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JP6221210B2 - Microorganism testing method and apparatus - Google Patents

Microorganism testing method and apparatus Download PDF

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JP6221210B2
JP6221210B2 JP2012199556A JP2012199556A JP6221210B2 JP 6221210 B2 JP6221210 B2 JP 6221210B2 JP 2012199556 A JP2012199556 A JP 2012199556A JP 2012199556 A JP2012199556 A JP 2012199556A JP 6221210 B2 JP6221210 B2 JP 6221210B2
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

本発明は、微生物の検査方法及びその装置に関し、特にバラスト水等に含まれて生存しているプランクトン等の微生物を検出するのに適した微生物の検査方法及びその装置に関する。   The present invention relates to a microorganism testing method and apparatus, and more particularly to a microorganism testing method and apparatus suitable for detecting microorganisms such as plankton that are contained in ballast water and are alive.

荷物を積載していない船舶は、当該船舶を安定させるためにバラスト水を搭載して航行し、荷物を積載する海域において前記バラスト水を排出する。
バラスト水は、通常、搭載する海域と異なる海域に排出されるため、該バラスト水に含まれるプランクトンや細菌等の微生物を本来の生息地以外の海域に運び、生態系を破壊する等の問題を引き起こす虞がある。
In order to stabilize the ship, the ship that is not loaded with cargo travels with ballast water and discharges the ballast water in the sea area where the luggage is loaded.
Ballast water is usually discharged into a sea area different from the sea area on which it is mounted. Therefore, problems such as the destruction of ecosystems by transporting microbes such as plankton and bacteria contained in the ballast water to sea areas other than their original habitats. May cause.

このような問題に対処するため、バラスト水の規制に関する国際的なルールが策定され、「船舶のバラスト水および沈殿物の規制および管理のための国際条約(バラスト水管理条約)」が採択されている。   In order to deal with such problems, international rules regarding the regulation of ballast water have been formulated, and the “International Convention for the Regulation and Management of Ship Ballast Water and Sediment (Ballast Water Management Convention)” has been adopted. Yes.

上記バラスト水管理条約に関連する「バラスト水サンプリングに関するガイドライン(G2)」は、「バラスト水排出基準(D−2)」において、船舶から排出されるバラスト水に含まれて生存している微生物の許容個体数を、例えば、最小サイズが50μm以上の微生物(以下、「Lサイズ生物」という。)については10個/m以下、最小サイズが10μm以上50μm未満の微生物(以下、「Sサイズ生物」という。)については10個/mL以下と、前記微生物の最小サイズにより区分して規定している。 The “Guidelines for Ballast Water Sampling (G2)” related to the above Ballast Water Management Convention is based on the “Ballast Water Emission Standard (D-2)”. For example, for a microorganism having a minimum size of 50 μm or more (hereinafter referred to as “L size organism”), the allowable number of individuals is 10 / m 3 or less, and a microorganism having a minimum size of 10 μm or more and less than 50 μm (hereinafter referred to as “S size organism”). “)” Is defined as 10 pieces / mL or less according to the minimum size of the microorganism.

現在までに、上記バラスト水などの水中で生息している微生物細胞を計測する方法として、特許文献1に記載されたものが知られている。   To date, a method described in Patent Document 1 is known as a method for measuring microbial cells that live in water such as the ballast water.

上記特許文献1に記載の方法によれば、微生物の生細胞に存在する酵素又は補酵素と反応し、細胞内で蛍光物質を生成する化学物質を微生物を含む測定対象試料に作用させ、一定時間混合接触を行った後、細胞内に生成した蛍光物質を励起するに必要な波長の光を試料に照射し、そのとき試料中の個々の微生物から発する光を点の数として計測することを特徴とする微生物細胞の生細胞の計測方法である。   According to the method described in Patent Document 1, a chemical substance that reacts with an enzyme or a coenzyme present in a living cell of a microorganism and generates a fluorescent substance in the cell is allowed to act on a measurement target sample including the microorganism, for a certain period of time. After mixed contact, the sample is irradiated with light of a wavelength necessary to excite the fluorescent substance generated in the cell, and then the light emitted from each microorganism in the sample is measured as the number of points. This is a method for measuring living cells of microbial cells.

これにより、従来の寒天培養方法では10時間〜数十時間必要であった測定時間が10分以内と格段に早くなり、また、生菌の発する光を点として光学的、電気的に検知計測する手段を確立したことにより、生菌の直接自動計数が可能となり殺菌装置のコントロール、製品品質の迅速管理が速やかに行えるといったメリットがある。   Thereby, in the conventional agar culture method, the measurement time required from 10 hours to several tens of hours is dramatically shortened to within 10 minutes, and the light emitted from the living bacteria is detected and measured optically and electrically. By establishing the means, it is possible to directly and automatically count viable bacteria, and there is an advantage that the sterilizer can be controlled and the product quality can be quickly managed.

しかしながら、上記特許文献1記載の方法にあっては、水の種類、温度、染色剤の種類、濃度、染色時間などの相違によって測定値がばらつく問題があり、改善が求められていた。   However, the method described in Patent Document 1 has a problem that the measured value varies due to differences in the type of water, temperature, type of dyeing agent, concentration, dyeing time, and the like, and improvement has been demanded.

特開平3−43069JP 3-43069A

本発明は上記問題点にかんがみ、水の種類、温度、染色剤の種類、濃度、染色時間などの相違によっても測定値がばらつく問題は生じず、安定して測定することが可能な微生物の検査方法及び装置を提供することを技術的課題とする。   In view of the above problems, the present invention does not cause a problem that the measurement value varies due to differences in the type of water, temperature, type of dyeing agent, concentration, dyeing time, etc., and inspection of microorganisms that can be stably measured It is a technical problem to provide a method and apparatus.

上記課題を解決するため本発明は、船舶から排出されるバラスト水に含まれて生存している微生物の許容個体数を、試料として採取した試料容器内の水中に存在する微生物数によって推定し、前記バラスト水の排水基準を満たすか否かを測定するための微生物の検査装置であって、光を透過する材質で形成された試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加して試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段と、該撹拌混合手段により前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を連続的に照射させる光源を備えた励起光源と、該励起光源の励起光により蛍光発光された光を受光して電気信号に変換する受光手段と、該受光手段により変換された電気信号中の前記試料溶液自体の蛍光発光に関する低周波成分のノイズ及び/又は前記電気信号の波形に関する高周波成分のノイズを濾波するフィルタリング手段と、該フィルタリング手段により濾波された電気信号に基づき所定の受光範囲を微生物が通過した時に発生する発光数を検出してカウントし、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段と、該制御手段に電気的に接続されている操作部と、を備え、該操作部は、測定対象となる微生物のサイズを切り換え可能な設定ボタンを含むという技術的手段を講じた。
In order to solve the above problems, the present invention estimates the allowable number of living microorganisms contained in the ballast water discharged from the ship by the number of microorganisms present in the water in the sample container collected as a sample, A microorganism testing apparatus for measuring whether or not the ballast water drainage standard is satisfied, and a sample solution and a fluorescent staining reagent are added to a sample container formed of a light transmitting material, and the sample solution is stirred. -An agitation and mixing means for mixing; an excitation light source comprising a light source for continuously irradiating the irradiated surface of the sample container while exciting the sample solution by the agitation and mixing means; and excitation of the excitation light source A light receiving means for receiving the light fluorescently emitted by the light and converting the light into an electric signal; and noise and / or the electric power of low frequency components relating to the fluorescence emission of the sample solution itself in the electric signal converted by the light receiving means. A filtering means for filtering the noise of a high frequency component for the signal of the waveform, a predetermined receiving range on the basis of the electrical signal filtered by said filtering means detects the emission number that occurs when the microorganism has passed and counted, the light emitting number Control means for calculating the amount of microorganisms contained in the sample in the sample container, and an operation part electrically connected to the control means, and the operation part determines the size of the microorganism to be measured. Technical measures were taken to include switchable setting buttons.

また、請求項2記載の発明は、前記フィルタリング手段が、ハイパスフィルタとローパスフィルタとを連結したバンドパスフィルタであることを特徴とする。   The invention according to claim 2 is characterized in that the filtering means is a band-pass filter in which a high-pass filter and a low-pass filter are connected.

そして、請求項3記載の発明は、前記励起光源が、前記試料容器の被照射面に対して直交する励起光が照射されるように配置する一方、前記受光手段が、前記励起光源の励起光と直交した角度で蛍光発光を受光する受光面が配置されていることを特徴とする。   The invention according to claim 3 is arranged such that the excitation light source is irradiated with excitation light orthogonal to the irradiated surface of the sample container, while the light receiving means is excitation light of the excitation light source. A light receiving surface for receiving fluorescent light emission at an angle orthogonal to is arranged.

請求項4記載の発明は、前記受光手段と前記試料容器との間に、観察範囲を規制するためのスリットを設けたことを特徴とする。   The invention described in claim 4 is characterized in that a slit for regulating an observation range is provided between the light receiving means and the sample container.

さらに、請求項5記載の発明は、前記励起光源と前記試料容器との間に、光源からの拡散光を一面に向かって同じ角度で均一に照射される平行光に変換する平行光変換手段を設けたことを特徴とする。   Furthermore, the invention described in claim 5 is a parallel light conversion means for converting the diffused light from the light source into parallel light that is uniformly irradiated at the same angle toward one surface between the excitation light source and the sample container. It is provided.

そして、請求項6記載の発明は、前記平行光変換手段が、所定厚さの平板に所定径のねじ切孔を穿設して形成したものであることを特徴とする。   The invention according to claim 6 is characterized in that the parallel light converting means is formed by drilling a threaded hole having a predetermined diameter in a flat plate having a predetermined thickness.

請求項7記載の発明は、前記平行光変換手段が、凸レンズで形成したものであることを特徴とする。   The invention according to claim 7 is characterized in that the parallel light converting means is formed of a convex lens.

請求項8記載の発明は、船舶から排出されるバラスト水に含まれて生存している微生物の許容個体数を、試料として採取した試料容器内の水中に存在する微生物数によって推定し、前記バラスト水の排水基準を満たすか否かを測定するための微生物の検査方法であって、測定対象となる微生物のサイズを設定するサイズ設定工程と、試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加した試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合工程と、前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を連続的に照射する励起工程と、前記励起光により蛍光発光された光を受光して電気信号に変換する受光工程と、該受光工程により変換された電気信号中の前記試料溶液自体の蛍光発光に関する低周波成分のノイズ及び/又は前記電気信号の波形に関する高周波成分のノイズを濾波するフィルタリング工程と、該フィルタリング工程により濾波された電気信号に基づき所定の受光範囲を微生物が通過した時に発生する発光数を検出し、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する微生物数推定工程と、を備えたものである。
The invention according to claim 8 estimates the allowable number of living microorganisms contained in the ballast water discharged from the ship based on the number of microorganisms existing in the water in the sample container collected as a sample, and the ballast A method for inspecting microorganisms for measuring whether or not a water drainage standard is satisfied, a size setting step for setting the size of a microorganism to be measured, and a sample in which a sample and a fluorescent staining reagent are added to a sample container A stirring and mixing step of stirring and mixing the solution; an excitation step of continuously irradiating the irradiated surface of the sample container with the excitation light while stirring the sample solution; and receiving light emitted by the excitation light. A light receiving step for converting the signal into an electric signal, and a low frequency component noise and / or a high frequency for the waveform of the electric signal in the fluorescence of the sample solution itself in the electric signal converted by the light receiving step. A filtering step of filtering the noise components, a predetermined receiving range on the basis of the electrical signal filtered by said filtering step detects the emission number that occurs when the microorganism has passed, the sample in the sample container from the light emitting Number And a microorganism number estimation step for calculating the amount of microorganisms contained.

操作者が試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加した後、撹拌混合手段を作動させて試料溶液の撹拌・混合を行い、次いで、励起光源及び受光手段を作動させると、微生物が蛍光発光してその受光量が受光手段により電気信号に変換されて取り込まれる。そして、制御手段では、当該電気信号に基づいて発光数が検出され、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量が算出されるようになる。このとき、受光手段には、微生物とは異なる海水成分の蛍光発光や、蛍光染色試薬の加水分解などの影響により、電気信号の外乱が発生して受光手段に取り込まれ、制御手段においては、微生物量の測定誤差や、計測誤差が生じる懸念がある。
本発明によれば、電気信号が制御手段に取り込まれる前に、フィルタリング手段によって外乱が濾波されるので、微生物の蛍光発光の受光量に相応する電気信号と外乱とを明確に区別することができる。これにより、微生物量の測定誤差が生じることはなく、測定値がばらつく問題も生じず、安定して測定することが可能となる。
After the operator adds the sample and the fluorescent staining reagent to the sample container, the agitation and mixing means are activated to agitate and mix the sample solution.Then, when the excitation light source and light receiving means are activated, the microorganisms emit fluorescence. The amount of received light is converted into an electrical signal by the light receiving means and captured. The control means detects the number of luminescence based on the electric signal, and calculates the amount of microorganisms contained in the sample in the sample container from the number of luminescence. At this time, the light receiving means generates a disturbance of the electric signal due to the influence of the fluorescence emission of seawater components different from the microorganisms or the hydrolysis of the fluorescent staining reagent, and is taken into the light receiving means. There is a concern that quantity measurement errors and measurement errors may occur.
According to the present invention, since the disturbance is filtered by the filtering means before the electric signal is taken into the control means, it is possible to clearly distinguish the electric signal corresponding to the amount of received fluorescence emission of the microorganism from the disturbance. . Thereby, the measurement error of the amount of microorganisms does not occur, the problem that the measured value does not vary does not occur, and the measurement can be performed stably.

本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の全体を示す斜視図である。It is a perspective view showing the whole microbe inspection device concerning one embodiment of the present invention. 本発明の一実施形態に係る測定部の概略平断面図である。It is a general | schematic plane sectional view of the measurement part which concerns on one Embodiment of this invention. 本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の全体構成を示すブロック図である。1 is a block diagram showing the overall configuration of a microorganism testing apparatus according to an embodiment of the present invention. 本発明のフィルタリング手段の回路の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the circuit of the filtering means of this invention. 本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の測定フローを示すフロー図である。It is a flowchart which shows the measurement flow of the microbe inspection apparatus which concerns on one Embodiment of this invention. 平行光変換手段の一実施形態を示す概略断面図である。It is a schematic sectional drawing which shows one Embodiment of a parallel light conversion means. スリットの有無により観察面が狭まることを示す作用図である。It is an effect | action figure which shows that an observation surface narrows with the presence or absence of a slit. 微生物の個体数と光電子増倍管(PMT)の受光カウントとの相関関係を示すグラフである。It is a graph which shows the correlation with the number of microorganisms and the light reception count of a photomultiplier tube (PMT). 微生物の生死によって検出が可能か否かの試験を示すグラフである。It is a graph which shows the test of whether detection is possible by the life and death of microorganisms. フィルタリング手段を装着する前の取得電圧の波形を示すグラフである。It is a graph which shows the waveform of the acquisition voltage before mounting | wearing with a filtering means. フィルタリング手段を装着した後の取得電圧の波形を示すグラフである。It is a graph which shows the waveform of the acquisition voltage after mounting | wearing with a filtering means.

本発明を実施するための形態を図面を参照しながら説明する。図1は本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の全体を示す斜視図であり、図2は本発明の一実施形態に係る測定部の概略平断面図であり、図3は本発明の一実施形態に係る微生物の検査装置の全体構成を示すブロック図である。   A mode for carrying out the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a perspective view showing an entire microorganism testing apparatus according to an embodiment of the present invention, FIG. 2 is a schematic plan sectional view of a measuring unit according to an embodiment of the present invention, and FIG. It is a block diagram which shows the whole structure of the microbe inspection apparatus which concerns on one Embodiment.

図1及び図2に示すように本発明の検査装置1は、CPU基板などの制御機構を内蔵して測定結果等の情報処理作業や統計処理作業などを行う本体部2と、該本体部2に並設した操作ボタン等の配置構成からなる操作部3と、前記測定結果等を表示するために液晶パネル等で形成された表示部4と、光を透過する透明な材質(例えば、ガラスや石英やアクリル樹脂等)で形成された試料容器5を収容し、試料溶液S中の微生物数を光学的に計数する測定部6とを主要部として構成されている。符号7は試料容器5内に収容された試料溶液Sを撹拌するための回転子であり、該回転子7は前記試料容器5内に試料溶液S及び発光試薬とともに収容し、前記試料容器5を測定部6に収容したときに、該測定部6内に内蔵されたマグネティックスターラ27により回転駆動される構成となっている。これにより、試料容器5内の試料と発光試薬とからなる試料溶液Sを所定温度で撹拌混合しながら試料溶液S中の微生物数を計数することができ、撹拌しないで静置して計測するものと比較すれば、極めて短時間で微生物が明るく発光し、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で計測することが可能となる。   As shown in FIGS. 1 and 2, an inspection apparatus 1 according to the present invention includes a main body 2 that incorporates a control mechanism such as a CPU board and performs information processing work such as measurement results and statistical processing work, and the main body 2 A display unit 4 formed of a liquid crystal panel or the like for displaying the measurement results, and a transparent material that transmits light (for example, glass or The main part is a measurement unit 6 that accommodates a sample container 5 formed of quartz, acrylic resin, or the like, and optically counts the number of microorganisms in the sample solution S. Reference numeral 7 denotes a rotor for stirring the sample solution S accommodated in the sample container 5, and the rotor 7 is accommodated in the sample container 5 together with the sample solution S and the luminescent reagent. When accommodated in the measuring unit 6, the magnetic stirrer 27 built in the measuring unit 6 is rotationally driven. Thereby, the number of microorganisms in the sample solution S can be counted while stirring and mixing the sample solution S composed of the sample and the luminescent reagent in the sample container 5 at a predetermined temperature, and the sample solution S can be measured without being stirred. Compared with, the microorganisms emit light brightly in a very short time, and the amount of microorganisms in the ballast water can be measured easily and in a short time.

図1に示す検査装置1の寸法は、幅が300mm、奥行が300mm、高さが100mm、重量は約2〜4kgの範囲に形成されており、手持ちトランク(図示せず)等に収容して、どこにでも持ち運び可能であり、船舶内での測定や、屋外での測定が可能である。
そして、光を透過する透明な材質で形成された試料容器5は、底面が50mm×50mm、高さが60mmの角柱状に形成され、水位が40mmのときの内容量が100ml(ミリリットル)に設定されている。試料容器5はこのような角柱状に限定されることはなく、内容量を100ml(ミリリットル)程度確保することができれば、円柱状であっても、立方体であってもよい。
The dimensions of the inspection apparatus 1 shown in FIG. 1 are 300 mm in width, 300 mm in depth, 100 mm in height, and about 2 to 4 kg in weight, and are accommodated in a handheld trunk (not shown) or the like. It can be carried anywhere and can be measured inside a ship or measured outdoors.
The sample container 5 formed of a transparent material that transmits light is formed in a prismatic shape having a bottom surface of 50 mm × 50 mm and a height of 60 mm, and the internal volume when the water level is 40 mm is set to 100 ml (milliliter). Has been. The sample container 5 is not limited to such a prism shape, and may be cylindrical or cubic as long as the internal volume can be secured about 100 ml (milliliter).

前記測定部6は、図1、図2及び図3に示すように、試料容器5を収容して保持する試料容器収容部9と、前記試料容器5に向けて励起光を照射する光源部13と、該光源部13から照射された励起光により試料容器5内で漂って発光している微生物を観察するための受光部19とを備えている。そして、受光部19からは、フィルタリング手段34を介してCPU基板23に電気的に連絡されている。CPU基板23では、受光部19からの電気信号により試料溶液S中の微生物数を計数し、測定結果等の情報処理作業や統計処理作業などを行うことができる。   As shown in FIGS. 1, 2, and 3, the measurement unit 6 includes a sample container storage unit 9 that stores and holds the sample container 5, and a light source unit 13 that emits excitation light toward the sample container 5. And a light receiving unit 19 for observing microorganisms drifting in the sample container 5 by the excitation light irradiated from the light source unit 13. The light receiving unit 19 is electrically connected to the CPU substrate 23 via the filtering unit 34. In the CPU substrate 23, the number of microorganisms in the sample solution S can be counted by an electrical signal from the light receiving unit 19, and information processing work such as measurement results, statistical processing work, and the like can be performed.

前記試料容器収容部9は、前記試料容器5の少なくとも二面を取り囲む保持プレート8a,8bにより形成され、前記光源部13からの光の照射を遮断しないように前記試料容器5を収容保持するものである。
そして、図2に示すように、試料容器5の被照射面Gに対して法線APによる励起光が入射されるよう光源部13が配置される。前記光源部13は、前記試料容器収容部9近傍に配置されたLED光源10と、該LED光源10の前面に配置され、拡散光を平行光に変換する平行光変換手段11(LEDは光源からランダム方向に拡散して照射される光であるため、一面に向かって同じ角度で均一に光線が当たる平行光に変換するもの)と、スリット状の平行光からなる励起光を試料容器5に照射する励起光用バンドパスフィルタ12とを備えている。
The sample container storage unit 9 is formed by holding plates 8a and 8b surrounding at least two surfaces of the sample container 5, and stores and holds the sample container 5 so as not to block light irradiation from the light source unit 13. It is.
Then, as shown in FIG. 2, the light source unit 13 is arranged so that excitation light from the normal line AP is incident on the irradiated surface G of the sample container 5. The light source unit 13 includes an LED light source 10 disposed in the vicinity of the sample container storage unit 9 and a parallel light conversion unit 11 (LED is a light source) that is disposed in front of the LED light source 10 and converts diffused light into parallel light. Since the light is diffused and irradiated in a random direction, the sample container 5 is irradiated with excitation light consisting of parallel light that is uniformly irradiated with light rays at the same angle toward one surface) and slit-shaped parallel light. And an excitation light band-pass filter 12.

図6は平行光変換手段11の一実施形態を示す概略断面図である。図6(a)に示す例は、平行光変換手段11として所定厚さの平板31に所定径のねじ切孔32を穿設して形成したものであり、光路長に合わせて平板31の厚さLとねじ切孔の孔径とが適宜設定されている。これにより、LED光源10から照射される入射角度θの散乱光は、ねじ切孔32を通過する際には平行光に変換されるものとなる。図6(a)に示す例では、θとLとの最適条件をSN比の試験により決定しており、例えば、M3(ネジ孔の外径)×0.5(ピッチ)とすれば、θが9.5°、Lが15mmのときが最適であった。   FIG. 6 is a schematic sectional view showing an embodiment of the parallel light converting means 11. In the example shown in FIG. 6A, the parallel light converting means 11 is formed by drilling a threaded hole 32 having a predetermined diameter in a flat plate 31 having a predetermined thickness, and the thickness of the flat plate 31 is adjusted to the optical path length. L and the hole diameter of the threaded hole are appropriately set. Thereby, the scattered light of the incident angle θ irradiated from the LED light source 10 is converted into parallel light when passing through the threaded hole 32. In the example shown in FIG. 6A, the optimum condition of θ and L is determined by the SN ratio test. For example, if M3 (outer diameter of screw hole) × 0.5 (pitch), θ Was 9.5 ° and L was 15 mm.

図6(b)に示す平行光変換手段11は、LED光源10の前面に凸レンズ33を設けたものであり、LED光源10から照射された散乱光は、凸レンズ33内を通過して外部に出射する際には平行光に変換されるものとなる。   The parallel light conversion means 11 shown in FIG. 6B is provided with a convex lens 33 on the front surface of the LED light source 10, and the scattered light emitted from the LED light source 10 passes through the convex lens 33 and is emitted to the outside. In this case, the light is converted into parallel light.

なお、本実施形態の光源部13は、光源としてLED光源10を用いたが、微生物に含まれる蛍光物質を励起させることができれば、LED光源10に限らず、平行光の照射が可能な平行光LED光源やレーザ光源や電球を採用することもできる。言うまでもないが、平行光の照射が可能な平行光LEDやレーザ光源を採用するときは、前述の平行光変換手段11は不要となる。   Note that the light source unit 13 of the present embodiment uses the LED light source 10 as a light source. However, the parallel light that can be irradiated with parallel light is not limited to the LED light source 10 as long as it can excite the fluorescent substance contained in the microorganism. An LED light source, a laser light source, and a light bulb can also be employed. Needless to say, when a parallel light LED or a laser light source capable of irradiating parallel light is employed, the above-mentioned parallel light conversion means 11 is not necessary.

そして、図2に示すように、前記受光部19は、光源部13からの法線APによる励起光と直交した角度を持って受光面Fが配置されるように設けられる。また、受光部19は前記LED光源10から試料容器5に向けて励起光が照射される平行光に対し、これと直交する光軸で蛍光が受光されるように配置構成した光電子増倍管(PMT)14と、該光電子増倍管(PMT)14の前面に配置した蛍光用バンドパスフィルタ15と、該蛍光用バンドパスフィルタ15の前面に配置した集光用レンズ16と、該集光用レンズ16の前面に配置したスリット17と、該スリット17と前記試料容器5との間隙に設置され、微生物に含まれる蛍光物質を励起させ、これにより発光した蛍光を集光し結像させるためのリレーレンズ18と、を備えたものである。   As shown in FIG. 2, the light receiving unit 19 is provided such that the light receiving surface F is arranged at an angle orthogonal to the excitation light by the normal line AP from the light source unit 13. The light-receiving unit 19 is a photomultiplier tube arranged and configured to receive fluorescence with an optical axis orthogonal to the parallel light irradiated with excitation light from the LED light source 10 toward the sample container 5 ( PMT) 14, a fluorescent bandpass filter 15 disposed in front of the photomultiplier tube (PMT) 14, a condensing lens 16 disposed in front of the fluorescent bandpass filter 15, and the condensing A slit 17 disposed on the front surface of the lens 16 and a gap between the slit 17 and the sample container 5 are used to excite a fluorescent substance contained in microorganisms, thereby condensing and imaging the emitted fluorescence. And a relay lens 18.

前記光電子増倍管(PMT)14と試料容器5との間のスリット17は、観察面をスリット状に狭めるものである。すなわち、図7に示すように、(a)スリットなしの状態では、受光面Fが円で形成されるバックグラウンドを監視するのに対し、(b)スリットありの状態では、受光面Fが斜線を除いた縦長スリットで形成されるバックグラウンドを監視することになる。したがって、受光面Fの受光面積が(b)のように狭まる結果、ノイズとなるバックグラウンドの蛍光発光の面積も狭まるため、バックグラウンドの蛍光発光に対する微生物の蛍光発光の信号の比が向上し、微生物の蛍光発光の検出精度が向上するのである。   The slit 17 between the photomultiplier tube (PMT) 14 and the sample container 5 narrows the observation surface in a slit shape. That is, as shown in FIG. 7, (a) in the state without slits, the background on which the light receiving surface F is formed in a circle is monitored, while (b) in the state with slits, the light receiving surface F is shaded. The background formed by the vertically long slits except for is monitored. Therefore, as a result of the light receiving area of the light receiving surface F being narrowed as shown in (b), the area of background fluorescent light emission, which becomes noise, is also narrowed. This improves the detection accuracy of the fluorescence emission of microorganisms.

なお、受光部19は、受光センサとして光電子増倍管(PMT)14を用いた例を示したが、これに限定されることはなく、シリコンフォトダイオード(SiPD)や、アヴァランシェフォトダイオード(APD)など、光電子増倍管(PMT)と同様に微生物に含まれる蛍光物質の発光を検知することができる各種の光検出器を採用することができる。   Although the light receiving unit 19 uses the photomultiplier tube (PMT) 14 as the light receiving sensor, the light receiving unit 19 is not limited to this, and is not limited to this, but a silicon photodiode (SiPD) or an avalanche photodiode (APD). As in the case of a photomultiplier tube (PMT), various types of photodetectors that can detect the emission of a fluorescent substance contained in a microorganism can be employed.

さらに、図3を参照して、本実施形態の検査装置1の電気的な制御構成を説明する。本体部2を形成する筐体20内中央には、AC電源21や二次電池22から電源の供給を受けて、前記光電子増倍管(PMT)14により光から電気に変換された出力信号を解析したり、任意の輝度範囲以上にあるか否かを判定したり、任意の輝度の信号をパルスカウントしたり、前記LED光源10のオン・オフ制御などを行うCPU基板23が配置されている。前記AC電源21と前記CPU基板23との間には、AC/DC変換器24を介在させてある。   Furthermore, with reference to FIG. 3, the electrical control structure of the inspection apparatus 1 of this embodiment is demonstrated. In the center of the housing 20 forming the main body 2, an output signal converted from light to electricity by the photomultiplier tube (PMT) 14 is supplied with power from an AC power source 21 or a secondary battery 22. A CPU board 23 is provided for performing analysis, determining whether or not it is within an arbitrary luminance range, pulse counting an arbitrary luminance signal, and controlling on / off of the LED light source 10. . An AC / DC converter 24 is interposed between the AC power source 21 and the CPU board 23.

前記CPU基板23には、前記光電子増倍管(PMT)14、前記LED光源10、読み出し書き込み用記憶部となるRAM25及び読み出し専用記憶部となるROM26がそれぞれ電気的に接続される。また、図1に示す操作部3の電源ボタン3a、測定開始ボタン3b、外部出力ボタン3c及び設定ボタン3dが電気的に接続されている。そして、前記電源ボタン3aの押下によりオン・オフの切換制御が行われ、前記測定開始ボタン3bの押下により測定が開始され、外部出力ボタン3cの押下により外部のプリンタやパソコンへデータの転送が行われ、設定ボタン3dの押下により、測定の種類の切換(Lサイズ微生物の測定かSサイズ微生物の測定かの切換)や、判定基準の設定の変更や、しきい値の設定の変更や、測定時間の設定の変更を行うことができる構成となっている。   The CPU substrate 23 is electrically connected to the photomultiplier tube (PMT) 14, the LED light source 10, a RAM 25 serving as a read / write storage unit, and a ROM 26 serving as a read-only storage unit. Further, the power button 3a, the measurement start button 3b, the external output button 3c, and the setting button 3d of the operation unit 3 shown in FIG. 1 are electrically connected. Then, on / off switching control is performed by pressing the power button 3a, measurement is started by pressing the measurement start button 3b, and data is transferred to an external printer or personal computer by pressing the external output button 3c. By pressing the setting button 3d, the measurement type is switched (L size microorganism measurement or S size microorganism measurement is switched), the judgment reference setting is changed, the threshold value setting is changed, and the measurement is performed. The time setting can be changed.

そのほか、前記CPU基板23には、前記回転子7を磁力により回転させるマグネティックスターラ27、液晶パネル等で形成された表示部4、CPU基板23など制御機器の冷却用ファン28、及びRS−232Cなど外部出力端子29を接続してある。   In addition, the CPU board 23 includes a magnetic stirrer 27 that rotates the rotor 7 by magnetic force, a display unit 4 formed of a liquid crystal panel, a cooling fan 28 for a control device such as the CPU board 23, and RS-232C. An external output terminal 29 is connected.

図4は本発明の要部となるフィルタリング手段の回路の一例を示す図である。図4に示すように、光電子増倍管(PMT)14とCPU基板23との間には、演算増幅器35、ハイパスフィルタ回路36及びローパスフィルタ回路37を電気的に接続している。前記演算増幅器35は、前記光電子増倍管(PMT)14により受光した受光量に応じて生成された出力電流を電圧に変換し、微小な電流であっても検出を可能とするものである。また、ハイパスフィルタ回路36は、入力信号のうち、所定の周波数より高い周波数の成分を減衰させず、所定の周波数より低い周波数の成分を逓減させるフィルタリング手段である。一方、ローパスフィルタ回路37は、入力信号のうち、所定の周波数より低い周波数の成分を減衰させず、所定の周波数より高い周波数の成分を逓減させるフィルタリング手段である。そして、前記ハイパスフィルタ回路36とローパスフィルタ回路37とを連結すると、必要な範囲の周波数のみを通過させるバンドパスフィルタ回路38となる。   FIG. 4 is a diagram showing an example of a circuit of the filtering means which is a main part of the present invention. As shown in FIG. 4, an operational amplifier 35, a high-pass filter circuit 36, and a low-pass filter circuit 37 are electrically connected between the photomultiplier tube (PMT) 14 and the CPU substrate 23. The operational amplifier 35 converts the output current generated according to the amount of light received by the photomultiplier tube (PMT) 14 into a voltage, and can detect even a minute current. The high-pass filter circuit 36 is a filtering unit that reduces the frequency component lower than the predetermined frequency without attenuating the frequency component higher than the predetermined frequency in the input signal. On the other hand, the low-pass filter circuit 37 is a filtering unit that reduces the frequency component higher than the predetermined frequency without attenuating the frequency component lower than the predetermined frequency in the input signal. When the high-pass filter circuit 36 and the low-pass filter circuit 37 are connected, a band-pass filter circuit 38 that passes only a necessary frequency range is obtained.

前記演算増幅器35は、オペアンプOPと抵抗Rとを有する。そして、前記ハイパスフィルタ回路36及びローパスフィルタ回路37は、互いに電気的に接続された抵抗R1,R2とコンデンサC1,C2とをそれぞれ有している。これにより、演算増幅器35により光電子増倍管(PMT)14からの出力電流が電圧に変換され、次いで、バンドパスフィルタ回路38の入力側から信号Vin(t)を入力すると、出力側では外乱となる電気信号が濾波された信号Vout(t)が出力されることになる。この濾波された信号Vout(t)をCPU基板23に入力すれば、微生物の蛍光発光の受光量に相応する電気信号と外乱とがすでに明確に区別されているから、微生物量の測定誤差が生じることはなく、測定値がばらつく問題も生じず、安定して測定することが可能となる。   The operational amplifier 35 has an operational amplifier OP and a resistor R. The high-pass filter circuit 36 and the low-pass filter circuit 37 have resistors R1 and R2 and capacitors C1 and C2 that are electrically connected to each other. As a result, the output current from the photomultiplier tube (PMT) 14 is converted into a voltage by the operational amplifier 35. Next, when the signal Vin (t) is input from the input side of the band-pass filter circuit 38, disturbance is generated on the output side. A signal Vout (t) obtained by filtering the electrical signal is output. If this filtered signal Vout (t) is input to the CPU board 23, an electrical signal corresponding to the amount of received fluorescence of the microorganism and the disturbance are already clearly distinguished, so that a measurement error of the amount of microorganism occurs. Therefore, there is no problem that the measured values vary, and stable measurement is possible.

図5は測定フローを示すフロー図であり、図1乃至図5を参照して上記構成における作用を説明する。   FIG. 5 is a flowchart showing a measurement flow, and the operation of the above configuration will be described with reference to FIGS.

まず、作業者はピペット等を使用し、温度20℃程度のバラスト水から100ml(ミリリットル)を試料として採取し、試料容器5に投入する(図5のステップ1)。次に、試料容器5内に蛍光染色試薬を添加する(図5のステップ2)。この蛍光染色試薬は一般的に知られているカルセインAM(Calcein-AM,ドイツ国Promocell GMBH 社製)や、FDAなどを使用することができる。カルセインAMは、植物性プランクトンに対して染色しやすい傾向がある一方、FDAは、動物性プランクトンに対して染色しやすい傾向があり、このため、染色試薬による染色を、カルセインAMとFDAとを混合した試薬により染色を行うと、試薬の染色時間を短くして、染色に要する時間を従来の半分にすることが可能となる。そして、作業者は試料容器5に回転子7を投入後、検査装置1の測定部6に収容し、測定部6の蓋30を被着することで測定準備が完了する。ここで、電源ボタン3aを押下すれば、該測定部6内に内蔵されたマグネティックスターラ27の駆動により回転子7が回転し、試料溶液Sが撹拌されることになる(図5のステップ3)。   First, the operator uses a pipette or the like to collect 100 ml (milliliter) as a sample from ballast water at a temperature of about 20 ° C. and put it into the sample container 5 (step 1 in FIG. 5). Next, a fluorescent staining reagent is added into the sample container 5 (step 2 in FIG. 5). As this fluorescent staining reagent, generally known calcein AM (Calcein-AM, manufactured by Promocell GMBH, Germany), FDA or the like can be used. Calcein AM tends to stain phytoplankton, while FDA tends to stain zooplankton. Therefore, staining with a staining reagent is mixed with calcein AM and FDA. When dyeing is performed with the reagent, it is possible to shorten the dyeing time of the reagent and halve the time required for dyeing. Then, after the operator puts the rotor 7 into the sample container 5, the operator accommodates it in the measurement unit 6 of the inspection apparatus 1 and attaches the lid 30 of the measurement unit 6 to complete the measurement preparation. Here, when the power button 3a is pressed, the rotor 7 is rotated by driving the magnetic stirrer 27 built in the measuring unit 6, and the sample solution S is stirred (step 3 in FIG. 5). .

次に、作業者は操作部の測定開始ボタン3bの押下により、所定時間後LED光源10が点灯し、励起光用バンドパスフィルタ12を透過した光が試料容器5に照射されることになる。このとき、例えば、波長特性として450nm〜490nmの波長の光が照射され、試料容器5内の検体(微生物)が蛍光発光することになる(図5のステップ4)。そして、この蛍光が蛍光用バンドパスフィルタ15を透過して光電子増倍管(PMT)14により検知されることになる(図5のステップ5)。   Next, when the operator depresses the measurement start button 3b of the operation unit, the LED light source 10 is turned on after a predetermined time, and the light transmitted through the excitation light band-pass filter 12 is irradiated to the sample container 5. At this time, for example, light having a wavelength of 450 nm to 490 nm is irradiated as wavelength characteristics, and the specimen (microorganism) in the sample container 5 emits fluorescence (step 4 in FIG. 5). This fluorescence passes through the fluorescence band-pass filter 15 and is detected by the photomultiplier tube (PMT) 14 (step 5 in FIG. 5).

光電子増倍管(PMT)14は、光電効果の利用により光エネルギが電気エネルギに変換されるとともに、電流増幅機能が付加され、高感度に蛍光発光を検知することができる。検知した電気信号は、演算増幅器35により増幅されてバンドパスフィルタ回路36に入力され、外乱となる電気信号が濾波された信号が出力される(図5のステップ6)。そして、外乱となる電気信号が濾波された信号はCPU基板23に送られ、一定しきい値以上の受光波形がカウントされることになる(図5のステップ7)。   The photomultiplier tube (PMT) 14 converts light energy into electrical energy by utilizing the photoelectric effect, and has a current amplification function, and can detect fluorescence emission with high sensitivity. The detected electrical signal is amplified by the operational amplifier 35 and input to the band-pass filter circuit 36, and a signal obtained by filtering the electrical signal that becomes a disturbance is output (step 6 in FIG. 5). Then, the signal obtained by filtering the electric signal that becomes a disturbance is sent to the CPU board 23, and the received light waveform exceeding a certain threshold value is counted (step 7 in FIG. 5).

さらに、CPU基板23では、受光波形カウント値から前記試料容器5内の水100ml(ミリリットル)中に存在する微生物数を推定して、排水基準を満たすか否かを表示部4に表示されるのである(図5のステップ8)。   Further, the CPU board 23 estimates the number of microorganisms present in 100 ml (milliliter) of water in the sample container 5 from the received light wave count value, and displays on the display unit 4 whether or not the drainage standard is satisfied. Yes (step 8 in FIG. 5).

以下、本発明の実施例について説明する。まず、上記実施形態の微生物の検査装置の検査精度の確認試験を行った。   Examples of the present invention will be described below. First, a confirmation test of the inspection accuracy of the microorganism inspection apparatus of the above embodiment was performed.

微生物の個体数と光電子増倍管(PMT)の受光カウントとの相関関係を調査した。S型シオミズツボワムシ(最小サイズ約100μm=Lサイズ生物)を複数の試料容器5(100mL容量)にそれぞれ5個体、10個体、50個体、100個体、1000個体と個体別に収容し、それぞれを蛍光染色試薬FDA(濃度0.01[ミリmol/リットル])で染色した。その結果、収容した微生物の個体数に応じて、波形のカウント数が増加してきており、5個体、10個体、50個体及び100個体の5サンプルについては直線的に応答した(図8(a)、図8(b)参照)。このため、得られた波形のカウント数からバラスト水100mL中に存在する微生物の個体数が推定できる。   The correlation between the microbial population and the photomultiplier tube (PMT) light reception count was investigated. S-type scallop worms (minimum size of about 100 μm = L size organisms) are accommodated individually in a plurality of sample containers 5 (100 mL capacity) as 5 individuals, 10 individuals, 50 individuals, 100 individuals, 1000 individuals, Staining was performed with a fluorescent staining reagent FDA (concentration 0.01 [millimol / liter]). As a result, the number of waveform counts increased in accordance with the number of contained microorganisms, and 5 samples of 5, 10, 50 and 100 responded linearly (FIG. 8 (a)). FIG. 8 (b)). Therefore, the number of microorganisms present in 100 mL of ballast water can be estimated from the obtained waveform count.

微生物の生死によって検出が可能か否かの試験を行った(図9(a)〜(d)参照)。熱により殺滅処理(60℃、30分の加熱)したS型シオミズツボワムシ(最小サイズ約100μm=Lサイズ生物)を、蛍光染色試薬FDA(濃度0.01[ミリmol/リットル])で染色する。殺滅処理1時間後、殺滅処理20時間後、殺滅処理5日後の3サンプルを作成してそれぞれ測定した。その結果、殺滅処理したものはいずれも一定のしきい値以上の波形が発見されず、殺滅処理せずに微生物が存在するサンプルと殺滅処理して微生物が存在しないサンプルとの判別が可能である。   A test was conducted as to whether or not detection was possible due to the life and death of microorganisms (see FIGS. 9A to 9D). S-type rotifer (minimum size of about 100 μm = L size organism) that has been killed by heat (heated at 60 ° C. for 30 minutes) with a fluorescent staining reagent FDA (concentration 0.01 [millimol / liter]) Stain. Three samples were prepared 1 hour after the killing treatment, 20 hours after the killing treatment, and 5 days after the killing treatment. As a result, no waveform with a certain threshold value or more was found in any of the killed samples, and it was possible to discriminate between samples that contained microorganisms without killing and samples that did not contain microorganisms. Is possible.

前記光電子増倍管(PMT)14とCPU基板23との間に、フィルタリング手段を装着する前と装着した後の取得電圧の波形を比較する。
図10はフィルタリング手段を装着する前の取得電圧の波形である。図10(a)に示す取得電圧の波形は、外乱(バックグラウンド成分約0.9V波形)と、しきい値を超えた生きた微生物と確認できる明確な山と、しきい値を超えない不明瞭な山との3つが混在したものとなっている。また、図10(b)に示す取得電圧の波形は、外乱(バックグラウンド成分約1.4V波形)と、しきい値を超えた生きた微生物と確認できる明確な山との2つが混在したものとなっている。さらに、図10(c)に示す取得電圧の波形は、外乱(バックグラウンド成分約0.4V波形)と、しきい値を超えない不明瞭な山との2つが混在したものとなっている。
Between the photomultiplier tube (PMT) 14 and the CPU substrate 23, the waveform of the acquired voltage before and after mounting the filtering means is compared.
FIG. 10 shows the waveform of the acquired voltage before the filtering means is attached. The waveform of the acquired voltage shown in FIG. 10 (a) is a disturbance (background component about 0.9V waveform), a clear mountain that can be identified as a living microorganism that has exceeded the threshold, and an error that does not exceed the threshold. Three with a clear mountain are mixed. In addition, the waveform of the acquired voltage shown in FIG. 10 (b) is a mixture of disturbance (background component approximately 1.4V waveform) and a clear mountain that can be identified as a living microorganism that exceeds the threshold. It has become. Furthermore, the waveform of the acquired voltage shown in FIG. 10C is a mixture of disturbance (background component approximately 0.4 V waveform) and an unclear peak that does not exceed the threshold value.

図11はフィルタリング手段を装着した後の取得電圧の波形である。図11(a)に示す取得電圧の波形は、外乱となるバックグラウンド成分を取り除くため、ハイパスフィルタ回路36のみを装着したときのものである。図10(b)に示す波形と比較すると、約1.4Vあったバックグラウンド成分が0Vに収束されており、外乱が除去されていることが分かる。   FIG. 11 shows the waveform of the acquired voltage after the filtering means is mounted. The waveform of the acquired voltage shown in FIG. 11A is obtained when only the high-pass filter circuit 36 is attached in order to remove a background component that becomes a disturbance. Compared with the waveform shown in FIG. 10B, it can be seen that the background component of about 1.4 V is converged to 0 V, and the disturbance is removed.

図11(b)の波形は、図11(a)で示す破線の円で囲まれた山の波形を拡大したときの立ち上がり波形である。図11(b)の波形では、しきい値を挟んで上下動を繰り返しており、測定誤差を大きくする要因となる。そこで、このような高周波波形を除去する目的でローパスフィルタ回路37を装着するのが望ましい。   The waveform in FIG. 11B is a rising waveform when the waveform of a mountain surrounded by a broken-line circle shown in FIG. In the waveform of FIG. 11B, the vertical movement is repeated across the threshold value, which causes a measurement error to increase. Therefore, it is desirable to attach a low-pass filter circuit 37 for the purpose of removing such a high-frequency waveform.

図11(c)に示す取得電圧の波形は、外乱の除去と高周波波形の除去とを行うため、ハイパスフィルタ回路36とローパスフィルタ回路37とを結合したバンドパスフィルタ38を装着したときのものである。図11(a)の波形と比較すると、高周波ノイズが除去されて波形が滑らかとなった。   The waveform of the acquired voltage shown in FIG. 11C is obtained when a band-pass filter 38 in which a high-pass filter circuit 36 and a low-pass filter circuit 37 are combined is mounted in order to remove disturbance and high-frequency waveform. is there. Compared with the waveform of FIG. 11A, the high frequency noise was removed and the waveform became smooth.

図11(d)の波形は、図11(c)で示す破線の円で囲まれた山の波形を拡大したときの立ち上がり波形である。図11(d)の波形では、図11(b)のようなギザギザ波形がなくなって滑らかになり、しきい値を挟んで上下動を繰り返すこともなくなった。これにより、測定誤差を極めて小さくすることで、精度よく測定することが可能となる。   The waveform in FIG. 11 (d) is a rising waveform when the waveform of the mountain surrounded by the broken-line circle shown in FIG. 11 (c) is enlarged. In the waveform of FIG. 11 (d), the jagged waveform as shown in FIG. 11 (b) is eliminated and smoothed, and the vertical movement is not repeated across the threshold value. Thereby, it becomes possible to measure with high accuracy by making the measurement error extremely small.

以上のように本実施形態によれば、試料容器5に試料と蛍光染色試薬とを添加した後、撹拌混合手段7により試料溶液の撹拌・混合を行い、次いで、前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を入射させ、さらに、受光手段により微生物の蛍光発光を受光するため、撹拌しないで静置して計測するものと比較すれば、極めて短時間で微生物が明るく発光し、バラスト水中の微生物の量を簡便かつ短時間で計測することが可能となる。そして、装置を小型化することが可能となり、製造コストが安価となる。
また、電気信号が制御手段に取り込まれる前に、フィルタリング手段によって外乱が濾波されるので、微生物の蛍光発光の受光量に相応する電気信号と外乱とを明確に区別することができ、微生物量の測定誤差が生じることはなく、測定値がばらつく問題も生じず、安定して測定することが可能となる。
As described above, according to the present embodiment, after the sample and the fluorescent staining reagent are added to the sample container 5, the sample solution is stirred and mixed by the stirring and mixing means 7, and then the sample solution is stirred while the sample solution is stirred. The excitation light is incident on the irradiated surface of the sample container, and the fluorescent light emission of the microorganisms is received by the light receiving means, so that the microorganisms emit light brightly in a very short time compared to the measurement without standing and stirring. In addition, the amount of microorganisms in the ballast water can be measured easily and in a short time. And it becomes possible to miniaturize an apparatus and to reduce manufacturing cost.
Further, since the disturbance is filtered by the filtering means before the electric signal is taken into the control means, the electric signal corresponding to the amount of received fluorescence of the microorganism and the disturbance can be clearly distinguished, and A measurement error does not occur, and there is no problem that the measurement value varies, so that stable measurement can be performed.

本発明は、バラスト水を排出する際に排出基準を満たしているか否かを確認するための微生物の検査装置に適用することができる。   The present invention can be applied to a microorganism testing apparatus for confirming whether or not the discharge standard is satisfied when discharging ballast water.

1 検査装置
2 本体部
3 操作部
4 表示部
5 試料容器
6 測定部
7 回転子
8 保持プレート
9 試料容器収容部
10 LED光源
11 平行光変換手段
12 励起光用バンドパスフィルタ
13 光源部
14 光電子増倍管(PMT)
15 蛍光用バンドパスフィルタ
16 集光用レンズ
17 スリット
18 リレーレンズ
19 受光部
20 筐体
21 AC電源
22 二次電池
23 CPU基板
24 AC/DC変換器
25 RAM
26 ROM
27 マグネティックスターラ
28 ファン
29 外部出力端子
30 蓋
31 平板
32 ねじ切孔
33 シリンドリカルレンズ
34 フィルタリング手段
35 演算増幅器
36 ハイパスフィルタ回路
37 ローパスフィルタ回路
38 バンドパスフィルタ回路
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Inspection apparatus 2 Main body part 3 Operation part 4 Display part 5 Sample container 6 Measuring part 7 Rotor 8 Holding plate 9 Sample container accommodating part 10 LED light source 11 Parallel light conversion means 12 Excitation light band pass filter 13 Light source part 14 Photoelectron increase Double pipe (PMT)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 15 Fluorescence band pass filter 16 Condensing lens 17 Slit 18 Relay lens 19 Light-receiving part 20 Case 21 AC power supply 22 Secondary battery 23 CPU board 24 AC / DC converter 25 RAM
26 ROM
27 Magnetic Stirrer 28 Fan 29 External Output Terminal 30 Lid 31 Flat Plate 32 Screw Cutting Hole 33 Cylindrical Lens 34 Filtering Means 35 Operational Amplifier 36 High Pass Filter Circuit 37 Low Pass Filter Circuit 38 Band Pass Filter Circuit

Claims (8)

船舶から排出されるバラスト水に含まれて生存している微生物の許容個体数を、試料として採取した試料容器内の水中に存在する微生物数によって推定し、前記バラスト水の排水基準を満たすか否かを測定するための微生物の検査装置であって、
光を透過する材質で形成された試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加して試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合手段と、
該撹拌混合手段により前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を連続的に照射させる光源を備えた励起光源と、
該励起光源の励起光により蛍光発光された光を受光して電気信号に変換する受光手段と、
該受光手段により変換された電気信号中の前記試料溶液自体の蛍光発光に関する低周波成分のノイズ及び/又は前記電気信号の波形に関する高周波成分のノイズを濾波するフィルタリング手段と、
該フィルタリング手段により濾波された電気信号に基づき所定の受光範囲を微生物が通過した時に発生する発光数を検出してカウントし、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する制御手段と、
該制御手段に電気的に接続されている操作部と、を備え、
該操作部は、測定対象となる微生物のサイズを切り換え可能な設定ボタンを含む
ことを特徴とする微生物の検査装置。
Estimate the allowable number of living microorganisms contained in the ballast water discharged from the ship based on the number of microorganisms present in the water in the sample container collected as a sample, and whether or not the above drainage standard for ballast water is satisfied an inspection apparatus of a microorganism for measuring or,
A stirring and mixing means for stirring and mixing the sample solution by adding the sample and a fluorescent staining reagent to a sample container formed of a light transmitting material;
An excitation light source comprising a light source for continuously irradiating the irradiated surface of the sample container with excitation light while stirring the sample solution by the stirring and mixing means;
A light receiving means for receiving the fluorescence emitted by the excitation light of the excitation light source and converting it into an electrical signal;
Filtering means for filtering low-frequency component noise related to fluorescence emission of the sample solution itself and / or high-frequency component noise related to the waveform of the electrical signal in the electrical signal converted by the light receiving means;
Based on the electrical signal filtered by the filtering means, the number of luminescence generated when microorganisms pass through a predetermined light receiving range is detected and counted, and the amount of microorganisms contained in the sample in the sample container is calculated from the number of luminescence. Control means;
An operation unit electrically connected to the control means,
The microbe inspection apparatus, wherein the operation unit includes a setting button capable of switching a size of a microbe to be measured.
前記フィルタリング手段は、ハイパスフィルタとローパスフィルタとを連結したバンドパスフィルタである請求項1記載の微生物の検査装置。   2. The microorganism testing apparatus according to claim 1, wherein the filtering means is a band-pass filter in which a high-pass filter and a low-pass filter are connected. 前記励起光源は、前記試料容器の被照射面に対して直交する励起光が照射されるように配置する一方、前記受光手段が、前記励起光源の励起光と直交した角度で蛍光発光を受光する受光面が配置されてなる請求項1又は2記載の微生物の検査装置。   The excitation light source is arranged so that excitation light orthogonal to the irradiated surface of the sample container is irradiated, while the light receiving means receives fluorescence emission at an angle orthogonal to the excitation light of the excitation light source. The microorganism testing apparatus according to claim 1, wherein a light receiving surface is arranged. 前記受光手段と前記試料容器との間には、観察範囲を規制するためのスリットを設けてなる請求項1から3のいずれかに記載の微生物の検査装置。   4. The microorganism testing apparatus according to claim 1, wherein a slit for regulating an observation range is provided between the light receiving means and the sample container. 前記励起光源と前記試料容器との間には、光源からの拡散光を一面に向かって同じ角度で均一に照射される平行光に変換する平行光変換手段を設けてなる請求項1から4のいずれかに記載の微生物の検査装置。   The parallel light converting means for converting the diffused light from the light source into parallel light that is uniformly irradiated at the same angle toward one surface is provided between the excitation light source and the sample container. The microorganism testing apparatus according to any one of the above. 前記平行光変換手段が、所定厚さの平板に所定径のねじ切孔を穿設して形成したものである請求項5記載の微生物の検査装置。   6. The microorganism testing apparatus according to claim 5, wherein the parallel light converting means is formed by drilling a threaded hole having a predetermined diameter in a flat plate having a predetermined thickness. 前記平行光変換手段が、凸レンズで形成したものである請求項5記載の微生物の検査装置。   6. The microorganism testing apparatus according to claim 5, wherein the parallel light converting means is formed of a convex lens. 船舶から排出されるバラスト水に含まれて生存している微生物の許容個体数を、試料として採取した試料容器内の水中に存在する微生物数によって推定し、前記バラスト水の排水基準を満たすか否かを測定するための微生物の検査方法であって、
測定対象となる微生物のサイズを設定するサイズ設定工程と、
試料容器に試料と蛍光染色試薬とを添加した試料溶液の撹拌・混合を行う撹拌混合工程と、
前記試料溶液を撹拌しつつ前記試料容器の被照射面に励起光を連続的に照射する励起工程と、
前記励起光により蛍光発光された光を受光して電気信号に変換する受光工程と、
該受光工程により変換された電気信号中の前記試料溶液自体の蛍光発光に関する低周波成分のノイズ及び/又は前記電気信号の波形に関する高周波成分のノイズを濾波するフィルタリング工程と、
該フィルタリング工程により濾波された電気信号に基づき所定の受光範囲を微生物が通過した時に発生する発光数を検出し、該発光数から前記試料容器中の試料に含まれる微生物量を算出する微生物数推定工程と、を備えたことを特徴とする微生物の検査方法。
Estimate the allowable number of living microorganisms contained in the ballast water discharged from the ship based on the number of microorganisms present in the water in the sample container collected as a sample, and whether or not the above drainage standard for ballast water is satisfied A method for testing microorganisms for measuring
A size setting process for setting the size of the microorganism to be measured;
A stirring and mixing step of stirring and mixing the sample solution in which the sample and the fluorescent staining reagent are added to the sample container;
An excitation step of continuously irradiating the irradiated surface of the sample container with excitation light while stirring the sample solution;
A light receiving step for receiving the light emitted by the fluorescent light by the excitation light and converting it into an electrical signal;
A filtering step of filtering low-frequency component noise related to fluorescence emission of the sample solution itself and / or high-frequency component noise related to the waveform of the electric signal in the electric signal converted by the light receiving step;
Estimating the number of microorganisms by detecting the number of emitted light when a microorganism passes through a predetermined light receiving range based on the electrical signal filtered by the filtering step, and calculating the amount of microorganisms contained in the sample in the sample container from the number of emitted light And a method for inspecting microorganisms.
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