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JP6113717B2 - 抗cdh3(p−カドヘリン)抗体の薬剤コンジュゲート - Google Patents

抗cdh3(p−カドヘリン)抗体の薬剤コンジュゲート Download PDF

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JP6113717B2 JP2014508962A JP2014508962A JP6113717B2 JP 6113717 B2 JP6113717 B2 JP 6113717B2 JP 2014508962 A JP2014508962 A JP 2014508962A JP 2014508962 A JP2014508962 A JP 2014508962A JP 6113717 B2 JP6113717 B2 JP 6113717B2
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Description

本発明は、抗CDH3抗体の薬剤コンジュゲートに関する。本発明はさらに抗CDH3抗体の薬剤コンジュゲートの使用方法に関する。
癌は、死亡原因の上位を占める重要な疾患であるが、その治療ニーズはいまだ満たされていない。近年、従来の化学療法の正常細胞にもダメージを与えるという問題点を解決するために、癌細胞に特異的に発現する特定の分子を標的として薬剤を設計し治療を行う分子標的薬による癌治療が盛んに研究されている。
その標的のひとつとして細胞表面抗原であるCDH3が同定される。CDH3はカルシウム依存的に同種親和性の細胞接着に関与する分子として発見された膜タンパク質である(Yoshida and Takeichi, Cell 28:217ー224,1982)。相互にホモロジーが高い約110アミノ酸残基からなるカドヘリンリピートを持つタンパク質はカドヘリンスーパーファミリーと呼ばれ、CDH3はその主要メンバーに属する。
ある種の癌細胞においてはCDH3の発現上昇例が報告されており、正常組織と比較して癌組織でのCDH3の発現が高い癌細胞に対して抗体を用いた癌治療が検討されている(WO2002/097395号公報、WO2007/102525号公報)。
分子標的薬としては、すでに多くの抗体医薬が実際に上市され、その多くは抗体依存性細胞傷害活性(ADCC:Antibody−dependent cellular cytotoxicity)を主な作用機序としている。しかしながら、その薬効は必ずしも十分なものではなく、より強力な抗腫瘍効果を目指した技術開発も同時に進められている。
抗体の抗腫瘍能を増強する有効な手段の一つとして抗体と強力な毒性を有する薬剤(毒素)との連結があげられる。毒素はそれ単独で患者に投与すると、正常組織にも障害を及ぼし、有効な治療手段とはなり得ない。しかしながら、腫瘍細胞特異的な抗原と結合する抗体と連結することにより、正常な組織に悪影響を及ぼさず、腫瘍細胞のみ殺傷しえる能力を持つに至る。こうした薬剤は抗体薬物コンジュゲート(ADC)と呼ばれる。即ち、毒素は抗体と結合している状態では何ら毒性を示さない。しかし、ある種の抗体は標的とする抗原に結合すると細胞内に取り込まれ、リソソームにて分解される。したがって、毒素を結合したその種の抗体が細胞内に取り込まれ、細胞内で分解される事で毒素が放出され、特定の細胞内部においてのみ毒性が発現し、その効果により細胞は殺傷される。
ADCに用いられる薬剤成分には、ジフテリア毒素などの細菌性タンパク質毒素、リシンなどの植物タンパク質毒素、アウリスタチン、メイタンシノイド、カリキアマイシンなどの低分子毒素及びその誘導体が含まれる。
ADCにおいて、抗体に結合している薬剤は血液中を循環し、標的とする腫瘍に集積した後に薬効をしめす。腫瘍部位以外での薬剤の放出(抗体からの離脱)は、副作用を生じる危険性があるため必ずしも好ましくはない。つまり、抗体に結合している薬剤は細胞内に取り込まれた後に抗体から離脱する設計が好ましい。近年ジェネンテック社は、このような観点からトラスツズマブに非開裂型リンカー(SMCC)を介して毒素を結合した薬剤(T−DM1)を開発、臨床試験がすすめられ、非常に高い臨床効果を示している。また、開裂性リンカーを介して薬剤成分と連結した抗体薬剤コンジュゲートも開発される。例えば、NCAM抗原を発現する癌を対象に、ジスルフィドリンカー(SPP)を介して薬剤とHuN901抗体を結合させた抗体薬剤コンジュゲートの開発がImmunoGen社により進められている。
上記の通り、ADCにより癌を治療するというコンセプトは公知である。当分野では、肺がん、大腸がんといった様々な癌を治療するための更なる薬剤に対する需要がある。この目的のために特に有用な薬剤に、有意に毒性が低いが有益な治療的有効性がある抗CDH3抗体薬剤コンジュゲートが含まれる。これら及び他の制限ないし過去の問題点は本発明によって解決されうる。
WO2002/097395号公報 WO2007/102525号公報
Yoshida and Takeichi, Cell 28:217ー224,1982
本発明は、CDH3を発現する癌細胞を効率的に殺傷する抗CDH3抗体薬剤コンジュゲートを提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、CDH3に対する抗体と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体が、CDH3を発現する癌細胞株に対して強力な細胞傷害活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体が提供される。
好ましくは、本発明の免疫複合体は、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片が、CDH3を発現している細胞に対して細胞傷害能を示す。
好ましくは、CDH3に対する抗体は、CDH3またはCDH3を発現している細胞を免疫原として投与した免疫細胞から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である。
好ましくは、前記抗体はモノクローナル抗体である。
好ましくは、前記抗体はキメラ化されている。
好ましくは、前記抗体はヒト化されている。
好ましくは、前記抗体はヒト抗体である。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号48、56及び65に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号75、82及び86に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号52、60及び70に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号75、82及び91に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号54、62及び72に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号74、81及び93に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号55、63及び73に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号80、85及び94に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号49、64及び66に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号76、84及び89に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号49、58及び68に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号79、82及び90に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号53、61及び71に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号75、82及び92に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号51、57及び67に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号78、83及び88に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、H鎖に配列番号50、59及び69に記載されたアミノ酸配列を含み、L鎖に配列番号77、83及び87に記載されたアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記抗体は、上記した本発明の抗体のH鎖のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるH鎖を有する。
好ましくは、CDH3は哺乳類のCDH3である。
好ましくは、CDH3は霊長類のCDH3から選択される。
好ましくは、CDH3はヒトのCDH3から選択される。
好ましくは、CDH3は、細胞の表面に発現されるCDH3である。
好ましくは、前記CDH3結合能を有する抗体断片は、Fab,F(ab’)2、又はscFvである。
好ましくは、前記化学療法剤は、細胞障害性物質である。
好ましくは、前記細胞傷害性物質は、メイタンシノイド及びその誘導体から選択される。
好ましくは、前記細胞傷害性物質は、アウリスタチン及びその誘導体から選択される。
好ましくは、前記メイタンシノイド及びその誘導体は、DM1、DM3、DM4から選択される。
好ましくは、前記アウリスタチン及びその誘導体は、MMAEあるいはMMAFから選択される。
好ましくは、前記細胞性障害剤は、DM1である。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片1分子あたり1〜10個のDM1が結合している。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片1分子あたり3〜8個のDM1が結合している。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片と化学療法剤との結合はリンカーを介してなる。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片と化学療法剤との結合は、抗体のFc領域の分子内ジスルフィド結合を介してなる。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片と化学療法剤との結合は、抗体のFc領域を遺伝子工学的に改変して結合したものである。
好ましくは、CDH3に対する抗体又はCDH3結合能を有するその断片と化学療法剤とを結合させるリンカーは、2価反応性架橋試薬である。
好ましくは、前記リンカーは、N−スクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)、N−スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシ−(6−アミドカプロエート) (LC−SMCC)、κ−マレイミドウンデカン酸N−スクシンイミジルエステル(KMUA)、γ−マレイミド酪酸N−スクシンイミジルエステル(GMBS)、ε−マレイミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N−(α−マレイミドアセトキシ)−スクシンイミドエステル(AMAS)、スクシンイミジル−6−(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)−ブチレート(SMPB)、およびN−(p−マレイミドフェニル)イソシアネート(PMPI)、6-マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドプロパノイル(MP)、p-アミノベンジルオキシカルボンイル(PAB)、N-スクシンイミジル4(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP) 及びN-スクシンイミジル(4-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(SIAB)、N-スクシンイミジル(4- (2-ピリジルチオ)ブタノエート(SPDB)から成る群より選択される。
好ましくは、前記リンカーは、プロテアーゼによって切断される。
好ましくは、前記リンカーはval-citを含む。
好ましくは、前記リンカーはPABAを含む。
さらに本発明によれば、CDH3の過剰発現によって特徴づけられる癌を治療するための、本発明の免疫複合体を含む医薬組成物が提供される。
好ましくは、本発明の医薬組成物は、抗がん作用を有する。
好ましくは、前記癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫から選択される。
本発明で提供される抗CDH3抗体と化学療法剤とを連結して成る免疫複合体は、化学療法剤を結合しない抗体と比較して、CDH3を発現する癌細胞株に、より強力な細胞傷害活性を示す。従って、本発明の免疫複合体は、CDH3を発現する癌細胞を有する患者に投与することにより、高い抗癌作用の発揮が期待できる。即ち、本発明の免疫複合体は、抗癌剤として有用である。
図1は、ヒトCDH3強制発現細胞株と市販抗ヒトCDH3抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。A:CHO細胞、B:CDH3強制発現CHO細胞。a:抗CDH3抗体0.01mg/mL、b:抗CDH3抗体0.1mg/mL、c:抗CDH3抗体1mg/mL 図2は、取得抗体3例と各細胞株との典型的なフローサイトメトリ結果を示す。A:CDH3強制発現CHO細胞、B:CHO細胞、C:肺がん由来細胞株NCI−H358。a:抗CDH3抗体0.01mg/mL、b:抗CDH3抗体0.1mg/mL、c:抗CDH3抗体1mg/mL。 図3は、各種腫瘍組織のCDH3のmRNAの発現結果を示す。A:正常組織、B:各種癌組織、C:膵臓癌分化度 図4は、各種ヒト腫瘍組織でのCDH3の発現結果を示す。 図5は、各CDH3キメラ抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。A:CHO細胞、B:CDH3強制発現CHO細胞、C:肺がん由来細胞株NCI−H358 図6は、DM1SMeの構造を示す。 図7は、CDH3抗体薬剤コンジュゲートの細胞傷害性試験結果を示す。ADC:CDH3抗体薬剤コンジュゲート、Naked:薬剤未結合CDH3抗体。 図8は、CDH3抗体薬剤コンジュゲートを用いた動物試験結果を示す。ADC:CDH3抗体薬剤コンジュゲート、Naked:薬剤未結合CDH3抗体。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の免疫複合体は、癌細胞を効率的に殺傷する抗CDH3抗体薬剤コンジュゲートとして提供される。
本発明の抗体を作成するための抗原としては、CDH3又はその部分ペプチドを用いることができる。一例としては、可溶型CDH3タンパク質などを用いることができるが、これに限定されるものではない。
本発明で使用される抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。抗体の製造法は当該分野で周知である[例えばSambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照]。
(a)ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製するためには、CDH3又はその部分ペプチドを抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1〜100mgであり、アジュバントを用いるときは1〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から6〜60日後に、酵素免疫測定法(ELISA(enzyme−linked immunosorbent assay)又はEIA(enzyme immunoassay))、放射性免疫測定法(RIA;radio immunoassay)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
(b)モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体を作製するためには、先ず、CDH3又はその部分ペプチドを抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1〜100mgであり、アジュバントを用いるときは1〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、1〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から1〜60日後、好ましくは1〜14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば P3X63−Ag.8.U1(P3U1)、NS−1などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI−1640培地などの動物細胞培養用培地中で、1×106〜1×107個/mlの抗体産生細胞と2×105〜2×106個/mlのミエローマ細胞とを混合し(抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比5:1が好ましい)、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI−1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に3×105個/well程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、CDH3と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水採取法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10%ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、5%CO2濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
腹水採取法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約1×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等の何れでもよい。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域(CDR)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域(Framework Region;FR)を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる(EP239400号公報、国際公開WO96/02576号公報など)。
タンパク質発現に使用する宿主細胞系は、抗体生産系では哺乳動物起源のものが多い。該生産者は発現したい遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞系を優先的に決定できる。一般的な宿主細胞系としては、CHO由来細胞株(チャイニーズハムスター卵巣細胞系)、CV1(サル腎臓系)、COS(SV40T抗原をするCV1の誘導体)、SP2/0(マウスミエローマ)、P3x63−Ag3.653(マウスミエローマ)、および293(ヒト腎臓)、293T(SV40T抗原をする293の誘導体)が挙げられるがそれらに限定されない。宿主細胞系は商業施設やthe American Tissue Culture Collection(ATCC)から、または発表された文献の発表機関から入手することができる。
宿主細胞系として、好ましくはdgfr遺伝子の発現欠損であるCHO由来細胞株かSP2/0のいずれかである(Urland, G. ら、Effect of gamma rays at the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions, Somat. Cell. Mol. Genet. Vol. 12, 1986, p5555-566、および、Schulman, M. ら、A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies, Nature Vol. 276, 1978, p269-270 をそれぞれ参照のこと)。最も好ましくは、宿主細胞系はDHFR欠失CHOである。
宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクションは、任意の技術を使って達成できる。具体的な方法としては、トランスフェクション(リン酸カルシウム法、DEAE法、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む)、センダイウイルス等のエンベロープを利用してDNAを導入する方法、マイクロインジェクション、およびレトロウイルスウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いた感染が挙げられるが、それらに限定されない(Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9 Introduction of DNA into Mammalian Cells, John Wiley and Sons, Inc.を参照のこと)。最も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入である。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる(特公平1−59878参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる(WO93/12227,WO92/03918,WO94/02602,WO94/25585,WO96/34096,WO96/33735参照)。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体(scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列から適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO92/01047,WO92/20791, WO93/06213,WO93/11236,WO93/19172,WO95/01438,WO95/15388を参考にすることができる。
また、これらの抗体は、CDH3を認識する限り、一価抗体、二価抗体、多価抗体のいずれでもよく、抗体断片(フラグメント)等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。また、抗体断片や低分子化抗体、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ScFv(single chain Fv)、DiabodyなどにFc部分を融合したものでもよい。このような抗体を得るには、これら抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
これらの抗体に、例えばポリエチレングリコール(PEG)等の各種分子を結合して使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法は当業者に公知である。
本発明の免疫複合体においては、上記の抗体に、更に化学療法剤を結合して、細胞傷害剤として使用することができる。本発明の免疫複合体は、例えばCDH3を発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。
本発明の免疫複合体の好ましい態様としては、抗体に薬剤等の細胞傷害性物質を結合したいわゆるADCをあげることができる。
本発明で用いられる化学療法剤の例としては例えばデュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、CC−1065、CBIを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、MCBIを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、CCBIを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン−10、コンブレタスタチン、カリケアマイシン(calicheamicin)、メイタンシン、メイタンシンアナログ、DM1,DM2,DM3,DM4、DMI、アウリスタチンE、アウリスタチンEB(AEB)、アウリスタチンEFP(AEFP)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、5−ベンゾイルバレリン酸AEエステル(AEVB)、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、SN−38、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、5−フルオロウラシル、6−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンC、マイトマイシンA、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、N8−アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等をあげることができるが、これだけに限定されるわけではない。
本発明におけるADCは、前記の化学療法剤と抗体とを結合し、公知の方法により作製できる。抗体と化学療法剤は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや他の物質を介して間接的に結合されてもよい。
化学療法剤が直接結合される場合の連結基は、例えばSH基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のFc領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。
抗体と化学療法剤を、他の物質(リンカー)を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または化学療法剤または両方と反応する官能基を1または2種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、,マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。
リンカーの例としては、N−スクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)、N−スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシ−(6−アミドカプロエート) (LC−SMCC)、κ−マレイミドウンデカン酸N−スクシンイミジルエステル(KMUA)、γ−マレイミド酪酸N−スクシンイミジルエステル(GMBS)、ε−マレイミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N−(α−マレイミドアセトキシ)−スクシンイミドエステル(AMAS)、スクシンイミジル−6−(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)−ブチレート(SMPB)、およびN−(p−マレイミドフェニル)イソシアネート(PMPI)、6-マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドプロパノイル(MP)、p-アミノベンジルオキシカルボンイル(PAB)、N-スクシンイミジル4(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP) 及びN-スクシンイミジル(4-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(SIAB)、N-スクシンイミジル(4- (2-ピリジルチオ)ブタノエート(SPDB)等があげられるが、これらに限定されるものではない。また、このリンカーは例えば、バリン-シトルリン(Val-Cit)、アラニン−フェニルアラニン(ala−phe)のようなペプチドリンカーであってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適時組み合わせて使用しても良い。
化学療法剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Cancer Research ;68 (22) 9280(2008)、Nature Biotechnology;26(8) 925(2008)、Bio Conjugate Chemistry;19、1673 (2008)、Cancer Research ;68 (15) 6300(2008)、又は特表2008-516896号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。
本発明の別の実施形態としては、抗体に毒素(トキシン)を化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。
本発明で用いられるトキシンとしては、例えば、ジフテリアトキシンA鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシン鎖;無糖鎖リシンA鎖ゲロニン(Gelonin)サポリン(Saporin)等をあげることができる。
本発明の免疫複合体は、高い細胞傷害活性を示すことから、細胞傷害剤として使用することができる。さらに、本発明の抗体は、CDH3高発現疾患の治療薬として使用することができる。本発明の細胞傷害剤及びCDH3高発現疾患の治療薬は、例えばカドヘリンを発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。ヒトCDH3高発現疾患としては、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫などがあげられる。
本発明の免疫複合体は、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜組み合わせることによって、医薬組成物として使用することができる。本発明の医薬組成物としては、例えば注射剤として製剤することができる。本発明の医薬組成物の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約10ng〜約100mg/kg体重の範囲である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例1 CDH3発現CHO細胞株の樹立
抗CDH3抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長CDH3を発現するCHO細胞の樹立を行った。
(1)CDH3遺伝子発現ベクターの作製
配列番号1に示す全長ヒトCDH3DNAを哺乳類発現ベクターpEF4/myc−HisB(インビトロジェン社)へ挿入するため、2種類の制限酵素KpnI(タカラバイオ社)及びXbaI(タカラバイオ社)で37℃、1時間処理した後、同じくKpnI及びXbaIで処理したpEF4/myc−HisBへT4 DNAリガーゼ(プロメガ社)により常法に従って挿入し、発現ベクターpEF4―CDH3―myc−Hisを得た。
(2)CDH3安定発現株の取得
FuGENE(登録商標)6トランスフェクション試薬(ロシュ・ダイアグノスティックス社)のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径10cmディッシュに8×105細胞のCHO細胞を播種し一晩培養後、8μgの発現ベクターpEF4―CDH3―myc−Hisと16μLのFuGENE6試薬を400μLの無血清RPMI1640培地(SIGMA−ALDRICH社)に混合し15分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬(Zeocin(登録商標))を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
CDH3全長発現CHOのクローン選抜は、抗c−Mycモノクローナル抗体(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社)を用いたウェスタンブロット法により行い、その結果、発現量が高く、かつ増殖が良好なCDH3全長発現CHO細胞株(EXZ1501)を得た。この細胞株と市販抗CDH3抗体(R&D SYSTEMS社)のフローサイトメーターによる測定結果を図1に示す。
実施例2 可溶型CDH3抗原の作製
抗CDH3抗体作製の免疫原とするため、C末端膜貫通領域以降を欠損させた可溶型CDH3(sCDH3)タンパク質を作製した。
(1)可溶型CDH3抗原発現ベクターの作製
CDH3全長cDNAをテンプレートとして、CDH3細胞外領域に相当する部分(配列番号2の1−654に相当、以下sCDH3cDNA)を増幅するように設計されたフォワードプライマー (配列番号3:CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT)とリバースプライマー (配列番号4:CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC)を用いてPCR反応を行った。反応にはKOD−Plus(東洋紡社)を用い、94℃−15秒、55℃−30秒、68℃−90秒、30サイクルの反応条件で行った。
その後、アガロースゲル電気泳動で目的サイズである約2.0kbpのバンドを含むゲル断片を切り出し、QIA(登録商標)クイックゲル抽出キット(キアゲン社)を用いて、目的のsCDH3cDNAを得た。
このsCDH3cDNAを発現用ベクターpEF4/myc−HisBへ挿入するために、2種類の制限酵素KpnI及びXbaIで処理した後、同じくKpnI及びXbaIで処理したpEF4/myc−HisBにT4 DNAリガーゼを用いて常法に従い挿入し、発現ベクターpEF4−sCDH3−myc−Hisを得た。
(2)可溶型CDH3タンパク質の発現
FuGENE6トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径10cmディッシュに8×105個のCHO細胞を播種し一晩培養後、8μgの発現ベクターpEF4−sCDH3−myc−Hisと16μLのFuGENE6試薬を400μLの無血清RPMI1640培地に混合、15分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬(Zeocin)を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
可溶型CDH3発現CHO細胞の選抜は、抗c−Mycモノクローナル抗体(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社)を用いたウェスタンブロット法で行った。培養上清中への分泌量が多く増殖が良好な細胞株を選択した結果、可溶型CDH3発現CHO細胞株(EXZ1702)が得られた。選択された可溶型CDH3発現CHO細胞株(EXZ1702)は、培養面積1,500cm2のローラーボトル3本を用い、ローラーボトル1本あたり無血清培地CHO−S−SFM−II(インビトロジェン社)333mLにて72時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からHisTrap(登録商標)HPカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)によるアフィニティークロマトグラフィーとSuperdex(登録商標)200pgカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)によるゲル濾過クロマトグラフィーにより可溶型CDH3タンパク質を得た。
実施例3 抗CDH3モノクローナル抗体の作製
(1)可溶型CDH3タンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した50μgの可溶型CDH3タンパク質とTiter−MAX Gold(登録商標)(タイターマックス社)を等量混合し、MRL/lprマウス(日本エスエルシー株式会社)の腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。2回目以降の免疫は同様に調製した25μgタンパク質量相当の可溶型CDH3タンパク質とTiter−MAX Goldを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から3日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞SP2/O−Ag14あるいはP3−X63−Ag8.653との細胞融合を行った。
(2)抗CDH3抗体産生ハイブリドーマの選抜
抗CDH3抗体の選抜は、全長CDH3を発現するCHO細胞株(EXZ1501)を用いたフローサイトメトリで行った。
すなわち、全長CDH3を発現するCHO細胞株(EXZ1501)を2mM EDTA−PBSで処理することで培養プレートから剥離後、1×106個/mLとなるようにFACS溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を50μL/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマ培養上清を加えて4℃で60分間反応させ、FACS溶液(200μL/ウェル)で2回洗浄した後、AlexaFluor488標識抗マウスIgG・ヤギF(ab‘)2(インビトロジェン社)を加えて、4℃で30分間反応させた。その後FACS溶液で2回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、CDH3発現CHO細胞との反応が認められるハイブリドーマを選抜した。
当該ハイブリドーマより得られた抗体と、CDH3発現CHO細胞(EXZ1501)、親株であるCHO細胞及びCDH3が高発現であると確認されているヒト細気管支肺胞上皮癌細胞株NCI−H358との典型的な反応結果を図2に示す。選抜したハイブリドーマ全てが、CDH3発現CHO細胞(EXZ1501)およびNCI−H358と反応し、CHO細胞とは反応しないことを確認した。
実施例4 正常組織および癌組織でのCDH3mRNAの発現
正常ヒト組織および各種癌組織より、レーザーマイクロダイセクション法(Laser Capture Microdissection)で回収したサンプルよりISOGEN(ニッポンジーン社)を用い定法に従って全RNAを調製した。RNA各10ngをGeneChipU−133B(Affymetrix社)を用い、Expression Analysis Technical Manual(Affymetrix社)に準じて遺伝子発現を解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、CDH3は正常ヒト組織では発現が限られ、肺癌、大腸癌、膵臓癌で発現が高かった(図3A、B)。また、分化度の異なる膵臓癌組織におけるCDH3mRNAの発現を検討したところ、分化度に関わらず発現が高い組織が認められた(図3C)。
実施例5 免疫組織化学染色による癌組織でのCDH3タンパク質の発現
癌臨床検体でのCDH3タンパク質の発現を確認するため、癌検体組織アレイで免疫染色を行った。
癌細胞組織アレイは、上海芯超生物科技有限公司社(Shanghai Outdo Biotech Co.,Ltd.)製の、膵癌(腺癌)、肺癌(腺癌)、肺癌(扁平上皮癌)および大腸癌(腺癌)を使用した。
各組織アレイスライドを脱パラフィン処理し、10mMTris 1mM EDTA(pH9.0)で95℃40分賦活化を行った。ENVISION+Kit(Dako社)付属のブロッキング試薬にて内在性ペルオキシダーゼの不活性化を行った後、抗CDH3抗体610227(BD BIOSCIENCE社)、およびネガティブコントロールとして抗HBs抗体Hyb−3423と5μg/mLの濃度で4℃一晩反応させた。抗体溶液を洗い流した後に、ENVISION+Kit付属のポリマー二次抗体試薬と室温30分間反応させた。ENVISION+Kit付属の発色試薬にて発色を行い、ヘマトキシリンエオジン溶液にて核染色を行った。
図4に結果を示す。癌細胞は抗CDH3抗体で染色され正常細胞は染色されなかった。
実施例6 ハイブリドーマからのRNAの精製
CDH3抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から、細胞質に存在するRNAをGough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, 173, p93-95 (1988)により記載されている方法(ただし、この論文に記されている溶解緩衝液のかわりに別のTNE緩衝液 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 8.0を用いた)に従って単離した。具体的な操作方法としては、5x10e6個のハイブリドーマ細胞を0.2mLのTNE緩衝液に懸濁して細胞膜を溶解後、遠心により細胞核を除去した。得られた約0.2mL細胞質上清に0.2mLの抽出緩衝液(10 mM Tris-HCl, pH7.5; 0.35 M NaCl; 1%(w/v) SDS; 10 mM EDTA, pH 8.0; 7 M 尿素)を加えた。この混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、得られたRNA溶液にキャリアとしてグリコーゲン(ロッシュ、Cat No. 901393)を加えてから、エタノールで沈澱させた。次にRNA沈殿物を、細胞質RNA濃度が0.5〜2マイクログラム/マイクロリットルになるように10〜50マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えて溶解した。
実施例7 ハイブリドーマから調製したRNAからのcDNAライブラリーの作製
一本鎖cDNAを合成するため、前記のように調製した細胞質RNAの0.5〜3マイクログラムを50mM Tris-HCl, pH 8.3(室温); 75mM KCl; 3mM MgCl2; 10mM DTT、100ナノグラムのランダムプライマー、0.5mM dNTP、200ユニットのSuperscript II(逆転写酵素、インビトロジェン社)を含む20マイクロリットル反応混合液を調製し、42°Cで50分間インキュベートした。このように合成したcDNAライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の鋳型として直接使用した。
実施例8 抗CDH3抗体可変領域をコードする遺伝子のPCR法による増幅
実験に用いたプライマーはすべて北海道システム・サイエンス株式会社で合成した。
A.マウス軽鎖の可変領域をコードする遺伝子をPCR法で増幅するために使用するプライマー
5'末端においてFR1部分と相同性を有するDNAプライマーと3'末端においてマウスL鎖内のJ鎖遺伝子と相同性を有する4セットプライマー(1)、あるいは、5' 末端においてL鎖シグナル部分(7セットプライマー)と3'末端においてKC部分(KVLアンチセンスプライマー)と相同性を有するプライマーセット(2)の2種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該cDNAからマウス免疫グロブリンL鎖可変域DNAを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
(1) マウスL鎖可変域クローニング4セットセンスプライマー
「Phage Display −A Laboratory Manual- , Barbas Burton Scott Silverman」 PROTOCOL 9.5を参考にSense Primer 17種、Reverse Primer 3種を北海道システムサイエンスで合成した。
VKセンス(FR1部分)下記17のプライマーの混合物をVKセンスプライマーとして使用した。
5'-GAYATCCAGCTGACTCAGCC-3'(縮重度2):配列番号5
5'-GAYATTGTTCTCWCCCAGTC-3'(縮重度4):配列番号6
5'-GAYATTGTGMTMACTCAGTC-3'(縮重度8):配列番号7
5'-GAYATTGTGYTRACACAGTC-3'(縮重度8):配列番号8
5'-GAYATTGTRATGACMCAGTC-3'(縮重度8):配列番号9
5'-GAYATTMAGATRAMCCAGTC-3'(縮重度16):配列番号10
5'-GAYATTCAGATGAYDCAGTC-3'(縮重度12):配列番号11
5'-GAYATYCAGATGACACAGAC-3'(縮重度4):配列番号12
5'-GAYATTGTTCTCAWCCAGTC-3'(縮重度4):配列番号13
5'-GAYATTGWGCTSACCCAATC-3'(縮重度8):配列番号14
5'-GAYATTSTRATGACCCARTC-3'(縮重度16):配列番号15
5'-GAYRTTKTGATGACCCARAC-3'(縮重度16):配列番号16
5'-GAYATTGTGATGACBCAGKC-3'(縮重度12):配列番号17
5'-GAYATTGTGATAACYCAGGA-3'(縮重度4):配列番号18
5'-GAYATTGTGATGACCCAGWT-3'(縮重度4):配列番号19
5'-GAYATTGTGATGACACAACC-3'(縮重度2):配列番号20
5'-GAYATTTTGCTGACTCAGTC-3'(縮重度2):配列番号21
Jアンチセンス(4セットプライマー)
J1 / J2アンチセンスプライマー (1)
5'-GGSACCAARCTGGAAATMAAA-3'(縮重度:8):配列番号22
J4アンチセンスプライマー (2)
5'-GGGACAAAGTTGGAAATAAAA-3':配列番号23
J5アンチセンスプライマー(3)
5'-GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA-3' :配列番号24
J1 / J2, J4, J5アンチセンスプライマー混合物 (4)
(2) マウスL鎖可変域クローニング7セットプライマー
VKセンス(シグナルペプチド部分)
このプライマーはノバジェン社のマウスIg-プライマーセット(Novagen; Merck,Cat.No.69831-3)を元に制限酵素部位を除去するように塩基配列を改変した。
Aセットセンスプライマー
5'-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3' :配列番号25
Bセットセンスプライマー
5'-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3' :配列番号26
Cセットセンスプライマー
5'-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3' :配列番号27
Dセットセンスプライマー(下記2種類のプライマーの混合物を使用)
5'-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3' :配列番号28
5'-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3' :配列番号29
Eセットセンスプライマー(下記3種類のプライマーの混合物を使用)
5'-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3':配列番号30
5'-ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG-3':配列番号31
5'- ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC -3':配列番号32
Fセットセンスプライマー(下記4種類のプライマーの混合物を使用)
5'-ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG-3':配列番号33
5'-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3':配列番号34
5'-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3':配列番号35
5'-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3':配列番号36
Gセットセンスプライマー(下記4種類のプライマーの混合物を使用)
5'-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3':配列番号37
5'-ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3':配列番号38
5'-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3':配列番号39
5'-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3':配列番号40
KVLアンチセンスプライマー
5'-ACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3':配列番号41
B.マウスH鎖V領域をコードする遺伝子をPCR法で増幅するために使用するプライマー
5' 末端においてマウスH鎖シグナル部分(4セットプライマー)と相同性を有するプライマーと3'末端においてKC部分と相同性を有するプライマー、あるいは5'末端においてFR1部分と相同性を有する1セットのプライマーと3' 末端においてマウスH鎖の定常領域(IGHC)と相同性を有する2種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該cDNAからマウス免疫グロブリンH鎖可変域DNAを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
(3) マウスH鎖可変域クローニングプライマー
VHセンス(シグナル部分:4セットプライマー)
このプライマーはCurrent Protocols in Immunology (John Wiley and Sons, Inc.), Unit 2.12 Cloning, Expression, and Modification of Antibody V RegionsのTable 2.12.2を参考にした。
5'-ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3'(縮重度:32):配列番号42
5'-ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3'(縮重度:8):配列番号43
5'-ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3':配列番号44
5'-ATGGRCAGRCTTACWTYY-3'(縮重度:32):配列番号45
(4) マウスH鎖可変域クローニングプライマー
VHセンス(FR1部分)
このプライマーはTanら、“Superhumanized" Antibodies: Reduction of Immunogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169 (2002) p1119-1125のセンスプライマーの塩基配列を改変してデザインした。
5'-SAGGTSMARCTKSAGSAGTCWGG-3'(縮重度:256):配列番号46
VHアンチセンス(3, 4に共通のアンチセンスプライマー)
マウスIgGすべてのアイソフォームとアニーリングできるように塩基配列を縮重してデザインした。
5'-CASCCCCATCDGTCTATCC-3'(縮重度:6):配列番号47
実施例9 キメラ抗CDH3免疫グロブリンの一過性発現ベクターの作製
発現プラスミドの作製: DNA Engine(Peltier Thermal Cycler, MJ Research, Bio-Rad) を用いたPCR法により抗CDH3マウスモノクローナル抗体L鎖、H鎖それぞれの可変領域を実施例8に示したプライマーを用いて増幅した。増幅したDNAフラグメントはサブクローニングベクターpGEM(プロメガ社)に組み込んで、このベクターのT7,SP6ユニバーサルプライマーで塩基配列を決定した。
その際に決定された塩基配列のうち、CDRに相当する部分をアミノ酸に変換した配列を表1に示す。
キメラ抗CDH3抗体のL鎖、および、H鎖の可変域塩基配列はIMGT/V-QUEST Search page (http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=mouseIg) で検索して、確かに抗体遺伝子がクローニングできていることを確認した。次に、クローン化された抗CDH3抗体のL鎖及びH鎖のV領域をコードする遺伝子は、キメラL鎖発現ベクターにはヒトCk領域をコードする遺伝子を、キメラH鎖発現ベクターにはヒトCg1領域をコードする遺伝子をそれぞれ接続した遺伝子をデザインして、これらL鎖、H鎖キメラ抗体遺伝子をGenScript社によって全長人工合成した。その際、CHO生産細胞での遺伝子発現が有利なようにコドン使用頻度の最適化 (Kimら、Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cells, Gene, 199, 1997, p293-301の方法に従った) をおこなった。具体的には、L鎖の場合、効率的な翻訳のために必須のDNA配列(Kozak,M.,J., At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J. Mol. Biol. 196, p947-950, 1987)、マウスIGKV(k鎖可変領域)遺伝子のシグナルペプチド、抗CDH3抗体のL鎖のV領域、ヒトKC(k鎖定常域)の順に遺伝子を並列し、その両端には制限酵素部位(5' 側にNheI, 3' 側にEcoRI)を付加した。キメラH鎖も同様に作製した。これら人工合成遺伝子をNheIとEcoRIで切断し、発現ベクターpCAGGSのNheIとEcoRI部位に組み込み、抗CDH3キメラ抗体L鎖発現ベクターpCAGGS-IGK, H鎖発現ベクターpCAGGS-IGHを得た。
実施例10 キメラ抗CDH3免疫グロブリンの安定発現ベクターの作製
遺伝子操作された抗体遺伝子をCHO細胞を用いて高レベルで発現させるために、CMVプロモーター配列に連結し、ポリAシグナルを有したジヒドロフォレートレダクターゼ(dhfr)遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製した。
キメラ抗体の安定発現生産細胞株をつくるために、dhfr遺伝子を組み込んだpCAGGS発現ベクターを作製した。具体的には、一過性の発現ベクターであるpCAGGS-IGH、および、pCAGGS-IGKに、CMVプロモーターとポリAシグナルを有したdhfr遺伝子を組み込むことである。CMVプロモーター、Kozak配列をもつマウスdhfr遺伝子、SV40ポリAシグナルをそれぞれPCR法によって増幅し、これらの遺伝子の混合物をPCR法で接続するとともに両端にHindIII部位を付加して、HindIII-CMVプロモーター-Kozak-dhfr-ポリA-HindIIIという遺伝子フラグメントを得た。このフラグメントをpCAGGS-IGH、あるいは、pCAGGS-IGKのHindIII部位に組み込んでpCAGGS-IGH-CMVp-dhfr-A、および、pCAGGS-IGK-CMVp-dhfr-Aを得た。これらの発現ベクターはキメラ抗体をCAGプロモーターで、dhfr遺伝子をCMVプロモーターで発現させることができ、効率的に遺伝子増幅を利用してキメラ抗体を生産することができた。
実施例11 キメラ抗CDH3生産CHO細胞株の樹立
CHO dhfr(-)細胞(G. Urlaubら、Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p4216-4220, 1980)を用いて、2種類のプラスミド(アンピシリン耐性遺伝子内のPvuIでプラスミドを切断して環状プラスミドから線状プラスミドにした)すなわち、キメラ抗CDH3L鎖を発現するためのpCAGGS-IGK-CMV-dhfr-Aベクター、および、キメラ抗CDH3H鎖を発現するためのpCAGGS-IGH-CMV-dhfr-Aベクターにより同時形質転換した。エレクトロポレーションはロンザ社製のAmaxaでおこなった。DNA(L鎖、H鎖各プラスミドにつき0.002mg/試料)を3x10e3 細胞の0.1mLのAmaxaエレクトロポレーションCHO用緩衝液に加えてパルスを与えた。
エレクトロポレーション処理された細胞を、10%の透析済みFBSを含有し、HT(H, ヒポキサンチン : T, チミジン)を含まないIscove's Modified Dulbecco培地(IMDM)に加えた。遺伝子導入から3日後、10%透析FBS、2 mM L-グルタミン、HTを含まないIMDMに培地を交換して1mg/mLのG418でneo+形質転換細胞の選択をおこない、キメラ抗体産生陽性細胞株クローンを得た。次に、G418で選択されたクローンを用いて遺伝子増幅をおこなった。0.25mM、1mMの2ラウンドのメソトレキセート(MTX)中での増幅の後、1リットルあたり約50〜100mgのキメラCDH3抗体を生産する細胞株を樹立できた。
実施例12 酵素免疫測定法(ELISA)によるキメラ抗体の定量
遺伝子導入したCHO細胞の培養上清をELISAにより測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギ抗ヒトIgG(H+L)(マウス、ウサギ、ウシ、マウスIgGに対して吸収済み)(コスモバイオ:AQI, Cat A-110UD)でコートした。ブロックした後、抗CDH3キメラ抗体産生CHO細胞からの培養上清を段階希釈し、各ウエルに加えた。プレートをインキュベーション、および洗浄後、ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(マウス、ウサギ、ウシ、マウスIgGに対して吸収済み)-HRP(コスモバイオ:AQI,Cat.A-110PD)を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションした後、反応を停止しそして450nmにおける吸光度を測定した。標準として精製ヒトIgGを用いた。
実施例13 キメラ抗体の結合活性
実施例10、11に示した方法で表2に示した組み合わせのCDR配列を持つ抗体を作製し、その結合活性をフローサイトメトリで評価した。
反応対象となる各細胞株(CHO細胞、CDH3強制発現CHO細胞及びCDH3の高発現が確認されているNCI−H358細胞株)を2mM EDTA−PBSで処理することにより培養プレートから剥離後、1×106個/mLとなるようにFACS溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を50μL/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種し、精製したキメラ抗体を10ug/mLになるように添加し、4℃で60分間反応させた。FACS溶液(150μL/ウェル)で2回洗浄した後、AlexaFluor488標識抗ヒトIgG・ヤギF(ab‘)2(インビトロジェン社)4μg/mlを加えて、4℃で30分間反応させた。その後FACS溶液で2回洗浄した後、フローサイトメトリを実施した。その結果、キメラ抗体はCDH3発現細胞株への強い反応性が認められた(図5)。
CDR−H1、H2及びH3はそれぞれ各抗体H鎖を、CDR−L1、L2及びL3はそれぞれ各抗体L鎖を構成するCDR配列を示す。
実施例14 薬剤の合成
DM1SMe(図6)は、米国特許第5,208,020号および6,333,410B1号に以前に記載されたように調製した。
実施例15 薬剤結合抗体の調製
1.結合薬剤の還元処理
EtOH300uLで溶解した0.78mgのDM1SMeと50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)180uL、TCEP Solution(Bond Breaker、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)20uLを混合し、窒素雰囲気下、室温で30分以上反応させ、薬剤を還元した。
還元薬剤はHPLCを使用して精製した後に溶媒留去後、10mg/mLになるようにジメチルアセトアミドに溶解した。
2.マレイミド化抗体の調製
1mg/mL抗CDH3キメラ抗体にモル比30倍過剰となる量のsulfo-SMCC(PIERCE社)を加え、30℃、1時間反応させた。
過剰な架橋剤を除くため、50mMリン酸カリウム、50mM NaCl、2mM EDTA(pH6.5)で平衡化した脱塩カラムで脱塩処理(ZebaSpinColumn、 サーモフィッシャーサイエンティフィック社)した。
3.薬剤による抗体の修飾
1mg/mLのマレイミド化した抗CDH3キメラ抗体と、結合したマレイミド基数の1.7倍に相当する還元薬剤とを50mMリン酸カリウム、50mM NaCl、2mM EDTA(pH6.5)中で、室温にて一晩反応させた。その後、過剰な薬剤をゲルろ過操作により除いた。
実施例16 抗体薬剤結合量の定量
抗体当たりの薬剤結合数は、252nm及び280nmの吸光度を測定する事で決定した。決定方法は非特許文献(Widdison,W.C.,Wilhelm,S.D.,Cavanagh,E.E.,et al. (2006) Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer. J.Med.Chem.,49,4392-4408)に記載の吸光係数εAb280=223,000M-1cm-1, εAb252=82,510M-1cm-1, εDM1280=5,180M-1cm-1, εDM1252=26,160M-1cm-1を利用した。
実施例17 細胞障害試験
薬剤結合抗体の細胞傷害性と特異性はWST-8を発色基質とした細胞増殖測定試薬(同仁化学研究所社,Cell counting assay kit-8)を使用して評価した。
即ち、CDH3が高発現であると確認されているヒト乳がん細胞株HCC1954と薬剤結合抗体(ADC)あるいは薬剤を結合していない抗体(Naked)を任意の量共存させ、37度で3日間、、5%CO2環境下でインキュベートした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後A450/620の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を100%としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した(図7)。なお、図中に用いられた抗体は、抗体番号067−17Cを使用し、ADCについては、実施例16に記載した方法で抗体あたりの薬剤導入数を計算したところ、抗体1分子辺り4.05個の薬剤が導入されていると見積もられた。
実施例18 細胞障害試験(抗体毎の比較)
取得した複数の抗CDH3抗体を用いて薬剤結合抗体の細胞傷害性を評価した。
測定は、実施例17に記載した方法に準じた。即ち、ヒト乳がん細胞株HCC1954と薬剤結合抗体(ADC)を共存させ、37度で3日間、5%CO2環境下でインキュベートした。その際のADC濃度は、0.01ug/mLとした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後A450/620の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を100%としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した。各抗体抗体1分子辺りの薬剤数は、実施例16に記載した方法で見積もった(表3)。
陰性対照抗体は、HCC1954と反応しないことが確認されている抗体が使用された。
実施例19 動物試験
薬剤結合抗体のインビボでの腫瘍縮小効果を、乳がん細胞株HCC1954を移植したゼノグラフトモデルにて確認した。投与は、抗アシアロGM1抗体(WAKO 014-09801)を、大塚蒸留水1mLで溶解後、大塚生理食塩水4mLを加えて全量5mLとした後、この溶液を、マウス1匹あたり100uL腹腔内投与。HCC1954は10%FBS含有RPMI1640培地を用いて培養し、SCIDマウス(メス、日本クレア)の右腹側部皮下に5x106個/マウスになるように移植した。
インビボ試験は各群5匹とし、15mg/kgを尾静脈より投与した。投与は平均腫瘍径が100-150mm3となった時点で開始し、1週間後に更に同量、計2回行なった。
図中に用いられた抗体は、抗体番号067−12C、067−23C及び067−27Cを使用し、ADCについては、実施例16に記載した方法で抗体あたりの薬剤導入数を計算したところ、抗体1分子辺り3〜4個の薬剤が導入されていると見積もられた。
腫瘍サイズの推移を図8に示す。

Claims (13)

  1. CDH3に対するモノクローナル抗体又はCDH3結合能を有するその断片とDM1とをN−スクシンイミジル4−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)リンカーで連結して成る免疫複合体。
  2. 前記抗体が、CDR−H1に配列番号48を含み、CDR−H2に配列番号56を含み、CDR−H3に配列番号65を含み、CDR−L1に配列番号75を含み、CDR−L2に配列番号82を含み、CDR−L3に配列番号86を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
  3. 前記抗体が、CDR−H1に配列番号52を含み、CDR−H2に配列番号60を含み、CDR−H3に配列番号70を含み、CDR−L1に配列番号75を含み、CDR−L2に配列番号82を含み、CDR−L3に配列番号91を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
  4. 前記抗体が、CDR−H1に配列番号54を含み、CDR−H2に配列番号62を含み、CDR−H3に配列番号72を含み、CDR−L1に配列番号74を含み、CDR−L2に配列番号81を含み、CDR−L3に配列番号93を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
  5. 前記抗体が、CDR−H1に配列番号55を含み、CDR−H2に配列番号63を含み、CDR−H3に配列番号73を含み、CDR−L1に配列番号80を含み、CDR−L2に配列番号85を含み、CDR−L3に配列番号94を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
  6. 前記抗体が、CDR−H1に配列番号49を含み、CDR−H2に配列番号64を含み、CDR−H3に配列番号66を含み、CDR−L1に配列番号76を含み、CDR−L2に配列番号84を含み、CDR−L3に配列番号89を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
  7. 前記抗体が、CDR−H1に配列番号49を含み、CDR−H2に配列番号58を含み、CDR−H3に配列番号68を含み、CDR−L1に配列番号79を含み、CDR−L2に配列番号82を含み、CDR−L3に配列番号90を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
  8. 前記抗体が、CDR−H1に配列番号53を含み、CDR−H2に配列番号61を含み、CDR−H3に配列番号71を含み、CDR−L1に配列番号75を含み、CDR−L2に配列番号82を含み、CDR−L3に配列番号92を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
  9. 前記抗体が、CDR−H1に配列番号51を含み、CDR−H2に配列番号57を含み、CDR−H3に配列番号67を含み、CDR−L1に配列番号78を含み、CDR−L2に配列番号83を含み、CDR−L3に配列番号88を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
  10. 前記抗体が、CDR−H1に配列番号50を含み、CDR−H2に配列番号59を含み、CDR−H3に配列番号69を含み、CDR−L1に配列番号77を含み、CDR−L2に配列番号83を含み、CDR−L3に配列番号87を含む、請求項1に記載の免疫複合体。
  11. CDH3の過剰発現によって特徴づけられる癌を治療するための請求項1から10の何れか1項に記載の免疫複合体を含む、医薬組成物。
  12. 抗がん作用を有する、請求項11に記載の医薬組成物。
  13. 前記癌が、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌、卵巣癌、肺癌、浸潤性膀胱癌、膵臓癌、脳の転移性癌、甲状腺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、メラノーマ、乳腺癌、肺腺癌、子宮頚部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫又は軟組織肉腫から選択される、請求項11又は12に記載の医薬組成物。
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