JP6002354B1

JP6002354B1 - Ａｎｇ２抗体

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Publication number: JP6002354B1
Application number: JP2016515959A
Authority: JP
Inventors: ドーエンムンレオン，ドンミエンヌ; シュー，ジアンフアイ
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2035-05-12
Also published as: NZ724877A; PE20161404A1; EP3145544B1; EP3145544A1; US20150329627A1; MX2016015151A; WO2015179166A1; BR112016023718A2; TN2016000442A1; CN106456755B; AU2015264550A1; EP3145544A4; ES2756331T3; US9695241B2; CL2016002892A1; PH12016502297A1; TWI551610B; JP2017031166A; AR100270A1; AP2016009553A0

Abstract

本発明は、ヒトアンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）に結合し、かつ単独でおよびＶＥＧＦ経路阻害剤と併用してがん、特に胃がん、肝細胞がん、卵巣がん、大腸がん、および乳がんを含めた、ＶＥＧＦＲ２およびＡｎｇ２によって至らされるがんを治療するために有用で有り得る、抗体に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、薬品の分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒトアンジオポエチン−２（Ａｎｇ２）に結合し、かつがん、特に腫瘍転移を治療するために、ならびに胃がん、肝細胞がん、卵巣がん、大腸がん、および乳がんを含めた、ＶＥＧＦＲ２およびＡｎｇ２によって至らされる固形腫瘍のためのヒト血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）阻害剤と併用して、有用であり得る抗体に関する。

がんの特質は、血管新生と呼ばれる、持続性の新しい血管形成である。アンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）およびＡｎｇ２は、血管新生を調節する主要経路の一員であり、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２は、内皮細胞に特異的な受容体型チロシンキナーゼＴｉｅ２に結合する分泌因子である。Ａｎｇ１は、周皮細胞によって構成的に分泌されかつＴｉｅ２受容体を介して血管健全性を安定化させる。Ａｎｇ２は、刺激（例えば創傷治癒、腫瘍成長）に反応してのみ内皮細胞から放出されかつ血管出芽を促進しかつＴｉｅ２シグナル伝達を介する周皮細胞−内皮細胞相互作用を阻害する。調査が、Ａｎｇ２の阻害は血管新生を阻害するためにＡｎｇ１よりも重要であることを示唆しているが、ある種の他の調査においては、Ａｎｇ２およびＡｎｇ１の阻害は有益性を示している（非特許文献１）。

ヒトＡｎｇ２に対する抗体は、ＶＥＧＦ遮断剤アフリベルセプトと併用して投薬した場合、マウス異種移植腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を阻害しかつ腫瘍血管系を減少することが示されている（非特許文献２のＲＥＧＮ９１０および特許文献１のＨ１Ｈ６８５Ｐ）。非特許文献３において、ｍＡｂ３．１９．３、ヒトＡｎｇ２抗体は、Ａｎｇ２よりも少なくとも５００倍低い親和性でＡｎｇ１に結合すると報告されている一方で、特許文献２の実施例４および９においては、出願者によって３．１９．３はＡｎｇ２に関して約５ｐＭのＫ_ＤおよびＡｎｇ１に関して約３０ｐＭのＫ_ＤでＡｎｇ１への強い交差反応性を有すると開示されている。ＳＷ６２０異種移植調査において、３．１９．３は、マウスＶＥＧＦＲ２に結合するモノクローナル抗体、ＤＣ１０１と併用して投薬された。

国際公開第２０１１０１４４６９号国際公開第２００６０６８９５３号

Ｃａｓｃｏｎｅら著、「ＪＣｌｉｎＯｎｃ（２０１２）３０（４）：４４１」Ｄａｌｙら著、「ＣａｎｃｅｒＲｅｓ（２０１３）７３（１）：１０８」Ｂｒｏｗｎら著、「ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ（２０１０）９（１）：１４５」

ヒトＡｎｇ２と高親和性で結合することおよびヒトＡｎｇ２を中和することによってＡｎｇ／Ｔｉｅ２血管新生経路を阻害する代替の抗体を提供する必要性は依然として存在する。具体的には、ヒトＡｎｇ２に高親和性で結合してヒトＡｎｇ２を中和するが、ヒトＡｎｇ１には高親和性で結合しないまたは中和しない抗体を提供する必要性が依然として存在する。

したがって、本発明の実施形態は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む抗体であって、軽鎖が軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含みかつ重鎖が重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲが配列番号３において与えられるアミノ酸配列を有し、かつＨＣＶＲが配列番号１において与えられるアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。

本発明のある種の抗体は、当技術分野において既知のヒトＡｎｇ２抗体よりも大きい高親和性でヒトＡｎｇ−２に結合する。さらには、本発明のある種の抗体は、がん療法としての可能性を示す、トリプルネガティブ乳がんのためのＥＬ１９９７、卵巣がんのためのＳＫＯＶ３ｘ．１、および前立腺がんのためのＰＣ３などの腫瘍異種移植モデルにおける陽性反応を実証する。加えて、本発明のある種の抗体は、ヒトＡｎｇ−１と比べてヒトＡｎｇ−２に選択的に結合し、かつヒトＡｎｇ１に関して可能性のあるオフターゲットの傾向を回避する。

さらに別の実施形態において、本発明は、ＬＣが配列番号４において与えられるアミノ酸配列を有し、かつＨＣが配列番号２において与えられるアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む抗体であって、それぞれの軽鎖が配列番号４において与えられるアミノ酸配列を有し、かつそれぞれの重鎖が配列番号２において与えられるアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、重鎖のうちの１つが軽鎖のうちの１つと鎖間ジスルフィド結合を形成し、かつ他方の重鎖が他方の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、かつ重鎖のうちの１つが他方の重鎖と２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する、抗体を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、抗体がグリコシル化された、抗体を提供する。

一実施形態において、本発明は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトＡｎｇ２（配列番号７）に結合する抗体であって、軽鎖が、それぞれ、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡ（配列番号８）、ＹＷＡＳＴＲＤＴ（配列番号９）、およびＨＱＹＳＳＹＰＰＴ（配列番号１０）からなる軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ重鎖が、それぞれ、アミノ酸配列ＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶ（配列番号１１）、ＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶ（配列番号１３）からなる重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む、抗体を提供する。

一実施形態において、本発明は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトＡｎｇ２（配列番号７）に結合する抗体であって、軽鎖が軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含みかつ重鎖が重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲが配列番号３において与えられるアミノ酸配列を有し、かつＨＣＶＲが配列番号１において与えられるアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号７）に結合する抗体であって、ＬＣが配列番号４において与えられるアミノ酸配列を有し、かつＨＣが配列番号２において与えられるアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む、ヒトＡｎｇ２（配列番号７）に結合する抗体であって、それぞれの軽鎖が配列番号４において与えられるアミノ酸配列を有し、かつそれぞれの重鎖が配列番号２において与えられるアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＡｎｇ２（配列番号７）に結合する抗体であって、重鎖のうちの１つが軽鎖のうちの１つと鎖間ジスルフィド結合を形成し、かつ他方の重鎖が他方の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、かつ重鎖のうちの１つが他方の重鎖と２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する、抗体を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、抗体がグリコシル化された、ヒトＡｎｇ２（配列番号７）に結合する抗体を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＡｎｇ２に関して約１５０ｐＭ未満の平衡解離定数、Ｋ_Ｄを有する本発明の抗体を提供する。本発明の抗体は、約１×１０^６Ｍ^−１ｓｅｃ^−１のヒトＡｎｇ２に対するｋ_ｏｎ速度によってさらに特徴付けられる。本発明の抗体は、約０．７×１０^−４ｓｅｃ^−１のヒトＡｎｇ２に対するｋ_ｏｆｆ速度によってさらに特徴付けられる。Ｋ_Ｄ、ｋ_ｏｎ、およびｋ_ｏｆｆ値は、アッセイの節における「結合キネティクス、親和性、および選択性」に記載のように３７℃での結合キネティクスによって確定される。

本発明の抗体は、ヒトＡｎｇ２に高親和性で結合する。本開示の目的のために、「高親和性」と言う語は、約１５０ｐＭ未満のヒトＡｎｇ２に関するＫ_Ｄを指す。Ｋ_Ｄ値は、アッセイの節における「結合キネティクス、親和性、および選択性」に記載のように３７℃での結合キネティクスによって確定される。

一実施形態において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む、哺乳動物細胞であって、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体を発現させる能力がある細胞を提供する。

一実施形態において、本発明は、抗体が発現するような条件下で本発明の哺乳動物細胞を培養すること、および発現した抗体を回収することを含む、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、抗体を産生するためのプロセスを提供する。

一実施形態において、本発明は、本発明のプロセスによって産生された抗体を提供する。

一実施形態において、本発明は、本発明の抗体、および許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。

一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、それを必要とする患者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含むがんを治療する方法であって、がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、大腸がん、または肝細胞がんである方法を提供する。さらに別の実施形態において、これらの方法は、シスプラチン、カルボプラチン、リポソーマルドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射可能な懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、カペシタビン、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびイリノテカン）、ならびにセツキシマブからなる群から選択される１種または複数の抗腫瘍剤との同時、別々、または連続した併用における有効量の本発明の抗体の投与を含む。

さらに別の実施形態において、これらの方法は、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ、およびデュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）からなる群から選択される１種または複数のがん免疫（ｉｍｍｕｎｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ）剤との同時、別々、または連続した併用における有効量の本発明の化合物の投与を含む。

一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む、乳がんを治療する方法を提供する。さらに別の実施形態において、これらの方法は、ラムシルマブ、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射可能な懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、ならびにカペシタビンからなる群から選択される１種または複数の抗腫瘍剤との同時、別々、または連続した併用における有効量の本発明の抗体の投与を含む。

一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む、卵巣がんを治療する方法を提供する。さらに別の実施形態において、これらの方法は、ラムシルマブ、シスプラチン、カルボプラチン、およびリポソーマルドキソルビシンからなる群から選択される１種または複数の抗腫瘍剤との同時、別々、または連続した併用における有効量の本発明の抗体の投与を含む。

一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む、胃がんを治療する方法を提供する。さらに別の実施形態において、これらの方法は、ラムシルマブとの同時、別々、または連続した併用における有効量の本発明の抗体の投与を含む。

一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む、肝細胞がんを治療する方法を提供する。さらに別の実施形態において、これらの方法は、ラムシルマブとの同時、別々、または連続した併用における有効量の本発明の抗体の投与を含む。

一実施形態において、本発明は、それを必要とする患者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む、大腸がんを治療する方法を提供する。さらに別の実施形態において、これらの方法は、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびイリノテカン）、およびセツキシマブからなる群から選択される１種または複数の抗腫瘍剤との同時、別々、または連続した併用における有効量の本発明の抗体の投与を含む。

一実施形態において、本発明は、療法における使用のための、本発明の抗体を提供する。一実施形態において、本発明は、がんの治療における使用のための、本発明の抗体を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、がんが乳がん、卵巣がん、胃がん、大腸がん、または肝細胞がんである、がんの治療における使用のための、本発明の抗体を提供する。さらに別の実施形態において、がんの治療における使用のために、本発明の抗体は、シスプラチン、カルボプラチン、リポソーマルドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射可能な懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、カペシタビン、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびイリノテカン）、ならびにセツキシマブからなる群から選択される１種または複数の抗腫瘍剤と同時、別々、または連続して併用される。

さらに別の実施形態において、がんの治療における使用のために、本発明の化合物は、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、およびデュルバルマブからなる群から選択される１種または複数のがん免疫剤と同時、別々、または連続して併用される。

一実施形態において、本発明は、乳がんの治療における使用のための、本発明の抗体を提供する。さらに別の実施形態において、乳がんの治療における使用のために、本発明の抗体は、ラムシルマブ、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射可能な懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、ならびにカペシタビンからなる群から選択されるからなる群から選択される１種または複数の抗腫瘍剤と同時、別々、または連続して併用される。

一実施形態において、本発明は、卵巣がんの治療における使用のための、本発明の抗体を提供する。さらに別の実施形態において、卵巣がんの治療における使用のために、本発明の抗体は、ラムシルマブ、シスプラチン、カルボプラチン、およびリポソーマルドキソルビシンからなる群から選択される１種または複数の抗腫瘍剤と同時、別々、または連続して併用される。

一実施形態において、本発明は、胃がんの治療における使用のための、本発明の抗体を提供する。さらに別の実施形態において、胃がんの治療における使用のために、本発明の抗体は、ラムシルマブと同時、別々、または連続して併用される。

一実施形態において、本発明は、肝細胞がんの治療における使用のための、本発明の抗体を提供する。さらに別の実施形態において、肝細胞がんの治療における使用のために、本発明の抗体は、ラムシルマブと同時、別々、または連続して併用される。

一実施形態において、本発明は、大腸がんの治療における使用のための、本発明の抗体を提供する。さらに別の実施形態において、大腸がんの治療における使用のために、本発明の抗体は、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびイリノテカン）、およびセツキシマブからなる群から選択される１種または複数の抗腫瘍剤と同時、別々、または連続して併用される。

さらに別の実施形態において、本発明は、がんの治療のための薬物の製造のための本発明の抗体の使用を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、がんが乳がん、卵巣がん、胃がん、大腸がん、または肝細胞がんである、がんの治療のための薬物の製造のための本発明の抗体の使用を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、がんの治療のための薬物の製造のためにシスプラチン、カルボプラチン、リポソーマルドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、注射可能な懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イキサベピロン、カペシタビン、ラムシルマブ、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびイリノテカン）、ならびにセツキシマブからなる群から選択される１種または複数の抗腫瘍剤との同時、別々、または連続した併用における本発明の抗体の使用を提供する。

本発明の抗体は、改変された、非天然型のポリペプチド複合体である。本発明のＤＮＡ分子は、本発明の抗体におけるポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む非天然型のＤＮＡ分子である。

本発明の抗体は、改変されたＣＤＲを有しかつヒトゲノム配列由来のフレームワークおよび定常領域と一致するまたは実質的に一致（実質的にヒト）するヒト由来である抗体（フレームワーク、ヒンジ領域、および定常領域の全てまたは部分）の幾つかの部分を有するように作られている。完全ヒト型フレームワーク、ヒンジ領域、および定常領域は、それらのヒト生殖細胞系配列ならびに天然型の体細胞突然変異を有する配列およびそれらの改変された突然変異を有する物である。本発明の抗体は、その中に１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、または付加を含有する完全ヒト型フレームワーク、ヒンジ領域、または定常領域由来のフレームワーク、ヒンジ領域、または定常領域を含んでいてよい。さらには、本発明の抗体は、好ましくは実質的にヒトにおいて非免疫原性である。

本発明の抗体は、ＩｇＧ型抗体でありかつ鎖内および鎖間ジスルフィド結合を介して架橋した４つのアミノ酸鎖（２つの「重」鎖および２つの「軽」鎖）を有する。それぞれの重鎖は、Ｎ末端ＨＣＶＲおよび重鎖定常領域（「ＨＣＣＲ」）からなる。それぞれの軽鎖は、ＬＣＶＲおよび軽鎖定常領域（「ＬＣＣＲ」）からなる。ある種の生体系において発現した場合、天然ヒトＦｃ配列を有する抗体は、Ｆｃ領域においてグリコシル化される。典型的には、グリコシル化は、抗体のＦｃ領域において高度に保存されたＮ−グリコシル化部位で生じる。Ｎ−グリカンは、典型的にはアスパラギンに付着する。抗体は、同様に他の位置でもグリコシル化され得る。

場合によっては、本発明の抗体は、Ｆｃ受容体媒介炎症機序に関与する能力またはエフェクター機能の減少をもたらす補体を活性化する能力の減少のためにヒトＩｇＧ_４Ｆｃ領域由来であるＦｃ部分を含有する。

さらには、本発明のある種の抗体は、ＩｇＧ_４−ＰＡＡＦｃ部分を含有する。ＩｇＧ_４−ＰＡＡＦｃ部分は、２２９位におけるセリンからプロリンへの突然変異、２３５位におけるフェニルアラニンからアラニンへの突然変異、および２３６位におけるロイシンからアラニンへの突然変異を有する。Ｓ２２９Ｐ突然変異は、半抗体形成（ＩｇＧ_４抗体における半分子の動的交換の現象）を防ぐヒンジ突然変異である。Ｆ２３５ＡおよびＬ２３６Ａ突然変異は、既に低いヒトＩｇＧ_４アイソタイプのエフェクター機能をさらに減少させる。

ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる、超可変性の領域、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、散在したより保存された領域にさらに細分され得る。それぞれのＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序で配列した、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲは「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と呼ばれ軽鎖の３つのＣＤＲは「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原との特異的な相互作用を形成する残基の大部分を含有する。現在配列描写に用いられる抗体のためのＣＤＲ割当ての３種の体系がある。ＫａｂａｔのＣＤＲ定義（Ｋａｂａｔら、「ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ」、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（１９９１年））は、抗体配列可変性に基づく。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの定義（Ｃｈｏｔｈｉａら、「Ｃａｎｏｎｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｆｏｒｔｈｅｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｓｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１９６、９０１〜９１７（１９８７年）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、「Ｓｔａｎｄａｒｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｃａｎｏｎｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、２７３、９２７〜９４８（１９９７年））は、抗体の３次元構造およびＣＤＲループの位相幾何学に基づく。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ定義は、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２を除いてＫａｂａｔのＣＤＲ定義と一致する。ＮｏｒｔｈのＣＤＲ定義（Ｎｏｒｔｈら、「ＡＮｅｗＣｌｕｓｔｅｒｉｎｇｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＣＤＲＬｏｏｐＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、４０６、２２８〜２５６（２０１１年））は、多数の結晶構造との親和性伝播（ａｆｆｉｎｉｔｙｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）クラスタリングに基づく。

本発明の目的のために、３種の方法の組み合わせがＣＤＲを定義するために用いられる。軽鎖ＣＤＲの場合は、ＮｏｒｔｈのＣＤＲ定義が用いられる。ＨＣＤＲ１の場合は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ定義の混成が用いられる。ＫａｂａｔのＨＣＤＲ１の定義は、重鎖の第１のシステインの後の９番目の残基から始まりかつ典型的には５から７残基の長さである一方で、ＣｈｏｔｈｉａのＨＣＤＲ１の定義は、このシステインの後の４番目の残基から始まりかつ典型的には７から９残基の長さである。本発明の抗体のＨＣＤＲ１は、Ｃｈｏｔｈｉａの開始位置およびＫａｂａｔの終了位置によって定義される。ＨＣＤＲ２の場合は、ＫａｂａｔのＣＤＲ定義が用いられる。ＨＣＤＲ３の場合は、Ｎｏｒｔｈ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ定義の混成が用いられる。ＫａｂａｔのＨＣＤＲ３の定義は、重鎖（本発明の抗体の配列番号２）の残基９９〜１１０を含みかつ典型的にはシステインの後の３つの残基で始まる。ＣｈｏｔｈｉａのＨＣＤＲ３の定義は、Ｋａｂａｔの定義と同じである。ＮｏｒｔｈのＨＣＤＲ３の定義は、重鎖（本発明の抗体の配列番号２）の残基９７〜１１０を含みかつ典型的にはシステイン残基のすぐ後から始まる。本発明の抗体のＨＣＤＲ３は、Ｎｏｒｔｈの開始位置およびＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｎｏｒｔｈの終了位置によって定義される。

ＨＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＨＣＶＲコードＤＮＡを重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト、ならびに他の哺乳動物の、重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において既知である。これらの領域を含むＤＮＡ断片は、例えば、標準のＰＣＲ増幅によって取得され得る。

ＬＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＬＣＶＲコードＤＮＡを軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって完全長軽鎖遺伝子に変換され得る。ヒト、ならびに他の哺乳動物の、軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において既知である。これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準のＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であってよい。

本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に作動可能に連結された後で宿主細胞において発現されるであろう。発現ベクターは、典型的には宿主生物においてエピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質変換されたそれらの細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸還元酵素を含有するであろう。

本発明の抗体は、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３またはＣＯＳ細胞などの哺乳動物の細胞において容易に産生され得る。宿主細胞は、当技術分野において良く知られている技術を用いて培養される。

当該のポリヌクレオチド配列（例えば、抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび発現制御配列）を含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて異なる、よく知られている方法によって宿主細胞内に導入してよい。

タンパク質精製の種々の方法を用いてよくかつこうした方法は、当技術分野において知られており、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８２：８３〜８９（１９９０）およびＳｃｏｐｅｓ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＮＹ（１９９４年）に記述されている。

本発明の別の実施形態において、抗体、またはそれをコードする核酸は、単離された形態で提供される。本明細書で使用する場合、「単離された」と言う語は、細胞環境において見つかる如何なる他の高分子種からも遊離したまたは実質的に遊離したタンパク質、ペプチド、または核酸を指す。本明細書で使用する場合「実質的に遊離した」は、当該のタンパク質、ペプチド、または核酸が、存在する高分子種の（モルベースで）８０％より多く、好ましくは９０％より多く、およびより好ましくは９５％より多くを含むことを意味する。

本発明の抗体、またはそれを含む医薬組成物は、非経口の経路（例えば、皮下および静脈内）によって投与してよい。本発明の抗体は、単回または多回投与で薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に単独で患者に投与してよい。本発明の医薬組成物は、当技術分野においてよく知られている方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ、第１９版（１９９５年）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．）によって調製してよくかつ本明細書に開示されるような、抗体、および１種または複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含んでいてよい。

「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」（または「治療する（ｔｒｅａｔ）」もしくは「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」）という語は、既存の症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を、遅らせる、妨げる、抑える、緩和する、停止する、軽減する、または反転させることを指す。

ヒトＡｎｇ２に関する抗体の親和性に関連して本明細書で使用する場合「結合する」は、そうでないと明示しない限り、本質的に本明細書に述べるような２５℃または３７℃における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーの使用による物を含めた、当技術分野において既知の一般的な方法によって測定されるような約１×１０^−８Ｍ未満、好ましくは、約１×１０^−９Ｍ未満のＫ_Ｄを意味することが意図される。本発明の化合物に関連して本明細書で用いられる「選択的」または「選択性」と言う語は、２５℃または３７℃において表面プラズモン共鳴によって測定されるような、ヒトＡｎｇ１などの標的ファミリーのメンバーを含めた、他のタンパク質に結合する化合物より約１０００倍、５００倍、２００倍、１００倍、５０倍、または約１０倍低いＫ_Ｄで、ヒトＡｎｇ２などの、標的に結合する化合物を指す。加えて、または代わりに、本発明のＡｎｇ２選択的抗体は、本明細書中以下において実施例に記載されている方法によってアッセイした場合ヒトＡｎｇ２に結合するが、ヒトＡｎｇ１には結合しないかまたは最小限しか結合しない。

「有効量」は、研究者、医師または他の臨床医によって求められている組織、器官、動物、哺乳動物またはヒトへの生物学的もしくは医学的反応または所望の治療効果を誘発する本発明の抗体または本発明の抗体を含む医薬組成物の量を意味する。抗体の有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の反応を引き出す抗体の能力などの因子に従って変わり得る。有効量は、治療的に有益な効果が、抗体のいかなる毒性または有害作用にも上回る量でもある。

本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。

実施例１：抗体発現および精製
重鎖および軽鎖の可変領域のポリペプチド、抗体Ａの完全な重鎖および軽鎖アミノ酸配列、およびそれをコードするヌクレオチド配列を、下記で「アミノ酸およびヌクレオチド配列」と題した節において示す。さらに、抗体Ａの軽鎖、重鎖、軽鎖可変領域、および重鎖可変領域に関する配列番号を、表１に示す。

これに限らないが、抗体Ａを含めた、本発明の抗体は、本質的に以下のように作成および精製してよい。適切な宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯは、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比（１：３または１：２など）またはＨＣおよびＬＣの両方をコードする単一ベクター系を用いて抗体を分泌するための発現系で一過的または安定的にトランスフェクトしてよい。その中に抗体が分泌されている、浄化した培地を、多数の一般的に使用される技術のいずれかを用いて精製してよい。例えば、培地は、好都合にはリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）などの、適合した緩衝液で平衡化した、ＦａｂフラグメントのためのＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、またはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用してよい。カラムは、非特異的な結合成分を除去するために洗ってよい。結合した抗体は、例えば、ｐＨ勾配（２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７から１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０、またはリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．４から１００ｍＭのグリシン緩衝液ｐＨ３．０など）によって溶離してよい。抗体画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって、検出してよく、次いでプールしてよい。さらなる精製は、意図する使用に応じて、任意である。抗体は、一般的な技術を用いて濃縮および／または除菌ろ過してよい。可溶性凝集体およびマルチマーは、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモード、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含めた、一般的な技術によって有効に除去してよい。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗体の純度は、９５％より大きい。産生物は、−７０℃で直ちに凍結するかまたは凍結乾燥してよい。

アッセイ
結合キネティクス、親和性、および選択性
ヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）、マウス、ウサギおよびイヌなどの可溶性Ａｎｇ２の複数種に関する結合キネティクス、親和性、および選択性は、当技術分野において既知の方法に従ってＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（ＧＥＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）などの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーの使用によって２５℃または３７℃で本発明の抗体について測定してよい。

ヒトＡｎｇ２は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから購入してよい。抗体の捕捉のためのプロテインＡ表面は、以下の方法を用いて調製してよい。ＣＭ４（Ｂｉａｃｏｒｅ＃ＢＲ−１００５−３４）またはＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ＃ＢＲ−１０００−９９）上の可溶性プロテインＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ：５３９２０２）の固定化は、ＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング法（Ｂｉａｃｏｒｅ＃ＢＲ−１０００−５０）を用いて調製してよい。簡単に言えば、ＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合物を５μｌ／ｍｉｎまたは１０μＬ／ｍｉｎで７分間注入することによって４つ全てのフローセルの表面を活性化してよい。その後、可溶性プロテインＡを、１０ｍＭの酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．５で希釈して、フローセル（Ｆｃ）２、３または４上に５μＬ／ｍｉｎまたは１０μＬ／ｍｉｎの流速で７分間固定化してよい。チップ表面上にまだ残っている未反応部位は、５μＬ／ｍｉｎまたは１０μＬ／ｍｉｎでのエタノールアミンの７分間注入でブロックしてよい。ランニング緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ＃ＢＲ−１００６−６９）であってよい。抗体試料は、ランニング緩衝液への希釈によって１μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬで調製してよい。２００ｎＭから３．１ｎＭにわたるＡｎｇ２リガンドの不連続な濃度は、ランニング緩衝液への２倍の段階希釈を用いて調製してよい。それぞれの分析サイクルは、一連の５つの別々のステップ、（１）別個のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３、およびＦｃ４）上への抗体の捕捉、（２）全てのＦｃ上で５０μＬ／ｍｉｎで２５０μＬ（表面接触時間３００秒）の不連続な濃度のＡｎｇ２の（ｋｉｎｊｅｃｔを用いる）注入、（３）解離相を観測するために２０分間の緩衝液流への戻し、（４）１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の１０μＬ（表面接触時間３０秒）注入でチップ表面の再生、（５）ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニング緩衝液の１５μＬ（表面接触時間４５秒）注入でチップ表面の平衡化、からなっていてよい。結果として得られるデータは、標準的な二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）を用いて処理してＢｉａｃｏｒｅ２０００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン４．１を用いて１：１結合モデルに適合させ、会合速度（ｋ_ｏｎ、Ｍ^−１ｓ^−１単位）、解離速度（ｋ_ｏｆｆ、ｓ^−１単位）を決定してよい。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の計算は、以下の関係、Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎから計算してよく、かつモル単位で示される。

Ｈ１Ｈ６８５Ｐ−２９３ＨＥＫは、ＨＣＶＲ配列（国際公開第２０１１０１４４６９号の配列番号１８）およびＬＣＶＲ配列（国際公開第２０１１０１４４６９号の配列番号２０）を利用する２９３ＨＥＫ細胞において発現されたヒトＩｇＧ１Ａｎｇ２抗体である。３．１９．３−２９３ＨＥＫは、Ａｎｇ２に結合しかつ３．１９．３ＨＣＶＲ配列（国際公開第２００９０９７３２５号の配列番号２）およびＭＥＤＩ１ＬＣＶＲ配列（国際公開第２００９０９７３２５号の配列番号３）を利用する２９３ＨＥＫ細胞において発現されたヒトＩｇＧ１抗体である。

本質的に本アッセイに記載のように実施された実験において、抗体Ａは、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ−２９３ＨＥＫおよび３．１９．３−２９３ＨＥＫよりもそれぞれ、約４倍および８倍低いＫ_ＤでヒトＡｎｇ２に結合する（表２）。

本質的に本アッセイに記載のように実施された実験において、抗体Ａは、ヒト、カニクイザル、マウス、ウサギおよびイヌＡｎｇ２にそれぞれ、８０、１０７、１０９、２１０および１４０ｐＭの親和性で結合する（表３）。

Ｋｉｎｅｘａでの親和性測定
ＫｉｎＥｘＡ３２００解析装置（ＳａｐｉｄｙｎｅＩｎｓｔ．Ｉｎｃ．）を用いて結合キネティクスを測定してよい。簡単に言えば、ヒトＡｎｇ２は、セファロースビーズに共有結合する場合がありかつ遊離Ｍａｂのビーズへの結合がＫｉｎＥｘＡ３２００上で検出され得る。Ｋ_Ｄを測定するために、段階的に減少して希釈したヒトＡｎｇ２と共にＭａｂ（１ｐＭ、２ｐＭ、または５ｐＭ）を含有する個々の試験管を、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ中で２５℃で数日間インキュベーションしてよい。インキュベーション後、それぞれ平衡した試料における遊離Ｍａｂを測定してよい。Ｋ_ｄ値は、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアでＮ曲線分析を用いて決定してよい。

本質的に本アッセイに記載のように実施された実験において、抗体Ａは、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ−２９３ＨＥＫよりも約８倍低いＫ_ＤでヒトＡｎｇ２に結合する（表４）。

抗体Ａは、固相ＥＬＩＳＡアッセイによってヒトＡｎｇ２のヒトＴｉｅ２への相互作用を阻害する
本発明の抗体によるヒトＡｎｇ２のその受容体ヒトＴｉｅ２への結合のブロックは、固相のｉｎｖｉｔｒｏでのＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定してよい。

アッセイのために、高結合９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃２５９２）を、４μｇ／ｍｌ（１００μｌ中）の組換えヒトＴｉｅ２−Ｆｃ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ＃３１３−ＴＩ）で、室温で一晩コーティングしてよい。プレートを、ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水）で３回洗ってよく次いで３００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳ）（ＢＳＡ：ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃００１−０００−１６２、ＩｇＧ非含有、プロテアーゼ非含有）でオービタルシェーカー上で室温で１〜２時間ブロックしてよい。ブロッキングステップ中、別個のポリプロピレンマルチウェルプレートにおいて、７５μｌの２×試験抗体（ブロッキング緩衝液で段階的に希釈した１：３）に、７５μｌの２×ビオチン化ヒトＡｎｇ２（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ＃ＢＴ６２３）（やはりブロッキング緩衝液で希釈）を加えてよい。抗体／ビオチン化Ａｎｇ２混合物を、次いで３７℃で１時間インキュベーションしてよい（最終ビオチン化Ａｎｇ２濃度は１００ｎｇ／ｍｌであった）。ブロッキング溶液を、Ｔｉｅ２−ＦｃコーティングしたＥＬＩＳＡプレートから除去してよく、その後ウェル当り５０μｌの抗体／ビオチン化Ａｎｇ２混合物を（複製のウェルにおいて）加えてよい。次いでプレートを、オービタルシェーカー上で、プレートシーラーで覆って、室温で２時間インキュベーションしてよい。次いでプレートを３回洗ってよく、その後ウェル当り１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ＃ＤＹ９９８、ブロッキング緩衝液で１：２００希釈してよい）を加えてよい。次いでプレートを、オービタルシェーカー上で、プレートシーラーで覆って、室温で４５分間インキュベーションしてよい。次いでプレートを、再び３回洗ってよい。

次いでプレートを、ウェル当り１００μｌのＯｎｅＣｏｍｐｏｎｅｎｔＴＭＢ基質（室温に温めてよい）（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸＬａｂｓ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）を加えることにより構築してよい。構築は、室温で１０分間進行させてよい（プレートをアルミニウム箔で覆ってよい）。構築は、ウェル当り１００μｌの酸性停止液（ＴＭＢ停止液、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸＬａｂｓ＃ＬＳＴＰ−１０００−０１）で停止してよい。プレートは、オービタルシェーカー上で混合してよくその後それらを、ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ５．４．１ソフトウェア（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐ．）を用いて、ＥＬＩＳＡリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０）上で４５０ｎｍで読み取ってよい。Ａ４５０値は、Ｔｉｅ−２−Ｆｃに結合したままのビオチン化Ａｎｇ２の量を反映する。Ａ４５０値の減少は、Ｔｉｅ−２−Ｆｃに結合しているビオチン化Ａｎｇ２のブロッキングを反映した。

Ｔｉｅ−２に結合しているＡｎｇ２の阻害に関するＩＣ５０値は、対数変換したＸ値を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６で計算してよい。非線形回帰（曲線適合）解析（シグモイド型用量反応、可変傾斜）を、対数変換したｘデータ上で実行してＩＣ５０値を得てよい。実験を２回以上実施する場合、実験間の幾何平均ＩＣ５０値（および９５％信頼区間）を計算してよい。

本質的に本アッセイに記載のように実施された実験において、抗体Ａは、用量依存的方法でＴｉｅ−２へのＡｎｇ２の結合を特異的にブロックし、０．０２７ｎＭ（９５％信頼区間０．０００８９〜０．８０２９ｎＭ）の幾何平均ＩＣ５０値（ｎ＝２）を結果として生じた。抗体ＡおよびＨ１Ｈ６８５Ｐ−２９３ＨＥＫは、同等な中和ＩＣ５０値を有した。

Ａｎｇ２誘発性のＴｉｅ−２のリン酸化の中和であるがＡｎｇ１媒介性のリン酸化ではない。
本発明の抗体によるｉｎｖｉｔｒｏでのヒトＴｉｅ−２の細胞ベースの阻害は、Ａｎｇ１およびＡｎｇ２が結合して用量依存的方法でヒトＴｉｅ−２リン酸化を誘導する細胞アッセイにおいて測定してよい。ｉｎｖｉｔｒｏでの細胞アッセイを、用量依存的方法においてＡｎｇ２を選択的中和するがＴｉｅ−２受容体のＡｎｇ１媒介リン酸化は中和しない抗体Ａの能力を評価するために用いてよい。Ａｎｇ２抗体、Ａｎｇ１／２交差反応性の抗体、および対照ヒトＩｇＧ_４ＰＡＡアイソタイプ抗体が、それぞれ陽性および陰性対照として含まれていてよい。

ＣＨＯ−Ｔｉｅ−２細胞株は、完全長ヒトＴｉｅ−２受容体（Ｃ末端における３ＸＦＬＡＧタグを有する）の安定的トランスフェクションによって生成してよい。ＣＨＯ−Ｔｉｅ−２細胞は、ＨａｍｓＦ−１２（ＣｅｌｌＧｒｏ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ＃１０−０８０−ＣＶ）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１００８２−１４７）、１Ｘ抗生物質−抗真菌剤（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１５２４０−０６２）、１．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＣｏｒｎｉｎｇＣｅｌｌｇｒｏ＃３０−２３４−ＣＩ）、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃５４０４１１）、および０．０７８％炭酸水素ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＨｙｃｌｏｎｅ＃ＳＨ３００３３．０１）の完全培地において維持してよい。

アッセイのために、ＣＨＯ−Ｔｉｅ−２細胞を、ポリ−リジンコーティングした９６−ウェルプレート（ＢＤＢｉｏｃｏａｔ＃３５６６４０）の内側の６０ウェル内に、（１００μｌの成長培地中で）ウェル当り１０，０００細胞に再懸濁させてよい。２００μｌのＤ−ＰＢＳを、蒸発を低減するために周辺部ウェル内に入れてよい。細胞を、３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ_２で一晩インキュベーションしてよい。翌日、細胞を１回洗ってよく培地を０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ７９７９、低エンドトキシン）を含有する１００μｌの無血清成長培地で置換してよい。次いで細胞を、無血清培地内で３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ_２で７．５から２４時間飢餓にさせてよい。飢餓期間中、抗体（６×最終濃度）を、０．１％ＢＳＡを含有する無血清成長培地でポリプロピレンプレートにおいて１：２で段階的に希釈してよい。ヒトＡｎｇ２（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ＃６２３−ＡＮ、Ｄ−ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で再構成）およびヒトＡｎｇ１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ＃９２３−ＡＮ、Ｄ−ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で再構成）も、６×最終濃度まで０．１％ＢＳＡを含有する無血清成長培地で希釈してよい。抗体およびＡｎｇ２またはＡｎｇ１リガンドを、次いでポリプロピレンプレートにおいて１：１比で混合してよく３７℃で１時間インキュベーションしてよい。抗体／リガンド混合物を、次いでウェル当り５０μｌで細胞に加えてよく（１処置当り３重のウェル）３７℃、９５％ＲＨ、５％ＣＯ_２で１３分間から２１時間インキュベーションしてよい。抗体の最終濃度範囲は、０．０６２５〜２８３ｎＭであってよく、かつヒトＡｎｇ２およびＡｎｇ１の最終濃度は、それぞれ、０．３μｇ／ｍｌ（約６ｎＭ）および０．５μｇ／ｍｌ（約８．９ｎＭ）であってよい。インキュベーション時間後、培地を素早くかつ完全に細胞から除去してよく、かつ新しく追加されたプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（１×プロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｓｉｇｍａ＃Ｐ８３４０、１×ホスファターゼ阻害剤カクテル２、Ｓｉｇｍａ＃Ｐ５７２６、１×ホスファターゼ阻害剤カクテル３、Ｓｉｇｍａ＃Ｐ００４４、１ｍＭ最終活性化オルトバナジウム酸ナトリウム（ＥＭＤＣｈｅｍｉｃａｌｓ＃５６７５４０））を含有していてよいウェル当り６０μｌの１×冷Ｔｒｉｓ溶解緩衝液（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ＃Ｒ６０ＴＸ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に細胞を溶解してよい。次いでプレートを、氷上に１０分間置いてよく、その後それらを低速で４℃で２５分間オービタルシェーカー上に置いてよい。次いでプレートを、密封して−８０℃で凍結してよい。

ホスホ−Ｔｉｅ−２（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓのヒトホスホ−Ｔｉｅ−２ＤｕｏＳｅｔＥＬＩＳＡキット、＃ＤＹＣ２７２０で）の分析の前日、高結合ＥＬＩＳＡプレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏＯｎｅ、＃６５５０８１）を、１×ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸＬａｂｓ＃ＣＯＡＴ−１０００−０１）中４μｇ／ｍｌのマウス抗−ヒトトータルＴｉｅ−２捕捉抗体で４℃で一晩コーティングしてよい。

ホスホ−Ｔｉｅ−２測定の日、溶解産物を含有するプレートを、氷上で融解してよい。コーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１×ＴＢＳＴ）で洗ってオービタルシェーカー上で（プレートシーラーで覆いながら）室温で最低限１時間ウェル当り３００μｌのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃００１−０００−１６２、ＩｇＧ非含有、プロテアーゼ非含有）、０．０１％アジ化ナトリウム）でブロックしてよい。ブロッキング中、溶解産物を、ポリプロピレンプレートにおいてプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する冷溶解緩衝液で１：５または１：１０希釈してよい。ＥＬＩＳＡプレートを、ブロックして４回洗ってよく、ウェル当り１００μｌの希釈した溶解産物（またはホスホ−Ｔｉｅ−２ＥＬＩＳＡ標準）を加えてシーラーで覆って、オービタルシェーカー上で室温で２時間インキュベーションしてよい。プレートを、４回洗ってよくかつウェル当り１００μｌのＨＲＰ複合化マウス抗−ホスホチロシン（推奨されるようにバイアル上で、ＴＢＳＴ／０．１％ＢＳＡで希釈）を加えてよい。プレートを、次いでシーラーで覆い、オービタルシェーカー上で室温で２時間インキュベーションしてよい。プレートを、次いで６回洗ってよくかつウェルからの液体の除去を徹底させてよい。次いでプレートを、ウェル当り１００μｌのＯｎｅＣｏｍｐｏｎｅｎｔＴＭＢ基質（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸＬａｂｓ＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）を加えることにより構築してよい。プレートを、アルミニウム箔で覆って室温で２０または３０分間構築させてよい。構築は、ウェル当り１００μｌの酸性停止液（ＴＭＢ停止液、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸＬａｂｓ＃ＬＳＴＰ−１０００−０１）で停止してよい。プレートを、次いでオービタルシェーカー上で混合してよい。ＥＬＩＳＡプレートを、ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ５．４．１ソフトウェア（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐ．）を用いて、ＥＬＩＳＡリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０）上で４５０ｎｍで読み取ってよい。試料のホスホ−Ｔｉｅ−２値は、標準曲線（４パラメータロジスティック適合）から得て、５または１０の希釈係数を掛けてよい。阻害パーセントは、以下の式によって計算してよい：（Ａｎｇ２単独処置の処置平均ｐＴｉｅ２値のｐＴｉｅ２値）／（平均培地単独ｐＴｉｅ２値−Ａｎｇ２単独処置の平均ｐＴｉｅ２値）＊１００。

Ａｎｇ２誘導性ホスホ−Ｔｉｅ−２の阻害についてのＩＣ５０値は、対数変換したＸ値を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４で計算してよい。非線形回帰（曲線適合）解析（シグモイド型用量反応、可変傾斜）を、対数変換したｘデータ上で実行してＩＣ_５０値を得てよい。実験を２回以上実施した場合、実験間の幾何平均ＩＣ_５０値（および９５％信頼区間）を計算してよい。

本質的に本アッセイに記載のように実施された実験において、抗体Ａは、ＣＨＯ−Ｔｉｅ−２細胞におけるヒトＡｎｇ２誘導性ホスホ−Ｔｉｅ−２を０．７７３ｎＭのＩＣ５０（９５％信頼区間０．４１２〜１．４５ｎＭ）（ｎ＝３）で用量依存的に中和した。さらには、抗体Ａは、抗−Ａｎｇ１／２交差反応性抗体３．１９．３−２９３ＨＥＫと比較した場合にＣＨＯ−Ｔｉｅ−２細胞におけるヒトＡｎｇ１誘導性ホスホ−Ｔｉｅ−２を中和しなかった。抗体ＡおよびＨ１Ｈ６８５Ｐ−２９３ＨＥＫは、同等なＡｎｇ２中和ＩＣ５０値を有した。

Ａｎｇ２誘導性血管構築の抑制
Ａｎｇ２抗体によるｉｎｖｉｖｏでの生理学的血管新生の抑制を、マウス網膜における血管構築のモデルにおいて測定してよい。前述のアッセイを、マウス網膜における生理学的血管新生を抑制する本発明の抗体の能力を調査するために用いてよい。

本アッセイのために、妊娠した雌がマウスの子を産んだ日をＰ０（出生後日数０）と記録してよい。出産後、２日および４日（Ｐ２およびＰ４）で子に、ビヒクル対照（ＰＢＳ）または１０ｍｇ／ｋｇの抗体Ａを注射してよい。Ｐ５でマウスを、と殺してよく目を採取してよくホルマリン中で５時間固定してよくＰＢＳで洗ってよい。

次いで網膜を、切開してよく、１：２００で希釈した抗−ＣＤ３１（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃｌｏｎｅＭＥＣ１３．３、カタログ５５３３７０）、および１：２００で希釈した抗−ＳＭＡ−ＦＴＩＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｃｌｏｎｅ１Ａ４カタログＦ３７７７）で染色してよい。抗−ＣＤ３１処理した網膜のために１：４００で希釈した抗−ＲａｔＡｌｅｘａ−６４７（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ７１２−６０６−１５３）を、二次抗体として用いてよい。網膜の取得は、ＮｉｋｏｎＴｉを用いて行ってよく、かつ血管進行、出芽している端細胞の数、および再形成集網叢の血管密度の定量化は、ＦＩＪＩソフトウェアを用いて実施してよい。高倍率画像は、共焦点ＮｉｋｏｎＡ１を用いて取得しよい。

本質的に本アッセイに記載のように実施された実験において、抗体Ａは、ＰＢＳ対照群と比較した場合に３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇにおいて同様に血管進行が抑制され、内皮細端細胞の数および血管密度が共に減少し、ならびに周皮細胞到達範囲が増加した。本データは、ＰＢＳ対照群と比較した場合全ての処置群についてｐ＜０．０００１で統計的に有意であった（表５）。

ＰＣ３前立腺がん異種移植モデルにおける抗体ＡのＩｎＶｉｖｏでの抗血管新生効果
Ａｎｇ２抗体およびＶＥＧＦＲ２抗体と併用したＡｎｇ２抗体の抗血管新生効果を、ＰＣ３前立腺がん異種移植モデルにおいて評価してよい。

マウス１０匹／群で無作為化した、体積約２５０ｍｍ^３のＰＣ３異種移植腫瘍を担持するマウスを、対照ＩｇＧ１、ＤＣ１０１（抗−ＶＥＧＦＲ２マウス抗体）、抗体Ａ、ＤＣ１０１＋抗体Ａで６日間処置してよい（２ＱＷ、２０ｍｇ／ｋｇ）。６日間後、腫瘍を収集し、固定化して解体してよい。解体した腫瘍を、ＣＤ１０５のために染色して総血管領域を決定してよい。

本質的に記載の通りに実施された実験において、総血管領域は、対照ＩｇＧ１群と比較した場合、ＤＣ１０１処置群において６５％減少し、抗体Ａ処置群において６９％減少し、および併用処置群において８４％減少した。ＩｇＧ１対照群と比較した場合、これらの結果は、全ての処置群についてｐ＜０．０００１で統計的に有意であった。

抗体Ａおよび抗−ＶＥＧＦＲ２抗体はｉｎｖｉｖｏで腫瘍成長を阻害する
本発明の抗体の有効性は、ｉｎｖｉｖｏでの異種移植モデルによって測定してよい。ＤＣ１０１（抗−ＶＥＧＦＲ２マウス抗体）、抗体Ａおよびその併用の抗腫瘍有効性は、皮下トリプルネガティブ患者由来乳がんモデル（ＥＬ１９９７）および皮下卵巣異種移植モデル（ＳＫＯＶ３ｘ．１）において評価してよい。担腫瘍マウスを、週２回の頻度で腹腔内注射によって、ＰＢＳで希釈した抗体で処置してよい。腫瘍成長は、処置の過程中に週２回の腫瘍体積の三次元キャリパー測定によって判定してよい。

ＥＬ１９９７トリプルネガティブ乳がん患者由来の異種移植：ｎ＝マウス７匹／群で無作為化した約３５０ｍｍ^３の体積でＥＬ１９９７トリプルネガティブ乳がん患者由来の異種移植片（ＴＮＢＣＰＤＸ）を担持する免疫不全マウスを、ビヒクル対照、２０ｍｇ／ｋｇでＤＣ１０１単剤療法、２０ｍｇ／ｋｇで抗体Ａ単剤療法、それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでシクロホスファミドおよびドキソルビシン併用、それぞれの単剤療法濃度で投薬されるＤＣ１０１および抗体Ａ併用またはシクロホスファミド、ドキソルビシン、ＤＣ１０１および抗体Ａ併用で処置してよい。処置は、連続した４週間で週に２回投与してよい。

本質的に記載の通りに実施された実験において、ＤＣ１０１および抗体Ａ単剤療法処置群は、それぞれ、３５．２％および５６．７％のＴ／Ｃ％（腫瘍体積における変化）を示した。２種の抗体、ＤＣ１０１および抗体Ａの併用は、１９．９％のＴ／Ｃ％をもたらした。さらに、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ＤＣ１０１および抗体Ａの併用は、ＤＣ１０１および抗体Ａの併用と比較した場合に統計的に有意な（ｐ＝０．００１９）腫瘍体積の減少を伴って、０．４％のＴ／Ｃ％をもたらした。化学療法剤単独、シクロホスファミドおよびドキソルビシンの併用処置は、３２％の％ＴＣをもたらした。これらの結果は、ＤＣ１０１または抗体Ａでの単剤療法処置は、有効であり、かつ併用においてはより大きな有効性の可能性を有し、これは化学療法剤の追加でさらに強化されることを示す。

ＳＫＯＶ３ｘ．１卵巣異種移植：ｎ＝マウス１０匹／群で無作為化した、体積約３５０ｍｍ^３でＳＫＯＶ３ｘ．１卵巣異種移植片を担持する免疫不全マウスを、ビヒクル対照、３、１０または３０ｍｇ／ｋｇで抗体Ａ単剤療法、２５ｍｇ／ｋｇでパクリタキセル単剤療法またはそれぞれ２５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでパクリタキセルおよび抗体Ａの併用で処置してよい。処置は、週に２回で４週間投与してよい。

本質的に記載の通りに実施された実験において、結果は、それぞれ抗体Ａの用量３、１０および３０ｍｇ／ｋｇについて３９．１、３２．５および２７．３のＴ／Ｃ％値ならびに対照と比較して＜０．００１のｐ値で２５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル単剤療法について２０．３のＴ／Ｃ％を示した。２５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルおよび１０ｍｇ／ｋｇの抗体Ａの併用は、ビヒクル対照群と比較した場合に７．１％のＴ／Ｃ％を示して、２種の単剤療法の有効性を強化した。

ＳＫＯＶ３ｘ．１卵巣異種移植：ｎ＝マウス１０匹／群で無作為化した、体積約２５０ｍｍ^３でＳＫＯＶ３ｘ．１卵巣異種移植片を担持する免疫不全マウスを、ビヒクル対照、２０ｍｇ／ｋｇでＤＣ１０１単剤療法、２５ｍｇ／ｋｇでパクリタキセル単剤療法、それぞれ２５ｍｇ／ｋｇでＤＣ１０１および抗体Ａ併用、またはそれぞれの単剤療法濃度で投薬されるパクリタキセル、ＤＣ１０１および抗体Ａ併用で処置してよい。処置は、週に２回で４週間投与してよい。

本質的に記載の通りに実施された実験において、ＤＣ１０１の単剤療法処置は、９．６％のＴ／Ｃ％をもたらした一方で、２種の抗体、ＤＣ１０１および抗体Ａの併用は、ビヒクル対照群と比較した場合に０．１％の改善されたＴ／Ｃ％をもたらした。パクリタキセル、ＤＣ１０１および抗体Ａの併用は、パクリタキセル単剤療法について１７．８％のＴ／Ｃ％と比較して約−３３％の腫瘍退縮をもたらした。これらの結果は、異種移植モデルにおいてＤＣ１０１でのＶＥＧＦＲ２阻害が、抗体Ａと併用してより大きい有効性の可能性を有することを示す。この併用の利益は、統計的に有意な腫瘍体積における退縮に繋がる化学療法剤の追加でさらに強化される。

アミノ酸およびヌクレオチド配列
配列番号１（抗体ＡのＨＣＶＲ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

配列番号２（抗体ＡのＨＣ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ

配列番号３（抗体ＡのＬＣＶＲ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＹＳＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号４（抗体ＡのＬＣ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱＹＳＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

配列番号５（抗体ＡのＬＣのＤＮＡ）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＣＴＣＣＴＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ

配列番号６（抗体ＡのＨＣのＤＮＡ）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＡＴＡＧＧＴＡＣＧＡＣＧＴＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ

配列番号７（ヒトＡｎｇ２）
ＹＮＮＦＲＫＳＭＤＳＩＧＫＫＱＹＱＶＱＨＧＳＣＳＹＴＦＬＬＰＥＭＤＮＣＲＳＳＳＳＰＹＶＳＮＡＶＱＲＤＡＰＬＥＹＤＤＳＶＱＲＬＱＶＬＥＮＩＭＥＮＮＴＱＷＬＭＫＬＥＮＹＩＱＤＮＭＫＫＥＭＶＥＩＱＱＮＡＶＱＮＱＴＡＶＭＩＥＩＧＴＮＬＬＮＱＴＡＥＱＴＲＫＬＴＤＶＥＡＱＶＬＮＱＴＴＲＬＥＬＱＬＬＥＨＳＬＳＴＮＫＬＥＫＱＩＬＤＱＴＳＥＩＮＫＬＱＤＫＮＳＦＬＥＫＫＶＬＡＭＥＤＫＨＩＩＱＬＱＳＩＫＥＥＫＤＱＬＱＶＬＶＳＫＱＮＳＩＩＥＥＬＥＫＫＩＶＴＡＴＶＮＮＳＶＬＱＫＱＱＨＤＬＭＥＴＶＮＮＬＬＴＭＭＳＴＳＮＳＡＫＤＰＴＶＡＫＥＥＱＩＳＦＲＤＣＡＥＶＦＫＳＧＨＴＴＮＧＩＹＴＬＴＦＰＮＳＴＥＥＩＫＡＹＣＤＭＥＡＧＧＧＧＷＴＩＩＱＲＲＥＤＧＳＶＤＦＱＲＴＷＫＥＹＫＶＧＦＧＮＰＳＧＥＹＷＬＧＮＥＦＶＳＱＬＴＮＱＱＲＹＶＬＫＩＨＬＫＤＷＥＧＮＥＡＹＳＬＹＥＨＦＹＬＳＳＥＥＬＮＹＲＩＨＬＫＧＬＴＧＴＡＧＫＩＳＳＩＳＱＰＧＮＤＦＳＴＫＤＧＤＮＤＫＣＩＣＫＣＳＱＭＬＴＧＧＷＷＦＤＡＣＧＰＳＮＬＮＧＭＹＹＰＱＲＱＮＴＮＫＦＮＧＩＫＷＹＹＷＫＧＳＧＹＳＬＫＡＴＴＭＭＩＲＰＡＤＦ

配列番号８（抗体ＡのＬＣＤＲ１）
ＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡ

配列番号９（抗体ＡのＬＣＤＲ２）
ＹＷＡＳＴＲＤＴ

配列番号１０（抗体ＡのＬＣＤＲ３）
ＨＱＹＳＳＹＰＰＴ

配列番号１１（抗体ＡのＨＣＤＲ１）
ＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶ

配列番号１２（抗体ＡのＨＣＤＲ２）
ＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧ

配列番号１３（抗体ＡのＨＣＤＲ３）
ＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶ

［１］
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトＡｎｇ２（配列番号７）に結合する抗体であって、前記軽鎖が、それぞれ、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡ（配列番号８）、ＹＷＡＳＴＲＤＴ（配列番号９）、およびＨＱＹＳＳＹＰＰＴ（配列番号１０）からなる軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ前記重鎖が、それぞれ、アミノ酸配列ＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶ（配列番号１１）、ＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶ（配列番号１３）からなる重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む、抗体。
［２］
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、抗体であって、前記軽鎖が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含みかつ前記重鎖が、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号３において与えられるアミノ酸配列を有し、かつ前記ＨＣＶＲが、配列番号１において与えられるアミノ酸配列を有する、抗体。
［３］
前記ＬＣが、配列番号４において与えられるアミノ酸配列を有し、かつ前記ＨＣが、配列番号２において与えられるアミノ酸配列を有する、前記［１］または［２］のいずれか一つに記載の抗体。
［４］
それぞれの軽鎖が、配列番号４において与えられるアミノ酸配列を有し、かつそれぞれの重鎖が、配列番号２において与えられるアミノ酸配列を有する、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む、前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の抗体。
［５］
前記重鎖のうちの１つが、前記軽鎖のうちの１つと鎖間ジスルフィド結合を形成し、かつ他方の重鎖が、他方の軽鎖と鎖間ジスルフィド結合を形成し、かつ前記重鎖のうちの１つが、他方の重鎖と２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する、前記［１］〜［４］のいずれか一つに記載の抗体。
［６］
前記抗体が、グリコシル化されている、前記［１］〜［５］のいずれか一つに記載の抗体。
［７］
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
［８］
配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体を産生するためのプロセスであって、前記抗体が発現されるような条件下で前記［７］に記載の哺乳動物細胞を培養するステップ、および前記発現された抗体を回収するステップを含む、プロセス。
［９］
前記［８］に記載のプロセスによって産生される抗体。
［１０］
前記［１］〜［６］または［９］のいずれか一つに記載の抗体、および許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
［１１］
有効量の前記［１］〜［６］または［９］のいずれか一つに記載の抗体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、がんを治療する方法。
［１２］
前記がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、大腸がん、または肝細胞がんである、前記［１１］に記載の方法。
［１３］
有効量のラムシルマブを同時に、別々に、または連続的に投与するステップをさらに含む、前記［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］
療法における使用のための、前記［１］〜［６］または［９］のいずれか一つに記載の抗体。
［１５］
前記がんの治療における使用のための、前記［１］〜［６］または［９］のいずれか一つに記載の抗体。
［１６］
前記がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、大腸がん、または肝細胞がんである、前記［１５］に記載の使用のための抗体。
［１７］
前記がんの治療における使用のための、ラムシルマブとの同時、別々、または連続した併用における前記［１］〜［６］または［９］のいずれか一つに記載の抗体。
［１８］
前記がんが、乳がん、卵巣がん、胃がん、大腸がん、または肝細胞がんである、前記［１７］に記載の使用のための併用。

Claims

軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトＡｎｇ２（配列番号７）に結合する抗体であって、前記軽鎖が、それぞれ、アミノ酸配列ＫＡＳＱＤＶＹＩＡＶＡ（配列番号８）、ＹＷＡＳＴＲＤＴ（配列番号９）、およびＨＱＹＳＳＹＰＰＴ（配列番号１０）からなる軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、かつ前記重鎖が、それぞれ、アミノ酸配列ＧＹＳＦＴＤＹＮＭＶ（配列番号１１）、ＹＩＤＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＥＧ（配列番号１２）、およびＡＲＴＲＤＲＹＤＶＷＹＦＤＶ（配列番号１３）からなる重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む、抗体。
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、抗体であって、前記軽鎖が、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含みかつ前記重鎖が、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号３において与えられるアミノ酸配列を有し、かつ前記ＨＣＶＲが、配列番号１において与えられるアミノ酸配列を有する、抗体。
前記ＬＣが、配列番号４において与えられるアミノ酸配列を有し、かつ前記ＨＣが、配列番号２において与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１または２のいずれか一項に記載の抗体。
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体を産生するためのプロセスであって、前記抗体が発現されるような条件下で請求項４に記載の哺乳動物細胞を培養するステップ、および前記発現された抗体を回収するステップを含む、プロセス。