JP6133053B2

JP6133053B2 - アミロイドの凝集体の定量方法及びその定量装置

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Publication number: JP6133053B2
Application number: JP2012279761A
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Inventors: 明典小田; 浩里園; 小杉　壮; 壮小杉
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Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2017-05-24
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Description

本発明は、アミロイドの凝集体の定量方法及びその定量装置に関する。

社会的問題となっているアルツハイマー型認知症の研究においては、根本的治療の観点から、ベータアミロイドタンパク質が早期診断及び治療のターゲットとして注目を浴びている。アルツハイマー型認知症において、ベータアミロイドタンパク質の脳内における蓄積が、最初にあらわれる病態だからである。蓄積したベータアミロイドタンパク質は、βシート構造に富む凝集体を形成し脳内の神経細胞に悪影響を与える。そのため、ベータアミロイドタンパク質の濃度及びベータアミロイドタンパク質の凝集についての情報を測定する方法が重要となる。

ベータアミロイドタンパク質は、凝集状態によって水に対し不溶となるものもあり、その場合には高速液体クロマトグラフィー及び電気泳動といった手法の適用が困難となる。そこで、不溶化物含有の有無に関わらず、ベータアミロイドタンパク質の凝集を測定する方法として蛍光測定がよく用いられる。蛍光測定の従来法として、チオフラビンＴ等の蛍光色素（蛍光物質）と分光蛍光光度計とを利用した蛍光強度測定がある（特許文献１）。この測定法は、チオフラビンＴと、ベータアミロイドタンパク質の凝集によって形成されるβシート構造と、の相互作用によって生じる蛍光を利用した方法であり、凝集体の定量や凝集状態の測定を行うことができる。

特開２０１１−２１２１１６号公報

大学出版、「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９９９年刊、第３０９巻、第２７４−２８７頁、第３０４−３０５頁Ｄ．Ｖ．Ｏ’Ｃｏｒｎｏｒ著、「ナノ・ピコ秒の蛍光測定と解析法−時間相関単一光子計数法−」、学会出版センター、第２章第３３〜５１頁、第６章第１５３〜２０６頁Ｐ．Ｋ．Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．Ｋｕｍｂｈａｋａｒ，Ｈ．Ｐａｌ，ａｎｄＳ．Ｎａｔｈ，‘ＵｌｔｒａｆａｓｔＢｏｎｄＴｗｉｓｔｉｎｇＤｙｎａｍｉｃｓｉｎＡｍｙｌｏｉｄＦｉｂｒｉｌＳｅｎｓｏｒ’，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，Ｖｏｌ．１１４，第２５４１−２５４６頁、（２０１０）Ａ．Ａ．Ｒｅｉｎｋｅ，Ｊ．Ｅ．Ｇｅｓｔｗｉｃｋｉ，ＩｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏＡｍｙｌｏｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅＵｓｉｎｇＣｈｅｍｉｃａｌＰｒｏｂｅｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｄｒｕｇ，Ｖｏｌ．７７，第３９９−４１１頁、（２０１１）

しかしながら、上記蛍光強度測定では、測定の対象とすべきでないチオフラビンＴの自家蛍光及び不純物に由来する蛍光も積算してしまうため、凝集体の定量において正確な値を得ることができない。

このような背景から、ベータアミロイドタンパク質の凝集体（ベータアミロイド凝集体）等のアミロイド凝集体の量を精度良く測定する方法の開発が望まれている。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、精度良く測定することが可能なアミロイドの凝集体の定量方法及びその定量装置を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ある特定の蛍光物質とアミロイド凝集体とが結合した複合体に由来する蛍光寿命値が、アミロイドの凝集状態に依存せずに一定であることを見出し、本願発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料に、上記蛍光物質を励起する光を照射する、励起光照射ステップと、
上記試料から発する蛍光を経時的に検出して、蛍光減衰曲線のデータを取得する、データ取得ステップと、
上記蛍光減衰曲線のデータと、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値と、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて上記複合体に由来する第一の重み因子を算出する、重み因子算出ステップと、
上記第一の重み因子に基づいて前記アミロイドの凝集体の量を算出する、凝集体定量ステップと、
を含む、アミロイドの凝集体の定量方法を提供する。

本発明の定量方法によれば、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値は、アミロイドの凝集体の状態に依存せずに一定であるので、アミロイドの凝集体を精度良く測定することが可能になる。

上記蛍光物質は、チオフラビンＳ、６−（２−フルオロエトキシ）−２−（４−メチルアミノスチリル）ベンゾオキサゾール及び８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、並びに、下記式（１）、（２）、（３）又は（４）で表される化合物から選ばれることが好ましい。これらの蛍光物質を用いることによって、アミロイドの凝集体をより精度良く測定することが可能になる。式（１）中、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ^３は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示し、ＡはＯ又はＳを示し、５員環に含まれる窒素原子は炭素数１〜６のアルキル基と結合していてもよく、式（２）中、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水酸基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を示し、Ｘは水素又はハロゲンを示し、式（３）中、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０及びＲ^１１はそれぞれ独立に水素、水酸基、ハロゲン、又は、１若しくは２つの炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示し、式（４）中、Ｒ^１２及びＲ^１３はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ^１４は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示す。

本発明に係る定量方法は、上記データ取得ステップに続いて、上記第一の蛍光寿命値を、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて算出する、蛍光寿命算出ステップを更に含んでもよい。上記ステップを更に含むことで、上記第一の蛍光寿命値が不明である蛍光物質を用いた場合でも、アミロイドの凝集体を定量することが可能になる。

更に本発明は、アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料に、上記蛍光物質を励起する光を照射する光源部と、上記試料から発する蛍光を経時的に検出する検出部と、経時的に検出した上記蛍光から蛍光減衰曲線のデータを記録する記録部と、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値と、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて上記複合体に由来する第一の重み因子を算出し、上記第一の重み因子に基づいて上記アミロイドの凝集体の量を算出する演算部と、を備える、アミロイドの凝集体の定量装置を提供する。

本発明によれば、精度良く測定することが可能なアミロイド凝集体の定量方法及びその定量装置を提供することが可能になる。

アミロイドの凝集体の定量装置の一実施形態を示す模式図である。チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体を含む試料の蛍光減衰曲線を示すグラフである。チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分の重み因子の経時変化を示すグラフである。チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分の重み因子及び蛍光量の相対比率を示すグラフである。チオフラビンＳによって染色されたベータアミロイド凝集体を含む試料の蛍光減衰曲線を示すグラフである。チオフラビンＳによって染色されたベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分の重み因子及び蛍光量の相対比率を示すグラフである。ＦＳＢによって染色されたベータアミロイド凝集体を含む試料の蛍光減衰曲線を示すグラフである。ＦＳＢによって染色されたベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分の重み因子及び蛍光量の相対比率を示すグラフである。ＡＮＳによって染色されたベータアミロイド凝集体を含む試料の蛍光減衰曲線を示すグラフである。ＡＮＳによって染色されたベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分の重み因子、蛍光量及び蛍光比の相対比率を示すグラフである。ＢＦ−１６８によって染色されたベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分の重み因子及び蛍光量の相対比率を示すグラフである。レスベラトロールによって染色されたベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分の重み因子及び蛍光量の相対比率を示すグラフである。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

本実施形態に係るアミロイドの凝集体の定量方法は、励起光照射ステップと、データ取得ステップと、重み因子算出ステップと、凝集体定量ステップと、を含む。

励起光照射ステップでは、アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料に、上記蛍光物質を励起する光を照射する。

本実施形態に係るアミロイドは、層状のβシート構造を含むアミロイド線維（アミロイド繊維）を形成し得るタンパク質を意味する。上記アミロイドとしては、例えば、ベータアミロイドタンパク質（アミロイドβタンパク質）、免疫グロブリン軽鎖タンパク質、アミロイドＡタンパク質、トランスサイレチンタンパク質、リソザイム、ＢｒｉＬタンパク質、シスタチンＣタンパク質、スクレイピータンパク質、β２ミクログロブリン、アポリポプロテインＡ１、ゲルソリン（ゲルゾリン）、ランゲルハンス島アミロイドタンパク質、フィブリノーゲン、プロラクチン、インシュリン、カルシトニン、心房性ナトリウムペプチド、α−シヌクレイン（シヌクリン）、プリオンタンパク質、ハンチンチンタンパク質、スーパーオキサイドジスムターゼ、α１−アンチキモトリプシ及びタウタンパク質が挙げられる。本実施形態に係る定量方法は、ベータアミロイドタンパク質に対して好ましく適用される。

本実施形態に係るアミロイドの凝集体（以下、アミロイド凝集体という場合がある）は、複数のアミロイド分子が凝集することによって生成される物質を意味する。アミロイド凝集体には、上記アミロイドのダイマー、トリマー、テトラマー、オリゴマー等が含まれる。

本実施形態に係る蛍光物質としては、蛍光物質とアミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する蛍光寿命値が、アミロイドの凝集状態に依存せずに一定となるような蛍光物質であれば特に制限されない。例えば、チオフラビンＳ、６−（２−フルオロエトキシ）−２−（４−メチルアミノスチリル）ベンゾオキサゾール（ＢＦ−１６８）及び８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、並びに、下記式（１）、（２）、（３）又は（４）で表される化合物が挙げられる。これらの蛍光物質を用いることによって、アミロイドの凝集体をより精度良く測定することが可能になる。

式（１）中、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ^３は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示し、ＡはＯ又はＳを示す。さらに、５員環に含まれる窒素原子は炭素数１〜６のアルキル基と結合していてもよい。上記炭素数１〜６のアルキル基は、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。上記ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。

式（１）で表される化合物としては、例えば、チオフラビンＴ、２−（４’−アミノフェニル）−６−メチルベンゾオキサゾール（ＭＢＰＡ）、２−（４’−メチルアミノフェニル）−６−メチルベンゾオキサゾール（（６−Ｍｅ−）ＢＴＡ−１）、２−（４’−ジメチルアミノフェニル）−６−ヨードベンゾチアゾール（ＴＺＤＭ）、２−（４’−メチルアミノフェニル）−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（ＰＩＢ）及び２−（４’−ジメチルアミノフェニル）−６−ヨードベンゾオキサゾール（ＩＢＯＸ）が挙げられる。

式（２）中、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水酸基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を示し、Ｘは水素又はハロゲンを示す。上記炭素数１〜６のアルコキシ基は、炭素数１〜３のアルコキシ基であることが好ましく、メトキシ基であることがより好ましい。上記ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。

式（２）で表される化合物としては、例えば、１−フルオロ−２，５−ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン（ＦＳＢ）、１，４−ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン（Ｘ−３４）、１−ブロモ−２，５−ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン（ＢＳＢ）、１−ヨード−２，５−ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン（ＩＳＢ）及び１−ヨード−２，５−ビス（３−カルボキシ−４−メトキシスチリル）ベンゼン（ＩＭＳＢ）が挙げられる。

式（３）中、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０及びＲ^１１はそれぞれ独立に水素、水酸基、ハロゲン、又は、１若しくは２つの炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示す。上記炭素数１〜６のアルキル基は、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。上記ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。

式（３）で表される化合物としては、例えば、レスベラトロール、ピセアタンノール、（Ｅ）−３’−ヨード−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチルベン（ｍ−Ｉ−スチルベン）、４−ジメチルアミノスチルベン及び４−Ｎ−メチルアミノ−４’−ヒドロキシスチルベン（ＳＢ−１３）が挙げられる。

式（４）中、Ｒ^１２及びＲ^１３はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ^１４は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示す。上記炭素数１〜６のアルキル基は、炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。上記ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。

式（４）で表される化合物としては、例えば、５−ブロモ−２−（４−ジメチルアミノフェニル）ベンゾフラン（ＢＦ−１）が挙げられる。

本実施形態に係るアミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料としては、これらの成分が含まれていればどのような試料でも制限されないが、好ましくは液体の試料である。上記試料は、例えばアミロイドの凝集体を含む生体試料と蛍光物質とを混合することによって調製することができる。上記生体試料としては、脳脊髄液等が挙げられる。

本実施形態に係る蛍光物質を励起する光としては、用いられる蛍光物質を励起することができれば特に制限されないが、例えば２８０〜８００ｎｍの範囲から選ばれる波長の光が挙げられる。

データ取得ステップでは、上記試料から発する蛍光を経時的に検出して、蛍光減衰曲線のデータを取得する。

上記試料から発する蛍光を経時的に検出して、蛍光減衰曲線のデータを取得する方法としては、公知の方法であれば特に制限されない。例えば、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社製、商品名Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ）を用いた方法が挙げられる。

重み因子算出ステップでは、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値と、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて上記複合体に由来する第一の重み因子を算出する。

上記第一の蛍光寿命値は、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とによって定まる固有の値であり、上記アミロイドの凝集状態に依存しない値である。そのため、本実施形態に係る定量方法では、アミロイドの凝集体を精度良く測定することが可能である。

上記複合体以外の蛍光成分としては、用いられる上記試料にもよるが、例えば、上記蛍光物質の自家蛍光による蛍光成分、蛍光寿命を測定する装置の特性に由来する見かけの蛍光成分、及び上記試料に含まれる不純物に由来する蛍光成分が挙げられる。

上記複合体に由来する第一の重み因子は、例えば、非特許文献２に記載の方法に従い以下の手順で算出することができる。

まず、下記数式（Ｉ）で表される関数Ｇ（ｔ）を、下記数式（ＩＩ）にしたがってコンボリューション積分し、関数Ｉ（ｔ）を得る。数式（ＩＩ）において、Ｅ（ｔ）は蛍光寿命測定装置の装置応答関数、Ｃはバックグラウンドである。次に、上記Ｉ（ｔ）と、測定された蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）とを比較し、両関数が最も良く一致するように、下記数式（ＩＩＩ）におけるχ^２を最小にする変数（τ_１〜τ_ｎ、Ａ_１〜Ａ_ｎ）の組み合わせを探索する。上記探索を行うことによって、数式（Ｉ）におけるτ_１〜τ_ｎ、Ａ_１〜Ａ_ｎの最良の組み合わせが得られる。数式（ＩＩＩ）において、ｎ_１は解析の開始時間、ｎ_２は解析の終了時間を示す。

この解析の結果によって得られたτ_１〜τ_ｎが各蛍光又は発光成分の寿命値であり、Ａ_１〜Ａ_ｎが各蛍光又は発光成分の重み因子、すなわち蛍光又は発光成分の量を示す。

ここで、ｎの値は、蛍光減衰曲線の解析に必要な指数関数の数を示す成分数であり、各成分は違う物理的機構及び／又は蛍光成分若しくは発光成分を起源とする。本実施形態において、これらの成分は、上記複合体に由来する蛍光成分、上記蛍光物質の自家蛍光による蛍光成分、蛍光寿命を測定する装置の特性に由来する見かけの蛍光成分、上記試料に含まれる不純物に由来する蛍光成分等を起源としている。

上記第一の蛍光寿命値、及び上記蛍光物質の自家蛍光の蛍光寿命値が既知である場合、これらの蛍光寿命値を定数として数式（Ｉ）に適用する。蛍光寿命を測定する装置が理想的な場合、蛍光減衰曲線は上述の２成分で解析できるはずであるが、他にも上記装置の特性に由来する見かけの蛍光成分、上記試料に含まれる不純物に由来する蛍光成分等が考えられるため、実際にはこれらの成分を含めた３成分以上の成分数で解析を行う。上記第一の蛍光寿命値がτ_ｎで表されるとき、Ａ_ｎが上記複合体に由来する第一の重み因子として求めることができる。

なお、上記第一の蛍光寿命値が未知であるとき、上記データ取得ステップに続いて、上記第一の蛍光寿命値を、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて算出する、蛍光寿命算出ステップを更に含んでもよい。具体的には、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、を上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に適用し、数式（ＩＩＩ）におけるχ^２を最小にする変数（τ_ｎ、Ａ_１〜Ａ_ｎ）の組み合わせを探索することによって、上記第一の蛍光寿命値（τ_ｎ）を算出する。

凝集体定量ステップでは、上記第一の重み因子に基づいて上記アミロイドの凝集体の量を算出する。上述したように上記第一の重み因子は、上記複合体に由来する蛍光成分の量、すなわち上記アミロイドの凝集体の量に対応する値である。そのため、上記第一の重み因子を直接上記アミロイドの凝集体の量の指標として用いてもよい。また、上記第一の重み因子を上記アミロイドの凝集体の量を反映する別のパラメータとしてもよい。例えば、基準となる第一の重み因子に対する相対比率として表して、上記アミロイドの凝集体の量を相対的に評価してもよい。

次に本実施形態に係るアミロイドの凝集体の定量装置について説明する。本実施形態に係る装置は、アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料に、上記蛍光物質を励起する光を照射する光源部と、上記試料から発する蛍光を経時的に検出する検出部と、経時的に検出した上記蛍光から蛍光減衰曲線のデータを記録する記録部と、上記蛍光減衰曲線のデータと、上記蛍光物質と上記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値と、上記複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて上記複合体に由来する第一の重み因子を算出し、上記第一の重み因子に基づいて上記アミロイドの凝集体の量を算出する演算部と、を備える。以下、詳細に説明する。

図１は、アミロイドの凝集体の定量装置の一実施形態を示す模式図である。アミロイドの凝集体の定量装置１００は、アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む試料３に、蛍光物質を励起する光を照射する光源部６と、試料３から発する蛍光を経時的に検出する検出部１と、経時的に検出した蛍光から蛍光減衰曲線のデータを記録する記録部１５と、蛍光減衰曲線のデータと、蛍光物質とアミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値と、複合体以外の蛍光成分に由来する１又は複数の蛍光寿命値と、に基づいて複合体に由来する第一の重み因子を算出し、第一の重み因子に基づいてアミロイドの凝集体の量を算出する演算部１６と、を備えている。

光源部６は、複数の波長が照射可能な単一又は複数の光源から構成されている。光源部６は、公知の光源を適宜使用することができるが、例えば、ＬＥＤ、半導体レーザーが挙げられる。

光源部６は、試料３に蛍光物質を励起する光を照射するものであって、励起する光の波長は、２８０ｎｍ〜８００ｎｍである。ここで、光源部６は、単色光源であっても、複数の光源を組み合せた光源であってもよい。光源部６の発光は、所定時間連続してもよいし、任意のパターンでパルス点灯させてもよい。同一又は異なる波長特性を有する複数の光源を順番に発光させたり、複数の光源を同時に発光させたりしてもよい。試料の交換時に検出部１を外部光から保護するため、ハッチ１４と同期して開閉するシャッター２を組み合わせても良い。

検出部１は、蛍光物質を励起する光（励起光）が照射されたことによって試料３から生じる蛍光を検出するものであり、蛍光を検知する光センサーと、光センサーに入射する光を制限するためのフィルター、光センサーが検知して出力する信号に基づいて蛍光量を算出する蛍光算出部を有している。

検出部１には、光電子増倍管を用いたフォトンカウンター、アバランシェフォトダイオードを用いた微弱光計測装置等を用いることができる。

記録部１５は、上記蛍光減衰曲線のデータの他にも、蛍光物質の自家蛍光の蛍光寿命値及び蛍光寿命測定装置の特性に由来する見かけの蛍光成分の蛍光寿命値等の解析に必要な情報も記録する。記録部１５は、後述するように解析装置１１に備えられてもよい。

演算部１６は、後述するように解析装置１１に備えられてもよい。

更に上記装置１００は、検出部１に入射する光を制御するシャッター２と、試料３から発せられる蛍光を検出部１に導く集光部４と、検出部１によって得られたデータを後述する解析装置１１に電気的に送信する通信部１０と、装置１００内の温度を調節するための温度調節部１９が設けられている。

検出部１、シャッター２、試料３、集光部４及び光源部６は、外部からの光が遮断可能な遮光部１３に格納されている。遮光部１３は例えば暗箱である。

試料３は、ハッチ１４を開閉して交換を行うことができる。

検出部１、シャッター２、光源部６、通信部１０及び温度調節部１９は、解析装置１１と電気的に接続されており、解析装置１１内にある制御部１２によってその機能が制御されている。

解析装置１１には、記録部１５、演算部１６、解析結果の表示を行う表示部１７、制御に必要な情報を入力するため入力部１８を備えている。

制御部１２は装置１００の作動状況を所定の手順に従って制御可能な制御装置であり、コンピュータ、タイマー、リレー等を組み合わせたもの等が使用できる。

解析装置１１と制御部１２は双方の機能を備えた１つのコンピュータを使用しても良いし、制御部１２、記録部１５、演算部１６、表示部１７、入力部１８に相当する機能を備えたコンピュータ等を用いてもよい。

以下、本発明について、実施例を挙げて更に詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１
（ａ）ベータアミロイド凝集体の調製
ベータアミロイドタンパク質（商品名：ヒト１−４２、ペプチド研究所製）をジメチルスルホキシドで５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、さらに１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いて、ベータアミロイドタンパク質の濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。得られたベータアミロイドタンパク質の調製液は、インキュベータを用いて３７℃でインキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、ベータアミロイド凝集体を含む試料（以下、ベータアミロイド凝集体サンプルという場合がある）を調製した。ベータアミロイド凝集体の量を調整するため、インキュベートの時間が０分、２０分、４０分、６０分、８０分又は１００分である上記試料をそれぞれ準備した。すなわちインキュベートの時間が０分である試料には凝集体が存在せず、インキュベートの時間が増えるに従って凝集体の量が増加し、インキュベートの時間が１００分である試料が最も凝集体の量が多い試料となる。

（ｂ）ベータアミロイド凝集体の染色
ベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、５μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＴ溶液（溶媒：５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。

（ｃ）染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光減衰曲線の測定
（ａ）及び（ｂ）の操作で得られた、インキュベートの時間（以下、凝集時間という場合がある）が０分〜１００分であるベータアミロイド凝集体サンプルから調製された染色試料を、それぞれ１ｃｍ角の石英セルに１０００μＬ分注した。その後、蛍光寿命測定装置（浜松ホトニクス社製、商品名Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ）を用いて、励起波長４０５ｎｍ、観測波長５００ｎｍで、蛍光減衰曲線の測定を行った。測定された蛍光減衰曲線を図２に示す。図２において、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ、凝集時間が０分、２０分、４０分、６０分、８０分及び１００分であるベータアミロイド凝集体サンプルを用いたときの蛍光減衰曲線を示す。

（ｄ）蛍光減衰曲線の解析によるベータアミロイド凝集体の定量
得られたそれぞれの減衰曲線Ｆ（ｔ）は、非特許文献２に従い以下の手順で、固有の蛍光寿命値と重み因子とを持つ複数の蛍光成分に分離した。

まず、数式（Ｉ）で表される関数Ｇ（ｔ）を、数式（ＩＩ）にしたがってコンボリューション積分し、関数Ｉ（ｔ）を得た。数式（ＩＩ）において、Ｅ（ｔ）は蛍光寿命測定装置の装置応答関数、Ｃはバックグラウンドである。次に、上記Ｉ（ｔ）と、測定された蛍光減衰曲線Ｆ（ｔ）とを比較し、両関数が最も良く一致するように、数式（ＩＩＩ）におけるχ^２を最小にする変数の組み合わせを探索した。上記探索を行うことによって、数式（Ｉ）におけるτ_１〜τ_ｎ、Ａ_１〜Ａ_ｎの最良の組み合わせを得た。数式（ＩＩＩ）において、ｎ_１は解析の開始時間、ｎ_２は解析の終了時間を示す。

この解析の結果によって得られたτ_１〜τ_ｎが各蛍光成分の寿命、Ａ_１〜Ａ_ｎが各蛍光成分の重み因子、すなわち蛍光成分の量である。

ｎの値は、すなわち減衰曲線の解析に必要な指数関数の数を示す成分数と呼ばれる数値である。各成分は違う物理的機構及び／又は蛍光種を起源とする。本実施例において、これらの成分は、蛍光寿命測定装置の特性、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光、チオフラビンＴの自家蛍光、及びそれ以外の蛍光成分を起源としており、成分数ｎは試料の状態によって適意に決定する必要がある。

チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体、及びチオフラビンＴの自家蛍光の蛍光寿命値が既知である場合、これらの蛍光寿命値を定数として数式（Ｉ）に適用する。計測装置が理想的な場合、蛍光減衰曲線は上記２成分で解析できるはずであるが、計測装置の特性に由来する見かけの成分、及びチオフラビンＴ以外の蛍光成分があるため、実際にはこれらの成分を含めた３成分以上の成分数で解析を行った。

チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値τ_４を１．８ｎｓ、チオフラビンＴの自家蛍光の蛍光寿命値τ_３を６．６ｎｓとしたときの、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の重み因子Ａ_４（第一の重み因子）の変化を図３に示す。

重み因子Ａ_４は、すなわちチオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の量を示すものである。図３は、凝集の進行に従って重み因子Ａ_４が増えていることを示しており、本手法によってベータアミロイド凝集体の量を定量できることを示すものである。

凝集時間が０分であるときにおける重み因子Ａ_４を１とした場合の、重み因子Ａ_４の凝集時間に対する変化を図４に示す。同じ試料において、凝集時間が０分であるときの全蛍光量を１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、ベータアミロイド凝集体の増加による計測値（重み因子Ａ_４）の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。すなわち、本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。さらに図４によれば、計測値の増分は、本手法の方が従来の方法よりも大きく、ベータアミロイド凝集体をより高感度に検出できることを示している。なお上述の減衰曲線の解析方法については、非特許文献２による一般的な解析方法を適用したものであり、本実施例によって、より高度な解析方法の適用を妨げるのではない。

実施例２
本実施例は、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値が未知であった場合のベータアミロイド凝集体の定量手法について記載するものである。なお本実施例は、蛍光寿命値が未知である場合の解析方法の一例であり、より高度な解析方法の適用を妨げるものではない

ベータアミロイド凝集体の調製、ベータアミロイド凝集体の染色、及び染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光減衰曲線の測定は、実施例１に準じて行った。

本実施例においては、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値が未知であることから、解析における成分数ｎ、及びチオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体からの蛍光の寿命を以下に示す手順を用いて決定した。

蛍光物質によって染色された凝集体の蛍光寿命値が未知である場合の解析の手順（１）
手順１：凝集時間が０分である染色試料の蛍光減衰曲線について必要かつ十分な成分数ｎで解析する。
手順２：解析の結果得られた蛍光寿命値τ_１〜τ_ｎを定数とする。
手順３：凝集時間が０分を超えている染色試料の蛍光減衰曲線について、成分数ｎ＋１で解析する。
手順４：解析の結果、得られた蛍光寿命値τ_ｎ＋１、及び重み因子Ａ_ｎ＋１を蛍光物質によって染色された凝集体の蛍光寿命値と量とする。

以下、手順（１）に従い、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値の決定と定量方法とを具体的に説明する。

まず、ベータアミロイドタンパク質のモノマー（以下、ベータアミロイドモノマーという場合がある）である凝集時間が０分である試料の蛍光減衰曲線について、上述した数式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を用いて解析を行った。解析を行うにあたり成分数ｎは任意であるが、Ｉ（ｔ）とＦ（ｔ）とが最も良く一致するのに必要な最低限の数とした。

このベータアミロイドモノマー試料においては、ベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分は存在しないはずなので、ここで決定されたｎ個の成分は、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光以外からの蛍光成分、すなわち上述した蛍光寿命測定装置の特性由来する見かけの蛍光成分、チオフラビンＴの自家蛍光に由来する蛍光成分、及び不純物等、それ以外のものに由来する蛍光成分の３成分である。

次に、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体が存在すると思われる、凝集時間が２０分以上である試料から得られた蛍光減衰曲線について、ベータアミロイド凝集体に由来する蛍光成分として新たに成分を追加、すなわち４成分で解析を行った。この解析において、ベータアミロイド凝集体以外の蛍光成分は、ベータアミロイドモノマー試料で得られた３個の蛍光寿命値（τ_１〜τ_３）として全て既知であるため、これら既知の蛍光寿命値を定数として解析した。この解析の結果、得られた蛍光寿命値τ_４が、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値であり、その重み因子Ａ_４がベータアミロイド凝集体の量となる。

上記解析手法において、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体で得られた蛍光減衰曲線のそれぞれについて、上記解析を個別に行ってもよい。別の解析手法として以下の手順（２）で行ってもよい。

蛍光物質によって染色された凝集体の蛍光寿命値が未知である場合の解析の手順（２）
手順１：凝集時間が０分である染色試料の蛍光減衰曲線について必要かつ十分な成分数ｎで解析する。
手順２：解析の結果得られた蛍光寿命値τ_１〜τ_ｎを定数とする。
手順３：十分に凝集が進行した染色試料の蛍光減衰曲線について、成分数ｎ＋１で解析する。
手順４：解析の結果、得られた寿命値τ_ｎ＋１を凝集体の蛍光寿命値として、同様に定数とする。
手順５：十分に凝集が進行した染色試料以外の染色試料について、τ_１〜τ_ｎ＋１を定数として解析する。
手順６：解析の結果、得られた重み因子Ａ_ｎ＋１を蛍光物質によって染色された凝集体の量とする。

まず、上記手順（２）に従い、ベータアミロイド凝集体が最も多いと思われる、凝集時間が１００分である試料について最初に解析を行い、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体からの蛍光寿命値τ_ｎ＋１を求める。凝集時間が異なる他の試料を用いた減衰曲線については、この値（τ_ｎ＋１）をチオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の既知の蛍光寿命として解析すれば、正確かつ迅速に解析を行うことができる。以下、具体的に説明する。

本実施例において、まずベータアミロイドモノマーに相当する凝集時間が０分である試料は、ｎ＝３、すなわち３成分で解析された。

次にτ_１〜τ_３の値を固定して、凝集時間が１００分である試料の蛍光減衰曲線を、４成分、すなわちτ_４及びＡ_１〜Ａ_４を変数として解析し、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値τ_４とこの試料における凝集体の量Ａ_４とを求めた。

最後に凝集時間が異なる他の凝集体試料について、τ_１〜τ_４を定数としＡ_１〜Ａ_４のみを変数として解析することによって、それぞれの凝集体の量を示すＡ_４を決定した。

本実施例の方法によって決定された、チオフラビンＴによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値τ_４は１．６ｎｓとなった。凝集体の量を示す重み因子Ａ_４の凝集時間に対する経時変化は、図３と同じであり、本手法によってもベータアミロイド凝集体の定量が可能であることが示された。

本実施例によれば、チオフラビンＴ等の蛍光物質によって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値が未知であっても、ベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値を決定することができると共に、ベータアミロイド凝集体の定量が可能である。

実施例３
本実施例は蛍光物質として、チオフラビンＴの類縁化合物であるチオフラビンＳを適用した例である。ベータアミロイド凝集体は、実施例１に記載の方法で調製した。

このベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、５μｍｏｌ／ＬのチオフラビンＳ溶液（溶媒：５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。上記染色試料は、実施例１に記載の方法によって蛍光寿命値の計測を行った。得られた蛍光減衰曲線を図５に示す。図５において、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ、凝集時間が０分、２０分、４０分、６０分、８０分及び１００分であるベータアミロイド凝集体サンプルを用いたときの蛍光減衰曲線を示す。

この減衰曲線を用いて、実施例２に記載の方法で解析を行った結果、チオフラビンＳによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値は４．５ｎｓとなった。凝集時間が０分である凝集体の重み因子を１とした場合の、凝集体の重み因子の凝集時間に対する変化を図６に示す。同じ試料における全蛍光量について、凝集時間が０分であるときを１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、凝集体の増加による計測値の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。さらに図６によれば、値の増分は本手法の方が従来の方法に比べてより大きく、凝集体をより高感度に検出できることが示された。

本実施例によれば、チオフラビンＳのような自家蛍光が比較的強い蛍光物質であっても、凝集体の定量が可能となる。また本手法が、チオフラビン系色素一般に適用できることも本実施例によって示された。

実施例４
本実施例は蛍光物質として、アミロイドを認識するための蛍光試薬として用いられる、１−フルオロ−２，５−ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシスチリル）ベンゼン（ＦＳＢ）を適用した例である。ＦＳＢは、アミロイド染色色素として古くから用いられているコンゴーレッドの類縁化合物であり、コンゴーレッドより強い蛍光強度を持つアミロイド認識蛍光試薬として知られている。ベータアミロイド凝集体は、実施例１に記載の方法で調製した。

このベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、１％（ｗ／ｖ）ＦＳＢ溶液（溶媒：ＤＭＳＯ）の４０００倍希釈液（希釈液：５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。上記染色試料は、実施例１に記載の方法によって蛍光寿命の計測を行った。得られた蛍光減衰曲線を図７に示す。図７において、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ、凝集時間が０分、２０分、４０分、６０分、８０分及び１００分であるベータアミロイド凝集体サンプルを用いたときの蛍光減衰曲線を示す。

この減衰曲線を用いて、実施例２に記載の方法で解析を行った結果、ＦＳＢによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値は２．３３ｎｓとなった。凝集時間が０分である凝集体の重み因子を１とした場合の、凝集体の重み因子の凝集時間に対する変化を図８に示す。同じ試料における全蛍光量について、凝集時間が０分であるときを１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、凝集体の増加による計測値の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。さらに図８によれば、値の増分は本手法の方が従来の方法に比べてより大きく、凝集体をより高感度に検出できることが示された。

本実施例によれば、ＦＳＢのようなチオフラビンＴとは別の骨格を持つアミロイド認識蛍光試薬であっても、凝集体の定量が可能となる。さらに本手法が、一般的なアミロイド認識蛍光試薬に適用できることも本実施例より示された。

実施例５
本実施例は蛍光物質として、粘性蛍光プローブとして有名な８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を適用した例である。ＡＮＳはアミロイド染色にはあまり用いられないが、溶媒の粘性等によって分子の運動が抑制されると蛍光強度が増強するという、チオフラビンＴと同じ発蛍光機構を持つ化合物である。ベータアミロイド凝集体は、実施例１に記載の方法で調製した。

このベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、５μｍｏｌ／ＬのＡＮＳ溶液（溶媒：５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。上記染色試料は、実施例１に記載の方法で蛍光寿命計測を行った。ただし、本実施例においては観測波長を４３５ｎｍに設定して測定を行った。得られた蛍光減衰曲線を図９に示す。図９において、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ、凝集時間が０分、２０分、４０分、６０分、８０分及び１００分であるベータアミロイド凝集体サンプルを用いたときの蛍光減衰曲線を示す。

この減衰曲線を用いて、実施例２に記載の方法で解析を行った結果、ＡＮＳによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値は０．８８ｎｓとなった。凝集時間が０分である凝集体の重み因子を１とした場合の、凝集体の重み因子の凝集時間に対する変化を図１０に示す。同じ試料における全蛍光量について、凝集時間が０分であるときを１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、凝集体の増加による計測値の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。

ＡＮＳは粘性によって蛍光スペクトルが大きくシフトすることが知られており、シフト前とシフト後の蛍光強度比を求めることで、蛍光量より鋭敏に蛍光変化を計測することができる。この蛍光比による凝集体の計測の結果も図１０中に点線で示した。図１０によれば、値の増分は、従来から用いられている蛍光量又は蛍光比による計測よりも本手法の方がより大きく、凝集体をより高感度に検出できることが示された。

なおＡＮＳにおいては、他の蛍光色素と異なり、凝集時間が４０分以上である試料中の凝集体の量が単調に増加していない。これはＡＮＳとベータアミロイド凝集体とが他の蛍光物質とは異なる結合様式を持っているために起こる現象であり、本手法に由来するものではない。本実施例によれば、ＡＮＳのようなチオフラビンＴと同じ発蛍光機構を持つ化合物であっても、凝集体の定量が可能となる。

実施例６
本実施例は蛍光物質として、チオフラビンＴの骨格を参考に設計されたＰＥＴ用ベータアミロイド標識試薬である６−（２−フルオロエトキシ）−２−（４−メチルアミノスチリル）ベンゾオキサゾール（ＢＦ−１６８）を適用した例である。ベータアミロイド凝集体は、実施例１に記載の方法で調製した。

このベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、５μｍｏｌ／ＬのＢＦ−１６８溶液（溶媒：０．０５［ｖｏｌ］％のＤＭＳＯを含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。

染色試料は、実施例１に記載の方法で蛍光寿命計測を行った。ただし、本実施例においては観測波長を４８０ｎｍに設定して測定を行った。得られた蛍光減衰曲線を用いて、実施例２に記載の方法で解析を行った結果、ＢＦ−１６８によって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値は４．５ｎｓとなった。凝集時間が０分である凝集体の重み因子を１とした場合の、凝集体の重み因子の凝集時間に対する変化を図１１に示す。同じ試料における全蛍光量について、凝集時間が０分であるときを１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、凝集体の増加による計測値の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。さらに図１１によれば、値の増分は本手法の方が従来の方法に比べてより大きく、凝集体をより高感度に検出できることを示している。

本実施例によれば、ＢＦ−１６８のような、ＰＥＴ計測用として設計された標識試薬であっても、凝集体の定量が可能となる。本手法が、ＰＥＴ用ベータアミロイド標識試薬一般に適用できることも本実施例よって示された。

実施例７
本実施例は蛍光物質として、スチルベン系の骨格を持つベータアミロイド標識試薬であるレスベラトロールを適用した例である。ベータアミロイド凝集体は、実施例１に記載の方法で調製した。

このベータアミロイド凝集体サンプル１０μＬに、５μｍｏｌ／Ｌのレスベラトロール溶液（溶媒：５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液、ｐＨ９．０）９９０μＬを混合して染色試料とした。上記染色試料は、実施例１に記載の方法で蛍光寿命の計測を行った。得られた減衰曲線を用いて、実施例２に記載の方法で解析を行った結果、レスベラトロールによって染色されたベータアミロイド凝集体の蛍光寿命値は４．５ｎｓとなった。凝集時間が０分である凝集体の重み因子を１とした場合の、凝集体の重み因子の凝集時間に対する変化を図１２に示す。同じ試料における全蛍光量について、凝集時間が０分であるときを１とした場合の相対比率も同時に示した。本手法の結果に関して、凝集体の増加による計測値の増加は、蛍光強度の増加と一致した傾向を示した。本手法による計測値が蛍光量を評価する方法と本質的に同じ情報を与えることが示された。さらに図１２によれば、値の増分は本手法の方がより大きく、凝集体をより高感度に検出できることを示している。

本実施例によれば、レスベラトロールのような、スチルベン系の骨格を持つベータアミロイド標識試薬であっても、凝集体の定量が可能となる。さらに本手法が、スチルベン系ベータアミロイド標識試薬一般に適用できることも本実施例によって示された。

１…検出部、６…光源部、１５…記録部、１６…演算部、１００…アミロイドの凝集体の定量装置。

Claims

アミロイドの凝集体と蛍光物質とを含む第一の試料に、前記蛍光物質を励起する光を照射する、励起光照射ステップと、
前記第一の試料から発する蛍光を経時的に検出して、第一の蛍光減衰曲線のデータを取得する、データ取得ステップと、
前記蛍光物質と前記アミロイドの凝集体とが結合した複合体に由来する第一の蛍光寿命値を、前記第一の蛍光減衰曲線のデータと、前記複合体以外の蛍光成分に由来する複数の蛍光寿命値と、に基づいて算出する、蛍光寿命算出ステップであって、前記複合体以外の蛍光成分に由来する複数の蛍光寿命値は、凝集していない前記アミロイドと前記蛍光物質とを含む第二の試料に前記光を照射することによって前記第二の試料から発する蛍光を経時的に検出して取得された第二の蛍光減衰曲線のデータに基づいて算出されている、ステップと、
前記第一の蛍光減衰曲線のデータと、前記第一の蛍光寿命値と、前記複合体以外の蛍光成分に由来する複数の蛍光寿命値と、に基づいて前記複合体に由来する第一の重み因子を算出する、重み因子算出ステップと、
前記第一の重み因子に基づいて前記アミロイドの凝集体の量を算出する、凝集体定量ステップと、
を含む、アミロイドの凝集体の定量方法。
前記蛍光物質が、チオフラビンＳ、６−（２−フルオロエトキシ）−２−（４−メチルアミノスチリル）ベンゾオキサゾール及び８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、並びに、下記式（１）、（２）、（３）又は（４）で表される化合物から選ばれる、請求項１に記載の定量方法。

（式（１）中、Ｒ^１及びＲ^２はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ^３は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示し、ＡはＯ又はＳを示し、５員環に含まれる窒素原子は炭素数１〜６のアルキル基と結合していてもよく、式（２）中、Ｒ^４及びＲ^５はそれぞれ独立に水酸基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を示し、Ｘは水素又はハロゲンを示し、式（３）中、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０及びＲ^１１はそれぞれ独立に水素、水酸基、ハロゲン、又は、１若しくは２つの炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよいアミノ基を示し、式（４）中、Ｒ^１２及びＲ^１３はそれぞれ独立に水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ^１４は炭素数１〜６のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示す。）