JP6342906B2 - 架橋されたヒアルロン酸及びヒドロキシアパタイトに基づく、美容用途のための注射可能な無菌水性製剤 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明の対象は、即時使用可能であり、吸収性であり、美容目的のために使用される、粒子状で凝集性の粘弾性ゲルとしての注射可能な無菌水性製剤であって、周波数１Ｈｚでのｔａｎδが０．６０以下であるような粘弾性特性を有し、ｉ）１％〜４％（質量／体積）の濃度の、架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１つ、ここで前記架橋は、いわゆる凝集性構造を有する架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルを得る可能性を提供するために行われ；及び、ｉｉ）５％〜６０％（質量／体積）の濃度のヒドロキシアパタイト、ここで前記ヒドロキシアパタイトは、２００μｍ以下の平均径を有する粒子の形態である、を含む、前記注射可能な無菌水性製剤である。

加齢は、誰もが直面する自然現象である。それは、必然的に人体の細胞活性の低下に付随して起こる。

最も明らかな年齢の兆しは、顔に現れ：皮膚の衰え、及び最初のしわが表れる。多くの解決策は、これらの年齢の兆しの発生を遅らせ、又は既に確立されてしまった兆しを修繕する試みのために開発されてきた。

これらの解決策として、皮膚中、又は皮下へいわゆる充填物質を注射することから成る技術が挙げられる。これらの物質は、イン・ビボで吸収性、又は非吸収性であり得る。これらの物質の役割は、身体の多様な部分、特に顔を処置するために、皮膚中、又は皮下に体積を作り出すことにより、崩れた部分を充填することである。この機械的な効果により、皮膚は、再び張りを持ち、そしてしわは滑らかになり、処置領域のより若い外観をもたらす。

いわゆる吸収性の充填物質として、皮膚美容において使用される架橋されたヒアルロン酸（ＨＡ）（＜＜安定化ＨＡ＞＞とも呼ばれる）が挙げられる。しわを埋めるため、又は身体の多様な領域の体積を回復するために、それは、数か月の期間で皮膚中又は皮下へ注射される。それは、注射後にほとんど副次効果を引き起こさず、そして長期間にわたって合併症を殆ど引き起こさないという利点を有する。一方で、良くない注射の場合、施術者は、既に注射された架橋されたＨＡに基づく製造物を分解する溶液である、ヒアルロニダーゼ（ＨＡの特異的酵素）の溶液を注射することにより、彼／彼女の処置を正す可能性を有する。架橋されたＨＡの注射は、それらの段階的な消失（経時的な組織におけるポリマーの吸収）のために、処置の効率を持続させるために、一定間隔、一般に６〜１２か月で繰り返される必要がある。架橋されていないヒアルロン酸自体は、皮膚中で短い滞留時間（１週間未満の半減期）を有し、それは、ラジカル的、酵素的、熱的及び機械的分解等の多様な要因により、イン・ビボで分解される。実際に上記の要因に伴い、架橋させることでヒアルロン酸の分解速度を遅らせることにより、その半減期を有意に増加させることを可能にし、それにより約１２か月で達成され得る美容処置の効率を可能にする。

経時的に強化された性能を有するヒアルロン酸に基づく処置の開発のために、徹底した科学調査が世界的に行われている。特にその目的は、注射された製造物の非常に高いレベルの安全性を保持しつつ、可能な限り長い期間に渡って最適な美容効果を保持するために、あまり急速には分解しないことを可能にする製造物を有することである。

他の吸収性充填物質は、皮膚美容市場に存在する。例えば、カルシウムヒドロキシアパタイトを含む製造物が言及され得る。これらの粒子は、セルロースの誘導体であるポリマー様カルボキシメチルセルロースを含み得る水性相中に懸濁される。本ファミリーの製造物は、しわを埋めるために、又は身体、特に顔の多様な領域の体積を回復するために皮膚中又は皮下に注射される。それらは、注射前におけるアレルギー試験の不存在を正当化する高いレベルの生体適合性を示す。これらの製造物について、副次効果及び合併症のいずれもほとんど報告されておらず、そしてほぼ１２か月以上の効率の持続が観察されている。吸収の観点からすれば、水性相は、処置領域から迅速に除去され、またヒドロキシアパタイト粒子は、経時的にマクロファージにより分解され、そして代謝される。

ヒドロキシアパタイト粒子によるコラーゲンの内因性産出の刺激もまた、皮膚の組織へ注射されたこれらの製造物について報告されている。

残念ながらこれらの製造物は、多様な科学文献に発表されているように、移動する傾向がある。この移動は、それが美容効果の早すぎる損失（正確な領域でのより少ない生体材料）を導き、そして潜在的に副次効果を誘導し得（特に、（生体材料にかけられる機械的ストレスのために、）処置領域から多少離れた特定の領域において粒子が濃縮され得る）、そしていわゆる硬質領域を局所的に誘導し得るため、問題がある。

これに関連して、組織中で延長した寿命を有し、即時使用可能であり、また上記の欠点を有さない美顔及び／又は美容目的のための、注射に適合した、顕著な機械的特性を有する製剤を、施術者に利用可能にすることが重要である。

本発明は、美容目的のために使用される、粒子状で凝集性の粘弾性ゲルとしての、注射可能であって生体吸収性の無菌水性製剤であって、ｉ）１％〜４％（質量／体積）の濃度の、架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１つ、ここで、ヒアルロン酸又はその塩の１つの分子量は、２．５×１０⁵Ｄａ〜４×１０⁶Ｄａであり、前記架橋は、いわゆる凝集性構造を有する架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルを得る可能性を提供するために行われ；および、ｉｉ）５％〜６０％（質量／体積）の濃度のヒドロキシアパタイト、ここで前記ヒドロキシアパタイトは、２００μｍ以下の平均径を有する粒子の形態である；を含み、周波数１Ｈｚでのｔａｎδが０．６０以下であるような粘弾性特性を有する、前記製剤に関する。

他の目的によれば、本発明は、注射可能な無菌水性製剤を調製するための方法であって、以下の：ａ）少なくとも１重量％〜４重量％の架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１つを含む第一の混合物を調製し、ここで前記調製は、二機能性又は多機能性分子を用いて、前記バイオポリマーの鎖間に共有結合を形成することによって行われ、ここで前記架橋は、いわゆる凝集性構造を有する架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルを得る可能性を提供するために行われ；ｂ）前記混合物を精製し；ｃ）その後、ヒドロキシアパタイトを５％〜６０％（質量／体積）の濃度で添加し、それを架橋されたヒアルロン酸に基づくゲル中に均一に分散させ；ｄ）前記ゲルを変換して、即時使用可能な形態の製造物を得；ｅ）湿式加熱にて前記製造物を無菌化すること、からなるステップを含む、前記方法に関する。

さらに他の目的によれば、本発明は、前記のような製剤を含む、好ましくはシリンジの形態であるキットに関する。

実施例２に記載された試験に従い、Ｂ’、Ｘゲル、並びに、ＣＭＣ及びヒドロキシアパタイトに基づく製剤の比較の写真を表す。

発明の詳細な説明
以下に記載される発明は、美顔及び美容目的のために使用され、また粘弾性、充填性及び長期効果特性を有する、生体吸収性であって注射可能な新規の無菌水性製剤を提案するという目標を有する。本製剤は、特定の凝集性の粘弾性ゲルの形態であり、
ｉ）１％〜４％（質量／体積）の濃度の、架橋されたヒアルロン酸、又はその塩の１つ、ここで前記架橋は、いわゆる凝集性構造を有する架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルを得る可能性を提供するために行われ；及び、
ii）５％〜６０％（質量／体積）の濃度のヒドロキシアパタイト、ここで前記ヒドロキシアパタイトは、２００μｍ以下の平均径を有する粒子の形態である、
を含み、
周波数１Ｈｚでのｔａｎδが０．６０以下であるような粘弾性特性を有することを特徴とする。

非常に驚くべきことに、本製剤は、本発明の条件にかかる架橋されたヒアルロン酸とヒドロキシアパタイト粒子との間の相乗効果により、長期に渡り組織中に体積を作り出す顕著な能力を有することが明らかとなった。

機械的観点から、（固体挙動：強い弾性及びごくわずかな粘性を有する）ヒドロキシアパタイト粒子は、ゲルの弾性を相当に強め、したがって、処置される欠陥のある領域を修復するために、組織上に有意な力／圧力を誘導することによって体積を作り出すその能力を相当に強める。

架橋されたヒアルロン酸自体は、粘弾性特性、すなわち弾性を提供するのみならず、組織に近い硬度をゲルに持たせることを可能とする粘性も提供する。それは、非常に強い弾性を補填し、ヒドロキシアパタイト粒子により提供される粘性の不存在を補填する。これは、（患者が製造物に触れてもあまり感じない程度に）よりいっそう均一の方法で、より少ない組織への外傷で（注射後の炎症の強い制限）、そして注射時における痛みがより少ない、組織中に統合される製造物を有する可能性を提供する。

一方、本発明の条件下で架橋されたヒアルロン酸は、凝集性タイプの架橋されたヒアルロン酸（低い吸収動態を有する架橋されたヒアルロン酸）の利益の上に存在する強い凝集性のために、ゲル中に保持される粒子であるヒドロキシアパタイト粒子の移動をかなり減少させることができる。この強い移動の制限は、長期に渡り改善された体積形成能を伴うゲルを有する可能性を提供し、そして患者によって感じられるいわゆる硬質領域の発生などの副作用を減らすことができる。

ヒアルロン酸は、グルクロン酸塩二糖類及びＮ−アセチルグルコサミン単位の繰返しから成る多糖である。それは、ヒト及び動物における連結性の上皮及び神経組織の間で広く分布している。それは、細胞外マトリクスの主成分の一つである。それは、細胞の増殖及び移動に有意に寄与する。それは、水性の体液、髄液、皮膚及び臍帯において、顕著に相当な濃度で見出される。

本発明において好ましいヒアルロン酸の塩として、陽イオンを有するヒアルロン酸塩、例えば、一価又は二価の塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、マンガン塩が挙げられる。ナトリウム塩が最も好ましい。

本発明によれば、ヒアルロン酸又はその塩の１つは、架橋された形態にある。本架橋は、二機能性又は多機能性分子を用いて、前記バイオポリマーの鎖間で共有結合を形成することにより得られる。架橋は、いわゆる凝集性構造、さらに単相構造と呼ばれる構造を有する架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルを得る可能性を提供するために行われる。

架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルの凝集性の性質は重要であり、また本発明において要求される特定の特徴である。ゲルは、それが水中に導入される場合においても、「二相」ゲルと呼ばれる非凝集性の性質を伴うゲル（ヒドロキシアパタイト粒子を維持することができず、それにより移動を回避する架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルのタイプ）のように、迅速に分散されるべきでない。実施例２は、凝集性ゲルと非凝集性ゲルの間におけるこの相違を取り上げる。

本発明は、通常１％〜４％（質量／体積）、好ましくは１％〜３％（質量／体積）の濃度の、架橋されたヒアルロン酸、又はその塩の１つを含む。１つの特定の好ましい代替によれば、架橋されたヒアルロン酸、又はその塩の１つの濃度は、１．５％〜２．５％（質量／体積）である。或いは、架橋されたヒアルロン酸、又はその塩の１つの濃度は、１．５％〜３％（質量／体積）又は１％〜２．５％（質量／体積）であり得る。

好都合には、本発明の水性製剤は、ヒアルロン酸、又はその塩の１つを含み、その分子量は、好ましくは２．５ｘ１０⁵Ｄａ〜４ｘ１０⁶Ｄａである。特定の好ましい代替によれば、当該分子量は、１ｘ１０⁶Ｄａ〜３ｘ１０⁶Ｄａである。或いは、分子量は、１ｘ１０⁶Ｄａ〜２．５ｘ１０⁶Ｄａ、又は２．５ｘ１０⁵ Ｄａ〜３ｘ１０⁶Ｄａである。

ヒドロキシアパタイトは、式（Ｃａ₅（ＰＯ₄）₃（ＯＨ）のリン酸塩のファミリーに由来する鉱物種であり、通常は、結晶構造の格子が２つの分子を含むという事実を強調するために、Ｃａ₁₀（ＰＯ₄）₆（ＯＨ）₂ と記載される。ヒドロキシアパタイトは、アパタイトの結晶学的ファミリーに属し、同形の化合物は、六方晶系の構造を有する。本化合物は、長年に渡り、多様な医療専門の製造物における生体材料として使用されてきた。

本発明は、一般に５％〜６０％（質量／体積）、好ましくは１０％〜５０％（質量／体積）、好ましくは２０％〜４０％（質量／体積）を占める濃度のヒドロキシアパタイト粒子を含む。そしてヒドロキシアパタイト粒子の平均径は、２００μｍ以下、好ましくは５０μｍ未満、好ましくは１０μｍ超である。

本発明の製剤の粘性及び弾性特性は、周波数１Ｈｚでの［粘性係数Ｇ’’／弾性係数Ｇ’］率に対応するパラメーターｔａｎデルタ又はｔａｎδが、０．６０以下、好ましくは０．５８以下の場合に最適であることが観察された。実際に本発明の製剤の弾性性質は、ヒドロキシアパタイト粒子の沈殿を回避できるように、その粘性と比べて十分に大きくあるべきことが示された。したがって、０．６０超であるヒドロキシアパタイト粒子は、経時的に沈降する傾向があると観察された。この沈殿は、ヒドロキシアパタイト粒子に基づく非均一性製剤を得ることに関与する。そしてそれは、針を通じた製剤の注射行為のために十分ではなく（針を遮断する）、また、注射領域での製剤の安全性及び性能のために十分ではない（例えば皮膚組織において、いわゆる硬質領域が発生する）。

一般に、弾性（Ｇ’）、及び弾性に対する粘性の比率（ｔａｎデルタ＝Ｇ’’／Ｇ’）の測定は、４０ｍｍの平面配置、１，０００μｍの空隙、及び２５℃の分析温度を伴うレオメーターを用いて、０．０１〜１００Ｈｚの周波数走査により行われる。

実施例２において示すように、本発明の製剤の凝集性は重要な要素であるが、後者の粘弾性性質が：
−それらの容器内部でのヒドロキシアパタイト粒子の経時的な沈殿を回避するように、そして
−注射の間、及び／又は注射領域で２相に分離する製造物（ヒドロキシアパタイト粒子及び架橋されたヒアルロン酸ゲル）を有し、それにより処置される領域中に不均一の帯を生じさせることを回避するように
適合されることが要求される。

本発明の他の目標は、従来技術の製剤と比べて、より優れた寿命を有することである。この美容効果のより良い寿命は、架橋されたヒアルロン酸の、注射領域における長期に渡るヒドロキシアパタイト粒子の維持能力、及びヒドロキシアパタイト粒子の、注目に値する長期にわたる機械的／流動学的特性を授ける能力を通して得られる。したがって本発明の製剤を伴う注射を新しくする必要性はより少なくなり、臨床症状における寿命の増加は、おそらく数か月間であろう。

放射線不透過性のヒドロキシアパタイト粒子の存在は、注射の間及び／又は注射後に、Ｘ線撮影を用いて、それらが施術者によって容易に配置され得るため、ゲルに利点を提供することを明記することも重要である。

他方で、ヒドロキシアパタイト粒子がコラーゲンの内因性産生を刺激する能力は、本発明の重要な要素である。組織における製造物のゆるやかな吸収は、コラーゲンの産生に付随して起こる（体積及び弾性の生成）。それは、長期における処置の性能に寄与し得る。

さらに施術者の注射を正すために、及び製造物を作り上げる架橋されたヒアルロン酸を分解するために、ヒアルロニダーゼの溶液を注射する彼／彼女に与えられる可能性は、本発明に利点を与える。しかしながら当該注射は、ヒドロキシアパタイト粒子の吸収を加速させることはなく、したがって組織内部における製造物の完全な分解はなされない。

したがって本発明は、体積を充填及び／又は回復し、並びに／或いは生物学的組織を置き換えるため、特にｉ）顔（頬、顎、頬骨、こめかみ、・・・）の体積を回復し、ｉｉ）身体（臀部、胸部、手、・・・）の体積を回復し、ｉｉｉ）顔のリポジストロフィーにより影響を及ぼされるＨＩＶ患者における顔の体積を回復するために使用される、上記のような製剤にある。

本発明の製剤は、これらに限定されないが、一般に少なくとも１つの他の添加剤（上記のもの以外）、及び／又は少なくとも１つの活性成分がそこに添加されるように使用される。

好都合には、本発明の製剤は、施術者が、注射直前に、彼自身／彼女自身で架橋されたヒアルロン酸及びヒドロキシアパタイト溶液を混合する必要がないので、＜＜即時使用可能製剤＞＞である。

したがって本製剤は、１又は複数のセラミック材料をさらに含み得る。これらの材料は、一般にリン酸三カルシウム、炭酸カルシウム及び硫酸カルシウム、又はそのセラミック材料のいくつかの組み合わせを含む群から選択される。

本発明の製剤は、リドカイン単剤若しくはそれとアドレナリンとの組み合わせ、プロカイン、エチドカイン単剤若しくはそれとアドレナリンとの組み合わせ、アルチカイン単剤若しくはそれとアドレナリンとの組み合わせ、メピバカイン、プラモカイン、キニソカイン、又は１若しくは複数のこれらの麻酔剤の塩を含む群から選択される１又は複数の麻酔剤をさらに含み得る。特に好ましい代替によれば、選択される麻酔剤は、塩酸リドカインである。本発明の製剤における麻酔剤の存在は、注射中及び注射後の患者の心地良さを改善することに関して主な利点を有する。

本発明の他の特定の実施形態によれば、本発明の製剤は、ポリオールファミリーの抗酸化剤等の１又は複数の抗酸化剤もさらに含み得る。抗酸化剤は、ソルビトール、グリセロール、マンニトール又はプロピレングリコールを含むポリオールの群から選択され得る。

他の対象によれば、本発明は、ａ）少なくとも１重量％〜４重量％の架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１つを含む第一の混合物を調製し、ここで前記調製は、二機能性又は多機能性分子を用いて、前記バイオポリマーの鎖間に共有結合を形成することによって行われ、ここで前記架橋は、いわゆる凝集性構造を有する架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルを得る可能性を提供するために行われ；ｂ）前記第一の混合物を精製し；ｃ）その後、ヒドロキシアパタイトを５％〜６０％（質量／体積）の濃度で添加し、それを架橋されたヒアルロン酸に基づくゲル中に均一に分散させ；ｄ）前記ゲルを変換して、即時使用可能な形態の製造物を得；ｅ）湿式加熱にて前記製造物を無菌化すること、のステップを含む注射可能な無菌水性製剤を調製するための方法に関する。

ステップｅ）の製剤の無菌化は、湿式加熱において達成される。当業者であれば、彼／彼女の製造物を無菌化するために適する加熱無菌化サイクル（無菌化サイクルの温度及び継続時間）の選択の仕方を知っている。例えば湿式加熱における以下の無菌化サイクルは：１３１℃、１分／１３０℃、３分／１２５℃、７分／１２１℃、２０分が使用され得る。

他の目標によれば、本発明は、好ましくは上記の製剤を含むシリンジの形態にあるキットに関する。

さらに本発明は、上記の製剤を含むアンプル又はフラスコ等のシリンジ以外の容器の形態であるキットに関する。

発明者は、架橋されたＨＡに基づく本発明の製剤が、特定の性質、特に凝集性の性質を有するべきであるということを以下の例において示した。もしそうでないとしたら（架橋されていないＨＡを伴う例、又は特許請求されている構造を有しない架橋されたＨＡを伴う例を参照）、ヒドロキシアパタイト粒子は、マトリクス中に適切に維持されないことにより、比較的に容易にゲルの外に拡散される。それは、安全性の問題を引き起こすこの移動のために、処置される領域での体積の損失（すなわち効率の損失）、及び可能性のある合併症を暗示し得る。

本発明は、以下の実施例１〜４による非限定的な方法において、ここに説明される。

実施例１
いわゆる凝集性構造を有する架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルの調製
ステップ１：分子量２．６ＭＤａの３．５ｇのヒアルロン酸ナトリウムを、１％の水酸化ナトリウム（３０．５ｇ）に添加する。混合物を、１時間３０分間放置して均一にする。４２０ｍｇのブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を、均一化した混合物に添加し、閉じ、その後に水槽中に５０℃で２時間置く。その後に混合物を、７．５ｇの１ＮのＨＣｌを添加することにより中和する。

２５ｍｇ／ｍＬ（２．５％）のヒアルロン酸濃度を得るために、中性のｐＨ（再生セルロース、分離限度：分子量＝６０ｋＤａ）を有する等浸透生理溶液による透析により、ゲルを２４時間精製する。その後にそれを、１時間３０分間、従来型のブレードミキサー中で均一にする（＝ゲル Ａ１／１２４ｇ）。

最終的にゲルを脱気し、２ｍＬのガラスシリンジ中に充填し、そしてスチームオートクレーブにより、１３０℃で３分間無菌化し得る（−いわゆる凝集性又は単相構造のゲルＡ／粘弾性ゲル）。

ステップ２：本発明のゲルの調製。１００ｇのゲルＡ１において、その粒子が３０〜５０マイクロメーターの平均粒度を有する４２．９ｇのホスホカルシウムヒドロキシアパタイトＣａ₁₀（ＰＯ₄）₆（ＯＨ）₂ を添加し、その後に刃を有する従来型のミキサー中で、１時間３０分間ゲルを均一化する（＝ゲル Ｂ１／１４２．９ｇ）。

最終的にゲルを脱気し、２ｍＬのガラスシリンジ中に充填し、そしてスチームオートクレーブにより、１３０℃で３分間無菌化し得る（＝ゲルＢ）。

ゲルは、粒子状で、凝集性の粘弾性である。実際に後者は、強い凝集性（実施例２を参照）を有し、またヒドロキシアパタイト粒子を含む粘弾性ゲルとして現れる（それは、弾性Ｇ’及び粘性Ｇ’’特性を有す／以下を参照）。

ゲルのヒアルロン酸濃度は、１７．５ｍｇ／ｍＬ（１．７５％）である（カルバゾールによる検定、欧州薬局方の方法）。一方でゲルのｐＨ（７．１５）及び浸透圧（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）は、生理学的な値である。

ゲルは、針を通して容易に注射可能である：２１Ｇ １ １／２の針に通してゲルを押し進めるためは、１２．５ｍｍ／分の押し進め速度を考慮すると、２６．３Ｎの力が要求される。

ゲルＡ及びＢは、機械的／流動学的な観点から特徴付けられる：これらの特徴を行うために用いられるレオメーターは、４０ｍｍの平面配置、１，０００マイクロメーターの空隙及び２５℃の分析温度を伴うＡＲ２０００（ＴＡ機器）である。

弾性（Ｇ’）及び弾性分の粘性の比率（ｔａｎデルタ＝Ｇ’’／Ｇ’）の比率の測定は、０．１〜１００Ｈｚの周波数走査を用いることにより行われる。
パラメーターの比較は、１Ｈｚで行われる。

製造物Ｂは、製造物Ａよりも有意に高い弾性を有することが分かる。しかしながら、それぞれの製造物Ａ及びＢのｔａｎデルタ値は比較的近く：ゲルＢは、ヒドロキシアパタイト粒子（それ自体は、高い弾性及びごくわずかな粘性を有する）の存在にもかかわらず、実質的に粘着の性質を保持する。本発明の製造物の強い凝集性と組み合わせられるこのより強い弾性は、製造物の増強された組織における体積の産出能を提供する。

試験されるゲルにより誘導される垂直抗力の測定は、ペルティエ面と１，５００マイクロメーターの空隙のための配置の間のサンプル、及び１．４ｇの量のゲルを圧迫することにより行われる。

製造物Ｂは、製造物Ａよりも有意に強い弾性、及び誘導された垂直抗力を有することが分かる。

本発明のゲルの、強い凝集性と組み合わされたこのより強い弾性は、製造物の増強された組織における体積の産出能を提供する。

実施例２
架橋されたＨＡに基づくゲルのいわゆる凝集性構造の重要性−比較検討
２０ｍｇ／ｍＬ（２％）のヒアルロン酸濃度を得るために、実施性１に記載された（いわゆる凝集性の単相構造の）ゲルＡ１を、中性のｐＨ（再生セルロース、分離限度：分子量＝６０ｋＤａ）を有する等浸透生理溶液により透析する。

その後、２００ｍｇ／ｍＬ（２０％）の濃度を得るために、ゲル中にカルシウムヒドロキシアパタイトを添加し、その後にスパチュラによる混合を行う（５ｇのゲルに２分間）。

その後、それにより得られたゲルを、オートクレーブ中で、１２１℃で２０分間無菌化する（＝本発明のゲルＢ’）。

そのヒアルロン酸濃度が２０ｍｇ／ｍＬ（２０％）である、非凝集性又は二相構造を伴う架橋されたヒアルロン酸に基づく商業用のＲｅｓｙｌａｎｅ（登録商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（登録商標）ゲル（バッチ１１３６３−１）を、スパチュラによる混合により、２００ｍｇ／ｍＬ（２０％）のカルシウムヒドロキシアパタイトでドープする（５ｇのゲルに２分間）。

それにより得られたゲルをその後、オートクレーブ中で、１２１℃で２０分間無菌化する（＝ゲルＸ）。

ゲルＡ１及びＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（登録商標）ゲルを、以下の試験に従い比較する：

５ｍＬの純水を含む３０ｍＬのフラスコにおいて、１ｍＬのゲルＡ１をフラスコ１中に導入し、そして１ｍＬのＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（登録商標）ゲルをフラスコ２中に導入する。フラスコを閉じた後に、両フラスコを手動で５秒間混合する。

１０秒後に、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（登録商標）ゲルが完全にバラバラになり／分散し、水溶液中に多数の粒子が形成されることが観察される。したがって実際にＲｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（登録商標）ゲルは、いわゆる非凝集性又は二相構造を有する（ゲルは、水溶液中に迅速に分散する）。

しかしながらゲルＡ１は、水溶液中で常に＜＜ゲルボール＞＞の形態にある。したがって実際にそれは、いわゆる凝集性または単相構造を有する（ゲルは、水溶液中で迅速に分散せず、それは、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（登録商標）ゲルとは異なり、強い凝集性を有する）。

本発明のゲルＢ’及びゲルＸを、以下の試験に従い比較する（図１を参照）：

５ｍＬの純水を含む３０ｍＬのプラスチックのフラスコにおいて、１ｍＬのゲルＢ’をフラスコ１中に導入し、そして１ｍＬのゲルＸをフラスコ２中に導入する。フラスコを閉じた後に、両フラスコを手動で５秒間混合する。

１０秒後に、ゲルＸが完全に完全にバラバラになり／分散し、水溶液中に多数の粒子が形成されることが観察される。ゲルＸは、粒子状で、非凝集性の粘弾性構造を有する。それは、本発明のゲルの特徴に対応しない。美容における用途のための医療行為では、後者は、注射領域の周囲で拡散／移動するだろう。

ゲルＢ’自体は、水溶液中で常に＜＜ゲルボール＞＞ の形態にある。したがってそれは、実際に粒子状で凝集性構造を有する。それは、美容における用途のための医療行為の範囲内において、注射領域の周囲で拡散／移動しない可能性を与える。したがってそれは、組織中のヒドロキシアパタイト粒子の移動に関連する合併症を回避する可能性を与えるのみならず、処置領域の生体材料が移動しないことを考慮すれば、長期に渡りその組織中の体積の生成能を維持することができるため、製造物のより優れた長期間実行能も有する可能性を与える。

実施例３
本発明のゲルの粘弾性の重要性−比較検討
Ｃは、４２０ｍｇの代わりに２００ｍｇのＢＤＤＥを導入することにより、実施例１に記載されたものと同一の手順（ステップ１及び２）に従い調製されたゲルである。

Ｄは、４２０ｍｇの代わりに２９０ｍｇのＢＤＤＥを導入することにより、実施例１に記載されたものと同一の手順（ステップ１及び２）に従い調製されたゲルである。

ゲルＣは、機械的／流動学的な観点から特徴付けられる。流動学的な特徴化を実施するために用いられるレオメーターは、４０ｍｍの平面配置、１，０００マイクロメーターの空隙及び２５℃の分析温度を伴うＡＲ２０００（ＴＡ機器）である。

粘性-対-弾性の比率（ｔａｎデルタ＝Ｇ’’／Ｇ’）の測定は、０．０１〜１００Ｈｚの周波数走査を実施することにより行われる。パラメーターの比較は、１Ｈｚで行われる。

ヒドロキシアパタイト粒子は、ゲルＣにおいて経時的に沈殿する傾向にあることが見られ（サンプルが遠心分離機に移される時によく観察される現象）、それはゲルＤでは観察されない。

この沈殿は、非均一性のヒドロキシアパタイト粒子に基づき製造物を得ることに関与し、それは、針を通してゲルを注射する行為には満足のいくものではないし（針を遮断する）、注射領域での製造物の安全性及び性能にも満足のいくものではない（例えば皮膚の組織におけるいわゆる硬質領域の発生等の合併症の有意なリスク）。

実施例２において示されるように、本発明のゲルの凝集性は重要であるが、後者の粘弾性性質が：
−それらの容器内部でのヒドロキシアパタイト粒子の経時的な沈殿を回避するように、
−注射の間、及び／又は注射領域で２相に分離する製造物（ヒドロキシアパタイト粒子及び架橋されたヒアルロン酸ゲル）を有し、それにより処置される領域中に不均一の帯を生じさせることを回避するように
適合されることが要求される。

したがって、（その粘性に対する）ゲルの弾性性質は、粒子の沈殿を回避することができるように、十分に大きくあるべきである。

実施例４
従来技術の溶液と本発明のゲルの比較
ａ）架橋されていないＨＡ及びヒドロキシアパタイトに基づく製剤。
本文献中に記載されているように、イン・ビボで架橋されていないヒアルロン酸は、１週間に満たない寿命を有する。したがって架橋されていないヒアルロン酸は、非常に迅速に吸収され、またヒドロキシアパタイト粒子の移動を許容せず、長期に渡り阻むので、ヒドロキシアパタイトにより架橋されていないＨＡ溶液は、注目に値するものではない。

ｂ）ヒドロキシアパタイトの水性製剤。
ヒドロキシアパタイト（Ｓ１）の水溶液を調製する（中性ｐＨを有する等浸透生理溶液中で、３０〜５０マイクロメーターから構成される粒度を有する３０％のホスホカルシウムヒドロキシアパタイト）。

５ｍＬの純水を含む３０ｍＬのプラスチックフラスコにおいて、１ｍＬの溶液Ｓ１を導入する。フラスコ中のヒドロキシアパタイト粒子の即時の分散が観察される。

本発明の製剤とは異なり、溶液Ｓ１は、長期に渡り注射領域でヒドロキシアパタイト粒子を維持することができない。

Ｃ）ＣＭＣ及びヒドロキシアパタイトに基づく製剤（図１を参照）
カルボキシメチルセルロール（ＣＭＣ）及びヒドロキシアパタイト（Ｓ３）の水性製剤を調製する（中性ｐＨを有する等浸透生理溶液中で、３０〜５０マイクロメーターから構成される粒度を有する３０％のホスホカルシウムヒドロキシアパタイト、及び２５０，０００Ｄａで２％のＣＭＣ）。

５ｍＬの純水を含む３０ｍＬのプラスチックフラスコにおいて、１ｍＬの製剤Ｓ３を導入する。フラスコを閉じた後に、フラスコを手動で５秒間混合する。

１０秒後に、水溶液中に多数の粒子として、製剤Ｓ３が完全にバラバラになり／分散することが観察される。

本発明の製剤とは異なり、製剤Ｓ３は、長期に渡り注射領域でヒドロキシアパタイト粒子を維持することができない。

Claims (17)

1. 美容目的のために使用される、注射可能な無菌水性製剤であって、凝集性の粘弾性ゲルの形態であり、周波数１Ｈｚでのｔａｎδが０．６０以下であるような粘弾性特性を有し、
   ｉ）１％〜４％（質量／体積）の濃度の、架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１つであって、前記架橋は、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を用いて行われる、前記架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１つ；及び、
   ｉｉ）５％〜６０％（質量／体積）の濃度のヒドロキシアパタイトであって、２００μｍ以下の平均径を有する粒子の形態である、前記ヒドロキシアパタイト
   を含む、前記注射可能な無菌水性製剤。
2. 前記ヒアルロン酸又はその塩の１つの分子量が、２．５×１０⁵ Ｄａ〜４×１０⁶ Ｄａであることを特徴とする、請求項１に記載の注射可能な無菌水性製剤。
3. 湿式加熱で無菌化されたことを特徴とする、請求項１又は２に記載の注射可能な無菌水性製剤。
4. 前記架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１つの濃度が、１％〜３％（質量／体積）であり、好ましくは１．５％〜２．５％（質量／体積）であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の注射可能な無菌水性製剤。
5. 前記ヒドロキシアパタイトの濃度が１０％〜５０％（質量／体積）であり、好ましくは２０％〜４０％（質量／体積）であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の注射可能な無菌水性製剤。
6. 前記ヒドロキシアパタイトの粒子の平均径が５０μｍ以下であり、且つ１０μｍ以上であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の注射可能な無菌水性製剤。
7. １又は複数のセラミック材料をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の注射可能な無菌水性製剤。
8. １又は複数の麻酔剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の注射可能な無菌水性製剤。
9. 前記１又は複数の麻酔剤は：リドカイン単剤若しくはそれとアドレナリンとの組み合わせ；アルチカイン若しくはそれとアドレナリンとの組み合わせ；メピバカイン；プラモカイン；キニソカイン；又は、１若しくは複数のこれらの麻酔剤の塩、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の注射可能な無菌水性製剤。
10. 前記麻酔剤が塩酸リドカインであることを特徴とする、請求項９に記載の注射可能な無菌水性製剤。
11. １又は複数の抗酸化剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の注射可能な無菌水性製剤。
12. 前記１又は複数の抗酸化剤が、ポリオールのファミリーから選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の注射可能な無菌水性製剤。
13. 前記ポリオールが、ソルビトール、グリセロール、マンニトール又はプロピレングリコールを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の注射可能な無菌水性製剤。
14. 体積を充填及び／又は回復するための、及び／又は生体組織を置き換えるために使用される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の注射可能な無菌水性製剤。
15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の注射可能な無菌水性製剤を含むキット。
16. シリンジ、アンプル又はフラスコの形態である、請求項１５に記載のキット。
17. 注射可能な無菌水性製剤を製造するための方法であって、以下のステップ：
    ａ）ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を用いて、ヒアルロン酸又はその塩の１つの鎖間に共有結合を形成することによって、少なくとも１重量％〜４重量％の架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１つを含む第一の混合物を調製し；
    ｂ）前記混合物を精製し；
    ｃ）その後、ヒドロキシアパタイトを５％〜６０％（質量／体積）の濃度で添加し、それを架橋されたヒアルロン酸に基づくゲル中に均一に分散させ；
    ｄ）前記ゲルを変換して、即時使用可能な形態の製造物を得；
    ｅ）湿式加熱にて前記製造物を無菌化すること
    を含む、前記方法。