JP6113717B2 - 抗cdh3(p−カドヘリン)抗体の薬剤コンジュゲート - Google Patents
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Description
好ましくは、本発明の免疫複合体は、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片が、CDH3を発現している細胞に対して細胞傷害能を示す。
好ましくは、CDH3に対する抗体は、CDH3またはCDH3を発現している細胞を免疫原として投与した免疫細胞から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である。
好ましくは、前記抗体はキメラ化されている。
好ましくは、前記抗体はヒト化されている。
好ましくは、前記抗体はヒト抗体である。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号52、60及び70に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号75、82及び91に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号54、62及び72に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号74、81及び93に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号55、63及び73に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号80、85及び94に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号49、64及び66に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号76、84及び89に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号53、61及び71に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号75、82及び92に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号51、57及び67に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号78、83及び88に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号50、59及び69に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号77、83及び87に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、CDH3は哺乳類のCDH3である。
好ましくは、CDH3は霊長類のCDH3から選択される。
好ましくは、CDH3はヒトのCDH3から選択される。
好ましくは、CDH3は、細胞の表面に発現されるCDH3である。
好ましくは、前記CDH3結合能を有する抗体断片は、Fab,F(ab’)2、又はscFvである。
好ましくは、前記細胞傷害性物質は、メイタンシノイド及びその誘導体から選択される。
好ましくは、前記細胞傷害性物質は、アウリスタチン及びその誘導体から選択される。
好ましくは、前記メイタンシノイド及びその誘導体は、DM1、DM3、DM4から選択される。
好ましくは、前記細胞性障害剤は、DM1である。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片1分子あたり1〜10個のDM1が結合している。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片1分子あたり3〜8個のDM1が結合している。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片と化学療法剤との結合は、抗体のFc領域の分子内ジスルフィド結合を介してなる。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片と化学療法剤との結合は、抗体のFc領域を遺伝子工学的に改変して結合したものである。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片と化学療法剤とを結合させるリンカーは、2価反応性架橋試薬である。
好ましくは、前記リンカーはval-citを含む。
好ましくは、前記リンカーはPABAを含む。
好ましくは、本発明の医薬組成物は、抗がん作用を有する。
好ましくは、前記癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫から選択される。
本発明の免疫複合体は、癌細胞を効率的に殺傷する抗CDH3抗体薬剤コンジュゲートとして提供される。
ポリクローナル抗体を作製するためには、CDH3又はその部分ペプチドを抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1〜100mgであり、アジュバントを用いるときは1〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から6〜60日後に、酵素免疫測定法(ELISA(enzyme−linked immunosorbent assay)又はEIA(enzyme immunoassay))、放射性免疫測定法(RIA;radio immunoassay)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
モノクローナル抗体を作製するためには、先ず、CDH3又はその部分ペプチドを抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1〜100mgであり、アジュバントを用いるときは1〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から1〜60日後、好ましくは1〜14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
抗CDH3抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長CDH3を発現するCHO細胞の樹立を行った。
(1)CDH3遺伝子発現ベクターの作製
配列番号1に示す全長ヒトCDH3DNAを哺乳類発現ベクターpEF4/myc−HisB(インビトロジェン社)へ挿入するため、2種類の制限酵素KpnI(タカラバイオ社)及びXbaI(タカラバイオ社)で37℃、1時間処理した後、同じくKpnI及びXbaIで処理したpEF4/myc−HisBへT4 DNAリガーゼ(プロメガ社)により常法に従って挿入し、発現ベクターpEF4―CDH3―myc−Hisを得た。
FuGENE(登録商標)6トランスフェクション試薬(ロシュ・ダイアグノスティックス社)のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径10cmディッシュに8×105細胞のCHO細胞を播種し一晩培養後、8μgの発現ベクターpEF4―CDH3―myc−Hisと16μLのFuGENE6試薬を400μLの無血清RPMI1640培地(SIGMA−ALDRICH社)に混合し15分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬(Zeocin(登録商標))を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
抗CDH3抗体作製の免疫原とするため、C末端膜貫通領域以降を欠損させた可溶型CDH3(sCDH3)タンパク質を作製した。
(1)可溶型CDH3抗原発現ベクターの作製
CDH3全長cDNAをテンプレートとして、CDH3細胞外領域に相当する部分(配列番号2の1−654に相当、以下sCDH3cDNA)を増幅するように設計されたフォワードプライマー (配列番号3:CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT)とリバースプライマー (配列番号4:CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC)を用いてPCR反応を行った。反応にはKOD−Plus(東洋紡社)を用い、94℃−15秒、55℃−30秒、68℃−90秒、30サイクルの反応条件で行った。
FuGENE6トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径10cmディッシュに8×105個のCHO細胞を播種し一晩培養後、8μgの発現ベクターpEF4−sCDH3−myc−Hisと16μLのFuGENE6試薬を400μLの無血清RPMI1640培地に混合、15分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬(Zeocin)を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
(1)可溶型CDH3タンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した50μgの可溶型CDH3タンパク質とTiter−MAX Gold(登録商標)(タイターマックス社)を等量混合し、MRL/lprマウス(日本エスエルシー株式会社)の腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。2回目以降の免疫は同様に調製した25μgタンパク質量相当の可溶型CDH3タンパク質とTiter−MAX Goldを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から3日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞SP2/O−Ag14あるいはP3−X63−Ag8.653との細胞融合を行った。
抗CDH3抗体の選抜は、全長CDH3を発現するCHO細胞株(EXZ1501)を用いたフローサイトメトリで行った。
正常ヒト組織および各種癌組織より、レーザーマイクロダイセクション法(Laser Capture Microdissection)で回収したサンプルよりISOGEN(ニッポンジーン社)を用い定法に従って全RNAを調製した。RNA各10ngをGeneChipU−133B(Affymetrix社)を用い、Expression Analysis Technical Manual(Affymetrix社)に準じて遺伝子発現を解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、CDH3は正常ヒト組織では発現が限られ、肺癌、大腸癌、膵臓癌で発現が高かった(図3A、B)。また、分化度の異なる膵臓癌組織におけるCDH3mRNAの発現を検討したところ、分化度に関わらず発現が高い組織が認められた(図3C)。
癌臨床検体でのCDH3タンパク質の発現を確認するため、癌検体組織アレイで免疫染色を行った。
癌細胞組織アレイは、上海芯超生物科技有限公司社(Shanghai Outdo Biotech Co.,Ltd.)製の、膵癌(腺癌)、肺癌(腺癌)、肺癌(扁平上皮癌)および大腸癌(腺癌)を使用した。
図4に結果を示す。癌細胞は抗CDH3抗体で染色され正常細胞は染色されなかった。
CDH3抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から、細胞質に存在するRNAをGough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, 173, p93-95 (1988)により記載されている方法(ただし、この論文に記されている溶解緩衝液のかわりに別のTNE緩衝液 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 8.0を用いた)に従って単離した。具体的な操作方法としては、5x10e6個のハイブリドーマ細胞を0.2mLのTNE緩衝液に懸濁して細胞膜を溶解後、遠心により細胞核を除去した。得られた約0.2mL細胞質上清に0.2mLの抽出緩衝液(10 mM Tris-HCl, pH7.5; 0.35 M NaCl; 1%(w/v) SDS; 10 mM EDTA, pH 8.0; 7 M 尿素)を加えた。この混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、得られたRNA溶液にキャリアとしてグリコーゲン(ロッシュ、Cat No. 901393)を加えてから、エタノールで沈澱させた。次にRNA沈殿物を、細胞質RNA濃度が0.5〜2マイクログラム/マイクロリットルになるように10〜50マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えて溶解した。
一本鎖cDNAを合成するため、前記のように調製した細胞質RNAの0.5〜3マイクログラムを50mM Tris-HCl, pH 8.3(室温); 75mM KCl; 3mM MgCl2; 10mM DTT、100ナノグラムのランダムプライマー、0.5mM dNTP、200ユニットのSuperscript II(逆転写酵素、インビトロジェン社)を含む20マイクロリットル反応混合液を調製し、42°Cで50分間インキュベートした。このように合成したcDNAライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の鋳型として直接使用した。
実験に用いたプライマーはすべて北海道システム・サイエンス株式会社で合成した。
A.マウス軽鎖の可変領域をコードする遺伝子をPCR法で増幅するために使用するプライマー
5'末端においてFR1部分と相同性を有するDNAプライマーと3'末端においてマウスL鎖内のJ鎖遺伝子と相同性を有する4セットプライマー(1)、あるいは、5' 末端においてL鎖シグナル部分(7セットプライマー)と3'末端においてKC部分(KVLアンチセンスプライマー)と相同性を有するプライマーセット(2)の2種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該cDNAからマウス免疫グロブリンL鎖可変域DNAを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
「Phage Display −A Laboratory Manual- , Barbas Burton Scott Silverman」 PROTOCOL 9.5を参考にSense Primer 17種、Reverse Primer 3種を北海道システムサイエンスで合成した。
5'-GAYATCCAGCTGACTCAGCC-3'(縮重度2):配列番号5
5'-GAYATTGTTCTCWCCCAGTC-3'(縮重度4):配列番号6
5'-GAYATTGTGMTMACTCAGTC-3'(縮重度8):配列番号7
5'-GAYATTGTGYTRACACAGTC-3'(縮重度8):配列番号8
5'-GAYATTGTRATGACMCAGTC-3'(縮重度8):配列番号9
5'-GAYATTMAGATRAMCCAGTC-3'(縮重度16):配列番号10
5'-GAYATTCAGATGAYDCAGTC-3'(縮重度12):配列番号11
5'-GAYATYCAGATGACACAGAC-3'(縮重度4):配列番号12
5'-GAYATTGTTCTCAWCCAGTC-3'(縮重度4):配列番号13
5'-GAYATTGWGCTSACCCAATC-3'(縮重度8):配列番号14
5'-GAYATTSTRATGACCCARTC-3'(縮重度16):配列番号15
5'-GAYRTTKTGATGACCCARAC-3'(縮重度16):配列番号16
5'-GAYATTGTGATGACBCAGKC-3'(縮重度12):配列番号17
5'-GAYATTGTGATAACYCAGGA-3'(縮重度4):配列番号18
5'-GAYATTGTGATGACCCAGWT-3'(縮重度4):配列番号19
5'-GAYATTGTGATGACACAACC-3'(縮重度2):配列番号20
5'-GAYATTTTGCTGACTCAGTC-3'(縮重度2):配列番号21
J1 / J2アンチセンスプライマー (1)
5'-GGSACCAARCTGGAAATMAAA-3'(縮重度:8):配列番号22
J4アンチセンスプライマー (2)
5'-GGGACAAAGTTGGAAATAAAA-3':配列番号23
J5アンチセンスプライマー(3)
5'-GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA-3' :配列番号24
J1 / J2, J4, J5アンチセンスプライマー混合物 (4)
VKセンス(シグナルペプチド部分)
このプライマーはノバジェン社のマウスIg-プライマーセット(Novagen; Merck,Cat.No.69831-3)を元に制限酵素部位を除去するように塩基配列を改変した。
5'-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3' :配列番号25
Bセットセンスプライマー
5'-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3' :配列番号26
Cセットセンスプライマー
5'-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3' :配列番号27
Dセットセンスプライマー(下記2種類のプライマーの混合物を使用)
5'-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3' :配列番号28
5'-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3' :配列番号29
Eセットセンスプライマー(下記3種類のプライマーの混合物を使用)
5'-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3':配列番号30
5'-ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG-3':配列番号31
5'- ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC -3':配列番号32
Fセットセンスプライマー(下記4種類のプライマーの混合物を使用)
5'-ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG-3':配列番号33
5'-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3':配列番号34
5'-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3':配列番号35
5'-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3':配列番号36
Gセットセンスプライマー(下記4種類のプライマーの混合物を使用)
5'-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3':配列番号37
5'-ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3':配列番号38
5'-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3':配列番号39
5'-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3':配列番号40
KVLアンチセンスプライマー
5'-ACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3':配列番号41
5' 末端においてマウスH鎖シグナル部分(4セットプライマー)と相同性を有するプライマーと3'末端においてKC部分と相同性を有するプライマー、あるいは5'末端においてFR1部分と相同性を有する1セットのプライマーと3' 末端においてマウスH鎖の定常領域(IGHC)と相同性を有する2種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該cDNAからマウス免疫グロブリンH鎖可変域DNAを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
VHセンス(シグナル部分:4セットプライマー)
このプライマーはCurrent Protocols in Immunology (John Wiley and Sons, Inc.), Unit 2.12 Cloning, Expression, and Modification of Antibody V RegionsのTable 2.12.2を参考にした。
5'-ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3'(縮重度:32):配列番号42
5'-ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3'(縮重度:8):配列番号43
5'-ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3':配列番号44
5'-ATGGRCAGRCTTACWTYY-3'(縮重度:32):配列番号45
VHセンス(FR1部分)
このプライマーはTanら、“Superhumanized" Antibodies: Reduction of Immunogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169 (2002) p1119-1125のセンスプライマーの塩基配列を改変してデザインした。
5'-SAGGTSMARCTKSAGSAGTCWGG-3'(縮重度:256):配列番号46
VHアンチセンス(3, 4に共通のアンチセンスプライマー)
マウスIgGすべてのアイソフォームとアニーリングできるように塩基配列を縮重してデザインした。
5'-CASCCCCATCDGTCTATCC-3'(縮重度:6):配列番号47
発現プラスミドの作製: DNA Engine(Peltier Thermal Cycler, MJ Research, Bio-Rad) を用いたPCR法により抗CDH3マウスモノクローナル抗体L鎖、H鎖それぞれの可変領域を実施例8に示したプライマーを用いて増幅した。増幅したDNAフラグメントはサブクローニングベクターpGEM(プロメガ社)に組み込んで、このベクターのT7,SP6ユニバーサルプライマーで塩基配列を決定した。
遺伝子操作された抗体遺伝子をCHO細胞を用いて高レベルで発現させるために、CMVプロモーター配列に連結し、ポリAシグナルを有したジヒドロフォレートレダクターゼ(dhfr)遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製した。
キメラ抗体の安定発現生産細胞株をつくるために、dhfr遺伝子を組み込んだpCAGGS発現ベクターを作製した。具体的には、一過性の発現ベクターであるpCAGGS-IGH、および、pCAGGS-IGKに、CMVプロモーターとポリAシグナルを有したdhfr遺伝子を組み込むことである。CMVプロモーター、Kozak配列をもつマウスdhfr遺伝子、SV40ポリAシグナルをそれぞれPCR法によって増幅し、これらの遺伝子の混合物をPCR法で接続するとともに両端にHindIII部位を付加して、HindIII-CMVプロモーター-Kozak-dhfr-ポリA-HindIIIという遺伝子フラグメントを得た。このフラグメントをpCAGGS-IGH、あるいは、pCAGGS-IGKのHindIII部位に組み込んでpCAGGS-IGH-CMVp-dhfr-A、および、pCAGGS-IGK-CMVp-dhfr-Aを得た。これらの発現ベクターはキメラ抗体をCAGプロモーターで、dhfr遺伝子をCMVプロモーターで発現させることができ、効率的に遺伝子増幅を利用してキメラ抗体を生産することができた。
CHO dhfr(-)細胞(G. Urlaubら、Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p4216-4220, 1980)を用いて、2種類のプラスミド(アンピシリン耐性遺伝子内のPvuIでプラスミドを切断して環状プラスミドから線状プラスミドにした)すなわち、キメラ抗CDH3L鎖を発現するためのpCAGGS-IGK-CMV-dhfr-Aベクター、および、キメラ抗CDH3H鎖を発現するためのpCAGGS-IGH-CMV-dhfr-Aベクターにより同時形質転換した。エレクトロポレーションはロンザ社製のAmaxaでおこなった。DNA(L鎖、H鎖各プラスミドにつき0.002mg/試料)を3x10e3 細胞の0.1mLのAmaxaエレクトロポレーションCHO用緩衝液に加えてパルスを与えた。
遺伝子導入したCHO細胞の培養上清をELISAにより測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギ抗ヒトIgG(H+L)(マウス、ウサギ、ウシ、マウスIgGに対して吸収済み)(コスモバイオ:AQI, Cat A-110UD)でコートした。ブロックした後、抗CDH3キメラ抗体産生CHO細胞からの培養上清を段階希釈し、各ウエルに加えた。プレートをインキュベーション、および洗浄後、ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(マウス、ウサギ、ウシ、マウスIgGに対して吸収済み)-HRP(コスモバイオ:AQI,Cat.A-110PD)を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションした後、反応を停止しそして450nmにおける吸光度を測定した。標準として精製ヒトIgGを用いた。
実施例10、11に示した方法で表2に示した組み合わせのCDR配列を持つ抗体を作製し、その結合活性をフローサイトメトリで評価した。
DM1SMe(図6)は、米国特許第5,208,020号および6,333,410B1号に以前に記載されたように調製した。
1.結合薬剤の還元処理
EtOH300uLで溶解した0.78mgのDM1SMeと50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)180uL、TCEP Solution(Bond Breaker、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)20uLを混合し、窒素雰囲気下、室温で30分以上反応させ、薬剤を還元した。
還元薬剤はHPLCを使用して精製した後に溶媒留去後、10mg/mLになるようにジメチルアセトアミドに溶解した。
1mg/mL抗CDH3キメラ抗体にモル比30倍過剰となる量のsulfo-SMCC(PIERCE社)を加え、30℃、1時間反応させた。
過剰な架橋剤を除くため、50mMリン酸カリウム、50mM NaCl、2mM EDTA(pH6.5)で平衡化した脱塩カラムで脱塩処理(ZebaSpinColumn、 サーモフィッシャーサイエンティフィック社)した。
1mg/mLのマレイミド化した抗CDH3キメラ抗体と、結合したマレイミド基数の1.7倍に相当する還元薬剤とを50mMリン酸カリウム、50mM NaCl、2mM EDTA(pH6.5)中で、室温にて一晩反応させた。その後、過剰な薬剤をゲルろ過操作により除いた。
抗体当たりの薬剤結合数は、252nm及び280nmの吸光度を測定する事で決定した。決定方法は非特許文献(Widdison,W.C.,Wilhelm,S.D.,Cavanagh,E.E.,et al. (2006) Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer. J.Med.Chem.,49,4392-4408)に記載の吸光係数εAb280=223,000M-1cm-1, εAb252=82,510M-1cm-1, εDM1280=5,180M-1cm-1, εDM1252=26,160M-1cm-1を利用した。
薬剤結合抗体の細胞傷害性と特異性はWST-8を発色基質とした細胞増殖測定試薬(同仁化学研究所社,Cell counting assay kit-8)を使用して評価した。
即ち、CDH3が高発現であると確認されているヒト乳がん細胞株HCC1954と薬剤結合抗体(ADC)あるいは薬剤を結合していない抗体(Naked)を任意の量共存させ、37度で3日間、、5%CO2環境下でインキュベートした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後A450/620の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を100%としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した(図7)。なお、図中に用いられた抗体は、抗体番号067−17Cを使用し、ADCについては、実施例16に記載した方法で抗体あたりの薬剤導入数を計算したところ、抗体1分子辺り4.05個の薬剤が導入されていると見積もられた。
取得した複数の抗CDH3抗体を用いて薬剤結合抗体の細胞傷害性を評価した。
測定は、実施例17に記載した方法に準じた。即ち、ヒト乳がん細胞株HCC1954と薬剤結合抗体(ADC)を共存させ、37度で3日間、5%CO2環境下でインキュベートした。その際のADC濃度は、0.01ug/mLとした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後A450/620の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を100%としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した。各抗体抗体1分子辺りの薬剤数は、実施例16に記載した方法で見積もった(表3)。
陰性対照抗体は、HCC1954と反応しないことが確認されている抗体が使用された。
薬剤結合抗体のインビボでの腫瘍縮小効果を、乳がん細胞株HCC1954を移植したゼノグラフトモデルにて確認した。投与は、抗アシアロGM1抗体(WAKO 014-09801)を、大塚蒸留水1mLで溶解後、大塚生理食塩水4mLを加えて全量5mLとした後、この溶液を、マウス1匹あたり100uL腹腔内投与。HCC1954は10%FBS含有RPMI1640培地を用いて培養し、SCIDマウス(メス、日本クレア)の右腹側部皮下に5x106個/マウスになるように移植した。
図中に用いられた抗体は、抗体番号067−12C、067−23C及び067−27Cを使用し、ADCについては、実施例16に記載した方法で抗体あたりの薬剤導入数を計算したところ、抗体1分子辺り3〜4個の薬剤が導入されていると見積もられた。
腫瘍サイズの推移を図8に示す。
Claims (13)
- CDH3に対するモノクローナル抗体又はCDH3結合能を有するその断片とDM1とをN−スクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)リンカーで連結して成る免疫複合体。
- 前記抗体が、CDR−H1に配列番号48を含み、CDR−H2に配列番号56を含み、CDR−H3に配列番号65を含み、CDR−L1に配列番号75を含み、CDR−L2に配列番号82を含み、CDR−L3に配列番号86を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
- 前記抗体が、CDR−H1に配列番号52を含み、CDR−H2に配列番号60を含み、CDR−H3に配列番号70を含み、CDR−L1に配列番号75を含み、CDR−L2に配列番号82を含み、CDR−L3に配列番号91を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
- 前記抗体が、CDR−H1に配列番号54を含み、CDR−H2に配列番号62を含み、CDR−H3に配列番号72を含み、CDR−L1に配列番号74を含み、CDR−L2に配列番号81を含み、CDR−L3に配列番号93を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
- 前記抗体が、CDR−H1に配列番号55を含み、CDR−H2に配列番号63を含み、CDR−H3に配列番号73を含み、CDR−L1に配列番号80を含み、CDR−L2に配列番号85を含み、CDR−L3に配列番号94を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
- 前記抗体が、CDR−H1に配列番号49を含み、CDR−H2に配列番号64を含み、CDR−H3に配列番号66を含み、CDR−L1に配列番号76を含み、CDR−L2に配列番号84を含み、CDR−L3に配列番号89を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
- 前記抗体が、CDR−H1に配列番号49を含み、CDR−H2に配列番号58を含み、CDR−H3に配列番号68を含み、CDR−L1に配列番号79を含み、CDR−L2に配列番号82を含み、CDR−L3に配列番号90を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
- 前記抗体が、CDR−H1に配列番号53を含み、CDR−H2に配列番号61を含み、CDR−H3に配列番号71を含み、CDR−L1に配列番号75を含み、CDR−L2に配列番号82を含み、CDR−L3に配列番号92を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
- 前記抗体が、CDR−H1に配列番号51を含み、CDR−H2に配列番号57を含み、CDR−H3に配列番号67を含み、CDR−L1に配列番号78を含み、CDR−L2に配列番号83を含み、CDR−L3に配列番号88を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
- 前記抗体が、CDR−H1に配列番号50を含み、CDR−H2に配列番号59を含み、CDR−H3に配列番号69を含み、CDR−L1に配列番号77を含み、CDR−L2に配列番号83を含み、CDR−L3に配列番号87を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
- CDH3の過剰発現によって特徴づけられる癌を治療するための請求項1から10の何れか1項に記載の免疫複合体を含む、医薬組成物。
- 抗がん作用を有する、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫から選択される、請求項11又は12に記載の医薬組成物。
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