JP5922646B2

JP5922646B2 - コーンルートワーム（ジアブロティカ種（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａｓｐｐ．））に関する抵抗性の発生を予防するためのＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ及びＣｒｙ３Ｂａタンパク質を含む組み合わせ

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Publication number: JP5922646B2
Application number: JP2013506332A
Authority: JP
Inventors: ナルバ，ケネス，イー．; ミード，トーマス; フェンシル，クリスティン，ジェイ．; リ，ヒュアロング; ヘイ，ティモシー，ディー．; ウッズレイ，アーロン，ティー．; オルソン，モニカ，ブリット
Original assignee: ダウアグロサイエンシィズエルエルシー
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-22
Publication date: 2016-05-24
Anticipated expiration: 2031-04-22
Also published as: US20130167268A1; RU2012149849A; AR081136A1; NZ603555A; CN102946716A; KR20130051952A; EP2560477B1; RU2576005C2; ES2665514T3; CN102946716B; EP2560477A1; BR112012027218A2; EP3366118A1; KR101842725B1; KR20130089146A; US9796983B2; RU2591519C2; AU2011242579B2; CA2796730A1; BR112012027140A2

Description

人間は食物及びエネルギー用にトウモロコシを育てる。トウモロコシは、重要な作物である。トウモロコシは、世界の多くの地域において食物、食品及び動物の餌の重要な源である。昆虫は、植物を食べて損害を与え、その結果、これらの人間の努力を台無しにする。害虫を防除するために毎年何十億ドルもが費やされ、害虫が与える損害のためにさらに何十億もが失われる。

化学的殺有害生物剤などの防護手段の使用にもかかわらず、害虫によって引き起こされる損害は、世界のトウモロコシ作物の損失の大きな要因である。これに照らして、虫害を防除するために及び従来の化学的殺有害生物剤の必要を低減するために、遺伝子工学によってトウモロコシなどの作物に害虫抵抗性を持たせている。

１，０００万エーカーを超える米国トウモロコシに、毎年、コーンルートワーム種の複合種がはびこっている。コーンルートワーム種の複合種としては、ノーザンコーンルートワーム（ジアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａｂａｒｂｅｒｉ））、サザンコーンルートワーム（Ｄ．ウンデシムプンクタタ・ホワルディ（Ｄ．ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａｈｏｗａｒｄｉ））及びウエスタンコーンルートワーム（Ｄ．ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａｖｉｒｇｉｆｅｒａ））が挙げられる。（他の種としては、ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａｖｉｒｇｉｆｅｒａｚｅａｅ）（メキシココーンルートワーム）、ジアブロティカ・バルテアタ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａｂａｌｔｅａｔａ）（ブラジルコーンルートワーム）、及びブラジルコーンルートワーム複合種（ジアブロティカ・ヴィリデュラ及びジジアブロティカ・スペシオーサ）が挙げられる）。）

これらのジアブロティカ種の土壌生息幼虫は、トウモロコシ植物の根を餌にし、その結果、倒伏を引き起こす。倒伏は、結局、トウモロコシ収穫量を低減させ、多くの場合、植物を枯死させる結果となる。トウモロコシの毛を餌にすることにより、それらの成虫甲虫は受粉を低減させ、従って、植物あたりのトウモロコシの収穫量に有害な影響を及ぼす。加えて、ジアブロティカ属の成虫及び幼虫は、ウリ科作物（キュウリ、メロン、カボチャなど）並びに商業生産されている多くの野菜及び農作物、並びに家の庭で栽培されるものを襲う。

合成有機化学殺虫剤が、害虫を防除するために使用される主なツールとなっているが、一部の地域では生物殺虫剤、例えば、バシラス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）に由来する殺虫タンパク質、が重要な役割を果たしている。Ｂｔ殺虫タンパク質遺伝子での形質転換により害虫抵抗性植物を生産できるようになって、近代農業に革命が起こり、殺虫タンパク質及びそれらの遺伝子の重要性及び価値が高まった。

バシラス・スリンジエンシス（Ｂ．ｔ．）の一部の菌株からの殺虫結晶タンパク質は、当分野において周知である。例えば、Hofte et al., Microbial Reviews, Vol.53, No.2, pp.242-255 (1989)を参照のこと。これらのタンパク質は、典型的には、前記細菌によっておおよそ１３０ｋＤａのプロトキシンとして生産され、その後、昆虫による摂食後に該昆虫の中腸においてプロテアーゼによって切断されて、おおよそ６０ｋＤａのコア毒素をもたらす。Ｂ．ｔ．の一部の菌株における花粉で異質の結晶性封入体を観察できるので、これらのタンパク質は、結晶タンパク質として公知である。これらの結晶性封入体は、多くの場合、幾つかの異質のタンパク質から構成される。

トランスジェニック害虫抵抗性作物の生産に利用されている遺伝子の１つの群は、バシラス・スリンジエンシス（Ｂ．ｔ．）からのデルタ−エンドトキシンである。デルタ−エンドドキシンは、トウモロコシばかりでなく、ワタ、ジャガイモ、イネ、ヒマワリなどの作物植物での発現に成功しており、害虫に対する優れた防除を提供することが証明されている。(Perlak, F. J et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943;Perlak, F. J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155;Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1101-1104;PCT publication number WO 01/13731;及びBing J W et al. (2000) Efficacy of Cry1F Transgenic Maize, 14^th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, Colo)。

今日までに、幾つかのＢｔタンパク質を使用して害虫抵抗性トランスジェニック植物が作り出されており、該植物は、登録及び商品化に成功している。これらとしては、トウモロコシにおけるＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ３Ａａ及びＣｒｙ３Ｂｂ、ワタにおけるＣｒｙ１Ａｃ及びＣｒｙ２Ａｂ、並びにジャガイモにおけるＣｒｙ３Ａが挙げられる。トウモロコシにはＳＭＡＲＴＳＴＡＸもあり、これはＣｒｙ１Ａ．１０５及びＣｒｙ２Ａｂを含む。

これらのタンパク質を発現する商品は、２つのタンパク質の組み合わせられた殺虫スペクトルが所望される場合（例えば、レプチドプレラ属の有害生物及びルートワームに対する抵抗性をそれぞれ提供するために組み合わせられるトウモロコシにおけるＣｒｙ１ＡｂとＣｒｙ３Ｂｂ）、又はそれらのタンパク質の独立した作用が、感受性昆虫集団における抵抗性の発生を遅らせるためのツールとしてそれらを有用なものにする場合（例えば、オオタバコガ幼虫に対する抵抗性管理を提供するために組み合わせられるワタにおけるＣｒｙ１Ａｃ及びＣｒｙ２Ａｂ）を除き、単一のタンパク質を発現する。

この技術の急速且つ広範にわたる採用につながった害虫抵抗性トランスジェニックタンパク質の特質の一部は、有害生物集団がこれらの植物によって生産される殺虫タンパク質に対する抵抗性を発生する懸念も生じさせる。Ｂｔに基づく害虫抵抗性形質の有用性を保つための幾つかの戦略が提唱されており、それらの戦略としては、リフュージと併用での高用量のタンパク質の展開、及び異なる毒素との交替又は同時展開が挙げられる(McGaughey et al.(1998), 「B.t.Resistance Management」, Nature Biotechnol.16:144-146)。

害虫抵抗性管理（ＩＲＭ）スタックでの使用に選択されるタンパク質は、ありタンパク質に対して発生した抵抗性が、別のタンパク質に対する抵抗性を付与しない（すなわち、それらのタンパク質に対して交叉抵抗性でない）ような活性でなければならない。例えば、「タンパク質Ａ」に対する抵抗性について選択された有害生物集団が「タンパク質Ｂ」に対して感受性である場合、交叉抵抗性ではないと、及びタンパク質Ａとタンパク質Ｂの併用がタンパク質Ａ単独に対する抵抗性を遅らせるのに有効であろうと結論づけられるだろう。

抵抗性昆虫集団が不在の場合、交叉抵抗性の可能性に関連づけられると推定される他の特性に基づいて評定を行うことができる。殺虫タンパク質の同定における受容体媒介結合の有用性は、提唱された交叉抵抗性を呈示しない可能性が高い(van Mellaert et al.1999)。このアプローチにつきものである交叉抵抗性の欠如の主要予測因子は、殺虫タンパク質が感受性昆虫種における受容体について競合しないことである。

２つのＢｔ毒素が同じ受容体について競合する事象において、その受容体がその昆虫において突然変異して、それらの毒素の一方がその受容体にもはや結合しない、従って、その昆虫に対してもはや殺虫性でない場合、その昆虫は、（同じ受容体に競合的に結合する）もう一方の毒素に対しても抵抗性であると言えるだろう。すなわち、その昆虫は、両方のＢｔ毒素に対して交叉抵抗性であると言える。しかし、２つの毒素が２つの異なる受容体に結合する場合、これは、その昆虫が同時にそれら２つの毒素に対して抵抗性でないことの表れであり得るだろう。

国際公開第９７／４０１６２号に開示されているように、比較的新しい殺虫タンパク質系がバシラス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）において発見された。この系は、二つのタンパク質、一方はおおよそ１５ｋＤａ及び他方は約４５ｋＤａを含む。米国特許第６，０８３，４９９号及び同第６，１２７，１８０号も参照のこと。これらのタンパク質は、今ではそれら固有のクラスに割り当てられており、それに応じてそれぞれＣｒｙ３４及びＣｒｙ３５というＣｒｙ名を受けている。Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅらのウェブサイト（ｂｉｏｌｓ．ｓｕｓｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／）を参照のこと。このタイプの系の多くの他の関連タンパク質が今や開示されている。例えば、米国特許第６，３７２，４８０号；国際公開第０１／１４４１７号；及び同第００／６６７４２号を参照のこと。そのようなタンパク質をコードする植物最適化遺伝子であって、植物における最適化発現のためにコドンを使用するように遺伝子工学で作り変えられる遺伝子も、開示されている。例えば、米国特許第６，２１８，１８８号を参照のこと。

Ｃｒｙ３４／３５系の正確な作用機作は未だ確定されていないが、昆虫腸細胞の膜に細孔を形成するようである。Moellenbeck et al., Nature Biotechnology, vol.19, p.668 (July 2001); Masson et al., Biochemistry, 43 (12349-12357) (2004)を参照のこと。Ｃｒｙ３４及びＣｒｙ３５タンパク質については３Ｄ原子座標及び結晶構造が公知であるにもかかわらず、正確な作用メカニズムは、依然として不明である。米国特許第７，５２４，８１０号及び同第７，３０９，７８５号を参照のこと。例えば、これらのタンパク質の一方又は両方が、典型的なタイプの受容体、例えばアルカリホスファターゼ又はアミノペプチダーゼ、を結合するかどうかは不明である。

さらに、昆虫がＣｒｙタンパク質に対する抵抗性を発生し得る種々のメカニズム（例えば、受容体の改変グリコシル化によるもの[Jurat-Fuentes et al.(2002) 68 AEM 5711-5717参照]、受容体タンパク質の除去によるもの[Lee et al.(1995) 61 AEM 3836-3842参照]、受容体を突然変異させることによるもの又は他のメカニズムによるもの[Heckel et al., J.Inv.Pathol.95 (2007) 192-197参照]）が存在するため、Ｃｒｙ３４／３５と他のＣｒｙタンパク質の間の交叉抵抗性が存在するのかどうかを演繹的に予測することは不可能であった。２つのタンパク質がＣｒｙ３４／３５二成分系に関係しているということも、Ｃｒｙ３４／３５系についての競合的結合の予測をさらに複雑にする。重ねて、これらのタンパク質が昆虫腸／腸細胞に有効に結合するかどうか及びどのように結合するのか、並びにそれらが互いに相互作用又は結合するかどうか及びどのように相互作用又は結合するのかは、不明である。

甲虫類の防除のための他の選択肢としては、次のタンパク質が挙げられる：Ｃｒｙ３Ｂｂ、Ｃｒｙ３Ｃ、Ｃｒｙ６Ｂ、ＥＴ２９、ＥＴ３３とＥＴ３４、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４３５、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＥＴ２９とＴＩＣ８１０、ＥＴ７０、ＥＴ７６とＥＴ８０、ＴＩＣ８５１、及びその他。ＲＮＡｉアプローチも提案されている。例えば、Baum et al., Nature Biotechnology, vol.25, no.11 (Nov.2007) pp.1322-1326を参照のこと。

国際公開第９７／４０１６２号米国特許第６，０８３，４９９号米国特許第６，１２７，１８０号米国特許第６，３７２，４８０号国際公開第０１／１４４１７号国際公開第００／６６７４２号米国特許第６，２１８，１８８号米国特許第７，５２４，８１０号米国特許第７，３０９，７８５号

Hofte et al., Microbial Reviews, Vol.53, No.2, pp.242-255 (1989) Perlak, F. J et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943 Perlak, F. J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321 Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155 Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1101-1104 Bing J W et al. (2000) Efficacy of Cry1F Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, Colo McGaughey et al.(1998), 「B.t.Resistance Management」, Nature Biotechnol.16:144-146 van Mellaert et al.1999 Moellenbeck et al., Nature Biotechnology, vol.19, p.668 (July 2001) Masson et al., Biochemistry, 43 (12349-12357) (2004) Jurat-Fuentes et al.(2002) 68 AEM 5711-5717 Lee et al.(1995) 61 AEM 3836-3842 Heckel et al., J.Inv.Pathol.95 (2007) 192-197 Baum et al., Nature Biotechnology, vol.25, no.11 (Nov.2007) pp.1322-1326

本発明は、以下を提供する。
［１］Ｃｒｙ３４タンパク質、Ｃｒｙ３５タンパク質及びＣｒｙ３Ｂ殺虫タンパク質を生産する、トランスジェニック植物。
［２］Ｃｒｙ３Ａ及びＣｒｙ６Ａからなる群より選択される第四の殺虫タンパク質をさらに生産する、上記［１］に記載のトランスジェニック植物。
［３］上記ＤＮＡを含む、上記［１］から［２］のいずれかに記載の植物の種子。
［４］上記［１］から［２］のいずれかに記載の複数の植物を含む植物の圃場。
［５］非Ｂｔリフュージ植物をさらに含む圃場であって、上記リフュージ植物が、上記圃場内のすべての作物植物の４０％未満を構成する、上記［４］に記載の植物の圃場。
［６］上記リフュージ植物が、上記圃場内のすべての作物植物の３０％未満を構成する、上記［５］に記載の植物の圃場。
［７］上記リフュージ植物が、上記圃場内のすべての作物植物の２０％未満を構成する、上記［５］に記載の植物の圃場。
［８］上記リフュージ植物が、上記圃場内のすべての作物植物の１０％未満を構成する、上記［５］に記載の植物の圃場。
［９］上記リフュージ植物が、上記圃場内のすべての作物植物の５％未満を構成する、上記［５］に記載の植物の圃場。
［１０］リフュージ植物がない、上記［４］に記載の植物の圃場。
［１１］上記リフュージ植物が、区画又は植栽帯内に存在する、上記［５］に記載の植物の圃場。
［１２］非Ｂｔリフュージ植物からのリフュージ種子と上記［３］に記載の複数の種子とを含む種子の混合物であって、上記リフュージ種子が上記混合物中のすべての種子の４０％未満を構成する、種子の混合物。
［１３］上記リフュージ種子が、上記混合物中のすべての種子の３０％未満を構成する、上記［１２］に記載の種子の混合物。
［１４］上記リフュージ種子が、上記混合物中のすべての種子の２０％未満を構成する、上記［１２］に記載の種子の混合物。
［１５］上記リフュージ種子が、上記混合物中のすべての種子の１０％未満を構成する、上記［１２］に記載の種子の混合物。
［１６］上記リフュージ種子が、上記混合物中のすべての種子の５％未満を構成する、上記［１２］に記載の種子の混合物。
［１７］上記［３］に記載の複数の種子を含む種子袋又は容器であって、ゼロのリフュージ種子を含む、袋又は容器。
［１８］昆虫によるＣｒｙタンパク質に対する抵抗性の発生を管理する方法であって、種子を作付けして、上記［５又は１０］に記載の植物の圃場を作ることを含む方法。
［１９］上記植物が、１０エーカーより多くを占有する、上記［５］から［１１］のいずれかに記載の圃場。
［２０］上記植物が、とうもろこし植物である、上記［１］から［２］のいずれかに記載の植物。
［２１］上記Ｃｒｙ３５タンパク質が、配列番号１及び配列番号２からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一であり、上記Ｃｒｙ３Ｂ殺虫タンパク質が、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一であり、並びに上記Ｃｒｙ３４タンパク質が、配列番号５と少なくとも９５％同一である、上記［１］から［２］のいずれかに記載の植物の植物細胞。
［２２］上記Ｃｒｙ３５タンパク質が、配列番号１及び配列番号２からなる群より選択される配列を含み、上記Ｃｒｙ３Ｂ殺虫タンパク質が、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択される配列を含み、並びに上記Ｃｒｙ３４タンパク質が、配列番号５を含む、上記［１］から［２］のいずれかに記載の植物。
［２３］上記［２１］に記載の植物細胞を生産する方法。
［２４］ルートワーム昆虫を防除する方法であって、上記昆虫をＣｒｙ３４タンパク質、Ｃｒｙ３５タンパク質及びＣｒｙ３Ｂ殺虫タンパク質と接触させることによる方法。
［２５］上記Ｃｒｙ３４タンパク質が、Ｃｒｙ３４Ａタンパク質であり、上記Ｃｒｙ３５タンパク質が、Ｃｒｙ３５Ａタンパク質であり、上記Ｃｒｙ３Ｂタンパク質が、Ｃｒｙ３Ｂａタンパク質である、上記［１］に記載の植物。
［２６］上記Ｃｒｙ３４タンパク質が、Ｃｒｙ３４Ａｂタンパク質であり、上記Ｃｒｙ３５タンパク質が、Ｃｒｙ３５Ａｂタンパク質である、上記［１］に記載の植物。
［２７］上記Ｃｒｙ３Ａタンパク質が、Ｃｒｙ３Ａａタンパク質であり、上記Ｃｒｙ６Ａタンパク質が、Ｃｒｙ６Ａａタンパク質である、上記［２］に記載の植物。
［２８］上記Ｃｒｙ３４タンパク質が、Ｃｒｙ３４Ａタンパク質であり、上記Ｃｒｙ３５タンパク質が、Ｃｒｙ３５Ａタンパク質であり、上記Ｃｒｙ３Ｂタンパク質が、Ｃｒｙ３Ｂａタンパク質である、上記［２４］に記載の方法。
［２９］上記Ｃｒｙ３４タンパク質が、Ｃｒｙ３４Ａｂタンパク質であり、上記Ｃｒｙ３５タンパク質が、Ｃｒｙ３５Ａｂタンパク質である、上記［２４］に記載の方法。

本発明は、一つには、Ｃｒｙ３Ｂａとの組み合わせでのＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂに関する。本発明は、一つには、Ｃｒｙ３４Ａｂ／Ｃｒｙ３５Ａｂ及びＣｒｙ３Ｂａがコーンルートワーム（ジアブロティカ種）集団による（いずれかの殺虫タンパク質系のみに対する）抵抗性の発生の予防に有用であるという驚くべき発見に関する。本開示のおかげで当業者には分かるであろうが、これらの殺虫Ｃｒｙタンパク質を生産する植物は、これらの殺虫タンパク質系のいずれかのみに対して抵抗性であるコーンルートワーム集団が発生し得る懸念の軽減に有用であろう。

本発明は、一つには、これらのＣｒｙタンパク質系の成分が、コーンルートワーム腸受容体を結合することについて互いに競合しないという発見によって裏づけられる。

本発明は、一つには、三（又はそれ以上）毒素系のトリプルスタック又は「プラスミド」にも関し、Ｃｒｙ３４Ａｂ／Ｃｒｙ３５Ａｂ及びＣｒｙ３Ｂａがその基本ペアである。従って、これらの２種の殺虫タンパク質系を生産する植物（及びそのような植物が作付けされる地所）は、本発明の範囲に含まれる。

図面のこの詳細な説明は、特に、添付の図に言及するものである。

図１Ａ．ウエスタンコーンルートワーム幼虫から調製したＢＢＭＶへのインプット放射標識Ｃｒｙ毒素の関数としての^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の結合。特異的結合＝全結合−非特異的結合、エラーバー＝ＳＥＭ（標準誤差）。図１Ｂ．ウエスタンコーンルートワーム幼虫から調製したＢＢＭＶへのインプット放射標識Ｃｒｙ毒素の関数としての^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３ＢＡｂ１の結合。特異的結合＝全結合−非特異的結合、エラーバー＝ＳＥＭ（標準誤差）。異なる非標識競合物濃度でのウエスタンコーンルートワーム幼虫から調製したＢＢＭＶへの^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の結合（ｌｏｇ０．１＝−１．０、ｌｏｇ１０＝１．０、ｌｏｇ１００＝２．０、ｌｏｇ１，０００＝３．０）。図３Ａ．Ｃｒｙ３４Ａｂ１不在下でのウエスタンコーンルートワーム幼虫から調製したＢＢＭＶへの^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の結合。図３Ｂ．Ｃｒｙ３４Ａｂ１存在下でのウエスタンコーンルートワーム幼虫から調製したＢＢＭＶへの^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の結合。様々な濃度の様々な非標識競合物の存在下でのウエスタンコーンルートワーム幼虫から調製したＢＢＭＶへの^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３Ｂａ１の結合。

配列の簡単な説明

配列番号１：完全長、天然ＣＲＹ３５ＡＢ１タンパク質配列。

配列番号２：キモトリプシンでトランケートされたＣｒｙ３５Ａｂ１コアタンパク質配列。

配列番号３：完全長、天然Ｃｒｙ３Ｂａ１タンパク質配列。

配列番号４：Ｃｒｙ３Ｂａ１トリプシンコアタンパク質配列。

配列番号５：完全長、天然Ｃｒｙ３４Ａｂ１タンパク質配列。

Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂタンパク質についての配列は、例えば、バシラス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｒｕｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）分離株ＰＳ１４９Ｂ１から得ることができる。本発明に従って使用するための他の遺伝子、タンパク質配列、及び源分離株については、例えば、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅらのウェブサイト（ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌ）を参照のこと。

本発明は、Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ殺虫タンパク質を、これらのＣｒｙタンパク質系のいずれか単独（他方を伴わない）に対する抵抗性を発生し得るコーンルートワーム集団によるコーンルートワーム摂食に起因する損害及び収穫量低下からトウモロコシを防護するために、Ｃｒｙ３Ｂａ毒素と併用することを含む。

従って、本発明は、コーンルートワームによるＣｒｙ３Ｂａ及び／又はＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂに対する抵抗性の発生を予防するための害虫抵抗性管理（ＩＲＭ）スタックを教示する。

本発明は、Ｃｒｙ３Ｂａ毒素タンパク質及びＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ毒素系を生産する細胞を含む有害生物ルートワームを防除するための組成物を提供する。

本発明は、さらに、Ｃｒｙ３Ｂａタンパク質とＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ二成分毒素の両方を生産するように形質転換された宿主を含み、該宿主は、微生物又は植物細胞である。

加えて、本発明は、有害生物ルートワームを防除する方法を提供することを意図しており、この方法は、前記有害生物又は前記有害生物の環境と、Ｃｒｙ３Ｂａタンパク質を含有する及びさらにＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ二成分毒素を含有する有効量の組成物とを接触させることを含む。

本発明の実施形態は、Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ二成分毒素をコードする植物発現可能遺伝子とＣｒｙ３Ｂａタンパク質をコードする植物発現可能遺伝子とを含むとうもろこし植物、及びそのような植物の種子を含む。

本発明のさらなる実施形態は、Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ二成分毒素をコードする植物発現可能遺伝子とＣｒｙ３Ｂａタンパク質をコードする植物発現可能遺伝子とが遺伝子移入されたとうもろこし植物、並びにそのような植物の種子を含む。

実施例において説明するように、放射標識Ｃｒｙ３５Ａｂコア毒素タンパク質を使用する競合的受容体結合研究は、Ｃｒｙ３５Ａｂが結合するＣＲＷ昆虫組織サンプルにおいてＣｒｙ３Ｂａコア毒素タンパク質が結合について競合しないことを示す。図２参照。これらの結果は、Ｃｒｙ３Ｂａタンパク質とＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂタンパク質の組み合わせが、いずれかのタンパク質系のみに対するＣＲＷ集団における抵抗性の発生を軽減するための有効な手段であることを示している。

従って、上に記載した又は本明細書の他の箇所に記載するデータに一部基づいて、Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ及びＣｒｙ３Ｂａタンパク質を使用して、ＣＲＷによる抵抗性発生の予防又は軽減するためのＩＲＭ組み合わせを生成することができる。他のタンパク質をこの組み合わせに加えて、例えば、害虫防除スペクトラムを拡大することができる。（Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂタンパク質とＣｒｙ３Ｂａタンパク質の）本組み合わせは、幾つかの好ましい「トリプルスタック」又は「ピラミッド」において、ルートワームの防除用のさらに別のタンパク質、例えばＣｒｙ３Ａａ及び／又はＣｒｙ６Ａａ、との組み合わせで使用することもできる；従って、そのような追加の組み合わせは、ルートワームに対する多重作用機作をもたらすであろう。ルートワームに対するＲＮＡｉは、尚さらなる選択肢である。例えば、Baum et al., Nature Biotechnology, vol.25, no.11 (Nov.2007) pp.1322-1326を参照のこと。

Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂタンパク質とＣｒｙ３Ａａタンパク質の組み合わせに関する米国特許出願第６１／３２７，２４０号（２０１０年４月２３日出願）、Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂタンパク質とＣｒｙ６Ａａタンパク質の組み合わせに関する米国特許出願第６１／３８８，２７３号（２０１０年９月３０日出願）、及びＣｒｙ３Ａａタンパク質とＣｒｙ６Ａａタンパク質の組み合わせに関する米国特許出願第６１／４７７，４４７号（２０１１年９月２０日出願）の開示に照らして、本発明の幾つかの好ましい「トリプルスタック」又は「多重作用機作スタック」は、Ｃｒｙ６Ａａタンパク質及び／又はＣｒｙ３Ａａタンパク質と共に、Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂタンパク質と組み合わせたＣｒｙ３Ｂａタンパク質を含む。ｃｒｙ３Ｂａ遺伝子、ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ遺伝子、及び第三又は第四の毒素系（例えば、ｃｒｙ３Ａａ及び／又はｃｒｙ６Ａａ遺伝子を含む、トウモロコシをはじめとする、トランスジェニック植物は、本発明の範囲に含まれる。従って、そのような実施形態は、少なくとも３つの作用機作で昆虫を標的にする。

本発明の展開選択肢は、ジアブロティカ種が問題となるトウモロコシ栽培地におけるＣｒｙ３Ｂａ及びＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂタンパク質の使用を含む。もう１つの展開選択肢は、Ｃｒｙ３Ｂａ及びＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂタンパク質の一方又は両方と他の形質との併用であるだろう。

Ｂｔ毒素が、Ｃｒｙ３Ｂａ及びＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂなどの一定のクラス内であっても、ある程度異なる場合があることは、当業者には理解されるであろう。

遺伝子及び毒素。用語「単離された」は、天然に存在しない構築物中のポリヌクレオチドを、又は精製された状態の若しくは別様に自然に存在しない状態のタンパク質を指す。本発明に従って有用な遺伝子及び毒素としては、開示する完全長配列ばかりでなく、これらの配列のフラグメント、変異体、突然変異体、及び本明細書において具体的に例示する毒素の特徴的殺有害生物活性を保持する融合タンパク質も挙げられる。本明細書において用いる場合、遺伝子の「変異体」又は「異形」という用語は、同じ毒素をコードする、又は殺有害生物活性を有する等価の毒素をコードする、ヌクレオチド配列を指す。本明細書において用いる場合、用語「等価の毒素」は、標的有害生物に対して請求項記載の毒素と同じ又は本質的に同じ生物活性を有する毒素を指す。これは、本発明によるとＣｒｙ３及びＣｒｙ３４／３５、ならびに（トリプル／マルチプルスタックで使用する場合）Ｃｒｙ６に当てはまる。これらのタンパク質のドメイン／サブドメインを交換してキメラタンパク質を作製することができる。Ｃｒｙ３４／３５タンパク質に関しては米国特許第７，３０９，７８５号及び同第７，５２４，８１０号を参照のこと。前記’７８５特許は、トランケートされたＣｒｙ３５タンパク質も教示している。トランケートされた毒素を本明細書においても例示する。

本明細書において用いる場合、境界線は、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins」, N.Crickmore, D.R.Zeigler, J.Feitelson, E.Schnepf, J.Van Rie, D.Lereclus, J.Baum, and D.H.Dean.Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813に従って、おおよそ９５％（Ｃｒｙ３Ｂａ及びＣｒｙ３４Ａｂ及びＣｒｙ３５Ａｂ）、７８％（Ｃｒｙ３Ｂ及びＣｒｙ３４Ａ及びＣｒｙ３５Ａ）及び４５％（Ｃｒｙ６及びＣｒｙ３４及びＣｒｙ３５）配列同一性を表す。本発明に従って例えばトリプル／マルチプルスタックで使用する場合、同じことがＣｒｙ３Ａ／Ｃｒｙ６にも当てはまる。

活性毒素をコードする遺伝子を幾つかの手段によって同定及び得ることができることは当業者には明らかであろう。本明細書において例示する特定の遺伝子又は遺伝子部分は、培養物寄託機関に寄託されている分離株から得ることができる。これらの遺伝子、又はそれらの部分若しくは変異体は、合成的に、例えば遺伝子合成装置の使用によって、構築することもできる。遺伝子の異形は、点突然変異を行うための標準的な技術を用いて容易に構築することができる。また、標準的な手順に従って市販のエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを使用して、これらの遺伝子のフラグメントを作製することができる。例えば、Ｂａｌ３１などの酵素、又は部位特異的突然変異誘発を用いて、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを系統的に切除することができる。様々な制限酵素を使用して、活性フラグメントをコードする遺伝子を得ることもできる。プロテアーゼを使用して、これらのタンパク質毒素のフラグメントを直接得ることができる。

例示する毒素の殺有害生物活性を保持するフラグメント及び等価物は、本発明の範囲内であるだろう。また、遺伝コードの冗長性のため、様々な異なるＤＮＡ配列が、本明細書において開示するアミノ酸配列をコードする場合がある。同じ又は本質的に同じ毒素をコードするこれらの代替ＤＮＡ配列を作り出すことは、十分に当業者の技能の範囲内である。これらの変異体ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内である。本明細書において用いる場合、「本質的に同じ」配列への言及は、殺有害生物活性にあまり影響を及ぼさないアミノ酸置換、欠失、付加又は挿入を有する配列を指す。殺有害生物活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子のフラグメントもこの定義に含まれる。

本発明に従って有用な毒素をコードする遺伝子及び遺伝子部分を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用によるものである。これらのプローブは、検出可能ヌクレオチド配列である。これらの配列は、適切な標識によって検出可能でる場合があり、又は国際出願番号国際公開第９３／１６０９４号に記載されているように生得的に蛍光性にされている場合がある。当分野において周知であるように、プローブ分子と核酸サンプルが、それら二分子間の強力な結合を形成することによってハイブリダイズする場合、道理上、このプローブ及びサンプルは実質的に相同であると想定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばKeller, G.H., M.M.Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp.169-170に記載されているような当分野において周知の技術によって、ストリンジェントな条件下で行われる。塩濃度と温度の組み合わせの幾つかの例は、次のとおりである（ストリンジェンシーが低い順に）：室温で２ＸＳＳＰＥ又はＳＳＣ；４２℃で１ＸＳＳＰＥ又はＳＳＣ；４２℃で０．１ＸＳＳＰＥ又はＳＳＣ；６５℃で０．１ＸＳＳＰＥ又はＳＳＣ。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが発生したかどうかを公知の手法で判定する手段を提供する。そのようなプローブ分析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に従ってプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置又は標準的な手順を使用して合成することができる。これらのヌクレオチド配列をＰＣＲプライマーとして使用して、本発明の遺伝子を増幅することもできる。

変異体毒素。本発明の一定の毒素を本明細書の中で具体的に例示してきた。これらの毒素は、単に本発明の毒素の例示であるので、本発明が、例示する毒素と同じ又は同様の殺有害生物活性を有する変異体又は等価の毒素（及び等価の毒素をコードするヌクレオチド配列）を含むことは、容易に分かるはずである。等価の毒素は、例示する毒素とのアミノ酸相同性を有するであろう。このアミノ酸同一性は、一部の実施形態において、典型的には７５％より大きく、又は好ましくは８５％より大きく、好ましくは９０％より大きく、好ましくは９５％より大きく、好ましくは９６％より大きく、好ましくは９７％より大きく、好ましくは９８％より大きく、又は好ましくは９９％より大きい。アミノ酸同一性は、生物活性の原因となる、又は結局は生物活性の原因である三次元配座の決定に関係する、毒素の重要領域において典型的に最も高いであろう。これに関して言えば、一定のアミノ酸置換は、これらの置換が、活性にとって重要でない領域にある場合、又はその分子の三次元配座に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である場合、許容され及び予想され得る。例えば、アミノ酸を次のクラスに配属することができる：非極性、非荷電極性、塩基性、及び酸性。あるクラスのアミノ酸を同じタイプの別のアミノ酸で置き換える保存的アミノ酸置換は、その置換がその化合物の生物活性を著しく改変しない限り、本発明の範囲内に入る。表１は、各クラスに属するアミノ酸の例のリストを提供するものである。

場合によっては、非保存的置換を行うこともできる。重要な要因は、これらの置換が、前記毒素の生物活性を有意に損なってはならないということである。

組換え宿主。本発明の毒素をコードする遺伝子を多種多様な微生物又は植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子の発現は、殺有害生物剤の細胞内生産及び維持を直接又は間接的に生じさせる結果となる。接合伝達及び組換え伝達を用いて、本発明の両方の毒素を発現するＢｔ株を作り出すことができる。他の宿主生物を前記毒素遺伝子の一方又は両方で形質転換させ、その後、使用して相乗効果を果たすことができる。適する微生物宿主、例えばシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、を用いて、該微生物を有害生物の生育環境に適用することができ、そこで該微生物は増殖し、摂取されることとなる。結果として有害生物は防除されることとなる。あるいは、毒素遺伝子の宿主としての役割を果たす微生物を、毒素の活性を延長する及び細胞を安定させる条件下で、処理することができる。毒素活性を保持するその処理された細胞を、標的有害生物の環境に適用することができる。（本ＩＲＭ遺伝子の少なくとも１つを含む）本発明の植物からの非再生可能／非全能性植物細胞は、本発明に含まれる。

植物形質転換。本発明の好ましい実施形態は、本殺虫タンパク質又はその変異体をコードする遺伝子での植物の形質転換である。形質転換植物は、該形質転換植物の細胞内の防除量の本殺虫タンパク質又はその変異体の存在のおかげで、昆虫標的有害生物による攻撃に対して抵抗性である。Ｂ．ｔ．殺虫毒素の殺虫特性をコードする遺伝物質を、特定の害虫によって食された植物のゲノムに導入することにより、成虫又は幼虫は、餌物植物の消費後、死滅するだろう。非常に多くの単子葉植物及び双子葉植物分類が形質転換されている。トランスジェニック普通作物並びに果実及び野菜は、商業的関心対象である。そのような作物としては、とうもろこし、イネ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ属、コムギ、ワタ、ラッカセイ、トマト、ジャガイモなどが挙げられるが、それらに限定されない。外来遺伝物質を植物細胞に導入するための、並びに導入された遺伝子を安定的に維持及び発現する植物を得るための、幾つかの技術が存在する。そのような技術としては、微粒子にコーティングされた遺伝物質の直接細胞への加速（米国特許第４，９４５，０５０号及び同第５，１４１，１３１号）が挙げられる。アグロバクテリウム技術を用いて植物を形質転換させることもできる、例えば、米国特許第５，１７７，０１０号、同第５，１０４，３１０号、欧州特許出願第０１３１６２４号Ｂ１、同第１２０５１６号、同第１５９４１８号Ｂ１、同第１７６１１２号、米国特許第５，１４９，６４５号、同第５，４６９，９７６号、同第５，４６４，７６３号、同第４，９４０，８３８号、同第４，６９３，９７６号、欧州特許出願第１１６７１８号、同第２９０７９９号、同第３２０５００号、同第６０４６６２号、同第６２７７５２号、同第０２６７１５９号、同第０２９２４３５号、米国特許第５，２３１，０１９号、同第５，４６３，１７４号、同第４，７６２，７８５号、同第５，００４，８６３号及び同第５，１５９，１３５号参照。他の形質転換技術としては、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）技術が挙げられる、米国特許第５，３０２，５２３号及び米国特許第５，４６４，７６５号参照。電気穿孔法技術も植物を形質転換させるために使用されている、国際公開第８７／０６６１４号、米国特許第５，４７２，８６９号、同第５，３８４，２５３号、国際公開第９２０９６９６号、及び同第９３２１３３５号参照。これらの形質転換特許及び公報のすべてが参照により組み込まれる。植物を形質転換させるための非常に多くの技術に加えて、外来遺伝子と接触させる組織のタイプも様々であり得る。そのような組織としては、胚形成組織、カルス組織タイプＩ及びＩＩ、胚軸、分裂組織などが挙げられるだろうが、それらに限定されない。当業者の技能の範囲内の適切な技術を用いて、ほぼすべての植物組織を分化中に形質転換させることができる。

上で論じたような当分野において周知である様々な技術を用いて、本毒素のいずれかをコードする遺伝子を植物細胞に挿入することができる。例えば、形質転換された微生物細胞の選択を可能にするマーカーと大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）において機能し得る複製系とを含む多数のクローニングベクターを、高等植物への挿入のための外来遺伝子の調製及び修飾に利用することができる。そのような操作は、例えば、所期の用途の必要に応じて突然変異、トランケーション、付加又は置換の挿入を含み得る。前記ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４などを含む。従って、Ｃｒｙタンパク質又は変異体をコードする配列をベクターの適する制限部位に挿入することができる。結果として生じたプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞の形質転換に使用し、それらの細胞を適切な栄養培地において培養し、その後、採取し、溶解して、作業可能な量のプラスミドを回収する。配列分析、制限フラグメント分析、電気泳動、及び他の生化学的−分子生物学的方法が、一般に、分析法として実施される。それぞれの操作の後、使用したＤＮＡ配列を切断し、次のＤＮＡ配列に連結させることができる。操作されたＤＮＡ配列それぞれを同じ又は異なるプラスミドにおいてクローニングすることができる。

植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡ含有ベクターの使用は徹底的に研究されており、EP 120516; Lee and Gelvin (2008), Fraley et al.(1986), and An et al.(1985)に十分に記載されており、当分野において定着している。

挿入されたＤＮＡは、一旦、植物ゲノムに組み込まれてしまえば、その後の世代全体にわたって比較的安定している。植物細胞を形質転換させるために使用されるベクターは、除草剤又は抗生物質、例えば、とりわけ、ビアラフォス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン又はヒグロマイシンに対する抵抗性をそれらの形質転換細胞に付与するタンパク質をコードする選択可能マーカー遺伝子を通常は含有する。従って、個々に利用される選択可能マーカー遺伝子は、形質転換細胞の選択を可能にするが、挿入ＤＮＡを含有しない細胞の成長は、その選択的化合物によって抑制されない。

宿主細胞へのＤＮＡの挿入には多数の技術を利用できる。それらの技術としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）によって形質転換剤として送達されるＴ−ＤＮＡでの形質転換が挙げられる。加えて、送達すべきＤＮＡを含有するリポソームと植物プロトプラストの融合、ＤＮＡの直接注入、微粒子銃形質転換（微粒子ボンバードメント）、又は電気穿孔法、及び他の可能な方法を利用してもよい。

本発明の好ましい実施形態において、植物は、タンパク質コーディング領域のコドン使用量が植物にとって最適化されている遺伝子で形質転換されるであろう。例えば、参照により本明細書によって組み込まれる米国特許第５３８０８３１号を参照のこと。また、有利には、トランケートされた毒素をコードする植物が使用されるであろう。前記トランケートされた毒素は、典型的に、その完全長毒素の約５５％から約８０％をコードするであろう。植物において使用するための合成Ｂ．ｔ．遺伝子を作り出す方法は、当分野において公知である(Stewart, 2007)。

形質転換技術にかかわらず、遺伝子は、植物細胞においてＢ．ｔ．殺虫毒素遺伝子及び変異体を発現することに適応させた遺伝子伝達ベクターに、該ベクターに植物プロモーターを含めることによって、組み込まれる。植物プロモーターに加えて、植物細胞において外来遺伝子を発現させるために、様々な源からのプロモーターを効率的に使用することができる。例えば、細菌起源のプロモーター、例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモータ及びマンノピンシンターゼプロモーター、を使用することができる。非バシラススリンジエンシスプロモーターを一部の好ましい実施形態では使用することができる。植物ウイルス起源のプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーター、キャッサバベインモザイクウイルス（ＣａｓｓａｖａＶｅｉｎＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）のプロモーターなどを使用することができる。植物プロモーターとしては、リブロース−１，６−二リン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、ベータ−コングリシンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、熱ショックプロモーター、ＡＤＦ（アクチン解重合因子）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、及び組織特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、転写効率を向上させることができる一定のエンハンサー配列要素を含有することもある。典型的なエンハンサーとしては、ＡＤＨ１−イントロン１及びＡＤＨ１−イントロン６が挙げられるが、これらに限定されない。構成的プロモーターを使用してもよい。構成的プロモーターは、ほぼすべての細胞タイプにおいて及びほぼ常に継続的遺伝子発現を命令する（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ）。組織特異的プロモーター（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ（アシルキャリアータンパク質）プロモーター）は、特定の細胞又は組織タイプ、例えば葉又は種子、における遺伝子発現の責任を負うものであり、これらのプロモーターも使用することができる。植物の一定の発育段階中に活性であり、特定の植物組織及び器官において活性でもあるプロモーターを使用することもできる。そのようなプロモーターの例としては、根特異的、花粉特異的、胚特異的、トウモロコシの毛に特異的、ワタ繊維特異的、種子内胚乳特異的、篩部特異的などであるプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。

一定の状況下では、誘導性プロモーターの使用が望ましいことがある。誘導性プロモーターは、特定のシグナル、例えば、物理的刺激（例えば、熱ショック遺伝子）；光（例えば、ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）；ホルモン（例えば、糖質コルチコイド）；抗生物質（例えば、テトラサイクリン）；代謝産物；及びストレス（例えば、干ばつ）に応答しての遺伝子の発現に責任を負う。植物において機能する他の望ましい転写及び翻訳要素、例えば、５’非翻訳リーダー配列、ＲＮＡ転写終結配列及びポリアデニレート付加シグナル配列を使用してもよい。非常に多くの植物特異的遺伝子伝達ベクターが当分野に公知である。

害虫抵抗性（ＩＲ）形質を有するトランスジェニック作物は、北米中のトウモロコシ及びワタ植物において優勢であり、これらの形質の取り扱いは世界的に拡大している。ＩＲ形質と除草剤耐性（ＨＴ）形質とを併せ持つ商用トランスジェニック作物が、多数の種子会社によって開発されている。これは、Ｂ．ｔ．殺虫タンパク質によって付与されるＩＲ形質と、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤、例えばスルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、スルホンアニリドなど、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）阻害剤、例えばビアァフォス、グルホシネートなど、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、例えばメソトリオン、イソキサフルトールなど、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤、例えばグリホサートなど、並びにアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤、例えばハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどに対する耐性などのＨＴ形質との組み合わせを含む。遺伝子導入で得たタンパク質が、除草剤化学クラス、例えばフェノキシ酸系除草剤及びピリジルオキシ酢酸オーキシン系除草剤（国際公開第２００７／０５３４８２Ａ２号参照）、又はフェノキシ酸系除草剤及びアリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤（国際公開第２００５／１０７４３７Ａ２、Ａ３号）、に対して耐性を植物にもたらす、他の例は、公知である。ＩＲ形質によって多数の有害生物の問題を防除できることは、価値のある商品概念であり、この製品概念の利便性は、害虫防除形質及び形質及び雑草防除形質が同じ植物に兼備されれば向上される。さらに、本発明のものなどのＢ．ｔ．殺虫タンパク質によって付与されるＩＲ形質と、上で述べたものなどの１つ又はそれ以上の追加のＨＴ形質、加えて、１つ又はそれ以上の追加のインプット形質（例えば、Ｂ．ｔ．由来の若しくは他の殺虫特性によって付与される他の害虫抵抗性、ＲＮＡｉなどのメカニズムによって付与される害虫抵抗性、線虫抵抗性、病害抵抗性、ストレス耐性、改善された窒素利用能など）又はアウトプット形質（例えば、高い含油量、健康な油組成、栄養改善など）の単一植物兼備により、向上された価値を得ることができる。そのような兼備は、従来の育種（育種スタック）によって達成されることがあり、又は付帯的に、多数の遺伝子の同時導入を伴う新規形質転換事象（分子スタック）として達成されることがある。恩恵としては、害虫を管理できること、並びに生産者及び／又は消費者に二次的な恩恵をもたらす作物植物における改善された雑草防除が挙げられる。このように、本発明を他の形質と併用して、任意の数の農耕学的問題点を柔軟に及び費用効果的に制御することができる改善された作物品質の完全な農耕学的パッケージを提供することができる。

形質転換された細胞は、通常の様式で植物内部で成長する。それらは、生殖細胞を形成することができ、及び形質転換された形質を後代植物に伝えることができる。

そのような植物を通常の様式で成長させることができ、同じ形質転換遺伝因子又は他の遺伝因子を有する植物と交配することができる。結果として生じたハイブリッド個体は、対応する表現型特性を有する。

本発明の好ましい実施形態において、植物は、コドン使用量が植物にとって最適化されている遺伝子で形質転換されるであろう。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号参照。加えて、植物において使用するための合成Ｂｔ遺伝子を作り出すための方法は、当分野において公知である(Stewart and Burgin, 2007)。好ましい形質転換植物の１つの非限定的な例は、Ｃｒｙ３Ｂａタンパク質をコードする植物発現可能遺伝子を含む、及びさらに、Ｃｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂタンパク質をコードする第二のセットの植物発現可能遺伝子を含む、稔性とうもろこし植物である。

同系交配とうもろこし系統へのＣｒｙ３Ｂａ−及びＣｒｙ３４Ａｂ／３５Ａｂ−決定形質の伝達（又は遺伝子移入）は、循環選抜育種法によって、例えば戻し交配によって、達成することができる。この場合、所望の反復親を、Ｃｒｙ決定形質に適する遺伝子を保有するドナー同系交配体（一回親）と先ず交配させる。次に、この交配種の後代を交配して反復親に戻し、その後、その結果として生じた後代を、一回親から伝達されるべき所望の形質について選抜する。所望の形質についての選抜を伴う反復親との三世代、好ましくは四世代、さらに好ましくは五世代又はそれ以上の世代の戻し交配の後、その後代は、伝達される形質を制御する遺伝子座についてヘテロ接合性であるだろうが、殆どの又はほぼすべての他の遺伝子については反復親と同様であるだろう（例えば、Poehlman & Sleper(1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175;Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol.1: Theory and Technique, 360-376参照）。

害虫抵抗性管理（ＩＲＭ）戦略。例えば、Ｒｏｕｓｈらは、殺虫性トランスジェニック作物の管理のための二毒素戦略（「ピラミッディング」又は「スタッキング」とも呼ばれる）を概説している。（The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998) 353, 1777-1786）。

ウェブサイト上で、アメリカ合衆国観光保護庁（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＡｇｅｎｃｙ）（ｅｐａ．ｇｏｖ／ｏｐｐｂｐｐｄ１／ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ／ｐｉｐｓ／ｂｔ＿ｃｏｒｎ＿ｒｅｆｕｇｅ＿２００６．ｈｔｍ）は、標的有害生物に対して活性な単一のＢｔタンパク質を生産するトランスジェニック作物と共に使用するための非トランスジェニック（すなわち、非Ｂ．ｔ．）リフュージ（非Ｂｔ作物／トウモロコシの区画）を設けることについて、以下の要件を発表している。
「マツマダラメイガ（ｃｏｒｎｂｏｒｅｒ）防護Ｂｔ（Ｃｒｙ１Ａｂ又はＣｒｙ１Ｆ）トウモロコシ製品についての具体的な構造化要件は、次のとおりである：
構造化リフュージ：コーンベルト内に２０％非レプチドプレラ属Ｂｔトウモロコシリフュージ；コットンベルト内に５０％非レプチドプレラ属Ｂｔリフュージ；
区画
内部（すなわち、Ｂｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大にするためのＢｔ圃場から１／２マイル（可能な場合には１／４マイル）以内の離隔した圃場）
圃場内植栽帯（Ｉｎ−ｆｉｅｌｄＳｔｒｉｐｓ）
植栽帯は、幼虫移動の影響を低減させるために少なくとも４畝幅（好ましくは６畝）でなければならない」

加えて、全米トウモロコシ生産者協会（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｒｎＧｒｏｗｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）も、彼らのウェブサイト：（ｎｃｇａ．ｃｏｍ／ｉｎｓｅｃｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ−ｆａｃｔ−ｓｈｅｅｔ−ｂｔ−ｃｏｒｎ）
で、リフュージ要件に関する同様のガイダンスを提供している。例えば：
「マツマダラメイガＩＲＭの要件：
−貴方のトウモロコシ畑の少なくとも２０％をリフュージハイブリッドのために作付けすること
−ワタ生産地では、リフュージは５０％でなければならない
−リフュージハイブリッドから１／２マイル以内に作付けしなければならない
−リフュージをＢｔ圃場内の植栽帯として作付けすることができる；リフュージ植栽帯は、少なくとも４畝幅でなければならない
−標的昆虫のために経済的許容限界に達する場合にのみ、リフュージを従来の殺有害生物剤で処理してもよい
−Ｂｔ系噴霧可能殺虫剤をリフュージトウモロコシに対して使用することはできない
−適切なリフュージを、Ｂｔトウモロコシを有するすべての農地に作付けしなければならない」

Ｒｏｕｓｈらが（例えば、１７８０頁及び１７８４頁右列で）述べているように、それぞれが標的有害生物に対して有効であり、交叉抵抗性が殆ど又は全くない２つのタンパク質のスタッキング又はピラミッディングは、より小さいリフュージの使用を可能にし得る。Ｒｏｕｓｈは、好結果のスタックについては１０％リフュージ未満のリフュージサイズで単一の（ピラミッディングされていない）形質のための約５０％リフュージに匹敵する抵抗性管理を提供できることを示唆している。現在利用できるピラミッディングされたＢｔトウモロコシ製品について、アメリカ合衆国環境保護庁（Ｕ．Ｓ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＡｇｅｎｃｙ）は、単一形質製品についてのもの（一般に２０％）より有意に少ない（一般に５％）非Ｂｔトウモロコシの構造化リフュージを作付けすることを求めている。

リフュージのＩＲＭ効果をもたらすための様々な方法があり、それらとしては、Roush et al.(supra)、及び米国特許第６，５５１，９６２号によってさらに論じられているように、圃場における様々な幾何学的作付けパターン（例えば上述のもの）及び袋詰め種子混合物（ｉｎ−ｂａｇｓｅｅｄｍｉｘｔｕｒｅ）が挙げられる。

上記百分率又は類似のリフュージ比率を、本ダブル又はトリプルスタック又はピラミッドに用いることができる。本発明はルートワーム標的昆虫に対する多重、非競合作用機作を提供するため、本発明は、「ゼロリフュージ」、すなわちリフュージ植物のない圃場、を（リフュージを必要としないため）提供することができるだろう。約１０エーカーより広い典型的なＢ．ｔ．トランスジェニック圃場には、一般に、許可が求められる。従って、本発明は、「ゼロリフュージ」である又はＢｔ植物を有さない１０エーカー又はそれ以上の圃場を含む；このサイズの圃場は、以前には、有意な非Ｂｔリフュージを有することが求められた。

本明細書の中で言及又は引用するすべての特許、特許出願、仮出願、及び出版物は、それらが本出願の明確な教示と矛盾しない程度に、それら全体が参照により組み込まれる。

以下は、本発明を実施するための手順を例証する実施例である。これらの実施例を限定とみなすべきではない。別の注記がない限り、すべての百分率は重量によるものであり、及びすべての溶媒混合物の比率は容量によるものである。すべての温度は、摂氏度でのものである。

具体的な指示又は含意がない限り、用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本明細書において用いる場合、「少なくとも１」を意味する。

実施例１
Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１及びＣｒｙ３Ｂａ１完全長毒素をコードする発現プラスミドの構築

完全長Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１及びＣｒｙ３Ｂａ１Ｃｒｙタンパク質をそれぞれ生産するように遺伝子操作で作り変えられたシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（Ｐｆ）発現プラスミドの構築には標準的なクローニング法を用いた。ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；マサチューセッツ州イプスウィッチ）からの制限エンドヌクレアーゼをＤＮＡ消化に使用し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＴ４ＤＮＡリガーゼをＤＮＡライゲーションに使用した。ＰｌａｓｍｉｄＭｉｄｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）をその供給業者の指示書に従って使用して、プラスミド調製を行った。アガロースＴｒｉｓ−アセテートゲル電気泳動の後、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＵｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＤＡカートリッジ（マサチューセッツ州ビルリカ）を使用して、ＤＮＡフラグメントを精製した。基本クローニング戦略は、完全長Ｃｒｙ３４Ａｂ１及びＣｒｙ３５Ａｂ１Ｃｒｙタンパク質のコーディング配列（ＣＤＳ）をｐＭＹＣ１８０３のＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ（又はＸｂａＩＩ）制限部位に、並びに完全長Ｃｒｙ３Ｂａ１タンパク質のＣＤＳをｐＭＹＣ１０５０のＫｐｎＩ及びＸｂａＩ制限部位に、それぞれサブクローニングすること、それによって、それらを、それぞれプラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬＰｈａｒｍａｃｉａ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）からのＰｔａｃプロモーター及びｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネータの発現制御下に置くことを必要とした。ｐＭＹＣ１８０３は、ＲＳＦ１０１０複製起点と、テトラサイクリン抵抗性遺伝子と、ＤＮＡフラグメント含有タンパク質コーディング領域を導入することができる制限酵素認識部位の前にリボソーム結合部位とを有する中コピープラスミドである（米国特許出願第２００８／０１９３９７４号）。その発現プラスミドを電気穿孔法によってＰ．フルオレッセンス株ＭＢ２１４に形質転換させ、ＳＯＣ−Ｓｏｙ加水分解物培地に回収し、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含有する溶原培地（Ｌｙｓｏｇｅｎｙｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）培地にプレーティングした。微生物操作の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００６／０００８８７７号、米国特許出願第２００８／０１９３９７４号及び米国特許出願第２００８／００５８２６２号において入手できる。ｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡの制限消化によって、コロニーをスクリーニングした。挿入物を含有する選択されたコロニーのプラスミドＤＮＡは、商業的シークエンシング供給業者、例えばＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ（アラバマ州ハンツヴィル）、との契約によりシークエンシングされた。配列データを集め、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓＣｏｒｐ、ミシガン州アナーバー）を使用して分析した。

実施例２
成長及び発現

Ｂｔ受容体結合及び昆虫バイオアッセイをはじめとする特性づけのためのＣｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１及びＣｒｙ３Ｂａ１毒素の振盪フラスコ生産での成長及び発現分析を、発現構築物を持つ振盪フラスコ成長Ｐ．フルオレッセンス株（例えば、Ｃｒｙ３４Ａｂ１についてはクローンｐＭＹＣ２５９３、Ｃｒｙ３５Ａｂ１についてはｐＭＹＣ３１２２、及びＣｒｙ３Ｂａ１についてはｐＭＹＣ１１７７）によって遂行した。２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを補足したＬＢ培地で成長させた種培養物を使用して、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを伴う２００ｍＬの同培地に接種した。２４時間、３０℃で振盪しながらの最初のインキュベーションの後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、ＰｔａｃプロモーターによるＣｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１及びＣｒｙ３Ｂａ１毒素の発現を誘導した。誘導時に及び誘導後の様々な時点で培養物をサンプリングした。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）により、細胞密度を測定した。

実施例３
振盪フラスコサンプルの細胞分画及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析

各サンプリング時、サンプルの細胞密度をＯＤ６００＝２０に調整した。１ｍＬアリコートを１４，０００×ｇで５分間、遠心分離する。細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）細菌タンパク質抽出溶液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、凍結された振盪フラスコ細胞ペレットサンプルから可溶性及び不溶性画分を生成した。各細胞ペレットを１ｍＬＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）溶液に再浮遊させ、溶解バッファでさらに１：４希釈し、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。溶解産物を１４，０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。その後、ペレット（不溶性画分）を等容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．４）に再浮遊させた。サンプルを、β−メルカプトエタノールを含有する２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファと１：１混合し、５分間沸騰させた後、ＮｕＰＡＧＥＮｏｖｅｘ４−２０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）に負荷した。電気泳動は、推奨ＸＴＭＯＰＳバッファ中で行った。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎをその製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従って用いてゲルを染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ画像形成システム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）を使用して画像形成した。

実施例４
封入体調製

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析）によって実証されるように、不溶性Ｂ．ｔ．殺虫タンパク質を生産したＰ．フルオレッセンスからの細胞を用いて、Ｃｒｙタンパク質封入体（ＩＢ）調製を行った。Ｐ．フルオレッセンス発酵ペレットを３７℃水浴で解凍する。それらの細胞を、溶解バッファ［５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム塩（エチレンジアミン四酢酸）、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）］に再浮遊させて２５％ｗ／ｖにし、使用直前に５ｍＬ／Ｌの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８４６５Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を添加した。最低設定でホモジナイザー（ＴｉｓｓｕｅＴｅａｒｏｒ、ＢｉｏＳｐｅｃＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、オクラホマ州バートルズヴィル）を使用して、細胞を浮遊させた。金属製スパチュラで混ぜることによってリゾチーム（白色鶏卵からの２５ｍｇのＳｉｇｍａＬ７６５１）をその細胞浮遊液に添加し、その浮遊液を室温で１時間インキュベートした。その浮遊液を氷で１５分間冷却し、その後、ＢｒａｎｓｏｎＳｏｎｉｆｉｅｒ２５０を使用して音波処理した（１分セッションを２回、５０％デューティサイクル、３０％アウトプット）。細胞溶解産物を顕微鏡検査によって点検した。追加の２５ｍｇのリゾチームを必要に応じて添加し、インキュベーション及び音波処理を繰り返した。細胞溶解が顕微鏡検査によって確認されたら、溶解産物を１１，５００×ｇで２５分間（４℃）遠心分離してＩＢペレットを形成し、上清を廃棄した。ＩＢペレットを１００ｍＬ溶解バッファに再浮遊させ、ハンドミキサーで均質化し、上記のように遠心分離した。上清が無色になり、ＩＢペレットが堅くなり、オフホワイトの色になるまで、そのＩＢペレットを（５０ｍＬ溶解バッファへの）再浮遊、音波処理及び遠心分離によって繰り返し洗浄した。最終洗浄については、２ｍＭＥＤＴＡを含有する滅菌濾過（０．２２μｍ）蒸留水にＩＢペレットを再浮遊させ、遠心分離した。２ｍＭＥＤＴＡを含有する滅菌濾過蒸留水に最終ペレットを再浮遊させ、１ｍＬアリコートを−８０℃で保存した。

実施例５
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び定量

ＩＢペレットの１ｍＬアリコートを解凍し、滅菌濾過蒸留水で１：２０希釈することによって、ＩＢ調製物中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び定量を行った。次に、その希釈サンプルを４×還元用サンプルバッファ［２５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、４０％グリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）及び８％ β−メルカプト−エタノール（ｖ／ｖ）］と共に沸騰させ、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン、１２＋２ウエルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に負荷し、１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で泳動させた。ゲルをおおよそ６０分間、２００ボルトで泳動させて、染色し、脱染し、その後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）手順を行った。同じゲルでのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）サンプル泳動についての濃度測定値を比較することによって標的バンドの定量を行って、Ｂｉｏ−ＲａｄＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して標準曲線を生成した。

実施例６
封入体の可溶化

（５０〜７０ｍｇ／ｍＬのＣｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１及びＣｒｙ３Ｂａ１タンパク質をそれぞれ含有する）Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｓ）クローンＭＲ１２５３、ＭＲ１６３６及びＭＲ８１６からの１０ｍＬの封入体浮遊液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆモデル５４１５Ｃ微量遠心管の最高設定（おおよそ１４，０００×ｇ）で遠心分離して、封入体をペレット化した。保存用バッファ上清を除去し、５０ｍＬコニカルチューブの中で、Ｃｒｙ３４Ａｂ１及びＣｒｙ３５Ａｂ１の両方については２５ｍＬの１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ３．０、及びＣｒｙ３Ｂａ１については１００ｍＭ炭酸ナトリウムバッファ、ｐＨ１１でそれぞれ置換した。ピペットを使用して封入体を再浮遊させ、ボルテックスにかけて徹底的に混合した。４℃で一晩、穏やかに揺動するプラットフォーム上にそれらのチューブを置いて、完全長Ｃｒｙ３４Ａｂ１、Ｃｒｙ３５Ａｂ１及びＣｒｙ３Ｂａ１タンパク質を抽出した。それらの抽出物を３０，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、得られた上清（可溶化された完全長Ｃｒｙタンパク質を含有する）を保存した。

実施例７
完全長プロトキシンのトランケーション

完全長Ｃｒｙ３５Ａｂ１及びＣｒｙ３Ｂａ１をキモトリプシン又はトリプシンでトランケート又は消化して、それらのタンパク質の活性形態であるキモトリプシン又はトリプシンコアフラグメントを生成した。具体的には、可溶化された完全長Ｃｒｙ３５Ａｂ１を、キモトリプシン（ウシ膵臓）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州Ｓｔ．）と共に（５０：１＝Ｃｒｙタンパク質：酵素、ｗ／ｗで）、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ３．０（実施例６）中、４℃で、穏やかに振盪しながら２〜３日間インキュベートし、その一方で、完全長Ｃｒｙ３Ｂａ１を、トリプシン（ウシ膵臓）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州Ｓｔ．）と共に（２０：１＝Ｃｒｙタンパク質：酵素、ｗ／ｗで）、１００ｍＭ炭酸ナトリウムバッファ、ｐＨ１１（実施例６）中、室温で、１〜３時間インキュベートした。完全タンパク質分解性プロセッシングをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した。完全長Ｃｒｙ３５Ａｂ１及びＣｒｙ３Ｂａ１の分子質量は、おおよそ４４ｋＤａに相当及びおおよそ５３ｋＤａに相当し、並びにそれらのキモトリプシン又はトリプシンコアは、おおよそ４０ｋＤａに相当及びおおよそ５５ｋＤａに相当した。Ｃｒｙ３５Ａｂ１の完全長及びキモトリプシンコアのアミノ酸配列をＳＥＱＩＤ１及びＳＥＱＩＤ２に提供し、並びにＣｒｙ３Ｂａ１の完全長及びトリプシンコアのアミノ酸配列をＳＥＱＩＤ３及びＳＥＱＩＤ４に提供する。キモトリプシンコアもトリプシンコアも、Ｃｒｙ３４Ａｂ１については入手できず、従って、完全長Ｃｒｙ３４Ａｂ１を結合アッセイに使用した。完全長Ｃｒｙ３４Ａｂ１のアミノ酸配列を、ＳＥＱＩＤ５として提供する。

実施例８
トランケートされた毒素の精製

キモトリプシン処理Ｃｒｙ３５Ａｂ１及びトリプシン処理Ｃｒｙ３Ｂａ１コアフラグメントを精製した。具体的には、消化反応物を３０，０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離して脂質を除去し、得られた上清を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心濾過装置（１０，０００分子量カットオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５倍濃縮した。その後、使い捨てＰＤ−１０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）又は透析を使用して、サンプルバッファを、Ｃｒｙ３４Ａｂ１及びＣｒｙ３５Ａｂ１の両方については２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ３．５に、並びにＣｒｙ３Ｂａ１については１０ｍＭＣＡＰＳ［３−（シクロヘキサアミノ）１−プロパンスルホン酸］、ｐＨ１０．５に変えた。ＡＴＫＡＥｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する精製のために対応するバッファを使用して最終容量を１５ｍＬに調整した。Ｃｒｙ３５Ａｂ１については、バッファＡは、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ３．５であり、バッファＢは、バッファＡ＋１ＭＮａＣｌ、ｐＨ３．５であった。ＨｉＴｒａｐＳＰ（５ｍＬ）カラム（ＧＥ）を使用した。バッファＡを使用してカラムを十分に平衡させた後、Ｃｒｙ３５Ａｂ１溶液をカラムに５ｍＬ／分の流量で注入した。１ｍＬ／画分で５ｍＬ／分での０〜１００％のバッファＢ勾配を使用して溶離を行った。Ｃｒｙ３Ｂａ１については、バッファＡは、１０ｍＭＣＡＰＳバッファ、ｐＨ１０．５であり、バッファＢは、１０ｍＭＣＡＰＳバッファ、ｐＨ１０．５＋１ＭＮａＣｌであった。ＣａｐｔｏＱ、５ｍＬ（５ｍＬ）カラム（ＧＥ）を使用し、すべての他の手順は、Ｃｒｙ３５Ａｂ１についてのものと同様であった。選択された画分の、最高品質の標的タンパク質を含有する画分をさらに選択するための、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後、それらの画分をプールした。精製Ｃｒｙ３５Ａｂ１キモトリプシンコアについては、上で説明したようにバッファを２０ｍＭＢｉｓｔ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．０と交換した。精製Ｃｒｙ３Ｂａ１トリプシンコアについては、使い捨てＰＤ−１０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）又は透析を使用してその塩を除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＢＳＡを標準物質として用いるＴｙｐｈｏｏｎ画像形成システム（ＧＥ）分析を用いて定量した後、サンプルを、後の結合アッセイのために４℃で保存した。

実施例９
ＢＢＭＶ調製

昆虫の刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）調製物を、Ｃｒｙ毒素受容体結合アッセイのために広範に使用した。本発明において使用するＢＢＭＶ調製物は、Wolferberger et al.(1987)によって記載された方法を用いて第３齢のウエスタンコーンルートワーム（ジアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａｖｉｒｇｉｆｅｒａｖｉｒｇｉｆｅｒａ）ＬｅＣｏｎｔｅ）の単離された中腸から調製した。ロイシンアミノペプチダーゼを前記調製物中の膜タンパク質のマーカーとして使用し、以前に記載されているように(Li et al.2004a)、粗製ホモジネート及びＢＢＭＶ調製物のロイシンアミノペプチダーゼ活性を判定した。ブラッドフォード法（１９７６）を用いて、ＢＢＭＶ調製物のタンパク質濃度を測定した。

実施例１０
^１２５Ｉ標識

飽和及び同種競合結合アッセイのために、^１２５Ｉを使用して精製完全長Ｃｒｙ３４Ａｂ１、キモトリプシン処理Ｃｒｙ３５Ａｂ１、及びトリプシン処理Ｃｒｙ３Ｂａ１を標識した。放射標識がＣｒｙ毒素の生物活性を無効にしないことを保証するために、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＩｏｄｉｎａｔｉｏｎＢｅａｄｓ（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）の指示書に従うことによりＮａＩを使用して低温ヨウ素標識化を行った。バイオアッセイの結果は、ヨウ素標識化Ｃｒｙ３５Ａｂ１キモトリプシンコアがウエスタンコーンルートワームの幼虫に対して依然として活性であるが、ヨウ素標識化がＣｒｙ３４Ａｂ１を不活性化することを示した。昆虫ＢＢＭＶへの放射標識^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３４Ａｂ１の特異的結合を検出することができず、それ故、Ｃｒｙ３４Ａｂ１の膜受容体結合を評定するために別の標識方法を必要とした。トリプシン処理Ｃｒｙ３Ｂａ１は、ウエスタンコーンルートワームに対して限られた活性を有し、それ故、低温ヨウ素標識化Ｃｒｙ３Ｂａ１トリプシンコアを使用するコーンルートワームに関するバイオアッセイは、活性変化を評定することが難しいと考えられた。加えて、ＢＢＭＶへの^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３Ｂａ１の特異的結合は、レベルが低くかったとしても検出された。Ｃｒｙ３Ｂａ１の低温ヨウ素標識化及びその毒性アッセイを省略した。放射標識^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１及び^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３Ｂａ１を、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＩｏｄｉｎａｔｉｏｎＢｅａｄｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）及びＮａ^１２５Ｉでのヨウ素標識化によって得た。Ｚｅｂａ（商標）ＤｅｓａｌｔＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ヨウ素標識化タンパク質から取り込まれない又は遊離１２５Ｉを除去した。ヨウ素標識化Ｃｒｙタンパク質の比放射能は、１〜５ｕＣｉ／ｕｇの範囲であった。標識及び結合アッセイの多数のバッチを行った。

実施例１１
飽和結合アッセイ

以前に記載されているように(Li et al. 2004b)、^１２５Ｉ標識Ｃｒｙ毒素を使用して特異的又は飽和結合アッセイを行った。昆虫ＢＢＭＶへのＣｒｙ３５Ａｂ１及びＣｒｙ３Ｂａ１の特異的結合を判定するため並びに結合親和性（解離定数、Ｋｄ）及び結合部位濃度（Ｂｍａｘ）を推定するために、一連の漸増濃度の^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１又は^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３Ｂａ１いずれかを、それぞれ、所与の濃度（０．１ｍｇ／ｍＬ）の昆虫ＢＢＭＶと共に、０．１％ＢＳＡを補足した１５０ｕＬの２０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．０、１５０ｍＭＫＣｌ中、室温で１時間、穏やかに振盪させながらインキュベートした。２０，０００×ｇで、室温で８分間の遠心分離により、浮遊液中の遊離毒素から、ＢＢＭＶに結合した毒素を分離した。０．１％ＢＳＡを含有する９００ｕＬの同じバッファ（氷冷）でそのペレットを２回洗浄した。ペレットに残存する放射能をＣＯＢＲＡＩＩＡｕｔｏ−Ｇａｍｍａｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ、ａＣａｎｂｅｒｒａｃｏｍｐａｎｙ）で測定し、全結合を考究した。別の系列の結合反応を並行して準備し、ＢＢＭＶのすべての特異的結合部位を完全に占有するように５００〜１０００倍過剰の対応する非標識毒素を結合反応のそれぞれに含め、それを使用して非特異的結合を判定した。全結合から非特異的結合を引くことによって、特異的結合を推定した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を実行することにより、使用した標識毒素の濃度に対する特異的結合を用いてこれらの毒素のＫｄ及びＢｍａｘ値を推定した。ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ又はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアのいずれかを使用して、チャートを作成した。実験を少なくとも４回繰り返し、結果を図１Ａ（ＢＢＭＶへの^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の結合）及び図１Ｂ（ＢＢＭＶへの^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３Ｂａ１の結合）のグラフにプロットした。これらの結合実験は、１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１と１２５Ｉ−Ｃｒｙ３Ｂａ１の両方がＢＢＭＶに特異的に結合できることを明示した（図１Ａ及び１Ｂ）。^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１及び^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３Ｂａ１は、結合親和性、それぞれ、Ｋｄ＝１１．６６±１１．４４、７．３５±３．８１（ｎＭ）、及び結合部位濃度、それぞれ、Ｂｍａｘ＝０．７８±０．４６、０．５５±０．１３（ｐｍｏｌｅ／ｍｇＢＢＭＶ）を有した。

^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の特異的結合を非標識Ｃｒｙ３４Ａｂ１の存在時に行った（１：５０＝^１２５−Ｃｒｙ３５Ａｂ１：Ｃｒｙ３４Ａｂ１、モル比）。^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の特異的結合が飽和されなかった（図２）ので、結合パラメータ（Ｋｄ及びＢｍａｘ）は得られなかった。しかし、^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の特異的結合は、非標識Ｃｒｙ３４Ａｂ１の存在時に全結合のおおよそ９０％を占めた。

実施例１２
競合結合アッセイ
Ｃｒｙ３４Ａｂ１及びＣｒｙ３５Ａｂ１が別々に、加えて二成分毒素としてそれらの混合物が、Ｃｒｙ３Ｂａ１と同じセットの結合部位を共有するかどうかを判定するために、競合結合アッセイを行った。Ｃｒｙ３Ｂａ１の同種競合結合アッセイのために、漸増量（０〜２．５００ｎＭ）の非標識Ｃｒｙ３Ｂａ１を、先ず、５ｎＭ ^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３Ｂａ１と混合し、その後、それぞれ、０．１ｍｇ／ｍＬの昆虫ＢＢＭＶと共に室温で１時間インキュベートして、ＢＢＭＶ上の推定受容体についてそれらを競合させた。同様に、５ｎＭ ^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１を非標識Ｃｒｙ３４Ａｂ１の不在下又は存在時に（１：５０＝^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１：Ｃｒｙ３４Ａｂ１、モル比）及び０．０３ｍｇ／ｍＬのＢＢＭＶと共にそれぞれ用いて、Ｃｒｙ３５Ａｂ１同種競合を完了した。ＢＢＭＶに結合した^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３Ｂａ１又は^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の百分率を、それぞれの反応について、非標識競合物不在時の最初の全（又は特異的）結合と比較して決定した。

^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１と非標識Ｃｒｙ３Ｂａ１の間の異種競合結合アッセイを非標識Ｃｒｙ３４Ａｂ１不在又は存在時に行って、それらが同じセットの結合部位を共有するかどうかを特定した。これは、競合物としての非標識Ｃｒｙ３Ｂａ１の量を増加させて、^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１単独又は^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１＋Ｃｒｙ３４Ａｂ１（１：５０＝^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１：Ｃｒｙ３４Ａｂ１、モル比）と結合について競合させることによって達成した。同様に、相互異種競合結合アッセイも行い、これは、非標識Ｃｒｙ３Ｂａ１と結合について競合するように反応に含める１つ又は２つの競合物として、別々に非標識Ｃｒｙ３５Ａｂ１及びＣｒｙ３４Ａｂ１、又はＣｒｙ３５Ａｂ１＋Ｃｒｙ３４Ａｂ１（１：５０＝Ｃｒｙ３５Ａｂ１：Ｃｒｙ３４Ａｂ１、モル比）混合物の量を増加させることによって達成した。この実験を少なくとも３回繰り返し、結果を図３Ａ（単独の^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂの結合パーセント）及び図３Ｂ（Ｃｒｙ３４Ａｂ１の存在下での^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の結合パーセント）のグラフにプロットした。

これらの実験結果は、Ｃｒｙ３４Ａｂ１の存在（図３Ａ）又は不在（図３Ｂ）に関係なく、Ｃｒｙ３５Ａｂ１が^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の特異的結合を競合除去（ｃｏｍｐｅｔｅｏｆｆ）できることを明示していた。しかし、Ｃｒｙ３Ｂａ１は、Ｃｒｙ３４Ａｂ１の不在時にも、存在時にも、^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３５Ａｂ１の特異的結合を競合除去することができなかった。相互競合結合アッセイにおいて、Ｃｒｙ３Ｂａも全結合の２０％を超えてそれ自体を置換することができ、これは、特異的結合がほんの小率しか占めない（図１Ｂ参照）ため、それがその特異的結合を完全に競合除去することを反映している。しかし、単独でのＣｒｙ３４Ａｂ１又はＣｒｙ３５Ａｂ１も、Ｃｒｙ３５Ａｂ１＋Ｃｒｙ３４Ａｂ１の混合物（１：１０）も、^１２５Ｉ−Ｃｒｙ３Ｂａ１を置換することができなかった。これらのデータは、Ｃｒｙ３５Ａｂ１単独又はＣｒｙ３５Ａｂ１＋Ｃｒｙ３４Ａｂ１の混合物がＣｒｙ３Ｂａ１と受容体結合部位を共有しないことを示していた。
参考文献
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米国特許出願第２００８００５８２６２号, 2008. rPA optimization.

Claims

Ｃｒｙ３４Ａｂタンパク質、Ｃｒｙ３５Ａｂタンパク質及びＣｒｙ３Ｂａ殺虫タンパク質を生産するトランスジェニック植物であって、前記Ｃｒｙ３５Ａｂタンパク質が、配列番号１および配列番号２からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一であり、前記Ｃｒｙ３Ｂａ殺虫タンパク質が、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一であり、前記Ｃｒｙ３４Ａｂタンパク質が、配列番号５と少なくとも９５％同一である、トランスジェニック植物。
Ｃｒｙ３Ａａ及びＣｒｙ６Ａａからなる群より選択される第四の殺虫タンパク質をさらに生産する、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
前記ＤＮＡを含む、請求項１から２のいずれかに記載の植物の種子。
非Ｂｔリフュージ植物からのリフュージ種子と請求項３に記載の複数の種子とを含む種子の混合物であって、前記リフュージ種子が前記混合物中のすべての種子の４０％未満を構成する、種子の混合物。
前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の３０％未満を構成する、請求項４に記載の種子の混合物。
前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の２０％未満を構成する、請求項４に記載の種子の混合物。
前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の１０％未満を構成する、請求項４に記載の種子の混合物。
前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の５％未満を構成する、請求項４に記載の種子の混合物。
請求項３に記載の複数の種子を含む種子袋又は容器であって、ゼロのリフュージ種子を含む、袋又は容器。
前記植物が、とうもろこし植物である、請求項１から２のいずれかに記載の植物。
前記Ｃｒｙ３５Ａｂタンパク質が、配列番号１及び配列番号２からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一であり、前記Ｃｒｙ３Ｂａ殺虫タンパク質が、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一であり、並びに前記Ｃｒｙ３４Ａｂタンパク質が、配列番号５と少なくとも９５％同一である、請求項１から２のいずれかに記載の植物の植物細胞。
前記Ｃｒｙ３５タンパクＡｂ質が、配列番号１及び配列番号２からなる群より選択される配列を含み、前記Ｃｒｙ３Ｂａ殺虫タンパク質が、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択される配列を含み、並びに前記Ｃｒｙ３４Ａｂタンパク質が、配列番号５を含む、請求項１から２のいずれかに記載の植物。
ルートワーム昆虫を防除する方法であって、前記昆虫を請求項１に記載のトランスジェニック植物と接触させることによる方法。