生されるもの、たとえばスルフヒドリル基へのカップリングを通した化学的カップリングなどのように、化学的手段によって産生されるもの、ならびに少なくとも１つのポリペプチド（つまりＦＸ）またはその部分が、リンカー（複数可）を介して直接的または間接的に他のポリペプチドに連結される任意の他の方法により産生されるものを含む。
本明細書において使用されるように、作動可能に連結は、融合タンパク質を指す場合、インフレームで互いに融合されるプロテアーゼポリペプチドおよび非プロテアーゼポリペプチドを指す。非プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合することができる。
本明細書において使用されるように、標的作用物質は、細胞表面受容体などのような細胞表面分子への特異的な結合を提供する、タンパク質またはその有効な部分などのような任意の部分であり、受容体は、いくつかの場合では、結合したコンジュゲートまたはその部分を内部移行することができる。標的作用物質はまた、たとえば、コンジュゲートのアフィニティー単離または精製、表面へのコンジュゲートの付加、またはコンジュゲートもしくはコンジュゲートを含有する複合体の検出を促進するもしくは容易にする作用物質とすることもできる。
本明細書において使用されるように、分子の誘導体または類似体は、分子から誘導される部分または分子の修飾バーションを指す。
本明細書において使用されるように、「疾患または障害」は、感染症、後天性状態、遺伝的状態を含むが、これらに限定されない原因または状態に起因し、同定可能な症状により特徴づけられる、生物における病的状態を指す。本明細書における対象の疾患および障害は、凝固タンパク質によって媒介されるものおよび凝固タンパク質が病因または病状において役割を果たすものを含む、凝固を伴うものを含む。疾患および障害はまた、血友病などにおいて、タンパク質の欠如によって引き起こされるものを含み、本明細書において特に関心があるのは、凝固タンパク質における欠損の欠乏症により凝固が生じないそれらの障害である。
本明細書において使用されるように、「凝血促進薬」は、血液凝固を促進する任意の物質を指す。
本明細書において使用されるように、「抗凝固薬」は、血液凝固を阻害する任意の物質を指す。
本明細書において使用されるように、「血友病」は、血液凝血因子における欠乏によって引き起こされる出血障害を指す。血友病は、たとえば、凝血因子の欠如、発現の低下、または機能の低下の結果となり得る。最も一般的な型の血友病は、血友病Ａであり、これは、第ＶＩＩＩ因子における欠乏に起因する。第２の一般的な型の血友病は、血友病Ｂであり、これは、第ＩＸ因子における欠乏に起因する。ＦＸＩ欠乏と呼ばれる血友病Ｃは、より軽度な、それほど一般的でない形態の血友病である。
本明細書において使用されるように、「先天性血友病」は、遺伝する血友病の型を指す。先天性血友病は、凝血因子遺伝子の突然変異、欠失、挿入、または他の修飾に起因し、凝血因子の産生は、欠如している、低下している、または機能しない。たとえば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子などのような凝血因子遺伝子における遺伝的突然変異は、先天性血友病、血友病ＡおよびＢをそれぞれもたらす。
本明細書において使用されるように、「後天性血友病」は、ＦＶＩＩＩを不活性化する自己抗体の産生に由来する、成人期において発症する血友病の型を指す。
本明細書において使用されるように、「出血障害」は、対象が、乏しい血液凝固による出血を制御する能力が減少している状態を指す。出血障害は、遺伝し得または獲得され得、また、たとえば、凝固経路における欠損もしくは欠乏、血小板活性における欠損もしくは欠乏、または血管の欠損に起因し得る。
本明細書において使用されるように、「後天性出血障害」は、肝臓疾患、ビタミンＫ欠乏症、またはクマジン（ワルファリン）もしくは他の抗凝固薬による療法などのような状態によって引き起こされる凝血欠乏に起因する出血障害を指す。
本明細書において使用されるように、疾患または状態を有する対象を「処置する」は、本明細書において提供されるポリペプチド、組成物、または他の産物が、対象に投与されることを意味する。
本明細書において使用されるように、治療剤、治療レジメン、放射線防護剤、または化学療法剤は、ワクチンを含む従来の薬剤および薬剤療法を意味し、これらは、当業者らに知られている。放射線治療剤は、当技術分野においてよく知られている。
本明細書において使用されるように、処置は、状態、障害、または疾患の症状が回復するまたは有益に改変される任意の様式を意味する。したがって、処置は、予防法、療法、および／または治療法を包含する。処置はまた、本明細書における組成物の任意の、医薬としての使用をも包含する。処置はまた、本明細書において提供される修飾ＦＸおよび組成物の任意の、医薬としての使用をも包含する。
本明細書において使用されるように、医薬組成物または他の治療薬の投与によるなどのような処置による特定の疾患または障害の症状の改善は、永久的なものまたは一時的なもの、永続的なものまたは一過性のものにかかわらず、組成物または治療薬の投与に帰し得るまたは関連し得る、症状の任意の緩和を指す。
本明細書において使用されるように、予防または予防法は、疾患または状態を発症する危険性を低下させる方法を指す。予防法は、疾患もしくは状態を発症する危険性の減少および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の予防または症状の悪化もしくは疾患の進行の危険性の低下を含む。
本明細書において使用されるように、特定の疾患を処置するための化合物または組成物の有効量は、疾患と関連する症状を改善させるまたはいくつかの様式では低下させるのに十分な量である。上記量は、単一投与量として投与することができまたはレジメンに従って投与することができ、それによって、それは、有効となる。その量は、疾患を治癒することができるが、典型的に、疾患の症状を改善させるために投与される。典型的に、反復投与が、症状の所望の改善を達成するために必要とされる。
本明細書において使用されるように、「治療有効量」または「治療有効用量」は、治療的効能をもたらすのに少なくとも十分な化合物を含有する作用物質、化合物、物質、または組成物を指す。有効量は、疾患または障害の症状を予防する、治癒する、改善させる、阻止する、または部分的に阻止するために必要な治療剤の含量である。
本明細書において使用されるように、処置される「患者」または「対象」は、哺乳動物を含むヒトまたは非ヒト動物を含む。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、およびサルなどのような霊長動物；イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウシなどのような家畜化された動物；ならびにマウス、ラット、ハムスター、およびアレチネズミなどのようなげっ歯動物を含む。
本明細書において使用されるように、組合せは、２つのアイテムの間のまたはそれ以上のアイテムの間の任意の関連を指す。関連は、空間的なものとすることができるまたは共通の目的のための２つもしくはそれ以上のアイテムの使用を指すことができる。
本明細書において使用されるように、組成物は、２つまたはそれ以上の産物または化合物（たとえば作用物質、修飾因子、調節因子など）の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性製剤もしくは非水性製剤、またはそれらの任意の組合せとすることができる。
本明細書において使用されるように、「製品」は、作製され、販売される産物である。本出願の全体にわたって使用されるように、この用語は、包装製品に含有される修飾プロテアーゼポリペプチドおよび核酸を包含するように意図される。
本明細書において使用されるように、流体は、流動することができる任意の組成物を指す。したがって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物の形態をしている組成物を包含する。
本明細書において使用されるように、「キット」は、包装された組合せを指し、所望により、組合せのエレメントを使用する方法を実施するための試薬および他の産物および／または成分を含む。たとえば、本明細書において提供される修飾プロテアーゼポリペプチドまたは核酸分子ならびに投与、診断、および生物学的活性または生物学的特性の評価を含むが、これらに限定されない目的のための他のアイテムを含有するキットが提供される。キットは、所望により、使用のための説明書を含む。
本明細書において使用されるように、動物は、これらに限定されないが、ヒト、ゴリラ、およびサルを含む霊長動物；マウスおよびラットなどのようなげっ歯動物；ニワトリなどのような家禽；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどのような反芻動物；ブタなどのようなヒツジに近い動物ならびに他の動物などのような任意の動物を含む。非ヒト動物は、企図される動物としてヒトを除外する。本明細書において提供されるプロテアーゼは、任意の源、動物、植物、原核生物、および菌類に由来するものである。
本明細書において使用されるように、遺伝子療法は、そのような療法が求められる障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトの標的細胞である、ある種の細胞の中へのＤＮＡなどのような異種核酸の移入を伴う。本明細書における目的上、遺伝子療法は、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドをコードする核酸の移入を伴う。ＤＮＡなどのような核酸は、直接的またはベクターもしくは他のデリバリービヒクルなどにおいてＤＮＡなどの異種核酸が発現し、それによって、コードされる治療産物が産生される様式で、選択される標的細胞の中に導入される。その代わりに、ＤＮＡなどのような異種核酸は、いくつかの様式において、治療産物をコードするＤＮＡの発現を媒介することができるまたはそれは、いくつかの様式において、直接的または間接的に治療産物の発現を媒介する、ペプチドまたはＲＮＡなどのような産物をコードすることができる。遺伝的療法はまた、欠陥遺伝子を置換するまたは核酸が導入される哺乳動物もしくは細胞により産生される遺伝子産物を補充する遺伝子産物をコードする核酸を送達するために使用することもできる。導入された核酸は、哺乳動物宿主において通常産生されないまたは治療有効量でもしくは治療的に有用な時に産生されない、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼなどのような治療化合物をコードすることができる。治療産物をコードする、ＤＮＡなどのような異種核酸は、産物またはその発現を増強するまたはその他の場合には改変するために、罹患した宿主の細胞の中への導入の前に、修飾することができる。遺伝的療法はまた、遺伝子発現の阻害因子またはリプレッサーまたは他の修飾因子のデリバリーを伴い得る。
本明細書において使用されるように、遺伝子療法のための治療的に有効な産物は、異種核酸、典型的にＤＮＡによってコードされ、宿主の中への核酸の導入に際して、遺伝性疾患もしくは後天性疾患の症状、徴候を改善させるもしくは排除するまたは疾患を治癒する産物が発現される、産物である。
本明細書において使用されるように、ポリペプチドが、アミノ酸の記載される配列から「本質的になる」という説明は、完全長ポリペプチドの記載される部分またはその断片のみが存在することを意味する。ポリペプチドは、他の源からのさらなるアミノ酸を所望により含むことができ、一般にそれらを含み、またはそれを他のポリペプチドの中に挿入することができる。
本明細書において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に特に明らかに指示しない限り、複数の指示物を含む。したがって、たとえば、「細胞外ドメイン」を含む化合物への言及は、１つまたは複数の細胞外ドメインを有する化合物を含む。
本明細書において使用されるように、範囲および量は、「約」、その特定の値または範囲として表現することができる。約はまた、まさにその量をも含む。したがって、「約５塩基」は、「約５塩基」およびまた「５塩基」をも意味する。
本明細書において使用されるように、「所望による」または「所望により」は、引き続いて記載される事象または状況が、生じるまたは生じないことおよび説明が、前記事象または状況が生じる場合およびそれが生じない場合を含むことを意味する。たとえば、所望により交換される基は、基が交換されないまたは交換されることを意味する。
本明細書において使用されるように、任意の保護基、アミノ酸、および他の化合物についての略語は、他に示されない限り、それらの共通の使用法、認識される略語、またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature（(1972) Biochem. 11:1726を参照されたい）に従うものとする。
Ｂ．止血および第Ｘ因子
本明細書において、修飾された活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）ポリペプチドおよびその触媒活性断片を包含する、修飾された（modify）第Ｘ因子（ＦＸ）ポリペプチドが提供される。血栓形成の共通経路における最初の酵素として、ＦＸは、凝固カスケードにおける独特の重要な位置を占める。ＦＸ上流の凝固因子ＩＸまたはＶＩＩＩにおける欠損は、ＦＸａの不適切な産生をもたらす。不適切なＦＸａの結果は、トロンビンおよび血餅形成フィブリンレベルの低下であり、これは、血友病を生じる［Robertsら (2006). Hemophilia A and hemophilia B. In MA Lichtmanら, eds., Williams Hematology, 7th ed., pp. 1867-1886. New York: McGraw-Hill］。よって、ＦＸは、上流凝固因子における欠損をバイパスするための魅力的な治療法であり、外科手技の最中またはその後の凝血促進等、他の血友病非依存性の医薬適用において有用でもあり得る。
ＦＸａは、カスケードにおける他の凝血因子における欠損をバイパスする治療用凝血原として働く潜在性を有するが、治療法としての完全に機能的なＦＸの使用は、全身性凝固の過剰な活性化のために、非実用的であることを証明した。活性ＦＸａがその活性化補助因子、ＦＶａと会合してプロトロンビナーゼ複合体を形成すると、トロンビン活性化において１００，０００倍を超える増加を生じるが、ＦＸａ単独は、低レベルのトロンビン活性化が可能である［Nesheimら (1979) J. Biol. Chem., 254:10952-10962］。よって、ＦＸａの注入は、望ましくない凝固誘発を生じ得る。実際には、ＦＸａの投与は、インビボ(in vivo)でトロンビン生成を引き起こし、動物モデルにおける播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の誘導に用いられる［Kruithofら (1997) Thombosis and Haemostasis 77(2):308-311; Gilesら (1984) J. Clin. Invest. 74(6):2219-2225］。したがって、治療法としてのＦＸａの使用は、かかる医薬調製物が血栓形成性であり、播種性血管内（intravasal）凝固をもたらし得るという懸念のために限定される。したがって、治療法としてのＦＸの使用のための研究は、不活性チモーゲンＦＸの使用に着目した（例えば、米国特許第４，５０１，７３１号明細書を参照）。本明細書で提供される修飾されたＦＸａポリペプチドを包含する修飾されたＦＸポリペプチドは、これらの問題を克服する。
治療法としてのＦＸａ使用の別の限定要因は、抗トロンビン（ＡＴ）ＩＩＩおよびプロテインＣ等、血漿プロテアーゼ阻害因子（inhibitor）によるその急速な不活性化による、循環ＦＸａの短い半減期に帰する［Gitelら (1984) J. Biol. Chem. 259(11):6890-6895; Gilesら (1988) Br. J. Haematol. 69(4):491-497］。
ＦＸａの望ましくない活性は、凝固経路の活性に限定されない。ＦＸａは、免疫および炎症経路の活性化ならびに傷害に応答した有糸分裂誘発においても十分に立証された役割を果たす［Altieri (1993) Blood 81:569-579; Altieri (1995) FASEB J. 9:860-865; Cirinoら (1997) J. Clin. Invest. 99(10):2446-2451; Leadleyら (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 1(2):169-175］。免疫、炎症および有糸分裂誘発経路のＦＸａ媒介性の活性化は、浮腫等、望まれない効果を生じ得る［Cirinoら (1997) J. Clin. Invest. 99(10):2446-2451］。ＦＸａのこれらの活性は第Ｖ因子とは無関係に生じ、これについてはより詳細に後述する。
重要なことに、第Ｘ因子のチモーゲン立体構造（後述）は、上述の経路を活性化することができない［Ambrosiniら (1997) J. Biol. Chem. 272(13):8340-8345］。したがって、上述の治療法としてのＦＸａ使用の落とし穴を克服するため、本明細書で提供されるＦＸａポリペプチドは、ポリペプチドがチモーゲン立体構造を模倣し、ＦＶａの非存在下において低活性から活性なしを提示するように、ポリペプチドの構造的能力を変更するよう修飾されている。しかし、飽和レベルのＦＶａの存在下では、ＦＸａ突然変異体の活性は、プロトロンビナーゼ複合体へとアセンブルした後に完全に回復される。本明細書に実証されている通り、本明細書で提供される修飾されたＦＸのＦＸａ型は、ＦＶａの非存在下と比較したＦＶａの存在下での触媒活性の比として、１５０，０００以上、一般に、３００，０００以上の相対補助因子依存性を提示する型を包含し、この値は、野生型ＦＸａにより提示されるものをおよそ５０倍〜１００倍超える。
突然変異体Ｉ１９５Ｌ［キモトリプシンナンバリングによるＩ１６Ｌに相当、Ivanciuら (2011) Nature Biotechnology, 29:1028-1033およびBunceら (2011) Blood, 117:290-8を参照］等、チモーゲン様活性を提示することが記述されている本技術分野における既存のＦＸａ突然変異体は、ＦＶａの非存在下で実質的な活性を依然として保持する。このことは、ある特定のチモーゲン様ＦＸａ突然変異体の治療適用を限定し得る。本明細書において、補助因子依存性の大幅な増加を提示（exhibt）する修飾されたＦＸａチモーゲン様ポリペプチドが、血栓症または炎症に関連する毒性を付与することなく凝固を容易にすることにより、治療上の利点を提示することが見出される。したがって、かかる修飾されたＦＸａポリペプチドが、本明細書で提供される。加えて、本明細書で提供されるＦＸａポリペプチドは、ＡＴＩＩＩ等、血漿プロテアーゼ阻害因子による不活性化に抵抗し、他にも循環半減期の増加または改善を提示するポリペプチドも包含する。
次のセクションおよびサブセクションは、ＦＸ型（例えば、チモーゲンおよびＦＸａ型）の凝固経路、構造、プロセッシングおよび調節ならびに凝固経路におけるＦＸの機能について記載する。ＦＶ依存性および非依存性活性の構造、機能および調節についても後述する。
１．凝固経路
凝固は、血液が血餅を形成する複雑な過程である。これは、損傷した血管からの失血の休止である止血の重要な部分であり、そこでは、損傷した血管壁が、血小板およびフィブリン含有血餅に覆われて出血を止め、損傷した血管の修復が始まる。凝固障害は、出血［大出血（hemorrhage）］または閉塞性凝血（血栓症）リスクの増加をもたらし得る。凝固経路は、高度に保存されており、細胞（血小板）およびタンパク質（凝固因子）構成成分に関与する。凝固の第１相において、血小板が活性化されて、傷害部位に止血栓を形成する。続いて、血小板血栓を強化するフィブリン鎖の形成をもたらすタンパク質分解カスケードにおいて作用する、血漿凝固因子に関与する二次止血が起こる。
血小板血栓の補強をもたらすタンパク質分解カスケードは、セリンプロテアーゼの循環チモーゲン（不活性チモーゲン）およびその糖タンパク質補助因子が活性化されて、活性構成成分となり、続いてこれがカスケードにおける次の反応を触媒し、最終的に架橋されたフィブリンをもたらす一連の反応によって生じる。凝固因子は、一般に、ローマ数字で示される（例えば、第Ｘ因子）。ローマ数字に付属する小文字の「ａ」は、活性型を示す（例えば、第Ｘａ因子）。
凝固カスケードは古典的に、３経路へと分けられる：外因性（または組織因子）経路、内因性（または接触活性化）経路および共通経路（図２を参照）。内因性および外因性経路は、並行して生じ、第Ｘ因子において収束して共通経路を形成し、フィブリン血餅の形成をもたらす［Mannら (1990) Blood, 76(1):1-16］。
ａ．組織因子（外因性）凝固経路
凝固は、血管への傷害により、血管を裏打ちする内皮が損傷されてから殆ど直後に開始される。血液凝固開始の一次経路は、組織因子経路である。組織因子（ＴＦ）は、正常であれば血流に曝露（expose）されない、細胞表面上に発現される膜貫通型タンパク質である。血液に曝露されると、ＴＦは、循環セリンプロテアーゼ第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）と会合し、膜表面における第ＶＩＩ因子の活性化（ＦＶＩＩａ）をもたらす。次に、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体（テナーゼとも呼ばれる）は、ＴＦ保有細胞表面における不活性循環第Ｘ因子（ＦＸ）の活性セリンプロテアーゼ（ＦＸａ）への変換を触媒する。
ｂ．内因性凝固経路
内因性凝固経路は、血漿中に内因的に存在する酵素に関与し、血管の統合性が損なわれた後に露出したコラーゲンにおける、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）を包含するタンパク質複合体の形成から始まる。他の事象の中でもとりわけ、ＦＸＩＩは、活性化されてＦＸＩＩａとなり、プロテアーゼカスケードを開始する。ＦＸＩＩａは、（第ＸＩ因子）ＦＸＩをＦＸＩａへと変換する。第ＸＩａ因子は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をＦＩＸａへと活性化する。次に、ＦＩＸａは、その糖タンパク質補助因子、ＦＶＩＩＩａとテナーゼ複合体を形成し、これは、活性化された血小板の表面においてＦＸをＦＸａへと活性化する。
ｃ．共通経路
外因性および内因性経路は、ＴＦ／ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａテナーゼ複合体によるＦＸのチモーゲン型の切断、したがって、活性ＦＸ（ＦＸａ）を形成するＦＸ活性化において収束する（図２）。Ｃａ２＋の存在下における、１：１化学量論におけるＦＸａとその活性化補助因子、第Ｖ因子（ＦＶａ）との相互作用は、膜結合型プロトロンビナーゼ複合体の形成をもたらす。プロトロンビナーゼ複合体は、ＦＸａとそのＦＶａ補助因子、基質プロトロンビンおよびリン脂質表面との会合により膜表面上に形成される。プロトロンビナーゼは、プロトロンビン（ＦＩＩとも呼ばれる）をＡｒｇ３２３−Ｉｌｅ３２４で切断し、続いてＡｒｇ２７４−Ｔｈｒ２７５で切断することにより作用して、活性セリンプロテアーゼ、トロンビン（ＦＩＩａとも呼ばれる）を得る［Krishnaswamyら (1986) J. Biol. Chem., 261:8977-8984; Krishnaswamyら (1987) J. Biol. Chem., 262:3291-3299］。次に、トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンへと変換し、活性化トランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩ因子によるフィブリンタンパク質の架橋後に、傷害部位に血餅をもたらす。
フィブリノーゲンからフィブリンへの変換に加えて、ＦＸａ活性化トロンビンは、フィードバックして直接的な切断により内因性凝固経路をさらに活性化し、これにより内因性凝固経路の数種の構成成分を活性化（例えば、第ＸＩ因子を第ＸＩａ因子へと変換および第ＶＩＩＩ因子を第ＶＩＩＩａ因子へと変換）することにより、凝固の増幅および伝播に関与する。トロンビンは、また、共通経路の第Ｖ因子を活性化し、血小板を活性化することにより、凝固および血栓を伝播する。
プロトロンビナーゼ複合体におけるその役割に加えて、ＦＸａは、トロンビンに加えてＦＶ、ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩを包含する凝固因子を活性化することにより活性をフィードバックすることができ、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の活性化における役割を果たし得る［Fosterら (1983) J. Biol. Chem., 258(22):13970-13977; Eatonら (1986) Biochemistry, 25(2):505-512; Butenas and Mann (1996) Biochemistry, 35(6):1904-1910］。
２．第Ｖ因子非依存性活性
第Ｖ／Ｖａ因子の非存在下で、ＦＸａは、低レベルのトロンビン活性化が可能であり、炎症応答、遺伝子発現および細胞増殖の媒介を包含する非止血性細胞事象においても機能する［Camererら (1999) J. Biol. Chem. 274:32225-32233; Cirinoら (1997) J. Clin. Invest. 99(10):2446-2451; Gajdusekら (1986) J. Cell Biol. 103:419-428; Gasicら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:2317-2320; Herbertら (1998) J. Clin. Invest. 101:993-1000; Koら (1996) J. Clin. Invest. 98:1493-1501; Papapetropoulosら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4738-4742; Sendenら (1998) J. Immunol 161:4318-4324］。これらのＦＶ／ＦＶａ非依存性活性は、下にさらに詳細に記載されている。
ａ．トロンビン活性化
その第Ｖａ因子補助因子の非存在下で、ＦＸａは、一部の触媒活性を維持し、有意に低下されてはいるが、プロトロンビン活性化をもたらす［Nesheimら (1979) J. Biol. Chem., 254:10952-10962］。プロトロンビン活性化の経路は、ＦＸａが溶液中に存在するか、リン脂質の表面においてＦＶａと共にプロトロンビナーゼ複合体に取り込まれているかに依存して明確に異なる。溶液において、プロトロンビン活性化は、プロトロンビンのＡｒｇ２７４における初回切断により進められてプレトロンビンおよび断片１．２を生じ、続いてプレトロンビン断片内のＡｒｇ３２３における第２の切断が行われて、α−トロンビンのジスルフィド結合したＡおよびＢ鎖を生じる［Mannら (1981) Methods Enzymol., 80:286-302］。
対照的に、膜結合型プロトロンビンが、膜結合型プロトロンビナーゼにより活性化される場合、プロトロンビン活性化は、先ずＡｒｇ３２３における切断により進められてメイゾトロンビンのジスルフィド結合した鎖を中間体産物として生じ、続いて、メイゾトロンビンのＡｒｇ２７４における切断が行われて、α−トロンビンおよび活性化ペプチド断片１．２を生じる［Krishnaswamyら (1986) J. Biol. Chem. 261(19) 8977-8984］。
メイゾトロンビン中間体は、それ自体が強力な血管収縮薬として働く優れたセリンプロテアーゼであり［Thompsonら (1987) Blood, 70:410a. (Abstract 1494); Thompsonら (1990) J. Vasc. Med. Biol., 1:348; Doyle and Mann (1990) J. Biol. Chem., 265(18):10693-10701］、トロンボモジュリンに結合されると、抗凝固薬プロテインＣ（後述）を活性化することにより、血液凝固における調節エレメントとして作用し得る［Mannら (1990) Blood, 76(1):1-16］。
ｂ．炎症および細胞増殖
凝固経路におけるその役割に加えて、ＦＸａは、炎症および有糸分裂誘発を包含する他の生理的機序に寄与する［Leadleyら (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 1(2):169-175］。ＦＸａは、主として、エフェクター細胞プロテアーゼ受容体（ＥＰＲ−１）に結合することにより、またはプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）のタンパク質分解による活性化により、様々な細胞におけるこれらのシグナル伝達経路を開始する。
ｉ．エフェクター細胞プロテアーゼ受容体−１（ＥＰＲ−１）
エフェクター細胞プロテアーゼ受容体−１（ＥＰＲ−１）は、単球、白血球、血管内皮細胞および平滑筋（smooth mucscle）細胞の表面におけるＦＸａの受容体として同定された［Altieri (1995) FASEB J 9:860-865; Nicholsonら (1996) J. Biol. Chem. 271:28407-28413; Bonoら (1997) J. Cell. Physiol. 172:36-43］。ＥＰＲ−１へのＦＸａの結合は、白血球活性化［Altieri (1995) J. Leukocyte Biol. 58:120-127］、トロンビン形成［Bouchardら (1997) J. Biol. Chem. 272:9244-9251; Ambrosini and Altieri (1996) J. Biol. Chem. 271:1243-1248）および細胞増殖（Nicholsonら (1996) J. Biol. Chem. 271:28407-28413）をもたらす。白血球活性化は、サイトカインの合成および接着分子の発現を伴い、これは、免疫応答の一部として血管拡張および炎症をもたらす。
成熟ＦＸ配列の位置８３〜８８に位置付けられるＦＸａ配列ＬＦＴＲＫＬ（配列番号５５５）は、ＥＰＲ−１の認識部位である［Ambrosiniら (1997) J. Biol. Chem. 272 (13): 8340-8345; Cirinoら (1997) J. Clin. Invest. 99(10):2446-2451］。ＦＸａ酵素活性は、ＥＰＲ−１結合に必要とされない［Herbertら (1998) J. Clin. Invest. 101:993-1000; Ambrosiniら (1997) J. Biol. Chem. 272 (13): 8340-8345］。しかし、第Ｘ因子のチモーゲン立体構造は、ＥＰＲ−１結合モチーフへの接近を防止するため、ＦＸの活性化は、ＥＰＲ−１結合に必要とされる。ＦＸａの軽鎖における立体構造転移は、相互作用ドメインを露わにし、ＥＰＲ−１結合と、続くシグナル伝達を可能にする。
ｉｉ．プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）
ＦＸａは、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）のタンパク質分解による活性化を介して細胞シグナル伝達を開始することができる。ＰＡＲは、血小板、内皮細胞、筋細胞およびニューロンにおいて高度に発現されるＧタンパク質共役受容体である［Macfarlaneら (2001) Pharmacol. Rev. 53(2):245-282］。特に、ＦＸａは、プロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ−１）およびプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）を切断してＮ末端ペプチドを放出させ、続いてこれはテザーリガンドとして作用して活性化をもたらす［McLeanら (2001) Thombosis Research 103:281-297］。ＰＡＲ−１およびＰＡＲ−２の活性化は、Ｇタンパク質共役シグナル伝達によって媒介される細胞増殖の増加［Macfarlaneら (2001) Pharmacol. Rev. 53(2):245-282］、炎症性サイトカインおよび接着分子の産生の増加［McLeanら (2001) Thombosis Research 103:281-297; Sendenら (1998) J. Immunol 161:4318-4324; Papapetropoulosら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4738-4742］ならびに血栓形成促進性組織因子（ＴＦ）の産生の増加［McLeanら (2001) Thombosis Research 103:281-297］をもたらす。ＦＸａ酵素活性は、ＰＡＲシグナル伝達の活性化に必要とされる［McLeanら (2001) Thombosis Research 103:281-297］。
３．第Ｘ因子阻害因子
第Ｘ因子活性は、血液における３種の主要な抗凝固性タンパク質系によって阻害される：抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）／ヘパリン、プロテインＣ／プロテインＳおよび組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）。３種の系は、第Ｘ因子活性の阻害、それによる凝固経路の阻害において明確に異なる相補的な役割を果たす。
抗トロンビン（ＡＴ−ＩＩＩ）は、第Ｘ因子が、ＡＴ−ＩＩＩの反応部位ループにおける反応性結合に攻撃を開始する際に、タンパク質分解過程の中間段階に酵素を捕獲することにより、第Ｘａ因子のセリンプロテアーゼ活性を阻害する。ヘパリンは、ＡＴ−ＩＩＩの反応部位ループにおける立体構造変化を誘導して、活性部位への第Ｘａ因子の侵入を容易にすることにより、また、第Ｘａ因子の表面における塩基性残基と直接的に相互作用して、安定な不活性三元複合体の形成を容易にすることにより、第Ｘａ因子の阻害を助ける［Rezaie, AR, (2000) J. Biol. Chem., 275(5):3320-3327; Langdownら (2004) J. Biol. Chem., 279 (45): 47288-47297］。
プロテインＣ経路において、血漿中を循環する別のビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼチモーゲンであるプロテインＣは、凝固経路の結果としてのトロンビン形成後に、内皮表面におけるトロンビン−トロンボモジュリン−内皮プロテインＣ受容体複合体による限定タンパク質分解により活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に変換される［Esmon and Owen (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2249-2252］。続いて、活性プロテインＣ（ＡＰＣ）は、タンパク質分解による切断により第Ｖａ因子（ＦＶａ）を不活性化することにより、第Ｘａ因子活性を阻害する。ＦＶａのＡＰＣ消化は、プロテインＳにより、ＦＶａのプロテインＣ切断を触媒し、ＦＸａに結合してプロテインＣの不活性化を阻害することにより容易になる［Mosnier and Griffin JH (2006) Front. Biosci., 11: 2381-2399］。
組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）は、第Ｘ因子チモーゲンではなく第Ｘａ因子の活性部位にまたはその付近に直接的に結合することにより、第Ｘａ因子を阻害する［Brozeら (1988) Blood, 71 (2): 335-343; Brozeら (1990) Biochemistry, 7539-7546］。上に記すＡＴ−ＩＩＩと同様に、ＦＸａのＴＦＰＩ阻害は、ヘパリンの存在下で加速される。続いて、ＦＸａ−ＴＦＰＩ複合体は、ＦＶＩＩａ−組織因子テナーゼ複合体に結合しこれを阻害することにより、組織因子凝固経路（および追加的なＦＸ活性化）を阻害する。
Ｃ．第Ｘ因子構造および活性化
他の凝固酵素と同様に、第Ｘ因子は、タンパク質分解による切断が活性化に必要とされる、チモーゲンと呼ばれる不活性前駆体として血液中を循環する。チモーゲンは、活性化後に産生されるセリンプロテアーゼと比較して、約１０，０００倍以下のタンパク質分解活性を保有する。上に記す通り、血管損傷部位における凝固の開始は、特異的なタンパク質分解による切断によりチモーゲンが変換されて活性プロテアーゼとなって、次に続く反応のための活性酵素を生成する一連の反応をもたらす。ＦＸａは、ＴＦ／ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａテナーゼ複合体により、ＦＸチモーゲンのタンパク質分解による切断により生成される（図２を参照）。これは結果的に、血液細胞活性化および可溶性フィブリノーゲンから不溶性フィブリンへの変換、したがって、血餅の形成をもたらす。過剰なプロテアーゼは、「自殺」基質として作用するか、または活性酵素を認識する循環プロテアーゼ阻害因子との反応により除去される。よって、凝固チモーゲンのタンパク質分解による活性化は、凝固カスケードの重要な調節的特色である。
第Ｘ因子ｃＤＮＡは、多数の哺乳類種からクローニングされている。例示的なＦＸポリペプチドとして、ヒト（配列番号２に表記され、配列番号１にコードされる前駆プレプロペプチド；および配列番号１３４に表記されている成熟型）、キタホオジロテナガザル（配列番号３９３に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４０４に表記されている成熟型）、オリーブヒヒ（アヌビスヒヒ）（配列番号３９４に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４０５の成熟型）、アカゲザル（配列番号３９５に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４０６に表記されている成熟型）、ダスキーティティサル（配列番号３９６に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４０７に表記されている成熟型）、アフリカゾウ（配列番号３９７に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４０８に表記されている成熟型）、マウス（配列番号３９８に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４０９に表記されている成熟型）、ウサギ（配列番号３９９に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４１０に表記されている成熟型）、ラット（配列番号４００に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４１１に表記されている成熟型）、イヌ（配列番号４０１に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４１２に表記されている成熟型）、ブタ（配列番号４０２に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４１３に表記されている成熟型）およびウシ（配列番号４０３に表記されている前駆プレプロペプチドおよび配列番号４１４に表記されている成熟型）が挙げられるがこれらに限定されない。ヒトＦＸの数種のアレル変異体も同定されている［Cargillら (1999) Nat. Gen., 22:231-238；配列番号５４７〜５５２］。
血流中への分泌により不活性ＦＸチモーゲン前駆体のプロセッシングを調節し、機能的ＦＸａ活性酵素の生成をもたらす過程および構造的特色について、ヒトＦＸ成熟、チモーゲンおよびＦＸａポリペプチドを例証しつつ、下に概要を述べる。かかる記載に基づき、当業者であれば、そのアレルまたは種変異体を包含する、他のＦＸポリペプチドにおけるその相当する成熟、チモーゲン、ＦＸａおよび触媒活性型が分かるか、またはこれらを決定することができる。例えば、チモーゲン型が、上述の単鎖成熟型のうちいずれかの２本鎖型を包含し、それにより、ポリペプチドが、ジスルフィド結合により連結された軽鎖および重鎖を含有するように、アミノ酸残基が、単鎖ＦＸの鎖内タンパク質分解により切除されることが理解される。加えて、種およびアレル変異体ならびに他の変異体のＦＸａは、一般に、活性化ペプチドをさらに欠くその２本鎖型として存在する。ヒトＦＸに関して例証する本明細書における記載ならびにその種およびアレル変異体に関する本技術分野における知識に鑑みて、当業者であれば、例証されているアレルおよび種変異体ならびに本技術分野において公知の他の変異体におけるかかる型に相当する残基に精通しており、これを同定することができる。
１．ＦＸプロセッシング、翻訳後修飾およびチモーゲン分泌
第Ｘ因子は、セリンエンドプロテイナーゼであり、キモトリプシン様フォールドを有するプロテアーゼのＳ１ペプチダーゼファミリーのメンバーである。第Ｘ因子をコードするヒト遺伝子は、第１３染色体の長腕（１３ｑ３４）に位置付けられる。これは、８個のエクソンで構成され、およそ３３キロベースの長さであり、主に肝臓において発現される。ヒトＦＸ転写物は、１５６０ヌクレオチドの長さであり、短い５’非翻訳領域と、１４６７ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（終止コドンを包含）と、３’非翻訳領域とを包含する。１４６７ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（またはＦＸ ｍＲＮＡ；配列番号１）は、４８８アミノ酸のプレプロペプチド（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ００７４２；配列番号２）をコードする。
第Ｘ因子は、肝臓において、プレプロペプチドと命名される単鎖前駆体タンパク質として合成される。プレプロペプチドＦＸは、肝細胞の分泌経路を移行する際にプロセッシングされる。ヒトＦＸを例証すると、プレプロペプチドは、第Ｘ因子ポリペプチドを小胞体（ＥＲ）への転位を経て肝細胞分泌経路へと導く、３１アミノ酸のＮ末端シグナルペプチド（配列番号２のアミノ酸１〜３１）を含有する。続いて、シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼにより切断され、新たなアミノ末端に９アミノ酸のプロペプチド（配列番号２のａａ３２〜４０）を残して、プロペプチド型のＦＸを生成する。ポリペプチドが、ＥＲ内腔においてその三次構造へとフォールドされる際に、１２個のジスルフィド結合が形成される。ヒトＦＸを参照すると、これらの結合は、配列番号１３４に表記されている残基に相当する、位置１７および２２、５０および６１、５５および７０、７２および８１、８９および１００、９６および１０９、１１１および１２４、１３２および３０２、２０１および２０６、２２１および２３７、３５０および３６４、３７５および４０３におけるシステイン残基の間に形成される（図１を参照）。
次に、その結果得られたポリペプチドは、ＥＲ内腔において翻訳後修飾される。Ｎ末端プロペプチドは、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼにより数個のグルタミン酸残基（配列番号１３４に表記されているＦＸポリペプチドのアミノ酸６、７、１４、１６、１９、２０、２５、２６、２９、３２および３９に相当））を変換してγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）とするための認識エレメントとして働く［Furie and Furie (1988) Cell, 53:505-518］。このγ−カルボキシル化工程は、ＥＲおよびゴルジ体の間のＦＸ前駆体の輸送における役割を果たし［Stanton and Wallin (1992) Biochem. J., 284:25-31］、循環成熟ＦＸチモーゲンの最適なＣａ２＋媒介性活性化に関与する。ＦＸポリペプチドは、β−ヒドロキシル化およびグリコシル化により、トランスゴルジ区画においてさらに翻訳後修飾される。研究により、これらの残基のグリコシル化が、その生理的活性化因子による第Ｘ因子チモーゲンの認識に重要であることが示された［Yangら (2009) J. Thromb. Haemost., 7(10):1696-1702］。例えば、ヒトＦＸを参照すると、ヒドロキシル化は、配列番号１３４に表記されているＦＸポリペプチドの位置６３に相当するアスパラギン酸残基において生じ［McMullenら (1983) Biochemistry, 22:2875-2884］、グリコシル化は、配列番号１３４に表記されているＦＸポリペプチドの残基１５９および１７１に相当する位置におけるスレオニン残基ならびに残基１８１および１９１に相当する位置におけるアスパラギン残基において生じる［Inoue and Morita (1993) Eur. J. Biochem, 218:153-163］。
プロペプチドは、トランスゴルジ体におけるタンパク質分解による切断により除去されて、プロペプチドを欠く成熟型（配列番号１３４に表記）を生成し、これは、血流へのチモーゲンの分泌に先立ち行われる。加えて、単鎖成熟ＦＸの鎖内タンパク質分解もトランスゴルジ区画において行われ、これは、プロペプチド切断の前であっても後であってもよい［Stanton and Wallin (1992) Biochem. J. 284:25-31］。これは、配列番号１３４に表記されている残基に相当するアミノ酸１４０〜１４２の除去と、２本鎖ポリペプチドの生成をもたらす。よって、その結果得られる分泌されたＦＸチモーゲンは、ジスルフィド結合によって連結された軽鎖および重鎖として存在する。例えば、配列番号１３４に表記されている成熟単鎖型を参照すると、軽鎖は、１３０アミノ酸（配列番号１３４の残基１〜１３９に相当）であり、重鎖は、３０６アミノ酸（配列番号１３４の残基１４３〜４４８に相当）である。分泌されたチモーゲンは、配列番号１３４のアミノ酸１４０〜１４２の切除による２本鎖型として存在し、それにより、ＦＸの軽および重鎖は、配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照したＣｙｓ１３２（軽鎖）およびＣｙｓ３０２（重鎖）の間のジスルフィド結合により連結を維持する［Di Scipioら (1977) Biochemistry, 16:698-706］。
軽鎖および重鎖を含有する、分泌された２本鎖チモーゲン不活性型は、酵素の活性化のために除去される必要がある活性化ペプチドを重鎖のＮ末端に含有する（図２を参照）。配列番号１３４に表記されているヒトＦＸに関して、野生型ＦＸａチモーゲンは、配列番号１３４のアミノ酸１〜１３９に相当するアミノ酸の配列を有する軽鎖と、アミノ酸１４３〜４４８に相当するアミノ酸の配列を有する重鎖とを有し、それにより、活性化ペプチドは、重鎖のアミノ末端における５２アミノ酸残基で構成される。活性ＦＸ（ＦＸａ）は、タンパク質分解による切断により生成されて、さらに後述する活性化ペプチドを除去する。ＦＸａの軽および重鎖は、配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照したＣｙｓ１３２（軽鎖）およびＣｙｓ３０２（重鎖）の間のジスルフィド結合により連結を維持する。
活性化ペプチド（後述）の切断に先立ち、循環する第Ｘ因子のチモーゲン型は、４種の主要セグメントに関してＦＸａとは構造的に明確に異なる構造的立体構造で存在する。「活性化ドメイン」と総称されるこれらのセグメントは、重鎖のＮ末端（活性化ペプチドプラス配列番号１３４の残基１９５〜１９８）ならびに残基３２５〜３３４、３６５〜３７７および４００〜４０６（配列番号１３４に表記されている残基に相当）である。重鎖のＮ末端における活性化ペプチドは、ＦＸの活性化ドメインセグメントを立体構造的に遮断する。不活性チモーゲンにおいて、活性化ドメインは、基質結合ポケット（Ｓ１部位）の一部を覆い、これにより基質接近を制限し、触媒活性を殆ど不可能にする。
２．活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）の活性化および生成
チモーゲン型の活性化切断と、一般に、活性化ペプチドの放出は、活性セリンプロテアーゼの生成に必要とされる。一般に、セリンプロテアーゼに関して、チモーゲンから活性セリンプロテアーゼへの変換は、キモトリプシンナンバリングに従ったＡｒｇ１５後の（典型的には、Ａｒｇ１５およびＩｌｅ１６間の結合の）切断を必要とする。これは、活性化ペプチドの除去をもたらし、Ｉｌｅ１６で始まる触媒ドメインにおける新たなＮ末端を露出させ得る。例えば、ＦＸに関して、活性化されたＦＸ（ＦＸａ）は、配列番号１３４に表記されている残基に相当するアミノ酸１９４〜１９５間のタンパク質分解による切断後に行われる活性化ペプチドの除去により、ＦＸチモーゲンから生成される。ＦＸに関して、タンパク質分解による切断は、インビボにおいて、凝固経路上流の活性化されたセリンプロテアーゼによって、即ち、ＴＦ／ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａテナーゼ複合体によって開始される。タンパク質分解による切断による活性化は、本明細書の実施例に記載されている通り、例えば、ラッセルクサリヘビ毒ＦＸ活性化因子を用いて、インビトロ（in vitro）において誘導することもできる。
活性化ペプチドを除去するためのタンパク質分解プロセッシングは、配列番号１３４に表記されている成熟ＦＸにおける疎水性残基Ｉｌｅ１９５〜Ｇｌｙ１９８に相当する、重鎖の新たなＮ末端を露わにする。その結果得られたＦＸａは、ジスルフィド結合により軽鎖に連結された、触媒として活性を有する重鎖を含有する。配列番号１３４に表記されているアミノ酸の配列に関して、野生型ＦＸａは、配列番号１３４のアミノ酸１〜１３９に相当するアミノ酸残基の配列を有する軽鎖と、配列番号１３４のアミノ酸残基１９５〜４４８に相当するアミノ酸の配列を有する重鎖とを有する。ＦＸａの軽および重鎖は、配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照したＣｙｓ１３２（軽鎖）およびＣｙｓ３０２（重鎖）の間のジスルフィド結合により連結を維持する。
重鎖の露出された新たなＮ末端配列は、触媒ドメインへとフォールドされ、配列特異的様式でＮ末端結合間隙へと挿入される。Ｎ末端挿入は、キモトリプシンナンバリングにより、触媒ドメイン内部におけるＩｌｅ１６およびＡｐｓ１９４のα−ＮＨ２基の間に塩橋の形成をもたらす（配列番号１３４に表記されている成熟ＦＸのナンバリングによるＩｌｅ１９５およびＡｓｐ３７８に相当）。塩橋形成は、活性化ドメインの再編成、触媒作用に必要とされるオキシアニオンホールの形成および基質結合部位の形成を包含する、触媒ドメイン構造における多数の変化に関連する。これらの変化は、活性セリンプロテアーゼの成熟化をもたらす。例えば、疎水性コアにおけるＡｓｐ３７８と新たに露出されたＮ末端の間に埋もれた塩橋の形成を適合させるための三次構造の再編成は、活性化ドメインにＳ１サブサイトを整える立体構造変化をもたらし、活性プロテアーゼを生じる。
配列番号１３４の重鎖残基１９５〜４４８は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼドメインを特色とする。キモトリプシン様セリンプロテアーゼファミリーの他のメンバーと同様に、ＦＸのプロテアーゼドメインは、触媒活性部位において収束する２個のグリークキー（Greek key）β−バレルサブドメインを含有する。残基Ｈｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２およびＳｅｒ３７９は、活性プロテアーゼの活性部位触媒３残基を作り出す。配列番号１３４のＡｒｇ４２９の後のＦＸａの追加的な自己タンパク質分解は、α型のＦＸａをβ型に変換する［Mertens and Bertina, Biochem. J. (1980) 185:647-658］。しかし、ＦＸａのこれら２型は、機能的に識別不能である［Pryzdial and Kessler, J. Biol. Chem. (1996) 271:16621-16626］。
プロテアーゼドメインの活性部位は、Ｓ１〜Ｓ４にナンバリングされる４個のサブポケットに分けられる。Ｓ１ポケットは、三次元構造において触媒３残基の隣に位置付けられ、基質特異性および結合の主要な決定要因である。Ｓ１ポケットは、Ｃｙｓ４０３−Ｃｙｓ３７５ジスルフィド結合によって連結された配列番号１３４の残基３９８〜４０３および３７３〜３７９、ならびに配列番号１３４の残基４０９〜４１２によって形成されるループにより形成される。Ｓ１ポケット内において、Ａｓｐ３７３、Ｇｌｙ４００およびＧｌｙ４１０は、基質結合選択性にとって重要な残基である。Ｓ２部位は、配列番号１３４の残基２７０〜２７９に相当するループによって形成された小型の浅いポケットである［Raiら, Curr. Med. Chem. (2001) 8(2):101-119］。配列番号１３４のＴｙｒ２７９に相当するＴｙｒは、Ｓ２サブサイトにおける酵素特異性に重要である［Rezaie, J. Biol. Chem. (1996) 271(39):23807-23814］。ＦＸａのＳ３区域は、Ｓ１ポケットの周縁部に位置付けられ、溶媒曝露されており、結合特異性を殆ど付与しない。Ｓ４サブサイトは、配列番号１３４のアミノ酸２７０〜２７９および３５０〜３５９を含有するループの間に形成され、３個のリガンド結合ドメインを含有する：「疎水性ボックス」（配列番号１３４の残基Ｔｙｒ２７９、Ｐｈｅ３５６およびＴｒｐ３９９により形成）、「カチオンホール」（配列番号１３４のＧｌｕ２７７の側鎖およびＫ２７６の主鎖により形成）および水部位（配列番号１３４の残基Ｔｈｒ２７８、Ｉｌｅ３５７およびＴｈｒ３５９により形成）［Raiら, Curr. Med. Chem. (2001) 8(2):101-119］。
ＦＸａおよびチモーゲン型の軽鎖は、それぞれ明確に異なる機能特性を保有する、３個の特徴的構造ドメインを有する［Leytusら, Biochemistry. (1986) 25:5098-5102; Padmanabhanら, J. Mol. Biol. (1993) 232:947-966］。γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）リッチドメイン（配列番号１３４の残基１〜３９）は、上述の１１個のＧＬＡ残基を含有し、細胞膜とのＣａ２＋依存性ＦＸ会合に重要である：プロトロンビナーゼ複合体のアセンブリーの要件［Morita and Jackson, J. Biol. Chem. (1986) 261(9):4015-4023］。ＧＬＡドメインに続いて、短い疎水性スタック（配列番号１３４の残基４０〜４５に相当）、ならびに２個の上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン：ＥＧＦ１（配列番号１３４のアミノ酸４６〜８４に相当）およびＥＧＦ２（配列番号１３４のアミノ酸８５〜１２８に相当）が存在し、これは、タンパク質−タンパク質相互作用に関与し、ＥＧＦ１の場合、残基Ｇｌｙ４７、Ｇｌｙ６４、Ｇｌｎ４９、Ａｓｐ／Ｈｙａ６３およびＡｓｐ４６に関与するＣａ２＋結合に関与する［Selander-Sunnerhagenら, J. Biol. Chem. (1992) 267(27):19642-19649］。
ＦＸａは、完全に機能的な活性部位を保有し、プロトロンビンを切断してトロンビンとするための触媒機構を含有するが、ある程度の活性は存在するものの、この反応にとっては不十分な触媒である。この補助因子非依存性活性は、上に記す通り、ＦＸａの注入に伴う有害副作用の原因の一部となる。一般に、生物学的基質の効率的な切断による完全な活性は、補助因子として第Ｖａ因子（ＦＶａ）を必要とする。血小板膜上に存在するＦＶａは、ＦＸａに結合し、リン脂質に対するＦＸａの親和性増加および触媒活性の増加をもたらす［例えば、Segersら (2007) Thromb. Haemost., 98:530-542を参照］。例えば、実施例に示す通り、野生型ＦＸａは、一般に、ＦＶａの存在下で、その非存在下よりも、その基質に対し３０００倍超増加した触媒活性を提示する。ＦＸａにおけるコア補助因子結合エピトープは、配列番号１３４に表記されている残基に相当するＡｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１およびＬｙｓ４１４である［例えば、Rudolphら (2001) J. Biol. Chem., 276:5123-5128を参照］。
Ｄ．修飾第Ｘ因子ポリペプチド
修飾（複数可）を含有しない相当する型のＦＸポリペプチドと比較して変更または改善された活性または特性を提示する、ＦＸチモーゲンプロテアーゼおよび活性ＦＸ（ＦＸａ）プロテアーゼポリペプチドを包含する、変異体または修飾第Ｘ因子（ＦＸ）ポリペプチドが、本明細書で提供される。特に、かかる変更または改善された活性または特性は、ＦＸポリペプチドが活性化された場合に、または修飾されたＦＸａポリペプチドとして存在する場合に明らかである。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおいて変更された活性または特性は、ＦＶａ補助因子依存性の増加、阻害因子に対する抵抗性の増加、グリコシル化のレベルもしくは程度の増加、半減期の増加および／または触媒活性の増加を包含する。例えば、阻害因子に対する抵抗性の増加は、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）または抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）の一方または両方に対する抵抗性の増加として顕在化され得る。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドの活性型は、ＦＶａの存在下を包含して触媒活性、したがって凝血原活性を提示する。かかる修飾されたＦＸポリペプチドは、ＦＶＩＩＩａおよびＦＩＸａ等、凝固カスケードにおけるより初期に作用する酵素の必要を同時にバイパスしつつ、疾患または状態の処置において用いて、凝固活性を提供することができる。
特に、その活性ＦＸａ型で存在する場合、創傷部位における局所的活性の改善を維持または提示するが、補助因子の非存在下では全身性活性を殆ど提示しないから全く提示しない、第Ｘ因子チモーゲンおよびＦＸａポリペプチドを包含する修飾されたＦＸポリペプチドが、本明細書で提供される。この結果は、野生型ＦＸａまたは本技術分野におけるいずれか既存のＦＸａ変異体と比較して実質的に増加した補助因子依存性をもたらす、本明細書で提供される修飾（複数可）によるものである。したがって、活性ＦＸａポリペプチドとして本明細書で提供される修飾されたプロテアーゼは、野生型ＦＸａよりもはるかに優れた効力を提示するが、循環する遊離型は、創傷部位におけるＦＶａ補助因子に結合しているときにのみ強い（即ち、野生型ＦＸａに匹敵する）活性を提示することができるため、安全性の増加を提示し得る。本明細書で提供されるＦＸチモーゲン型およびＦＸａを包含する修飾されたＦＸポリペプチドは、血友病（血友病ＡまたはＢ）を有する対象を処置するための治療適用と共に、外科手術または他の外傷における等、止血を制御するための他の適用において用いることができる。
半減期の増加を提示する、第Ｘ因子チモーゲンおよびＦＸａ型を包含する修飾されたＦＸポリペプチドも包含されている。血友病の処置のための治療法としての第Ｘ因子／第Ｘａ因子チモーゲン／プロテアーゼの使用に関する問題は、それらの短い半減期である。例えば、第Ｘ因子は、２４〜４０時間の半減期を提示する。凝固経路に欠陥または欠損を提示する血友病患者の長期処置のため、不都合かつ望まれない頻度における反復的な投薬を回避するためには、より長い半減期が有利である。本明細書で提供される修飾第Ｘ因子／第Ｘａ因子チモーゲン／プロテアーゼは、グリコシル化のレベルおよび／または種類の変更を理由とする半減期の変更を提示する。グリコシル化は、タンパク質の安定性、溶解性を増加させ、免疫原性を低下させることにより、ポリペプチドの血清半減期を増加させることができる。第Ｘ因子チモーゲンおよびＦＸａ型を包含する本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、ＡＴＩＩＩおよび他の阻害因子等、阻害因子に対する抵抗性の増加により、活性型の場合の半減期の増加も提示する。
ＦＸポリペプチドにおける修飾（複数可）は、発現、精製およびプロセッシング（インビトロまたはインビボ）されたときに、活性化ペプチドを欠く軽鎖と重鎖とを含有するＦＸａをもたらすことのできる型でさえあれば、いかなる型のＦＸポリペプチドになすこともできる。本明細書における目的のため、本明細書におけるＦＸポリペプチドにおけるアミノ酸置き換え（複数可）への言及は、軽鎖（アミノ酸残基１〜１３９に相当）および重鎖（アミノ酸残基１４０〜４４８に相当）を含有し、それにより、重鎖は、ＦＸａ型に正常には存在しないアミノ酸残基１４０〜１４２および５２アミノ酸の活性化ペプチドを含有する、配列番号１３４に表記されている成熟型における残基に関するものである。したがって、修飾された成熟型のＦＸが本明細書で提供される。アミノ酸置き換えは、配列番号１３４に表記されている成熟ポリペプチドとのアライメントにより、本技術分野において公知のいずれかのＦＸ型またはいずれかの変異体ＦＸの相当する残基においてなすことができる（例えば、図１を参照）。よって、ジスルフィド結合により連結された重鎖および軽鎖を含有する、配列番号１３４のアミノ酸残基１４０〜１４２に相当するアミノ酸残基を欠く２本鎖チモーゲン型であり、配列番号１３４に表記されているナンバリングを参照したアミノ酸置き換え（複数可）を含有する、修飾されたＦＸポリペプチドも本明細書で提供される。アミノ酸残基１４０〜１４２に相当するアミノ酸残基を欠き、重鎖における活性化ペプチドを欠き、ジスルフィド結合により連結された重鎖および軽鎖を含有する配列番号１３４の２本鎖型であり、配列番号１３４に表記されているナンバリングを参照したアミノ酸置き換え（複数可）を含有する修飾されたＦＸａ型が、さらに本明細書で提供される。他の型のＦＸまたは配列番号１３４以外の他のＦＸポリペプチドにおける相当する残基は、配列番号１３４とのアライメントにより同定することができる。
本願を通じて、いずれかのセリンプロテアーゼにおけるアミノ酸残基のナンバリングに用いられる一般的なナンバリングスキームである、キモトリプシンナンバリングについて参照することもできる［Greer (1990) Proteins:Structure, Function and Genetics, 7:317-334］。配列番号１３４に表記されている成熟配列およびキモトリプシンに基づくＦＸナンバリングの相当するナンバリングスキームは、本明細書の表１で提供されている。よって、キモトリプシンナンバリングを参照して、本技術分野において公知のいずれかの変異体ＦＸにおいて本明細書で提供されるアミノ酸置き換え（複数可）を生成することも当業者のレベルの範囲内である。
したがって、配列番号１３４に表記されている成熟ＦＸに修飾を含有する修飾されたＦＸポリペプチド、または修飾（複数可）を包含するそのチモーゲン、活性もしくは触媒活性型、あるいは配列番号１３４に対し、または修飾（複数可）を包含するそのチモーゲン、活性もしくは触媒活性型に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するその変異体が、本明細書で提供される。例えば、修飾は、配列番号３９３〜４１４または５４７〜５５２のいずれかに表記されているいずれかの配列等、本技術分野において公知のいずれかのアレルもしくは種変異体または本技術分野において公知の他の変異体（例えば、セクションＤ．５を参照）あるいはそのチモーゲン、活性または触媒活性型を参照してなすことができる。
その結果得られた修飾されたＦＸポリペプチドは、単鎖型であってもよく、または２本以上の鎖を含有してもよい。典型的には、修飾されたＦＸポリペプチドは、２本鎖チモーゲンまたは２本鎖活性ＦＸａである。単鎖ポリペプチドとして本明細書で提供されるいずれかの修飾されたポリペプチドが、自己活性化または活性化されて、２本鎖型を生成できることが理解される。さらに、活性化ペプチドを含有する、チモーゲン型で本明細書で提供されるいずれかの修飾されたポリペプチドは、公知の活性化因子（例えば、他の凝固因子複合体またはＲＶＶ）により活性化されて、修飾されたＦＸａ、２本鎖型を生成することができる。活性化工程は、インビトロで行ってもよく、またはインビボ投与、例えば、チモーゲン型のインビボ投与により引き起こしてもよい。例えば、インビトロで活性化が行われる場合、活性化ペプチドまたは他の切断されたペプチド配列は、本技術分野において公知の通り、また、実施例を包含する本明細書の他の箇所に記載されている通り、最終ＦＸａ型から精製することができる。修飾されたＦＸポリペプチドの活性は、典型的には、その２本鎖活性ＦＸａ型で提示される。
例えば、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合により連結された軽鎖および重鎖を有する２本鎖型を包含する。特に、ＦＸポリペプチドにおける修飾は、配列番号１３４のアミノ酸１〜１３９に相当するアミノ酸の配列を有する軽鎖およびアミノ酸１４３〜４４８に相当するアミノ酸の配列を有する重鎖を有するチモーゲン２本鎖型、またはチモーゲンであり、配列番号１３４のアミノ酸１〜１３９に相当するアミノ酸の配列を有する軽鎖およびアミノ酸１４３〜４４８に相当するアミノ酸の配列を有する重鎖を有するＦＸに対し少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するその変異体におけるものである。他の例において、ＦＸポリペプチドにおける修飾（複数可）は、活性化ペプチドを欠く２本鎖ＦＸａ型におけるものである。例えば、ＦＸポリペプチドにおける修飾（複数可）は、配列番号１３４のアミノ酸残基１〜１３９に相当するアミノ酸の配列を有する軽鎖および配列番号１３４のアミノ酸１９５〜４４８に相当するアミノ酸の配列を有する重鎖を有するＦＸａにおけるもの、または触媒活性を有し、配列番号１３４のアミノ酸残基１〜１３９に相当するアミノ酸の配列を有する軽鎖および配列番号１３４のアミノ酸１９５〜４４８に相当するアミノ酸の配列を有する重鎖を有するＦＸａに対しもしくはその触媒活性部分に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するその変異体におけるものである。
出発点の無修飾の参照ポリペプチドの本明細書で提供される修飾は、アミノ酸置き換えもしくは置換、アミノ酸の付加もしくは欠失またはこれらのいずれかの組み合わせを包含する。例えば、修飾されたＦＸポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０個以上の修飾された位置を有するポリペプチドを包含する。出発参照ＦＸポリペプチドと比較して２個以上の修飾を有する修飾されたＦＸポリペプチドも、本明細書で提供される。修飾されたＦＸポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０個以上の修飾された位置を有するポリペプチドを包含する。
本明細書で提供される修飾（複数可）は、ＦＸポリペプチドのＦＸａ型の活性または特性を変更して、例えば、修飾（複数可）を含有しないＦＸａ型と比較して補助因子依存性を増加させる、阻害因子に対する抵抗性を増加させる、グリコシル化を変更するおよび／または半減期を増加させるいずれか１個または複数の修飾（複数可）を包含することができる。例えば、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、補助因子依存性を増加させる修飾（複数可）を包含することができる。かかる例において、ＦＶａの非存在下での触媒活性（ＦＶａ非依存性触媒活性）を減少させること、および／または補助因子ＦＶａの非存在下での基質親和性（例えば、プロトロンビンに対する）を減少させることにより、補助因子依存性を増加させることができる。別の例において、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、半減期を増加させる修飾（複数可）を包含することができる。かかる例において、半減期の増加は、ＴＦＰＩまたはＡＴ−ＩＩＩ等、阻害因子に対する抵抗性を増加させる１個または複数の修飾（複数可）により引き起こすことができる。他の例において、半減期の増加は、修飾されたＦＸポリペプチドがグリコシル化または高グリコシル化される（hyperglycosylated）ような、新たなグリコシル化部位の付加を生じる１個または複数の修飾（複数可）により引き起こすことができる。本明細書における特定の例において、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、修飾（複数可）を含有しないＦＸと比較して補助因子依存性を増加させ、半減期を増加させる修飾（複数可）を包含することができる。一部の例において、単一のアミノ酸置換または置き換え等、単一の修飾は、ＦＸポリペプチドの２、３、４種以上の特性または活性を変更する。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドと、一般に、そのＦＸａ型は、各特性および活性に関してアッセイして、修飾の効果の範囲を同定することができる。かかるアッセイは、本技術分野において公知であり、後述する。
本明細書で提供される、その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドは、修飾されたＦＸａとしての活性２本鎖型の場合、ＦＶａ依存性凝固活性を提示する。活性型の場合、ＦＶａ依存性活性が保存される、即ち、修飾（複数可）を含有しないＦＸａと比較して保持または増加される。例えば、活性は、修飾（複数可）を含有しないＦＸａのＦＶａ依存性活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％以上である。
その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、修飾（複数可）を含有しないＦＸポリペプチドと比較して、それぞれがその活性２本鎖型である場合、補助因子依存性の増加、阻害因子に対する抵抗性の増加、グリコシル化の変更［例えば、高グリコシル化］および／または半減期の増加を提示し、ＦＶａ依存性凝固活性を保存する限りにおいて、本明細書で提供されるいずれかの修飾は、当業者に公知の他のいずれかの修飾（例えば、セクションＤ．５に表記されているいずれか）と組み合わせることができる。
限定されないが、炭水化物部分の付加、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加、Ｆｃドメインの付加等を包含する、ポリペプチドの一次配列に存在するまたは存在しない他の修飾が、修飾されたＦＸポリペプチドにおいて包含されてもよい。例えば、かかる追加的な修飾は、タンパク質の安定性または半減期を増加させるためになすことができる。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、細胞機構により追加的に修飾されたＦＸポリペプチドも包含し、例えば、グリコシル化された、γ−カルボキシル化されたおよびβ−ヒドロキシル化されたポリペプチドを包含する。
本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子も、本明細書で提供される。特定の例において、核酸配列は、例えば、コードされた配列の発現レベルを増加させるようコドン最適化することができる。特定のコドン使用は、修飾されたポリペプチドが発現される宿主生物に依存する。当業者であれば、哺乳類またはヒト細胞、細菌または酵母、例えば、エシェリキア・コリ（E. coli）またはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等における発現に最適なコドンに精通している。例えば、コドン使用情報は、kazusa.or.jp.codonにおいて利用できるコドン使用データベースから入手することができる［例えば、データベースの記載に関してRichmond (2000) Genome Biology, 1:241を参照］。Forsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047; Brownら (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298; Sharpら (1988) Nucleic Acids Res., 12:8207-8211; Sharpら (1991) Yeast, 657-78も参照されたい。
一部の例において、コード核酸分子が、ポリペプチドのプロセッシングを変更するための異種配列を含有するよう修飾されてもよい。例えば、核酸は、ポリペプチドの分泌もしくは産生を増加させるために、またはタンパク質の機能的産生を他の形で改善するために、異種シグナル配列、プレプロペプチド（シグナル配列およびプロペプチドを含有）またはプロペプチドをコードする核酸を含有することができる。特定の例において、核酸は、第Ｘ因子のプロペプチドよりもガンマ−カルボキシラーゼに対し変更された（例えば、低下した）親和性を提示する、ビタミンＫ依存性タンパク質のプレプロペプチドまたはプロペプチドをコードする核酸を含有することができる。ガンマ−カルボキシラーゼは、第Ｘ因子の活性に必要とされる、グルタミン酸（Ｇｌｕ）からガンマカルボキシルグルタミン酸（Ｇｌａ）への修飾を触媒する酵素である。第Ｘ因子のプロペプチドの親和性は、第ＶＩＩ因子、プロテインＳ、第ＩＸ因子、プロテインＣおよびプロトロンビン等、他のビタミンＫ依存性ポリペプチドと比べてガンマ−カルボキシラーゼに対し最高の親和性を有する［Camireら (2000) Biochemistry, 39:14322-9］。ガンマ−カルボキシラーゼに対し低下した親和性を提示する別のビタミンＫ依存性ポリペプチドのプレプロペプチドまたはプロペプチドを含有するようコード核酸を修飾することは、より優れた基質代謝回転を可能にし、ひいてはタンパク質産生を改善し、ガンマ−カルボキシル化された産生総タンパク質のパーセンテージの増加をもたらすことにより、ガンマ−カルボキシル化を増強させる。例えば、プロトロンビンプロペプチド（配列番号４１５〜５４６のうちいずれかのアミノ酸残基１〜４３として表記）をコードする異種配列を含有する、修飾されたＦＸポリペプチドをコードする核酸が本明細書で提供される。本明細書の他の箇所に記載されている通り、コード核酸は、カルボキシル化された第Ｘ因子の分率をさらに増加させるために、ビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）トランスフェクト細胞において産生することもできる［例えば、Sunら (2005) Blood, 106:3811-3815を参照］。
本明細書で提供される修飾されたポリペプチドおよびコード核酸分子は、当業者に公知の標準組換えＤＮＡ技法により産生することができる。標的タンパク質におけるいずれかの１個または複数のアミノ酸に突然変異を引き起こすための、本技術分野において公知のいずれかの方法を用いることができる。方法は、コード核酸分子の標準部位特異的もしくはランダム突然変異誘発または固相ポリペプチド合成方法を包含する。特に、ペプチド合成と、続くペプチドライゲーションを包含する全面的な化学合成方法を用いることができる。ＦＸポリペプチドをコードする核酸分子は、コード核酸のランダム突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ等のキット等、キットを使用）、重複ＰＣＲ、遺伝子シャッフリングまたは他の組換え方法等、突然変異誘発に付すことができる。続いて、ポリペプチドをコードする核酸は、異種的に発現されるよう宿主細胞に導入することができる。一部の例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、全面的な化学合成、固相または溶液相ペプチド合成の使用等、合成的に産生される。
後述するサブセクションにおいて、変更された特性および活性を提示し、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａ型を包含し、核酸分子をコードする、本明細書で提供される例示的な修飾されたＦＸポリペプチドが記載される。後述の記載は、補助因子依存性の増加、阻害因子（例えば、ＡＴ−ＩＩＩ）に対する抵抗性の増加およびグリコシル化の変更の中から得られる１種または複数の特性または活性に基づき編成される。本明細書で提供される修飾されたポリペプチドのうち１種または複数が、上に同定されている特性または活性のうち１、２または全種を提示し得るように、これらの特性および活性が相互排他的ではないことが理解される。
さらに、配列番号１３４に表記されている位置を参照した位置１９５におけるＶａｌ、Ａｌａ、ＳｅｒもしくはＴｈｒへのおよび／または位置１９６におけるＩｌｅ、Ａｌａ、ＳｅｒもしくはＴｈｒへの（キモトリプシンナンバリングによる残基１６および１７に相当）修飾を含有する修飾されたＦＸポリペプチドの本明細書に後述する一部の例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、野生型第Ｘ因子に存在しないプロテアーゼプロセッシング部位をもたらすために、別のセリンプロテアーゼ由来の異種活性化ペプチドを含有しない。一例において、前駆体、成熟またはチモーゲン型として、位置１９５および／または１９６（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒによる）にアミノ酸置き換えを含有する、本明細書で提供される修飾第Ｘ因子ポリペプチドは、プロテアーゼ切断部位の一部としてＡｒｇ１９４（キモトリプシンナンバリングによるＡｒｇ１５）を含有する。特定の例において、本明細書で提供される第Ｘ因子ポリペプチドの前駆体、成熟またはチモーゲン型は、配列番号１３４に表記されているアミノ酸の配列のアミノ酸残基１４３〜１９４に相当するＦＸ活性化ペプチドを含有する。本明細書における例において、位置１９５および／または１９６（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒによる）に修飾を含有する、活性型の本明細書で提供される修飾されたＦＸａポリペプチドは、配列番号１３４に表記されているアミノ酸の配列のアミノ酸残基１４３〜１９４に相当する活性化ペプチドを含有する修飾されたＦＸチモーゲンの活性化切断およびプロセッシングにより活性にされる。
１．グリコシル化の変更
ポリペプチドのグリコシル化が変更されるように、ＦＸポリペプチドに１個または複数の修飾（複数可）を含有する、修飾されたＦＸチモーゲンおよび修飾されたＦＸａポリペプチドを包含する修飾されたＦＸポリペプチドが、本明細書で提供される。修飾は、アミノ酸の挿入、欠失または置き換えとなり得る。特に、修飾は、アミノ酸置き換えである。グリコシル化部位は、グリコシル化が可能な真核細胞においてポリペプチドが産生される際にこれがグリコシル化されるような、グリコシド結合を介したポリペプチドへの単糖およびオリゴ糖の付着のための部位を提供する。２種の主要な型のグリコシル化は、アスパラギン残基のアミド窒素を介して糖単位が付着されるＮ結合型グリコシル化と、セリン、スレオニン、ヒドロキシリジンまたはヒドロキシプロリン残基のヒドロキシル基を介して糖単位が付着されるＯ結合型グリコシル化である。他のよりマイナーな型のグリコシド結合は、システインへのＳ結合およびトリプトファンへのＣ結合を包含する。Ｎ結合型グリコシル化は、コンセンサス配列−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓ（式中、Ｘａａはプロリンではない）におけるアスパラギンに生じる。Ｏ−グリコシル化に公知のモチーフは存在しないが、Ｏ−グリコシル化は、高比率のセリン、スレオニンおよびプロリン残基を有する配列に存在する可能性がより高い。しかし、潜在的グリコシル化部位の存在は、その部位が、ＥＲにおける翻訳後プロセッシングにおいてグリコシル化されることを保証しない。さらに、グリコシル化のレベルは、所定の部位において変動する可能性があり、ある一部位は、多くの異なるグリカン構造を有し得る。
ＦＸは、一般に、ポリペプチドの活性化ペプチド部分（配列番号１３４を参照した残基Ｔｈｒ１５９、Ｔｈｒ１７１、Ａｓｎ１８１およびＡｓｎ１９１に相当）に存在する２個のＯ結合型および２個のＮ結合型グリコシル化部位を有する、グリコシル化されたタンパク質である。これらのグリコシル化残基は、生理的活性化因子によるチモーゲン活性化に必要とされる［例えば、Yangら (2009) J. Thromb. Haemost., 7:1696-1702を参照］。
本明細書において、ポリペプチドの機能および活性を変更することができる、さらに別のグリコシル化部位をＦＸに導入してよいことが見出される。一般に、ポリペプチドの機能および活性は、さらに別のグリコシル化部位の付加により改善または増加され、これにより治療上の利益をもたらす。例えば、グリコシル化は、タンパク質の安定性、溶解性を増加させ、免疫原性を低下させることにより、ポリペプチドの血清半減期を増加させることができる。グリコシル化は、タンパク質のタンパク質分解を低下させることにより、タンパク質の安定性を増加させることができ、熱分解、変性剤への曝露、酸素フリーラジカルによる損傷およびｐＨの変化からタンパク質を保護することができる。グリコシル化は、標的タンパク質が、細胞表面受容体を包含する他のタンパク質への結合に関与し得るクリアランス機序から逃れることを可能にすることもできる。シアル酸を含有する炭水化物部分は、タンパク質の溶解性に影響を及ぼすことができる。シアル酸部分は、高度に親水性であり、標的タンパク質の疎水性残基を遮蔽することができる。これは、標的タンパク質の凝集および沈殿を減少させる。凝集の減少は、標的タンパク質に対する免疫応答の防止も助ける。炭水化物は、さらに、免疫系から免疫原性配列を遮蔽することができる。炭水化物部分に占有される空間の容量は、免疫系によって調査される利用できる表面積を減少させることができる。これらの特性は、標的タンパク質の免疫原性の低下をもたらす。
したがって、グリコシル化の変更を提示する、本明細書で提供されるＦＸポリペプチドは、血液における半減期の増加を包含する、薬物動態および薬力学特性の改善を提示することができる。グリコシル化の変更を提示する、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、触媒活性の増加および／または阻害因子に対する抵抗性の増加等、他の活性および特性の変更を提示することもできる。特に、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドの中でも、グリコシル化の変更を提示するポリペプチドと、補助因子依存性の増加（例えば、セクションＤ．２を参照）またはＴＦＰＩもしくはＡＴ−ＩＩＩ等の阻害因子に対する抵抗性の増加（例えば、セクションＤ．３を参照）のうち一方または両方を提示するポリペプチドが包含される。
本明細書で提供されるＦＸポリペプチドの中でも、無修飾のＦＸポリペプチドと比較してグリコシル化のレベルおよび／または種類を変更させることにより修飾されたポリペプチドが包含される。グリコシル化は、無修飾のＦＸポリペプチドと比較して増加または減少され得る。場合によっては、グリコシル化のレベルまたは程度が増加され、高グリコシル化されたＦＸポリペプチドをもたらす。これは、例えば、無修飾のＦＸポリペプチドにおいては見出されない、炭水化物が連結される少なくとも１個の非天然グリコシル化部位を取り込むことにより達成することができる。高グリコシル化されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドにおいて見出されるがグリコシル化されていない、少なくとも１個の天然グリコシル化部位への炭水化物部分の連結により生成することもできる。
本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、変更された、例えば、新たなＯ結合型グリコシル化、Ｎ結合型グリコシル化またはＯ結合型およびＮ結合型グリコシル化を含有することができる。一部の例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、それぞれ異なるグリコシル化部位に連結された１、２、３、４、５個以上の炭水化物部分を包含する。グリコシル化部位（複数可）は、天然グリコシル化部位（複数可）および／または非天然グリコシル化部位（複数可）となり得る。一部の例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、２個以上の非天然グリコシル化部位がグリコシル化される。例えば、修飾されたＦＸポリペプチドは、１、２、３、４、５個以上の非天然グリコシル化部位を導入するよう修飾することができる。
非天然グリコシル化部位は、アミノ酸置き換えにより導入することができる。Ｏ−グリコシル化部位は、例えば、セリンまたはスレオニンによる天然残基のアミノ酸置き換えにより作製することができる。Ｎ結合型グリコシル化部位は、モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓ（式中、Ｘａａはプロリンではない）を作製することにより作製することができる。アミノ酸修飾によるこのコンセンサス配列の作製は、アスパラギンによる天然アミノ酸残基の置き換え、セリン、スレオニンもしくはシステインによる天然アミノ酸残基の置き換えまたはアスパラギンによる天然アミノ酸残基の置き換えおよびセリン、スレオニンもしくはシステインによる天然残基のアミノ酸置き換えに関与し得る。非天然グリコシル化部位は、ＦＸポリペプチドにおけるいずれかの領域において作製することができる。例えば、１個または複数のグリコシル化部位は、軽鎖および／または重鎖に導入することができる。一部の例において、１個または複数のグリコシル化部位は、軽鎖のＥＧＦ１ドメインにおいて導入される。他の例において、非天然グリコシル化部位は、重鎖のプロテアーゼドメイン領域に導入される。グリコシル化のレベル（例えば、導入された非天然グリコシル化部位の数）は、無修飾または野生型ＦＸポリペプチドのグリコシル化のレベルと比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上増加され得る。
本明細書で提供される例示的な修飾（複数可）は、限定されないが、それぞれ配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置５１に相当する位置におけるＮ；位置５６に相当する位置におけるＮおよび位置５８に相当する位置におけるＳ；位置６２に相当する位置におけるＮおよび位置６４に相当する位置におけるＳ；位置６５に相当する位置におけるＮおよび位置６７に相当する位置におけるＳ；位置６７に相当する位置におけるＮ；位置７３に相当する位置におけるＮおよび位置７５に相当する位置におけるＳ；位置７５に相当する位置におけるＮおよび位置７７に相当する位置におけるＳ；位置７７に相当する位置におけるＮおよび位置７９に相当する位置におけるＳ；位置７８に相当する位置におけるＮおよび位置８０に相当する位置におけるＳ；位置８２に相当する位置におけるＳ；位置８３に相当する位置におけるＮ；位置８２に相当する位置におけるＮおよび位置８４に相当する位置におけるＳ；位置８５に相当する位置におけるＮおよび位置８７に相当する位置におけるＳ；位置８６に相当する位置におけるＮおよび位置８８に相当する位置におけるＳ；位置９５に相当する位置におけるＮおよび位置９７に相当する位置におけるＳ；位置１１４に相当する位置におけるＮ；位置１１９に相当する位置におけるＮおよび位置１２１に相当する位置におけるＳ；位置１２２に相当する位置におけるＳ；位置２１５に相当する位置におけるＮおよび位置２１７に相当する位置におけるＳ；位置２４３に相当する位置におけるＮおよび位置２４５に相当する位置におけるＳ；位置２６４に相当する位置におけるＮおよび位置２６６に相当する位置におけるＳ；位置２９３に相当する位置におけるＮおよび位置２９５に相当する位置におけるＳ；位置３８８に相当する位置におけるＮ；位置３８９に相当する位置におけるＮおよび位置３９１に相当する位置におけるＳ；位置４２８に相当する位置におけるＮおよび位置４３０に相当する位置におけるＳ、および／または位置４２９に相当する位置におけるＮおよび位置４３１に相当する位置におけるＳによる、無修飾のＦＸポリペプチドにおけるアミノ酸置き換え（複数可）を包含する、１個または複数のアミノ酸置き換え（複数可）による修飾による非天然グリコシル化の導入を包含する。配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照した、非天然グリコシル化を導入するための本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおける非限定的なアミノ酸置き換え（複数可）が、表４に表記されている。
典型的には、グリコシル化が変更された、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、ＦＸの少なくとも１種の活性を保持する。場合によっては、無修飾のＦＸポリペプチドと比較した、修飾されたＦＸポリペプチドに存在するグリコシル化レベルの変更またはグリコシル化の種類の変化は、触媒活性の増加および／またはＡＴ−ＩＩＩ等の阻害因子に対する抵抗性の増加として顕在化され得る。活性の増加は、グリコシル化の付加を理由とすることができるか、または非依存的にもしくはグリコシル化の変更と協調して作用して活性の変化を引き起こす二次的アミノ酸修飾（複数可）を理由とすることができる。セクションＤ．２およびセクションＤ．３は、本明細書で提供される修飾（複数可）のうちいずれかと組み合わせてグリコシル化を変更することができる、例示的な修飾（複数可）について記載する。
例えば、グリコシル化が変更された本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、無修飾のＦＸと比較して、半減期の増加、触媒活性の増加および／または凝固活性の増加を提示する。グリコシル化が変更された修飾されたＦＸポリペプチドの半減期は、無修飾または野生型ＦＸポリペプチドの半減期と比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上増加され得る。半減期は、本明細書に記載されている薬物動態（ＰＫ）またはクリアランス試験の実施（例えば、実施例７）等により、本技術分野において公知のアッセイにおいて測定されるものを用いて決定することができる。グリコシル化が変更された修飾されたＦＸポリペプチドの触媒活性は、インビボまたはインビトロいずれかのアッセイにおいて測定される無修飾または野生型ＦＸポリペプチドの触媒活性と比較して、少なくともまたは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上増加され得る。触媒活性の増加は、ＦＶａ依存性および／またはＦＶａ非依存性触媒活性となり得る。典型的には、グリコシル化が変更された本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、ＦＶａ依存性触媒活性を保持する、または修飾されたポリペプチドが補助因子依存性の増加を提示するような、ＦＶａ依存性触媒活性の増加を提示する。例示的なかかる修飾されたＦＸポリペプチドは、セクションＤ．２に表記されている。
他の例において、グリコシル化が変更された本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、無修飾のＦＸと比較して、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増加等、阻害因子に対する抵抗性の増加を提示する。グリコシル化が変更された修飾されたＦＸポリペプチドのＡＴ−ＩＩＩ等の阻害因子に対する抵抗性は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、４０００倍、４５００倍、５０００倍、５５００倍、６０００倍以上増加され得る。よって、適切なインビトロ、インビボまたはエクスビボ（ex vivo）アッセイにおいて評価される場合、グリコシル化が変更された修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドの抵抗性と比較して、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増加を呈することができる。例示的なかかる修飾されたＦＸポリペプチドは、セクションＤ．３に表記されている。
２．補助因子依存性の増加
ＦＸポリペプチドに１個または複数の修飾（複数可）を含有し、活性ＦＸａ型の場合、補助因子ＦＶａの非存在下（ＦＶａ非依存性活性）と比較して、ＦＶａの存在下で（ＦＶａ依存性活性）より優れた触媒活性を提示する、修飾されたＦＸチモーゲンおよび修飾されたＦＸａポリペプチドを包含する、修飾されたＦＸポリペプチドが本明細書で提供される。修飾は、アミノ酸の挿入、欠失または置き換えとなり得る。特に、修飾は、アミノ酸置き換えである。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しないＦＸａと比較して、ＦＶａの非存在下に対するＦＶａの存在下の触媒活性の比としての補助因子依存性の増加を提示する。
ＦＶａは、ＦＸａの活性を実質的に増加させるよう作用するが、野生型ＦＸａは、ＦＶａの非存在下であってもある程度の活性を提示する。例えば、本明細書の実施例に例証されている通り、野生型ＦＸａ（例えば、血漿由来または組換えにより産生）の補助因子依存性は、およそ３，０００である。上に記す通り、ＦＶａ非依存性活性は、治療法としてのＦＸａの使用を限定する望まれない活性をもたらし得る。本明細書において、ＦＶａ依存性活性を保持しつつ、ＦＶａ非依存性活性の限定または低下を達成することができることが見出される。ＦＶａの存在下における触媒活性の変化は、ＦＶａ依存性凝固活性の増加として顕在化され得る。よって、膜表面におけるプロトロンビナーゼ活性を維持しつつ、望まれない活性を低下、最小化または消失させて、治療適用に必要とされる血餅形成を引き起こすことができる。活性ＦＸａポリペプチドとしての本明細書で提供される修飾されたプロテアーゼは、野生型ＦＸａよりもはるかに優れた効力を提示する一方、循環する遊離型は、創傷部位におけるＦＶａ補助因子に結合しているときにのみ活性を提示し得るため、さらにより安全となり得る。
補助因子依存性の増加は、ＦＸチモーゲンからＦＸａへの立体構造スイッチに関連する、ＦＸの重鎖における１個または複数のアミノ酸残基の修飾により達成される。正常には、ＦＸは、活性化前にチモーゲン型を好み、活性化後にＦＸａ型を好む、チモーゲンから活性プロテアーゼへの立体構造型の平衡状態で存在する。チモーゲン型において、一次特異性ポケット（例えば、Ｓ１結合部位）およびオキシアニオンホールは、その「活性立体構造」において存在しないまたは安定化されず、このことは、チモーゲン型を不活性にする。加えて、基質特異性の拡張部位（エキソサイト）およびＦＶａ結合部位もまた、「活性立体構造」へと適切に形成されないまたは安定化されない。変更された活性状態への転移は、Ａｒｇ１９４−Ｉｌｅ１９５（キモトリプシンナンバリングによるＡｒｇ１５−Ｉｌｅ１６）間の結合の切断によりシフトさせることができ、これにより、Ａｓｐ３７８（キモトリプシンナンバリングによるＡｓｐ１９４）との塩橋の形成に関与する新たなＮ末端の作製をもたらす。プロテアーゼ状態への転移は、ＦＸａ型との安定化相互作用の存在により、結合切断なしでも生じ得る。例えば、ＦＶａ補助因子は、ＦＸａとの強い安定化相互作用をもたらし、平衡をＦＸａ型へとシフトさせる。
結合切断により、このチモーゲンから活性酵素への転移は、活性酵素を産生するためのプロテアーゼの他の立体構造変化とも関連する。例えば、配列番号１３４を参照した成熟ナンバリングによる残基１９５〜１９８、３２５〜３３４、３６６〜３７７および４００〜４０６（キモトリプシンナンバリングによる残基１６〜１９、１４２〜１５２、１８４〜１９３および２１６〜２２３に相当）に相当する活性化ドメインにおける立体構造変化は、一次特異性ポケットまたは基質結合部位およびオキシアニオンホールを再び整え、安定化する［Tosoら (2008) J. Biol. Chem., 283:18627-18635］。さらに、プロトロンビン結合および触媒作用に関与する、残基２１３〜２１９および２４９〜２５９（キモトリプシンナンバリングによる残基３４〜４０および７０〜８０に相当）を含有するループによって形成されるエキソサイト１は、プロエキソサイト状態で存在し、転移に伴う立体構造変化を有する活性立体配置でのみ発現される［Bockら (2007) J. Thromb. Haemost., 5:81-94］。チモーゲンから活性酵素への立体構造変化は、コア補助因子結合エピトープを形成するエキソサイト２におけるＡｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１およびＬｙｓ４１４を包含するＦＶａ結合部位の発現ももたらす［Bianchini (2004) J Biol. Chem., 279:3671-3679も参照］。活性酵素立体構造は、基質結合によっても安定化される。
ＦＸタンパク質の立体構造的平衡は、チモーゲンから活性酵素への転移に関連するアミノ酸残基の修飾によってシフトされ得る。これらの残基における修飾は、平衡をチモーゲン様状態へとシフトさせることができる。チモーゲンから活性酵素への転移に関連する残基は、アミノ酸残基１９５〜１９８（キモトリプシンナンバリングによる残基１６〜１９に相当）等、新たなＮ末端における残基を包含する。チモーゲン転移に関連する他の残基は、立体構造変化において直接的に役割を果たすか、または他の形でエネルギー的に連結される、活性化ドメインおよびエキソサイト（上に表記）における残基を包含する。これらの領域における残基の突然変異は、転移過程における活性化された酵素の活性化ドメインおよび／またはエキソサイトの構造的撹乱をもたらし、これにより、基質結合および／または触媒作用を変更し、チモーゲン様活性をもたらすことができる。例えば、活性化ドメインの一部は、構造的に変更されると基質のタンパク質分解の低下をもたらし得る自己溶解ループ（キモトリプシンナンバリングによる残基１４２〜１５２に相当）である。したがって、これらの領域における突然変異は、ＦＸａ型をさらに不安定化し、チモーゲン様状態を好む平衡のシフトをもたらすことができる。本明細書において、上述のドメインに関連するまたはこれに極めて近接した残基の修飾を修飾し、ＦＶ非依存性活性に影響を及ぼし、実質的に増加した補助因子依存性を提示するプロテアーゼをもたらすこともできることが見出される。触媒３残基は、触媒活性に必要とされるため、突然変異誘発の標的にされない（例えば、配列番号１３４を参照したＨｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２およびＳｅｒ３７９）。
特に、上述のチモーゲンから活性酵素への転移において生じる、分子間塩橋または他の「カップルされた」立体構造変化の形成を崩壊またはこれを不安定化させるために、修飾は、結合切断後にＦＸａへの転移を開始するＮ末端ペプチドセグメントにおける残基においてなされる。例えば、ＦＸａにおけるＩｌｅ１９５と、また、ある程度までＶａｌ１９６は、タンパク質部分の内に埋もれ、それにより、Ｉｌｅ１９５のα−アンモニウム基およびＡｓｐ３７８の側鎖カルボキシレート基が、内部塩橋を形成する。この塩橋は、活性酵素を安定化する。例えば、位置１９５、１９６および／または３７８におけるアミノ酸残基の修飾による塩橋の崩壊は、チモーゲン様構造に向けた活性酵素構造の形質転換をもたらすことが見出される。隣接残基１９７および１９８の修飾もまた、酵素をチモーゲン様構造へと形質転換するための修飾の標的である。
加えて、本明細書で提供される修飾は、一部のセリンプロテアーゼにおいてチモーゲン状態を安定化することが公知のチモーゲン３残基における修飾を包含する。例えば、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンのチモーゲン構造において、Ａｓｐ３７８（キモトリプシンナンバリングによるＡｓｐ１９４）に相当する側鎖は、位置２１１における埋もれたヒスチジン（キモトリプシンナンバリングによるＨｉｓ４０）とのイオン対によって安定化され、このヒスチジンは、位置２１９（キモトリプシンナンバリングによるＳｅｒ３２）とも水素結合を形成する［Madisonら (1993) Science, 262:419-421］。このチモーゲン３残基(zymogen triad)（キモトリプシンナンバリングによるＡｓｐ１９４−Ｈｉｓ４０−Ｓｅｒ３２）は、チモーゲン型を安定化する。ロイシン（Ｌ）は、位置２１１（キモトリプシンナンバリングによる位置３２に相当）に存在し、グリシン（Ｇ）は、位置２１９（キモトリプシンナンバリングによる位置４０に相当）に存在するため、相当するチモーゲン３残基は、ＦＸには存在しない。したがって、本明細書における修飾は、ＦＸにおいて相当するチモーゲン３残基（キモトリプシンナンバリングによるＡｓｐ１９４−Ｈｉｓ４０−Ｓｅｒ３２）が形成された修飾を包含する。
ＦＸのチモーゲン型と同様に、チモーゲン様立体構造状態のＦＸａポリペプチドは、触媒活性を殆ど提示しない。上に記す通り、活性は、ＦＶａ補助因子によって調節することができる。恐らく、プロテアーゼドメインの立体構造活性化が、ＦＶａ結合部位の露出に要求されるため、ＦＸのチモーゲン型およびＦＸａのチモーゲン様型は、一般に、ＦＶａに対する親和性の低下を提示する。にもかかわらず、ＦＶａは、このように強い安定剤であるため、チモーゲン様立体構造状態からＦＸａへの平衡は、過剰なＦＶａ補助因子の強い安定化存在の存在下で救出され得る。したがって、本明細書における例において、チモーゲン様変異体は、ＦＶａの非存在下で活性を殆ど提示しないが、ＦＶａの存在下で実質的な活性を提示することができる。その結果得られたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しないＦＸａと比較して増加された、ＦＶａの非存在下と比較したＦＶａの存在下での触媒活性の比（相対補助因子依存性とも呼ばれる）を提示する。補助因子依存性の増加は、ＦＶａの非存在下における触媒活性の減少および／またはＦＶａの存在下における触媒活性の増加によるものとなり得る。
例えば、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、活性ＦＸａ型の場合、１０，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；１００，０００；２００，０００；３００，０００；４００，０００；５００，０００；６００，０００；７００，０００；８００，０００；９００，０００；１，０００，０００；２，０００，０００；３，０００，０００；４，０００，０００；５，０００，０００；６，０００，０００；７，０００，０００；８，０００，０００；９，０００，０００；１０，０００，０００；１５，０００，０００；２０，０００，０００；２５，０００，０００；３０，０００，０００；３５，０００，０００；４０，０００，０００；４５，０００，０００；５０，０００，０００以上を超える等、５０００を超える相対補助因子依存性を提示する。修飾（複数可）を含有しないＦＸａと比較して、相対補助因子依存性は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、４０００倍、４５００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１００００倍、１５０００倍、２００００倍以上増加する。よって、適切なインビトロ、インビボまたはエクスビボアッセイにおいて評価される場合、修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドと比較して、補助因子依存性の増加を呈することができる。
かかる修飾されたＦＸポリペプチドの中でも、配列番号１３４に表記されている位置に相当する、ＦＸの重鎖におけるアミノ酸位置（複数可）１９５、１９６、１９７、１９８、２００、２０２、２１１、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２７３、２７６、３０６、３２６、３２７、３３２、３３４、３３６、３３８、３７８、４２０および／または４２４に修飾（複数可）を含有するポリペプチドが包含される。例えば、本明細書に提示される修飾されたＦＸポリペプチドは、アミノ酸位置（複数可）１９８、２０２、２１１、２１４、２１７、２１９、３２７および／または３３８に修飾（複数可）を含有するポリペプチドを包含する。一般に、修飾は、アミノ酸置き換えである。その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、アミノ酸置き換え（複数可）を含有しないＦＸａと比較して補助因子依存性の増加を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、アミノ酸置き換えは、その位置における他の１９種類のアミノ酸のいずれと行ってもよい。
一例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３４に表記されている通り、位置１９５、１９６、１９７または１９８（キモトリプシンナンバリングによる位置１６〜１９）、例えば、少なくとも、位置１９６に相当する位置における少なくとも１個のアミノ酸置き換え（複数可）等、少なくとも１個のアミノ酸修飾（複数可）を含有する。これらのアミノ酸残基は、ＦＸチモーゲンの活性化切断により露出された新たなＮ末端における疎水性残基に相当する。本明細書の他の箇所で記述されている通り、Ｎ末端における疎水性残基は、残基Ａｓｐ３７８（キモトリプシンナンバリングによるＡｓｐ１９４）と共に、不活性から活性状態への転移に必要な塩橋を形成する。例えば、配列番号１３４に表記されている例示的なＦＸポリペプチドのナンバリングを参照した位置１９６に存在するＶａｌ残基は、疎水性であり、この相互作用に適する。本明細書において、極性Ｒ基を含有する親水性中性アミノ酸残基となるようＮ末端アミノ酸残基１９５、１９６、１９７および／または１９８（キモトリプシンナンバリングによる残基１６〜１９に相当）を修飾すると、塩橋形成を崩壊または不安定化(destablize)するよう特に作用することが見出される。置き換えのための例示的なかかるアミノ酸残基は、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）またはＴｙｒ（Ｙ）である。
本明細書で提供される例示的な修飾として、それぞれ配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置１９６に相当する位置におけるＩ；位置１９６に相当する位置におけるＳ；位置１９６に相当する位置におけるＬ；位置１９６に相当する位置におけるＴ；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置２００に相当する位置におけるＡ；位置２００に相当する位置におけるＶ；位置２０２に相当する位置におけるＳ；位置２１１に相当する位置におけるＳ；位置２１４に相当する位置におけるＤ；位置２１４に相当する位置におけるＡ；位置２１４に相当する位置におけるＳ；位置２１５に相当する位置におけるＮ；位置２１６に相当する位置におけるＲ；位置２１６に相当する位置におけるＫ；位置２１６に相当する位置におけるＡ；位置２１６に相当する位置におけるＳ；位置２１７に相当する位置におけるＳ；位置２１８に相当する位置におけるＲ；位置２１８に相当する位置におけるＫ；位置２１８に相当する位置におけるＡ；位置２１９に相当する位置におけるＨ；位置２７３に相当する位置におけるＡ；位置２７３に相当する位置におけるＥ；位置２７６に相当する位置におけるＡ；位置２７６に相当する位置におけるＥ；位置３０６に相当する位置におけるＥ；位置３２６に相当する位置におけるＳ；位置３２６に相当する位置におけるＴ；位置３２６に相当する位置におけるＶ；位置３２６に相当する位置におけるＱ；位置３２６に相当する位置におけるＮ；位置３２６に相当する位置におけるＭ；位置３２６に相当する位置におけるＫ；位置３２６に相当する位置におけるＹ；位置３２６に相当する位置におけるＥ；位置３２６に相当する位置におけるＤ；位置３２７に相当する位置におけるＡ；位置３２７に相当する位置におけるＬ；位置３３２に相当する位置におけるＡ；位置３３２に相当する位置におけるＤ；位置３３２に相当する位置におけるＥ；位置３３２に相当する位置におけるＳ；位置３３２に相当する位置におけるＧ；位置３３４に相当する位置におけるＡ；位置３３４に相当する位置におけるＴ；位置３３４に相当する位置におけるＮ；位置３３６に相当する位置におけるＥ；位置３３８に相当する位置におけるＡ；位置３３８に相当する位置におけるＳ；位置３３８に相当する位置におけるＮ；位置３３８に相当する位置におけるＲ；位置３３８に相当する位置におけるＶ；位置３３８に相当する位置におけるＹ；位置３３８に相当する位置におけるＭ；位置４２０に相当する位置におけるＡ；位置４２０に相当する位置におけるＥ；位置４２４に相当する位置におけるＡ；および／または位置４２４に相当する位置におけるＥによる、無修飾のＦＸポリペプチドにおけるアミノ酸置き換えが挙げられるがこれらに限定されない。その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、補助因子依存性の増加を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、修飾されたＦＸポリペプチドは、上述のアミノ酸置き換え（複数可）のうちいずれかの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上を含有することができ、それにより、各置き換えは、異なる位置に存在する。かかる修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも２倍増加された補助因子依存性を提示するポリペプチドを包含する。配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照した、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおけるかかる非限定的なアミノ酸置き換え（複数可）は、表５および６に表記されている。
その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して少なくとも２倍増加された補助因子依存性を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、さらに別のアミノ酸置き換え（複数可）が、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドに包含されてもよく、これは、本明細書に記載されているまたは本技術分野において公知の他のいかなるアミノ酸置き換えであってもよい。例えば、さらに別の修飾は、ＡＴ−ＩＩＩ等、阻害因子に対する抵抗性を増加させるための（例えば、セクションＤ．３）、および／またはグリコシル化を変更するための（例えば、セクションＤ．１）、本明細書に記載されているいずれかのさらに別の修飾（複数可）を包含する。非天然グリコシル化部位を導入するための例示的なアミノ酸置き換え（複数可）として、それぞれ配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置５１に相当する位置におけるＮ；位置５６に相当する位置におけるＮおよび位置５８に相当する位置におけるＳ；位置６２に相当する位置におけるＮおよび位置６４に相当する位置におけるＳ；位置６５に相当する位置におけるＮおよび位置６７に相当する位置におけるＳ；位置６７に相当する位置におけるＮ；位置７３に相当する位置におけるＮおよび位置７５に相当する位置におけるＳ；位置７５に相当する位置におけるＮおよび位置７７に相当する位置におけるＳ；位置７７に相当する位置におけるＮおよび位置７９に相当する位置におけるＳ；位置７８に相当する位置におけるＮおよび位置８０に相当する位置におけるＳ；位置８２に相当する位置におけるＳ；位置８３に相当する位置におけるＮ；位置８２に相当する位置におけるＮおよび位置８４に相当する位置におけるＳ；位置８５に相当する位置におけるＮおよび位置８７に相当する位置におけるＳ；位置８６に相当する位置におけるＮおよび位置８８に相当する位置におけるＳ；位置９５に相当する位置におけるＮおよび位置９７に相当する位置におけるＳ；位置１１４に相当する位置におけるＮ；位置１１９に相当する位置におけるＮおよび位置１２１に相当する位置におけるＳ；位置１２２に相当する位置におけるＳ；位置２１５に相当する位置におけるＮおよび位置２１７に相当する位置におけるＳ；位置２４３に相当する位置におけるＮおよび位置２４５に相当する位置におけるＳ；位置２６４に相当する位置におけるＮおよび位置２６６に相当する位置におけるＳ；位置２９３に相当する位置におけるＮおよび位置２９５に相当する位置におけるＳ；位置３８８に相当する位置におけるＮ；位置３８９に相当する位置におけるＮおよび位置３９１に相当する位置におけるＳ；位置４２８に相当する位置におけるＮおよび位置４３０に相当する位置におけるＳ、および／または位置４２９に相当する位置におけるＮおよび位置４３１に相当する位置におけるＳによる、無修飾のＦＸポリペプチドにおけるアミノ酸置き換え（複数可）が挙げられるがこれらに限定されない。配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照した、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおけるかかる非限定的なアミノ酸置き換え（複数可）は、表６に表記されている。
特定の例において、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、それぞれ配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置１９６に相当する位置におけるＳ；位置１９６に相当する位置におけるＴ；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置２００に相当する位置におけるＡ；位置２００に相当する位置におけるＶ；位置２０２に相当する位置におけるＳ；位置２１１に相当する位置におけるＳ；位置２１４に相当する位置におけるＤ；位置２１４に相当する位置におけるＡ；位置２１４に相当する位置におけるＳ；位置２１５に相当する位置におけるＮ；位置２１６に相当する位置におけるＲ；位置２１６に相当する位置におけるＡ；位置２１６に相当する位置におけるＳ；位置２１７に相当する位置におけるＳ；位置２１８に相当する位置におけるＲ；位置２１８に相当する位置におけるＡ；位置２１９に相当する位置におけるＨ；位置２７３に相当する位置におけるＥ；位置２７６に相当する位置におけるＥ；位置３０６に相当する位置におけるＥ；位置３２６に相当する位置におけるＳ；位置３２６に相当する位置におけるＴ；位置３２６に相当する位置におけるＶ；位置３２６に相当する位置におけるＮ；位置３２６に相当する位置におけるＭ；位置３２６に相当する位置におけるＫ；位置３２６に相当する位置におけるＹ；位置３２６に相当する位置におけるＥ；位置３２６に相当する位置におけるＤ；位置３２７に相当する位置におけるＡ；位置３２７に相当する位置におけるＬ；位置３３２に相当する位置におけるＤ；位置３３２に相当する位置におけるＥ；位置３３２に相当する位置におけるＳ；位置３３２に相当する位置におけるＧ；位置３３４に相当する位置におけるＡ；位置３３４に相当する位置におけるＴ；位置３３４に相当する位置におけるＮ；位置３３６に相当する位置におけるＥ；位置３３８に相当する位置におけるＡ；位置３３８に相当する位置におけるＳ；位置３３８に相当する位置におけるＮ；位置３３８に相当する位置におけるＲ；位置３３８に相当する位置におけるＶ；位置３３８に相当する位置におけるＹ；位置３３８に相当する位置におけるＭ；位置４２０に相当する位置におけるＥ；および／または位置４２４に相当する位置におけるＥによる、無修飾のＦＸポリペプチドにおけるアミノ酸置き換えであるがこれらに限定されない、少なくとも１個の修飾を包含する。
本明細書における例において、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａを包含する、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置２１１に相当する位置におけるＳによる置き換えまたは位置２１９に相当する位置におけるＨによる置き換えである、無修飾のＦＸポリペプチドにおける少なくとも１個のアミノ酸置き換えを有する。その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、補助因子依存性の増加を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、修飾されたＦＸポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸置き換え（複数可）を含有することができ、それにより、各置き換えは、異なる位置に存在する。例えば、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａを包含する本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置２１１に相当する位置におけるＳによる置き換えおよび位置２１９に相当する位置におけるＨによる置き換えである、無修飾のＦＸポリペプチドにおける少なくとも２個のアミノ酸置き換えを有する。さらに別のアミノ酸置き換え（複数可）は、本明細書に記載されているまたは本技術分野において公知の他のいかなるアミノ酸置き換えであってもよい。特定の例において、さらに別のアミノ酸置き換えは、位置１９５、１９６、１９７または１９８に存在する。例示的なかかるさらに別のアミノ酸置き換え（複数可）として、位置１９５に相当する位置におけるＬによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＶによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＳによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＴによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＩによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＡによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＦによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＤによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＧによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＩによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＡによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＳによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＬによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＦによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＩによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＴによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＧによる置き換え；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置１９７に相当する位置におけるＮ；位置１９７に相当する位置におけるＨ；および位置１９７に相当する位置におけるＲが挙げられるがこれらに限定されない。他の例において、さらに別の修飾は、ＡＴ−ＩＩＩ等、阻害因子に対する抵抗性を増加させるための（セクションＤ．３）、および／またはグリコシル化変更を増加させるための（セクションＤ．１）、本明細書に記載されているいずれかのさらに別の修飾（複数可）を包含する。かかる修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも２倍増加された補助因子依存性を提示するポリペプチドを包含する。配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照した、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおける非限定的なアミノ酸置き換え（複数可）は、表７に表記されている。
本明細書における特定の例において、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａを包含する、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、それぞれ配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置１９６に相当する位置におけるＳ；位置１９６に相当する位置におけるＬ；位置１９６に相当する位置におけるＴ；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置２００に相当する位置におけるＡ；位置２００に相当する位置におけるＶ；位置２０２に相当する位置におけるＳ；位置３３８に相当する位置におけるＡ；位置３３８に相当する位置におけるＳ；または位置３３８に相当する位置におけるＶによる置き換えである、無修飾のＦＸポリペプチドにおける少なくとも１個のアミノ酸置き換えを有する。その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、補助因子依存性の増加を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、修飾されたＦＸポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸置き換え（複数可）を含有することができ、それにより、各置き換えは、異なる位置に存在する。さらに別のアミノ酸置き換え（複数可）は、本明細書に記載されているまたは本技術分野において公知の他のいかなるアミノ酸置き換えであってもよい。例えば、さらに別の修飾は、補助因子非依存性を増加させる、ＡＴ−ＩＩＩ等、阻害因子に対する抵抗性を増加させる（セクションＤ．３）および／またはグリコシル化を変更する（セクションＤ．１）、本明細書に上述されているいずれかのさらに別の修飾（複数可）を包含する。かかる修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも１０倍増加した補助因子依存性を提示するポリペプチドを包含する。配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照した、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおけるかかる非限定的なアミノ酸置き換え（複数可）は、表８および表９に表記されている。
特定の例において、その活性型において補助因子依存性の増加を提示する、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａを包含する、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドのアミノ酸位置１９６に、非極性、中性または親水性アミノ酸残基となるような少なくとも１個のアミノ酸置き換えを有する。したがって、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３４に表記されているアミノ酸の配列を参照した位置１９６に相当する位置におけるＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＣまたはＹによる置き換えである、少なくとも１個のアミノ酸置き換え等、少なくとも１個のアミノ酸修飾を含有する。本明細書で提供されるかかる修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、一般には、少なくとも１００倍以上等、少なくとも５０倍増加した補助因子依存性を提示するポリペプチドを包含する。本明細書で提供される例示的なかかる修飾されたＦＸポリペプチドは、位置１９６に相当する位置におけるＳによる置き換えである少なくとも１個のアミノ酸置き換えを含有する、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａを包含するＦＸポリペプチドである。その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、一般には、少なくとも１００倍以上等、少なくとも５０倍増加した補助因子依存性を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、修飾されたＦＸポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸置き換え（複数可）を含有することができ、それにより、各置き換えは、異なる位置に存在する。さらに別のアミノ酸置き換え（複数可）は、本明細書に記載されているまたは本技術分野において公知の他のいかなるアミノ酸置き換えであってもよい。例えば、さらに別の修飾は、補助因子非依存性を増加させ、ＡＴ−ＩＩＩ等、阻害因子に対する抵抗性を増加させ（セクションＤ．３）および／またはグリコシル化を変更するための（セクションＤ．１）、本明細書に上述されているいずれかのさらに別の修飾（複数可）を包含する。配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照した、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおけるかかる非限定的なアミノ酸置き換え（複数可）は、表９に表記されている。
３．阻害因子に対する抵抗性の増加
ＦＸポリペプチドに１個または複数の修飾（複数可）を含有し、活性ＦＸａ型の場合、ＦＸ阻害因子による阻害に対する抵抗性の増加を提示する、修飾されたＦＸチモーゲンおよび修飾されたＦＸａポリペプチドを包含する修飾されたＦＸポリペプチドが、本明細書で提供される。ＦＸ阻害因子は、例えば、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）および抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を包含する。修飾は、アミノ酸の挿入、欠失または置き換えとなり得る。特に、修飾は、アミノ酸置き換えである。
ＴＦＰＩは、クニッツ（Kunitz）型阻害因子である。ＴＦＰＩは、配列番号５５７に表記されているアミノ酸の前駆体配列を有し、配列番号５５７の２９〜３０４として表記されている残基に相当する成熟配列を有する。ＴＦＰＩは、三価であり、３個のクニッツ型ドメインを含有する。ＴＦＰＩは、その第２のクニッツドメイン（配列番号５５７に表記されている配列の残基１２５〜１７５に相当）によりＦＸａを直接的に阻害する。ＴＦＰＩは、ＦＸａが結合した後に、その第１のクニッツドメイン（配列番号５５７に表記されている配列における残基５４〜１０４に相当）を介して、第ＶＩＩａ因子／組織因子（ＴＦ）複合体を阻害することもできる。ＴＦＰＩによる阻害は、リン脂質およびＦＶａの存在下においてより大きい。後述するＡＴＩＩＩと同様に、ＴＦＰＩの活性は、ＦＸａとの活性部位結合による相互作用により媒介される。チモーゲン様ポリペプチドである修飾されたＦＸポリペプチド等、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドの中でも、結合による相互作用が変更されたためおよび／またはＴＦＰＩによる阻害に利用できないために、ＴＦＰＩに対する抵抗性の増加を提示するポリペプチドが包含される。
ＡＴ−ＩＩＩは、抗凝固薬セルピン（セリンプロテアーゼ阻害因子）である。ＡＴ−ＩＩＩは、４６４アミノ酸残基（配列番号５５３を参照）を含有する前駆体タンパク質として合成される。分泌の経過において、３２残基シグナルペプチドが切断されて、４３２アミノ酸成熟ヒト抗トロンビン（配列番号５５４）を生成する。５８ｋＤａのＡＴ−ＩＩＩ糖タンパク質は、血液中を循環し、凝固系の多数のセリンプロテアーゼを阻害するためのセリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）として機能する。ＡＴ−ＩＩＩの主な標的は、トロンビンおよび第Ｘａ因子であるが、ＡＴ−ＩＩＩは、ＦＩＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａおよびより低い程度ではあるが、ＦＶＩＩａの活性を阻害することも示した（例えば、図２を参照）。
ＡＴ−ＩＩＩの作用は、臨床診療において抗凝固薬として広く用いられている、天然起源のヘパラン硫酸または様々な組織由来ヘパリン等、グリコサミノグリカンにより大いに増強される。ＡＴ−ＩＩＩは、高度に特異的な様式で、反応中心ループ（ＲＣＬ）の立体構造変化を誘導する、ヘパリンにおける独特の五糖配列に結合する。かかる立体構造において、ＡＴ−ＩＩＩの反応中心ループは、セリンプロテアーゼの反応部位とより効率的に相互作用し、阻害を引き起こすことができる。ＡＴＩＩＩ ＲＣＬのこのような「活性化」は、特異的五糖それ自体や、他の「低分子量」型のヘパリン、また、高分子量型のヘパリンにより誘導することができる。ＡＴ−ＩＩＩおよびＦＸａの両方における結合部位を有する長鎖ヘパリン（または「高分子量」ヘパリン）は、ＡＴ−ＩＩＩおよびＦＸａの鋳型としても作用し、これにより、両者を極めて近接させ、阻害性相互作用をさらに容易にする。ヘパリンの非存在下で、ＡＴ−ＩＩＩは、ＦＸａの相対的に無効な阻害因子である［Quinseyら (2002) J. Biol. Chem., 277:15971-15978］。
ＡＴ−ＩＩＩは、ＦＸａと特異的に相互作用し、ＦＸチモーゲン型とは相互作用しない。Ａｒｇ１９４−Ｉｌｅ１９５結合（キモトリプシンナンバリングによるＡｒｇ１５−Ｉｌｅ１６）の切断により生じる立体構造スイッチは、ＡＴ−ＩＩＩおよびヘパリン相互作用に必要とされるエキソサイトを構造的に露出させる。ＦＸａとのＡＴ−ＩＩＩ相互作用は、エキソサイト１における拡張された基質結合部位残基により、特に、成熟ナンバリングによるグルタミン酸残基２１５、２１６および２１９（キモトリプシンナンバリングによる残基３６、３７および３９に相当）により媒介または増強される［例えば、Quinseyら (2002) and Bianchiniら (2004) J. Biol. Chem., 279:3671-3679を参照］。ＦＸａのヘパリン結合エキソサイトは、エキソサイト１の反対側に位相幾何学的に位置付けられ、配列番号１３４に表記されている成熟ナンバリングによる残基Ａｒｇ２７３、Ｌｙｓ２７６、Ａｒｇ３０６、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、Ｌｙｓ４２０およびＡｒｇ４２４（キモトリプシンナンバリングによるＡｒｇ９３、Ｌｙｓ９６、Ａｒｇ１２５、Ａｒｇ１６５、Ｌｙｓ１６９、Ｌｙｓ２３６およびＡｒｇ２４０に相当）を包含する［例えば、Rezaie (2000) J. Biol. Chem., 275:3320-7を参照］。加えて、自己溶解ループ３２６〜３３６（キモトリプシンナンバリングによる残基１４３〜１５４に相当）の塩基性残基は、ＦＸａによるＡＴ−ＩＩＩのヘパリン活性化立体構造の認識における役割も果たす［Rezaieら (2005) J. Biol. Chem., 280:32722-32728; Bianchiniら (2004)］。
ＴＦＰＩまたはＡＴ−ＩＩＩを包含する阻害因子に対する抵抗性の増加は、阻害因子（例えば、ＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩ）相互作用に関連するＦＸポリペプチドにおける１個または複数の残基を修飾することにより達成することができる。また、抵抗性の増加は、ヘパリン相互作用に関与する１個または複数の残基を修飾することにより達成することができる。例えば、エキソサイト１、自己溶解ループまたはヘパリン結合エキソサイトにおける１個または複数の残基を修飾することができる。加えて、ＦＸａポリペプチドをよりチモーゲン様にし、これにより上述の結合部位への接近を立体構造的に撹乱する修飾（複数可）も、阻害因子に対する抵抗性の増加を付与することができる。したがって、阻害因子（例えば、ＡＴＩＩＩまたはＴＦＰＩ）に対する抵抗性を増加させるための修飾（複数可）は、チモーゲン３残基を形成するための、配列番号１３４を参照した成熟ナンバリングによる残基１９５〜１９８、３２５〜３３４、３６６〜３７７および４００〜４０６（キモトリプシンナンバリングによる残基１６〜１９、１４２〜１５２、１８４〜１９３および２１６〜２２３に相当）および／または残基２１１、２１９または３７８に相当する活性化ドメインの１個または複数の残基にも生じ得る（例えば、上述のセクションＤ．２を参照）。
例えば、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、活性ＦＸａ型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａと比較して、少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、４０００倍、４５００倍、５０００倍、５５００倍、６０００倍以上等、少なくとも２倍の、阻害因子（例えば、ＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩ）に対する抵抗性の増加を提示する。よって、適切なインビトロ、インビボまたはエクスビボアッセイにおいて評価される場合、修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドと比較して、阻害因子（例えば、ＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩ）に対する抵抗性の増加を呈することができる。
かかる修飾されたＦＸポリペプチドの中でも、配列番号１３４に表記されている残基に相当するＦＸの重鎖におけるアミノ酸残基（複数可）１９６、１９７、２００、２０２、２１１、２１４、２１６、２１８、２１９、２７３、２７６、３０６、３２６、３２７、３３２、３３４、３３６、３３８、４２０および／または４２４に修飾（複数可）を含有するポリペプチドが包含される。一般に、修飾は、アミノ酸置き換えである。その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、アミノ酸置き換え（複数可）を含有しないＦＸａと比較して、阻害因子（例えば、ＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩ）に対する抵抗性の増加を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、アミノ酸置き換えは、その位置における他の１９種類のアミノ酸のいずれと行ってもよい。
特定の例において、阻害因子に対する抵抗性を引き起こすための修飾（複数可）は、ＦＸａポリペプチドをよりチモーゲン様とし、これにより阻害因子結合（例えば、ＡＴ−ＩＩＩ結合またはＴＦＰＩ結合）の速度を低下させる修飾となり得る。例えば、阻害因子（例えば、ＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩ）に対する抵抗性の増加を提示する修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３４に表記されている位置を参照した位置１９５、１９６、１９７または１９８（キモトリプシンナンバリングによる位置１６〜１９）に相当する位置に、少なくとも１個のアミノ酸置き換え（複数可）等、少なくとも１個のアミノ酸修飾（複数可）を含有することができる。これらのアミノ酸残基は、ＦＸチモーゲンの活性化切断により作製された新たなＮ末端における疎水性残基に相当する。本明細書の他の箇所で記述されている通り、「活性化切断」後に、Ｎ末端における疎水性残基は、「活性化ポケット」へと挿入し、Ｉｌｅ１９５の新たなα−アンモニウムは、不活性から活性状態への転移に必要な、残基Ａｓｐ３７８（キモトリプシンナンバリングによるＡｓｐ１９４に相当）と塩橋を形成する。例えば、配列番号１３４に表記されている例示的なＦＸポリペプチドに存在するＶａｌ残基は、疎水性であり、活性化ポケット内の最適な相互作用に適する。特定の例において、極性Ｒ基を含有する親水性中性アミノ酸残基となるよう、Ｎ末端アミノ酸残基１９５、１９６、１９７および／または１９８（キモトリプシンナンバリングによる残基１６〜１９に相当）をアミノ酸置き換え（複数可）により修飾することは、活性を依然として保持しつつ、このα塩橋形成または上述の他の「カップルした」立体構造変化を崩壊または不安定化させる。例示的なかかるアミノ酸残基は、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）またはＴｙｒ（Ｙ）である。
本明細書における例において、阻害因子（例えば、ＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩ）に対する抵抗性の増加を付与する、本明細書で提供される修飾として、それぞれ配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置１９６に相当する位置におけるＩ；位置１９６に相当する位置におけるＳ；位置１９６に相当する位置におけるＬ；位置１９６に相当する位置におけるＴ；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置２００に相当する位置におけるＡ；位置２００に相当する位置におけるＶ；位置２００に相当する位置におけるＳ；位置２０２に相当する位置におけるＳ；位置２１１に相当する位置におけるＳ；位置２１４に相当する位置におけるＤ；位置２１４に相当する位置におけるＡ；位置２１４に相当する位置におけるＳ；位置２１６に相当する位置におけるＲ；位置２１６に相当する位置におけるＫ；位置２１６に相当する位置におけるＡ；位置２１６に相当する位置におけるＳ；位置２１８に相当する位置におけるＲ；位置２１８に相当する位置におけるＫ；位置２１８に相当する位置におけるＡ；位置２１９に相当する位置におけるＨ；位置２７３に相当する位置におけるＡ；位置２７３に相当する位置におけるＥ；位置２７６に相当する位置におけるＡ；位置２７６に相当する位置におけるＥ；位置３０６に相当する位置におけるＥ；位置３２６に相当する位置におけるＡ；位置３２６に相当する位置におけるＳ；位置３２６に相当する位置におけるＴ；位置３２６に相当する位置におけるＶ；位置３２６に相当する位置におけるＱ；位置３２６に相当する位置におけるＮ；位置３２６に相当する位置におけるＭ；位置３２６に相当する位置におけるＫ；位置３２６に相当する位置におけるＹ；位置３２６に相当する位置におけるＥ；位置３２６に相当する位置におけるＤ；位置３２７に相当する位置におけるＡ；位置３２７に相当する位置におけるＬ；位置３３２に相当する位置におけるＡ；位置３３２に相当する位置におけるＤ；位置３３２に相当する位置におけるＥ；位置３３２に相当する位置におけるＳ；位置３３２に相当する位置におけるＧ；位置３３４に相当する位置におけるＡ；位置３３４に相当する位置におけるＴ；位置３３４に相当する位置におけるＮ；位置３３６に相当する位置におけるＥ；位置３３８に相当する位置におけるＡ；位置３３８に相当する位置におけるＳ；位置３３８に相当する位置におけるＮ；位置３３８に相当する位置におけるＲ；位置３３８に相当する位置におけるＶ；位置３３８に相当する位置におけるＹ；位置３３８に相当する位置におけるＭ；位置４２０に相当する位置におけるＡ；位置４２０に相当する位置におけるＥ；位置４２４に相当する位置におけるＡ；および／または位置４２４に相当する位置におけるＥによる、無修飾のＦＸポリペプチドにおけるアミノ酸置き換えが挙げられるがこれらに限定されない。その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、阻害因子抵抗性（例えば、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性および／またはＴＦＰＩ抵抗性）の増加を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、修飾されたＦＸポリペプチドは、上述のアミノ酸置き換え（複数可）のうちいずれかの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上を含有することができ、それにより、各置き換えは、異なる位置に存在する。かかる修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも２倍増加した阻害因子抵抗性（例えば、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性および／またはＴＦＰＩ抵抗性）を提示するポリペプチドを包含する。配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照した、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおけるかかる非限定的なアミノ酸置き換え（複数可）は、表１０〜１３に表記されている。
その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも２倍増加した阻害因子抵抗性（例えば、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性および／またはＴＦＰＩ抵抗性）を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、さらに別のアミノ酸置き換え（複数可）が、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドに包含されてもよく、本明細書に記載されているまたは本技術分野において公知他のいかなるアミノ酸置き換えであってもよい。例えば、さらに別の修飾は、補助因子依存性を増加させるため（例えば、セクションＤ．２）および／またはグリコシル化を変更するための（例えば、セクションＤ．１）、本明細書に記載されているいずれかのさらに別の修飾（複数可）を包含する。非天然グリコシル化部位を導入するための例示的なアミノ酸置き換え（複数可）として、それぞれ配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置５１に相当する位置におけるＮ；位置５６に相当する位置におけるＮおよび位置５８に相当する位置におけるＳ；位置６２に相当する位置におけるＮおよび位置６４に相当する位置におけるＳ；位置６５に相当する位置におけるＮおよび位置６７に相当する位置におけるＳ；位置６７に相当する位置におけるＮ；位置７３に相当する位置におけるＮおよび位置７５に相当する位置におけるＳ；位置７５に相当する位置におけるＮおよび位置７７に相当する位置におけるＳ；位置７７に相当する位置におけるＮおよび位置７９に相当する位置におけるＳ；位置７８に相当する位置におけるＮおよび位置８０に相当する位置におけるＳ；位置８２に相当する位置におけるＳ；位置８３に相当する位置におけるＮ；位置８２に相当する位置におけるＮおよび位置８４に相当する位置におけるＳ；位置８５に相当する位置におけるＮおよび位置８７に相当する位置におけるＳ；位置８６に相当する位置におけるＮおよび位置８８に相当する位置におけるＳ；位置９５に相当する位置におけるＮおよび位置９７に相当する位置におけるＳ；位置１１４に相当する位置におけるＮ；位置１１９に相当する位置におけるＮおよび位置１２１に相当する位置におけるＳ；位置１２２に相当する位置におけるＳ；位置２１５に相当する位置におけるＮおよび位置２１７に相当する位置におけるＳ；位置２４３に相当する位置におけるＮおよび位置２４５に相当する位置におけるＳ；位置２６４に相当する位置におけるＮおよび位置２６６に相当する位置におけるＳ；位置２９３に相当する位置におけるＮおよび位置２９５に相当する位置におけるＳ；位置３８８に相当する位置におけるＮ；位置３８９に相当する位置におけるＮおよび位置３９１に相当する位置におけるＳ；位置４２８に相当する位置におけるＮおよび位置４３０に相当する位置におけるＳ、および／または位置４２９に相当する位置におけるＮおよび位置４３１に相当する位置におけるＳによる、無修飾のＦＸポリペプチドにおけるアミノ酸置き換え（複数可）が挙げられるがこれらに限定されない。配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照した、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおけるかかる非限定的なアミノ酸置き換え（複数可）は、表１１に表記されている。
特定の例において、本明細書で提供される修飾として、それぞれ配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置１９６に相当する位置におけるＳ；位置１９６に相当する位置におけるＴ；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置２００に相当する位置におけるＡ；位置２００に相当する位置におけるＶ；位置２００に相当する位置におけるＳ；位置２０２に相当する位置におけるＳ；位置２１１に相当する位置におけるＳ；位置２１４に相当する位置におけるＤ；位置２１４に相当する位置におけるＡ；位置２１４に相当する位置におけるＳ；位置２１６に相当する位置におけるＲ；位置２１６に相当する位置におけるＫ；位置２１６に相当する位置におけるＡ；位置２１６に相当する位置におけるＳ；位置２１８に相当する位置におけるＲ；位置２１８に相当する位置におけるＡ；位置２１９に相当する位置におけるＨ；位置２７３に相当する位置におけるＥ；位置２７６に相当する位置におけるＥ；位置３０６に相当する位置におけるＥ；位置３２６に相当する位置におけるＳ；位置３２６に相当する位置におけるＴ；位置３２６に相当する位置におけるＶ；位置３２６に相当する位置におけるＮ；位置３２６に相当する位置におけるＭ；位置３２６に相当する位置におけるＫ；位置３２６に相当する位置におけるＹ；位置３２６に相当する位置におけるＥ；位置３２６に相当する位置におけるＤ；位置３２７に相当する位置におけるＡ；位置３２７に相当する位置におけるＬ；位置３３２に相当する位置におけるＤ；位置３３２に相当する位置におけるＥ；位置３３２に相当する位置におけるＳ；位置３３２に相当する位置におけるＧ；位置３３４に相当する位置におけるＡ；位置３３４に相当する位置におけるＴ；位置３３４に相当する位置におけるＮ；位置３３６に相当する位置におけるＥ；位置３３８に相当する位置におけるＡ；位置３３８に相当する位置におけるＳ；位置３３８に相当する位置におけるＮ；位置３３８に相当する位置におけるＲ；位置３３８に相当する位置におけるＶ；位置３３８に相当する位置におけるＹ；位置３３８に相当する位置におけるＭ；位置４２０に相当する位置におけるＥ；および／または位置４２４に相当する位置におけるＥによる、無修飾のＦＸポリペプチドにおけるアミノ酸置き換えが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書における例において、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａを包含する、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置２１１に相当する位置におけるＳによる置き換えまたは位置２１９に相当する位置におけるＨによる置き換えである、無修飾のＦＸポリペプチドにおける少なくとも１個のアミノ酸置き換えを有する。その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、阻害因子（例えば、ＡＴ−ＩＩＩまたはＴＦＰＩ）に対する抵抗性の増加を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、修飾されたＦＸポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸置き換え（複数可）を含有することができ、それにより、各置き換えは、異なる位置に存在する。例えば、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａを包含する、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置２１１に相当する位置におけるＳによる置き換えおよび位置２１９に相当する位置におけるＨによる置き換えである、無修飾のＦＸポリペプチドにおける少なくとも２個のアミノ酸置き換えを有する。さらに別のアミノ酸置き換え（複数可）は、本明細書に記載されているまたは本技術分野において公知の他のいかなるアミノ酸置き換えであってもよい。特定の例において、さらに別のアミノ酸置き換えは、位置１９５、１９６、１９７または１９８においてなされる。例示的なかかるさらに別のアミノ酸置き換え（複数可）として、位置１９５に相当する位置におけるＬによる置き換え：位置１９５に相当する位置におけるＶによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＳによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＴによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＩによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＡによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＦによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＤによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＧによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＩによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＡによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＳによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＬによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＦによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＩによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＴによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＧによる置き換え；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置１９７に相当する位置におけるＮ；位置１９７に相当する位置におけるＨ；および／または位置１９７に相当する位置におけるＲが挙げられるがこれらに限定されない。他の例において、さらに別の修飾は、補助因子依存性を増加させるため（例えば、セクションＤ．２）および／またはグリコシル化を変更するための（例えば、セクションＤ．１）、本明細書に記載されているいずれかのさらに別の修飾（複数可）を包含する。かかる修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して、阻害因子に対し少なくとも２倍以上増加した抵抗性および／または増加した補助因子依存性を提示するポリペプチドを包含する。配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照した、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおけるかかる非限定的なアミノ酸置き換え（複数可）は、表１２に表記されている。
本明細書における特定の例において、その活性型において阻害因子抵抗性（例えば、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性および／またはＴＦＰＩ抵抗性）の増加を提示する、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａを包含する本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、それぞれ配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置１９６に相当する位置におけるＳ；位置１９６に相当する位置におけるＬ；位置１９６に相当する位置におけるＴ；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置３２６に相当する位置におけるＮ；位置３３４に相当する位置におけるＡ；位置３３４に相当する位置におけるＴ；位置３３８に相当する位置におけるＡ；位置３３８に相当する位置におけるＳ；または位置３３８に相当する位置におけるＶによる置き換えである、無修飾のＦＸポリペプチドにおける少なくとも１個のアミノ酸置き換えを有する。その結果得られる修飾されたＦＸポリペプチドが、活性型の場合、阻害因子抵抗性（例えば、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性および／またはＴＦＰＩ抵抗性）の増加を提示し、ＦＶａ依存性触媒活性を保持するのであれば、修飾されたＦＸポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸置き換え（複数可）を含有することができ、それにより、各置き換えは、異なる位置に存在する。さらに別のアミノ酸置き換え（複数可）は、本明細書に記載されているまたは本技術分野において公知の他のいかなるアミノ酸置き換えであってもよい。例えば、さらに別の修飾は、補助因子非依存性を増加させる（セクションＤ．２）および／またはグリコシル化を変更する（セクションＤ．１）、本明細書に上述されているいずれかのさらに別の修飾（複数可）を包含する。かかる修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍以上増加した補助因子依存性等、少なくとも５倍増加した補助因子依存性を提示するポリペプチドを包含する。
特定の例において、その活性型において阻害因子抵抗性（例えば、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性および／またはＴＦＰＩ抵抗性）の増加を提示する、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａを包含する本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドに少なくとも２個のアミノ酸置き換え（複数可）を有し、一方の置き換えは、アミノ酸位置１９５、１９６、１９７または１９８に存在し、他方の置き換えは、位置２７３、２７６、３０６、３２６、３３２、３３８、４２０および／または４２４のうち１個または複数に相当する位置における置き換えである。置き換えは、その位置における他の１９種類のアミノ酸のいずれと行ってもよい。アミノ酸位置１９５、１９６、１９７または１９８における例示的な非限定的な置き換えは、位置１９５または１９６における、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）またはＴｙｒ（Ｙ）による置き換え、例えば、ＳまたはＴによる置き換え等、非極性、中性または親水性アミノ酸残基となるよう行われる。位置２７３、２７６、３０６、３２６、３３２、３３８、４２０および／または４２４のうち１個または複数に相当する位置における例示的な非限定的な置き換えは、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）またはＶａｌ（Ｖ）等、酸性または中性アミノ酸残基となるよう行われ、例えば、ＡまたはＥによる置き換えである。位置１９５、１９６、１９７および／または１９８に、ならびに位置２７３、２７６、３０６、３２６、３３２、３３８、４２０および／または４２４のうち１個または複数に少なくとも２個の置き換えを含有するかかる修飾されたＦＸポリペプチドは、活性型の場合、修飾（複数可）を含有しない無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも２倍、４倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、特に、少なくとも５００倍増加した阻害因子抵抗性（例えば、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性および／またはＴＦＰＩ抵抗性）を提示するポリペプチドを包含する。
特定の例において、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａを包含する、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドに少なくとも２個のアミノ酸置き換え（複数可）を有し、
１）少なくとも１個は、それぞれ配列番号１３４に表記されているアミノ酸位置を参照した、位置１９５に相当する位置におけるＬによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＶによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＳによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＴによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＩによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＡによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＦによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＤによる置き換え；位置１９５に相当する位置におけるＧによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＩによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＡによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＳによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＬによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＦによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＩによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＴによる置き換え；位置１９６に相当する位置におけるＧによる置き換え；位置１９７に相当する位置におけるＳ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置１９７に相当する位置におけるＡ；位置１９７に相当する位置におけるＮ；位置１９７に相当する位置におけるＨ；および／または位置１９７に相当する位置におけるＲに相当する置き換えであり、
２）少なくとも１個は、位置２７３に相当する位置におけるＡ；位置２７３に相当する位置におけるＥ；位置２７６に相当する位置におけるＡ；位置２７６に相当する位置におけるＥ；位置３０６に相当する位置におけるＥ；位置３２６に相当する位置におけるＡ；位置３２６に相当する位置におけるＳ；位置３２６に相当する位置におけるＴ；位置３２６に相当する位置におけるＶ；位置３２６に相当する位置におけるＱ；位置３２６に相当する位置におけるＮ；位置３２６に相当する位置におけるＭ；位置３２６に相当する位置におけるＫ；位置３２６に相当する位置におけるＹ；位置３２６に相当する位置におけるＥ；位置３２６に相当する位置におけるＤ；位置３３２に相当する位置におけるＡ；位置３３２に相当する位置におけるＤ；位置３３２に相当する位置におけるＥ；位置３３２に相当する位置におけるＳ；位置３３２に相当する位置におけるＧ；位置３３８に相当する位置におけるＡ；位置３３８に相当する位置におけるＳ；位置３３８に相当する位置におけるＮ；位置３３８に相当する位置におけるＲ；位置３３８に相当する位置におけるＶ；位置３３８に相当する位置におけるＹ；位置３３８に相当する位置におけるＭ；位置４２０に相当する位置におけるＡ；位置４２０に相当する位置におけるＥ；位置４２４に相当する位置におけるＡ；および／または位置４２４に相当する位置におけるＥによる置き換えに相当する置き換えである。配列番号１３４に表記されているアミノ酸残基を参照した、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドにおけるかかる非限定的なアミノ酸置き換え（複数可）は、表１３に表記されている。
４．例示的な修飾されたＦＸポリペプチド
配列番号２に表記されている前駆体ＦＸポリペプチドまたはそれに対し少なくとも７５％配列同一性を提示するその変異体にアミノ酸置き換え（複数可）を含有する、修飾されたＦＸポリペプチドが本明細書で提供される。例えば、修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号２に対し少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するＦＸポリペプチドにアミノ酸置き換え（複数可）を含有する。例示的なかかる修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号４〜１３３のいずれかに表記されているアミノ酸の配列、または配列番号４〜１３３のいずれかに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有するＦＸポリペプチドである。特定の例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号５〜２５、３２、３７、４１、４２、４４、４５、４７〜４９、５１〜５８、６０〜７１、７３〜７７、８１〜１１１および１１４〜１３３のいずれかに表記されているアミノ酸の配列、または配列番号５〜２５、３２、３７、４１、４２、４４、４５、４７〜４９、５１〜５８、６０〜７１、７３〜７７、８１〜１１１および１１４〜１３３のいずれかに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有するＦＸポリペプチドである。
異種シグナル配列を含有する前駆体ＦＸポリペプチドにアミノ酸置き換え（複数可）を含有する修飾されたＦＸポリペプチドが、本明細書で提供される。例えば、異種シグナル配列は、トロンビン由来のものである（例えば、配列番号４１５のアミノ酸１〜４３に相当）。例えば、配列番号４１５に表記されているＦＸポリペプチドまたはそれに対し少なくとも７５％配列同一性を提示するその変異体にアミノ酸置き換え（複数可）を含有する修飾されたＦＸポリペプチドが、本明細書で提供される。例えば、修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号４１５に対し少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するＦＸポリペプチドにアミノ酸置き換え（複数可）を含有する。例示的なかかる修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号４１７〜５４６のいずれかに表記されているアミノ酸の配列、または配列番号４１７〜５４６のいずれかに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有するＦＸポリペプチドである。特定の例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号４１８〜４３８、４４５、４５０、４５４、４５５、４５７、４５８、４６０〜４６２、４６４〜４７１、４７３〜４８４、４８６〜４９０、４９４〜５２４および５２７〜５４６のいずれかに表記されているアミノ酸の配列、または配列番号４１８〜４３８、４４５、４５０、４５４、４５５、４５７、４５８、４６０〜４６２、４６４〜４７１、４７３〜４８４、４８６〜４９０、４９４〜５２４および５２７〜５４６のいずれかに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有するＦＸポリペプチドである。
配列番号１３４に表記されている成熟ＦＸポリペプチドまたはそれに対し少なくとも７５％配列同一性を提示するその変異体にアミノ酸置き換え（複数可）を含有する修飾されたＦＸポリペプチドが、本明細書で提供される。例えば、修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３４に対し少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するＦＸポリペプチドにアミノ酸置き換え（複数可）を含有する。例示的なかかる修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３６〜２６５のいずれかに表記されているアミノ酸の配列、または配列番号１３６〜２６５のいずれかに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有するＦＸポリペプチドである。特定の例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３７〜１５７、１６４、１６９、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９〜１８１、１８３〜１９０、１９２〜２０３、２０５〜２０９、２１３〜２４３および２４６〜２６５のいずれかに表記されているアミノ酸の配列、または配列番号１３７〜１５７、１６４、１６９、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９〜１８１、１８３〜１９０、１９２〜２０３、２０５〜２０９、２１３〜２４３および２４６〜２６５のいずれかに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有するＦＸポリペプチドである。
配列番号１３６〜２６５のいずれか、または配列番号１３６〜２６５のいずれかに対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列の、チモーゲン、活性または触媒活性型も、本明細書で提供される。特定の例において、配列番号１３７〜１５７、１６４、１６９、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９〜１８１、１８３〜１９０、１９２〜２０３、２０５〜２０９、２１３〜２４３および２４６〜２６５のいずれかのチモーゲン、活性または触媒活性型が提供される。例示的なかかる型は、ジスルフィド結合により連結された重および軽鎖を有する２本鎖型である。アミノ酸置き換え（複数可）は、重鎖に存在する。
例えば、配列番号１３４のアミノ酸１〜１３９の配列を有する軽鎖および配列番号１３４のアミノ酸１４３〜４４８の配列を有する重鎖を含有するチモーゲンＦＸポリペプチドに、または軽鎖もしくは重鎖に対し少なくとも７５％配列同一性を提示する重鎖を含有するその変異体にアミノ酸置き換え（複数可）を含有するＦＸのチモーゲン型である修飾されたＦＸポリペプチドが、本明細書で提供される。例えば、修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３４のアミノ酸１〜１３９の配列を有するチモーゲンＦＸ軽鎖ポリペプチドに対し少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示する軽鎖および／または配列番号１３４のアミノ酸１４３〜４４８の配列を有するチモーゲンＦＸ重鎖ポリペプチドに対し少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示する重鎖を含有するチモーゲンＦＸポリペプチドにアミノ酸置き換え（複数可）を含有する、修飾されたＦＸチモーゲンである。例示的なかかる修飾されたＦＸチモーゲンポリペプチドは、配列番号１３４に表記されているアミノ酸１〜１３９（即ち、配列番号１３６〜２６５のいずれかのアミノ酸１〜１３９に相当）の配列を有する軽鎖、または配列番号１３４のいずれかに表記されているアミノ酸１〜１３９に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有する軽鎖と、配列番号１３６〜２６５のいずれかのアミノ酸１４３〜４４８の配列を有する重鎖、または配列番号１３６〜２６５のいずれかに表記されているアミノ酸１４３〜４４８に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有する重鎖を含有するポリペプチドを含有するＦＸポリペプチドである。特定の例において、修飾されたＦＸチモーゲンポリペプチドは、配列番号１３４に表記されているアミノ酸１〜１３９（即ち、配列番号１３６〜２６５のいずれかのアミノ酸１〜１３９に相当）の配列を有する軽鎖、または配列番号１３４のいずれかに表記されているアミノ酸１〜１３９に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有する軽鎖と、配列番号１３７〜１５７、１６４、１６９、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９〜１８１、１８３〜１９０、１９２〜２０３、２０５〜２０９、２１３〜２４３および２４６〜２６５のいずれかのアミノ酸１４３〜４４８の配列を有する重鎖、または配列番号１３７〜１５７、１６４、１６９、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９〜１８１、１８３〜１９０、１９２〜２０３、２０５〜２０９、２１３〜２４３および２４６〜２６５のいずれかに表記されているアミノ酸１４３〜４４８に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有する重鎖を含有するポリペプチドを含有するＦＸポリペプチドである。
配列番号１３４のアミノ酸１〜１３９の配列を有する軽鎖および配列番号１３４のアミノ酸１９５〜４４８の配列を有する重鎖を含有するＦＸａポリペプチド、または軽鎖もしくは重鎖に対し少なくとも７５％配列同一性を提示するその変異体にアミノ酸置き換え（複数可）を含有するＦＸａ型である修飾されたＦＸポリペプチドが、本明細書で提供される。例えば、修飾されたＦＸポリペプチドは、配列番号１３４のアミノ酸１〜１３９の配列を有するＦＸａ軽鎖ポリペプチドに対し少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示する軽鎖、および／または配列番号１３４のアミノ酸１９５〜４４８の配列を有するＦＸａ重鎖ポリペプチドに対し少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示する重鎖を含有するＦＸａポリペプチドにアミノ酸置き換え（複数可）を含有する修飾されたＦＸａである。例示的なかかる修飾されたＦＸａポリペプチドは、配列番号１３４に表記されているアミノ酸１〜１３９（即ち、配列番号１３６〜２６５のいずれかのアミノ酸１〜１３９に相当）の配列を有する軽鎖、または配列番号１３４のいずれかに表記されているアミノ酸１〜１３９に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有する軽鎖と、配列番号１３６〜２６５のいずれかのアミノ酸１９５〜４４８の配列を有する重鎖、または配列番号１３６〜２６５のいずれかに表記されているアミノ酸１９５〜４４８に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有する重鎖を含有するポリペプチドを含有するＦＸポリペプチドである。特定の例において、修飾されたＦＸａポリペプチドは、配列番号１３４に表記されているアミノ酸１〜１３９（即ち、配列番号１３６〜２６５のいずれかのアミノ酸１〜１３９に相当）の配列を有する軽鎖、または配列番号１３４のいずれかに表記されているアミノ酸１〜１３９に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有する軽鎖と、配列番号１３７〜１５７、１６４、１６９、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９〜１８１、１８３〜１９０、１９２〜２０３、２０５〜２０９、２１３〜２４３および２４６〜２６５のいずれかのアミノ酸１９５〜４４８の配列を有する重鎖、または配列番号１３７〜１５７、１６４、１６９、１７３、１７４、１７６、１７７、１７９〜１８１、１８３〜１９０、１９２〜２０３、２０５〜２０９、２１３〜２４３および２４６〜２６５のいずれかに表記されているアミノ酸１９５〜４４８に対し少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を提示するアミノ酸の配列を有する重鎖を含有するポリペプチドを含有するＦＸポリペプチドである。
表１４に、本明細書で提供される例示的な修飾されたＦＸポリペプチドをまとめる。
５．追加的な修飾
追加的な修飾を、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドのいずれかになすことができる。追加的な修飾（複数可）は、アミノ酸挿入、欠失、置き換え、化学修飾および／または翻訳後修飾となり得る。例えば、化学部分（例えば、ポリマー部分）のための付着部位を提供するため、１個または複数のさらに別の非天然グリコシル化部位を導入するため、および／またはポリペプチドの活性もしくは他の特性を改善もしくは変更するために、さらに別のアミノ酸置き換え（複数可）を、修飾されたＦＸポリペプチドにおいてなすことができる。変更され得る例示的な特性または活性として、溶解性、安定性、触媒活性（例えば、プロトロンビナーゼ活性）、補助因子（例えば、ＦＶａ）への結合、基質特異性、基質選択性および／または阻害因子（例えば、ＡＴＩＩＩ）への結合が挙げられるがこれらに限定されない。
かかる修飾（複数可）は、当業者に周知のものである［例えば、米国特許第５，９９０，０７９号；第６，０１７，８８２号；第６，５７３，０７１号；第６，５６２，５９８号；第６，６６０，４９２号；第６，６７０，１４７号；第６，９５８，３２２号、第７，０７８，５０８号；第７，２２０，５６９号；第７，６４５，６０２号；第８，０４８，９９０号；米国特許出願公開第２００３０２０７４０２号；第２００６−０１４８０３８号；第２００９００５３１８５号；第２００９０１７５８２８号；第２００９０１７５９３１号；第２０１００１２５０５２号；第２０１００２５５０００号；第２０１０−０２８５５６８号；第２０１１−００１５１２８号；第２０１１−０２９３５９７号；国際公開ＰＣＴ出願ＷＯ１９９８０３９４５６およびＷＯ２００５０２３３０８；ならびにUprichard and Perry, Blood Rev 16: 97-110 (2002); Venkateswarluら, Biophys J 82(3):1190-1206 (2002); Vianelloら, Thromb. Res. 107:51-54 (2002); Vianelloら Thromb. Res. 104:257-264 (2001); Vianelloら, Blood Coagul. Fibrinolysis 14:401-405 (2003); Wallmarkら, Blood 78(supple1): 60 (1991); Wallmarkら, Thromb Haemost. 65:1263 (1991); Wangら, Haemophilia. 11(1):31-37 (2005); Wangら, Haematologica. 90(12):1659-1664 (2005); Watzkeら, J. Biol. Chem. 265:11982-11989 (1990); Watzkeら, J Clin Invest. 88(5):1685-1689 (1991); Watzkeら, Thromb Haemost 69:1452 (1993); Whinnaら, J. Thromb Haemost 2(7):1127-1134; Yangら, Biochemistry 47(22):5976-5985 (2008);およびZamaら, Br. J. Haematol. 106:809-811 (1999)を参照］。
例えば、修飾されたＦＸポリペプチドは、ポリペプチドをポリマーとのコンジュゲーションに対し感受性となるよう修飾することができる。例示的なポリマーとして、例えば、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン(polyvinylpyrrolidine)またはポリプロリンが挙げられる［Abuchowskiら (1981); Newmarkら (1982); and Katreら (1987)］。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、１個または複数のポリエチレングリコール部分により修飾することができる（ＰＥＧ化）。活性化されたＰＥＧ誘導体は、ＦＸポリペプチドと直接的に相互作用させるために用いることができ、これは、カルボン酸の活性エステルまたは炭酸塩誘導体、特に、脱離基がＮ−ヒドロキシサクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、イミダゾールまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホン酸塩であるものを包含する。マレイミドまたはハロアセチル基を含有するＰＥＧ誘導体は、スルフヒドリル基の修飾に用いることができ、ヒドラジンまたはヒドラジド基を含有するＰＥＧ試薬は、炭水化物基の過ヨウ素酸酸化により生成されたアルデヒドの修飾に用いることができる。
ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホスレオニン等、リン酸化されたアミノ酸残基を有する修飾されたＦＸポリペプチド配列も企図される。本明細書で提供されるポリペプチドの追加的な修飾は、限定されないが、アセチル化およびカルボキシル化を包含する、ポリペプチドの化学誘導体化を包含する。例えば、アシル化されたＦＸの不活性変異体が産生され、これは、血漿への注射後に徐々に脱アシル化され、これにより活性化第Ｘ因子を経時的に生成する［Wolfら (1995) Blood. 86, pp 4153-4157］。
本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドの他の適した追加的な修飾は、タンパク質分解に対するその抵抗性を増加させるため、溶解特性を最適化するため、および／または治療剤としてより適したものにするために、標準化学技法および／または組換え核酸方法を用いて修飾されたポリペプチドである。例えば、ペプチドの主鎖を環化して、安定性を増強することができる［Friedlerら (2000) J. Biol. Chem. 275:23783-23789等を参照］。Ｄ−アミノ酸または非天然起源の合成アミノ酸等、天然起源のＬ−アミノ酸以外の残基を包含するアナログを用いることができる。
追加的な修飾は、ポリペプチドの細胞プロセッシングおよび／または翻訳後修飾を変更、増加または改善する修飾を包含する。例えば、追加的な修飾は、細胞培養におけるプロペプチドプロセッシングの有効性を改善するために、プロペプチド切断部位の領域（例えば、Ｔｈｒ３９）における修飾を包含する［Rudolphら (1997) Prot. Express and Puri., 10: 373-378］。他の例において、また、本明細書の他の箇所に記載されている通り、より高い度合のガンマカルボキシル化は、第Ｘ因子のプレプロペプチドをトロンビンのプレプロペプチドに置き換えることにより達成することができる［例えば、Camireら (2000) Biochemistry. 39 pp. 14322-14329を参照］。
他の例示的な追加的な修飾は、ポリペプチドの１種または複数の特性または活性を変更するためのアミノ酸置き換え（複数可）を包含する。例えば、修飾は、例えば、限定されないが配列番号１３４に表記されている残基に相当する位置１０、１１、１２、２８、２９、３２、３３、３４または３５におけるアミノ酸置き換えを包含する、Ｇｌａドメインにおける残基の修飾により、その合成に必要とされるビタミンＫに対する依存性を変更する修飾を包含する（例えば、米国特許第６，０１７，８８２号および第８，０４８，９９０号を参照）。修飾は、別のセリンプロテアーゼまたは他のペプチドもしくはタンパク質の異種残基による活性化ペプチドにおける残基のアミノ酸置き換え（複数可）等により、活性化するＦＸの能力を増強するためになすこともできる［例えば、米国特許第６，９５８，３２２号および第６，５７３，０７１号；国際ＰＣＴ公開出願ＷＯ９８／３８３１７、ＷＯ０３／０３５８６１、ＷＯ２００４／００５３４７；米国特許出願公開第２００６／０１４８０３８号明細書；Himmelspachら Thromb. Res., 97, 51-67 (2000); Wolfら (1991) JBC. 266, no. 21. pp. 13726-13730; Volkelら (2005), Mol. Biotechnol., 29 (1):19-30を参照］。追加的な修飾は、ＦＸポリペプチドが補助因子非依存的な形で自己活性化されるような、活性化ペプチドを欠失させるための修飾を包含する［Rudolphら, (2002) Thromb Haemost., 88:756-62］。さらに別の修飾は、天然ではＦＸを活性化しない他のプロテアーゼが、ＦＸを切断および活性化することができるように、活性化切断部位を変更または修飾する修飾を包含する（例えば、ＷＯ９８／３８３１７；ＷＯ９８／３８３１８；ＷＯ０１／１０８９６を参照）。
本明細書で提供される修飾されたＦＸのキメラタンパク質を作製することができる。例えば、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体(comples)等、経路における凝固因子複合体と生産的に相互作用するキメラを生成するために、軽鎖の部分［例えば、Ｇｌａドメインおよび／またはＥＧＦドメイン（複数可）］は、ＦＩＸ等、別の凝固プロテアーゼ由来の相当する部分に置き換えることができる［Thiecら (2003) JBC, 12: 10393-10399］。
Ｅ．ＦＸポリペプチドの産生
修飾されたＦＸポリペプチドを包含するＦＸポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現のための本技術分野において周知の方法により得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸の同定のための、当業者に公知のいずれかの方法を用いることができる。本技術分野において利用できるいずれかの方法を用いて、例えば、肝臓等、細胞または組織供給源等から、ＦＸポリペプチドをコードする全長（即ち、全コード領域を網羅する）ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得ることができる。ｃＤＮＡは、商業的に（例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ、メリーランド州ロックビル）または合成方法により得ることもできる。修飾されたＦＸポリペプチドは、部位特異的突然変異誘発等により、本明細書に記載されている通りに遺伝子操作することができる。
ＦＸは、核酸分子をクローニングおよび単離するための、本技術分野において公知のいずれかの利用できる方法を用いてクローニングまたは単離することができる。かかる方法は、核酸のＰＣＲ増幅、ならびに核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体に基づくスクリーニングおよび活性に基づくスクリーニング等のライブラリーのスクリーニングを包含する。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を包含する、核酸の増幅のための方法を用いて、ＦＸポリペプチドをコードする核酸分子を単離することができる。核酸含有材料は、ＦＸコード核酸分子を単離するための出発材料として用いることができる。例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物（例えば、肝臓由来）、体液試料（例えば、血液、血清、唾液）、健康および／または罹患対象由来の試料は、増幅方法において用いることができる。核酸ライブラリーもまた、出発材料の供給源として用いることができる。プライマーを設計して、ＦＸコード分子を増幅することができる。例えば、プライマーは、ＦＸが生成される発現配列に基づき設計することができる。プライマーは、ＦＸアミノ酸配列の戻し翻訳に基づき設計することができる。増幅により生成される核酸分子を配列決定し、ＦＸポリペプチドをコードしていることを確認することができる。
ベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コードＤＮＡ配列の増幅に設計されたベクターに合成遺伝子をクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を包含する、追加的なヌクレオチド配列を、ＦＸコード核酸分子に連結することができる。さらに、機能的ＤＮＡエレメントを特定する追加的なヌクレオチド配列を、ＦＸコード核酸分子に作動可能に連結することができる。かかる配列の例として、細胞内タンパク質発現を容易にするために設計されたプロモーター配列およびタンパク質分泌を容易にするために設計された分泌配列が挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質結合領域を特定する配列等、追加的なヌクレオチド配列も、ＦＸコード核酸分子に連結することができる。かかる領域として、特異的標的細胞へのＦＸの取り込みを容易にするため、または合成遺伝子の薬物動態を他の形で増強するための配列が挙げられるがこれらに限定されない。
続いて、同定および単離された核酸は、適切なクローニングベクターに挿入することができる。本技術分野において公知の多数のベクター−宿主系を用いることができる。可能なベクターとして、プラスミドまたは修飾されたウイルスが挙げられるがこれらに限定されないが、ベクター系は、用いる宿主細胞と適合性でなければならない。かかるベクターとして、ラムダ誘導体等のバクテリオファージまたはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体等のプラスミドまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）が挙げられるがこれらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡ断片を、相補的付着末端を有するクローニングベクターにライゲーションすることにより達成することができる。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて引き起こすことができる。ＤＮＡ断片化に用いられる相補的制限部位が、クローニングベクターに存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端は、酵素により修飾することができる。あるいは、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端にライゲーションすることにより、いずれか所望の部位を産生することができる；このようなライゲーションされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学合成されたオリゴヌクレオチドを含有することができる。代替的な方法において、切断されたベクターおよびＦＸタンパク質遺伝子は、ホモポリマーテイル付加により修飾することができる。遺伝子配列の多くのコピーを生成するために、組換え分子は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔および超音波穿孔により宿主細胞に導入することができる。
標的タンパク質におけるいずれか１個または複数のアミノ酸の突然変異を引き起こす本技術分野において公知のいずれかの方法を用いることができる。方法は、コード核酸分子の標準部位特異的もしくはランダム突然変異誘発または固相ポリペプチド合成方法を包含する。例えば、ＦＸポリペプチドをコードする核酸分子は、コード核酸のランダム突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ等のキット等、キットを使用）、重複ＰＣＲ、遺伝子シャッフリングまたは他の組換え方法等、突然変異誘発に付すことができる。続いて、ポリペプチドをコードする核酸は、異種的に発現されるよう宿主細胞に導入することができる。一部の例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、固相または溶液相ペプチド合成を用いる等、合成的に産生される。
特異的な実施形態において、単離されたＦＸタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成されたＤＮＡ配列を取り込む組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の複数のコピーの生成を可能にする。よって、形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要であれば、単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収
１．ベクターおよび細胞
１つまたは複数のＦＸタンパク質の組換え発現のために、ＦＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部分を含有する核酸は、適切な発現ベクター、つまり、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入することができる。例示的なそのようなベクターは、たとえばｐＣＭＶなどのような任意の哺乳動物発現ベクターである。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルはまた、ＦＸ遺伝子についての天然プロモーターおよび／またはそれらのフランキング領域によって供給することもできる。
ＦＸまたは修飾ＦＸをコードする核酸を含有するベクターもまた、提供される。ベクターを含有する細胞もまた、提供される。細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、ベクターは、その中での使用に適した任意のベクターである。
ベクターを含有する、内皮細胞を含む原核細胞および真核細胞が、提供される。そのような細胞は、細菌細胞、酵母細胞、菌類細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞を含む。細胞は、コードＦＸタンパク質が細胞によって発現される条件下で上記細胞を成長させ、かつ発現ＦＸタンパク質を回収することによって、ＦＸポリペプチドまたはその修飾ＦＸポリペプチドを産生するために使用される。本明細書における目的上、ＦＸは、培地の中に分泌させることができる。
一実施形態では、ＦＸ活性を有し、ＦＸポリペプチドの全てもしくは一部分を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列またはその複数のコピーを含有するベクターが、提供される。ベクターは、細胞におけるＦＸポリペプチドもしくは修飾ＦＸポリペプチドの発現について選択することができるまたはＦＸタンパク質が、分泌タンパク質として発現されるように選択することができる。ＦＸが発現される場合、核酸は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α−接合因子シグナル配列もしくはその部分などのような分泌シグナルまたは天然シグナル配列をコードする核酸に連結される。
様々な宿主−ベクター系は、タンパク質コード配列を発現するために使用することができる。これらは、ウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルス、および他のウイルス）を用いて感染させた哺乳動物細胞株；ウイルス（たとえばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞株；酵母ベクターを含有する酵母などのような微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡを用いて形質転換された細菌を含むが、これらに限定されない。ベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性において変わる。使用される宿主−ベクター系に依存して、多くの適した転写エレメントおよび翻訳エレメントのいずれか１つを使用することができる。
ベクターの中へのＤＮＡ断片の挿入について当業者らに知られている任意の方法が、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術ならびにインビボ組換え（遺伝的組換え）を含むことができる。ＦＸポリペプチドもしくは修飾ＦＸポリペプチドまたはそのドメイン、誘導体、断片、もしくは相同体のタンパク質をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはその断片が、（１つまたは複数の）組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主において発現するように、第２の核酸配列によって調節することができる。たとえば、タンパク質の発現は、当技術分野において知られている任意のプロモーター／エンハンサーによって制御することができる。特定の実施形態では、プロモーターが、ＦＸタンパク質についての遺伝子に対して天然のものではない。使用することができるプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター（Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列において含有されるプロモーター（Yamamotoら Cell 22:787-797 (1980)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら, Nature 296:39-42 (1982)）；β−ラクタマーゼプロモーター（Jayら, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543）またはｔａｃプロモーター（DeBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)）などのような原核生物発現ベクター；”Useful Proteins from Recombinant Bacteria”:Scientific American 242:79-94 (1980)）もまた参照されたい；ノパリン合成酵素プロモーター（Herrar-Estrellaら, Nature 303:209-213 (1984)）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（Garderら, Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)）を含有する植物発現ベクターならびに光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrellaら, Nature 310:115-120 (1984)）；Ｇａｌ４プロモーターなどのような酵母および他の菌類に由来するプロモーターエレメント、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されてきた以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swiftら, Cell 38:639-646 (1984); Ornitzら, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)）；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahanら, Nature 315:115-122 (1985)）、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら, Cell 38:647-658 (1984);Adamsら, Nature 318:533-538 (1985);Alexanderら, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)）、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Lederら, Cell 45:485-495 (1986)）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinckertら, Genes and Devel. 1:268-276 (1987)）、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammerら, Science 235:53-58 1987)）、肝臓中で活性なアルファ−１抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら, Genes and Devel. 1:161-171 (1987)）、骨髄性細胞において活性なベータグロビン遺伝子制御領域（Magramら, Nature 315:338-340 (1985); Kolliasら, Cell 46:89-94 (1986)）、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら, Cell 48:703-712 (1987)）、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Shani, Nature 314:283-286 (1985)）および視床下部の性腺刺激細胞において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonら, Science 234:1372-1378 (1986)）を含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、ＦＸポリペプチドもしくは修飾ＦＸポリペプチドまたはそのドメイン、断片、誘導体、もしくは相同体をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーター、１つまたは複数の複製開始点、および所望により、１つまたは複数の選択マーカー（たとえば抗生物質抵抗性遺伝子）を含有するベクターが、使用される。ＦＸポリペプチドの発現のためのベクターおよび系は、よく知られているピキアベクター（たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）、特にコードタンパク質の分泌のために設計されるベクターを含む。哺乳動物細胞における発現のための例示的なプラスミドベクターは、たとえば、ｐＣＭＶ、ｐＦＵＳＥ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）および当業者によく知られている他の多数のベクターを含む。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換のための例示的なプラスミドベクターは、たとえば、ｐＱＥ発現ベクターを含む（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから入手可能；系について記載する、Ｑｉａｇｅｎによって出版される文献もまた参照されたい）。ｐＱＥベクターは、イー・コリにおける組換えタンパク質の、厳重に調節された、高度なレベルの発現を提供するためのファージＴ５プロモーター（イー・コリＲＮＡポリメラーゼにより認識される）および二重のｌａｃオペレーター抑圧モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳＩＩ）、６ＸＨｉｓタグコード配列、ｔ０およびＴ１転写ターミネーター、ＣｏｌＥ１複製開始点、ならびにアンピシリン抵抗性を付与するためのベータ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターは、組換えタンパク質のＮ−またはＣ−末端のいずれかに６ｘＨｉｓタグを置くことを可能にする。上記プラスミドは、３つの全てのリーディングフレームのためのマルチクローニングサイトを提供し、Ｎ−末端６×Ｈｉｓタグ付きタンパク質の発現を提供するｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０、およびｐＱＥ３１を含む。イー・コリ細胞の形質転換のための他の例示的なプラスミドベクターは、たとえば、ｐＥＴ発現ベクターを含む（米国特許第４，９５２，４９６号を参照されたい；ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能；系を記載する、Ｎｏｖａｇｅｎによって出版されている、文献もまた参照されたい）。そのようなプラスミドは、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘発性イー・コリｌａｃオペレーター、およびｌａｃリプレッサー遺伝子を含有するｐＥＴ１１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、およびイー・コリｏｍｐＴ分泌シグナルを含有するｐＥＴ１２ａ−ｃ；ならびにＨｉｓカラムを用いる精製において使用されるＨｉｓ−Ｔａｇ（商標）リーダー配列およびカラムでの精製の後での切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域、およびＴ７ターミネーターを含有するｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。
２．発現系
ＦＸポリペプチド（修飾および未修飾）は、たとえば、宿主細胞、宿主動物の中への、ＦＸをコードする核酸分子の導入およびインビトロにおける、ＦＸをコードする核酸分子からの発現などのような、インビトロおよびインビボにおける方法を含む、タンパク質産生のための、当技術分野において知られている任意の方法によって産生することができる。ＦＸおよび修飾ＦＸポリペプチドは、投与および処置に必要な、必要とされる量および形態のＦＸポリペプチドを産生するのに適した任意の生物において発現することができる。発現宿主は、イー・コリ、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む哺乳動物細胞などのような原核生物および真核生物を含む。発現宿主は、タンパク質産生レベルおよび発現したタンパク質上に存在する翻訳後修飾の種類において異なり得る。発現宿主の選定は、これらの因子ならびに調節および安全性の考慮、産生コスト、ならびに精製の必要性および方法などのような他の因子に基づいてなすことができる。
真核生物宿主における発現は、サッカロマイセス・セレビシエおよびピキア・パストリア(Pichia pastoria)などのような酵母、ショウジョウバエの細胞および鱗翅目の昆虫の細胞などのような昆虫細胞、タバコ、トウモロコシ、イネ、藻類、およびアオウキクサ属などのような植物および植物細胞における発現を含むことができる。発現のための真核細胞はまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などのような哺乳動物細胞株をも含む。真核生物の発現宿主はまた、たとえば、血清、乳、および卵における産生を含む、トランスジェニック動物における産生を含む。
ＦＸの発現のための、多くの発現ベクターが、入手可能であり、当業者に知られている。発現ベクターの選定は、宿主発現系の選定により影響を及ぼされる。そのような選択は、十分に、当業者の技術のレベルの範囲内にある。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターならびに所望によりエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写終結シグナルおよび翻訳終結シグナルを含むことができる。安定した形質転換に使用される発現ベクターは、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを典型的に有する。いくつかの場合において、複製開始点は、細胞におけるベクターのコピー数を増幅させるために使用することができる。
ＦＸまたは修飾ＦＸポリペプチドはまた、タンパク質融合物として利用するまたは発現することができる。たとえば、融合物は、ポリペプチドに対してさらなる機能性を追加するために生成することができる。融合タンパク質の例は、シグナル配列、局在化のためなどのようなタグ、たとえばｈｉｓ６タグもしくはｍｙｃタグまたは精製のためのタグ、たとえばＧＳＴ融合物、ならびにタンパク質分泌および／または膜結合を指示するための配列の融合物を含むが、これらに限定されない。
１つの態様において、プロテアーゼは、不活性チモーゲン形態において発現される。他の態様において、ＦＸポリペプチドまたは修飾ＦＸポリペプチドは、活性化が、ポリペプチドのＦＸチモーゲン形態の発現分泌および精製の後に、ラッセルクサリヘビ蛇毒ＦＸ活性化因子（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）との反応により成し遂げられることによって、活性形態において産生することができる。かかる例において、活性化因子は、透析により、または活性化因子（たとえばビオチン−ストレプトアビジン）と適合性があるアフィニティーカラムを使用することにより、得られる精製された調製物から除去され得る。
場合によっては、不活性化ＦＸポリペプチド形態は、調製において活性化ＦＸａ形態から除去される。たとえば、ＦＸａはコンホメーション的に変化するため、ヘパリンに結合する能力を示す。したがって、ＦＸａは、ヘパリンカラム(colum)を使用するクロマトグラフィーによりチモーゲン形態も含む調製物から精製することができる。これは、本明細書における実施例２に例示される。典型的に、ここの例において、ＦＸａポリペプチドは、少なくとも７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の純度を示す。一般的に、ＦＸａ調製物は、実質的に、ＦＸチモーゲン形態を含む他のタンパク質汚染物質を含まない。
ａ．原核生物発現
原核生物（とりわけイー・コリ）は、大量のＦＸを産生するための系を提供する（たとえばPlatisら (2003) Protein Exp. Purif. 31(2): 222-30およびKhalilzadehら (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 63-69を参照されたい）。イー・コリの形質転換は、当業者らによく知られている単純で速い技術である。イー・コリについての発現ベクターは、高度なレベルのタンパク質発現を誘発するのにおよび宿主細胞に対していくらかの毒性を示すタンパク質を発現するのに有用である誘発性プロモーターを含有することができる。誘発性プロモーターの例は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７ＲＮＡプロモーターおよびＳＰ６ＲＮＡプロモーター、ならびに温度調節性λＰＬプロモーターを含む。
ＦＸは、イー・コリの細胞質内環境において発現させることができる。細胞質は、還元環境であり、いくつかの分子については、これは、不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオトレイトールおよびβ−メルカプトエタノールなどのような還元剤ならびに変性剤（たとえばグアニジン−ＨＣｌおよび尿素など）は、タンパク質を再可溶化するために使用することができる。代替アプローチは、酸化環境ならびにシャペロニン様イソメラーゼおよびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生に至る、細菌の細胞膜周辺腔におけるＦＸの発現である。典型的に、タンパク質を周辺質に向けるリーダー配列は、発現されることとなるタンパク質に融合される。次いで、リーダーは、周辺質の内部で、シグナルペプチターゼによって除去される。周辺質標的リーダー配列の例は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子に由来するｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーを含む。いくつかの場合において、周辺質の発現は、培地の中への発現タンパク質の漏出を可能にする。タンパク質の分泌は、培養上清からの速やかで単純な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は、周辺質から浸透圧溶解により得ることができる。細胞質内発現に類似して、いくつかの場合において、タンパク質は、不溶性になり得、変性剤および還元剤は、可溶化および再折り畳みを容易にするために使用することができる。誘発および成長の温度もまた、発現レベルおよび溶解性に影響を及ぼし得る。典型的に、２５℃および３７℃の間の温度が、使用される。突然変異もまた、発現タンパク質の溶解性を増加させるために使用することができる。典型的に、細菌は、非グリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が機能のためにグリコシル化を必要とするとき、グリコシル化は、宿主細胞からの精製の後にインビトロにおいて追加することができる。
ｂ．酵母
サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、およびピキア・パストリスなどのような酵母は、ＦＸのための有用な発現宿主である（たとえばSkokoら (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3):257-65を参照されたい）。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いてまたは相同組換えによる、安定した染色体の統合によって形質転換することができる。典型的に、誘発性プロモーターは、遺伝子発現を調節するために使用される。そのようなプロモーターの例は、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ５ならびにＣＵＰ１などのようなメタロチオネインプロモーターを含む。発現ベクターは、形質転換ＤＮＡの選択および維持のために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、およびＵＲＡ３などのような選択マーカーを含むことが多い。酵母において発現されるタンパク質は、可溶性であることが多く、Ｂｉｐなどのようなシャペロニンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現は、発現レベルおよび溶解性を改善することができる。さらに、酵母において発現されるタンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエに由来する酵母接合型アルファ−因子分泌シグナルなどのような分泌シグナルペプチド融合物およびＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはアークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)グルコアミラーゼなどのような酵母細胞表面タンパク質との融合物を使用して、分泌のために指示され得る。プロテアーゼ切断部位（たとえばＫｅｘ−２プロテアーゼ）は、ポリペプチドが分泌経路を出る場合に、融合配列をポリペプチドから除去するよう操作することができる。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでのグリコシル化も可能である。
ｃ．昆虫および昆虫細胞
特にバキュロウイルス発現系を使用する昆虫および昆虫細胞は、ＦＸまたはその修飾形態などのようなポリペプチドを発現するのに有用である（たとえばMunetaら (2003) J. Vet. Med. Sci. 65(2):219-23を参照されたい）。血リンパにおける発現を含む昆虫細胞および昆虫幼虫は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用されるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、安全性を改善し、真核生物の発現の調節性の問題を低下させる制限的な宿主範囲を有する。典型的に、発現ベクターは、高レベルの発現のために、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのようなプロモーターを使用する。一般的に使用されるバキュロウイルス系は、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）およびカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）などのようなバキュロウイルスならびにヨトウガに由来するＳｆ９、シューダレティア・ユニプンクタ(Pseudaletia unipuncta)（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）などのような昆虫細胞株を含む。高度な発現のために、発現される分子のヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において厳密に処理され、発現タンパク質を培養培地の中に分泌するために使用することができる。さらに、細胞株シューダレティア・ユニプンクタ（Ａ７Ｓ）およびオオカバマダラ（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞株に類似するグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。
昆虫細胞における代替発現系は、安定して形質転換された細胞の使用である。Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ ２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ）およびＣ７細胞（ヒトスジシマカ）などのような細胞株は、発現に使用することができる。ショウジョウバエメタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅を用いる重金属誘発の存在下で高度なレベルの発現を誘発するために使用することができる。発現ベクターは、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどのような選択マーカーの使用によって典型的に維持される。
ｄ．哺乳動物細胞
哺乳動物発現系は、ＦＸポリペプチドを発現するために使用することができる。発現コンストラクトは、アデノウイルスなどのようなウイルス感染によってまたはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどのような直接的ＤＮＡ移入によってならびに電気穿孔および微量注射などのような物理的手段によって、哺乳動物細胞に移入することができる。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、およびポリアデニル化エレメントを典型的に含む。そのようなベクターは、高度なレベルの発現のための転写プロモーター−エンハンサー、たとえばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞型において活性である。組織プロモーターおよび細胞型プロモーターならびにエンハンサー領域もまた、発現に使用することができる。例示的なプロモーター／エンハンサー領域は、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ１抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、および生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などのような遺伝子に由来するものを含むが、これらに限定されない。選択マーカーは、発現コンストラクトを有する細胞を選択し、維持するために使用することができる。選択マーカー遺伝子の例は、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、およびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどのような細胞表面シグナリング分子を有する融合物は、活性状態にあるタンパク質の、細胞表面上での発現を指示することができる。
多くの細胞株は、哺乳動物発現に利用可能であり、マウス、ラット、ヒト、サル、およびニワトリならびにハムスターの細胞を含む。例示的な細胞株は、ＢＨＫ（つまりＢＨＫ−２１細胞）、２９３−Ｆ、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌）および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株およびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２９３Ｔ、２Ｂ８、およびＨＫＢの細胞を含むが、これらに限定されない。細胞株はまた、分泌タンパク質の細胞培養液からの精製を容易にする無血清培地に適合させて利用可能である。１つのそのような例は、無血清ＥＢＮＡ−１細胞株である（Phamら, (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42）。
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物は、ＦＸの発現に使用することができる。発現コンストラクトは、微粒子銃などのような直接的ＤＮＡ移入およびプロトプラストの中へのＰＥＧ媒介性移入を使用してならびにアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて、植物に典型的に移入される。発現ベクターは、プロモーター配列およびエンハンサー配列、転写終結エレメント、ならびに翻訳制御エレメントを含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技術は、シロイヌナズナおよびタバコなどのような双子葉植物宿主ならびにトウモロコシおよびイネなどのような単子葉植物宿主の間で通常分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターおよびＵＢＱ３プロモーターを含む。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどのような選択マーカーは、形質転換細胞の選択および維持を容易にするために使用されることが多い。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養において維持することができる、または完全な植物に再生成させることができる。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主においてＦＸを産生するための選定に影響を及ぼし得る。トランスジェニック植物細胞はまた、タンパク質を産生するよう操作された藻類を含むこともできる（たとえばMayfieldら (2003) PNAS 100:438-442を参照されたい）。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主においてＦＸを産生するための選定に影響を及ぼし得る。
２．精製
宿主細胞に由来するＦＸポリペプチドの精製のための方法は、選定される宿主細胞および発現系に依存する。分泌分子については、タンパク質は、細胞を除去した後に培養培地から一般に精製される。細胞内発現については、細胞を溶解させ、タンパク質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック植物およびトランスジェニック動物などのようなトランスジェニック生物が、発現に使用される場合、組織または器官は、溶解した細胞抽出物を作製するために出発物質として使用することができる。さらに、トランスジェニック動物産生は、乳または卵におけるポリペプチドの産生を含むことができ、これは、収集することができ、必要であれば、さらに、タンパク質を抽出し、さらに、当技術分野における標準的な方法を使用して精製することができる。
ＦＸは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析、キレートクロマトグラフィー、ならびにイオン交換クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。たとえば、ＦＸポリペプチドは、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。ＦＸポリペプチドを精製するための例示的な方法は、機能的Ｇｌａドメインを有する任意のポリペプチドの結合を可能にするイオン置換カラムの使用、その後に続く、カルシウムの存在下における溶出によるものである。アフィニティー精製技術もまた、調製の効率および純度を改善するために使用することができる。たとえば、ＦＸに結合する抗体、受容体、および他の分子を、アフィニティー精製において使用することができる。発現コンストラクトはまた、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合物、またはＨｉｓ６などのようなアフィニティータグを追加するように操作し、タンパク質に対して、それぞれ、ｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂、およびＮｉ−樹脂を用いてアフィニティー精製することができる。純度は、ゲル電気泳動技術および染色技術ならびに分光光度計技術を含む、当技術分野において知られている任意の方法によって評価することができる。
上記のとおり、ＦＸプロテアーゼは、発現させ、精製して、不活性形態（チモーゲン形態）とすることができるまたは、代わりに、発現プロテアーゼは、活性形態に精製することができる。ＦＸチモーゲンポリペプチドは、最初に、哺乳動物細胞における産生、その後に続く精製を含むが、これらに限定されない、本明細書において記載される産生の方法のいずれかによって調製することができる。活性化ペプチドの切断を介して活性化されたＦＸａポリペプチドは、インビトロにおいて調製することができる（つまりＦＸａ；二重鎖形態）。ＦＸポリペプチドの、活性プロテアーゼ形態、ＦＸａへの切断は、活性化因子（たとえばRussell's Viper Venom FX 活性化因子）、活性化因子の切断および不活性形態のさらなる切断との反応によって達成することができる。
３．融合タンパク質
修飾ＦＸポリペプチドおよび１つまたは複数の他のポリペプチドを含有する融合タンパク質もまた、提供される。適した経路による投与のために製剤されるそのような融合タンパク質を含有する医薬組成物が、提供される。融合タンパク質は、任意の順番で、修飾ＦＸポリペプチドならびに抗体またはその断片、成長因子、受容体、リガンド、および他のそのような作用物質などのような作用物質を連結することによって、ＦＸポリペプチドの精製を容易にする、ＦＸポリペプチドの薬力学的特性を、たとえば、標的細胞もしくは標的組織にポリペプチドを向けることによって改変する、および／またはＦＸポリペプチドの発現もしくは分泌を増加させる目的で、形成される。典型的に、任意のＦＸ融合タンパク質は、非融合ポリペプチドと比較して、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の触媒活性を含む、非融合ＦＸポリペプチドと比較して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の触媒活性を保持する。
ＦＸポリペプチドの、他のポリペプチドとの連結は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に達成することができる。一例では、連結が、ヘテロ二官能性剤を介するなどのような化学的連結またはチオール連結または他のそのような連結によるものとすることができる。融合はまた、組換え手段によって達成することもできる。他のポリペプチドに対するＦＸポリペプチドの融合は、ＦＸポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に対するものとすることができる。本明細書中で提供されるＦＸポリペプチドを有する融合タンパク質において使用することができるポリペプチドの非限定的な例は、たとえば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）ポリペプチド、免疫グロブリンＧに由来するＦｃドメイン、または異種シグナル配列（たとえばトロンビンに由来する）を含む。融合タンパク質は、イー・コリマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などのような、細胞によるタンパク質の取り込みを助ける、さらなる成分を含有することができる（国際ＰＣＴ出願ＷＯ０１／３２７１１を参照されたい）。
融合タンパク質は、標準的な組換え技術によって産生することができる。たとえば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術に従って、インフレームで、例えば、ライゲーションのための平滑端または粘着端、適切な末端を提供するための制限酵素による消化、適宜、粘着端の補充、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処置、および酵素的ライゲーションを利用することによって、共にライゲーションすることができる。他の実施形態では、融合遺伝子が、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成することができる。代わりに、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片の間の相補的オーバーハングを起こすアンカープライマーを使用して実行することができ、引き続いて、遺伝子断片をアニールし、再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成することができる（たとえばAusubelら (eds.) Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, 1992を参照されたい）。そのうえ、融合部分を既にコードしている多くの発現ベクターが、市販で入手可能である（たとえばＧＳＴポリペプチド）。ＦＸコード核酸は、融合部分がインフレームでプロテアーゼタンパク質に連結されるように、そのような発現ベクターの中にクローニングすることができる。
４．ポリペプチド修飾
修飾ＦＸポリペプチドは、裸のポリペプチド鎖または複合体として調製することができる。いくつかの適用のために、翻訳後修飾または他の化学的修飾を有していない「裸の」形態で修飾ＦＸを調製することは望ましいものとなり得る。裸のポリペプチド鎖は、翻訳後にＦＸを修飾しない適した宿主において調製することができる。そのようなポリペプチドはまた、インビトロ系において、化学的ポリペプチド合成を使用して調製することができる。他の適用のために、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、または他の知られている修飾を含む特定の修飾が、所望され得る。修飾は、インビトロにおいてまたはたとえば、そのような修飾をもたらす、適した宿主において修飾ＦＸを産生することによってなすことができる。
５．ヌクレオチド配列
ＦＸまたは修飾ＦＸポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。核酸分子は、任意のコードＦＸポリペプチドの対立遺伝子変異体またはスプライス変異体を含む。本明細書において提供される例示的な核酸分子は、配列番号：４〜１３３または４１７〜５４６のいずれかにおいて記載されるポリペプチド、またはその成熟、チモーゲン、活性または触媒活性形態をコードするいずれかのものなど、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドをコードするいずれかのものである。一実施形態では、本明細書において提供される核酸分子が、少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、または９９％の配列同一性を有するまたは中もしくは高ストリンジェンシーの条件下で、本明細書において提供されるＦＸポリペプチドをコードする完全長の任意の核酸の少なくとも７０％に沿ってハイブリダイズする。他の実施形態では、核酸分子が、本明細書において提供されるＦＸポリペプチドのいずれかをコードする縮重コドン配列を有するものを含むことができる。
Ｆ．修飾ＦＸ活性の評価
ＦＸポリペプチドの活性および特性は、インビトロにおいておよび／またはインビボにおいて評価することができる。そのような評価のためのアッセイは、当業者らに知られており、試験された活性および結果を、治療活性およびインビボ活性と相互に関連されることが知られている。一例では、ＦＸ変異体が、未修飾ＦＸおよび／または野生型ＦＸと比較して、評価することができる。他の例として、修飾ＦＸポリペプチドの活性は、インビトロまたはインビボにおいてＡＴ−ＩＩＩに暴露し、ＡＴ−ＩＩＩに暴露されていない修飾ＦＸポリペプチドのものと比較して評価することができる。そのようなアッセイは、ＦＶａの存在下または非存在下において実行することができる。インビトロアッセイは、凝固アッセイ、結合アッセイ、タンパク質アッセイ、および分子生物学アッセイを含む、細胞ベースのアッセイなどのような、当業者に知られている任意の検査アッセイを含む。インビボアッセイは、動物モデルにおけるＦＸアッセイおよびヒトに対する投与を含む。いくつかの場合において、ＦＸの活性は、アッセイ決定因子に対して、血液、血清、または他の体液を評価することによってインビボにおいて決定することができる。ＦＸ変異体もまた、治療的効能などのような活性または特性を評価するためにインビボにおいて試験することができる。
典型的に、本明細書において記載されるアッセイは、ＦＸの活性化形態、つまりＦＸａに関してのものである。そのようなアッセイはまた、そのような形態が、典型的に、ＦＸの血液凝固活性に必要とされるタンパク質分解活性または触媒活性を含まないので、陰性対照を提供するように、不活性チモーゲン形態を用いる実行することもできる。さらに、そのようなアッセイはまた、ＦＸの活性を増大することができる、ＦＶａなどのような補因子の存在下において実行することができる。
１．インビトロアッセイ
例示的なインビトロアッセイは、ポリペプチド修飾および活性を評価するためのアッセイを含む。修飾は、当技術分野において知られている、γ−カルボキシル化、および他の翻訳後修飾を評価するインビトロアッセイ、タンパク質アッセイ、ならびにコンホメーションアッセイを使用して評価することができる。活性についてのアッセイは、第Ｖａ因子およびプロトロンビンなどのような他の凝固因子とのＦＸａ相互作用の測定、ＦＸａポリペプチドのタンパク質分解活性を決定するためのタンパク質分解アッセイ、ホスファチジルセリンおよび他のリン脂質に対するＦＸａポリペプチドの結合性および／または親和性を決定するためのアッセイ、ならびに凝固に対するＦＸａポリペプチドの効果を決定するための細胞ベースのアッセイを含むが、これらに限定されない。
修飾ＦＸａポリペプチドの濃度は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、およびビシンコニン酸（ＢＣＡ）法；ＵＶ吸光度；ならびにこれらに限定されないが、免疫学的方法、放射性の方法、蛍光性の方法、および関連する方法などのような他の定量化可能なタンパク質ラベル法を含むが、これらに限定されない、当技術分野においてよく知られている方法によって評価することができる。プロトロンビンポリペプチドの切断またはＦＸａプロテアーゼ活性によって産生される産物を含む、タンパク質分解反応の切断産物の評価は、発色基質切断、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学的検査、免疫沈降、ＮＨ２−末端配列決定、およびタンパク質ラベル化を含むが、これらに限定されない方法を使用して実行することができる。
修飾ＦＸａポリペプチドの構造的特性もまた、評価することができる。たとえば、修飾ＦＸポリペプチドのＸ線結晶解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、および低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）は、ＦＸポリペプチドの３次元構造および／または基質、Ｃａ２＋、もしくは補因子結合などのようなＦＸポリペプチドの他の特性を評価するために実行することができる。
さらに、ＦＸａ分解の存在および程度は、硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および電気泳動にかけられたＦＸａ含有試料のウェスタンブロッティングなどのような標準的な技術によって測定することができる。プロテアーゼに暴露されたＦＸａポリペプチドはまた、修飾ＦＸａポリペプチドの切断部位の場所または変化を決定するためにＮ−末端配列決定にかけることもできる。
ａ．翻訳後修飾
ＦＸ／ＦＸａポリペプチドはまた、翻訳後修飾の存在について評価することができる。このようなアッセイは当技術分野で知られており、グリコシル化、ヒドロキシル化およびカルボキシル化を測定するためのアッセイを含む。グリコシル化についての例示的なアッセイにおいて、炭水化物分析は、例えば、ヒドラジン分解またはエンドグリコシダーゼ処理に暴露されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドのＳＤＳページ分析で実施することができる。ヒドラジン分解は、無水ヒドラジンとのインキュベーションによって、糖タンパク質からＮ結合型グリカンおよびＯ結合型グリカンを放出するが、エンドグリコシダーゼ放出はＰＮＧａｓｅ Ｆに関与し、これは糖タンパク質からほとんどのＮ−グリカンを放出する。ＦＸ／ＦＸａポリペプチドのヒドラジン分解処置またはエンドグリコシダーゼ処置は、蛍光体ラベルまたは発色団ラベルを用いてタグを付けることができる還元末端を生成する。ラベルＦＸ／ＦＸａポリペプチドは、蛍光体支援炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）によって分析することができる。グリカンに対する蛍光性タグはまた、ＨＰＬＣによる単糖分析、複雑なグリコシル化パターンのプロファイリングまたはフィンガープリンティングに使用することもできる。例示的なＨＰＬＣ方法は、親水性相互作用クロマトグラフィー、電子相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む。例示的なグリカンプローブは、３−（アセチルアミノ）−６−アミノアクリジン（ＡＡ−Ａｃ）および２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）を含むが、これらに限定されない。炭水化物部分はまた、グリコシル化ＦＸ／ＦＸａポリペプチドを認識する特異的な抗体の使用を通して検出することができる。
β−ヒドロキシル化を測定するための例示的なアッセイは、アルカリ加水分解に付されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドの逆相ＨＰＬＣ分析を含む Fernlund, P and J. Stenflo (1983) J. Biol. Chem. 258(20):12509-12）。ＦＸ／ＦＸａポリペプチドのカルボキシル化およびγ−カルボキシル化は、アルカリ加水分解、次にカチオン交換カラムを使用するＨＰＬＣを使用して評価することができ、修飾された残基は、エドマン分解を使用するアミノ末端配列決定分析の後に同定することができる（Camireら (2000) Biochemistry. 39(46):14322-14329）。プロペプチド（プロ−ＦＸ）を含むＦＸポリペプチドと翻訳後γ−カルボキシレート修飾に関与するカルボキシラーゼとの相互作用もまた、評価することができる。たとえば、カルボキシラーゼに対するＦＸペプチドの相対的アフィニティーは、第ＩＸ因子プロペプチド／ガンマ−カルボキシグルタミン酸ドメイン基質について阻害定数（Ｋｉ）を決定することにより比較することができる（Stanley, T. B. (1999) J. Biol. Chem. 274:16940-16944）。
ｂ．タンパク質分解活性（触媒活性）
修飾ＦＸａポリペプチドは、タンパク質分解活性について試験することができる。ＦＸａのタンパク質分解活性は、発色基質、たとえばＦ−３３０１（ＣＨ３ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＡｃＯＨ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓ−２２２２ Ｂｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｇ−ＯＲ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡＨＣｌ；Ｒ＝Ｈ（５０％）およびＲ＝ＣＨ３（５０％）；ＤｉａＰｈａｒｍａ）、Ｓ−２３３７（ベンゾイル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−（γ−ピペリジル）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリン；Ｋａｂｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）、ＣＢＳ ３９．３１（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｔａｇｏ Ｌｔｄ．）または蛍光発生基質、たとえばＰｅｆａｆｌｕｏｒ ＦＸａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ−ＡｃＯＨ；Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ）を使用して測定することができる。ＦＸａポリペプチドを、単独で、またはＦＶａの存在下で、所望によりリン脂質の存在下で、様々な濃度の発色基質とインキュベートする。基質の切断は、吸光度または蛍光によりモニタリングすることができ、基質加水分解の速度は、容易に利用できるソフトウェアを使用する線形回帰により決定することができる。
第Ｘａ因子のタンパク質分解活性はまた、ＦＸａ基質、たとえばプロトロンビンの活性化をモニタリングすることにより間接的に評価することができる。ＦＶａとのプレインキュベーション有りまたは無しで、リン脂質の存在下で、ＦＸａポリペプチドは、精製されたプロトロンビン（市販されている）とインキュベートすることができる。次に、プロトロンビンのＦＸａポリペプチド切断の結果として産生される活性なトロンビンの量は、蛍光変化を介してモニタリングされる（ＵＳ ２００５／０１４２０３２、以下の実施例４も参照）、Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ（Ｈ−Ｄ−ＣＨＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ２ＡｃＯＨ；Ｃｅｎｔｅｒｃｈｅｍ）のような蛍光発生基質、または、吸光度変化によりモニタリングされるＴ３０６８（β−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ ｐ−ニトロアニリドジアセテート；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）のような発色基質に対するトロンビンの活性として測定される。次に、第Ｘａ因子ポリペプチド活性は、測定されたトロンビン活性から推定される。
ｃ．凝固活性
ＦＸ／ＦＸａポリペプチドは、当技術分野においてよく知られているアッセイを使用することによって凝固活性について試験することができる。たとえば、アッセイのいくつかは、２ステージ凝血アッセイ（Skogenら, (1983) J. Biol. Chem. 259(4):2306-2310）；プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイ；ＰＴ試験の改良であるアッセイ；活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）；活性化凝血時間（ＡＣＴ）；希釈活性化第Ｘ因子活性化凝血時間(dilute activated factor X-activated clotting time)（ＸＡＣＴ）(Exnerら (2000) Blood Coagul Fibrinolysis. 14(8):773-779)；再石灰化活性化凝血時間；リー−ホワイト凝血時間；トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）；または回転トロンボエラストメトリー(rotational thromboelastometry)（ＲＯＴＥＭ）を含むが、これらに限定されない。たとえば、修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドの凝固活性は、ＰＴベースのアッセイによって決定することができ、ＦＸ／ＦＸａは、ＦＸ欠損血漿において希釈され、Ｄａｄｅ ＢｅｈｒｉｎｇからのＩｎｎｏｖｉｎ（商標）として入手可能なものなどのようなプロトロンビン時間試薬（リン脂質およびカルシウムを有する）と混合される。血餅形成は、光学的に検出され、血餅までの時間は、決定され、ＦＸ欠損血漿のみに対して比較される。
ｄ．他のタンパク質および分子への結合および／またはそれによる阻害
阻害アッセイは、たとえばアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）／ヘパリン複合体などのようなＦＸａ阻害因子に対する修飾ＦＸａポリペプチドの抵抗性を測定するために使用することができる。他の阻害因子についての阻害の評価もまた、試験することができ、プロテインＺ依存性プロテアーゼ阻害因子（ＺＰＩ）、およびＦＸａ特異的抗体などのような他のセリンプロテアーゼ阻害因子を含むが、これらに限定されない。阻害は、ＦＸａポリペプチドと市販のＡＴ−ＩＩＩおよび未分画ヘパリンとのインキュベーションにより評価することができる。次いで、ＦＸａの活性は、上記に記載される、任意の１つまたは複数の活性アッセイまたは凝固アッセイを使用して測定することができ、ＡＴ−ＩＩＩまたはＺＰＩによる阻害は、阻害因子とインキュベートされなかったＦＸａポリペプチドの活性との、阻害因子とインキュベートされたＦＸａポリペプチドの活性の比較によって評価することができる。
ＦＸａポリペプチドは、他の凝固因子および阻害因子に対する結合について試験することができる。たとえば、ＦＶａなどのような補因子、プロトロンビンなどのような基質、ＡＴ−ＩＩＩ、ＺＰＩおよびヘパリンなどのような阻害因子とのＦＸａの直接的なおよび間接的な相互作用は、免疫沈降；カラム精製；非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイを含む表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）；蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）；蛍光偏光（ＦＰ）；等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）；円二色性（ＣＤ）；タンパク質断片補足性アッセイ（ＰＣＡ）；核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法；光散乱；沈降平衡；小ゾーンゲル濾過クロマトグラフィー；ゲル遅延；ファーウェスタンブロッティング；蛍光偏光；ヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリント；ファージディスプレー；および様々な様々な２−ハイブリッド系を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている任意の結合アッセイを使用して評価することができる。１つの例として、リン脂質結合ＦＶａへのＦＸａの結合親和性は、放射性ＦＸａおよびＦＶａおよび油遠心分離を使用して決定された（Tracyら, (1981) J. Biol. Chem. 256(2): 743-751）。
ｅ．リン脂質親和性
ホスファチジルセリン（ＰＳ）および他のリン脂質に対する修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドの結合性および／または親和性は、当技術分野においてよく知られているアッセイを使用して決定することができる（たとえばBurriら, (1987) Biochimica et Biophysica Acta. 923(2): 176-186を参照のこと）。高度に純粋なリン脂質（たとえば既知濃度のウシＰＳおよび卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）これは、Ｓｉｇｍａなどから入手可能である）は、有機溶媒において、小さな単層リン脂質小胞を調製するために使用することができる。これらのＰＳ／ＰＣ小胞へのＦＸ／ＦＸａポリペプチドの結合は、入射光に対する９０°での相対的な光散乱によって決定することができる。ＰＣ／ＰＳ単独でのおよびＰＣ／ＰＳ／ＦＸまたはＰＣ／ＰＳ／ＦＸａでの光散乱の強度は、解離定数を決定するために測定される（Burriら, (1987) Biochimica et Biophysica Acta. 923(2): 176-186）。ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー機器でなどのような表面プラズマ共鳴もまた、リン脂質膜に対するＦＸ／ＦＸａポリペプチドの親和性を測定するために使用することができる（Erbら, (2002) Eur. J. Biochem. 269(12):3041-3046）。
２．非ヒト動物モデル
非ヒト動物モデルは、修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドの活性、有効性および安定性を評価するために使用することができる。たとえば、非ヒト動物は、疾患または状態についてのモデルとして使用することができる。非ヒト動物は、止血に対する効果をモニターするために、表１４に記載されているＦＸ／ＦＸａ変異体のいずれか、特にチモーゲンまたはＦＸａまたはそれらの触媒活性形態のようなＦＸ／ＦＸａ変異体の投与の前に、抗凝固治療薬の過剰摂取のような疾患および／または表現型誘導物質を注射することができる。
遺伝モデルもまた、有用である。例えば、血友病Ａを示す第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスのような、１つまたは複数の遺伝子の過剰発現、過小発現、またはノックアウトによって疾患または状態を模倣するマウスなどのような動物は、生成することができる（Biら (1995) Nat Gen 10:119-121）。第ＶＩＩ因子欠乏；第ＩＸ因子欠乏（たとえば、血友病Ｂモデル）；第Ｘ因子欠乏；第ＸＩ因子欠乏（血友病Ｃモデル）；第ＸＩＩ因子欠乏；およびＩ、ＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ型家族性多発性凝固因子欠乏（ＦＭＦＤ）に限定されないがこれらを含む他の凝固因子における欠乏もまた、ＦＸ／ＦＸａ変異体を試験するために産生することができる（Roberts, HR and MD Bingham, “Other Coagulation Factor Deficiencies”. Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, 1998: 773-802参照）。そのような動物は、当技術分野においてよく知られているトランスジェニック動物産生技術または天然に存在する突然変異株もしくは誘発突然変異株を使用することによって生成することができる。ＦＸ／ＦＸａと関連する疾患の有用な非ヒト動物モデルの例は、出血障害、特に血友病、または血栓症のモデルを含むが、これらに限定されない。損傷または外傷のための非ヒト動物モデル、および外傷後血液希釈性血液凝固障害(post trauma hemodilutional coagulopathy)または急性外傷性血液凝固障害の動物モデルもまた、ＦＸ／ＦＸａポリペプチドの活性、たとえば凝固活性を評価するために使用することができる。これらの非ヒト動物モデルは、野生型ＦＸ／ＦＸａポリペプチドと比較して、ＦＸ／ＦＸａ変異体の活性をモニターするために使用することができる。
動物モデルはまた、修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドの安定性、半減期およびクリアランスをモニターするために使用することもできる。そのようなアッセイは、修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドを比較するのに、ならびにさらなる非ヒト動物試験およびヒト試験のための用量および用量レジメンを計算するのに有用である。例えば、たとえば、表１４のいずれかにおいて記載されているものを含む本明細書において提供される任意のＦＸ／ＦＸａ変異体のような修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチド、特にチモーゲン、ＦＸａまたはそれらの触媒活性部分は、マウスの尾部静脈の中に注射することができる。次いで、血液試料は、注射の後の時点で採取され（数分、数時間、および数日後など）、次いで、限定はしないが、血清または血漿を含む身体的サンプルにおける修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドのレベルは、たとえばＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイによって、特定の時点でモニターすることができる。ＦＸ／ＦＸａポリペプチドの注射後の様々な時点の血液サンプルもまた、実施例８に記載されているように、様々なモデルを使用して凝固活性について試験される。薬物動態学試験のこれらの型は、凝血促進のための投与のための適当な用量を決定することを手助けするＦＸ／ＦＸａポリペプチドの半減期、クリアランスおよび安定性に関する情報を提供することができる。
表１４のいずれかにおいて記載されているもののような修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチド、特にチモーゲン、ＦＸａまたはそれらの触媒活性形態は、血友病のための動物モデルを使用して、治療有効性について試験することができる。非限定的な一例では、マウスなどのような動物モデルを、使用することができる。血友病のマウスモデルは、当技術分野において入手可能であり、修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドを試験するために用いることができる。例えば、抗ＦＶＩＩＩ抗体での注射により産生される血友病Ａのマウスモデルは、凝固因子ポリペプチドの血液凝固活性を評価するために使用することができ（たとえば、Tranholmら Blood (2003)102:3615-3620）、血友病の誘発モデルにおける修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドの試験を検討する。血友病Ａ（Biら (1995) Nat Gen 10:119-121）または血友病Ｂ（Margaritisら (2004) J Clin Invest 113:1025-1031）の遺伝的マウスモデルもまた、修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドを試験するために用いることができる。
出血障害の非マウスモデルも存在する。ＦＸ／ＦＸａポリペプチド活性は、ワルファリン誘導出血またはメラガトラン誘導出血を有するラット（Dinessら (1992) Thromb. Re.s 67:233-241、Elgら (2001) Thromb. Res. 101:145-157）、およびヘパリン誘導出血を有するウサギ（Chanら (2003) J. Thromb. Haemost. 1:760-765）において評価することができる。抗凝固薬過剰摂取の霊長動物モデル（Gruberら, (2008) Blood 112: Abstract 3825）もまた、修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチド活性を試験するために使用することができる。重度の出血を示す近交系(Inbred)血友病Ａ、血友病Ｂおよびフォン・ヴィレブランド病イヌ（Brinkhousら (1989) PNAS 86:1382-1386）もまた、修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドを有する非ヒト動物試験において使用することができる。ＦＸ／ＦＸａポリペプチドの活性もまた、血小板減少症が血小板抗体の使用およびガンマ照射の組合せにより誘導される出血のウサギモデルにおいて評価することができる（Tranholmら (2003) Thromb. Res. 109:217-223）。
全身性出血障害を有する動物に加えて、後天性血液凝固障害の損傷および外傷モデルもまた、修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドの活性、および凝固治療薬としての安全性および有効性を評価するために使用することができる。かかるモデルの非限定的な例は、ウサギ冠動脈狭窄モデル（Fattoruttoら (2004) Can J Anaesth; 51:672-679）、ブタにおけるＶグレード肝臓損傷モデル（Kopelmanら (2000) Cryobiology; 40:210-217; Martinowitzら (2001) J Trauma; 50:721-729）、ブタ大動脈切開モデル（Sondeenら (2004) Shock; 22:163-168）、外傷の急性血液凝固障害のブタモデル（Harrら, (2011) J Surg Res; 170(2):319-324）；および外傷の後天性血液凝固障害のブタモデル（Dickneite, G. and I. Pragst, (2009) Br J Anaesth; 102(3):345-354）を含む。
３．臨床アッセイ
多くのアッセイは、臨床的使用のためのＦＸ／ＦＸａの活性を評価するのに利用可能である。そのようなアッセイは、インビボにおける凝固、タンパク質安定性、および半減期の評価ならびに表現型アッセイを含むことができる。表現型アッセイおよびＦＸ／ＦＸａ処置の治療効果を評価するためのアッセイは、ＦＸ／ＦＸａの血中レベルの評価（たとえば、肥満度指数（ＢＭＩ）について修正するための、投与前のならびに第１の投与の後、最後の投与直後、および中間の時点を含む投与の後の時点の血清ＦＸ／ＦＸａの測定）、ＦＸ／ＦＸａでの処置後に上記方法を使用するインビトロでの血液凝固の評価（たとえばＰＴアッセイ）、および未修飾ＦＸ／ＦＸａおよび／または野生型ＦＸ／ＦＸａまたは偽薬を用いて処置される対象と比較した、長い間にわたる症状の回復を含む、ＦＸ／ＦＸａ処置に対する表現型の応答を含む。修飾ＦＸ／ＦＸａポリペプチドで処置される患者は、失血、輸血の必要性、およびヘモグロビンについてモニタリングすることができる。患者は、ルーチン的な投与もしくは反復投与のためのある期間にわたりまたは出血、外傷、もしくは手術手技などのような急性事象に応じた投与の後に定期的にモニターすることができる。
Ｇ．製剤および投与
出血障害の処置における使用のための修飾ＦＸチモーゲンおよび修飾ＦＸａポリペプチドを含む修飾ＦＸポリペプチドの組成物は、本明細書において提供される。このような組成物は、治療有効量の本明細書に記載されている修飾ＦＸチモーゲンまたはＦＸａポリペプチドを含む。有効濃度のＦＸポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその誘導体は、全身投与、局所投与、または局所的投与のための適した医薬担体または医薬媒体と混合される。化合物は、選択される障害の処置に有効な量で含まれる。組成物における活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化、排泄率、投薬スケジュール、および投与される量ならびに当業者に知られている他の因子に依存するであろう。
本明細書において提供される化合物の投与に適した医薬担体または医薬媒体は、当業者らに知られている任意のそのような担体を含み、特定の投与様式に適したものとなる。治療有効量の本明細書において記載されるＦＸポリペプチドを含む医薬組成物はまた、投与の直前に、滅菌水などを用いて再構成される凍結乾燥粉末として提供することができる。
１．製剤
修飾ＦＸチモーゲンおよび修飾ＦＸａポリペプチドを含む修飾ＦＸポリペプチドを含有する医薬組成物は、選択される量のポリペプチドを、１つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤と混合することによって、任意の従来の様式において製剤することができる。担体または賦形剤の選択は、投与する医者の技術の範囲内にあり、多くのパラメーターに依存し得る。これらは、たとえば、投与のモード（すなわち、全身、経口、経鼻、経肺、局所的、局所、または任意の他のモード）および処置される障害を含む。
化合物は、微粒子化された形態もしくは他の適した形態で懸濁させることができるまたはより可溶性の活性産物を産生するために誘導体化することができる。結果として生じる混合物の形態は、投与の意図されるモードおよび選択される担体または媒体における化合物の溶解性を含む、多くの因子に依存する。結果として生じる混合物は、溶液、懸濁液、乳濁液、および他のそのような混合物であり、非水性または水性の混合物、クリーム、ゲル、軟膏剤、乳剤、液剤、エリキシル剤、ローション、懸濁剤、チンキ剤、ペースト、泡、エアロゾル、灌注剤、スプレー剤、坐剤、包帯、または全身投与、局所投与、もしくは局所的投与に適している任意の他の製剤として製剤することができる。筋肉内投与、非経口投与、または関節内投与などのような局所的内部投与については、ポリペプチドは、等張緩衝生理食塩水などのような水性ベースの培地において溶液懸濁剤として製剤することができるまたは内部投与のために意図される生体適合性支持体もしくは生体接着性のものと組み合わせられる。
一般に、薬学的に許容可能な組成物は、規制当局に対する承認を考慮して調製されるか、または動物およびヒトにおける使用のための、一般に承認される薬局方に従って調製される。医薬組成物は、アイソフォームが共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体などのような担体を含むことができる。そのような医薬担体は、落花生油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油などのような、石油起源、動物起源、野菜起源、または合成起源のものを含む、水および油などのような、滅菌した液体とすることができる。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水は、典型的な担体となる。食塩水ならびに水性デキストロース溶液および水性グリセロール溶液は、特に注射可能な溶液のための、液体担体として利用することができる。組成物は、有効成分と共に、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、またはカルボキシメチルセルロースなどのような希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、および滑石などのような滑沢剤；ならびにデンプン、アカシアゴムなどのような天然ゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、ならびに当業者らに知られている他のそのような結合剤などのような結合剤を含有することができる。適した医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールを含む。組成物はまた、望ましい場合、少数の量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤、たとえばアセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレアート、および他のそのような作用物質を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、および徐放性製剤の形態をとることができる。治療化合物およびラクトースまたはデンプンなどのような、適した粉末ベースの粉末ミックスを含有する、たとえば、吸入器または注入器における使用のためのゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、製剤することができる。組成物は、伝統的な結合剤およびトリグリセリドなどのような担体と共に坐剤として製剤することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および他のそのような作用物質などのような、標準的な担体を含むことができる。経口投与のための調製物もまた、ボーマン−バーク阻害因子、コンジュゲーションボーマン−バーク阻害因子、アプロチニン、およびカモスタットなどのようなプロテアーゼ阻害因子と共に適切に製剤することができる。適した医薬担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」において記載される。そのような組成物は、対象または患者への適切な投与のための形態を提供するために、適した量の担体と共に、一般に精製形態において、治療有効量の化合物を含有するであろう。
製剤は、投与のモードに適するはずである。たとえば、修飾ＦＸチモーゲンおよび修飾ＦＸａポリペプチドを含む修飾ＦＸを含む組成物は、注射による（たとえばボーラス注射または継続注入による）非経口投与のために製剤することができる。注射可能な組成物は、油性媒体または水性媒体において、懸濁剤、液剤、または乳剤としてそのような形態をとることができる。滅菌した注射可能な調製物はまた、たとえば１，４−ブタンジオールにおける液剤として、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶剤における、滅菌した注射可能な液剤または懸濁剤とすることができる。滅菌した不揮発性油は、溶剤または懸濁媒として慣習的に利用される。この目的のために、合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸を含む）、ゴマ油、やし油、落花生油、綿実油、および他の油のような天然に存在する植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪性媒体を含むが、これらに限定されない任意の無刺激の不揮発性油を、利用することができる。緩衝液、保存剤、酸化防止剤、および適した成分は、必要に応じて組み込むことができるまたはその代わりに、製剤を含むことができる。
ポリペプチドは、組成物におけるただ一つの薬学的に活性な成分として製剤することができる、または他の活性成分と組み合わせることができる。ポリペプチドは、抗体などのような標的作用物質へのコンジュゲーションなどによって、デリバリーのために標的にすることができる。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁剤もまた、薬学的に許容可能な担体として適し得る。これらは、当業者らに知られている方法に従って調製することができる。たとえば、リポソーム製剤は、米国特許第４，５２２，８１１号において記載されるように調製することができる。リポソームデリバリーはまた、徐放性製剤を含むこともでき、フィブロネクチンを用いて修飾される、コラーゲンゲルおよびリポソームなどのような医薬マトリックスを含む（たとえば、Weinerら (1985) J Pharm Sci. 74(9): 922-5を参照されたい）。本明細書において提供される組成物は、これらに限定されないが、不活性担体またはコロイド分散系などのような、デリバリーを容易にする１つまたは複数のアジュバントをさらに含有することができる。そのような不活性担体の代表的で非限定的な例は、水、イソプロピルアルコール、ガス状フルオロカーボン、エチルアルコール、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール、ゲル産生物質、ステアリルアルコール、ステアリン酸、鯨ろう、ソルビタンモノオレアート、メチルセルロース、およびそれらの２つまたはそれ以上の適した組合せから選択することができる。活性化合物は、処置される対象に対して望ましくない副作用の非存在下において、薬学的に許容可能な担体において、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれる。治療有効濃度は、本明細書において提供されるアッセイなどのような知られているインビトロ系およびインビボ系において化合物を試験することによって経験的に決定することができる。
ａ．投薬量
本明細書において提供される修飾ＦＸチモーゲンおよび修飾ＦＸａポリペプチドを含む修飾ＦＸポリペプチドを含む医薬組成物は、単回投薬量（直接）投与、複数投薬量投与または希釈または他の修飾のために製剤化することができる。製剤における化合物の濃度は、投与時に、意図される処置のために有効である量の送達のために有効である。典型的に、組成物は、単回投薬量投与のために製剤化される。組成物を製剤化するために、化合物またはそれらの混合物の重量分率を、処置される状態が軽減または改善されるように、有効な濃度で選択されたビヒクル中に溶解、懸濁、分散、または混合される。
投与される治療剤の正確な量または用量は、特定のＦＸポリペプチド（たとえばＦＸチモーゲンまたはＦＸａおよび／または特定の修飾物）、投与の経路、ならびに疾患の重症度ならびに対象の体重および全身状態などのような他の考慮に依存する。全身投与、治療剤の局所的濃度が、いくつかの場合において、全身投与に際して安全性を伴って達成することができるものよりも、局所的投与の後に、高いものとなり得るが、治療剤の局所的投与は、典型的に、全身投与のあらゆるモードよりも低い用量を必要とするであろう。
必要であれば、特定の投薬量および持続時間ならびに処置プロトコールは、経験的に決定するまたは推定することができる。たとえば、組換えＦＸポリペプチドおよび天然ＦＸポリペプチドの例示的な用量は、適切な投薬量を決定するための出発点として使用することができる。典型的に、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドは、組換え野生型ＦＸポリペプチドと比較して、低下した投薬量および／または低下した頻度で有効となり得る。処置の用量および注射の間の間隔は、出血の重症度および処置に対する患者の応答に応じて変わるであろう、また、適宜、調整することができる。未修飾ＦＸと比較した、修飾ＦＸの活性のレベルおよび半減期などのような因子は、投薬量の決定をなす場合、考慮に入れることができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に決定することができる。たとえば、未修飾ＦＸポリペプチドよりも長い半減期を示す修飾ＦＸポリペプチドは、未修飾ＦＸポリペプチドよりも低い用量および／または低い頻度で投与することができる。同様に、未修飾ＦＸポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示す修飾ＦＸポリペプチドを使用する、治療的効能に必要とされる投薬量は、頻度および量を低下させることができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に当業者によって決定することができる。
ＦＸチモーゲンまたはＦＸａを含む修飾ＦＸポリペプチドの投与量は、ポリペプチドの血液レベルをＦＸポリペプチド形態の通常量の約１０％から約４００％、５０％から１００％または１００％から２５０％に上昇させる量であり得る。投薬量レベルをモニタリングまたは調整するために投与されるＦＸポリペプチドに対する血漿または血液レベルをモニタリングすることは当業者が十分に可能であるレベルである。
組成物は、５０単位／ｍＬから１０００単位／ｍＬまたは約５０単位／ｍＬから１０００単位／ｍＬ、たとえば５０単位／ｍＬから５００単位／ｍＬ、１００単位／ｍＬから６００単位／ｍＬまたは４００単位／ｍＬから１０００単位／ｍＬである量におけるＦＸポリペプチドにて製剤化され得る。組成物の容量は、０．５ｍＬから１００ｍＬ、たとえば０．５ｍＬから５ｍＬ、１ｍＬから１０ｍＬ、５ｍＬから５０ｍＬまたは３０ｍＬから６０ｍＬであり得る。
たとえば、本明細書において提供される修飾ＦＸポリペプチドは、０．０１から１，０００ｍｇ、たとえば０．０５から５００ｍｇ、たとえば１ｍｇから５００ｍｇの投薬量で患者への投与のために製剤化され得る。有効量の薬物は、通常、０．０００２ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、たとえば、約０．００１ｍｇ／ｋｇから７ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇから０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇから０．０７５ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも０．０４ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇの投薬量レベルで提供される。典型的には、投薬量は、少なくとも十分な改善が観察されるまで、少なくとも１日１回である。投与は、数分の過程（たとえば１から１０分または２から５分）にわたってボーラス注入により成し遂げられ得る。あるいは、患者は１から３時間毎にボーラス注入を受けることができ、また十分な改善が観察されるとき、ポリペプチドの１日に１回の注入を成し遂げることができる。したがって、いくつかの例において、投与は、１時間毎に、１日毎に、１週毎にまたは１月毎に繰り返すことができる。例えば、出血症状を経験している患者、たとえば凝固因子欠乏または他の関連する外傷を有する患者の処置のために、投与は、止血が成し遂げられるまで、１−２４時間毎、たとえば２−１２時間毎または４−６時間毎に繰り返すことができる。
ｂ．剤形
医薬品の治療的に活性な化合物およびその誘導体は、典型的に、単位剤形または複数回の剤形で製剤され、投与される。製剤は、適した量の化合物または薬学的に許容可能なその誘導体を含有する、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒、滅菌した非経口液剤または非経口懸濁剤、経口液剤または懸濁剤、および油水乳剤を含むが、これらに限定されない剤形で、ヒトおよび動物に対する投与のために提供することができる。それぞれの単位用量は、必要とされる医薬担体、医薬媒体、または医薬希釈剤と関連して、望ましい治療効果をもたらすのに十分な所定の量の治療的に活性な化合物を含有する。単位用量形態の例は、アンプルおよびシリンジならびに個々に包装される錠剤またはカプセル剤を含む。いくつかの例では、単位用量が、投与前に再構成される凍結乾燥散剤として提供される。たとえば、ＦＸポリペプチドは、注射のための単一用量液剤を生成するために、適した液剤を用いて再構成される凍結乾燥散剤として提供することができる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥散剤が、滅菌蒸留水を用いる再構成によって、緩衝液または食塩水におけるＦＸポリペプチドをもたらすように、ＦＸポリペプチドおよび塩などのような、さらなる構成成分を含有することができる。単位用量形態は、分割してまたはそれを複数にして投与することができる。複数用量形態は、分離した単位用量形態で投与されるように、単一の容器中に包装される複数の同一単位剤形である。複数用量形態の例は、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤のボトル、またはパイントもしくはガロンのボトルを含む。したがって、複数用量形態は、包装において分離されない複数の単位用量である。
２．修飾ＦＸポリペプチドの投与
本明細書において提供されるＦＸチモーゲンまたはＦＸａポリペプチドを含む修飾ＦＸポリペプチド（つまり活性化合物）は、体液または他の組織試料などのような混合物を修飾ＦＸポリペプチドと接触させることによって、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて投与することができる。たとえば、エクスビボにおいて化合物を投与する場合、対象からの体液または組織試料は、たとえばバイパス機械におけるチューブまたはフィルターなどのようなチューブまたはフィルター上にコーティングされているＦＸポリペプチドと接触させることができる。インビボにおいて投与される場合、活性化合物は、液体形態、半液体形態、または固体形態において、任意の適切な経路によって、たとえば経口的に、経鼻的に、経肺で、非経口的に、静脈内に、皮内に、皮下に、関節内に、槽内に眼内に、脳室内に、鞘内に、筋肉内に、腹腔内に、気管内に、または局所におよびその任意の２つまたはそれ以上の任意の組合せによって、投与することができ、投与のそれぞれの経路に適した様式において製剤される。修飾ＦＸポリペプチドは、１回または２回、３回、４回、もしくは治療効果を達成するために必要とされる任意の回数などのように、１回よりも多く投与することができる複数回の投与は、任意の経路または経路の組合せを介して達成することができ、時間ごと（たとえば２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、またはそれ以上）、日ごと、週ごとまたは月ごとで投与することができる。
投与に最も適した経路は、処置される疾患状態、たとえば出血障害の場所に依存して変わるであろう。一般に、ＦＸポリペプチドは、静脈内ボーラス注射によって投与されるであろう。投与（注入）時間は、約１〜１０分または２〜５分のような数分にわたってであり得る。他の例では、ＦＸの望ましい血液レベルが、血漿レベルによって確かめられるように、活性剤の継続注入によって維持することができる。主治医は、毒性または骨髄、肝臓、もしくは腎臓の機能障害により、投薬量を下げるために、どのようにかついつ療法を終了させる、中断する、調整するかを知っているであろうということに留意されたい。反対に、主治医はまた、臨床応答が適当でない場合に、どのようにかついつ処置をより高度なレベルに調整するかをも知っているであろう（有毒な副作用防止する）。
他の例では、出血障害の場所が、ＦＸ製剤が代替経路を介して投与されることを示してもよい。たとえば、脳の中への（たとえば脳室内）投与を含む局所的投与は、患者がこの領域における出血を経験している場合、実行されてもよい。同様に、関節における出血の処置のために、関節への治療剤の注射による局所的投与（つまり関節内手段、静脈内手段、または皮下手段）を利用することができる。他の例では、たとえば、クリーム、ゲル、もしくは軟膏剤として製剤された、皮膚への治療剤の局所投与または吸入によるまたは気管内の肺への投与が、出血がこれらのエリアに局在化している場合、適切であってもよい。
修飾ＦＸポリペプチドがデポー調製物として製剤される場合、長時間作用性製剤は、植え込み（たとえば皮下にもしくは筋肉内に）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、たとえば、治療化合物は、適したポリマー物質もしくは疎水性物質（たとえば許容可能な油中の乳剤として）またはイオン置換樹脂と共にまたはわずかに可溶性の誘導体として、たとえばわずかに可溶性の塩として製剤することができる。
組成物は、所望の場合、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有することができる包装、キット、またはディスペンサーデバイスにおいて提供することができる。包装は、たとえば、ブリスターパック等の金属箔またはプラスチック箔を含有する。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための説明書を添付することができる。活性剤を含有する組成物は、包装材料、本明細書において提供される作用物質、および作用物質が提供される障害を示すラベルを含有する製品として包装することができる。
３．修飾ＦＸポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子療法）
修飾ＦＸポリペプチドをコードする核酸分子および遺伝子療法に適したそれらをコードする発現ベクターの組成物もまた、提供される。タンパク質を送達するのではなく、全身的にもしくは他の経路などによりインビボにおいてまたはリンパ球を含む細胞の除去、その中への核酸の導入、および宿主もしくは適合性のあるレシピエントへの再導入などによりエクスビボにおいて核酸を投与することができる。
修飾ＦＸポリペプチドは、核酸分子の発現によって細胞および組織に送達することができる。修飾ＦＸポリペプチドは、修飾ＦＸポリペプチドをコードする核酸分子として投与することができ、エクスビボ技術および直接的インビボ発現を含む。核酸は、当業者らに知られている任意の方法によって細胞および組織に送達することができる。単離核酸配列は、さらなる操作のためにベクターの中に組み込むことができる。本明細書において使用されるように、ベクター（またはプラスミド）は、その発現または複製のいずれかのために細胞の中に異種ＤＮＡを導入するために使用される別個のエレメントを指す。そのような媒体の選択および使用は、当業者の技術の範囲内に十分にある。
コード核酸分子の発現による修飾ＦＸポリペプチドの投与のための方法は、組換えベクターの投与を含む。ベクターは、複製の起点の包含などによりエピソームのままとなるように設計することができるまたは細胞における染色体の中に統合するよう設計することができる。修飾ＦＸポリペプチドはまた、非ウイルス性ベクターを使用して、エクスビボ遺伝子発現療法において使用することができる。たとえば、細胞は、修飾ＦＸポリペプチドコード核酸をゲノムの場所の中に統合し、調節配列に作動可能に連結されるまたは結果として、それが、ゲノムの場所における調節配列に作動可能に連結されて配置されることなどによって、修飾ＦＸポリペプチドを発現するように操作することができる。次いで、そのような細胞は、処置を必要とする患者などのような対象に局所的にまたは全身的に投与することができる。
ウイルス性ベクターは、たとえばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、および遺伝子療法のために設計される他のものを含み、利用することができる。ベクターは、エピソームのままとすることができるまたは処置される対象の染色体の中に統合することができる。修飾ＦＸポリペプチドは、ウイルスによって発現させることができ、修飾ＦＸポリペプチドは、処置を必要とする対象に投与される。遺伝子療法に適したウイルス性ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、および上記に述べられている他のものを含む。たとえば、アデノウイルス発現技術は、当技術分野においてよく知られており、アデノウイルス産生および投与方法もまた、よく知られている。アデノウイルス血清型は、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から利用可能である。アデノウイルスは、エクスビボにおいて使用することができる、たとえば、細胞は、処置を必要とする患者から単離され、修飾ＦＸポリペプチド発現アデノウイルスベクターを用いて形質導入される。適した培養期間の後、形質導入された細胞は、対象に局所的および／または全身的に投与される。代わりに、修飾ＦＸポリペプチド発現アデノウイルス粒子は、単離され、対象の疾患または状態を予防する、処置する、または回復させるために、治療有効量のデリバリーのために、薬学的に許容可能な担体において製剤される。典型的に、アデノウイルス粒子は、対象体重１キログラム当たり１個の粒子から１０１４個の粒子の範囲、一般に、対象体重１キログラム当たり１０６個または１０８個の粒子から１０１２個の粒子の間の用量で送達される。
いくつかの場面において、細胞表面膜タンパク質もしくは標的細胞に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどのような、細胞を標的にする作用物質と共に核酸源を提供することが望ましい。ＦＸはまた、デリバリーのために、特定の細胞型の中に向けることもできる。たとえば、ＦＸポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターは、肝細胞などのような非分裂細胞における安定した発現に使用することができる（Margaritisら (2004) J Clin Invest 113:1025-1031）。他の例では、ＦＸポリペプチドをコードするウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターが、続くデリバリーのために、単離細胞の中に形質導入することができる。ＦＸの発現およびデリバリーのためのさらなる細胞型は、線維芽細胞および内皮細胞を含むが、これらに限定されない。
核酸分子は、人工染色体および他の非ウイルス性ベクターの中に導入することができる。ＡＣＥＳなどのような人工染色体（Lindenbaumら (2004) Nucleic Acids Res. 32(21):e172を参照されたい）は、アイソフォームをコードし、発現するように操作することができる。手短かに言えば、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）は、細胞の中に大きなペイロードの遺伝子情報を自律複製非統合方式において導入するための手段を提供する。ＭＡＣの中で特有に、哺乳動物サテライトＤＮＡベースの人工染色体発現（ＡＣＥ）は、異なる種の細胞株において再現性よくデノボ生成され、宿主細胞の染色体から容易に精製することができる。次いで、精製された哺乳動物ＡＣＥは、様々なレシピエント細胞株に再導入することができ、ＡＣＥは、長期間、選択圧の非存在下においてＡＣＥ系を使用して安定して維持される。このアプローチを使用して、１つまたは２つの遺伝子標的を特異的に積むことがＬＭＴＫ（−）およびＣＨＯ細胞中で達成された。
修飾ＦＸポリペプチドをコードする核酸を導入する他の方法は、酵母における２工程遺伝子置換技術であり、酵母人工染色体（ＹＡＣ）においてクローニングされる完全アデノウイルスゲノム［Ａｄ２；Ketnerら (1994) PNAS 91: 6186-6190］ならびにＹＡＣクローンにおける特異的な領域を標的とするためのアデノウイルス配列、関心のある遺伝子のための発現カセット、ならびにポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含有するプラスミドを用いて始まる。ＹＡＣは、より大きな遺伝子の組み込みを可能にするので、特に関心がある。このアプローチは、哺乳動物細胞または全動物に対する遺伝子移入のための、記載される修飾ＦＸポリペプチドのいずれかをコードする核酸を運ぶ、アデノウイルスベースのベクターの構築に使用することができる。
核酸は、リポソームなどのような媒体にカプセル化するまたは細菌細胞、特に弱毒化された細菌などのような細胞の中に導入するまたはウイルス性ベクターの中に導入することができる。たとえば、リポソームが利用される場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、たとえば、特定の細胞型に対して向性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリングにおいて内部移行を起こすタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化を標的にし、細胞内半減期を増強させるタンパク質が、ターゲティングのためにおよび／または取り込みを容易にするために使用することができる。
エクスビボおよびインビボにおける方法については、修飾ＦＸポリペプチドをコードする核酸分子は、処置されることとなる、適したドナーまたは対象からの細胞の中に導入される。療法の目的のために核酸を導入することができる細胞は、たとえば、処置されることとなる疾患または状態に適切な任意の所望の利用可能な細胞型を含み、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などのような血球；様々な幹細胞または前駆細胞、特にたとえば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、およびそれらの他の源から得られる幹細胞などのような造血幹細胞または造血前駆細胞を含むが、これらに限定されない。
エクスビボ処置については、処置されることとなる対象と適合性のあるドナーに由来する細胞または処置されることとなる対象からの細胞は、除去され、核酸は、これらの単離細胞の中に導入され、修飾細胞は、対象に投与される。処置は、たとえば患者の中に植え込まれる多孔質膜内にカプセル化されるものなどのように、直接的投与を含む（たとえば、それぞれ、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照されたい）。インビトロにおける哺乳動物細胞の中への核酸の移入に適した技術は、リポソームならびにカチオン脂質（たとえばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌ）の使用、電気穿孔法、微量注射法、細胞融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ならびにリン酸カルシウム沈降法を含む。ＤＮＡデリバリーの方法は、インビボにおいて修飾ＦＸポリペプチドを発現させるために使用することができる。そのような方法は、電気穿孔、超音波、およびリン酸カルシウムデリバリーの使用などのように、局所的および全身的なデリバリーを含む、核酸のリポソームデリバリーおよび裸のＤＮＡのデリバリーを含む。他の技術は、微量注射、細胞融合、染色体媒介性遺伝子移入、ミクロセル媒介性遺伝子移入、およびスフェロプラスト融合を含む。
修飾ＦＸポリペプチドのインビボ発現は、さらなる分子の発現に連結させることができる。たとえば、修飾ＦＸポリペプチドの発現は、操作されたウイルスなどにおいて、細胞毒性産物の発現と連結することができるまたは細胞毒性ウイルスにおいて発現させることができる。そのようなウイルスは、治療的効果のために標的とされる特定の細胞型を標的にすることができる。発現修飾ＦＸポリペプチドは、ウイルスの細胞毒性を増強させるように使用することができる。
修飾ＦＸポリペプチドのインビボ発現は、細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターなどのような特異的な調節配列に、修飾ＦＸポリペプチドコード核酸分子を作動可能に連結することを含むことができる。修飾ＦＸポリペプチドはまた、とりわけ標的細胞型および／または標的組織において感染するおよび／または複製するベクターから発現することができる。誘発性プロモーターは、修飾ＦＸポリペプチド発現を選択的に調節するために使用することができる。例示的な調節可能な発現系は、ドキシサイクリン誘発性遺伝子発現系であり、これは、組換えＦＸ発現を調節するために使用されてきた（Srourら (2003) Thromb. Haemost. 90(3):398-405）。
核酸分子は、裸の核酸としてまたはベクター、人工染色体、リポソーム、および他の媒体において、全身投与、局所経路、局所的経路、および投与の他の経路によって対象に投与することができる。全身およびインビボにおけるものである場合、核酸分子または核酸分子を含有する媒体は、細胞を標的にすることができる。
投与はまた、細胞または組織を典型的に標的にするベクターまたは細胞の投与などによって直接的なものとすることができる。たとえば、腫瘍細胞および増殖は、修飾ＦＸポリペプチドのインビボ発現についての標的細胞となり得る。修飾ＦＸポリペプチドのインビボ発現に使用される細胞はまた、患者にとって自己となる細胞をも含む。そのような細胞は、患者から取り出され、修飾ＦＸポリペプチドの発現のための核酸を、導入し、次いで、注射または植え付けなどによって患者に投与することができる。
Ｈ．治療上の使用
本明細書で提供される修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドは、ＦＸチモーゲンまたはＦＸａが用いられる様々な治療法と共に診断方法において用いることができる。かかる方法として、下に記載および収載する生理的および医学的状態の処置方法が挙げられるがこれらに限定されない。典型的には、かかる処置は、止血性応答の増加等、凝固の増加が望まれる処置を包含する。例えば、本明細書で提供される修飾されたポリペプチドは、例えば、血友病患者において生じる出血障害の処置において用いることができる。ＦＸ／ＦＸａポリペプチドは、凝固経路におけるその中心的役割のため、限定されないが血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）または血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠損症）を包含する患者の凝固因子欠損症の処置に特に適しており、これにより欠損因子の要求をバイパスする。本明細書で提供される修飾されたポリペプチドは、外科手術または他の外傷と併せて用いることもできる。
本明細書における方法において、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドのいずれかのＦＸチモーゲンもしくはＦＸａ型またはこれらの触媒活性断片のいずれかを、対象に投与することができる。本明細書で提供される修飾されたポリペプチドは、治療活性を保持するが、修飾された特性、特に、補助因子依存性の増加、触媒活性の増加、基質親和性の増加、グリコシル化の変更および／またはＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増加を提示するよう設計される。かかる修飾された特性は、例えば、補助因子の存在下に限定される修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドの凝固活性の増加により、ポリペプチドの治療上の有効性を改善することができる。変更された特性は、半減期の増加をもたらすこともできる。本明細書で提供される修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドは、野生型ＦＸ／ＦＸａと比較して、同じ効果を達成するためのより低い投薬量を包含する、インビボ活性および治療効果の改善と、より少ないおよび／または低頻度の投与、副作用の減少ならびに治療効果の増加等、投与および処置における他の改善を提示することができる。
例えば、実用上の限定は、血液障害の処置のためのバイパス戦略としての、無修飾のＦＸａポリペプチドを包含するＦＸａポリペプチドの臨床用途を制限した。例えば、循環する無修飾のＦＸａは、内在性の循環するプロテアーゼ阻害因子により急速に不活性化され、２０〜４０時間の生物学的ＦＸ半減期［Robertsら, (1965) Thromb Diath Haemorrh. 13:305-313］を１〜２分間未満に［Gitelら, (1984) J Biol Chem. 259:6890-6895］低下させる。加えて、凝固の病的活性化は、単独のまたは医薬組成物におけるＦＸａポリペプチドの投与に対する懸念である［Gitelら, (1984) J Biol Chem. 259:6890-6895; Lechler (1999) Thromb Res. 95(Suppl. 1):S39-S50］。これは、ＦＸａポリペプチドの投与を用いて、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の動物モデルを作製することができるという事実によって証明される［Kruithofら, (1997) Thrombosis and Haemostasis. 77(2):308-311; Gilesら, (1984) J Clin Invest. 74:2219-2225］。
本明細書に記載されている修飾されたＦＸポリペプチドは、ＦＸａポリペプチドの臨床用途の限定に取り組むために修飾された。ＦＸポリペプチド投与による過剰な凝血を防止するために、本明細書に記載されている修飾されたＦＸポリペプチドは、ＦＸａ型の補助因子依存性の増加（実施例４を参照）を提示するよう修飾されており、活性化された補助因子ＦＶａが存在しない限り、ＦＸａポリペプチドが最小活性から活性なしを提示するように、修飾されたＦＸａポリペプチド活性を制限する。ＦＶａ利用能および会合に基づく修飾されたＦＸａポリペプチド活性の限定は、無修飾のＦＸａポリペプチド処置に関連する血栓症リスクを低下または排除する。重要なことに、しかし、ＦＶａの存在下では、本明細書に記載されている修飾されたＦＸａポリペプチドは、正常な、場合によっては、正常を超える触媒活性を実証する。本明細書に記載されている修飾されたＦＸａポリペプチドの補助因子依存性の増加が、望まれない凝血を低下または排除しつつ、本明細書における修飾されたＦＸａポリペプチドを包含する修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸａポリペプチドと比較して、血清半減期の改善、阻害因子に対する抵抗性の増加、触媒活性の増加および／または凝固活性の増加等、薬物動態および薬力学特性の改善を提示することができる。
一部の例において、ＦＸチモーゲンまたはＦＸａ型を包含するＦＸポリペプチドの処置方法は、持続的な治療効果を引き起こすために、作用のより長い持続時間を必要とする。これは、血友病患者および他の先天性または慢性出血障害の処置に特に当てはまる。本明細書の他の箇所で記述されている通り、ＦＸａの半減期は、一部には、ＡＴ−ＩＩＩ等の阻害因子による阻害のために、４０時間未満である。ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性を提示する、および／または非天然グリコシル化部位の導入により高グリコシル化されている、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、半減期の増加を提示することができる。よって、本明細書に記載されているかかる修飾されたＦＸポリペプチドを用いて、凝血障害のためのより長く持続する治療法を送達することができる。
特に、修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドは、処置のためにＦＸ／ＦＸａを用いることのできる治療方法における使用のために企図されている。典型的には、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、凝血原であり、先天性出血障害および後天性出血障害を包含する出血障害の処置に用いることができる。例示的な疾患および障害は、血液凝固障害、血液障害、出血性障害、血友病、凝固因子欠損症、ならびに外傷および外科手術に関連する出血を包含する後天性血液障害等が挙げられるがこれらに限定されない。一部の例において、ＦＸ／ＦＸａポリペプチドにより処置する出血は、脳、内耳領域、眼、肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管等、臓器において生じる。他の実施形態において、出血は、出血性胃炎および分娩後女性等における大量子宮出血等における、びまん性である。
例えば、血友病ＡおよびＢ等、出血障害の患者は、多くの場合、外科手術または外傷における出血合併症のリスクがある。かかる出血は、急性関節血症（関節における出血）、慢性血友病性関節症、血腫（例えば、筋肉、後腹膜、舌下および咽頭後）、血尿（腎臓の管からの出血）、中枢神経系出血、胃腸出血（例えば、ＵＧＩ出血）および大脳大出血として顕在化され得、これはまた、修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドにより処置することができる。その上、外科手術（例えば、肝切除）または抜歯等、外傷に関連するいずれかの出血は、修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドにより処置することができる。
修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドによる疾患および状態の処置は、本明細書に記載されている適した製剤を用いて、限定されないが、注射、経肺、経口および経皮投与を包含するいずれかの適した投与経路により引き起こすことができる。処置は、典型的には、静脈内ボーラス投与により引き起こされる。
必要であれば、特定の投薬量および持続時間および処置プロトコールは、経験的に決定または外挿することができる。野生型または無修飾のＦＸチモーゲンまたはＦＸａポリペプチドの投薬量は、修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａポリペプチドの投薬量を決定するためのガイダンスとして用いることができる。修飾されたＦＸチモーゲンまたはＦＸａポリペプチドの投薬量は、関連する動物試験から決定または外挿することもできる。無修飾のＦＸ／ＦＸａと比較した修飾されたＦＸ／ＦＸａの活性のレベルおよび半減期等の因子は、かかる決定を行う際に用いることができる。特定の投薬量およびレジメンは、種々の因子に基づき経験的に決定することができる。かかる因子は、個体の体重、総体的健康、年齢、用いた特異的化合物の活性、性別、食事、投与時間、排泄率、薬物組み合わせ、疾患の重症度および経過ならびに疾患に対する患者の素質ならびに処置する医師の判断を包含する。活性成分、ポリペプチドは、典型的には、医薬品として有効な担体と組み合わされる。担体材料と組み合わせて単一剤形または複数剤形を産生することができる活性成分の量は、処置されている宿主および特定の投与様式に応じて変動し得る。
一部の例において、修飾されたＦＸポリペプチドの不活性チモーゲン型は、病的出血を制御するために投与することができる。例えば、ＦＸポリペプチドは、約５０〜８００ユニット／ｍｌの投薬量で投与することができ、ＦＸチモーゲンの比活性は、約２０〜１３０ユニット／ｍｇタンパク質である（米国特許第４，５０１，７３１号）。修飾されたＦＸポリペプチドのチモーゲン型が投与される場合、内在性テナーゼ複合体が、投与されたＦＸチモーゲンを切断して、治療活性を付与する活性化ＦＸ（ＦＸａ）とする。
一部の例において、本明細書に記載されている修飾されたＦＸポリペプチドは、活性化ＦＸ型（ＦＸａ）における病的出血を制御するために投与することができる。例えば、精製されたＦＸポリペプチドは、実施例２Ｂに記載されている通り精製の最中等、インビトロにおいて投与前に、ラッセルクサリヘビ毒ＦＸ活性化因子（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または他の凝固因子により活性化することができる。チモーゲン様活性を提示するよう修飾された、本明細書で提供される修飾されたＦＸａポリペプチドは、約１０〜２５０μｇ／ｋｇの間等、１０〜１０００μｇ／ｋｇの間、一般に、４０μｇ／ｋｇ等、１０〜７５μｇ／ｋｇの間の投薬量で投与することができる（例えば、米国特許出願公開第２００９０１７５９３１号を参照）。
他の例において、本明細書に記載されている修飾されたＦＸポリペプチドは、治療組成物、例えば、直接的なＦＸ活性化因子を含有するまたは含有しない組成物の一部として投与することができる。例えば、治療組成物は、第ＩＩ因子および／またはプロトロンビン等、テナーゼ複合体の一部を形成しない他の凝固因子を含有することができる。別の例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａ；ＦＩＸまたはＦＩＸａ等、活性またはチモーゲン型のＦＸ活性化酵素を含有してもよい治療組成物において提供することができる。ＦＸポリペプチドは、例えば、１０：１の比で活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）と組み合わせて、阻害因子による血友病患者に投与することができる［Shirahataら, (2012) Haemophilia 18:94-101］。別の例において、０．５８ＩＵ／ｍｌ ＦＸおよび０．２９ＩＵ／ｍｌ ＦＩＸを含有する治療用濃縮製剤を用いて、抗凝固薬の過量投与により誘導される凝固障害を処置することができる［Olesenら, (2009) J. Thrombosis and Haemostasis 7(S2):Abstract No. PP-MO-386］。他の例において、修飾されたプロトロンビン複合体濃縮製剤は、修飾されたＦＸポリペプチドならびに凝血因子ＩＩ、ＶＩＩおよびＩＸと共にプロテインＣおよびプロテインＳを用いて生成することができる。
血液の凝血時間におけるＦＸ／ＦＸａポリペプチドの効果は、限定されないが、全血プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、活性化凝血時間（ＡＣＴ）、再石灰化活性化凝血時間またはＬｅｅ−Ｗｈｉｔｅ凝血時間を包含する、本技術分野において公知の凝血検査のいずれかを用いてモニターすることができる。
患者の状態が改善したら、必要であれば、化合物または組成物の維持用量を投与することができ、投薬量、剤形もしくは投与頻度またはこれらの組み合わせを修飾することができる。場合によっては、対象は、疾患症状が再発したら、または予定される投薬量に基づき、長期基盤における間欠的処置を要求することができる。他の場合において、大出血、外傷または外科手技等、急性事象に応答して、追加的な投与を要求することができる。
修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドは、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて治療活性を有する。このセクションは、例示的な使用および投与方法を提供する。このような記載されている治療法は、例示的なものであり、修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドの適用を限定しない。以下は、ＦＸ／ＦＸａを単独でまたは他の薬剤と組み合わせて処置薬剤として用いることができる、いくつかの例示的な状態である。
１．先天性出血障害
本明細書に記載されているもの等、修飾されたＦＸチモーゲンおよびＦＸａポリペプチドを用いて、先天性出血障害を処置することができる。例えば、ＦＸおよびＦＸａポリペプチドを用いて、内因性または外因性凝固経路のいずれかにおけるいずれかの凝固因子をバイパスし、その欠損による凝固障害を処置することができる。先天性凝固因子欠損症に起因する出血障害は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）；血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）；血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠損症）；第ＶＩＩ因子欠損症；第Ｘ因子欠損症；第ＸＩＩ因子欠損症；ならびにＩ、ＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ型家族性多発性凝固因子欠損症（ＦＭＦＤ）を包含する［Roberts, HR and MD Bingham, “Other Coagulation Factor Deficiencies,” Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, 1998: 773-802を参照］。修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドは、限定されないが、フォン・ヴィルブランド病、遺伝性血小板障害（例えば、チェディアック・東およびヘルマンスキー・パドラック症候群等、貯蔵プール疾患、トロンボキサンＡ２機能不全、グランツマン血小板無力症ならびにベルナール・スーリエ症候群）およびランデュ・オスラー・ウェーバー症候群としても公知の遺伝性出血性毛細血管拡張症（Telangiectsasia）等の追加的な先天性出血疾患および障害の処置において用いることもできる。
ａ．血友病
本明細書に記載されているもの等、修飾されたＦＸチモーゲンおよびＦＸａポリペプチドを用いて、血友病等、先天性出血障害を処置することができる。血友病は、１種または複数の血液凝固因子における欠損に起因する出血障害である。これは、組織損傷部位において血餅を形成する能力の減少によって特徴付けられる。先天性Ｘ連鎖血友病は、血友病Ａおよび血友病Ｂを包含し、これらは、それぞれＦＶＩＩＩおよびＦＩＸに欠損をもたらす突然変異（複数可）に起因する。血友病Ａは、１０，００００名の男性に１名の比率で発生し、一方、血友病Ｂは、５０，０００名の男性につき１名に発生する。血友病ＡおよびＢは、軽度、中等度または重度としてさらに分類される。血漿レベル５％〜２５％の正常に機能する第ＶＩＩＩまたはＩＸ因子は軽度、１％〜５％は中等度、１％未満は重度として分類される。多くの場合ＦＸＩ欠損症と称される血友病Ｃは、相対的に軽度の、稀な常染色体劣性遺伝疾患であり、１０００００名につき約１名に影響を及ぼす。
血友病の患者は、自発的または外傷に応答したものとなり得る、反復性の関節および筋肉出血を患う。出血は、重度急性疼痛の原因となり、移動を制限し、滑膜肥大化を包含する続発性合併症をもたらし得る。さらに、関節における反復性の出血は、関節損傷の原因となり、滑膜、軟骨および骨を破壊し得る、慢性滑膜炎の原因となり得る。出血は、一般に、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）の輸血、ＦＸＩ補充療法により処置されるか、または外部の創傷または抜歯の処置等、外用処置のために、フィブリン糊により処置される。血友病ＡまたはＢのために最も一般的な処置は、患者にＦＶＩＩＩまたはＦＩＸが投与される補充療法である。製剤は、血漿由来または組換え産物として商業的に入手でき、組換えタンパク質は、現在、以前には処置されなかった患者における最適な処置である。これらの治療法は、大いに成功を収め得るが、患者が、新たに投与された第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害因子を発生させる場合、合併症が生じる。
阻害因子は、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸと反応し、凝血原機能に干渉する、大部分はＩｇＧ４サブクラスのＩｇＧ抗体である。阻害因子は、５名の重度血友病Ａ患者につき約１名に影響を及ぼす。大部分の対象は、多くの場合小児期初期である第ＶＩＩＩ因子の最初の注入の投与直後にこれらの阻害因子を発生させるが、対象は、阻害因子を後年に発生させる。阻害因子はまた、軽度または中等度血友病Ａの１５名につき約１名に影響を及ぼす。これらの阻害因子は通常、成人期に発生し、投与された外因性ＦＶＩＩＩを破壊するだけではなく、内在性ＦＶＩＩＩも破壊する。その結果、軽度および中等度血友病は、重度となる。臨床的には、阻害因子を有する血友病Ａ患者は、ＦＶＩＩＩに再曝露されたときに経験する既往性応答の強度に従って高および低レスポンダーに分類される。阻害因子は、１００名の血友病Ｂ患者につき約１名に影響を及ぼす。殆どの場合、阻害因子は、治療用第ＩＸ因子の最初の注入後に発生し、アレルギー反応を伴い得る。
本明細書で提供される修飾されたＦＸチモーゲンおよびＦＸａポリペプチドならびに本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドをコードする核酸は、阻害因子を有する血友病患者を包含する血友病患者のための治療法において普遍的に用いることができ、血友病に関連する出血状態の処置に用いることができる。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドを用いて、例えば、ＦＶＩＩＩａおよび／またはＦＩＸａの必要をバイパスしつつトロンビン生成を増強することにより、自発的出血エピソードを制御もしくは防止するか、または外傷もしくは外科手技に応答した出血を制御もしくは防止することができる。
修飾されたＦＸポリペプチドは、例えば、動物モデルを用いることにより、治療上の有効性に関して検査することができる。例えば、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ欠損マウス、抗体誘導性血友病性マウスまたは他のいずれか公知の血友病の疾患モデルは、修飾されたＦＸポリペプチドにより処置することができる。疾患症状および表現型の進行をモニターして、修飾されたＦＸポリペプチドの効果を査定する。修飾されたＦＸポリペプチドは、臨床治験等において、動物モデルや対象に投与して、プラセボ対照および／または無修飾のＦＸポリペプチドを用いた対照と比較したインビボ有効性を査定することもできる。
ｂ．他の凝固因子欠損症
本明細書に記載されているもの等、修飾されたＦＸチモーゲンおよびＦＸａポリペプチドを用いて、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ以外の凝固因子における欠損に起因する凝固障害の患者を処置することもできる。例えば、ＦＸポリペプチドを用いて、第ＶＩＩ因子欠損症、第Ｘ因子欠損症、第ＸＩＩＩ因子欠損症ならびにＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ型家族性多発性凝固因子欠損症（ＦＭＦＤ）の患者を処置することができる（Roberts, HR and MD Bingham, “Other Coagulation Factor Deficiencies,” Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, 1998: 773-802を参照）。
ｉ．第ＶＩＩ因子欠損症
本明細書に記載されているもの等、修飾されたＦＸチモーゲンおよびＦＸａポリペプチドは、第ＶＩＩ因子欠損症の対象または患者において用いることができる。第ＶＩＩ因子欠損症は、５００，０００名につきおよそ１名に影響を及ぼす常染色体劣性遺伝出血障害である。ＦＶＩＩ欠損症は、臨床的に軽度、中等度または重度となることができ、軽度から中等度欠損症は、外科手術および外傷後の出血の増加によって特徴付けられる。重度ＦＶＩＩ欠損症（１％未満のＦＶＩＩ活性）の患者は、血友病と類似の症状を経験する。例えば、ＦＶＩＩ欠損症対象は、関節出血、関節出血、自発的鼻出血、胃腸出血、尿路出血する傾向がある。脳内出血および筋肉出血も報告されている一方、女性は、重度月経過多（重い月経性出血）を経験し得る。処置は、血漿、ＰＣＣおよび組換えＦＶＩＩａを用いた補充療法により行うことができる［Hednerら, (1993) Transfusion Med Rev, 7:78-83；米国特許出願公開第２００９−０２９１８９０号明細書］。本明細書に記載されている修飾されたＦＸポリペプチドは、凝固経路においてＦＶＩＩの下流で作用し、よって、ＦＶＩＩ欠損症患者における出血エピソードの処置および外科的介入または観血的手技における出血の防止において用いることができる。修飾されたＦＸポリペプチドは、チモーゲン型でまたは活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。
ｉｉ．第Ｘ因子欠損症
本明細書に記載されているもの等、修飾されたＦＸチモーゲンおよびＦＸａポリペプチドは、第Ｘ因子欠損症の対象または患者において用いることができる。第Ｘ因子欠損症は、１，０００，０００名に１名の発生率による稀な常染色体劣性遺伝出血障害である。第Ｘ因子欠損症は、臨床的に軽度（６〜１０ＩＵ／ｄＬ）から重度（＜１ＩＵ／ｄＬまたは正常ＦＸ活性の＜１％）に及ぶ可変的な出血表現型を呈する。正常の１０〜１５％の第Ｘ因子活性を有する個体は、限定的な自発的出血を経験し、大出血は、外科手術または外傷との関連においてのみ生じる［Peyvandiら, (1998) Br J Haematol. 102:626-628; Uprichard, J and DJ Perry, (2002) Blood Reviews. 16:97-110; Roberts, HR and MD Bingham, “Other Coagulation Factor Deficiencies,” Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, 1998: 773-802］。ＦＸ欠損症患者が、鼻出血を経験することはよくあり、影響を受ける女性の５０％は、月経過多を提示する。重度症例の患者において、関節血症、重度術後大出血および中枢神経系大出血も報告されている。
現在、第Ｘ因子欠損症の補充処置は、血液［Girolamiら (1970) Thromb Diath Haemorrh 24(1):175-18４］、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）［Girolamiら, (1970) Br J Haematol 19(2):179-192］および併用（combination）療法、例えば、因子を含有するプロトロンビナーゼ複合体濃縮製剤（ＰＣＣ）［Lechler, E (1999) Thromb Res 95(Suppl 1):S39-S50］に限定されている。ＦＸを含有する併用療法は、セクションＩにさらに記載されている。ＦＸポリペプチド投与は、現在利用できない。本明細書に記載されている修飾されたＦＸａポリペプチドを用いて、ＦＸ欠損症患者における出血エピソードを処置し、外科的介入または観血的手技における出血を防止することができる。
ｉｉｉ．家族性多発性凝固因子欠損症
本明細書に記載されているもの等、修飾されたＦＸチモーゲンおよびＦＸａポリペプチドを用いて、家族性多発性凝固因子欠損症（ＦＭＦＤ）とも呼ばれる、遺伝する多発性凝固因子欠損に起因する凝固障害の患者を処置することもできる。いずれの因子が影響を受けるかに基づいて分類される、６型のＦＭＦＤが存在する。Ｉ型ＦＭＦＤは、第ＶおよびＶＩＩＩ因子における欠損に起因し、ＩＩ型ＦＭＦＤは、第ＶＩＩＩおよびＩＸ因子における欠損に起因し、ＩＩＩ型ＦＭＦＤの患者は、ビタミンＫ依存性凝固因子（即ち、第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ因子）を欠損し、ＩＶ型ＦＭＦＤは、第ＶＩＩおよびＶＩＩＩ因子における欠損に起因し、第ＶＩＩＩ、ＩＸおよびＸＩ因子における欠損は、Ｖ型ＦＭＦＤをもたらし、第ＩＸおよびＸＩ因子における欠損は、ＶＩ型ＦＭＦＤとして分類される。ＦＭＦＤ、ＩＩおよびＩＶ型は、凝固経路におけるＦＸ上流の凝固因子に欠損を含有し、よって、単独のまたは他の処置と組み合わせた、本明細書に記載されている修飾されたＦＸポリペプチドによる処置から恩恵を得ることができる。本明細書に記載されているＦＸポリペプチドを用いて、通常、併用療法の一部として、他の型のＦＭＦＤを処置することもできる。ＦＭＦＤのうち、Ｉ型およびＩＩＩ型のみが、広範に特徴付けられている。
ＩＩＩ型ＦＭＦＤの臨床的顕在化は、因子欠損または機能不全の程度に応じて、無症状から重度大出血に及ぶ。ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸおよびＦＸの合成におけるカルボキシル化工程の欠陥をもたらす、ガンマグルタミルカルボキシラーゼおよびビタミンＫエポキシド還元酵素複合体の欠陥は、これら４因子の欠損の組み合わせを産生し得る［Brennerら, (1998) Blood. 92:4554-4559; Oldenburgら, (2000) Thromb Haemost. 84:937-941］。ＩＩＩ型ＦＭＦＤは、常染色体劣性遺伝様式で遺伝する。ＩＩＩ型ＦＭＦＤの一部の個体は、大用量のビタミンＫに応答性である［Goldsmithら, (1982) J Clin Invest. 69:1253-1260］。しかし、出血エピソードの処置は、欠損因子を置き換える治療法を必要とする（Roberts, HR and MD Bingham, “Other Coagulation Factor Deficiencies,” Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, 1998: 773-802）。よって、本明細書に記載されている修飾されたＦＸポリペプチドは、一部の型のＦＭＦＤのための処置レジメンの一部として用いることができる。
ｃ．その他
他の先天性出血障害は、本明細書で提供されるＦＸチモーゲンまたはＦＸａポリペプチドを包含するＦＸポリペプチドにより処置して、凝固を促進することができる。フォン・ヴィルブランド病（ｖＷＤ）に関連する、自発的および外科手術関連の出血エピソードは、本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドを用いて処置することができる。ｖＷＤは、凝血タンパク質、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）の欠陥または欠損が原因の出血障害であり、集団の１％〜２％において生じると推定される。ｖＷＤの対象は、容易に挫傷し、反復性の鼻出血をし、抜歯、扁桃摘出術または他の外科手術後に出血し、女性患者は、月経性出血が増加し得る。修飾されたＦＸポリペプチドを用いて、ｖＷＤ患者における自発的および外科手術関連の出血を寛解させることができる。
例えば、グランツマン血小板無力症およびヘルマンスキー・パドラック症候群等、他の血小板関連の出血障害も、内在性凝血活性の低下に関連する。血小板関連の出血障害の患者における過剰な自発的または外科手術関連の出血も、治療用量の修飾されたＦＸポリペプチドによって制御することができる。例えば、外科手術を受けているグランツマン血小板無力症の患者は、外科手術の前、最中および／または後に、修飾されたＦＸポリペプチドにより処置して、大量失血を防止することができる。修飾されたＦＸポリペプチドは、不活性チモーゲン型でまたは活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。
２．後天性出血障害
出血障害は、先天性ではなく後天性であってもよい。本明細書に記載されているもの等、修飾されたＦＸチモーゲンおよびＦＸａポリペプチドを用いて、後天性出血障害を処置することもできる。後天性出血障害は、外科手技の結果としての凝固障害、薬物誘導性の凝固障害、例えば、化学療法レジメンによる血小板減少症を包含する。一例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、抗凝固療法の過量投与に対する解毒薬として用いることができる（米国特許出願公開第２０１１／００１５１２８号）。修飾されたＦＸポリペプチドを用いて、肝臓疾患、ビタミンＫ欠損症の結果としての後天性第Ｘ因子欠損症等、後天性凝固因子欠損症を処置することもできる。修飾されたＦＸ処置から恩恵を受けることのできる他の後天性出血障害は、溶血性尿毒症症候群、アレルギー性紫斑病（ヘノッホ・シェーンライン紫斑病）および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を包含する。
一例において、修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドを用いて、対象における外傷もしくは外科手術による出血エピソードまたは低められた血小板の数値もしくは活性を処置することができる。例えば、例えば輸血の結果としての血液希釈凝固障害または外傷後の急性外傷性凝固障害は、修飾されたＦＸ／ＦＸａポリペプチドにより処置することができる。外科手術を受けている患者のための例示的な方法は、大出血を防止するための処置と、限定されないが、心臓外科手術、血管形成、肺外科手術、腹部外科手術、脊髄外科手術、脳外科手術、血管外科手術、歯科外科手術または骨髄、心臓、肺、膵臓もしくは肝臓の移植を包含する臓器移植外科手術等の外科手術の前、最中または後の処置とを包含する。
ａ．化学療法−後天性血小板減少症
白血病および他のがん等のための化学療法処置は、血小板減少症をもたらし得る。これは、化学療法を受けている患者の骨髄における血小板産生の減少によるものである可能性が高く、典型的には、薬物療法の６〜１０日後に起こる。後天性血小板減少症の処置は通常、血小板、赤血球細胞または血漿輸血によるものであり、これは、血小板欠損に起因し得るいずれかの異常な自発的出血の防止に役立つ。化学療法誘導性血小板減少症または他のいずれかの後天性もしくは先天性血小板減少症の患者における出血は、治療量の本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドの投与により制御することもできる。例えば、胃腸管等に制御できない出血を伴う血小板減少症患者に、治療量のＦＸポリペプチドの静脈内ボーラス注射を投与して、大出血を止めることができる。修飾されたＦＸポリペプチドは、不活性チモーゲン型でまたは活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。
ｂ．他の凝固障害
他の後天性凝固障害は、本明細書に提示されている修飾されたＦＸポリペプチドを用いて処置することができる。凝固障害は、限定されないが、劇症肝不全［ＦＨＦ；肝毒性（hepatoxic）薬物、毒素、代謝疾患、感染性疾患および虚血等が原因］、硬変を包含する他の肝臓疾患およびウィルソン病に関連する疾患、ビタミンＫ欠損症（抗生物質処置または食事等が原因）、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少症（ＴＴＣ）ならびに播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）を包含する状態に起因し得る。従来の処置は、一般に、血漿、赤血球細胞（ＲＢＣ）または血小板の輸血によってなされるが、不成功となり得る。
一例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、観血的手技を受けているＦＨＦの患者に投与して、出血を防止することができる。新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）による従来の処置は多くの場合不成功であり、大量の血漿を必要とし、容量過負荷および全身浮腫（皮下結合組織への浮腫液の全身性浸潤）を生じ得る。例えば、肝臓生検または肝臓移植等、観血的外科手術の最中、前および／または後の静脈内ボーラスによる治療量の修飾されたＦＸポリペプチドによる処置は、ＦＨＦ患者における出血を防止し、止血を確立することができる。患者を血液のＰＴによりモニターして、処置の有効性を決定することができる。
別の例において、ＦＸは、例えば、従来の輸血注入に応答しなかった、肝臓機能不全およびＤＩＣに関連する重度帝王切開後腹腔内出血等、凝固障害に関連する重度出血の患者に投与することができる。さらに、修飾されたＦＸポリペプチドを用いて、新生児および小児科患者における凝固障害を処置することができる。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドと比較して、凝固活性の増加のためのＦＶａ依存性の増強と半減期の増加を提示し、したがって、例えば、より低用量で、低頻度で、より少ない有害反応により投与することができる。修飾されたＦＸポリペプチドは、内在性酵素により活性化されるよう不活性チモーゲン型で、または活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。
ｃ．移植−後天性出血
骨髄移植（ＢＭＴ）および幹細胞移植（ＳＣＴ）後の重度出血は、血小板の低下によって生じる、これらの手技に関連する相対的によく見られる生命に関わる合併症である。例えば、びまん性肺胞大出血（ＤＡＨ）は、移植集団における推定発生率１〜２１％、死亡率６０〜１００％の、ＢＭＴの肺性合併症である。かかる出血エピソードの従来の処置は、副腎皮質ステロイド処置ならびに血漿、血小板および／またはＲＢＣの輸血を包含するが、これらの大部分は、全死亡率およそ５０％で不成功に終わる［Hicksら (2002) Bone Marrow Transpl. 30:975-978］。副腎皮質ステロイドおよび／または血小板注入による同時的処置ありまたはなしによる、静脈内ボーラスによるＦＸの投与を行ってＤＡＨを処置し、止血を確立することができる。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドと比較して、凝固活性の増加のためのＦＶａ依存性の増強と半減期の増加を提示し、したがって、例えば、より低用量で、低頻度で、より少ない有害反応により投与することができる。修飾されたＦＸポリペプチドは、内在性酵素により活性化されるよう不活性チモーゲン型で、または活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。
ｄ．抗凝固薬治療誘導性の出血
血栓塞栓症等の状態の処置のために抗凝固療法を受けている患者は、ワルファリン、ヘパリン、フォンダパリヌクスおよびリバーロキサバン等、抗凝固薬の急性投与による出血エピソードを提示し得るか、またはかかる治療法の長期使用の結果として出血性障害を発症し得る。出血エピソードのための処置は、典型的に、ヘパリンを中和するためのビタミンＫ、血漿、外因性ＦＩＸおよびプロタミン等、凝血原の投与を包含する。単独での、または医薬品製剤の一部としての外因性ＦＸの投与を行って、抗凝固薬の効果を中和し、ＰＴ、ａＰＴＴおよび／または他の凝固マーカーを増加させ、止血を確立することもできる［Gruberら, 2008 Blood. 112:Abstract 3825］。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、抗凝固薬処置による後天性出血障害の患者における出血エピソードを制御するための処置において用いることができる。修飾されたＦＸポリペプチドは、内在性酵素により活性化されるよう不活性チモーゲン型で、または活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。より急速な処置のため、修飾されたポリペプチドは、一般に、活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与される。
ｅ．後天性血友病
第ＶＩＩＩ因子阻害因子は、それ以外の点では健康な個体において自発的に発生することがあり、「後天性血友病」として公知の状態をもたらす。後天性血友病は、年間発生率が百万名の集団につき０．２〜１．０名の稀な状態である。自己抗体は、主にＩｇＧ４抗体であり、これは、ＦＶＩＩＩに結合すると、トロンビン切断、フォン・ヴィルブランド因子相互作用および／またはリン脂質結合に干渉することにより、ＦＶＩＩＩ活性を阻害する。これは、影響を受ける患者のおよそ８７％において生命に関わる大出血をもたらす。主に関節および筋肉において出血する遺伝性血友病の患者とは対照的に、一般的な出血部位は、皮膚、粘膜、筋肉および後腹膜である。後天性血友病は、活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤または組換え活性化第ＶＩＩ因子［ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ］により処置して、出血エピソードを制御することができる。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、凝固活性の増強を提示し、ＦＶＩＩ補充療法の必要をバイパスする。修飾されたＦＸポリペプチドは、内在性酵素により活性化されるよう不活性チモーゲン型で、または活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。より急速な回復を必要とする適用のため、例えば、外科手術において、修飾されたポリペプチドは、活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。
３．外傷および外科的出血
修飾されたＦＸポリペプチドは、正常な凝固系を有する対象における周術期および外傷による失血に関連する出血を処置するための治療法として用いることができる。例えば、修飾されたＦＸポリペプチドを患者に投与して、凝固を促進し、外科手術に関連する失血を低下させ、さらに、輸血の必要を低下させることができる。
一部の例において、修飾されたＦＸポリペプチドは、様々な種類の外科手術を受けている正常な凝固の患者に投与して、急速な止血を引き起こし、失血を防止することができる。修飾されたＦＸによる処置は、外科手術部位における止血を促進し、失血を低下または防止し、これにより、輸血の必要を低下または消失させることができる。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドの一部は、半減期の増加、循環プロテアーゼ阻害因子に対する抵抗性の増加および触媒活性の増加等、特性の増強を提示し、したがって、例えば、より低用量で、低頻度で、より少ない有害反応により投与することができる。修飾されたＦＸポリペプチドは、内在性酵素により活性化されるよう不活性チモーゲン型で、または活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。
本明細書に記載されているもの等、修飾第Ｘ因子ポリペプチドを用いて、外傷による傷害を有する対象における凝固を促進し、失血を防止することもできる。外傷は、外因性作用因子による生きた組織への傷害として定義され、米国における主な死亡原因の第４位である。外傷は、鈍的外傷（内部圧迫、臓器損傷および内部大出血をもたらす）または貫通性外傷（身体を貫通し、組織、血管および臓器を破壊し、外部大出血をもたらす作用因子の結果）のいずれかとして分類される。外傷は、限定されないが、自動車事故（鈍的および／または貫通性外傷を引き起こす）、銃創（貫通性外傷を引き起こす）、刺創（貫通性外傷を引き起こす）、機械による事故（貫通性および／または鈍的外傷を引き起こす）および有意な高さからの落下（貫通性および／または鈍的外傷を引き起こす）を包含する、いくつかの事象によって引き起こされ得る。外傷の結果としての制御できない大出血は、関連する死亡率の多くの原因である。
びまん性凝固障害は、対象の２５〜３６％もの多さにおいて生じる、外傷患者に関連する相対的に一般的な合併症である。凝固障害は、凝固因子および血小板の希釈および消費、線維素溶解、アシドーシスならびに低体温等、種々の因子により、傷害後早期に発症し得る。従来の管理は、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）血小板、ＲＢＣおよび／または寒冷沈降物の輸血による補充療法、アシドーシスの補正ならびに低体温の処置に関与する。これらの工程は、多くの場合、出血を止め、死亡を防止するには不十分である。治療量のＦＸ単独または他の治療法との組み合わせの投与による処置は、外傷患者における凝固を促進し、失血を低下させることができる。例えば、ＦＸポリペプチド含有処置は、希釈性凝固障害のブタモデルにおける凝固および最終血餅強度を増強した［Dickneiteら, (2010) J Trauma 68(5):1151-1157; Mitterlechnerら, (2011) J Thrombosis and Haemostasis. 9(4):729-737］。本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドと比較して、凝固活性の増加のためのＦＶａ依存性の増強と半減期の増加を提示し、したがって、例えば、より低用量で、低頻度で、より少ない有害反応により投与することができる。修飾されたＦＸポリペプチドは、内在性酵素により活性化されるよう不活性チモーゲン型で、または活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。
Ｉ．併用療法
本明細書に記載されている修飾されたＦＸポリペプチドのいずれかは、限定されないが、他の生物製剤、小分子化合物および外科手術を包含する他の治療剤または手技と組み合わせて、それに先立ち、それと間欠的に、またはそれに引き続き投与することができる。ＦＸ（ＦＸａおよびｒＦＸａを包含）の適応があるかまたはそれが用いられたことがあり、他の薬剤および処置が利用できる、上に例証されているもの全てを包含するいずれかの疾患または状態のために、チモーゲンまたは活性化型のＦＸは、それらと組み合わせて用いることができる。したがって、チモーゲンまたは活性化型の本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは同様に用いることができる。処置する疾患または状態に応じて、例示的な組み合わせとして、ビタミンＫ、ビタミンＫ誘導体およびプロテインＣ阻害因子、血漿、血小板、赤血球細胞ならびに副腎皮質ステロイド等、他の精製された血漿または組換え凝固因子、凝血原との組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の例において、血液および新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）は、第Ｘ因子レベルの最小の上昇のための第Ｘ因子補充療法の供給源である［Girolamiら (1970) Thromb Diath Haemorrh 24(1):175-184; Girolamiら, (1970) Br J Haematol 19(2):179-192］。しかし、第Ｘ因子欠損症処置は、典型的に、ＦＩＩ、ＦＶＩＩおよびＦＩＸに加えて第Ｘ因子を含有するプロトロンビナーゼ複合体濃縮製剤（ＰＣＣ）による処置によって引き起こされる［Lechler, E (1999) Thromb Res 95(Suppl 1):S39-S50］。かかる濃縮製剤は、商業的に入手することができ、例えば、Ｋｏｎｙｎｅ ８０（Ｃｕｔｔｅｒ、ＵＳＡ）；Ｐｒｏｆｉｌｎｉｎｅ ＨＴ（Ａｌｐｈａ、ＵＳＡ）；Ｐｒｏｐｌｅｘ Ｔ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｙｌａｎｄ、ＵＳＡ；またはＢｅｂｕｌｉｎ ＶＨ（Ｉｍｍｕｎｏ、ＵＳＡ）が挙げられる。活性化ＦＸ（ＦＸａ）を含有する活性化（Acivated）ＰＣＣ、例えば、Ａｕｔｏｐｌｅｘ（Ｂａｘｔｅｒ、Ｈｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）およびＦＥＩＢＡ（Ｉｍｍｕｎｏ、ＵＳＡ）も入手できる。典型的には、止血は、１０〜２０ＩＵ／ｄＬの術後ＦＸレベルにより達成される［Knightら, (1985) Transfusion, 25(1):78-80; Bolton-Maggs, PHB. The rare coagulation disorders. Treatment of hemophilia. Manchester: World Federation of Hemophilia; 2006］。ＦＩＸおよびＦＸの濃縮製剤は、第Ｘ因子欠損症の処置にも用いられた。しかし、無修飾のＦＸポリペプチドを含有するＰＣＣ、活性化ＰＣＣおよび他の濃縮製剤を用いる場合、血栓塞栓性エピソードが懸念となる［Lechler (1999) Thromb Res. 95(Suppl. 1):S39-S50］。ＦＸ含有濃縮製剤の血栓塞栓性エピソードは、本明細書に記載されているもの等、修飾されたＦＸポリペプチドを用いることにより低下または排除することができる。
本明細書で提供される修飾されたＦＸポリペプチドは、無修飾のＦＸポリペプチドと比較して、凝固活性の増加のためのＦＶａ依存性の増強と半減期の増加を提示し、したがって、例えば、より低用量で、低頻度で、より少ない有害反応により投与することができる。修飾されたＦＸポリペプチドは、内在性酵素により活性化されるよう不活性チモーゲン型で、または活性化ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチドとして投与することができる。
Ｊ．製品およびキット
修飾されたＦＸポリペプチドもしくは修飾されたＦＸポリペプチドをコードする核酸またはこれらの誘導体もしくは生物学的活性部分の医薬品化合物は、包装材料と、止血性疾患または障害の処置に有効な医薬組成物と、修飾されたＦＸポリペプチドまたは核酸分子が、止血性疾患または障害の処置に用いられることを示すラベルとを含有する製品として包装することができる。
本明細書で提供される製品は、包装材料を含有する。医薬品産物の包装において用いるための包装材料は、当業者に周知のものである。例えば、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，３２３，９０７号および第５，０５２，５５８号を参照されたい。医薬品包装材料の例として、ブリスターパック、瓶、チューブ、吸入器、ポンプ、袋、バイアル、容器、シリンジ、瓶ならびに選択された製剤および企図される投与および処置様式に適したいずれかの包装材料が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で提供される化合物および組成物の多様な製剤は、いずれかの止血性疾患または障害のための種々の処置として企図される。
修飾されたＦＸポリペプチドおよび核酸分子は、キットとして提供することもできる。キットは、本明細書に記載されている医薬組成物と、投与のための品目とを包含することができる。例えば、修飾されたＦＸに、シリンジ、吸入器、投薬量カップ、ドロッパーまたはアプリケーター等、投与のための装置を供給することができる。キットは、投薬量、投薬レジメンを包含する適用のための説明書と、投与様式のための説明書とを包含してもよい。キットは、本明細書に記載されている医薬組成物と、診断のための品目を包含することもできる。例えば、かかるキットは、対象のＦＸまたはＦＸに調節される系の濃度、
Ｋ．実施例
以下の実施例は、説明の目的のみのために含まれ、本発明の範囲を限定するようには意図されない。
実施例１
第Ｘ因子ポリペプチドのクローニングおよび発現
Ａ．ｐＦＵＳＥベクターへの第Ｘ因子遺伝子のクローニング
４８８アミノ酸ヒト第Ｘ因子（ＦＸ）前駆体ポリペプチド（Ｐ００７４２；配列番号：１において記載）をコードする核酸を、伸長因子−１α（ＥＦ−１α）コアプロモーターならびにヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）１型長い末端反復のＲセグメントおよびＵ５配列の部分（Ｒ−Ｕ５’）を含む複合プロモーターｈＥＦ１−ＨＴＬＶを含有する哺乳動物発現ベクター、ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２（本明細書においてｐＦＵＳＥと略す）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；配列番号：２６６）にクローン化した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＣＦ Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を供給者によって指定された条件に従って用いた。
Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎプロセスのために、ヒト免疫グロブリン１（ｈＩｇＧ１）Ｆｃ部分を含まないプラスミドｐＦＵＳＥを、ｐＦＵＳＥ−Ａｃｃ−Ｆ１フォワードプライマー：ＧＴＧＣＴＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧ（配列番号：２６７）およびｐＦＵＳＥ−Ａｃｃ−Ｒ３リバースプライマー：ＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣ（配列番号：２６８）でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて直線化し、アクセプターＤＮＡとして用いた。ＦＸの全長コード配列を、ＦＸ−ｗｔｓｐ−Ｉｎｖｉｖｏ−Ｆ１フォワードプライマー：
（配列番号：２６９）
およびＦＸ−Ｉｎｖｉｖｏ−Ｒ１リバースプライマー：
（配列番号：２７０）
と共にヒトＦＸ ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を鋳型として用いてＰＣＲによって増幅した。上記の２つのＦＸドナー増幅プライマー配列に関して、フォワードおよびリバースプライマー配列それぞれにおけるＦＸ「ＡＴＧ」開始および「ＴＧＡ」終止コドンの相補配列の両方に下線をつけた。１８ｎｔ長相同性領域、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎのための非アニーリング５’プライマー末端を太字で示す。
標準的ＰＣＲ反応およびサーモサイクリング条件を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に製造者によって推奨されるとおり用いた。アクセプターおよびドナーＰＣＲ産物の両方を、次いでイー・コリ由来ｄａｍメチル化ＰＣＲ鋳型バックグラウンドを除去するためにＤｐｎＩ制限酵素で消化した。次いでそれらを混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応を供給者によって指定された条件を用いて実施した。
反応混合物をイー・コリＸＬ１ Ｂｌｕｅ ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。コロニーを２５ｐｐｍ Ｚｅｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を添加した２ｘＹＴアガープレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを選択されたクローンから単離し、正確なクローニングを検証するために配列決定した。正確な配列を含むクローンをさらなる試験について用いた。
Ｂ．プロトロンビンシグナルペプチドおよびプロペプチド配列を有するＦＸプラスミドの構築
ＦＸ天然シグナルペプチドおよびプロペプチド配列をプロトロンビン配列と交換するために、上記実施例１Ａにおいて産生されたプラスミドを、Ｆ１０−Ｐｒｏ−Ａｃｃ−Ｆ１フォワードプライマー：ＧＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＧＡＴＧ（配列番号：２７１）およびｐＦＵＳＥ−Ａｃｃ−Ｒ３リバースプライマー：ＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣ（配列番号：２７２）でのＰＣＲにより直線化し、アクセプターＤＮＡとして用いた。プロトロンビンシグナルペプチドおよびプロペプチド（配列番号：４１５のアミノ酸１−４３として記載されているもの、および配列番号：２７３として記載されているもの）のヌクレオチド配列を、ＦＩＩ−ＳＰ＋Ｐｒｏ−Ｆ１０Ａｃｃ−Ｆ１フォワードプライマー：
（配列番号：２７４）およびＦＩＩ−ＳＰ＋Ｐｒｏ−Ｆ１０Ａｃｃ−Ｒ１リバースプライマー：
（配列番号：２７５）と共にヒトプロトロンビンｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を鋳型として用いてＰＣＲによって増幅した。上に記載の２つのプロトロンビンドナー増幅プライマー配列に関して、１８ｎｔ長相同性領域、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎのための非アニーリング５’プライマー末端を太字で示し、プロトロンビン‘ＡＴＧ’開始コドンは、フォワードプライマー配列において下線をつける。標準的ＰＣＲ反応およびＩｎＦｕｓｉｏｎ反応を上記のとおりに行い、１つの配列と検証されたクローンを、ＦＸ変異体の産生のための鋳型としての使用のために選択した。
Ｃ．ＦＸ変異体の生成
ＦＸ変異体を、新たに合成されたＤＮＡに設計された突然変異を組み込むためのプライマーとして働く特異的に設計したオリゴヌクレオチドと共にＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の説明書に従って用いて生成した。望まれる突然変異を含む相補的プライマーを、クローン化ＦＸ ｃＤＮＡ配列を鋳型として含有する実施例１Ｂにおいて生成される精製した二重鎖スーパーコイルプラスミドＤＮＡを用いるサイクルにおいて伸長した。プライマーの伸長は、新たに合成される鎖への対象の突然変異の組み込みをもたらし、ねじれ型ニック（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｎｉｃｋｓ）を含む突然変異プラスミドを生じた。増幅に続いて、イー・コリ由来プラスミドＤＮＡのｄａｍメチル化親鎖を除去するために突然変異導入産物をＤｐｎＩ制限酵素で消化した。次いでＤＮＡをイー・コリＸＬ１ Ｂｌｕｅ ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、２５ｐｐｍ Ｚｅｏｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を添加した２ｘＹＴアガープレート上での選択が続いた。プラスミドＤＮＡを選択されたクローンから単離し、ＦＸ遺伝子上の望まれる位置での突然変異の組み込みを検証するために配列決定した。
ＦＸ変異体を生成するために用いた各相補的プライマー対由来のオリゴヌクレオチドの内の１つのヌクレオチド配列を以下の表１５に提供する。置換されたアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレット配列を大文字で示す。たとえば置換Ｉ１６Ｌ（キモトリプシンナンバリングによるＩ１６Ｌ；配列番号：４１６）を含有するＦＸ変異体を生成するために、ＦＸ−Ｉ１６ＬフォワードプライマーおよびＦＸ−Ｉ１６Ｌフォワードに相補的であるプライマーを、３−ｂｐ「ＡＴＣ」野生型配列を３−ｂｐ「ＣＴＧ」突然変異体配列で置き換えるために用いた。
下の表１５は、ＦＸ突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを記載する。突然変異体トリプレットを大文字で示し、プライマー名は、プライマーを用いた突然変異誘発の結果として産生された、キモトリプシンナンバリングによる、突然変異体に対応する。
表１５
下の表１６は、配列番号：１３４において記載される成熟ＦＸポリペプチドと比較したナンバリングを用いて示される、およびキモトリプシンナンバリングに基づく突然変異を有する生成されたＦＸ変異体を記載する。提供される配列番号は、列挙された突然変異体のコード前駆体ポリペプチドおよび成熟配列を指す。
実施例２
ＦＸポリペプチドの発現、精製および活性化
Ａ．ＦＸポリペプチドの発現および精製
野生型および変異体のＦＸポリペプチドをＣＨＯ発現（ＣＨＯＸ）細胞（Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎｅ）において発現した。ＣＨＯ発現（ＣＨＯＸ）細胞をＤＭ２０４Ｂ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において維持し、産生種培地に接種するために用いた。トランスフェクションをＷＡＶＥバイオリアクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において行った。４．６ＬのＤＭ２０４Ｂ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍを有するおよそ４００ｍＬの種培地で１．２ｘ１０６ｖｃ／ｍＬの播種密度で２０Ｌウェーブバッグに接種した。ＷＡＶＥバイオリアクターを３７．１℃で振動角６度および振動速度２４ｒｐｍに合わせ、細胞が３日後に１３−１６ｘ１０６ｖｃ／ｍＬの細胞密度に達するようにした。１６ｍｇのＦＸプラスミドＤＮＡおよび１０２．５ｍｇのＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を混合し、トランスフェクション複合体を形成し、５．０ＬのＴｆＭＡＸ２に希釈し、最初の播種の３日後にＷＡＶＥバイオリアクター上の培養物に加えた。トランスフェクション複合体およびＴｆＭＡＸ培地をウェーブバッグに加えた。培養物を４日間発現させ、粗ＦＸ溶解物を回収した。回収するために、ウェーブバッグの内容物を３時間、４℃で静置した。次に、培養上清をＣＵＮＯデプスフィルターによって回収し、次にＦＸを精製した。
機能性Ｇｌａドメインを有するＦＸポリペプチドが吸着し、カルシウム溶出工程が続くＱ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＦＸポリペプチドを精製した。典型的には、トランスフェクトした細胞由来の培養上清を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を含む溶液で２倍に希釈し、次に５００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０を１．５ｍＭの最終ＥＤＴＡ濃度に希釈されたサンプルに加えた。サンプルをろ過し、それらを緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ）で次に緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で最初に予め平衡化されたＱ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ カラム上に負荷した。サンプルのロードの完了後に、２８０ｎｍでのフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）の吸光度がベースラインに達するまで、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。緩衝液Ａを緩衝液Ｃ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）と置き換え、ポンプ洗浄を緩衝液を完全に置き換えるように一連において(in the lines)行った。ポンプ洗浄完了後に、緩衝液Ｃをカラムに適用し、ＦＸポリペプチドを溶離し、画分に回収した。溶出後に、桃色色素（培養培地からの）をカラムから洗い流すまで、画分を回収する間、カラムを緩衝液Ｂで洗浄した。カラムを、緩衝液Ａでの洗浄により、再使用のために再平衡化した。
溶出画分をＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してさらに精製した。ＦＸを含む上記緩衝液Ｃで回収された画分をプールし、ＥＤＴＡを２０ｍＭの最終濃度に加えた。次に、プールした画分を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で２倍に希釈し、緩衝液Ｄ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２）で予め平衡化したＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ カラムに負荷した。負荷されるカラムを緩衝液Ｄでの洗浄後、０．１５Ｍ ＮａＣｌから０．５Ｍ ＮａＣｌの勾配をカラムに適用し、画分を回収した。ＦＸを含有する画分をプールし、ＣａＣｌ２を１２．５ｍＭまで加えた。
Ｂ．ＦＸおよびＦＸ変異体の活性化
ＦＸチモーゲンから活性化ＦＸ（ＦＸａ）を産生するために、ビオチンであらかじめコンジュゲートされた１０．１μｇ／ｍＬのラッセルクサリヘビ蛇毒ＦＸ活性化因子（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、実施例２Ａにおいて作製されたプールした画分に加えた。活性化反応物を１．５時間３７℃でインキュベートし、次に２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０にて１：５希釈した。次に、混合物をＳｔｒｅｐＴｒａｐ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に付し、ラッセルクサリヘビ蛇毒ＦＸ活性化因子を取り出した。
最後に、不活性ＦＸを、ヘパリン ＨＰ クロマトグラフィーにより活性化ＦＸａから分離した。ＳｔｒｅｐＴｒａｐカラムからのカラムフロースルーを、緩衝液Ｅ（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）においてあらかじめ平衡化されたヘパリン ＨＰ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接付した。２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０中０．１から０．７Ｍ ＮａＣｌの線状勾配をカラムに適用し、画分を回収した。活性ＦＸａを含む画分をプールし、血液透析濾過(diafiltration)により緩衝液を５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、１００ｍＭ ＮａＣｌに交換した。
実施例３
貯蔵溶液中の触媒活性プロテアーゼ（ＦＸａ）濃度の決定
ＦＸａまたはＦＸａ変異体の貯蔵溶液中の第Ｘａ因子（ＦＸａ）の触媒活性濃度の決定を、トリプシン様セリンプロテアーゼのための活性部位滴定剤（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｔｉｔｒａｎｔ）として開発された蛍光発生エステル基質であるフルオレセイン−モノ−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＦＭＧＢ）での貯蔵プロテアーゼサンプルの滴定により行った。場合によっては、活性ＦＸａまたはＦＸａ変異体の濃度をまた、野生型ＦＸａに対してピコモルＫｉを有する大腸菌からのＦＸａの天然タイトバインディング可逆性阻害因子であるエコチン（Seymourら (1994) Biochemistry 33:3949-3958）での滴定により決定した。ＦＭＧＢ滴定が不可能であったＦＸａ変異体のサブセットについて、エコチン滴定は、以下に記載されるとおりに達成した。
Ａ．活性部位滴定剤フルオレセイン−モノ−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＦＭＧＢ）を用いるＦＸａの活性部位滴定
ＦＸａの貯蔵溶液中で触媒活性第Ｘ因子（ＦＸａ）の濃度を、蛍光発生エステル基質フルオレセイン−モノ−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＦＭＧＢ）を使用するＢｏｃｋら（Archives of Biochemistry and Biophysics (1989) 273:375-388）に記載されている滴定アッセイの修飾バーションにより決定した。ＦＭＧＢはＦＸまたは不活性プロテアーゼとではなく、ＦＸａと直ちに反応し、ＦＭＧＢ濃度が飽和しており、脱アシル化が特に遅く、触媒作用の律速である条件下で、事実上安定なアシル−酵素中間体を形成する。これらの条件下で、ＦＸａプロテアーゼは、一回の触媒代謝回転を受け、フルオレセインフルオロフォアを放出する。蛍光の最初のバーストをフルオレセイン蛍光の外部濃度標準曲線で較正すると、活性部位の濃度を算出できる。
Ｂｏｃｋらにより当初に記載されているアッセイへの修飾は、１）飽和量のＦＸａに対する補因子の包含、２）第Ｖａ因子（血漿精製ＦＶａ、Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および高濃度のリン脂質（７５％ ホスファチジルコリン（ＰＣ）／２５％ ホスファチジルセリン（ＰＳ）；ＰＣ／ＰＳ小胞直径〜１２０ｎｍ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の添加、および３）ＦＭＧＢの増加した濃度であった。
ＦＶａおよびＰＣ／ＰＳ小胞の非存在下で、立証された増加した補因子依存性を有するＦＸａ変異体は、ＦＭＧＢエステル基質とわずかに反応したか、または反応しなかった。したがって、これらの修飾は、高度の補因子依存性が引き起こされたＦＸａ変異体の完全な触媒活性をサポートするために必要とされた（実施例４Ａ参照）。
さらなる修正版を、反応容量を最小限にし、サンプルスループットを増加させるように９６−ウェルプレートフォーマットのためのアッセイを修正するように開発した（最大１８サンプル／１プレート）。活性部位滴定アッセイを、９６ウエルハーフエリア黒色プレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６９４）において最終５０μＬ反応容量で行った。現在の方法を、１０−１００μＭの範囲である貯蔵溶液でのＦＸａプロテアーゼ変異体の活性部位滴定のために最適化した。この範囲外と推定された濃度を有するプロテアーゼ貯蔵物について、濃縮または最初の希釈工程を必要とした。最終反応物は、１μＭ ＦＶａおよび２４０μＭ ＰＣ／ＰＳリン脂質を含む１×緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２および０．１％ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中、〜３００−６５０ｎＭのそれぞれのＦＸａ変異体および１０、５０または７５μＭ ＦＭＧＢを含んだ。ＦＭＧＢの希釈標準(working)溶液を、乾燥重量に基づいてＤＭＦ中５ｍＭ ＦＭＧＢの貯蔵濃度から緩衝液Ａにおいて２×濃度（２０−１５０μＭ）で調製し、濃度をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２における吸光係数１９，４９８Ｍ−１ｃｍ−１を用いる４５２ｎｍでの吸光分光法によって確認した。
活性部位滴定アッセイを以下のとおり調製した。ＦＸａ変異体を、２×ＦＶａおよびＰＣ／ＰＳ小胞（それぞれ２μＭおよび４８０μＭ）を含む１×緩衝液Ａにおいて０．６−１．３μＭに希釈し、２５μＬの容量を９６ウエルハーフエリア黒色アッセイプレートのデュプリケートウェルにアリコートした。反応を、１×緩衝液Ａ中の２５μＬの２×希釈標準溶液のＦＭＧＢ（２０−１５０μＭ）の添加により開始した。４８５ｎｍの励起および５３５ｎｍの発光のＥｎｖｉｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、反応のバースト相におけるフルオレセイン蛍光の放出を、３０秒毎１８０分間測定した。
活性ＦＸａによるＦＭＧＢの触媒作用に続いて放出されるフルオレセインの化学量論量を、１μＭ ＦＶａおよび２４０μＭ ＰＣ／ＰＳリン脂質を含む１×緩衝液Ａ中の遊離フルオレセインの標準曲線を用いて決定した。フルオレセイン標準溶液は、０．１Ｎ ＮａＯＨにおける吸光係数８９，１２５Ｍ−１ｃｍ−１を用いる４９６ｎｍでの標準条件下での吸光分光法によって確認されるＦＭＧＢの正確な濃度で、ＤＭＦ中〜７０−１５０ｍＭの貯蔵溶液から新たに調製した。次に、遊離フルオレセインの標準曲線を、０から２．５μＭ ＦＭＧＢの範囲を有する１μＭ ＦＶａおよび２４０μＭ ＰＣ／ＰＳリン脂質を含む１×緩衝液Ａへの標準の連続希釈により作成した。
データ分析のために、反応トレースを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）から．ＴＸＴファイルとして出力し、後の非線状データ分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ表計算ソフト環境内の自動曲線適合（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｕｒｖｅ ｆｉｔｔｉｎｇ）および統計分析のためのソフトウェアパッケージであるＸＬｆｉｔ４で行った（ＩＤＢＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。バックグラウンドＦＭＧＢ加水分解の寄与を決定し、ＦＸａが加えられていないコントロールウェルのセットを使用して、実験反応トレースから減算した。一般的に、バックグラウンドＦＭＧＢ加水分解は、観察される総蛍光バーストの５％未満であった。補正曲線を、Δ蛍光＝Ｙ０＋Ａｍｐ＊（１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓ＊（Ｘ−Ｘ０）））＋ｓｌｏｐｅ＊（Ｘ−Ｘ０）［式中、パラメーターＸおよびＸ０＝完了の時間および反応開始の時間、Ｙ０＝アッセイ系におけるバックグラウンド蛍光を構成する補正値（ｏｆｆｓｅｔ）、Ａｍｐ＝上に概説した飽和アッセイ条件下でのバースト相の振幅、ｋｏｂｓはアシル酵素形成に関して観察された一次速度定数であり、ｓｌｏｐｅはプロテアーゼによるＦＭＧＢの完全代謝回転に関するバルク速度定数（ｂｕｌｋ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）である］の形の線形成分（脱アシル化の低速を表すため）を有する単一指数方程式（ｓｉｎｇｌｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｑｕａｔｉｏｎ）にフィットさせた。反応物中の活性ＦＸａプロテアーゼの濃度を、振幅（Ａｍｐ）に関するフィットパラメーターのフルオレセイン標準曲線との比較によって算出した。デュプリケートアッセイからの値を平均し、標準偏差を決定した。次に、貯蔵調製物中の活性ＦＸａの濃度を、算出されたアッセイ濃度から決定し、アッセイにおいて使用された希釈の程度で調整した。
Ｂ．タイトバインディング阻害因子を使用するＦＸａの活性部位滴定
ＦＭＧＢ滴定が不可能であったとき、ＦＸａの貯蔵溶液中の触媒活性第Ｘａ因子またはＦＸａ変異体の濃度を、大腸菌由来のＦＸａのタイトバインディング可逆性阻害因子である既知の量のエコチンでの滴定により決定した。
市販されている調製物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．）中の活性エコチンの濃度を、市販の大腸菌エコチン調製物と既知の濃度の組換えヒトトリプシン（ｒｈ−トリプシン、Ｐｏｌｙｍｕｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を滴定することによって決定した。１００ｎＭ 活性部位滴定ｒｈ−トリプシンの最終濃度および０−２００ｎＭエコチンの段階量(stepped dose)を使用して、滴定を２．０ｍＬ容量の１×緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ＰＥＧ ８０００）中で行った。９６ウエルディープウエルポリプロピレンプレート中で室温で６０分インキュベーション後、２．０ｍＬをきれいな石英キュベット（１０ｍｍｘ１０ｍｍ）に移した。ＦＭＧＢを最終濃度５μＭ（５．３ｍＭ貯蔵から１．９μＬ／２．０ｍＬ）に加え、残存活性ｒｈ−トリプシンをＦＭＧＢバーストから決定した。データを、エコチンのそれぞれの量に対するバーストプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）の５０秒にわたって積分し、ΔＦｏｂｓ／ΔＦｍａｘ［式中、ΔＦｍａｘは阻害因子の非存在下でのｒｈ−トリプシンバーストの全振幅であり、ΔＦｏｂｓは阻害因子の存在下でのバーストの振幅である］に変換した。その後、活性阻害因子の希釈標準濃度を、完全阻害で外挿されるＸ−ｉｎｔｅｒｃｅｐｔおよび反応物中の活性ｒｈ−トリプシンの既知の量から決定した。
エコチン活性部位滴定反応を、０．１％ ＢＳＡを補った１×緩衝液Ｂ中、２×濃度（４００ｎＭ−０ｎＭ）でのエコチンの１．３３倍希釈シリーズ（５０μｌへの１５０μＬ）を調製することにより行った。ＦＸａまたはＦＸａ変異体プロテアーゼサンプルを２×希釈標準濃度（４００ｎＭ）に希釈し、５０μＬを９６ウエルポリプロピレンアッセイプレートのデュプリケートウェルにアリコートした。反応を、１００μＬ（５０μＬ＋５０μＬ）の反応容量において２００ｎＭ−０ｎＭの範囲のエコチンの最終濃度に５０μＬの２×エコチン １２点希釈シリーズを加えることにより開始した。
阻害反応は室温（〜２５℃）で１２０分間インキュベートし、蛍光発生基質、Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ Ｘａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、Ｃｅｎｔｅｒｃｈｅｍ）でＦＸａまたはＦＸａ変異体の残存活性を読み出した。ペプチド基質に対して高い活性を有する野生型ＦＸａおよびＦＸａ変異体を、許容される範囲内の反応速度を成し遂げるように、０．１％ ＢＳＡ緩衝液を補った１×緩衝液Ｂにて最終７５μＬ容量に１０から１００倍希釈した。ペプチド基質に対する乏しい活性を有するＦＸａ変異体を、不希釈で試験した。７５μＬの希釈または不希釈サンプルを、９６ウエル黒色アッセイプレートに移し、次に、２５μＬの０．４ｍＭ（０．１ｍＭ最終）Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ Ｘａを加えた。次に、反応の初期速度を２５℃で１５−６０分間測定した。希釈変化による解離は速度測定中に無視できると仮定した。したがって、インキュベーション濃度は以下のデータ分析における阻害因子およびプロテアーゼについて使用される最終濃度であった。
阻害因子の非存在下での反応速度（Ｖ０）に対する阻害因子の存在下での反応速度（Ｖｉ）の比率を、プロテアーゼの固定の濃度で阻害因子（エコチン）のそれぞれの濃度について決定した。Ｖｉ／Ｖ０比率をプロットし、得られる滴定曲線を、Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において方程式（１）の表現により評価した。分析は、ｎ＝１の阻害因子／プロテアーゼ化学量論と仮定して行った。
方程式（１）：
Ｖｉ／Ｖ０＝Ｙ−Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ＋ｓｌｏｐｅ＊［エコチン］
次に、方程式（１）から外挿されるＸ−Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔに関するフィット値を、方程式（２）を使用して、全濃度のプロテアーゼが知られており、エコチンが用量応答曲線を作成するために使用される濃度で活性であったと仮定して、貯蔵ＦＸａ溶液の活性部位滴定（ＡＳＴ）濃度および「画分活性」値を決定するために使用した。エコチン濃度増加に対する活性の線形損失（０％−９０％）により定義された値のみを評価した。
方程式（２）：
（［Ｘ−Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ］ｆｉｔ−値／［ＦＸａ］アッセイ）＊［ＦＸａ］全タンパク質＝［ＦＸａ］エコチン−ＡＳＴ
実施例４
基質、プロトロンビン（ＦＩＩ）に対するＦＸａの触媒活性の決定
基質、プロトロンビン（ＦＩＩ）に対するＦＸａおよびＦＸａ変異体の触媒活性を、血漿精製ＦＶａおよびリン脂質の存在（補因子依存性）および非存在（補因子非依存性）の両方において評価した。それぞれの触媒活性を、合成基質Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ（Ｈ−Ｄ−ＣＨＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ；Ｃｅｎｔｅｒｃｈｅｍ）のトロンビン（ＦＩＩａ）介在切断によって産生される蛍光を、トロンビン（ＦＩＩａ）を産生するプロトロンビン（ＦＩＩ）のＦＸａ切断を評価するために使用した蛍光発生アッセイを間接的に使用して評価した。
基質プロテアーゼ（プロトロンビン）が補因子依存性アッセイにおいて活性化プロテアーゼ（ＦＸａ）の濃度より少なくとも１０００倍および変異体活性に依存する補因子非依存性アッセイにおいて活性化プロテアーゼ（ＦＸａ）の濃度より少なくとも１０から１０００倍を超えて過剰であった場合の動力学的速度定数を算出するために様々なプロトロンビン濃度を用いた。簡潔には、以下のアッセイは、室温（２５℃）で３０−６０分にわたって測定される動力学的アッセイにおいて、基質、Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨに対するトロンビンの活性を直接的に観察することによりプロトロンビナーゼ触媒プロトロンビン活性化の動力学基準を提供する。ＦＸａ／プロトロンビナーゼ機能（ｋｃａｔおよびＫＭ）の動力学的速度定数の決定のために、実験は、固定された飽和量の第Ｖａ因子（２０ｎＭ）の存在下または非存在下で限定量の第Ｘａ因子、およびプロトロンビンの濃度の増加（０から８μＭ）でＰＣ／ＰＳ含有リン脂質小胞（２０μＭ）で行った。次に、トロンビンによるＰｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨの触媒作用に続く遊離フルオロフォア、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）の放出を反応の経過にわたって連続的に評価し、ＦＸａ変異体の動力学的速度定数を決定した。
Ａ．ＦＶａ依存性アッセイプロトコール
ＦＶａ（血漿精製された、Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）およびリン脂質（７５％ホスファチジルコリン（ＰＣ）／２５％ホスファチジルセリン（ＰＳ）；ＰＣ／ＰＳ小胞直径〜１２０ｎｍ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の存在下でＦＸａによるプロトロンビン（ＦＩＩ）活性化の動力学的速度を評価するアッセイのために、ＦＸａ変異体を上記実施例１−３において記載したとおり発現し、精製し、活性化し、および活性部位滴定した。次に、ＦＸａ変異体を、２×濃度のＦＶａ（４０ｎＭ）およびＰＣ／ＰＳ小胞（４０μＭ）を含有する２ｍＬ容量の１×緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＣａＣｌ２／０．１％ ＢＳＡ／０．１％ ＰＥＧ−８０００、ｐＨ７．４）にて０．２ｐＭの２×濃度に連続希釈した。
ＤＦＰ／ＦＰＲ−ｃｍｋ処理したプロトロンビン（ＦＩＩ）の５μＭ溶液を０．１ｍＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ基質を含有する１×緩衝液Ａ ２．０ｍＬ中に調製した。これは、試験されたプロトロンビンの最高濃度を表し、３つのアッセイプレートの十分な容量を提供した。次に、プロトロンビン／Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ溶液を０．１ｍＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨを含有する１×緩衝液Ａ 最終容量７００μＬで１２チャネルディープウエルポリプロピレンプレート中に１．８倍系列希釈し、５０００ｎＭ、２７７８ｎＭ、１５４３ｎＭ、８５７ｎＭ、４７６ｎＭ、２６５ｎＭ、１４７ｎＭ、８２ ｎＭ、４５ｎＭ、２５ｎＭ、１４ｎＭおよび０ｎＭ プロトロンビンの最終希釈物を得た。各プロトロンビン希釈シリーズ合計２５μＬを、最大３つの９６ウエルハーフエリア黒色アッセイプレートに分注した。典型的にはアッセイ反応は、予め定義したプレートマップ（ＦＸａ変異体４種／プレート）によって、プロトロンビナーゼ溶液（ＦＸａ／ＦＶａ／リン脂質／Ｃａ２＋）２５μＬを、プロトロンビン希釈物シリーズ２５μＬを含む３つのアッセイプレートに分配するように、ＢｉｏＭｅｋ ＦＸ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍまたは１２チャネルマイクロピペットを用いて開始した。
アッセイにおける試薬の最終濃度は、次のとおりであった：０．１ｐＭ ＦＸａ、２０ｎＭ ＦＶａ、２０μＭ ＰＣ／ＰＳ小胞、５０μＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ、および０ｎＭから２５００ｎＭのプロトロンビン（ＦＩＩ）希釈物。反応をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒにおいて３０分間、２５℃でモニターした。遊離ＡＭＣの標準曲線を０μＭから１００μＭ ＡＭＣに及ぶ用量範囲を用いるデータ分析計算においてＲＦＵからμＭへの変換係数として利用した。
Ｂ．ＦＶａ非依存性アッセイプロトコール
ＦＶａの非存在下であるが、リン脂質（７５％ホスファチジルコリン（ＰＣ）／２５％ホスファチジルセリン（ＰＳ）；ＰＣ／ＰＳ小胞直径〜１２０ｎｍ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）の存在下でＦＸａによるプロトロンビン（ＦＩＩ）活性化の動力学的速度を評価するアッセイのために、ＦＸａ変異体を上記実施例１−３において記載したとおり発現し、精製し、活性化し、および活性部位滴定した。次に、ＦＸａ変異体を、２×濃度のＰＣ／ＰＳ小胞（４０μＭ）を含有する２ｍＬ容量の１×緩衝液Ａにて２×濃度の２０ｐＭ（野生型）または１ｎＭ−４ｎＭ（ＦＸａ変異体について）に連続希釈した。ＤＦＰ／ＦＰＲ−ｃｍｋ処理したプロトロンビン（ＦＩＩ）の８μＭ溶液を０．１ｍＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ基質を含有する１×緩衝液Ａ ２．０ｍＬ中に調製した。これは、試験されたプロトロンビンの最高濃度を表し、最大３つのアッセイプレートの十分な容量を提供した。次に、プロトロンビン／Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ溶液を０．１ｍＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨを含有する１×緩衝液Ａ 最終容量７００μＬで１２チャネルディープウエルポリプロピレンプレート中に１．８倍系列希釈し、８０００ｎＭ、４４４４ｎＭ、２４６９ｎＭ、１３７２ｎＭ、７６２ｎＭ、４２３ｎＭ、２３５ｎＭ、１３１ｎＭ、７３ｎＭ、４０ｎＭ、２２ｎＭおよび０ｎＭ プロトロンビンの最終希釈物を得た。各プロトロンビン希釈シリーズ合計２５μＬを、最大３つの９６ウエルハーフエリア黒色アッセイプレートに分注した。典型的にはアッセイ反応は、予め定義したプレートマップ（ＦＸａ変異体４種／プレート）によって、ＦＶａ非依存性プロトロンビナーゼ溶液（ＦＸａ／リン脂質／Ｃａ２＋）２５μＬを、プロトロンビン希釈物シリーズ２５μＬを含む３つのアッセイプレートに分配するように、ＢｉｏＭｅｋ ＦＸ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍまたは１２チャネルマイクロピペットを用いて開始した。
アッセイにおける試薬の最終濃度は、次のとおりであった：１０ｐＭ ＦＸａまたは０．５−２ｎＭ ＦＸａ変異体、２０μＭ ＰＣ／ＰＳ小胞、５０μＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ、および０ｎＭから４０００ｎＭのプロトロンビン（ＦＩＩ）希釈物。反応をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒにおいて３０分間、２５℃でモニターした。遊離ＡＭＣの標準曲線を０μＭから１００μＭ ＡＭＣに及ぶ用量範囲を用いるデータ分析計算においてＲＦＵからμＭへの変換係数として利用した。
Ｃ．データ分析
ＦＸａによるプロトロンビン（ＦＩＩ）の触媒作用の定常状態動力学を決定するために用いる全ての方程式は、参考文献Petersenら(1985)Biochem.J.225:149-158の“Zymogen-Activation Kinetics:Modulatory effects of trans-4-(aminomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid and poly-D-lysine on plasminogen activation”に記載されたものに基づく。以下のスキームＡに記載した系の定常状態動力学に関する理論は、産物の放物型蓄積（ｐａｒａｂｏｌｉｃ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）を表す方程式（３）の表現によって記載される。
方程式（３）
スキームＡの機序により、ａ０は活性化プロテアーゼ（ＦＸａ）の濃度であり、ｚ０はチモーゲン（ＦＩＩ）の濃度であり、ＫａおよびＫｚはチモーゲンの活性酵素（ＦＩＩａ）への活性化因子触媒転換に関するＫｃａｔおよびＫＭを示し、ＫｅおよびＫＳは所与の時間ｔにわたるＦＩＩａによる基質から産物への転換に関するＫｃａｔおよびＫＭを示す。
プログレス曲線の分析のために、方程式（３）を、蛍光発生基質のプロトロンビン加水分解の定常状態動力学を非依存的に決定し、化合物定数Ｋ２に置き換えた方程式（４）の形に再計算した。
方程式（４）
１×緩衝液Ａ中のＰｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨでのトロンビン（ＦＩＩａ）活性が５．７μＭのＫＭおよび４０．４ｓ−１のＫｃａｔ値を有すると非依存的に決定した。これらの値の方程式（５）への代入は、３６．３ｓ−１のＫ２補正係数を与えた。
方程式（５）
ＦＸａ触媒活性の程度を決定するために、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で集めた生データを、．ＴＸＴファイルとして出力した。さらなる非線形データ分析を、ＸＥ Ｒｕｎｎｅｒ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｏｄｕｌｅ（ＩＤＢＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ内で直接実施した。集計表テンプレートを、各プロトロンビン濃度で検査したＦＸａ変異体の放物型反応速度（ｐａｒａｂｏｌｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ）（μＭ／秒２）を方程式（６）に示す標準直角双曲線の関数（すなわちミカエリスメンテン方程式）に自動的にフィットするように設定し、ＶｍａｘおよびＫＭについてのフィット値を得た。
方程式（６）
次に、検査したＦＸａ変異体についてのＫｃａｔ値を方程式（７）によるＶｍａｘ（μＭ／秒２）に対するフィット値から算出した。
方程式（７）
特異的定数Ｋｃａｔ／ＫＭをＫＭのフィット値および（上の方程式（７）の計算から生じる）算出されたＫｃａｔから直接算出した。
Ｄ．結果
以下の表１７−１８は、ＦＸａ補因子（ＦＶａ）の存在下および非存在下でのアッセイしたＦＸａ変異体それぞれについての、表１９に記載されている触媒活性を計算するために使用される動力学的パラメーターを記載する。各ＦＸａ突然変異体、ならびに組換え野生型ＦＸａ（ＦＸａ ＷＴと称される）および血漿精製ＦＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ）についての、ミカエリスメンテン定数ＫＭのフィット値、および計算される触媒速度定数ｋｃａｔを、以下の表１７および１８においてそれぞれ提供する。表１７および１８はまた、ＫＭおよびｋｃａｔ動力学的パラメーターについて標準偏差（Ｓ．Ｄ．）、変動係数（百分率として；％ＣＶ）および実施アッセイ数（ｎ）も提供する。各動力学的パラメーターをＦＸａ補因子ＦＶａの存在下および非存在下でＦＸａ突然変異体について決定した。
表１８に記載されているＦＸａポリペプチドに対する計算されたｋｃａｔ値を、表１７に記載されているＫＭのフィット値により割り、触媒活性についての動力学的定数ｋｃａｔ／ＫＭ（Ｍ−１ｓ−１）を出した。ＦＸａ突然変異体の触媒活性を、触媒活性定数として、および野生型ＦＸａの活性の百分率として表１９に記載されている。相対的補因子依存性も表１９において示される（最後のカラム）。ここで、補因子依存性は、ＦＶａの存在下での触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）（ＦＶａ依存性触媒活性）をＦＶａの非存在下での触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）（ＦＶａ非依存性触媒活性）で割った比率として定義される。
ＦＸａ変異体の活性を野生型ＦＸａと比較する場合（ＷＴ ｋｃａｔ／ＫＭの％）、活性におけるいかなる差異も突然変異の結果であり、たとえば異なる発現系に関連する翻訳後修飾における差異の結果ではないことを確実にするために変異体ＦＸａポリペプチドについて用いたのと同じ条件を用いて発現および精製した組換え野生型ＦＸａポリペプチド（ＦＸａ ＷＴ）と比較した。したがって、比較に用いた野生型ＦＸａポリペプチドは、配列が配列番号１において記載されるＦＸ遺伝子のクローニングから生成され、ＣＨＯ細胞からアミノ酸配列が配列番号：１３４のアミノ酸１−１３９および１９５−４４８として記載されているポリペプチドとして発現された実施例２において記載される組換え野生型ＦＸａであった。
ＦＸａ変異体の観察された触媒活性（表１９におけるｋｃａｔ／ＫＭ）は、いくつかの変異体（たとえば、ＦＸａ−Ｇ１９７Ｐ、ＦＸａ−Ｇ１９８Ａ、ＦＸａ−Ｄ３７８ＮおよびＦＸａ−Ｉ１９５Ｌ／Ｖ１９６Ｓ）での検出不可能なプロトロンビナーゼ活性から、野生型ＦＸａ（たとえば、ＦＸａ−Ｌ６５Ｎ／Ｅ６７Ｓ／Ｖ１９６Ｓ、ＦＸａ−Ｒ２３６Ｖ、ＦＸａ−Ｖ１９６ＳおよびＦＸａ−Ｌ２１１Ｓ／Ｇ２１９Ｈ）と比較してプロトロンビン（ＦＩＩ）の活性化についてのＫｃａｔ／ＫＭにおけるわずかな増加までの範囲であった。いくつかの変異体は、野生型ＦＸａと比較して著しく増加した補因子依存性を示した（ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ、ＦＸａ−Ｋ３３８Ｓ、ＦＸａ−Ｉ１９５Ｌ、ＦＸａ−Ｇ１９７Ｓ、およびそれらの組合せ、たとえば、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｋ３３８Ｓ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ３２６Ｍ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ３２６Ｎ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｋ２７６ＥおよびＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ３３２Ｇ）。観察される改善された補因子依存性は、主にＦＶａの非存在下でＦＸａ変異体の活性における減少によるものであったが、しかしながら、いくつかの変異体はＦＶａ依存アッセイにおいて３から５倍低いＫＭ値により証明される補因子の非存在下でより低い基質親和性を示した（表１７）。
単一のまたは複数の追加的グリコシル化部位を提供するように変異されたいくつかのＦＸａ変異体は、ほぼ野生型活性（たとえば、ＦＸａ−Ｅ８２Ｎ／Ｆ８４Ｓ／Ｖ１９６Ｓ、ＦＸａ−Ｇ１１４Ｎ／Ｖ１９６Ｓ／Ｅ２６４Ｎ／Ｅ２６６Ｓ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｅ２６４Ｎ／Ｅ２６６Ｓ／Ｋ３８８ＮおよびＦＸａ−Ｇ１１４Ｎ／Ｖ１９６Ｓ／Ｌ２１１Ｓ／Ｇ２１９Ｈ）を示したが、他は低下した触媒活性を示した。
実施例５
アンチトロンビン／ヘパリン複合体によるＦＸａの阻害の決定
アンチトロンビン／ヘパリン複合体（ＡＴ／ヘパリン）による野生型ＦＸａまたはＦＸａ変異体の阻害を、小分子基質、ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＦＸａ；Ｃｅｎｔｅｒｃｈｅｍ）に対するＦＸａの触媒活性についてのＡＴ／へパリンによる阻害のレベルを測定することによって評価した。予め定義されたアッセイ条件下でＦＸａ変異体の触媒活性の５０％阻害（ＩＣ５０）のために必要であったＡＴのモル濃度に相当するＫ０．５値を、検査した各ＦＸａ変異体について決定した。阻害反応を、より長いヘパリン鎖により提供される「鋳型（templating）」効果によって阻害反応の速度を増加する全長未分画ヘパリン（ＵＦＨ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の存在下で実施した（たとえば、Olsonら (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939参照）。ＡＴ／ＵＦＨ複合体による野生型ＦＸａまたはＦＸａ変異体の阻害についての見かけの二次速度定数（Ｋａｐｐ）も修飾したプロトコール（ＡＴ／ＵＦＨ複合体とのインキュベーション時間を変更した）を用いて直接評価した。
Ａ．アンチトロンビン／ＵＦＨ複合体によるＦＸａの阻害
ＵＦＨ存在下での阻害反応のために、１×緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＰＥＧ ８０００、ｐＨ７．４）１．０ｍＬ容量中の過剰ＵＦＨ（２μＭ）の溶液中への血漿精製ヒトＡＴ−ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）の２０μＭ貯蔵物の希釈によって、２０００ｎＭ、１０００ｎＭ、２００ｎＭまたは１００ｎＭ ＡＴ／ＵＦＨの２ｘ溶液（最終２μＭ ＵＦＨ）を調製した。ＡＴ／ＵＦＨ溶液を１５分間、室温でインキュベートし、次に、２μＭ ＵＦＨを含有する１×緩衝液Ａの容量５００μＬで９６ディープウエルポリプロピレンプレート中に２倍連続希釈した。ＡＴの最終希釈物はＡＴの出発濃度に依存し、２０００−０ｎＭ、１０００−０ｎＭ、２００−０ｎＭまたは１００−０ｎＭ（すなわち列Ａ−Ｈ）の範囲であった。標準条件下でＡＴ阻害に対する増加した耐性を示した変異体を、より高い濃度のＡＴを使用してさらに試験した。各ＡＴ希釈物３５μＬのアリコートを、９６ウエルＶ底保存プレートのそれらそれぞれの列に分注し、全てのカラム（すなわち１−１２）を満たした。ＦＸａ変異体を最初に１×緩衝液Ａ中に１００ｎＭへ希釈した。次に、各１００ｎＭ ＦＸａ変異体５０μＬを１×緩衝液Ａ ２．５ｍＬ中、２．０ｎＭの濃度へ希釈し、次に、同じ予め定義したプレートマップ（プレート１枚当たりＦＸａ変異体４種）に従ってこの溶液７０μＬを９６ウエルＶ底保存プレートに分注した。
アッセイ反応は、各ＦＸａ変異体に対して計２枚の重複アッセイプレートにおいて１ウェル当たりＡＴ／ＵＦＨの各希釈物３５μＬを含有するプレートにＦＸａ溶液３５μＬを分配するようにプログラムしたＢｉｏＭｅｋ ＦＸ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを用いて開始した。最終阻害アッセイ条件は、１．０ｎＭ ＦＸａ、および、１μＭ ＵＦＨ中の３５ｎＭから０ｎＭ、５０ｎＭから０ｎＭ、１００ｎＭから０ｎＭ、５００ｎＭから０ｎＭまたは１０００ｎＭから０ｎＭのＡＴの範囲のＡＴ／ＵＦＨ希釈物であった。
阻害反応物を３０秒間、室温（〜２５℃）でさらにインキュベートし、反応物４０μＬアリコートを、１５ｍｇ／ｍＬポリブレンを補ったアッセイ緩衝液Ａ中に０．３ｍＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ Ｘａを２０μＬ含有する９６ウェル黒色ハーフエリアプレートにＢｉｏＭｅｋ ＦＸを移した。ＡＴ／ＵＦＨ反応をクエンチするために、最終濃度５ｍｇ／ｍＬのポリブレン（ヘキサジメトリンブロミド）を反応物に加えた。ＦＸａの残存活性を、２５℃に設定した蛍光プレート読み取り装置において基質切断の初速度を６０分間追跡することによって評価した。残存活性の決定のための最終アッセイ条件は、緩衝液Ａ中の２．０ｎＭ ＦＸａ変異体、０．１ｍＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＦＸおよび５ｍｇ／ｍＬ ポリブレンであった。
ＡＴ／ＵＦＨによるＦＸａまたはＦＸａ変異体に対する阻害の程度を決定するために、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で集めた生データを．ＴＸＴファイルとして出力した。さらなる非線形データ分析を、ＸＥ Ｒｕｎｎｅｒ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｏｄｕｌｅ（ＩＤＢＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅで直接実施した。テンプレートを、各実験ＡＴ濃度で各ＦＸａ反復についてのＡＴ希釈系列、ＡＴのＦＸａに対する比およびＶｉ／Ｖ０比を算出するために用いた。残存ＦＸａ活性（Ｖｉ／Ｖ０として表す）対ＡＴ濃度の非線形回帰分析を、［Ｃ＋（Ａｍｐ＊（１−（Ｘ／（Ｋ０．５＋Ｘ））））］；式中、Ｃ＝オフセット（アッセイの経過において１００％阻害に達しなかったデータセットの外挿を可能にするために０に固定）、Ａｍｐ＝フィットおよびＫ０．５の振幅（アッセイ条件下で最大半量の阻害のために必要なＡＴの濃度に相当する）、の形の双曲線阻害方程式を用いて処理した。
いくつかのＦＸａ変異体について、ＡＴ／ＵＦＨはＡＴの検査した最高濃度で総プロテアーゼ活性の１０〜１５％未満を阻害し、標準スクリーニング条件下でのアッセイについて検出の上限を表している。したがって１０％未満の最大阻害を有する変異体は、１００００ｎＭの下限Ｋ０．５値に帰され、ほとんどの場合は報告された値より大きなＡＴ抵抗性を有すると予測される。
表２０は、ＡＴ／ＵＦＨを用いて実施したアッセイの結果を提供する。結果は、フィトされたＫ０．５パラメーターとしておよび、野生型ＦＸａと比較した各変異体についてのＡＴ−ＩＩＩ抵抗性の程度をフィットされたＫ０．５値の比（Ｋ０．５変異体／Ｋ０．５野生型）として表す表現として表す。比較に用いた野生型ＦＸａポリペプチドは、実施例１−２において調製された組換え野生型ＦＸａであった。
いくつかのＦＸａ変異体は、野生型ＦＸａ（ＦＸａ ＷＴ）と比較して５００倍を超えて増加したＡＴに対する抵抗性を示した。たとえばＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｋ２７６Ｅ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ３３２Ｇ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ３３２Ｄ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ３２６Ｄ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｋ３３８Ｓ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｋ４２０ＡおよびＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ４２４Ｅは、ＡＴ−ＩＩＩに顕著な抵抗性を示す群に含まれる。
＊ １００００ｎＭのＫ０．５値は、アッセイ条件下で１０％未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。
Ｂ．アンチトロンビン／ＵＦＨ複合体によるＦＸａの阻害に対する二次速度定数（ｋａｐｐ）の決定
ＡＴ／ＵＦＨによるＦＸａ変異体の阻害に対する二次速度定数（ｋａｐｐ）を、実施例５Ａに記載したのと同じアッセイを若干の変更を伴って用いて決定した。使用される方法は、競合速度論的または不連続的方法よりも、同時に複数の変異体に対する二次速度定数を評価するためにさらに変更することができる（たとえば、Olsonら (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939参照）。
ＵＦＨの存在下での阻害反応のために、ＡＴ／ＵＦＨの１０００ｎＭ溶液を、１×緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＰＥＧ ８０００、ｐＨ７．４）１．０ｍＬ容量の中の過剰量ＵＦＨ（２μＭ）溶液中への血漿精製ヒトＡＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）２０μＭ保存物の希釈によって調製した。ＡＴ／ＵＦＨ溶液を、１５分間、室温でインキュベートし、２μＭ ＵＦＨを含有する１×緩衝液Ａの最終容量５００μＬで９６ディープウエルポリプロピレンプレートのカラムにおいて２．０倍系列希釈した。変更したｋａｐｐアッセイのためのＡＴ−ＩＩＩの最終希釈は、５００ｎＭ−０ｎＭ（すなわち列Ａ−Ｈ）の範囲であった。各ＡＴ−ＩＩＩ希釈物の合計３５μＬを９６ウエルＶ底保存プレートのそれらそれぞれの列に全てのカラムを満たすように（すなわち１〜１２）分注した。ＦＸａ変異体を１×緩衝液Ａ中に１００ｎＭに最初に希釈した。次に、各１００ｎＭ ＦＸａ変異体の５０μＬを１×緩衝液Ａ ２．５ｍＬ中で濃度２．０ｎＭへ希釈し、次に、上記と同じ予め定義したプレートマップ（プレート１枚当たりＦＸａ変異体４種）に従ってこの溶液の７０μＬアリコートを９６ウエルＶ底保存プレートに分注した。
アッセイ反応は、各ＦＸａ変異体に対して計２枚の重複アッセイプレートにおいて１ウエル当たりＡＴ／ＵＦＨの各希釈物３５μＬを含有するプレートにＦＸａ溶液３５μＬを分配するようにプログラムしたＢｉｏＭｅｋ ＦＸ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを用いて開始した。最終阻害アッセイ条件は、１．０ｎＭ ＦＸａおよび１μＭ ＵＦＨ中に５００ｎＭから０ｎＭの範囲のＡＴ希釈物であり、ヘパリンは過剰のままであった。阻害反応物をさらに、予測される阻害速度定数に依存して室温（〜２５℃）で様々な時間インキュベートし、＞９０％阻害がアッセイにおけるＡＴの最も高い濃度（５００ｎＭ）で達成することができるように調整した。典型的なインキュベーション時間を各変異体または変異体の種類について特異的に決定したが、全般的には表２１に概説したインキュベーション時間に従った。
表２１．予測されるｋａｐｐ値に基づくアッセイインキュベーション時間
予め決定されたインキュベーション時間後、１５ｍｇ／ｍＬポリブレンを補ったアッセイ緩衝液Ａ中に０．３ｍＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ Ｘａを２０μＬ含む９６ウエル黒色ハーフエリアプレートに、反応物の４０μＬアリコートをＢｉｏＭｅｋ ＦＸによって移した。最終濃度５ｍｇ／ｍＬのポリブレン（ヘキサジメトリンブロミド）を、ＡＴ／ＵＦＨ反応をクエンチするために緩衝液Ａに添加した。ＦＸａの残存活性を２５℃に設定した蛍光読み取り装置において基質切断の初速度を６０分間追跡することによって評価した。残存活性の決定のための最終アッセイ条件は、緩衝液Ａ中、１．０ｎＭ ＦＸａ変異体、０．１ｍＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ Ｘａおよび５ｍｇ／ｍＬ ポリブレンであった。ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅおよびＸＥ Ｒｕｎｎｅｒ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｏｄｕｌｅ（ＩＤＢＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた実施例５ＡにおいてＡＴ／ＵＦＨ阻害アッセイについて上に記載したのと類似するやり方でＫ０．５値を算出するためのデータ分析を実施した。実施例５Ａに概説した擬一次条件下でのアッセイ設定を用いて、種々のインキュベーション時間を検査することにより、次の方程式：
方程式（８）
方程式（９）
を用いてＡＴによる阻害についての見かけの二次速度定数（ｋａｐｐ）を算出することが可能である。
ｔ１／２（アッセイの時間によって定義される）でのＫ０．５＝［ＡＴ］についてのフィット値から、ＡＴによる所与のＦＸａ変異体の阻害についてのＫｏｂｓおよびそれによりＫａｐｐを算出するために必要な全ての値が入手可能になる。算出されたＫａｐｐ値は、文献において典型的に報告される値を示すことから本算出において１．２の一定値をもたらす阻害の化学量論（Ｓ．Ｉ．）における変化のいかなる潜在的影響も考慮していない（たとえば、Olsonら (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939参照）。
表２２は、ＡＴ／ＵＦＨを用いて実施した二次速度アッセイの結果を提供する。結果は、フィトされたＫａｐｐパラメーターとしておよび、野生型ＦＸａと比較した各変異体についてのＡＴ抵抗性の程度をそれらのフィットされたＫａｐｐ値の比（Ｋａｐｐ野生型／Ｋａｐｐ変異体）として表す表現としての両方で表す。比較のために使用される野生型ＦＸａポリペプチドは、実施例１−３に記載されているとおり、配列番号：１に記載されているＦＸ遺伝子のクローニングから産生され、配列番号：１３４のアミノ酸１−１３９および１９５−４４８として記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドとしてＣＨＯ細胞から発現される、組換え野生型ＦＸａ（すなわちＦＸ ＷＴポリペプチド）であった。いくつかのＦＸａ変異体は、野生型ＦＸａと比較して３００倍を超えて増加したＡＴに対する抵抗性を示した。例えば、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ３３２Ｇ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｋ４２０Ｅ／Ｒ４２４Ｅ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ３３２Ｄ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ３３２ＳおよびＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｋ３３８Ｓは、ＡＴに顕著な抵抗性を示すこの群に含まれる。
実施例６
ＦＸａのその補因子第Ｖａ因子への機能性補因子結合（ＫＤ−ａｐｐ）の決定
基質プロトロンビン（ＦＩＩ）の存在下またはその飽和での補因子第Ｖａ因子（ＦＶａ）に対するＦＸａ変異体の機能性補因子結合（ＫＤ−ａｐｐ）を、ＦＸａによる活性化で生じるトロンビン（ＦＩＩａ）の合成基質Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨでの活性をアッセイすることによる蛍光発生アッセイにおいて間接的に評価した。補因子（ＦＶａ）が活性化プロテアーゼ（ＦＸａ）の濃度より少なくとも１０００倍過剰であるＦＶａ濃度の範囲を見かけの動力学的速度定数（ＫＤ−ａｐｐ）を算出するために用いた。アッセイは、基質プロトロンビン（ＦＩＩ）の飽和レベルで触媒活性を評価する前に、プロトロンビナーゼ複合体を形成するリン脂質小胞の存在下でＦＸａと補因子（ＦＶａ）を種々の濃度で予めインキュベートする実施例４（基質プロトロンビン（ＦＩＩ）に対するＦＸａの触媒活性の決定）に記載したアッセイの変形であるように設計した。簡潔には、活性化および活性部位滴定されたＦＸａ変異体をリン脂質小胞を有するカルシウム含有緩衝液で希釈し、プロトロンビナーゼ複合体を形成するように様々な濃度のＦＶａと混合し、次にアッセイを開始するために飽和濃度のプロトロンビンおよび蛍光基質Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ（Ｈ−Ｄ−ＣＨＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、Ｃｅｎｔｅｒｃｈｅｍ）と混合した。産生されるトロンビンによるＰｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨの触媒作用に続く遊離フルオロフォア、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）の放出を連続的経時的に測定し、ＦＸａ変異体の動力学的速度定数を決定した。
Ａ．アッセイプロトコール
種々のＦＶａ濃度（血漿精製ＦＶａ、Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）およびリン脂質の存在下でＦＸａによるプロトロンビン活性化の動力学的速度を評価するアッセイのために、ＦＸａ変異体を上記実施例１−３において記載したとおり発現、精製、活性化および活性部位滴定した。次に、ＦＸａ変異体を１×緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＣａＣｌ２／０．１％ＢＳＡ／０．１％ ＰＥＧ−８０００、ｐＨ７．４）０．２５ｍＬ容量中に０．４−８ｐＭ（４×）の濃度に系列希釈した。ＦＶａを、８０μＭの新鮮再懸濁リン脂質（７５％ホスファチジルコリン（ＰＣ）／２５％ホスファチジルセリン（ＰＳ）；ＰＳ／ＰＣ小胞直径〜１２０ｎｍ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を含有する１×緩衝液Ａ１．０ｍＬ容量中に、試験される変異体に依存して様々な最高（ｔｏｐ）濃度に、一般的に２−６０ｎＭ（最高用量の４×）の範囲へさらに希釈した。ＦＶａ溶液を、８０μＭ ＰＣ／ＰＳ小胞（４×）を含有する１×緩衝液Ａ最終用量０．４ｍＬで、１２チャネルディープウエルポリプロピレンプレートにおける１．８倍系列希釈した。次に、ＦＶａの希釈系列を、４×ＦＸａ希釈物（各２５μＬ）と１：１で９６ウエル丸底黒色アッセイプレートにおいて、予め定義したプレートマップ（ＦＸａ変異体４種／プレート）に従って混合し、種々の濃度のＦＶａと平衡化プロトロンビナーゼ複合体を形成するように１５分間、２５℃で予めインキュベートした。最終２×溶液（５０μＬ）は次のとおりであった：０．２−４ｐＭ ＦＸａ変異体、６０−０ｎＭ ＦＶａおよび４０μＭ ＰＣ／ＰＳ小胞。
活性部位滴定し、ＤＦＰ／ＦＰＲ−ｃｍｋ処理したプロトロンビン（ＦＩＩ）の５０００ｎＭ（２×）の溶液を０．１ｍＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ基質を含有する１×緩衝液Ａ ３０ｍＬ中に調製し、４種のアッセイのために十分な容量を提供した。これは実施例４、表１７に報告したＫＭ値より少なくとも１０−５０倍高いプロトロンビン（ＦＩＩ）の２×飽和濃度を示した。典型的にはアッセイ反応は、ＦＩＩ／Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ希釈物５０μＬを、各ＦＸａ変異体およびＦＶａ希釈物（プロトロンビナーゼ複合体）５０μＬを含む４枚のアッセイプレートに分配するようにプログラムしたＢｉｏＭｅｋ ＦＸ ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを用いて開始した。アッセイにおける試薬の最終濃度は、０．１−２．０ｐＭ ＦＸａ、２０μＭ ＰＣ／ＰＳ小胞、５０μＭ Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ、２．５μＭ プロトロンビン（ＦＩＩ）および０−０．５ｎＭ、０−１．０ｎＭ、０−３．０ｎＭまたは０−１０ｎＭ ＦＶａ希釈物であったが、他のＦＶａ希釈物の範囲も時々使用した。反応を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒにおいて３０分間、２５℃でモニターした。遊離ＡＭＣの標準曲線を０μＭから１００μＭ ＡＭＣに及ぶ用量範囲を用いる続くデータ分析計算においてＲＦＵからμＭへの変換係数として利用した。
Ｂ．データ分析
ＦＸａ変異体のＦＶａに対する機能的親和性をそれらの触媒活性に基づいて決定するために、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で集めた生データを．ＴＸＴファイルとして出力した。さらなる非線形データ分析を、ＸＥ Ｒｕｎｎｅｒ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｏｄｕｌｅ（ＩＤＢＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いるＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅで直接実施した。データ分析は、若干の変更を伴って本質的に実施例４Ｃにおいて記載のとおりであった。Ａｂａｓｅテンプレートを、各ＦＶａ濃度で検査したＦＸａ変異体の放物型反応速度（μＭ／秒２）を方程式（１０）に示す標準直角双曲線の関数（すなわちミカエリスメンテン方程式）に自動的にフィットするように設定し、ＶｍａｘおよびＫＤ−ａｐｐのフィット値を得た。
方程式（１０）
表２３は、アッセイしたＦＸａ変異体それぞれについての機能的親和性（ＫＤ−ａｐｐ）を記載する。組換え野生型ＦＸａ（ＦＸａ ＷＴと称する）、および血漿精製ＦＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ）もアッセイした。表２３は、親和性に関する動力学的定数ＫＤ−ａｐｐ（ｎＭ）として、およびＦＸａ変異体と比較した野生型ＦＸａの機能的親和性の比として（各ＦＸａ変異体の機能的親和性は、基質プロトロンビン（ＦＩＩ）の活性化についてのＫＤ−ａｐｐ（ｎＭ）によって定義される）表した結果を示す。ＦＸａ変異体の活性を野生型ＦＸａと比較する場合は、活性におけるいかなる差異も突然変異の結果であり、たとえば異なる発現系に関連する翻訳後修飾における差異の結果ではないことを確実にするために、変異体ＦＸａポリペプチドについて用いたのと同じ条件を用いて発現および精製した組換え野生型ＦＸａポリペプチドと比較した。したがって、比較に用いた野生型ＦＸａポリペプチドは、配列が配列番号１において記載されるＦＸ遺伝子のクローニングから生成され、ＣＨＯ細胞から配列番号：１３４のアミノ酸１−１３９および１９５−４４８として記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドとして発現された、実施例１−３において記載される（組換え野生型ＦＸａ（すなわちＦＸａ ＷＴ ポリペプチド）であった。標準偏差（Ｓ．Ｄ．）、変動係数（百分率として；％ＣＶ）および実施アッセイ数（ｎ）も表２３において提供する。
いくつかの変異体が野生型と類似の親和性またはＫＤ−ａｐｐにおける名目上の増加を示したが（たとえば、ＦＸａ−Ｒ３２６ＹおよびＦＩＸａ−ＦＸａ−Ｌ２１１Ｓ／Ｇ２１９Ｈ）、いくつかの変異体は、ＫＤ−ａｐｐにおける１０−１００倍を超える増加を有する機能的親和性における顕著な増加を表した。顕著に増加した補因子依存性を有する変異体（実施例４）は、機能的補因子親和性において最も大きな減少を示した。たとえば、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ３２６Ｑ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｋ４２０Ｅ／Ｒ４２４Ｅ、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｒ２７３ＥおよびＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ／Ｋ３３８Ｓはこの群に含まれる。
実施例７
ＦＸａポリペプチドの薬物動態学分析
ＦＸａ変異体ポリペプチドの薬物動態学（ＰＫ）特性を静脈内投与後の種々の時点でのマウス血漿中の変異体ＦＸａの量を測定することによって評価した。ＥＬＩＳＡアッセイをマウス血漿中の全ＦＸａタンパク質を定量するために用い、薬物動態学的特性を評価した。
Ａ．動物。
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）によって供給されたオスＣＤ−１マウス（３０−４０ｇｍ）を処理前の少なくとも３日間隔離した。系列ＰＫ研究のために、オスＣＤ−１マウス（３０−３７ｇｍ）に留置頸動脈血管カニューレを装着した。ＰＤまたはＰＫ実験に用いる前は、濾過水道水および食餌を自由摂取させた。
Ｂ．投与および血液採取
マウス（１時点当たりＮ＝３）にＦＸａポリペプチドを尾静脈を介して静脈内投与（０．５ｍｇ／ｋｇ、投与容量２ｍｌ／ｋｇ）した。投与後の適切な時点（２−９６０分）で動物を麻酔し、最終的な心穿刺を用いてクエン酸を含むシリンジに血液を抜いた（０．５〜１ｍＬ）。最後のＰＫ試験のための十分な量のタンパク質が入手できない場合、合計４〜６匹だけの動物およびずらして配置した時点を使用する一連の出血を利用した。過剰な血液量を除去することなく全ての時点で採取するために全過程のそれぞれについてマウス２匹を用いた。一連の出血実験において、血液は、０．９％生理食塩水を含む０．１ｍＬシリンジに少量の血液を最初に除去することによって覚醒動物を拘束して試料採取した。次いで０．１Ｍクエン酸ナトリウム４．５μＬを含むシリンジを取り付け、血液０．０５ｍＬをシリンジに抜き、血液を１．５ｍＬチューブに移した。最初のシリンジを再び取り付け、生理食塩水０．０７ｍＬをカニューレを通じて戻した。プロセスを繰り返す場合カニューレは次の時点まで蓋をしておいた。一連および最後の試験の両方に関して血液試料を採取１５分間以内に遠心分離し（９０００ｒｐｍ、８分間、４℃）、血漿を除去し、直ちに液体窒素中で新鮮凍結し、分析まで凍結保存（−７０℃）した。
Ｃ．ＰＫ評価
クエン酸処理血液試料を、上記実施例７Ｂに記載されているとおり、投与後９６０分までの種々の時点（すなわち、投与前、２、５、１０、１５、３０、６０、１２０、２４０、３６０および９６０分）で最終実験のために心穿刺によってまたは系列実験のために留置カテーテルによって採取した。ＦＸａの血漿濃度を、ヒト第Ｘ／Ｘａ因子特異的ＥＬＩＳＡを用いて決定した。１対のポリクローナル検出および捕捉抗体（＃ＦＸ−ＥＩＡ−Ｃ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ａｎｃａｓｔｅｒ、ＯＮ）を使用した。ＦＸ／Ｘａ ＥＬＩＳＡは、興味ある変異体の薬物動態パラメータを決定するために使用される尺度を提供した。
簡潔には、ＦＸ／Ｘａを（１：５００）に対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体、Ｃｏａｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１５ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中のプレートのウェルに２時間室温（ＲＴ）でコートした。プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳＴ）で洗浄し、サンプル希釈剤（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００ｎＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．２）において希釈されたＦＸ／Ｘａを含有する血漿試料を適用した。全てのサンプルおよび標準物を、一貫性を維持するためにサンプル希釈剤（Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ）に希釈された１：２００ ＣＤ−１マウス血漿の最終濃度に標準化した。血漿試料をプレート上で１：２００および１：１０００に希釈し、次に、１：４希釈し、１：１０００および１：４０００のさらなる希釈セットを得た。未結合物質を除去するためにプレートを洗浄後、ＦＸ／Ｘａに対するペルオキシダーゼコンジュゲート検出抗体（１：１０００）を捕捉されたＦＸ／Ｘａに結合させるためにプレートに添加した。未結合コンジュゲート抗体を除去するためにプレートを洗浄後、化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｆｅｍｔｏ、＃３７０７４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とのインキュベーションによってペルオキシダーゼ活性が開始した。化学発光シグナルをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ蛍光プレートリーダーを使用して測定した。ペルオキシダーゼ活性の標準曲線は、０．８２ｐｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲にわたって特徴的に直線的である。異なるＦＸａ変異体に対する抗体親和性における差異を排除するためにＦＸａ変異体それ自体を標準曲線のために用いた。各試料を２枚の別々のアッセイプレートで測定し、標準曲線の線形範囲内の測定値を血漿試料中のＦＸａ変異体の濃度を算出するために用いた。
Ｄ．ＰＫデータ分析
ＦＸａ変異体でのマウス研究からのＰＫ（ＥＬＩＳＡ）パラメーターをＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（ｖ５．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）での非コンパートメント解析を用いて算出した。ＦＸａ変異体のＰＫは、見かけの双指数関数的血漿減衰（ｂｉｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｌａｓｍａ ｄｅｃａｙ）に従った。検査した各変異体について選択されたパラメーターを表２５に提供する。ＰＫパラメーターは、ハーフタイム（終末、分）、ＭＲＴ（ＭＲＴ０−ｌａｓｔ、分）、曲線下面積（ＡＵＣ）０〜最終（分μｇ／ｍＬ）／用量（ｍｇ／ｋｇ）；最大濃度（Ｃｍａｘ；（μｇ／ｍＬ）／用量（μｇ／ｋｇ）、Ｖｄ（ｍＬ／ｋｇ）およびクリアランス（Ｃｌ、ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ）を含んだ。
実施例８
ＦＸａポリペプチドの凝血促進活性のインビボ評価
ＦＶＩＩＩ欠損マウス系（ＦＶＩＩＩ−／−）を、血友病ＡのマウスモデルとしてＦＸａポリペプチドの凝血促進活性を評価するために確立した。マウスをＦＸａポリペプチドで処理し、２０分間に失われた血液量をＦＸａポリペプチドの凝血促進活性を決定するために測定した。
Ａ．ＦＸａポリペプチド凝血促進活性のインビボ評価
オスＦＶＩＩＩ−／−マウスをケタミン／キシラジンカクテル（生理食塩水中４５ｍｇ／ｍｌおよび３．６ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内投与によって麻酔し、体温降下が生じないことを確実にするために温めたプラットホーム（３９℃）上に置いた。処置室を温度８２°Ｆに維持した。尾部切断の十（１０）分前に尾部を予め温めたＰＢＳ、１０ｍＬに浸漬した（１５ｍＬ遠心管；３９℃）。最大１５匹のマウスに、組換えヒトＦＸａ（５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５、１００ｍＭ ＮａＣｌに希釈された）または修飾ＦＸａポリペプチド（５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６、１００ｍＭ ＮａＣｌに希釈された）を一回注射で尾静脈を介して注射した。マウスの陰性対照群は適当な緩衝液だけを受けた。注射し損ねた場合は、動物を研究から排除した。
ＦＸａポリペプチドまたは緩衝液の注射は、尾部切断の５分前に行った。尾部切断はカミソリ刃を用いて尾部末端から５ｍｍで行い、血液をＰＢＳ中に２０分間採取した。採取期の最後に総失血を評価した。採取チューブを混合し、各試料の１ｍＬアリコートを取り、ヘモグロビン含有量についてアッセイした。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を滅菌水中、１対４に希釈し、１００μＬを１ｍＬ試料に添加して溶血させた。次いで試料の吸光度を５４６ｎｍの波長で測定した。失血量を算出するために、ＰＢＳ中に希釈し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で上のとおり溶血させた既知の容量のマウス血液の５４６ｎｍでの吸光度を測定することによって作成した標準曲線に対して吸光度を読み取った。値を平均値±ＳＥＭとして表す。
１．野生型ＦＸａ血液凝固活性を評価する用量反応研究
１つの試験において、野生型ＦＸａの血液凝固活性を、上記ＦＶＩＩＩ−／−マウスにおいて０．１、０．３および１ｍｇＦＸａ／ｋｇ体重の用量を使用して分析した。緩衝液（５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）のみを受けた対照群における失血は９４０．９５±３０．７８μｌ（ｎ＝９）であった。０．１ｍｇ／ｋｇで野生型ＦＸａでの処理は失血に対して阻害効果を有さなかったが（９５８．７６±３１．９１μｌ、ｎ＝９）、０．３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇでの処理はそれぞれ８７０．３６±５３．９２μｌおよび８０２．６２±５２．９２μｌに失血の阻害をもたらした（それぞれの用量でｎ＝１０）。正確なＥＤ５０値は、高用量の野生型ＦＸａに対して観察された毒性によって、この試験において決定することができなかった。
次の試験において、野生型ＦＸａの最大耐量（ＭＴＤ）が０．１２５ｍｇ／ｋｇであると決定した。さらなる試験は、０．１ｍｇ／ｋｇの単回投与後の凝固を試験した。この実験において、野生型ＦＸａでの処理は、緩衝液のみ群（８９０．１４±２３．９７μｌから９１４．０３±２３．４８μｌ（緩衝液群、ｎ＝１５；用量群、ｎ＝１０）と比較して失血に対して阻害効果がなかった。クラスカル−ワリス、次にダンポストテスト（用量反応実験）、およびマンホイットニーテスト（単回投与実験）をそれぞれ使用する統計分析は、０．１ｍｇ／ｋｇでの野生型ＦＸａで失血の有意な阻害がないことを証明した。
２．ＦＸａ−Ｉ１９５Ｌ（Ｉ１６Ｌ）血液凝固活性を評価する用量反応研究
Ｉ１９５Ｌ（キモトリプシンナンバリングによるとＩ１６Ｌ）ＦＸａ突然変異体の凝血促進効果の用量反応を、上記ＦＶＩＩＩ−／−マウスにおいて試験した。第１の分析において、緩衝液（５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６、１００ｍＭ ＮａＣｌ）のみを受けた動物群における失血は９３０．７４±１６．３３μｌ（ｎ＝９）であった。０．２、０．６および２ｍｇ／ｋｇでＦＸａ−Ｉ１９５Ｌ（Ｉ１６Ｌ）での処理は失血の有意な阻害をもたらした：それぞれ７１７．３４±４１．３４μｌ（ｎ＝８）、７０４．９３±４６．４５μｌ（ｎ＝１０）、および４８８±９５．６５μｌ（ｎ＝１１）（クラスカル−ワリス、次にダンポストテストを使用してｐ＜０．０５）。
第２の試験において、緩衝液のみ群における失血は９１０．８５±２３．７９μｌ（ｎ＝１２）であった。０．４６ｍｇ／ｋｇでＦＸａ−Ｉ１９５Ｌ（Ｉ１６Ｌ）での処理は、失血の有意な阻害がなかった（８２８．２４±３６．７９μｌ；ｎ＝８）。しかしながら、１．５３および４．５８ｍｇ／ｋｇの増加した用量でＦＸａ−Ｉ１９５Ｌ（Ｉ１６Ｌ）での処理は、対照群と比較して失血の有意な阻害をもたらした：それぞれ６９０．９９±４１．８８μｌ（ｎ＝９）および１２１．６２±７６．５２μｌ（ｎ＝７）（クラスカル−ワリス、次にダンポストテストを使用してｐ＜０．０５）。
３．ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）血液凝固活性を評価する用量反応研究
ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（キモトリプシンナンバリングによるとＶ１７Ｓ）突然変異体の凝血促進効果の用量反応を、上記方法を使用してＦＶＩＩＩ−／−マウスにおいて評価した。第１の試験において、緩衝液（５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６、１００ｍＭ ＮａＣｌ）のみを受けた動物の対照群における失血は８５５．９４±６２．５５μｌ（ｎ＝９）であった。０．７および２．３３ｍｇ／ｋｇでＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）での処理は対照群と比較して失血の有意な阻害がなかった：それぞれ７３７．１６±２１．７５μｌ（ｎ＝８）および６１４．３８±７５．１３μｌ（ｎ＝８）。しかしながら、６．９８ｍｇ／ｋｇの増加したＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）用量は、緩衝液のみの群と比較して失血の有意な阻害をもたらした（１５１．５１±３２．４３μｌ（ｎ＝７）；クラスカル−ワリス、次にダンポストテストを使用してｐ＜０．０５）。
第２の試験において、緩衝液のみ群における失血は８７７．３６±４１．７μｌ（ｎ＝８）であった。０．７ｍｇ／ｋｇでＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）での処理は、失血の有意な阻害がなかった（５３２．８０±５３．３４μｌ；ｎ＝９）；一方、２．３３および６．９８ｍｇ／ｋｇでＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）での処理は失血の阻害をもたらし、緩衝液のみ群と比較して有意であった（それぞれ１８９．６６±４０．１４μｌ（ｎ＝８）および８９．２８±１４．４６μｌ（ｎ＝７）；クラスカル−ワリス、次にダンポストテストを使用してｐ＜０．０５）。
第３の試験において、緩衝液のみ群における失血は１０１８．８２±２７．１３μｌ（ｎ＝９）であった。０．７ｍｇ／ｋｇでＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）での処理は、失血の有意な阻害がなかった（７６０．２７±２５．９２μｌ、ｎ＝９）。２．３３および６．９８ｍｇ／ｋｇでＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）での処理は失血の阻害をもたらし、緩衝液のみ群と比較して有意であった（それぞれ４１４．０６±６１．８９μｌ（ｎ＝９）および１８７．２４±２５．０８μｌ（ｎ＝９）；クラスカル−ワリス、次にダンポストテストを使用してｐ＜０．０５）。
４．低下した温度でのＦＸａ突然変異体の血液凝固活性を評価する用量反応研究
以前の実験（実施例８Ａ１−３）は８２°Ｆの室温で行ったが、ＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）凝固活性をまた７２−７４°Ｆの室温で評価した。第１の試験において、緩衝液のみ群における失血は９３９．９３±１９．１２μｌ（ｎ＝９）であった。０．７ｍｇ／ｋｇでＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）での処理は、失血の有意な減少がなかったが（７９８．７１±２６．０４μｌ；ｎ＝９）、２．３３および６．９８ｍｇ／ｋｇでＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）での処理は、緩衝液のみ群と比較して失血の有意な減少をもたらした（それぞれ５０２．４８±９３．３１μｌ（ｎ＝８）および１４１．８１±３０．３７μｌ（ｎ＝９）；クラスカル−ワリス、次にダンポストテストを使用してｐ＜０．０５）。
７２−７４°Ｆの室温での第２の評価において、緩衝液のみ群における失血は９７７．４２±２０．６１μｌ（ｎ＝９）であった。０．７ｍｇ／ｋｇでＦＸａ−Ｖ１９６Ｓ（Ｖ１７Ｓ）での処理は、失血の有意な減少がなかった（６９０．５２±７９．４１μｌ；ｎ＝１０）。２．３３および６．９８ｍｇ／ｋｇの両方でＦＸａ−Ｖ１７Ｓでの処理は、緩衝液のみ群と比較して失血の有意な阻害をもたらした（それぞれ３０５．７４±７０μｌ（ｎ＝１０）および１５２．４２±３７．４４μｌ（ｎ＝１０）；クラスカル−ワリス、次にダンポストテストを使用してｐ＜０．０５）。
他のＦＸａ−ポリペプチドの凝固活性を、７２−７４°Ｆの室温で上記のとおりに決定した。試験されたＦＸａ−ポリペプチドに対する非線形回帰を用いて算出したＥＤ５０値を、以下の表２６に示す。
＊＝実験２における最も高い用量群は３匹のみの動物を有し、死亡がこの用量で観察された。
変更が当業者に明らかであることから、本発明が添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることが意図される。

Claims (39)

  1. 配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、成熟ナンバリングに基づいて、未修飾第Ｘ因子（ＦＸ）ポリペプチドにおける位置１９６および３３２に対応する位置でアミノ酸置換を含む単離された修飾ＦＸポリペプチドであって、
    対応するアミノ酸位置は、配列番号：１３４に記載されているポリペプチドと未修飾ＦＸポリペプチドのアラインメントにより同定され；
    位置１９６でのアミノ酸置換はセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）であり；
    位置３３２でのアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびグリシン（Ｇ）から選択され；
    未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４に記載されているＦＸの成熟形態のアミノ酸の配列を有するか、または配列番号：１３４の残基１４０−１４２が除去されている成熟ＦＸ形態であるか、または配列番号：２の完全長ＦＸ前駆体ポリペプチドであるか、または配列番号：１３４のアミノ酸１−１３９からなるアミノ酸残基の配列を有する軽鎖および配列番号：１３４のアミノ酸残基１４３−４４８の配列からなる重鎖を有するＦＸの二本鎖形態であるか、または配列番号：１３４のアミノ酸１−１３９からなるアミノ酸残基の配列を有する軽鎖および配列番号：１３４のアミノ酸残基１９５−４４８の配列からなる重鎖を有する活性化ＦＸａ形態であり；
    修飾ＦＸポリペプチドは、未修飾ＦＸポリペプチドと比較して最大５個のアミノ酸置換を含み；
    位置１９６および３３２での置換に加えて、アミノ酸置換は、
    配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置２１１に対応する位置でのＳ；位置２１４に対応する位置でのＤ；位置２１４に対応する位置でのＡ；位置２１４に対応する位置でのＳ；位置２１６に対応する位置でのＲ；位置２１６に対応する位置でのＫ；位置２１６に対応する位置でのＡ；位置２１６に対応する位置でのＳ；位置２１８に対応する位置でのＲ；位置２１８に対応する位置でのＫ；位置２１８に対応する位置でのＡ；位置２１９に対応する位置でのＨ；位置２７３に対応する位置でのＡ；位置２７３に対応する位置でのＥ；位置２７６に対応する位置でのＡ；位置２７６に対応する位置でのＥ；位置３０６に対応する位置でのＥ；位置３２６に対応する位置でのＳ；位置３２６に対応する位置でのＴ；位置３２６に対応する位置でのＶ；位置３２６に対応する位置でのＱ；位置３２６に対応する位置でのＮ；位置３２６に対応する位置でのＭ；位置３２６に対応する位置でのＫ；位置３２６に対応する位置でのＹ；位置３２６に対応する位置でのＥ；位置３２６に対応する位置でのＤ；位置３３８に対応する位置でのＡ；位置３３８に対応する位置でのＳ；位置３３８に対応する位置でのＮ；位置３３８に対応する位置でのＲ；位置３３８に対応する位置でのＶ；位置３３８に対応する位置でのＹ；位置３３８に対応する位置でのＭ；位置４２０に対応する位置でのＡ；位置４２０に対応する位置でのＥ；位置４２４に対応する位置でのＡ；および位置４２４に対応する位置でのＥ；ならびに
    配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、
    位置５１に対応する位置でのＮ；
    位置５６に対応する位置でのＮおよび位置５８に対応する位置でのＳ；
    位置６２に対応する位置でのＮおよび位置６４に対応する位置でのＳ；
    位置６５に対応する位置でのＮおよび位置６７に対応する位置でのＳ；
    位置６７に対応する位置でのＮ；
    位置７３に対応する位置でのＮおよび位置７５に対応する位置でのＳ；
    位置７５に対応する位置でのＮおよび位置７７に対応する位置でのＳ；
    位置７７に対応する位置でのＮおよび位置７９に対応する位置でのＳ；
    位置７８に対応する位置でのＮおよび位置８０に対応する位置でのＳ；
    位置８２に対応する位置でのＳ；
    位置８３に対応する位置でのＮ；
    位置８２に対応する位置でのＮおよび位置８４に対応する位置でのＳ；
    位置８５に対応する位置でのＮおよび位置８７に対応する位置でのＳ；
    位置８６に対応する位置でのＮおよび位置８８に対応する位置でのＳ；
    位置９５に対応する位置でのＮおよび位置９７に対応する位置でのＳ；
    位置１１４に対応する位置でのＮ；
    位置１１９に対応する位置でのＮおよび位置１２１に対応する位置でのＳ；位置１２２に対応する位置でのＳ；
    位置２１５に対応する位置でのＮおよび位置２１７に対応する位置でのＳ；
    位置２４３に対応する位置でのＮおよび位置２４５に対応する位置でのＳ；
    位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；
    位置２９３に対応する位置でのＮおよび位置２９５に対応する位置でのＳ；
    位置３８８に対応する位置でのＮ；
    位置３８９に対応する位置でのＮおよび位置３９１に対応する位置でのＳ；
    位置４２８に対応する位置でのＮおよび位置４３０に対応する位置でのＳ；および
    位置４２９に対応する位置でのＮおよび位置４３１に対応する位置でのＳ
    から選択される非天然グリコシル化部位を導入する１つまたは複数のアミノ酸置換
    から選択され、
    修飾ＦＸポリペプチドは、活性ＦＸａ形態のとき、アミノ酸置換を含まない修飾ＦＸポリペプチドと同じアミノ酸配列を含む未修飾ＦＸポリペプチドの活性形態と比較して、少なくとも５０倍増加した第Ｖａ因子（ＦＶａ）補因子依存性、およびアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する増加した耐性を示し；
    補因子依存性は、修飾を含まない未修飾ＦＸポリペプチドに対する修飾ＦＸポリペプチドのＦＶａ依存性活性／ＦＶａ非依存性活性の比率を比較することにより評価される、
    修飾第Ｘ因子（ＦＸ）ポリペプチド。
  2. 位置１９６でのアミノ酸置換がセリン（Ｓ）である、請求項１に記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  3. 位置３３２に対応する位置でのアミノ酸置換がＡである、請求項１または請求項２に記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  4. 活性化ＦＸａポリペプチドである、請求項１−３のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  5. 配列番号：９２−９６および２２４−２２８のいずれかに記載されているアミノ酸の配列を含む、修飾第Ｘ因子（ＦＸ）ポリペプチドであって、
    修飾ＦＸポリペプチドは、完全長ＦＸポリペプチド、成熟形態、二本鎖チモーゲン形態、または二本鎖活性化形態であり；
    未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：２の完全長ポリペプチドであるか、または配列番号：１３４の成熟形態であるか、または配列番号：１３４のアミノ酸１−１３９からなるアミノ酸残基の配列を有する軽鎖および配列番号：１３４のアミノ酸残基１４３−４４８の配列からなる重鎖を有するＦＸの二本鎖形態であるか；または配列番号：１３４のアミノ酸１−１３９からなるアミノ酸残基の配列を有する軽鎖および配列番号：１３４のアミノ酸残基１９５−４４８の配列からなる重鎖を有する活性化ＦＸａ形態である、
    修飾ＦＸポリペプチド。
  6. ＦＶａ補因子依存性が、未修飾ポリペプチドと比較して、少なくとも７５倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍または１０００倍増加している、請求項１−４のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  7. 同じ形態の未修飾ポリペプチドと比較して、３個または４個のみのアミノ酸置換を含む、請求項１−４および６のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  8. 未修飾ＦＸポリペプチドは、配列番号：１３４のアミノ酸１−１３９からなるアミノ酸残基の配列からなる軽鎖および配列番号：１３４のアミノ酸１９５−４４８の配列からなる重鎖を有する二本鎖ＦＸａ形態である、請求項１−７のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  9. 未修飾ＦＸポリペプチドにおいて２個のみのアミノ酸置換を含む請求項１に記載の修飾ＦＸポリペプチドであって、アミノ酸置換は、
    位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＡ；
    位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＤ；
    位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＥ；
    位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＳ；および
    位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＧ；
    でのアミノ酸置換から選択される、修飾ＦＸポリペプチド。
  10. 位置１９６に対応する位置でのＳおよび位置３３２に対応する位置でのＡでのアミノ酸置換を含む、請求項９に記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  11. 配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、成熟ナンバリングに基づいて、未修飾ＦＸａポリペプチドにおける位置１９６および位置３３２でアミノ酸置換を含む、ＦＸａポリペプチドである修飾活性第Ｘ因子ポリペプチドであって、
    位置１９６での置換はセリン（Ｓ）であり、３３２での置換はアラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）またはグリシン（Ｇ）であり；
    修飾ＦＸａポリペプチドは最大５個のみアミノ酸置換を含み；
    未修飾ＦＸａは、配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列からなる軽鎖、および配列番号：１３４の残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列からなる重鎖を含み；
    修飾ＦＸａは、アミノ酸置換を含まない未修飾ＦＸａポリペプチドと比較して、少なくとも５０倍増加したＦＶａ補因子依存性を示し；
    補因子依存性は、ＦＶａの非存在下と比較しての、第Ｖａ因子（ＦＶａ）の存在下での修飾ＦＸａの触媒活性の比率であり、
    位置１９６および３３２での置換に加えて、アミノ酸置換は、
    配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、位置２１１に対応する位置でのＳ；位置２１４に対応する位置でのＤ；位置２１４に対応する位置でのＡ；位置２１４に対応する位置でのＳ；位置２１６に対応する位置でのＲ；位置２１６に対応する位置でのＫ；位置２１６に対応する位置でのＡ；位置２１６に対応する位置でのＳ；位置２１８に対応する位置でのＲ；位置２１８に対応する位置でのＫ；位置２１８に対応する位置でのＡ；位置２１９に対応する位置でのＨ；位置２７３に対応する位置でのＡ；位置２７３に対応する位置でのＥ；位置２７６に対応する位置でのＡ；位置２７６に対応する位置でのＥ；位置３０６に対応する位置でのＥ；位置３２６に対応する位置でのＳ；位置３２６に対応する位置でのＴ；位置３２６に対応する位置でのＶ；位置３２６に対応する位置でのＱ；位置３２６に対応する位置でのＮ；位置３２６に対応する位置でのＭ；位置３２６に対応する位置でのＫ；位置３２６に対応する位置でのＹ；位置３２６に対応する位置でのＥ；位置３２６に対応する位置でのＤ；位置３３８に対応する位置でのＡ；位置３３８に対応する位置でのＳ；位置３３８に対応する位置でのＮ；位置３３８に対応する位置でのＲ；位置３３８に対応する位置でのＶ；位置３３８に対応する位置でのＹ；位置３３８に対応する位置でのＭ；位置４２０に対応する位置でのＡ；位置４２０に対応する位置でのＥ；位置４２４に対応する位置でのＡ；および位置４２４に対応する位置でのＥ；ならびに
    配列番号：１３４に記載されているアミノ酸位置を基準にして、
    位置５１に対応する位置でのＮ；
    位置５６に対応する位置でのＮおよび位置５８に対応する位置でのＳ；
    位置６２に対応する位置でのＮおよび位置６４に対応する位置でのＳ；
    位置６５に対応する位置でのＮおよび位置６７に対応する位置でのＳ；
    位置６７に対応する位置でのＮ；
    位置７３に対応する位置でのＮおよび位置７５に対応する位置でのＳ；
    位置７５に対応する位置でのＮおよび位置７７に対応する位置でのＳ；
    位置７７に対応する位置でのＮおよび位置７９に対応する位置でのＳ；
    位置７８に対応する位置でのＮおよび位置８０に対応する位置でのＳ；
    位置８２に対応する位置でのＳ；
    位置８３に対応する位置でのＮ；
    位置８２に対応する位置でのＮおよび位置８４に対応する位置でのＳ；
    位置８５に対応する位置でのＮおよび位置８７に対応する位置でのＳ；
    位置８６に対応する位置でのＮおよび位置８８に対応する位置でのＳ；
    位置９５に対応する位置でのＮおよび位置９７に対応する位置でのＳ；
    位置１１４に対応する位置でのＮ；
    位置１１９に対応する位置でのＮおよび位置１２１に対応する位置でのＳ；位置１２２に対応する位置でのＳ；
    位置２１５に対応する位置でのＮおよび位置２１７に対応する位置でのＳ；
    位置２４３に対応する位置でのＮおよび位置２４５に対応する位置でのＳ；
    位置２６４に対応する位置でのＮおよび位置２６６に対応する位置でのＳ；
    位置２９３に対応する位置でのＮおよび位置２９５に対応する位置でのＳ；
    位置３８８に対応する位置でのＮ；
    位置３８９に対応する位置でのＮおよび位置３９１に対応する位置でのＳ；
    位置４２８に対応する位置でのＮおよび位置４３０に対応する位置でのＳ；および
    位置４２９に対応する位置でのＮおよび位置４３１に対応する位置でのＳ
    から選択される非天然グリコシル化部位を導入する１つまたは複数のアミノ酸置換
    から選択される、
    修飾活性第Ｘ因子ポリペプチド。
  12. 位置３３２での置換がＡである、請求項１１に記載の修飾ＦＸａポリペプチド。
  13. 未修飾ＦＸポリペプチドが、
    ａ）配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含むチモーゲンＦＸポリペプチド、または
    ｂ）配列番号：１３４の残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列を含む軽鎖、および配列番号：１３４の残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列を含む重鎖を含む活性ＦＸ（ＦＸａ）ポリペプチド
    から選択される、請求項１−１０のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  14. ａ）配列番号：２２４−２２８のいずれかにおいて記載されているアミノ酸の配列；
    ｂ）配列番号：２２４−２２８のいずれかの残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列からなる軽鎖および残基１４３−４４８として記載されているアミノ酸の配列からなる重鎖を含むアミノ酸の配列；および
    ｃ）配列番号：２２４−２２８のいずれかの残基１−１３９として記載されているアミノ酸の配列からなる軽鎖および残基１９５−４４８として記載されているアミノ酸の配列からなる重鎖を含むアミノ酸の配列
    から選択されるアミノ酸の配列を含む、請求項１−１０および１２のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  15. 配列番号：９２−９６のいずれかに記載されているアミノ酸の配列またはその活性化ＦＸａ形態を含む、請求項１４に記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  16. 配列番号：２２４−２２８のいずれかに記載されているアミノ酸の配列を含む、請求項１４に記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  17. 一本鎖ポリペプチドである、請求項１−１０および１３−１６のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  18. 二本鎖ポリペプチドである、請求項１−１０および１３−１６のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  19. ＦＸａポリペプチドである、請求項１−１６のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチド。
  20. 薬学的に許容される媒体中に請求項１−１９のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチドを含む医薬組成物。
  21. 局所的投与、全身投与、または局所投与用に製剤されている、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 単一投薬量投与用に製剤されている、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 請求項１−１９のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子。
  24. 請求項２３に記載の核酸分子を含むベクター。
  25. 原核生物ベクター、ウイルスベクター、または真核生物ベクターである、請求項２４に記載のベクター。
  26. ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、およびサイトメガロウイルスベクターから選択される、請求項２５に記載のベクター。
  27. 請求項２４−２６のいずれかに記載のベクターを含む単離細胞または細胞培養物。
  28. 真核細胞である、請求項２７に記載の細胞または細胞培養物。
  29. 真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の細胞または細胞培養物。
  30. 哺乳動物細胞が、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）または２９３細胞またはＣＨＯ細胞から選択される、請求項２９に記載の細胞または細胞培養物。
  31. 修飾ＦＸポリペプチドが産生される条件下で請求項２７−３０のいずれかに記載の細胞または細胞培養物を培養することを含む、請求項１−１９のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチドを産生する方法。
  32. 修飾ＦＸポリペプチドを単離することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 出血障害を処置することにおける使用のための請求項１−１９のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチドを含む医薬組成物であって、
    修飾ＦＸポリペプチドは、アミノ酸置換を含む完全長ＦＸ、成熟形態またはＦＸａ形態であり、
    出血障害は、凝固因子の欠損による障害、凝固因子に対する後天性阻害因子の存在による障害、血液疾患、出血性障害、フォン・ヴィレブランド病、ビタミンＫアンタゴニストを有する抗凝固薬治療に由来する障害、遺伝的血小板障害、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症、ガンマ−カルボキシラーゼ欠損症、外傷と関連する出血、損傷、血栓症、血小板減少症、卒中、血液凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症および貯蔵プール欠損症から選択される、
    医薬組成物。
  34. 出血障害の処置のための医薬の製造における請求項１−１９のいずれかに記載の修飾ＦＸポリペプチドの使用であって、
    修飾ＦＸポリペプチドは、アミノ酸置換を含む完全長ＦＸ、成熟形態またはＦＸａ形態であり、
    出血障害は、凝固因子の欠損による障害、凝固因子に対する後天性阻害因子の存在による障害、血液疾患、出血性障害、フォン・ヴィレブランド病、ビタミンＫアンタゴニストを有する抗凝固薬治療に由来する障害、遺伝的血小板障害、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症、ガンマ−カルボキシラーゼ欠損症、外傷と関連する出血、損傷、血栓症、血小板減少症、卒中、血液凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症および貯蔵プール欠損症から選択される、
    使用。
  35. 出血障害が血友病である、請求項３４に記載の使用。
  36. 出血障害が血友病Ａまたは血友病Ｂである、請求項３４または３５に記載の使用。
  37. 薬学的に許容される担体中に請求項２３に記載の核酸分子または請求項２４−２６のいずれかに記載のベクターを含む医薬組成物。
  38. 出血障害を処置することにおける使用のための薬学的に許容される担体中に請求項２３に記載の核酸分子または請求項２４−２６のいずれかに記載のベクターを含む医薬組成物であって、
    出血障害は、凝固因子の欠損による障害、凝固因子に対する後天性阻害因子の存在による障害、血液疾患、出血性障害、フォン・ヴィレブランド病、ビタミンＫアンタゴニストを有する抗凝固薬治療に由来する障害、遺伝的血小板障害、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠損症、ガンマ−カルボキシラーゼ欠損症、外傷と関連する出血、損傷、血栓症、血小板減少症、卒中、血液凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマン血小板無力症および貯蔵プール欠損症から選択される、
    医薬組成物。
  39. 出血障害が血友病である、請求項３３、３７または３８に記載の医薬組成物。
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