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JP6270719B2 - 合成致死性および癌の治療 - Google Patents

合成致死性および癌の治療 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、その全容が参照により完全に本明細書に組み込まれる、2011年7月22日に出願された米国出願第61/510,686号に対する優先権を主張するものである。
本発明の分野は一般に、癌を治療するための化合物、組成物および方法に関する。
癌はカナダにおける主な死因である。カナダ癌協会(Canadian Cancer Society)は、2011年には約170000の新たな癌症例、および癌の結果として約75000の死が存在すると推測している。
癌を治療するための新たな手法は、合成致死性の概念に関する。いずれか一方の突然変異は生存率と適合性があるが、両者の突然変異は死をもたらす場合、2つの遺伝子(または2つの遺伝子産物)は合成致死性である。別の言い方をすれば、「合成致死性」は、突然変異と(例えば)薬剤が癌細胞の死を一緒に引き起こすが、突然変異または薬剤の一方が細胞死をもたらすことはない状況を記載する。癌関連突然変異に対して合成致死性である遺伝子(または遺伝子産物)の標的化は癌細胞のみを死滅させ、正常細胞は生存させるはずである。したがって合成致死性は、抗癌性特異的物質の開発の基盤をもたらす。
癌を治療するための合成致死性の手法は新しく、大部分は合成致死性遺伝子(および遺伝子産物)を同定できないことが原因で、未だ一般的な手法ではない。
タンパク質のN-ミリストイル化は、ミリスチン酸(14-炭素鎖飽和脂肪酸)が、様々な細胞、ウイルス、および腫瘍タンパク質(例えば、発癌性Src関連チロシンキナーゼ、ヘテロ三量体Gαサブユニットなど)のNH2末端グリシンと共有結合した修飾である。
細胞ミリストイル化タンパク質には、シグナル変換および発癌において多様な生物学的機能がある。ミリストイル化によるタンパク質の修飾は、細胞増殖において重要なシグナル変換および制御機能に必要とされるものを含めて、真核生物細胞における多くの重要なタンパク質の亜細胞標的化、タンパク質立体配座および生物学的活性に必要とされる。Srcファミリーのチロシンキナーゼ(癌原遺伝子)は、特に最も広く研究されているミリストイル化タンパク質である。
タンパク質のミリストイル化はN-ミリストイルトランスフェラーゼ(NMT)によって触媒される。NMTは真核生物細胞中でこの活性を担い、メチオニルアミノペプチダーゼによる開始メチオニン残基の除去後に、そのポリペプチド基質を修飾することによって働く。この修飾は同時翻訳プロセスとして主に起こるが、ミリストイル化は翻訳後、タンパク質のタンパク質分解切断後、典型的にはアポトーシス中に起こる可能性もある。哺乳動物NMT酵素の2つのアイソザイムがクローニングされており、NMT1およびNMT2で明示される。NMTは細胞中で生存促進的役割を果たす。この2つのNMTは全ての正常細胞に存在する。
J.A.Frearson et al(2010)Nature.464.728〜723頁 Raju.R.V.,and Sharma.R.K.(1999)Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase.Methods Mol Biol 116、193〜211頁 Towler,D.,and Glaser,L.(1986)Protein fatty acid acylation:enzymatic synthesis of an N-myristoyglycyl peptide.Proc Natl Acad Sci USA83、2812〜2816頁 King et al.1991、Anal Biochem
癌を治療するための化合物、組成物および方法が依然必要とされている。
この背景情報は、本発明とおそらく関係があると本出願人によって考えられる既知の情報を得る目的で与える。任意の前述の情報が本発明に対する従来技術を構成することを必ずしも認めるものではなく、そう解釈すべきでもない。
本発明の一態様によれば、癌を有する対象を治療するための化合物および組成物を提供する。本明細書に記載する化合物、組成物および方法で治療するのに適した、癌を有する対象を同定するための方法も提供する。
本発明の一態様によれば、NMT2に欠陥がある癌を有する対象を治療する方法であって、NMT阻害剤を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。具体的な例では、前記NMT阻害剤はNMT1阻害剤である。
具体的な態様では、前記癌はリンパ腫である。態様の一例では、前記リンパ腫はB細胞リンパ腫である。より具体的な例では、前記B細胞リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B-CLL/SLL、免疫細胞腫/ヴァルデンストレーム病、MALT型/単球様B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小児リンパ腫、または未分化大細胞リンパ腫である。
具体的な態様では、前記NMT阻害剤は小分子、抗体、ペプチド断片、または核酸である。
具体的な態様では、前記小分子はトリス-DBA、HMA、もしくはDDD85646、またはこれらの誘導体である。具体的な態様では、前記抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。具体的な態様では、前記核酸はdsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、リボザイム、shRNA分子、またはsiRNA分子を含む。
具体的な態様では、前記対象はヒト対象である。
本発明の別の態様では、方法は化学療法剤を投与するステップをさらに含む。具体的な例では、前記化学療法剤はCHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAPまたはEPOCHである。
本発明の別の態様では、癌を有する対象を治療する方法であって、前記対象由来のサンプルを測定して前記サンプルがNMT2に欠陥があるかどうか決定するステップ、および前記サンプルがNMT2に欠陥があるとき、前記対象にNMTの阻害剤を投与するステップを含む方法を提供する。具体的な例では、前記NMT阻害剤はNMT1阻害剤である。
具体的な態様では、前記NMT阻害剤はNMT1阻害剤である。
具体的な態様では、前記癌はリンパ腫である。具体的な態様では、前記リンパ腫はB細胞リンパ腫である。より具体的な態様では、前記B細胞リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B-CLL/SLL、免疫細胞腫/ヴァルデンストレーム病、MALT型/単球様B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小児リンパ腫、または未分化大細胞リンパ腫である。
具体的な態様では、前記NMT阻害剤は小分子、抗体、ペプチド断片、または核酸である。
具体的な態様では、前記小分子はトリス-DBA、HMA、もしくはDDD85646、またはこれらの誘導体である。具体的な態様では、前記抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。具体的な態様では、前記核酸はdsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、リボザイム、shRNA分子、またはsiRNA分子を含む。
具体的な態様では、前記対象はヒト対象である。
本発明の別の態様では、方法は化学療法剤を投与するステップをさらに含む。具体的な例では、前記化学療法剤はCHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAPまたはEPOCHである。
別の態様では、定量的蛍光活性化細胞選別、酵素結合免疫吸着アッセイ、免疫組織化学法、定量的免疫組織化学法、蛍光共鳴エネルギー移動、フォスター共鳴エネルギー移動、蛍光タンパク質再構成法、質量分析法、イムノブロットアッセイまたは共免疫沈降アッセイを使用して、前記サンプルの測定を実施する。
本発明の別の態様では、NMT2に欠陥がある癌を有する対象を治療するためのキットであって、NMT阻害剤およびその使用に関する説明書を含むキットを提供する。一例では、前記NMT阻害剤はNMT1阻害剤である。
具体的な態様では、前記癌はリンパ腫である。具体的な態様では、前記リンパ腫はB細胞リンパ腫である。より具体的な態様では、前記B細胞リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B-CLL/SLL、免疫細胞腫/ヴァルデンストレーム病、MALT型/単球様B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小児リンパ腫、または未分化大細胞リンパ腫である。
具体的な態様では、前記NMT阻害剤は小分子、抗体、ペプチド断片、または核酸である。
具体的な態様では、前記小分子はトリス-DBA、HMA、もしくはDDD85646、またはこれらの誘導体である。具体的な態様では、前記抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。具体的な態様では、前記核酸はdsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、リボザイム、shRNA分子、またはsiRNA分子を含む。
具体的な態様では、前記対象はヒト対象である。
本発明の別の態様では、方法は化学療法剤を投与するステップをさらに含む。具体的な例では、前記化学療法剤はCHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAPまたはEPOCHである。
本発明の別の態様では、NMT2に欠陥がある癌を有する対象を治療するための阻害剤NMTの使用を提供する。具体的な例では、前記NMT阻害剤はNMT1阻害剤である。
具体的な態様では、前記癌はリンパ腫である。具体的な態様では、前記リンパ腫はB細胞リンパ腫である。より具体的な態様では、前記B細胞リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B-CLL/SLL、免疫細胞腫/ヴァルデンストレーム病、MALT型/単球様B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小児リンパ腫、または未分化大細胞リンパ腫である。
具体的な例では、前記NMT阻害剤は小分子、抗体、ペプチド断片、または核酸である。
具体的な例では、前記小分子はトリス-DBA、HMA、もしくはDDD85646、またはこれらの誘導体である。具体的な態様では、前記抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。具体的な態様では、前記核酸はdsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、リボザイム、shRNA分子、またはsiRNA分子を含む。
具体的な態様では、前記対象はヒト対象である。
本発明の別の態様では、方法は化学療法剤を投与するステップをさらに含む。具体的な例では、前記化学療法剤はCHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAPまたはEPOCHである。
本発明の別の態様では、NMT2に欠陥がある癌を有する対象の治療用の、医薬品を調製するための阻害剤NMTの使用を提供する。
具体的な態様では、前記NMT阻害剤はNMT1阻害剤である。
具体的な態様では、前記癌はリンパ腫である。具体的な態様では、前記リンパ腫はB細胞リンパ腫である。より具体的な態様では、前記B細胞リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B-CLL/SLL、免疫細胞腫/ヴァルデンストレーム病、MALT型/単球様B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小児リンパ腫、または未分化大細胞リンパ腫である。
具体的な態様では、前記NMT阻害剤は小分子、抗体、ペプチド断片、または核酸である。
具体的な態様では、前記小分子はトリス-DBA、HMA、もしくはDDD85646、またはこれらの誘導体である。具体的な態様では、前記抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。具体的な態様では、前記核酸はdsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、リボザイム、shRNA分子、またはsiRNA分子を含む。
具体的な態様では、前記対象はヒト対象である。
本発明の別の態様では、方法は化学療法剤を投与するステップをさらに含む。具体的な例では、前記化学療法剤はCHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAPまたはEPOCHである。
本発明の別の態様では、対象における癌の診断、予後、分類またはモニタリングの1つまたは複数に関するマーカーとしてのNMT2の使用を提供する。
本発明の別の態様では、対象における癌の診断、予後、分類またはモニタリングの1つまたは複数に関するマーカーとしての、タンパク質のミリストイル化の使用を提供する。
本発明の別の態様では、対象における癌の診断、予後、分類またはモニタリングの1つまたは複数に関するマーカーとしての、タンパク質のアシル化の使用を提供する。
具体的な態様では、前記癌はリンパ腫である。
具体的な態様では、前記リンパ腫はB細胞リンパ腫である。
具体的な態様では、前記B細胞リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B-CLL/SLL、免疫細胞腫/ヴァルデンストレーム病、MALT型/単球様B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小児リンパ腫、または未分化大細胞リンパ腫である。
具体的な態様では、イムノアッセイまたは核酸検出、またはタンパク質活性から選択されるアッセイを使用して前記マーカーを測定する。
本発明の実施形態を、単に例として、添付の図面を参照することによって、ここで記載する。
正常B細胞の一型(L0)、ならびに様々なB細胞リンパ腫およびT細胞白血病における、NMT1およびNMT2発現のイムノブロット分析を示す図である。 NMT阻害剤、トリス-ジベンジリデンアセトン-ジパラジウム(トリス-DBA)に対する、様々な正常細胞および様々なB細胞リンパ腫およびT細胞白血病の感受性を示すグラフである。 トリス-ジベンジリデンアセトン-ジパラジウム(トリス-DBA)による、N-ミリストイルトランスフェラーゼ(NMT)の阻害を示す棒グラフである。 NMT1に対する抗体でプロ−ビングした、リンパ腫細胞系を示すイムノブロットの図である。 NMT2に対する抗体でプロ−ビングした、リンパ腫細胞系を示すイムノブロットの図である。 不死化正常Bリンパ球性細胞系と比較した、バーキットリンパ腫細胞系に対するNMT阻害剤の感受性を示す線グラフである。 pcDNA3.1-V5-NMT2によるラモスBリンパ腫細胞のトランスフェクションの結果を示す図であり、細胞生存率で示す、空プラスミドベクターでトランスフェクトした対照細胞に対して2.5倍のトリスDBA(5ug/ml)に対する生存の増大を示し(パネルA)、(パネルB)イムノブロットを示す。
以下に発明を実施する形態において、肉太活字体の数字は、本発明の様々な実施形態を示す図面に関連して記載および参照する構成要素パーツを確認するために働く。本発明の様々な実施形態を記載する際に、同じ参照符号を使用して類似要素の同一性を確認していることを留意されたい。さらに、簡潔性のため、図面の幾つかの図から幾つかのパーツを省略してある。
以下でより詳細に記載するように、癌を有する対象を治療するための化合物、組成物および方法を本明細書中に記載する。本明細書に記載する化合物、組成物および方法で治療するのに適した癌を有する対象を同定するための方法も本明細書中に記載する。癌を有する対象を同定するための方法も本明細書中に記載する。
本出願は、NMTに欠陥がある癌を治療するための方法および組成物を提供する。NMTに欠陥がある癌には、NMT2またはNMT1に欠陥がある癌がある。具体的な例では、NMTに欠陥がある癌はNMT2に欠陥がある癌である。
本明細書中で使用する、用語「癌」は、細胞の異常で制御不能な成長によって引き起こされる様々な状態を指す。「癌細胞」と呼ばれ癌を引き起こし得る細胞は、制御不能な増殖、不死性、転移能力、急激な成長および増殖率、および/または幾つかの典型的な形態学的特徴などの特徴的性質を有する。癌細胞は腫瘍の型であり得るが、このような細胞は対象内に単独で存在する可能性もあり、または非腫瘍形成癌細胞である可能性がある。(例えば、臨床的または放射線医学的手段による)1つまたは複数の腫瘍の存在の検出、腫瘍内または別の生物サンプル由来の(例えば、組織バイオプシー由来の)細胞検査、癌を示す血中マーカーの測定、および癌を示す遺伝子型の検出だけには限られないが、これらを含めた任意の幾つかの方法で、癌を検出することができる。しかしながら、前述の検出法の1つまたは複数における陰性結果が癌の不在を必ずしも示すわけではなく、例えば、癌治療に対して完全な応答を示した患者が、後の再発によって証明されるように、依然として癌を有する可能性がある。
本開示の具体的な例では、癌はリンパ腫である。
本明細書中で使用する、用語「リンパ腫」は、リンパ系におけるBまたはT細胞の悪性増殖を指す。「リンパ腫」は、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫を含めた、多型の悪性増殖を含む。本明細書中で使用する、用語「非ホジキンリンパ腫」は、(例えば、癌性領域内のリード-ステルンベルグ細胞の存在によって特徴付けられる)ホジキンリンパ腫ではない、リンパ系におけるBまたはT細胞の悪性増殖を指す。非ホジキンリンパ腫は29を超える型のリンパ腫を包含し、その間の識別は癌細胞の型に基づく。
本開示のより具体的な例では、癌はB-リンパ腫である。
したがって一実施形態では、本開示の化合物、組成物および方法は、B細胞リンパ腫を有する対象を治療するのに適している。
B細胞リンパ腫の例には、例えば、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B-CLL/SLL、免疫細胞腫/ヴァルデンストレーム病、およびMALT型/単球様B細胞リンパ腫があるが、これらだけには限られない。バーキットリンパ腫などの小児リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、前駆体B-LBL、前駆体T-LBL、および未分化大細胞リンパ腫の治療も企図する。
本明細書中で使用する、用語「対象」は動物を指し、例えばネコ、イヌなどの飼育動物、家畜(例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど)、実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど)、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、霊長類、非ヒト霊長類、げっ歯類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および任意の他の動物を、例えば含むことができる。具体的な例では、対象はヒトである。
本明細書中で使用する、用語「治療」または「治療する」は、臨床結果を含めた、有益または望ましい結果を得ることを指す。有益または望ましい臨床結果は、検出可能であれ検出不能であれ、1つまたは複数の症状もしくは状態の軽減または改善、疾患程度の減退、疾患状態の安定化(すなわち非悪化)、疾患の蔓延防止、疾患進行の遅延または緩慢化、疾患状態の改善または緩和、疾患再発の減退、および(部分的であれ完全であれ)寛解だけには限られないが、これらを含み得る。「治療する」および「治療」は、治療を施さない場合の予想生存期間と比較した、生存期間の延長も意味することができる。本明細書中で使用する、「治療する」および「治療」は予防的治療も含む。例えば、初期の癌、例えば初期段階リンパ腫がある対象を治療して進行を妨げることができ、あるいは、本明細書に記載する化合物もしくは組成物で寛解中の対象を治療して、再発を防止することができる。
B細胞リンパ腫細胞はNMT2ではなくNMT1を発現することを、本明細書中で示す。(図1および図4中に示すように)、これは、NMT1とNMT2の両方を発現する試験した白血病および他の細胞とは対照的である。
Bリンパ腫細胞はNMT阻害剤による細胞生存率の阻害に感受性があることを、本明細書中でさらに示す。
一例では、NMT阻害剤はトリス-ジベンジリデンアセトン-ジパラジウム(トリス-DBA)である(図2)。
他の例では、NMT阻害剤2-ヒドロキシミリステート(HMA)を使用してBリンパ腫細胞を阻害する。
さらに別の例では、T.brucie NMTのピラゾールスルホンアミド阻害剤[J.A.Frearson et al(2010)Nature.464.728〜723頁](DDD85646)を使用してB細胞リンパ腫を阻害する(図5)。
具体的な例では、B細胞リンパ腫を有する対象の治療は、NMT阻害剤を前記対象に投与するステップを含む。
本発明においてNMT阻害剤化合物または誘導体は、NMT2に欠陥がある癌の治療に使用することができる。
本明細書中で使用する、用語「欠陥がある」は、例えば、(野生型または対照サンプルと比較した)NMT合成、レベル、活性、もしくは機能の阻害、低下または排除、ならびにNMT(例えば、NMT1またはNMT2)のタンパク質の合成、レベル、活性、もしくは機能の誘導または刺激の阻害を広く指す。この用語は、NMTの合成、レベル、活性、もしくは機能を制御することができる、任意の代謝または制御経路も指す。この用語は、他の分子との結合および複合体形成から生じる阻害、低下または排除も含む。したがって、用語「NMTに欠陥がある」は、タンパク質機能またはタンパク質経路機能の阻害、低下または排除をもたらすことを指す。しかしながら、この用語は、これらの機能のどれもが、同時に阻害されなければならないことを意味するものではない。
幾つかの例では、NMT遺伝子における突然変異の存在を決定することによって、NMTに欠陥があるとして癌を同定することができる。このような核酸検出および増幅の方法は、当業者にはよく知られている。
例えば、増幅する核酸は生物サンプルに由来してよい。(フェノールおよびクロロホルム抽出などの)様々な抽出法が、DNAまたはRNAを単離するのに適している。サンプルから抽出した核酸は、当技術分野でよく知られている核酸増幅技法を使用して増幅することができる。非制限的な例には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、ネステッドPCR、リガーゼ連鎖反応、増幅可能RNAレポーター、Q-β複製、転写ベース増幅、ブーメランDNA増幅、鎖置換活性化、サイクリングプローブ技術、等温核酸配列ベース増幅(NASBA)があり、または他の配列複製アッセイもしくはシグナル増幅アッセイも使用することができる。
増幅の方法は当技術分野でよく知られている。幾つかの方法は、cDNAへのRNAの逆転写を利用する。
一例ではPCRを使用して、対象の標的配列、例えばNMT2配列を増幅する。
核酸は検出前に増幅させることが可能であり、または増幅ステップ中に、例えば「リアルタイム」法で直接検出することができる。幾つかの実施形態では、生成するアンプリコンが検出可能状態で標識されるように、標識プライマーを使用して標的配列を増幅する。幾つかの実施形態では、プライマーを蛍光標識する。幾つかの実施形態では、標的配列を増幅し、生成したアンプリコンは電気泳動によって検出する。
遺伝子発現のレベルは、サンプル中のNMT2mRNAの量を評価することにより決定することができる。サンプル中のmRNAの測定法は当技術分野で知られている。mRNAのレベルを測定するため、サンプル中の細胞を溶かすことができ、溶解物中または溶解物から精製もしくは半精製したRNA中のmRNAのレベルを、当業者に知られている任意の様々な方法によって測定することができる。このような方法には、非制限的に、検出可能状態で標識したDNAまたはRNAプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ、例えばノーザンブロッティング、または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した定量もしくは半定量RT-PCR法がある。あるいは、定量もしくは半定量in situハイブリダイゼーションアッセイを、例えば組織切片、または非溶解細胞縣濁液、および検出可能状態で標識した、例えば蛍光、または酵素標識DNAもしくはRNAプローブを使用して実施することができる。mRNAを定量化するためのさらなる方法には、RNA保護アッセイ(「RPA」)、cDNAおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、レプレゼンテーションディファレンス分析(「RDA」)、ディファレンシャルディスプレイ、EST配列分析、連続遺伝子発現解析(「SAGE」)、およびLuminex FlexMAP(「LMF」)での多重ライゲ−ション媒介増幅がある。
「リアルタイム」法を使用して増幅をモニタリングすることもできる。リアルタイムPCRは、核酸標的の検出および定量化を可能にする。典型的には、定量PCRのためのこの手法は蛍光色素を利用し、色素はSYBR Green.RTM.Iなどの二本鎖特異的色素であってよい。あるいは、他の蛍光色素、例えばFAMまたはHEXを、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーと結合させることが可能である。リアルタイムPCRを実施することができる様々な器機が当技術分野で知られている。PCRの各サイクルで生じる蛍光シグナルは、PCR産物の量に比例する。蛍光とサイクル数のプロットを使用して増幅の動態を記載し、蛍光閾値レベルを使用して初期鋳型濃度と関係がある分画サイクル数を定義する。熱サイクル中に増幅を実施し、蛍光を読み取ることができる器機で検出するとき、融解分析を使用して、目的とするPCR産物と非特異的PCR産物を区別することができる。増幅およびシグナル生成後の反応の温度を段階的に上昇させながら、蛍光の変化を測定することによって、目的とする産物の(Δct)、および非特異的産物のそれを決定することができる。
「多重検出」または「多重化」としても知られる方法は、サンプル中の多数の核酸の増幅を含むことができる。本明細書中で使用する、用語「多重PCR」は、2セット以上のPCRプライマーを反応に加えて、1つまたは複数の標的遺伝子マーカー由来の核酸を含めた多数の核酸を検出し定量化するステップを含むPCRを指す。さらに、内部対照(例えば、18s rRNA、GADPH、またはβ-アクチン)との多重化によって、反応なしでPCRの対照をもたらす。
幾つかの例では、NMT遺伝子の後成的不活性化またはタンパク質機能の消失を決定することにより、NMTに欠陥があるとして癌を同定することができる。
幾つかの例では、対象由来の細胞のサンプルにおける、(NMT1またはNMT2を含めた)NMTの活性を決定することにより、NMTに欠陥があるとして癌を同定することができる。例えば癌細胞に欠陥がある場合は対照に対して、好ましくは同じ組織由来の非癌細胞に対して、活性を決定することができる。したがって、NMTに欠陥がある癌にはNMT活性および/または発現の低減または排除があり得る。NMTの活性は、当技術分野でよく知られている技法を使用することにより決定することができる。これらの例では、NMTに欠陥がある癌には活性の低減または排除がある。
幾つかの例では、NMTタンパク質の量、濃度および/またはレベルを決定することにより、NMTに欠陥があるとして癌を同定することができる。
幾つかの例では、癌を有する対象、もしくは癌を有する疑いがある対象由来の生物サンプルにおけるミリストイル化タンパク質の量を決定することにより、NMTに欠陥があるとして癌を同定することができる。この例では、ミリストイル化タンパク質の有無、または量を、例えば適切な脂肪酸アナログを使用する、クリックケミストリーを使用して決定することができる。非制限的な方法を、本明細書の材料および方法中に記載する。ミリストイル化タンパク質の有無、または量を決定する別の方法は、当業者に知られている。(場合によっては対照と比較して)サンプル中に少量のミリストイル化タンパク質を有するサンプルは、NMTに欠陥があるサンプル、またはNMTに欠陥がある癌を示す。
幾つかの例では、癌を有する対象、もしくは癌を有する疑いがある対象由来の生物サンプルにおけるアシル化タンパク質の量を決定することにより、NMTに欠陥があるとして癌を同定することができる。この例では、アシル化タンパク質の有無、または量を決定することができる。このような方法は、当業者には知られているはずである。(場合によっては対照と比較して)サンプル中に少量のアシル化タンパク質を有するサンプルは、NMTに欠陥があるサンプル、またはNMTに欠陥がある癌を示す。
幾つかの例では、突然変異などの1つまたは複数の配列変異の存在を決定することにより、NMTに欠陥があるとして癌を同定することができ、多型は、野生型ヌクレオチド配列に対する1つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入または置換を含むことができる。1つまたは複数の変異は核酸配列のコードもしくは非コード領域中に存在する可能性があり、NMTの発現もしくは機能を低減または消失させる可能性がある。したがって、変異体核酸は活性が低減もしくは消失した変異体ポリペプチドをコードする可能性があり、または例えば制御エレメントの改変した活性により、細胞内での発現がほとんどもしくは全くない野生型ポリペプチドをコードする可能性がある。
様々な方法を、対象から得たサンプル中の特定核酸配列の有無を決定するために使用することができる。
幾つかの例では、NMT経路の要素のNMTの、正または負のレギュレーターの発現または活性のレベルを評価することにより、NMTに欠陥があるとして癌を同定することができる。例えばイムノブロットおよびELISAなどのイムノアッセイ、ならびにRT-PCR、ナノストリング技術、RNA-seq、核酸ハイブリダイゼーションまたは核型分析などの核酸検出法によって、発現レベルを決定することができる。
幾つかの例では、個体由来の細胞サンプル中の、1つまたは複数の変異、例えばNMTの多型または突然変異の存在を決定することにより、NMTに欠陥があるとして癌を同定することができる。
癌と関係がある突然変異および多型は、変異体(すなわち、突然変異体または対立遺伝子変異体)ポリペプチドの存在を検出することによって、タンパク質レベルで検出することもできる。
別の例では、癌を有する対象を治療する方法であって、前記癌がNMT2に欠陥がある癌細胞を含み、NMT阻害剤および/またはNMT1阻害剤を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
本明細書中で使用する、用語「阻害する」または「阻害剤」は、タンパク質合成、レベル、活性、もしくは機能を阻害する任意の方法または技法、ならびに対象のタンパク質、例えばNMT2の合成、レベル、活性、もしくは機能の誘導または刺激を阻害する方法を指す。この用語は、対象のタンパク質の合成、レベル、活性、もしくは機能を制御することができる任意の代謝または制御経路も指す。この用語は、他の分子との結合および複合体形成を含む。したがって用語「阻害剤」は、その施用がタンパク質機能もしくはタンパク質経路機能の阻害をもたらす、任意の作用物質または化合物を指す。しかしながら、この用語は、これらの機能のどれもが、同時に阻害されなければならないことを意味するものではない。
別の例では、癌を有する対象を治療する方法であって、前記癌がNMT1に欠陥がある癌細胞を含み、NMT阻害剤および/またはNMT2阻害剤を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
幾つかの例では、治療法は、治療有効量の本明細書に記載する化合物を対象に投与するステップを含み、場合によっては一回投与からなり、あるいは一連の施用を含む。具体的な例では、前記化合物はNMT阻害剤、NMT1阻害剤および/またはNMT2阻害剤である。
より具体的な例では、NMT阻害剤はトリス-DBA、HMA、DDD85646、またはこれらの誘導体である。
他の例では、対象に投与するのに適した薬学的に有効な量の化合物および/または組成物を提供する。
本明細書中で使用する、用語「薬学的に有効な量」は、研究者または臨床医によって調査中である組織、系、動物もしくはヒトの生物学的または医学的応答を誘導する、薬剤または薬学的作用物質の量を指す。この量は治療有効量であり得る。
化合物および組成物は薬学的に許容される形で提供する。
本明細書中で使用する、用語「薬学的に許容される」は、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症がなく妥当なベネフィット/リスク比で釣り合う対象の組織との接触における使用に適した、化合物、材料、組成物、および/または剤形を指す。それぞれの担体、賦形剤なども、製剤の他の成分と適合性がある意味で「許容される」。
実際の投与量、ならびに投与の速度および経時的変化は、治療される対象の性質および重症度に依存する。治療の処方、例えば用量に関する決定などは、一般開業医および他の医師の責任範囲内にあり、典型的には治療する障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、および開業医に知られている他の要因を考慮に入れる。
化合物または組成物は、治療する状態に応じて、同時的または連続的のいずれかで、単独または他の治療と併用して投与することができる。
製剤は便宜上単位剤形で存在してよく、製薬の技術分野でよく知られている任意の方法によって調製することができる。このような方法は、1つまたは複数の補助成分を構成し得る担体と活性化合物を結合させるステップを含む。一般に製剤は、液状担体または微細固形担体または両方と活性化合物を均一かつ密接に結合させるステップ、および次いで必要であれば、生成物を成形するステップによって調製する。
経口(例えば、摂取による)、局所(例えば、経皮、鼻腔内、眼部、頬、および舌下を含む)、肺(例えば、口または鼻を例えば介した、例えばエアロゾルを使用した吸入または注入療法による)、直腸、膣内、例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、髄腔内、脊髄内、包内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、および胸骨内を含めた注射による非経口、例えば皮下または筋肉内へのデポー剤インプラントだけには限られないが、これらを含めて、全身/末梢であれ望ましい作用部位であれ、任意の好都合な投与経路によって、対象に化合物および組成物を投与することができる。
(例えば、摂取による)経口投与に適した製剤は、それぞれ所定量の活性化合物を含有する、カプセル、カシェ剤または錠剤などの別個単位として、粉末もしくは顆粒として、水溶液もしくは非水溶液に溶かした溶液もしくは縣濁した縣濁液として、または水中油滴型液状エマルジョンもしくは油中水滴型液状エマルジョンとして、ボーラスとして、舐剤として、またはペーストとして提供できる。
(例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含めた注射による)非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、バッファー、防腐剤、安定剤、静菌剤、および目的とするレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有し得る、水性または非水性の等張で、発熱物質を含まない滅菌注射溶液、ならびに縣濁剤および増粘剤、およびリポソーム、または血中成分または1つもしくは複数の器官を化合物が標的化するように設計した他のマイクロ粒子系を含み得る水性および非水性滅菌縣濁液がある。このような製剤において使用するのに適した等張媒体の例には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸加リンゲル注射液がある。
製剤は単位用量または多数回用量密閉容器、例えばアンプルおよびバイアル中で提供することができ、使用直前に滅菌液状担体、例えば注射用水の添加のみを必要とする凍結-乾燥(凍結乾燥)状態で保存することができる。即興の注射溶液および縣濁液は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。製剤は、リポソーム、または血中成分または1つもしくは複数の器官を活性化合物が標的化するように設計した他のマイクロ粒子系の形であってよい。
本明細書に開示する化合物を含む組成物は、標準的な化学療法レジメと併用して、または放射線療法と共に、本明細書に記載する方法中で使用することができる。
患者におけるリンパ腫の場合、既知の治療は治療する対象、疾患の型、およびその段階に依存する。リンパ腫に関する既存の治療モダリティは当業者に知られている。したがって既知の治療は、本明細書に開示するNMT阻害剤と一緒に使用することができる。
リンパ腫の治療において使用するための一般的な薬剤の組合せには、CHOP(すなわち、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソン)、GAP-BOP(すなわち、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プロカルバジン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、およびプレドニソン)、m-BACOD(すなわち、メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン)、ProMACE-MOPP(すなわち、プレドニソン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリンと標準的なMOPP)、ProMACE-CytaBOM(プレドニソン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサート、およびロイコボリン)、ならびにMACOP-B(メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン、ブレオマイシン、およびロイコボリン)があるが、これらだけには限られない。再発侵襲性非ホジキンリンパ腫に関して、以下の化学療法剤の組合せ、IMVP-16(すなわち、イフォスファミド、メトトレキサート、およびエトポシド)、MIME(すなわち、メチル-gag、イフォスファミド、メトトレキサート、およびエトポシド)、DHAP(すなわち、デキサメタゾン、-16高用量シタラビン、およびシスプラチン)、ESHAP(すなわち、エトポシド、メチルプレドニソン、高用量シタラビン、およびシスプラチン)、CEFF(B)(すなわち、シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニソン、およびブレオマイシン)、ならびにCAMP(すなわち、ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビン、およびプレドニソン)を、本明細書に記載する化合物および組成物と共に使用することができる。
再発性、耐性ホジキン病などの特定リンパ腫に使用するための救済化学療法用の治療には、VABCD(すなわち、ビンブラスチン、ドキソルビシン、ダカルバジン、ロムスチンおよびブレオマイシン)、ABDIC(すなわち、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダカルバジン、ロムスチン、およびプレドニソン)、CBVD(すなわち、ロムスチン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、デキサメタゾン)、PCVP(すなわち、ビンブラスチン、プロカルバジン、シクロホスファミド、およびプレドニソン)、CEP(すなわち、ロムスチン、エトポシド、およびプレドニムスチン)、EVA(すなわち、エトポシド、ビンブラスチンおよびドキソルビシン)、MOPLACE(すなわち、シクロホスファミド、エトポシド、プレドニソン、メトトレキサート、シタラビン、およびビンクリスチン)、MIME(すなわち、メチル-gag、イフォスファミド、メトトレキサート、およびエトポシド)、MINE(すなわち、ミトクアゾン(mitoquazone)、イフォスファミド、ビノレルビン、およびエトポシド)、MTX-CHOP(すなわち、メトトレキサートおよびCHOP)、CEM(すなわち、ロムスチン、エトポシド、およびメトトレキサート)、CEVD(すなわち、ロムスチン、エトポシド、ビンデシン、およびデキサメタゾン)、CAVP(すなわち、ロムスチン、メルファラン、エトポシド、およびプレドニソン)、EVAP(すなわち、エトポシド、ビンブラスチン、シタラビン、およびシスプラチン)、ならびにEPOCH(すなわち、エトポシド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、およびプレドニソン)があるが、これらだけには限られない。
NMT1またはNMT2を阻害するための別の方法を、癌の治療、特にB細胞リンパ腫の治療のための合成致死戦略において使用することができることは理解されよう。例えば、NMT1またはNMT2の発現は、アンチセンスまたはRNAi技術を使用して阻害することができる。遺伝子発現および/またはタンパク質活性を下方制御するための、これらの手法の使用は当業者に知られている。
本開示の別の態様では、患者のNMT2阻害剤および/またはNMT1阻害剤治療の利点を決定する方法を提供する。
一例では、本開示の方法は、NMT1および/もしくはNMT2の有無、または量または濃度に関して、癌を有する対象、もしくは癌を有する疑いがある対象由来のサンプルを定性的または定量的に決定、分析または測定するステップを含む。
別の例では、本開示の方法は、ミリストイル化タンパク質の有無、または量または濃度に関して、癌を有する対象、もしくは癌を有する疑いがある対象由来のサンプルを定性的または定量的に決定、分析または測定するステップを含む。
別の例では、本開示の方法は、アシル化タンパク質の有無、または量または濃度に関して、癌を有する対象、もしくは癌を有する疑いがある対象由来のサンプルを定性的または定量的に決定、分析または測定するステップを含む。
本明細書中で使用する、用語「サンプル」は、遺伝子発現レベル、タンパク質レベル、酵素活性レベルなどに関してアッセイすることができる、癌細胞を含む、または癌細胞を含有する疑いがある、液体、細胞または組織サンプルだけには限られないが、これらを含めた、対象由来の任意のサンプルを指す。サンプルは、例えば、血液サンプル、分画血液サンプル、骨髄サンプル、バイオプシー、凍結組織サンプル、新たな組織試料、細胞サンプル、および/またはパラフィン包埋切片、そこから相対的mRNAレベルの測定を可能にするのに十分な量および適切な性質のRNAを抽出することができる材料、またはそこから相対的ポリペプチドレベルの測定を可能にするのに十分な量および適切な性質のポリペプチドを抽出することができる材料を含むことができる。
NMT1もしくはNMT2の決定、分析または測定、またはNMT1および/もしくはNMT2の有無は、患者における癌のNMT1阻害剤またはNMT2阻害剤治療の利点と関連付けることができる。
ミリストイル化タンパク質の決定、分析または測定、またはミリストイル化タンパク質の有無は、患者における癌のNMT1阻害剤またはNMT2阻害剤治療の利点と関連付けることができる。
具体的な例では、本発明の抗体は、対象のタンパク質、例えばタンパク質NMT1またはNMT2に免疫反応的または免疫特異的であり、したがってそれと特異的および選択的に結合する。一例では、ヒトNMT1またはNMT2に免疫反応的および免疫特異的である抗体を使用することができる。ヒトNMT1またはNMT2に対する抗体は免疫特異的であることが好ましい。用語「抗体(antibody)」および「複数の抗体(antibodies)」は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体だけには限られないが、これらを含む。
別の例では、本発明の抗体は、NMT1タンパク質とNMT2タンパク質の両方に免疫反応的または免疫特異的であり、したがってそれらと特異的および選択的に結合する。この例では、ヒトNMT1とNMT2の両方に免疫反応的および免疫特異的である抗体を使用することができる。ヒトNMT1およびNMT2に対する抗体は免疫特異的であることが好ましい。この例では、NMT1とNMT2の異なる分子量により、例えばSDS-PAGEおよびイムノブロッティングを使用して、両タンパク質の有無を単一抗体を使用して確認することができる。用語「抗体(antibody)」および「複数の抗体(antibodies)」は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体だけには限られないが、これらを含む。
用語「特異的に結合する」は、特異的ポリペプチド、例えばNMT1またはNMT2のエピトープとの、抗体の高アビディティーおよび/または高アフィニティー結合を指す。この特異的ポリペプチドにおけるそのエピトープと抗体の結合は、任意の他のエピトープ、特に対象の特異的ポリペプチドと結合している、またはそれと同じサンプル中の分子中に存在し得るエピトープと同じ抗体の結合より強い。対象のポリペプチドと特異的に結合する抗体は、弱い、ただし検出可能なレベルで他のポリペプチドと結合することができる。このような弱い結合、またはバックグラウンド結合は、当業者に知られているように、例えば適切な対照を使用することによって、対象の化合物またはポリペプチドと特異的抗体の結合とは容易に識別可能である。
一例では、癌細胞を含有するかまたは癌細胞を含有する疑いがあるサンプルを、癌を有する対象から得る。このようなサンプルの回収は当業者によく知られている。具体的な例では、サンプルは血液サンプルである。サンプルを得る方法、このようなサンプルの処理および/または保存法も当業者によく知られている。
具体的な例では、サンプル内のNMT1またはNMT2タンパク質の検出、分析または測定は、免疫組織化学法を使用して実施する。他のイムノアッセイ、定性的または定量的アッセイも本発明中で使用することができることは、当業者には明らかであろう。
NMT1またはNMT2の検出、分析または測定中で使用することができる他の例には、対象からサンプルを得るための、イムノブロッティング、ELISA、間接的免疫蛍光法、多重化ビーズ技術、免疫沈降および質量分析があるが、これらだけには限られない。実際には、患者のサンプルをNMT2染色が低いまたは無いと決定する例では、対象はNMT阻害剤療法に適した候補であると考えられる。
別の例では、本開示の方法は、NMT1および/またはNMT2活性の有無または量に関して、癌患者を有する対象由来の生物サンプル中のNMT1タンパク質および/またはNMT2タンパク質の活性を定性的または定量的に決定、分析または測定するステップを含む。この例では、NMT1またはNMT2の(天然または合成)基質の使用を使用して、NMT1またはNMT2活性が存在する、不在であるサンプル、またはその量を確認する。
実際には、対象のサンプルがNMT2に欠陥があると決定する例では、対象はNMT阻害剤に関する投与に適した候補であると考えられる。
実際には、患者のサンプルはNMT2活性が低いまたは無いと決定する例では、対象はNMT阻害剤に関する投与に適した候補であると考えられる。
実際には、患者のサンプルはミリストイル化タンパク質の量が少ないまたは存在しないと決定する例では、対象はNMT阻害剤に関する投与に適した候補であると考えられる。
実際には、対象のサンプルはアシル化タンパク質の量が少ないまたは存在しないと決定する例では、対象はNMT阻害剤に関する投与に適した候補であると考えられる。
別の例では、本開示の方法は、癌を有するかまたは癌を有する疑いがある対象由来のサンプル中のNMT1またはNMT2遺伝子における突然変異、欠失などを確認するステップを含む。この場合、NMT1またはNMT2遺伝子における前記突然変異、欠失などは、前記サンプル内の癌細胞におけるNMT1またはNMT2タンパク質活性の消失または低下をもたらす。NMT1またはNMT2におけるこのような突然変異、欠失などを確認する方法は当業者に知られており、RFLP、RT-PCT、マイクロアレイ分析、および/または任意の適切な型のDNA配列決定を含むが、これらだけには限られない。実際には、患者のサンプルが、低いNMT2タンパク質活性をもたらす、またはそれをもたらさないNMT2における突然変異、欠失などを有すると決定する例では、対象はNMT阻害剤療法に適した候補であると考えられる。
別の例では、本開示の方法は、癌を有するかまたは癌を有する疑いがある対象由来のサンプル中のNMT1またはNMT2のmRNAにおける突然変異、欠失などを確認するステップを含む。この場合、NMT1またはNMT2のmRNAにおける前記突然変異、欠失などは、前記サンプル内の癌細胞におけるNMT1またはNMT2タンパク質活性の消失または低下をもたらす。NMT1またはNMT2のmRNAにおけるこのような突然変異、欠失などを確認する方法は当業者に知られており、ノーザンブロッティング、RT-PCR、マイクロアレイ分析、および/または任意の適切な型のmRNA配列決定を含むが、これらだけには限られない。実際には、患者のサンプルが、低いNMT2タンパク質活性をもたらす、またはそれをもたらさないNMT2のmRNAにおける突然変異、欠失などを有すると決定する例では、対象はNMT阻害剤療法に適した候補であると考えられる。
別の例では、本開示の方法は、NMT1またはNMT2の欠陥と関係がある癌に罹患している対象の治療するための方法であって、NMTの阻害剤を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
阻害剤の例には、小分子、抗体、ペプチド断片、および/または核酸分子があるが、これらだけには限られない。
小分子の具体的な例には、トリス-DBA、HMA、DDD85646、およびこれらの誘導体がある。本明細書中で使用する、用語「誘導体」には、塩、配位錯体、in vivo加水分解性エステルなどのエステル、遊離酸または塩基、水和物、プロドラッグまたは脂質、カップリングパートナーがあるが、これらだけには限られない。
NMT1のその活性部位を化学合成することによって、ペプチド断片を完全または部分的に調製することができる。当業者に知られている確立した、標準的な液相または固相ペプチド合成法に従い、ペプチド断片を調製することができる。
核酸阻害剤、またはその補体は、活性ポリペプチドの生成を下方制御することによって活性または機能を阻害する。これは、当技術分野でよく知られている従来法を使用して、例えば実施例中に記載するリアルタイムPCRを使用したスクリーニングによって、モニタリングすることができる。
核酸阻害剤の例には、遺伝子発現を下方制御するためのその使用が当技術分野で十分確立している、アンチセンスまたはRNAi技術がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸、プレmRNAまたは成熟mRNAの相補配列とハイブリダイズして、塩基除去修復経路成分の生成に干渉し、結果としてその発現が低減されるまたは完全もしくは実質的に完全に妨げられるように設計することができる。コード配列を標的化する以外に、アンチセンス技法を使用して、例えば5'隣接配列における遺伝子の対照配列を標的化することができ、それによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは発現対照配列に干渉することができる。
アンチセンスの代替は、標的遺伝子と同じ方向であるセンスに挿入される標的遺伝子の全部または一部のコピーを使用して、同時抑制により標的遺伝子の発現の低減を得ることである。
追加的に、二本鎖RNA(dsRNA)サイレンシングを使用することができる。dsRNA媒介サイレンシングは遺伝子特異的であり、RNA干渉(RNAi)と呼ばれることが多い。
別の例では、転写時にリボザイムを生成する核酸を使用し、リボザイムは特定部位で核酸を切断することができ、したがってNMTに影響を与える際にも有用である。
さらに別の例では、低分子RNAを利用して遺伝子発現を制御することができる。これらは、低分子干渉RNA(siRNA)によるmRNAの標的化分解、転写後遺伝子サイレンシング(PTG)、マイクロRNA(miRNA)によるmRNAの発生段階制御配列特異的翻訳抑制および標的化転写遺伝子サイレンシングを含む。
さらに別の例では、細胞内での低分子ヘアピン型RNA分子(shRNA)の発現を使用することができる。shRNAは、小ループ配列により隔てられた低分子逆方向反復配列からなる。一つの逆方向反復配列は遺伝子標的と相補的である。細胞内で、shRNAはDICERによってsiRNAにプロセシングされ、siRNAは標的NMT遺伝子mRNAを分解し発現を抑制する。好ましい実施形態では、ベクターからの転写によってshRNAが(細胞内で)内在的に生成される。
NMT1またはNMT2の欠陥は、NMT1またはNMT2媒介経路の要素に欠陥がある可能性がある、NMT1またはNMT2に欠陥がある表現型であり、すなわち、経路の要素の活性の発現は、対照細胞と比較して、癌細胞において低減または消失する可能性がある。幾つかの実施形態では、癌細胞はNMT1またはNMT2に欠陥がある可能性がある、すなわちNMT1またはNMT2の活性の発現は、対照細胞と比較して、癌細胞において低減または消失する可能性がある。
したがって、対象における癌の診断、予後、分類、またはモニタリングの1つまたは複数に関するマーカーとしてのNMT2の使用を提供する。幾つかの例では、イムノアッセイまたは核酸検出、またはタンパク質活性から選択されるアッセイを使用して前記NMT2を測定する。
対象における癌の診断、予後、分類またはモニタリングの1つまたは複数に関するマーカーとしての、タンパク質のミリストイル化の使用も提供する。
対象における癌の診断、予後、分類またはモニタリングの1つまたは複数に関するマーカーとしての、タンパク質のアシル化の使用も提供する。
幾つかの例では、前記癌はリンパ腫である。より具体的な例では、前記リンパ腫はB細胞リンパ腫である。より具体的な例では、前記B細胞リンパ腫は、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、B-CLL/SLL、免疫細胞腫/ヴァルデンストレーム病、MALT型/単球様B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小児リンパ腫、または未分化大細胞リンパ腫である。
キットの形でこのような方法において使用する化合物および/または組成物を提供することによって、本発明の方法を好都合に実施することができる。このようなキットは、組成物を含有することが好ましい。このようなキットは、その使用説明書を含有することが好ましい。
本明細書に記載する本発明のより良い理解を得るために、以下の実施例を述べる。これらの実施例が、単なる例示目的であることは理解されるはずである。したがって、それらは如何なる形式でも本発明の範囲を制限することはないはずである。
(実施例)
以下の実施例では、当業者によって理解されているように、標準的な方法を使用した。
材料および方法
抗体および試薬
トリスジブチルベンジリデンアセトンパラジウム(トリスDBA)はDr.Arbiser(U.Alabama)の親切な提供物であった。DDD85646は[J.A.Frearson et al(2010)Nature.464.728〜723頁]中に記載されたように合成し、Dr.David Gray and Paul Wyatt、Dundee Universityから得た。
マウス抗NMT1(クローン14;1:1000)およびマウス抗NMT2(クローン30;1:2000)抗体はBD Biosciences、San Jose、CA、USAからのものであった。ウサギ抗NMT1(ポリクローナル;1:3000)はProteintech、Chicago、IL、USAから購入した。ウサギ抗GFP(1:20,000)、抗PARP-1(1:5000)、抗GAPDH(1:5000)および抗c末端PAK2(1:2000)抗体はEusera(www.eusera.com)Edomonton、AB、Canadaからのものであった。マウス抗αチューブリン(1:15,000)およびウサギ抗V5(1:10,000)抗体はSigma Aldrich、St.Louis、MO、USAから購入した。マウス抗His(1:2000)はQiagen、Germanyからのものであった。ウサギ抗切断型カスパーゼ-8(1:1000)および抗切断型カスパーゼ-3(1:1000)は、いずれもCell Signaling Danvers、MA、USAからのものであった。Enhanced chemiluminesce(ECL)Plus and ECL Primeウエスタンブロッティング検出キットはGE Healthcare、Pittsburgh、PA、USAから購入した。他に言及しない限り、使用した全ての化学物質はSigma-Aldrich(St.Louis、MO、USA)から購入し、最高純度で利用可能であった。
DNA構築物。V5-およびHisタグNMT1およびNMT2構築物の操作処理。Gatewayクローニングシステム(Life Technologies、Grand Island、N.Y.、USA)と適合性があるNMT1およびNMT2エントリーベクターはGenecopocia(Rockville、MD、USA)から購入した。製造者の説明書に従いLRクロナーゼ酵素(Life Technologies)を使用して、NMT1およびNMT2遺伝子をデスティネーションベクターpcDNA3.1/nV5DEST(Life Technologies)に組み込んで、プラスミドN末端タグNMT(His-NMT1、His-NMT2、V5-NMT1およびV5-NMT2)を生成した。V5タグNMT構築物は哺乳動物細胞発現用に使用し、一方His-NMT構築物は細菌発現用に使用した。クローニング産物はDNAの配列決定によって確認した(Eurofins MWG Operon、Huntsville、AL、USA)。
細胞培養。B細胞の由来はDr.Jim Stoneからの提供物であり、またはATCCから得た。細胞培養用の全ての試薬はInvitrogenから購入した。B細胞は加湿インキュベーター中で37℃および5%CO2において培養し、10%のウシ胎児血清、100U/mlのペニシリンおよび0.1mg/mlのストレプトマイシンを補充したRPMI培地中に維持した。
細胞溶解。細胞は冷却PBS中で洗浄し、0.1%のSDS-RIPAバッファー[50mMのトリス、150mMのNaCl、1%のIgepal CA-630、0.5%のNaDC、2mMのMgCl2、1×完全プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics);pH8.0]中で溶解し、4℃において15分間固定した。4℃において15分間の16,000gでの遠心分離後に、細胞溶解物上清を得た。
アポトーシスの誘導。他に言及しない限り、2.5μMのスタウロスポリン(STS)(Sigma Aldrich、St.Louis、MO、USA)および5μg/mLのシクロヘキシミド(ICN Biochemicals Inc.Aurora、OH、USA)を使用しアポトーシスを誘導して、タンパク質の翻訳を阻害しアポトーシスの誘導を助長した。
NMT阻害剤とのインキュベーション。トリスジブチルベンジリデンアセトンパラジウム(トリスDBA)はDr.Arbiserの親切な提供物であった。細胞は高濃度のトリスDBA(もしくは対照に関してDMSO)と共に24時間、またはDDD85646と共に24時間および48時間インキュベートした。
B細胞トランスフェクション。製造者の説明書に従いNeon(登録商標)トランスフェクションシステム(Life technologies)、および100μLチップに適合させたラモスB細胞トランスフェクション用の最適化プロトコール(パルス電圧1,300V;パルス幅20ms、2パルスおよび7.7.106細胞/mL)を使用してB細胞をトランスフェクトした。古典的に、2つのトランスフェクションを施用して、生存率アッセイを実施するのに十分な生存細胞を得た。
細胞生存率アッセイ。B細胞およびT細胞の生存率を、トリパンブルー色素排除法を使用して測定した。細胞は密集状態(2×106細胞/mL、最大)で増殖させ、最小基底のアポトーシスとなることを確実にした。NMT阻害剤とのインキュベーション後、約20000個の細胞(10μL)を、10μLのTC10(商標)トリパンブルー色素(Biorad)と共に15分間インキュベートした。TC10(商標)自動セルカウンター(Biorad)を使用して、細胞生存率を定量化した。
in vitroでのNMT活性のアッセイ。Raju.R.V.,and Sharma.R.K.(1999)Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase.Methods Mol Biol 116、193〜211頁からのN-ミリストイルトランスフェラーゼ活性のアッセイプロトコールを適合させた。[3H]ミリストイル-CoAは、Towler,D.,and Glaser,L.(1986)Protein fatty acid acylation:enzymatic synthesis of an N-myristoyglycyl peptide.Proc Natl Acad Sci USA83、2812〜2816頁によって以前に記載されたように、各実験用に新たに合成した。簡単に言うと、細胞を0.25Mのスクロースバッファー(50mMのNaH2PO4、pH7.4)に再縣濁し、Branson Sonicatorにおいてレベル6.0で2ラウンドの超音波処理を施した。反応混合物は、NMT活性バッファー(0.26Mのトリス-HCl、3.25mMのEGTA、2.92mMのEDTAおよび29.25mMの2-メルカプトエタノール、1%のTriton X-100、pH7.4)中でインキュベートした10μLの細胞抽出物(約20μgのタンパク質)、および切断型Bid(0.1mM、水中に溶解)のN末端配列に対応するミリストイル化または非ミリストイル化デカペプチドで構成される。7.4μL(約10pMol)の新たに合成した[3H]ミリストイル-CoA(最終混合物体積=25μL)を加えることによって反応を開始し、30℃で15分間インキュベートした。P81ホスホセルロースペーパーディスク(Whatman、Kent、UK)における15μLの反応混合物のスポットにより反応を停止させ、30秒間乾燥させる。ディスクを洗浄して(洗浄バッファー、25mMのトリスバッファー、pH7.4)残留放射能([3H]-ミリステートおよび[3H]ミリストイル-CoA)を除去し、一方[3H]ミリストイル-ペプチドはホスホセルロースペーパー上に保持した。液体シンチレーション計数により放射能を定量化し、ミリストイル化ペプチドのpMolに変換した(Raju.R.V.,and Sharma.R.K.(1999)Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase.Methods Mol Biol 116、193〜211頁)。
RT-PCR。内部対照として18Sプローブを使用し、TaqmanのNMT1およびNMT2プローブを用いてqRT-PCRを実施した。サイクル時間数の差(Δct)は、本発明者らが各細胞型に関する18S内部対照の発現の指数関数的増加を見たサイクル時間(ct)を、シグナルの指数関数的増加を再度見る地点でのNMTサイクル時間から差し引くことによって計算した。
(実施例1)
図1は、正常細胞および様々なB細胞リンパ腫およびT細胞白血病における、NMT1およびNMT2発現の分析を示す。この図は、正常B細胞(EBV形質転換ヒトBリンパ球、L0)およびヒト白血病T細胞系(ジャーカット、MOLT-4、CEM)と比較した、NMT1のみを発現するBリンパ腫細胞系(BL-2、ラモス)における、NMT2の発現のほぼ完全な不在を示す。
理論によって束縛されることは望まないが、ただ一つのNMTアイソザイムのみを発現する細胞、例えばNMT2のほぼ完全な不在を示すバーキットリンパ腫細胞は、改変型ミリストイル化タンパク質プロファイルを有する可能性がある。
(場合によっては対照と比較して)サンプル中に少量のミリストイル化タンパク質を有するサンプルは、NMTに欠陥があるサンプル、またはNMTに欠陥がある癌を示す。このようなNMTに欠陥がある癌は、阻害剤またはNMT1で治療するのが適切である。
(実施例2)
図2は、NMT阻害剤、トリス-ジベンジリデンアセトン-ジパラジウム(トリス-DBA)に対する、様々なB細胞リンパ腫およびT細胞白血病の感受性を示す。様々なB細胞およびT細胞は、高濃度のトリスDBAと共に24時間インキュベートした。トリパンブルー色素排除法を使用して細胞生存率を測定し、対照に関しては100%に調整した。トリパンブルー色素排除によって測定した細胞生存曲線は、B細胞リンパ腫がNMT阻害剤、トリス-ジベンジリデンアセトン-ジパラジウム(トリス-DBA)に対してより感受性があることを示す。
(実施例3)
図3は、トリス-ジベンジリデンアセトン-ジパラジウム(トリス-DBA)による、N-ミリストイルトランスフェラーゼ(NMT)の阻害を示す。
精製組換えNMT1およびNMT2を用いたペプチドミリストイル化アッセイを使用して、NMT活性をアッセイした。NMT活性は、(King et al.1991、Anal Biochemから適合させた)ホスホセルロースペーパーで生成し検出した放射標識ミリストイルペプチドの量から計算した。
この図は、精製組換えNMT酵素を使用すると、トリス-ジベンジリデンアセトン-ジパラジウム(トリス-DBA)がin vitroでNMTを阻害することを示す。
(実施例4)
図4は、NMT1(パネルA)およびNMT2(パネルB)に対する抗体でリンパ腫細胞系をプロ−ビングした、イムノブロットの結果を示す。図4の凡例は、以下に相当する:IM9:Bリンパ芽球;BL2:バーキットリンパ腫;CEM:T細胞白血病;Karpas299:T細胞リンパ腫;Sup-M2:ALCL;UCONN:ALCL(ALCL:未分化大細胞リンパ腫);DAUDI:バーキットリンパ腫;ラモス:バーキットリンパ腫BJAB:バーキットリンパ腫;HD-MYZ:ホジキンリンパ腫;KM-H2:ホジキンリンパ腫;L428:ホジキンリンパ腫;ジャーカット:T細胞白血病。
(実施例5)
図5は、異なる濃度で48時間後に不死化正常Bリンパ球性細胞系(IM9)と比較した、バーキットリンパ腫細胞系ラモスに対するNMT阻害剤の有効性を示す。
(実施例6)
この実施例では、pcDNA3.1-V5-NMT2による(本明細書中で示すようにNMT1を発現する)ラモスBリンパ腫細胞のトランスフェクションによって、空プラスミドベクターでトランスフェクトした対照細胞に対して、トリスDBA(5ug/ml)に対する生存が2.5倍増大した。図6では、ラモス細胞系に関して勧められるプロトコール(1,350ボルト、30ms)に従いNeonトランスフェクションシステム(Invitrogen)を使用して、20×106個のラモスBリンパ腫細胞を32μgのDNA(pcDNA3.1-V5空またはpcDNA3.1-V5-NMT2)でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞は5分間1200rpmで遠心分離して、死細胞および細胞残骸を除去した。上清中の細胞は完全RPMIにおいて6時間回収した。PBSで洗浄した後、細胞を再縣濁し、トリスDBA(5ug/ml)を含有するRPMI中で24時間増殖させ、次いでトリパンブルー色素排除法を使用して計数した(パネルA)。細胞を溶かし、NMT2に対する抗体および充填対照用にGAPDHを用いて、ウエスタンブロッティング(ECL)を実施してNMT2の発現を確認した(パネルB)。
(実施例7)
この実施例では、内部対照として18Sプローブを使用し、TaqmanのNMT1およびNMT2プローブを用いてqRT-PCRを実施した。サイクル時間数の差(Δct)は、本発明者らが各細胞型に関する18S内部対照の発現の指数関数的増加を見たサイクル時間(ct)を、シグナルの指数関数的増加を再度見る地点でのNMTサイクル時間から差し引くことによって計算した。以下のTable 1(表1)中に示すように、Bリンパ腫細胞系においてNMT2発現とNMT1発現の比は(最大60倍)減少する。理論によって束縛されることは望まないが、ウエスタンブロッティングにより評価して、これらの結果は、NMT2をコードするmRNAの低減は、NMT2タンパク質レベルの低減の原因であり得ることを示唆することができる。
本明細書中で言及する全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明と関係がある当業者のレベルを示し、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
このように本発明を記載してきたが、多くの方法で本発明を変更することができることは明白であろう。このような変更は本発明の精神および範囲から逸脱するとみなすべきではなく、全てのこのような修正は、当業者には明白であるように、以下の特許請求の範囲内に含まれるものとする。

Claims (30)

  1. NMT2遺伝子の後成的不活性化、または、タンパク質機能の消失、または正常B細胞である対照と比較して低いか存在しないNMT2タンパク質のレベルを有することによって決定される、NMT2に欠陥がある、B細胞リンパ腫である癌を有する対象を治療するための、NMT1阻害剤を含む組成物であって、
    前記B細胞リンパ腫が、バーキットリンパ腫である組成物。
  2. 前記NMT1阻害剤が小分子、抗体、ペプチド断片、または核酸である、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記小分子がDDD85646、またはその誘導体である、請求項2に記載の組成物。
  4. 前記抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項2に記載の組成物。
  5. 前記核酸がdsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、リボザイム、shRNA分子、またはsiRNA分子を含む、請求項2に記載の組成物。
  6. 前記対象がヒト対象である、請求項1に記載の組成物。
  7. 化学療法剤をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
  8. 前記化学療法剤がCHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAPまたはEPOCHである、請求項7に記載の組成物。
  9. B細胞リンパ腫である癌を有する対象を検出する方法であって、
    a.前記対象由来のサンプルを測定して、NMT2遺伝子の後成的不活性化、または、タンパク質機能の消失、または正常B細胞である対照と比較して低いか存在しないNMT2タンパク質のレベルを有することによって決定される、前記サンプルがNMT2に欠陥があるかどうか決定するステップ
    を含み、
    前記B細胞リンパ腫が、バーキットリンパ腫である方法。
  10. 前記対象がヒト対象である、請求項9に記載の方法。
  11. 定量的蛍光活性化細胞選別、酵素結合免疫吸着アッセイ、免疫組織化学法、定量的免疫組織化学法、蛍光共鳴エネルギー移動、フォスター共鳴エネルギー移動、蛍光タンパク質再構成法、質量分析法、イムノブロットアッセイまたは共免疫沈降アッセイを使用して、前記サンプルの測定を実施する、請求項9に記載の方法。
  12. NMT2遺伝子の後成的不活性化、または、タンパク質機能の消失、または正常B細胞である対照と比較して低いか存在しないNMT2タンパク質のレベルを有することによって決定される、NMT2に欠陥がある、B細胞リンパ腫である癌を有する対象を治療するためのキットであって、NMT1阻害剤およびその使用に関する説明書を含み、
    前記B細胞リンパ腫が、バーキットリンパ腫であるキット。
  13. 前記NMT1阻害剤が小分子、抗体、ペプチド断片、または核酸である、請求項12に記載のキット。
  14. 前記小分子がトリス-DBA、HMA、もしくはDDD85646、またはこれらの誘導体である、請求項13に記載のキット。
  15. 前記抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項13に記載のキット。
  16. 前記核酸がdsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、リボザイム、shRNA分子、またはsiRNA分子を含む、請求項13に記載のキット。
  17. 前記対象がヒト対象である、請求項12に記載のキット。
  18. 化学療法剤をさらに含む、請求項12に記載のキット。
  19. 前記化学療法剤がCHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAPまたはEPOCHである、請求項18に記載のキット。
  20. NMT2遺伝子の後成的不活性化、または、タンパク質機能の消失、または正常B細胞である対照と比較して低いか存在しないNMT2タンパク質のレベルを有することによって決定される、NMT2に欠陥がある、B細胞リンパ腫である癌を有する対象の治療用の、医薬品を調製するためのNMT1阻害剤の使用であって、
    前記B細胞リンパ腫が、バーキットリンパ腫である使用。
  21. 前記NMT1阻害剤が小分子、抗体、ペプチド断片、または核酸である、請求項20に記載の使用。
  22. 前記小分子がDDD85646、またはその誘導体である、請求項21に記載の使用。
  23. 前記抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項21に記載の使用。
  24. 前記核酸がdsRNA分子、RNAi分子、miRNA分子、リボザイム、shRNA分子、またはsiRNA分子を含む、請求項21に記載の使用。
  25. 前記対象がヒト対象である、請求項20に記載の使用。
  26. 化学療法剤を投与するステップをさらに含む、請求項20に記載の使用。
  27. 前記化学療法剤がCHOP、GAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEFF(B)、CAMP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、MTX-CHOP、CEM、CEVD、CAVP、EVAPまたはEPOCHである、請求項26に記載の使用。
  28. 対象におけるB細胞リンパ腫である癌の診断、予後、分類またはモニタリングの1つまたは複数に関する、NMT2遺伝子の後成的不活性化、または、タンパク質機能の消失、または正常B細胞である対照と比較して低いか存在しないNMT2タンパク質のレベルを有することによって決定されるマーカーとしてのNMT2の使用であって、
    前記B細胞リンパ腫が、バーキットリンパ腫である使用。
  29. 対象におけるB細胞リンパ腫である癌の診断、予後、分類またはモニタリングの1つまたは複数に関するマーカーとしての、タンパク質のミリストイル化の使用であって、
    前記B細胞リンパ腫が、バーキットリンパ腫である使用。
  30. イムノアッセイまたは核酸検出、またはタンパク質活性から選択されるアッセイを使用して前記マーカーを測定する、請求項28に記載の使用。
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