JP5913181B2 - スクレロスチンに対する抗体の使用のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、スクレロスチンに対する抗体ならびにスクレロスチンにより仲介される病的障害または骨異常に関連する疾患、例えば、骨粗鬆症の処置における該抗体の使用のための組成物および方法に関する。
SOST遺伝子は、213個のアミノ酸からなる分泌型糖タンパク質であるスクレロスチンタンパク質をコードする。スクレロスチンは、システインノット含有因子のスーパーファミリーのメンバーである。スクレロスチンは、DAN/Cerberusタンパク質ファミリーに関連し、BMPとその受容体との結合を阻害し、その結果、BMPシグナル伝達カスケードを阻害することにより、直接BMPシグナル伝達を阻害する(Avsian-Kretchmer, Mol Endocrinol 2004, 18(1):1-12)。
本明細書に記載された本発明の1つの態様は、スクレロスチンポリペプチド(配列番号155)を標的とする抗体または該抗体の抗原結合部分を含む機能性タンパク質であって、哺乳類でスクレロスチンポリペプチドに特異的に結合し、骨形成、骨塩密度、骨塩量、骨量、骨質および骨強度を増加させ得る、抗体または機能性タンパク質を提供する。
本発明は、スクレロスチンと特異的に結合し、スクレロスチンの機能特性を阻害する単離抗体、特に、ヒト抗体に関する。ある態様において、本発明の抗体は、特定の重鎖および軽鎖配列に由来し、および/または特定のアミノ酸配列を含むCDR領域のような特定の構造特徴を含む。本発明は、単離抗体、該抗体を製造する方法、該抗体を含む免疫抱合体および多価もしくは多特異的分子、ならびに本発明の抗体、免疫抱合体もしくは二重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、スクレロスチン発現の存在と関連する障害もしくは状態を阻害すること、例えば、スクレロスチンにより仲介されるか、もしくは増加したレベルのスクレロスチンと関連する病的障害、例えば、骨関連疾患、例えば、骨粗鬆症の処置において、該抗体を使用する方法に関する。
本発明の抗体は、実施例に記載されたとおり単離されたヒトモノクローナル抗体を含む。本発明の単離抗体のVHアミノ酸配列は、配列番号69-77に示されている。本発明の単離抗体のVLアミノ酸配列は、各々、配列番号80-88に示されている。本発明の抗体の対応する好ましい全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号113-121に示されている。本発明の抗体の対応する好ましい全長軽鎖アミノ酸配列は、各々、配列番号124-132に示されている。本発明の他の抗体は、突然変異しているが、上記の配列で示されたCDR領域と、CDR領域で少なくとも60%、70%、80%、90%または95%もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸を含む。ある態様において、本発明は、1個以下、2個以下、3個以下、4個以下もしくは5個以下のアミノ酸が、上記の配列で示されたCDR領域と比較してCDR領域で突然変異している突然変異アミノ酸配列を含む。
(i) 哺乳類細胞での発現のために最適化された配列番号113-121からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長重鎖;
および哺乳類細胞での発現のために最適化された配列番号124-132からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離モノクローナル抗体; または
(ii) その抗原結合部分を含む、機能性タンパク質。
(i) 哺乳類細胞での発現のために最適化された配列番号135-143からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む全長重鎖;
および哺乳類細胞での発現のために最適化された配列番号146-154からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む全長軽鎖を有する単離モノクローナル抗体; または
(ii) その抗原結合部分を含む、機能性タンパク質。
また他の態様において、本発明の抗体は、本明細書に記載された抗体のアミノ酸およびヌクレオチド配列に相同な全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列; 全長重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列、可変領域重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列、または可変領域重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有し、ここで、該抗体は、本発明の抗スクレロスチン抗体の望まれる機能特性を保持する。
ある態様において、本発明の抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびにCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を有し、ここで、1種もしくはそれ以上のこれらのCDR配列が、本明細書に記載された抗体に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を有し、該抗体は、本発明の抗スクレロスチン抗体の望まれる機能特性を保持する。したがって、本発明は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびにCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域からなる単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を含む機能性タンパク質を提供し、ここで、該重鎖可変領域CDR1アミノ酸配列は、配列番号1-11およびその保存的修飾からなる群から選択され、該重鎖可変領域CDR2アミノ酸配列は、配列番号12-22およびその保存的修飾からなる群から選択され、該重鎖可変領域CDR3アミノ酸配列は、配列番号23-33およびその保存的修飾からなる群から選択され、該軽鎖可変領域CDR1アミノ酸配列は、配列番号34-44およびその保存的修飾からなる群から選択され、該軽鎖可変領域CDR2アミノ酸配列は、配列番号45-55およびその保存的修飾からなる群から選択され、該軽鎖可変領域CDR3アミノ酸配列は、配列番号56-66およびその保存的修飾からなる群から選択され、該抗体は、スクレロスチンに特異的に結合し、少なくとも1個の下記の機能特性を示す: 該抗体は、細胞に基づくWntシグナル伝達アッセイにおいて、スクレロスチンの阻害効果を妨害するか、細胞に基づく石灰化アッセイにおいて、スクレロスチンの阻害効果を妨害するか、またはSmad1リン酸化アッセイにおいて、スクレロスチンの阻害効果を妨害するか、またはスクレロスチンのLRP-6への結合を阻害するか、または骨形成および骨量および骨密度を増加させる。
他の態様において、本発明は、本明細書に記載された本発明のさまざまな特異的抗スクレロスチン抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
(i) 細胞に基づくWntシグナル伝達アッセイにおいて、スクレロスチンの阻害効果を妨害すること;
(ii) 細胞に基づく石灰化アッセイにおいて、阻害効果を妨害すること;
(iii) スクレロスチンのLRP-6への結合を阻害すること; および
(iv) 骨形成および骨量および骨密度を増加させること
を可能にする実施例に記載された抗体のすべてが、スクレロスチンの同じエピトープに高親和性をもって結合する(ここで、該エピトープは、配列番号156および配列番号157からのアミノ酸を含む立体構造エピトープである)ことが見出されたのは、実際に驚くべきことである。任意の特定のモデルにより拘束されることなく、アミノ酸配列配列番号156および配列番号157は、本発明の抗体により認識されるスクレロスチンポリペプチドの1つの立体構造エピトープ領域を示すことが本明細書で示されている。
本発明の抗体はさらに、修飾抗体を作製するために、本明細書で示される1種もしくはそれ以上のVHおよび/またはVL配列を有する抗体を出発物質として用いて作製され得て、ここで、該修飾抗体は、出発抗体からの改変された特性を有し得る。抗体は、1種もしくはそれ以上の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内、例えば、1種もしくはそれ以上のCDR領域内、および/または1種もしくはそれ以上のフレームワーク領域内の1種もしくはそれ以上の残基を修飾することにより改変され得る。さらに、抗体は、例えば、本発明のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することにより改変され得る。
生じたポリペプチドが、スクレロスチンに特異的に結合する少なくとも1個の結合領域を含む限りにおいて、さまざまな抗体/免疫グロブリンフレームワークもしくはスカホールが使用され得る。そのようなフレームワークもしくはスカホールドは、ヒト免疫グロブリンの5個の主要なイディオタイプ、またはその断片(例えば、本明細書の他の場所で開示されたもの)を含み、他の動物種の免疫グロブリンを含み、好ましくは、ヒト化されたものを有する。単一重鎖抗体、例えば、ラクダにおいて同定されたものは、この点で特に関心がある。新規フレームワーク、スカホールドおよび断片は、当業者により発見され、開発され続けている。
新種メンバー(new world members)、例えば、ラマ種(Lama paccos, Lama glamaおよびLama vicugna)を含む、ラクダおよびヒトコブラクダ(Camelus bactrianusおよびCamelus dromaderius)ファミリーのメンバーから得られた抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性およびヒト対象についての抗原性に関して特徴づけられている。実際に見出された哺乳類のこのファミリー由来の特定のIgG抗体は、軽鎖を欠いており、その結果、他の動物由来の抗体について2個の重鎖および2個の軽鎖を有する一般的な4個の鎖からなる四次構造とは構造的に異なっている。PCT/EP93/02214(1994年3月3日に公開されたWO 94/04678)を参照のこと。
既知の非免疫グロブリンフレームワークもしくはスカホールドは、Adnectins (フィブロネクチン) (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd (Cambridge, MA)およびAblynx nv (Zwijnaarde, Belgium))、リポカリン(Anticalin) (Pieris Proteolab AG, Freising,Germany)、小型モジュラー免疫薬剤(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディ(Avidia, Inc. (Mountain View, CA))、Protein A (Affibody AG, Sweden)ならびにアフィリン(γ-クリスタリンまたはユビキチン) (Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)、タンパク質エピトープ模倣剤(Polyphor Ltd, Allschwil, Switzerland)を含むが、これらに限定されない。
アドネクチンスカホールドは、III型フィブロネクチンドメイン(例えば、III型フィブロネクチンの10番目のモジュール(10 Fn3ドメイン))に基づく。III型フィブロネクチンドメインは、2つのβシート間に分布し、それ自身互いを包み込んでタンパク質のコアを形成する7個もしくは8個のβ鎖を有し、さらに互いにβ鎖を連結し、溶媒に曝されるループ(CDRに類似した)を含む。βシートサンドウィッチの各末端に、少なくとも3つのループが存在し、ここで、該末端は、β鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である(米国特許第6,818,418号)。
該技術は、可変領域を保持するためのスカホールドとして、アンキリン由来リピートモジュールを有するタンパク質を用いることに基づき、異なる標的への結合のために使用され得る。アンキリンリピートモジュールは、2つの逆平行鎖αヘリックスおよびβターンからなる33個のアミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、主に、リボソームディスプレイを用いて最適化される。
Avimersは、天然のAドメイン含有タンパク質、例えば、LRP-1に由来する。これらのドメインは、もともと、タンパク質-タンパク質相互作用のために使用され、ヒトにおいては、250を超えるタンパク質が、構造的にAドメインに基づく。Avimersは、アミノ酸リンカーにより結合した多くの異なる“Aドメイン”モノマー(2-10)からなる。Avimersは、例えば、20040175756; 20050053973; 20050048512; および20060008844に記載された方法論を用いて、標的抗原に結合し得るように作製され得る。
Affibody(登録商標)親和性リガンドは、Protein AのIgG結合ドメインのうちの1つのスカホールドに基づいて、3個のヘリックスバンドルからなる小さくて単純なタンパク質である。Protein Aは、細菌Staphylococcus aureus由来の表面タンパク質である。このスカホールドドメインは、58個のアミノ酸からなり、そのうちの13個は、多くのリガンド変異型を有するAffibody(登録商標)ライブラリーを作製するために無作為化される(例えば、米国特許第5,831,012号を参照のこと)。Affibody(登録商標)分子は、抗体を模倣し、それらは、150 kDaの分子量である抗体と比較して、6 kDaの分子量を有する。その小サイズにも関わらず、Affibody(登録商標)分子の結合部位は、抗体のそれに類似している。
Anticalins(登録商標)は、Pieris ProteoLab AG社により開発された製品である。それらは、通常、化学的に感受性があるか、もしくは不可溶性の化合物の生理学的輸送もしくは貯蔵に関与する、小さくて強固なタンパク質の広範な集団であるリポカリンに由来する。いくつかの天然のリポカリンは、ヒトの組織もしくは体液中に生じる。
アフィリン(商標)分子は、タンパク質および小分子に対する特異的な親和性について設計された非免疫グロブリンタンパク質である。新規アフィリン(商標)分子は、異なるヒト由来スカホールドタンパク質に基づく2つのライブラリーから迅速に選択され得る。
PEMは、タンパク質のβヘアピン二次構造を模倣する中程度のサイズ、環状、ペプチド様分子(MW 1-2kDa)であり、主な二次構造は、タンパク質-タンパク質相互作用に関与する。より一般には、開示された抗体のエピトープの3D構造を模倣するすべてのポリペプチドは、本発明の一部である。好ましい態様は、少なくとも下記のポリペプチドE1-L-E2を含む30-100個のアミノ酸のポリペプチドであり、ここで、E1は、配列番号156であり、E2は、配列番号157であり、Lは、E1およびE2が本発明の抗体により認識される領域の3D構造を再構築するのを可能にするポリペプチドリンカーである。好ましい態様によると、Lは、グリシンもしくはセリンアミノ酸から選択される10-20個のアミノ酸からなるリンカーである。好ましくは、リンカーLは、ペプチドGGGSGGGGSGGGG(配列番号X/配列番号158)またはGGGGSGGGGSGGGGSGGGG(配列番号Y/配列番号159)を含み、より好ましくは、リンカーLは、本質的に、配列番号Xまたは配列番号Yからなる。
本発明の改変抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、修飾がVHおよび/またはVL内のフレームワーク残基でなされているものを含む。一般には、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるようになされる。例えば、1つの方法は、1種もしくはそれ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列に“復帰突然変異させる”ことである。より特には、体細胞突然変異を受けた抗体は、該抗体が由来する生殖細胞系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を該抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定され得る。フレームワーク領域配列を生殖細胞系列構成に戻すために、例えば、部位特異的突然変異誘発もしくはPCR仲介突然変異誘発により、体細胞突然変異を生殖細胞系列配列に“復帰突然変異させる”ことが可能である。そのような“復帰突然変異”抗体はまた、本発明に包含されることが意図される。
上記したとおり、本明細書で示されるVHおよびVL配列または全長重鎖および軽鎖を有する抗スクレロスチン抗体は、全長重鎖および/または軽鎖配列、VHおよび/またはL配列、またはそこに結合した定常領域を修飾することにより、新規抗スクレロスチン抗体を作製するために使用され得る。したがって、本発明の他の局面において、本発明の抗スクレロスチン抗体の構造的な特徴は、本発明の抗体の少なくとも1種の機能的特性を保持する(例えば、ヒトスクレロスチンに結合し、また、1種もしくはそれ以上のスクレロスチンの機能的特性を阻害する(例えば、受容体結合、骨溶解の予防もしくは軽減))、構造的に関連する抗スクレロスチン抗体を作製するために使用される。
本発明の他の局面は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。全長軽鎖親ヌクレオチド配列の例は、配列番号144-145に示されている。全長重鎖親ヌクレオチド配列の例は、配列番号133-134に示されている。哺乳類細胞での発現のために最適化された全長軽鎖ヌクレオチド配列の例は、配列番号146-154に示されている。哺乳類細胞での発現のために最適化された全長重鎖ヌクレオチド配列の例は、配列番号135-143に示されている。
モノクローナル抗体(mAb)は、慣用的なモノクローナル抗体手法、例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含むさまざまな技術により作製され得る。モノクローナル抗体を作製するための多くの技術、例えば、Bリンパ球のウイルス性もしくは発癌性形質転換が使用され得る。
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化マウス由来の脾細胞および/またはリンパ節細胞が単離され得て、適当な不死化細胞株、例えば、マウス骨髄腫細胞株と融合され得る。生じたハイブリドーマは、抗原特異的抗体の産生のためにスクリーニングされ得る。例えば、免疫化マウス由来の脾臓リンパ細胞の単一細胞懸濁物を、50% PEGを用いて、6分の1の数のP3X63-Ag8.653非分泌性マウス骨髄腫細胞(ATCC, CRL 1580)と融合させることができる。細胞を、平底マイクロタイタープレートに、約2 x 145で播種し、その後、20% 胎児クローン血清(fetal Clone Serum)、18% “653”条件培地、5% origen (IGEN)、4 mM L-グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、50 ユニット/mlペニシリン、50 mg/ml ストレプトマイシン、50 mg/ml ゲンタマイシンおよび1X HAT (Sigma; HATは、融合の24時間後に添加される)を含む選択培地で、2週間インキュベートする。約2週間後、HATをHTで置換した培地で細胞を培養し得る。次いで、個々のウェルを、ヒトモノクローナルIgMおよびIgG抗体について、ELISAによりスクリーニングし得る。広範なハイブリドーマ増殖が生じると、通常、10-14日後に培地を観察することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、ヒトIgGについてなお陽性であるとき、モノクローナル抗体は、少なくとも2回の限界希釈によりサブクローン化され得る。その後、安定なサブクローンは、特徴づけのために、組織培養培地中に少量の抗体を産生するように、インビトロで培養され得る。
本発明の抗体はまた、例えば、当分野で既知である組み換えDNA技術および遺伝子導入法の組み合わせを用いて、宿主細胞形質転換体で産生され得る(例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
他の局面において、本発明は、本発明の抗スクレロスチン抗体またはその断片を含む、二重特異性もしくは多特異的分子に関する。本発明の抗体またはその抗原結合領域を誘導体化させるか、または他の機能性分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、他の抗体もしくは受容体のためのリガンド)と結合させて、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を作製することができる。本発明の抗体を実際に誘導体化させるか、または2種以上の他の機能性分子と結合させて、3種以上の異なる結合部位および/または標的分子に結合する多特異的分子を作製することができ; そのような多特異的分子はまた、本明細書で使用される“二重特異性分子”なる用語に包含されることが意図される。本発明の二重特異性分子を作製するために、本発明の抗体を、1種もしくはそれ以上の他の結合分子、例えば、他の抗体、抗体断片、ペプチドもしくは結合模倣剤と機能的に結合させることができ(例えば、化学的カップリング、遺伝学的融合、非共有結合または別の方法で)、その結果、二重特異性分子が生じる。
他の局面において、本発明は、スクレロスチンに結合する本発明の抗体の少なくとも2個の同一または異なる抗原結合部分を含む、多価化合物を提供する。好ましくは、スクレロスチンの三量体の性質を考慮すると、本発明の化合物は、少なくとも3個もしくは4個の抗体の抗原結合部分を提供する。抗原結合部分は、タンパク質融合または共有もしくは非共有結合により結合することが可能である。あるいは、結合方法は、バイスペシフィック分子について記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体の架橋抗体を、本発明の抗体の定常領域、例えば、Fcもしくはヒンジ領域に結合する抗体と架橋させることにより取得され得る。
他の局面において、、本発明は、組成物、例えば、薬学的に許容される担体と共に製剤される、モノクローナル抗体、もしくはその抗原結合部分(複数もある)の1種もしくはその組み合わせを含む、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、本発明の抗体もしくは免疫抱合体もしくは二重特異性分子の1種もしくはその組み合わせ(例えば、2種もしくはそれ以上の異なるもの)を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、もしくは相補的な活性を有する抗体の組み合わせを含み得る。
本発明の抗体は、インビトロおよびインビボ診断的および治療的利用を有する。例えば、これらの分子は、さまざまな障害を処置、予防もしくは診断するために、培養細胞に、例えば、インビトロもしくはインビボで、または対象に、例えば、インビボで投与され得る。本明細書で使用される“対象”なる用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。非ヒト動物は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。
機能アッセイ
アルカリホスファターゼアッセイ(ALP)
細胞
MC3T3 1b細胞は、OSE2-lucを発現するMC3T3-JP細胞のクローンである。このクローンは、pcDNA3.1+中の8x-OSE2wt-mOG2lucを用いた、MC3T3-JP (MC3T3-E1マウス骨芽細胞, Japan clone, Jp; Dr. T. Kokkubo, Novartis, Japanからの贈与)の安定なトランスフェクション後に取得された。
MC3T3-1b細胞を、一般に、10% ウシ胎児血清(FCS; Amimed Cat#2-01F100-I)、2 mM L-グルタミン(Gibco Cat#25030-024)、50 IU ペニシリン/50 μg/ml ストレプトマイシン(Amimed Cat#4-01F00-H)および10mM Hepes (Gibco Cat#15630-056)ならびに0.75 mg/ml G418 (Gibco Cat#10131-027)を補充した最小必須培地α(MEMα; Invitrogen, Cat#22561-021)(維持培養培地)で培養した。
DMEM-LG中の10 mM アスコルビン酸(Wako Pure Chemical Cat#013-12061)、5 mM 酢酸中の14 nM BMP-2 (R&D Cat#355-BM-010)および0.1% ウシ血清アルブミン(BSA, Sigma Cat#A-8806); Tyrode溶液中の1 M β-グリセロリン酸(Sigma Cat#G9891); Tyrode溶液: 1L H2O中の9.72g Tyrode塩(Sigma Cat#T2145)および1g NaHCO3、ALP基質バッファー: 25mM グリシンおよび0.5mM MgCL2、pH 10.5 ; ALP基質溶液: 3.75ml ALP基質バッファー中の5mg p-ニトロフェニルリン酸(Sigma 104 substrate, Sigma Cat#50942-200TAB)、pH 10.5; ALP基質溶液中の1 mM p-ニトロフェノール(Sigma Cat#104-1)。
ALPアッセイについて、MC3T3 1b細胞を、アッセイ培養培地(G418を含まない維持培養培地に相当する)で増殖させた。MC3T3 1bを、誘導が72時間後に開始されるとき3x104 細胞/mlで、誘導が96時間後に開始されるとき2x104 細胞/mlで、200 μlで播種した。プレートを、37℃、5% CO2で、72時間もしくは96時間インキュベートし、その後、完全培地(10mM b-グリセロリン酸(bGP)および50μM アスコルビン酸(AA)で培養培地を補充した)を用いて誘導を開始した。試験される抗体を完全培地で希釈した。BMP-2 (0.7 nM)およびスクレロスチン(50 nM)と共に、抗体を、200μlの完全培地の最終量でウェルに加えた(トリプリケート)。各々のプレートについて、下記の4つの内部コントロールを、トリプリケートでインキュベートした: 溶媒コントロール(BSA)、BMP-2コントロール(0.7 nM)、BMP-2 + スクレロスチン(BMP-2 (0.7 nM)およびスクレロスチン(50 nM))ならびにスクレロスチンコントロール(50 nM)。プレートを、37℃、5% CO2で、さらに72時間インキュベートした。誘導期間の最後に、培地を除去し、各ウェルに150μlのALP 基質溶液(新たに調製された)を加えることにより、アッセイを終結させた。プレートを、3 - 30分間、インキュベートした。100 μlの1M NaOHを加えて、反応を停止させ、プレートをPlateshakerで振とうさせた。ODを、405nmで、ブランクに対して読み取り、ALP活性を、nmol/分で計算した。BMP-2[0.7 nM BMP-2]誘導ALP産生の少なくとも70%阻害を得るために、50 nM スクレロスチンが使用された。
このアッセイは、スクレロスチンがSTFレポーター遺伝子のWnt1仲介誘導を阻害する能力に基づいて抗体を試験するために確立された。
1日目に、HEK293細胞を、10% ウシ胎児血清(FCS)、1% L-グルタミン(Gibco, Cat #25030.024)、1% 非必須アミノ酸(Gibco, cat #11140)を含むが、抗生物質を含まないDMEM (Gibco, Cat#61965-026)中、24ウェル ポリ-D-リジンプレート(BD-BioCoat #356414)のウェルあたり1.3 - 1.4 x 105 細胞(0.5mlの量で)で播種した。2日目に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat#11668-019)を用いて、トランスフェクションを行った。トランスフェクションされる各ウェルについて、下記の量のプラスミドを、50μlの最終量のOptiMEM(登録商標)I (Gibco, Cat#31985-047)に加えた: コントロールウェルについて(pcDNA3+, 480 ng; SuperTopFlash (STF) 20 ng; phRL-CMV, 0.5 ng)およびWnt1処理ウェルについて(pcDNA-wnt1, 20 ng; pcDNA3+, 460 ng; SuperTopFlash (STF) 20 ng; phRL-CMV, 0.5 ng)。
用量阻害曲線を確立するために、10% FCS、1% L-グルタミンおよび1% 非必須アミノ酸を含むが、抗生物質を含まないDMEM中に一連のrhSOSTの二倍希釈を調製し、160nMで開始した。ストックrhSOSTの濃度は、1% FCSを含むDMEM中に260μg/mlであった。一般に、各条件をデュプリケートで試験した。したがって、各条件について1mlの培地を調製し、ウェルからトランスフェクション混合物を含む培地を除去した後、ウェルあたり450μlを加えた。処理時間は、18-20時間であった。インキュベーションの終了後、ルシフェラーゼアッセイを下記したとおりに行った。
前もって抗体をSOSTと混合した後、細胞に加えた。この目的のために、20〜30nMのrhSOSTを含むDMEM培地(10% FCS、1% L-グルタミンおよび1% 非必須アミノ酸(抗生物質は含まない))を調製した。次いで、異なる希釈の試験抗体を、実験デザインに応じて、培地を含むSOSTに加えた。これらの混合物を、処理の40分前に調製した。各条件を、通常、デュプリケートで試験した。そうするために、各条件について1mlの培地を調製し、ウェルからトランスフェクション混合物を含む培地を除去した後、ウェルあたり450μlを加えた。処理時間は、18-20時間であった。インキュベーションの終了後、ルシフェラーゼアッセイを下記したとおりに行った。
インキュベーションの終了後、培地を除去し、300μlの1X Passive Lysis Buffer (Promega, Cat#E194A)を溶解細胞に加えた。次いで、ルシフェラーゼ活性を、30μlのライセートを用いて、Dual-Glo Luciferase System (Promega, Cat#E2940)で測定した(デュプリケート)。アッセイは、キットで提供された取扱説明書にしたがって行われた。一般には、30μlのDual-Gloルシフェラーゼ(ホタルルシフェラーゼ; STFのために)および30μlのDual-Glo Stop and Glo (ウミシイタケルシフェラーゼ; トランスフェクション効率コントロールのために)基質を使用した。発光シグナルを、MithrasLB940装置(Berthold Technologies)で測定した。
ホタル対ウミシイタケルシフェラーゼの比率を計算した。SOSTなしのWnt1の値を1と設定することにより、最終結果を示す。
細胞
MC3T3 1b細胞は、OSE2-lucを発現するMC3T3-JP細胞のクローンである。このクローンは、pcDNA3.1+中の8x-OSE2wt-mOG2lucを用いた、MC3T3-JP (MC3T3-E1マウス骨芽細胞, Japan clone, Jp; Dr. T. Kokkubo, Novartis, Japanからの贈与)の安定なトランスフェクション後に取得された。
MC3T3-1b細胞を、一般に、10% ウシ胎児血清(FCS; Amimed Cat#2-01F100-I)、2 mM L-グルタミン(Gibco Cat#25030-024)、50 IU ペニシリン/50 μg/ml ストレプトマイシン(Amimed Cat#4-01F00-H)および10mM Hepes (Gibco Cat#15630-056)ならびに0.75 mg/ml G418 (Gibco Cat#10131-027)を補充した最小必須培地α(MEMα; Invitrogen, Cat#22561-021)(維持培養培地)で培養した。
ウェルへのマトリックス結合カルシウム沈着を、Calcium kit (Axon Lab, Cat#AXON0012)を用いて、MC3T3-1b細胞で決定した。細胞の応答性を改善するために、細胞を、96ウェルプレートで、100μlのアッセイ用培養培地(G418を含まない維持培養培地)中、6x103細胞/ウェルまたは2x103 細胞/ウェルで播種し、コンフルエンスに達するまで3日間インキュベートした。次いで、アッセイ用培養培地を交換し、試験される化合物を、10mM b-グリセロリン酸(bGP; Sigma Cat#G9891)および50μM アスコルビン酸(AA; Wako Pure Chemical Cat#013-12061)と共に加えた。細胞にそれらを加える前に、試験されるスクレロスチンおよびFabを、室温で2時間、別々のプレートでプレインキュベートし、その一方で、スクレロスチン-Fab混合物を加える前に、アッセイ用96ウェルプレートに2.1もしくは2.8 nM BMP-2 (R&D Systems, Cat#355-BM-010)を加えた。細胞を、14日間インキュベートし、アッセイ用培地を、3-4日ごとに置換した。簡潔には、インキュベーションの終了後、細胞を、200 μl PBS/ウェルで2回洗浄し、50 μlの0.5 M HClを各ウェルに加えて、プレートを、-20℃で最短24時間、凍結させた。適当な時間で、プレートを、室温で2時間融解させ、各ウェルの10μlを新しい96ウェルプレートに移した。次いで、Calcium Working Solution (1:5)を加え(200μl)、5-30分後、プレートを、マイクロプレートリーダーを用いて、595 nmで読み取った。
材料
MC3T3-E1マウス骨芽細胞(Japan clone, kind gift of Dr. T. Kokkubo, Novartis, Japan) C3H10T1/2細胞(マウス胚間葉細胞; ATCC, Cat.Nb.: CCL-226)。
非グリコシル化15N SCL、E. coli由来(Novartis, PSU11274)
グリコシル化hSOST-APP、HEK-EBNA由来(Novartis, BTP11100)
グリコシル化rhSCL、マウス骨髄腫細胞由来(R&D Systems, Cat.Nb.: 1406-ST/CF)
抗hSOST抗体(R&D Systems, Cat.Nb.: AF1406)
PhosphoSafe Extraction Reagent (Novagen, Cat. Nb.: 71296-3)
Protease Inhibitor Cocktail Set III (Calbiochem, Cat. Nb.: 539134)
NuPAGE Novex Tris-Acetate Gel 7% 1.5mm、15ウェル(Invitrogen, Cat. Nb.: EA03585)
Tris-Acetate SDS Running Buffer 20x (Invitrogen, Cat. Nb.: LA0041)
NuPAGE Antioxidant (Invitrogen, Cat. Nb.: NP0005)
Immobilon-P Transfer Membrane 0.45um (Millipore, Cat. Nb.: IPVH00010)
Wattmanクロマトグラフィーペーパー(Merck, Cat. Nb.: 3587600)
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module (Invitrogen)
VersaMaxマイクロプレートリーダー(Bucher)
MC3T3-E1およびC3H10T1/2細胞を、一般に、各々、最小必須培地α(MEMα; Invitrogen, Cat#22561-021)または高グルコースを含むDMEM(Invitrogen, Cat#41965-039)で培養した。すべての培養物に10% ウシ胎児血清(FCS; BioConcept Cat#2-01F10-I, lot. Z04459P)、2 mM L-グルタミン(Invitrogen Cat#25030-024)、50 IU ペニシリン/50 ug/ml ストレプトマイシン(Invitrogen Cat#15140-122)および10mM Hepes (Invitrogen Cat#15630-056)を補充した(維持培養培地)。
Smad (H-465)抗体(Santa Cruz, Cat.Nb.: sc-7153)は、ヒト起源の全長Smad1を示すアミノ酸1-465に対して作製されたウサギポリクローナルIgGである。それは、ヒト、ラットおよびマウス起源のSmad1、Smad2、Smad3、Smad5およびSmad8を認識する。ホスホ-Smad1 (Ser463/465)/Smad5 (Ser463/465)/Smad8 (Ser426/428)抗体(Cell Signalling, Cat#9511)は、ヒトmad5のSer463/465周辺の残基に相当する合成ホスホ-ペプチドに対して作製されたウサギポリクローナルIgGである。それは、ヒト、マウス、ラット、ミンクおよびアフリカツメガエル起源のSmad1(セリン463およびセリン465で二重にリン酸化されたときのみ)ならびにSmad5およびSmad8(同等の部位でリン酸化されたときのみ)の内在性レベルを検出する。抗体は、他のSmad関連タンパク質と交差反応しない。
Quantity One (Bio-Rad)を用いて化学発光活性を測定し、XLfit4ソフトウェアを用いてEC50値を計算した。各ホスホ-Smadシグナルを、その対応する全Smadシグナルにより標準化した。
96ウェルマイクロタイター未処理プレートを、PBSで希釈した100 μl/ウェルのLRP6/Fc (1 μg/ml, R&D Systems, Cat#1505-LR)で被覆した。非特異的結合(NSB)のコントロールとして、数個のウェルを、100 μl/ウェルのPBSで満たした。プレートをプラスチックフィルムで覆い、室温で一晩、インキュベートした。被覆後、プレートを、PBS中の200μl/ウェル 0.05% Tween 20 (Fluka, Cat#93773)で3回洗浄し、ウェルを、TBS中の300μl/ウェル SuperBlock blocking buffer (Pierce, Cat#37535)を加えることにより、37℃で1時間、ブロッキングした。インキュベーション後、ブロッキング溶液を除去し、PBS中の1% BSAで希釈した100μl/ウェルのスクレロスチン(E.coli由来, Novartis; 1 - 1000ng/ml)を加えた。プレートを、室温で2時間インキュベートし、その後、PBS中の200μl/ウェル0.05% Tween 20で、3回洗浄した。その後、PBS中の1% BSAで希釈した100μl/ウェルの抗スクレロスチン抗体(1μg/ml)を加え、プレートを、室温で2時間インキュベートし、その後、PBS中の200μl/ウェル 0.05% Tween 20で3回洗浄した。最後に、PBS中の1% BSA (Sigma Cat. Nb.:A-7888)で希釈した100μl/ウェルのALP共役抗Goat IgG Ab (1:5000; Sigma Cat#A-7888)を、室温で1時間加えて、その後、プレートを、PBS中の200μl/ウェル 0.05% Tween 20で3回洗浄した。ALPを決定するために、100μl/ウェルのALP基質(Sigma, Cat#S0942)溶液(5ml ジエタノールアミン基質バッファー1xあたり1錠; Pierce, Cat#34064)を90分間プレートに加えて、吸光度を405nmで測定した。
HEK293細胞(ATCC Cat#CRL-1573)を、一般に、10% FCS (BioConcept Cat#2-01F10-I, lot. Z04459P)、2 mM L-グルタミン(Invitrogen Cat#25030-024)、100 IU ペニシリン/100 μg/ml ストレプトマイシン(Invitrogen Cat#15140-122)および10 mM HEPES (Invitrogen Cat#15630-056)を補充したDMEM/F12 (Invitrogen Cat#21331-020)で培養した。Hek293細胞を、ポリ-D-リジン48ウェルプレート様式に、5x104 細胞/ウェルで播種し、24時間インキュベートし、その後、Lipofectamine 2000 (Invitrogen Cat#11668-019)でのトランスフェクションを行った。トランスフェクションされる各ウェルについて、下記の量のプラスミドを25 μl OptiMEM(登録商標)I (Gibco, Cat#31985-047)の最終量で加えて、穏やかに混合した: コントロールウェルについて(pmaxGFP, 62.5 ng, pcDNA3+, 125 ng; SuperTopFlash (STF) 62.5 ng; SV40駆動ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド, 0.75 ng)、およびWnt1処理ウェルについて(pmaxGFP, 62.5 ng, pcDNA-wnt1, 62.5 ng; pcDNA3+, 62.5 ng; SuperTopFlash (STF) 62.5 ng; SV40駆動ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド, 0.75 ng)、およびLRP4-Wnt1処理ウェルについて(pcDNA3+-LRP4, 62.5 ng, pcDNA3+-wnt1, 62.5 ng; pcDNA3+, 62.5 ng; SuperTopFlash (STF) 62.5 ng; SV40駆動ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド, 0.75 ng)。第2の試験管で、0.8μlのLipofectamine 2000を希釈して、OptiMEM(登録商標)の最終量25μlとし、室温で5分間、インキュベートした。次いで、2つの試験管の内容物を、脂質試験管の内容物をDNA試験管に加えることにより混合し、室温で30分間インキュベートし、DNA-脂質複合体を形成させた。その後、DNA-脂質複合体(50μl)を各ウェルに等しく加えて、5% CO2条件下、37℃で5時間、インキュベートした。5時間のインキュベーションが終わると、細胞は、試験試薬、例えば、SOST、DKK1 (R&D Cat#1096-DK)、抗体などで20時間処理するための準備が整ったものとなる。“Wntアッセイ”について記載されたとおり(150 μlのPassive Lysis Bufferを代わりに加えた)、ルシフェラーゼアッセイを行った。
C28a2細胞(Mary Goldring, Harvard Institutes of Medicine, Boston, MA, USから入手)を、HEPESが含まれず、非必須アミノ酸(Gibco Cat#11140)の補充が加えられたことを除いてはHEK293と同じ培地で培養した(上記を参照のこと)。C28a2細胞を、抗生物質不含培地で、24ウェルプレート様式に、1x105 細胞/ウェルで播種し、一晩インキュベートし、その後、Lipofectamine 2000 (Invitrogen Cat#11668-019)でのトランスフェクションを行った。トランスフェクションされる各ウェルについて、下記の量のプラスミド(総量600 ng/ウェル)を添加して、最終量50 μl OptiMEM(登録商標)I (Gibco, Cat#31985-047)として、穏やかに混合した: コントロールウェルについて(SuperTopFlash (STF) 100 ng; SV40駆動ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド, 2 ngおよびpcDNA3+, 500 ng(補償のために))、およびWnt1処理ウェルについて(pcDNA-wnt1プラスミド, 100 ng; LRP5プラスミド, 100 ng; SuperTopFlash (STF) 100 ng; SV40駆動ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド, 2 ngおよびpcDNA3+, 300 ng)、およびLRP4-Wnt1処理ウェルについて(pcDNA-wnt1プラスミド, 100 ng; LRP5プラスミド, 100 ng; LRP4プラスミド, 100 ng; SuperTopFlash (STF) 100 ng SV40駆動ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド, 2 ngおよびpcDNA3+, 200 ng)。第2の試験管で、1.6μlのLipofectamine 2000を、48.4μlのOptiMEM(登録商標)で希釈し、室温で5分間、インキュベートした。次いで、2つの試験管の内容物を、脂質試験管の内容物をDNA試験管に加えることにより混合し、室温で30分間インキュベートし、DNA-脂質複合体を形成させた。その後、DNA-脂質複合体(100μl)を各ウェルに等しく加えて、5% CO2条件下、37℃で2時間、インキュベートした。2時間のインキュベーションの終了後、トランスフェクション培地を450 μl/ウェルの抗生物質不含培地で置換し、細胞を24時間インキュベートした。次いで、細胞を、試験試薬、例えば、SOSTもしくはDKK1 (R&D Cat#1096-DK)で20時間処理した。“Wntアッセイ”について記載されたとおり、ルシフェラーゼアッセイを行った。
Wnt1/STF/Renilla Hek293細胞(Wnt1発現プラスミド、SuperTopFlashレポータープラスミド、およびSV40駆動ウミシイタケルシフェラーゼプラスミドを有する、Hek293細胞の安定なトランスフェクションから得られた安定なクローン(ATCC Cat#CRL-1573))を、一般に、10% FCS (Amimed Cat#2-0F100-I)、2 mM L-グルタミン(Invitrogen Cat#25030-081)、100 IU/ml ペニシリン/100 μg/ml ストレプトマイシン(Gibco Cat#15140-163)、6 μg/ml ピューロマイシン(Invitrogen Cat#ant-pr-1)、150 μg/ml ゼオシン(Invitrogen Cat#45-0430)および150 μg/ml ハイグロマイシン(Invitrogen Cat#10687-010)を補充したDMEM 4500 g/L グルコース(Invitrogen Cat#41965-035)で培養した。ノックダウン実験の間、選択抗生物質を欠損させた。細胞を、ポリ-D-リジン24ウェルプレート形式に、0.6x105 細胞/ウェルで播種し、一晩接着させ、その後、HiPerFect (Qiagen Cat#301707)を用いて、LRP4 siRNAのトランスフェクションを行った。LRP4 siRNAのセンスおよびアンチセンス配列は、下記のとおりであった:
LRP4a: TAAATTATCATAAAGTCCTAA / AGGACTTTATGATAATTTATT; (配列番号:160/161)
LRP4b: ATAGTGGTTAAATAACTCCAG / GGAGTTATTTAACCACTATTT; (配列番号:162/163)
LRP4c: TAAATTCTCGTGATGTGCCAT / GGCACATCACGAGAATTTATT; (配列番号:164/165)
LRP4d: TTTCTTATAGCACAGCTGGTT / CCAGCTGTGCTATAAGAAATT; (配列番号:166/167)
LRP4e: TAGACCTTTCCATCCACGCTG / GCGTGGATGGAAAGGTCTATT; (配列番号:168/169)。
8月齢の雌OF1/ICマウス(n=16/群, Charles River, France)に、抗スクレロスチン抗体ANTIBODY A (25 mg/kg, h/mIgG2a) (MOR05813)またはコントロール抗体(抗PC-h/mIgG2a)を、週2回静脈内投与した。コントロール群は、100 μ/kg PTH(1-34)またはPBSビヒクルの毎日の静脈内投与を受けた。すべての動物について、2.5週間、処理を続けた。組織形態計測的解析のための時間点で、半分の動物(n = 8 / 群)を安楽死させた。残りの動物(n = 8 / 群)について、5週まで処理を続けた。
コントロール抗体: 抗PC-h/mIgG2a、
濃度: 2.5 mg/ml、適用用量: 10ml/kg
ビヒクル: 50 mM Citrat, 140 mM NaCl。
2.45 mg/ml、適用用量: 10ml/kg
ビヒクル: 50 mM Citrat, 140 mM NaCl。
1 アイソタイプコントロールiv. = 抗PC-mIgG2a
2 抗SOST-MOR05813 iv.
3 ビヒクルコントロール sc. = PBS+BSA 0.1%
4 hPTH(1-34) sc.。
動物を、25℃、12:12時間の明暗サイクルで、4〜5匹の群で飼育した。それらに、0.8%リンおよび0.75% カルシウム(NAFAG 3893.0.25, Kliba, Basel, Switzerland)を含む標準的な実験食を与えた。食餌および水は、不断給餌された。
動物実験は、Canton of Basel-City, Switzerlandにおける有効な規制に基づいて行われた。
末梢骨定量的コンピューター断層撮影装置(pQCT)
動物を、吸入麻酔(Isoflurane, 2.5%)下、側臥位で入れた。左脚を伸ばして、この位置で固定した。
動物を、吸入麻酔(Isoflurane, 2.5%)下、側臥位で入れた。左脚を伸ばして、この位置で固定した。
エクスビボDEXA測定を、左側脛骨、左側大腿骨および第1 - 4腰椎で行った。エタノール(70%)を軟組織刺激のために使用した。測定を、小動物の測定のために適応させた通常のHologic QDR-1000装置を用いて行った。0.9 cmの直径および超高分解能モード(行間) 0.0254 cm、分解能0.0127 cm)を有するコリメーターを使用した。
Alizarin (20mg/kg, 皮下, アリザリンコンプレキソン, Merck, Dietikon, Switzerland) - 解剖の10日前。
Calcein (30mg/kg, 皮下, Fluka, Buchs, Switzerland) - 解剖の3日前。
解剖後、右側大腿骨および第5および第6腰椎をKarnovskyの固定剤に24時間入れ、4℃でエタノールにて脱水し、樹脂に埋め込んだ(メタクリル酸メチル)。Microtome 2050 Supercut (Reichert Jung, Arnsberg, Germany)を用いて、一組の5μm厚の非連続ミクロトーム切片を、蛍光色素標識に基づく骨形成の評価のために、前頭体心平面(frontalmid-body plane)において切り出した。カメラ(SONY DXC-950P, Tokyo, Japan)を備えたLeica DM顕微鏡(Leica, Heerbrugg, Switzerland)および適合Quantimet 600ソフトウェア(Leica, Cambridge, United Kingdom)を用いて、切片を調べた。動物あたり1つの切片をサンプルとした。サンプルの顕微鏡画像をデジタル化し、スクリーン上で半自動的に評価した。骨傾斜、単一および二重標識化骨傾斜、ならびに内部標識幅を測定した(X200倍率)。石灰化周囲値(%)、骨石灰化速度(マイクロメーター/日)(海綿骨コンパートメントでの切片傾斜について収集された)および1日の骨形成速度値(1日の骨形成速度/骨傾斜[マイクロメーター/日])を計算した。すべてのパラメーターを、大腿骨遠位骨幹端の二次海綿骨および1つの腰椎で評価した。他の組の切片を、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)で染色した。骨表面あたりの破骨細胞面(%)を二次海綿骨で評価した。
結果は、平均 +/- SEMとして示す。統計的解析は、スチューデントt検定(両側; 不対)を用いて行われた。処理(抗スクレロスチン抗体またはhPTH(1-34))を、コントロール(コントロール抗体またはPBS)との差異について試験した(*, + p< 0.05, **, ++ p < 0.01)。
表面プラズモン共鳴(Biacore)を用いた選択された抗ヒトスクレロスチンFabの親和性決定
速度定数konおよびkoffを、共有結合で固定化したスクレロスチンに結合する各Fabの連続希釈を用いて、BIAcore 3000装置(BIAcore, Uppsala, Sweden)で決定した。共有結合での抗原固定化のために、標準的なEDC-NHSアミンカップリング化学を用いた。動態測定を、1.5 - 500 nMの範囲のFab濃度を用いて、20 μl/分の流速で、PBS (136 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1,76 mM KH2PO4 pH 7.4)で行った。各濃度についての注入時間は、1分であり、その後、3分間、相分離を行った。再生のために、2 x 5 μlの10 mM グリシン pH 1.5使用した。BIA評価ソフトウェア3.1 (BIAcore)を用いて、すべてのセンサグラムを適合させた。
E. coliライセート(BEL抽出物)中のスクレロスチン結合抗体断片の親和性の測定のために、結合をBioVeris M-384 SERIES(登録商標) Workstation (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)により解析した。
ビオチニル化ヒトスクレロスチンタンパク質を、提供者の指示にしたがって、M-280 Streptavidin常磁性ビーズ(Dynal)に固定した。ウェルあたり、ビーズストック溶液の1:25希釈物を加えた。100 μlの希釈化BEL抽出物およびビーズを、シェーカー上で、室温で一晩インキュベートした。検出のために、提供者(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)の指示にしたがって、BV-tagTMで標識した抗ヒト(Fab)'2 (Dianova)を使用した。
KD決定のために、Fabの単量体画分(分析的SECにより解析されたとき、少なくとも90%の単量体含有量; Superdex75, Amersham Pharmacia)を使用した。溶液中のエレクトロケミルミネセンス(ECL)に基づく親和性決定およびデータ評価を、基本的に、Haenel et al., 2005に記載されたとおり行った。一定量のFab (25 pM)を、溶液中、異なる濃度(連続3n希釈)の非標識ヒト、マウスもしくはカニクイザルスクレロスチン(出発濃度: 500 pM)で平衡化した。常磁性ビーズM-280 Streptavidin, Dynalに結合したビオチニル化ヒトスクレロスチン (0.5 μg/ml)およびBV-tag(商標) (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)標識化抗ヒト(Fab)'2抗体(Dianova)を加えて、30分間インキュベートした。次いで、非結合Fabの濃度を、M-SERIES(登録商標)384アナライザー(BioVeris Europe)を用いたECL検出により定量化した。
BioVerisTMに基づく結合阻害能アッセイについて、組み換えヒトBMP-2を、提供者の指示にしたがって、カルボン酸M-270磁性ビーズ(Dynal)に直接結合させた(NHS/EDC化学)。アッセイを、96ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート(Nunc)で行った。アッセイバッファー(PBS + 1 % Tween 20 (ストリンジェント)もしくは0.1% Tween 20 (低ストリンジェント) + 1 % BSA)中、50 μl/ウェルの精製化Fabを1:3の希釈工程で希釈した(出発濃度: 1000 nM)。50 μl/ウェルのビオチニル化ヒトスクレロスチン(4 nM)を各Fab希釈物に加えた。Eppendorf Thermomixer上、400 rpmで振とうしながら、22℃で90分間のインキュベーション後、25 μlのBMP-2被覆ビーズ(2.7E07ビーズ/ml)および提供者(BioVeris Europe)の指示にしたがってBV-tag(商標)で標識した1:500希釈化Streptavidinを各ウェルに加えて、30分間インキュベートした(800 rpm, 22℃)。BioVeris M-384 SERIES(登録商標) Workstation (BioVeris Europe)により検出を行った。EC50決定について、4パラメーターロジスティック回帰モデル(XLfit, IDBS)を用いた。
ヒトIgG1フォーマットおよびヒト/マウスIgG2aフォーマットへの変換
全長IgGを発現するために、重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変ドメイン断片を、Fab発現ベクターから適当なpMorph(登録商標)Igベクター: pMorph(登録商標)_h_Ig1およびキメラヒト/マウスpMorph(登録商標)2_h/m_Ig2aにサブクローン化した。制限酵素EcoRI、MfeI、BlpIを、VHドメイン断片のpMorph(登録商標)_h_IgG1またはpMorph(登録商標)2_h/m_IgG2aへのサブクローン化のために使用し、EcoRV、BsiWI、HpaIを、VLドメイン断片のpMorph(登録商標)_h_Igκ、pMorph(登録商標)_h_IgλおよびpMorph(登録商標)2_h/m_Igλベクター各々へのサブクローン化のために使用した。
HEK293もしくはHKB11細胞を、等モル量のIgG重鎖および軽鎖発現ベクターでトランスフェクションした。トランスフェクションの4日もしくは5日後、細胞培養上清を回収した。上清のpHをpH 8.0に調製し、滅菌ろ過した後、溶液を、標準的なプロテインAカラムクロマトグラフィー(Poros 20A, PE Biosystems)にかけた。
天然のシグナルペプチド(aa 1-213, NPL 005002)を特徴とするヒトスクレロスチン前駆体(GenBank受託番号AF326739)をコードする完全長cDNAを、制限酵素部位Asp718およびXba1への挿入により、哺乳類発現ベクターpRS5aにクローン化した。タンパク質を検出および精製するためのタグ(APP = EFRH)を、遺伝子のC末端に付加した。
His6-PreScissionタグ化SOST aa24-213 (NPL006071, プラスミドpXI504)およびSOST aa24-213 (NPL006690, プラスミドpXI515)をリフォールディングにより作製した。E.coli Tuner (DE3)を各プラスミドで形質転換した。
希釈化ホールディング溶液を、2倍濃縮により、1.5倍量の50mM Tris pH 8、5mM GSH、0.5mM GSSGに対してダイアフィルトレーションし、次いで、もとの量まで再び希釈した。これを3回行い、その後、PreScissionプロテアーゼを加えて、溶液を4℃で48時間放置した。すべての濃縮/ダイアフィルトレーションは、10KDaのカットオフ膜を用いたPelliconII限外ろ過カセットにより行われた。最後に、溶液を10倍濃縮した。
希釈化ホールディング溶液を10倍濃縮した。濃縮前に、4つすべてのジスルフィド架橋の形成を確認するために、LC-MSを使用した。
ヒトスクレロスチンタンパク質に対する治療抗体を、抗体変異型タンパク質の起源として、市販で利用可能なファージディスプレイライブラリーであるMorphoSys HuCAL GOLD (登録商標)ライブラリーを用いて、高い結合親和性を有するクローンの選択により作製した。
ヒトスクレロスチンを認識する抗体の選択のために、いくつかのパニング戦略を適用した。
a) 抗原(ヒトおよびマウススクレロスチン)をMaxisorp 96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc, Wiesbaden, Germany)に直接被覆する固相パニング、または
b) 抗原(ビオチニル化スクレロスチン)、各々の抗原複合体をN/A透明ストリップ(clear strip)に捕捉する捕捉および準溶液パニング(semi-solution panning)または、
c) ファージ-抗原複合体を、各パニングプールについてStreptavidin 磁性ビーズ(Dynabeads M-280; Dynal)により捕捉する、ビオチン化スクレロスチンを用いた溶液パニング。
最初のスクレロスチン上でのパニングのために、Maxisorpプレートのウェルを、PBSで希釈した300 μl (5 μg/ml)のヒトスクレロスチン(HEK細胞で産生された)で一晩被覆した。
2種の異なる方法を、この種のパニングについて行った: 捕捉準溶液パニングおよび標準準溶液パニング手順。
この型のパニングについて、200 μlのStreptavidin磁性ビーズ(Dynabeads M-280; Dynal)をPBSで1回洗浄し、Chemiblockを用いて、室温で2時間ブロックした。Chemiblockを用いて、500 μlのファージを、室温で1時間、回転させながら(rotating)ブロックした。ブロック化ファージを、50 μlのブロック化Streptavidin磁性ビーズに対して、30分間、2回プレ吸着させた。ファージ上清を新たなブロック化2 ml反応管に移し、異なる濃度のヒトビオチニル化スクレロスチンを加えて(表5、6および7を参照のこと)、室温で1時間、回転させながらインキュベートした。100 μlのブロック化Streptavidin磁性ビーズを、各パニングプールに加えて、ローターで10分間インキュベートした。ビーズを、約2.5分間、粒子分離器(Dynal MPC-E)で集めて、溶液を注意深く除去した。
選択されたFab断片のマイクロ発現
可溶性Fabの迅速な発現を促進するために、選択されたHuCAL GOLD(登録商標)ファージのFabコード挿入物を、各々のディスプレイベクターからのXbaIおよびEcoRIにより、E. coli発現ベクターpMORPH(登録商標)X9_MH (Rauchenberger et al., 2003)にサブクローン化した。発現プラスミドのE. coli TG1 F-細胞への形質転換後、クロラムフェニコール耐性単一コロニーを採取し、100 μlの2xYT-CG培地で前もって満たした滅菌96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに移し、37℃で一晩増殖させた。5 μlの各々のE. coli TG-1培養物を、ウェルあたり34 μg/ml クロラムフェニコールおよび0.1% グルコースを補充した100 μlの2xYT-CG培地で前もって満たした新たな滅菌96ウェルマイクロタイタープレートに移した。マイクロタイタープレートを、培養物が〜0.5のOD600nmでわずかに濁るまで(〜2-4時間)、マイクロプレートシェーカ上で、400 rpmで振とうさせながら、30℃でインキュベートした。これらの発現プレートに、ウェルあたり34 μg/ml クロラムフェニコールおよび3 mM IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)を補充した20 μl 2xYT培地を加えて(最終濃度: 0.5 mM IPTG)、マイクロタイタープレートをガス透過性テープで密封し、400 rpmで振とうさせながら、30℃で一晩インキュベートした。
より大規模なスケールで、E. coli TG1 F-細胞でのpMORPH(当職商標)X9_Fab_MHによりコードされるFab断片の発現を、34 μg/mlのクロラムフェニコールを補充した750 mlの2xYT培地を用いて、シェーカーフラスコ培養で行った。培養物を、OD600nmが0.5に達するまで、30℃で振とうした。Fab発現を、0.75 mM IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)の添加により誘導し、さらに30℃で20時間培養した。細胞を回収し、リゾチームを用いて破壊し、Fab断片をNi-NTAクロマトグラフィーで単離した。見かけの分子量を、キャリブレーション標準を用いたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により決定した。濃度を、UV-分光光度法(Krebs et al., 2001)により決定した。
直接被覆したスクレロスチン上でのスクレロスチン結合Fabの検出のための酵素結合免疫吸着法(ELISA) Maxisorp (Nunc, Rochester, NY, USA) 384ウェルプレートを、4℃で一晩、PBS(pH 7.4)中、20 μlの2.5 μg/ml 抗原(HEK細胞で産生されたヒトスクレロスチン、E. coli細胞で産生されたヒトスクレロスチンおよびマウススクレロスチン)で被覆した。
溶液パニングを行った後、HuCAL GOLD(登録商標) Fabについてスクリーニングするために、この種のELISAを使用した。
パニング後、濃縮されたファージプールを、pMORPH(登録商標)23ライブラリーベクター(ファージ表面上への効率的な抗体の提示を可能にする)から可溶性Fabのペリプラズム発現を仲介するpMORPH(登録商標)X9_Fab_MH発現ベクターにサブクローン化した。単一コロニーを採取し、可溶性Fabをこれらの単一コロニーから発現させた。
Biacoreを用いた親和性決定
抗スクレロスチン抗体をさらに特徴づけるために、ヒト、マウスおよびカニクイザルスクレロスチンへの親和性を決定した。組み換えスクレロスチンタンパク質をCM5 Biacoreチップに固定し、Fabを異なる濃度で移動相に適用した。一価親和性の信頼性のある決定のために、定性的サイズ排除クロマトグラフィーで、≧90%の単量体画分を示すFabバッチのみをBiacore測定について使用した。
作製され、精製されたすべてのFabを、組み換えヒトBMP-2へのスクレロスチン結合を阻害するそれらの能力について、BioVerisに基づく結合阻害能アッセイで試験した。2つの異なるストリンジェンシー条件(バッファー系中、0.1%および1% Tween 20)を試験した。27個のうちの9個のFabは、ストリンジェントバッファー条件下で、固定化BMP-2へのスクレロスチン結合を阻害することができた。
親結合体のIgG変換およびIgGの特徴づけ
21個の候補を、各々、pMORPH(登録商標)_h_IgG1発現ベクターおよびpMORPH(登録商標)_h_Igベクターシリーズの対応する軽鎖構築体にサブクローン化することにより、IgG1形式に変換した。HEK293もしくはHKB11細胞の一過的なトランスフェクションにより発現を行い、全長免疫グロブリンを細胞培養上清から精製した。精製後のIgG1の機能性を、固定化したヒト、マウスおよびカニクイザルスクレロスチンへのELISA結合により評価した。
すべての精製されたhIgGの力価を測定し、ALPアッセイで試験した。該アッセイは、BMP-2 スクレロスチン阻害に関して信頼性があったが、選択された候補は、すべての実験でスクレロスチン阻害を示すことができなかった(アッセイごとの活性の変動(assay to assay activity variation)、プレートごとの変動(plate to plate variation)、3系のウェル内の高い変動(high variance within triplicate wells))。したがって、IgGの活性の順位付けのみが可能であった。
ALPアッセイでIgGを試験した結果により、順位付けのみが可能となった。この順位付けから、高リスクで、親和性成熟について、4つのFabを選択した。すべての候補を、L-CDR3およびH-CDR2において、単一リード候補として最適化されるように選択した。
下記の成熟ライブラリーからの抗体提示ファージを、別々のパニングおよびスクリーニングにかけた:
リード1: MOR04518 (L-CDR3成熟)
リード1: MOR04518 (H-CDR2成熟)
リード2: MOR04520 (H-CDR2成熟)
リード3: MOR04532 (L-CDR3成熟)
リード3: MOR04532 (H-CDR2成熟)
リード4: MOR04799 (L-CDR3成熟)
リード4: MOR04799 (H-CDR2成熟)
親和性が改善されたスクレロスチン特異的Fabの同定のために、〜2900個の単一クローンの細菌ライセートを希釈し、ストレプトアビジン被覆ビーズに固定化されたビオチニル化ヒトスクレロスチンに結合するFabについて調べた。BioVeris Workstationを用いて、結合を解析した。最も高いシグナルを生じるクローンは、改善された親和性を示し、したがって、溶液平衡タイトレーションによるさらなる解析のために選択された。
最適化Fabを細胞ALPアッセイで試験した。それらの多くは不活性であり、スクレロスチン阻害の可変反転(variable reversal)は、いくつかのFabで見られた。したがって、クローンの選択物をヒト/マウスIgG2a様式に変換し、同じアッセイで試験した。しかし、ヒト/マウスIgG2a様式でのこれらのクローンは、スクレロスチン阻害を十分に反転することができず、望まれるEC50 (<10nM)基準には達しなかった。最良の成熟化候補であるMOR05177 (親MOR04518から成熟したVL)は、50nM Fabで、または140 - 467nM ヒト/マウスIgG2aで、75-85%のALPシグナルの回復を示した。
スクレロスチンが、直接もしくは間接的に、Wntシグナル伝達に影響を与えることを示す新規公開物(Wu et al. JBC 2005, He et al. JBC 2005, Bezooyen et al. ASBMR 2005, Winkler et al. JBC 2005)に基づいて、新たな機能性バイオアッセイを開発した。
石灰化アッセイでの親および親和性成熟化Fabの活性
石灰化は、石灰化マトリクスを形成するMC3T3細胞の能力に基づくものであり、それは、骨細胞分化を受けるそれらの能力を示す。強い石灰化(ウェル(96ウェル様式)あたり、>1μg カルシウムの沈着)が、試験されたすべてのBMP-2濃度で、14日後に測定された。さらにスクレロスチン濃度を増加させると、BMP-2 (2.1 nM)誘導石灰化の用量依存性阻害を誘導した(IC50: 120 nM) (データは示していない)。
LRP6 / スクレロスチンELISAは、LRP6に結合するスクレロスチンの能力に基づく。さらに作製されたFabを特徴づけるために、FabおよびIgGの選択物を本アッセイで試験した。R&Dから入手した抗スクレロスチン抗体(1000 ng/ml = 〜7nM)の存在下で、LRP6に結合するスクレロスチン(0.9 nM)は、コントロールと比較して、68%まで阻害された(データは示していない)。
ホスホ-Smad1アッセイ(Western)は、MC3T3-E1細胞において15分以内にSmad1リン酸化を誘導するBMP-6の能力に基づく。MOR05318_IgG2 lambdaは、115 nMのEC50で、BMP-6誘導Smad1リン酸化におけるスクレロスチンの作用を阻害し、BMP-6誘導リン酸化の最大66%までSmad1リン酸化を回復した。ネガティブコントロールとして用いた抗リゾチームIgG(IgG C)は、効果を示さなかった(図4)。
LRP4 mRNAノックダウンは、SOSTの非存在下でSTF活性に影響を与えなかった(LRP4 siRNA eは、例外)。しかしながら、それは、STF活性を阻害するSOSTの能力を10%〜30%減少させた。これは、試験された5つすべてのsiRNA単独で(図5A)、または異なる組合せで(データは、示していない)、実証された。過剰発現により、LRP4は、HEKおよびc28a2 supertopflashアッセイの各々において、SOSTのIC50を5倍および16倍減少させた(図5BおよびC)。この効果は、LRP4がDKK1のIC50に影響を与えなかったという意味において特異的であった。LRP4のノックダウン(siRNA)は、Wnt-1誘導STFにおけるSOSTの阻害作用を減少させたが、それは、DKK1の阻害作用を減少させなかった(図5D)。同様に、LRP4は、MOR05813_IgG2a EC50を17.2 nMから30 nMまで増加させることにより、抗SOST抗体の作用を減少させた(図5E)。これらのデータは、LRP4がSOST作用の促進剤であることを示す。
バイオアッセイから得られた結果に基づいて、2つの新たな抗体断片の親和性および生物学的活性を増大させるために、定方向突然変異誘発(Virnekas et al., 1994)を用いたカセット突然変異誘発により、LCDR3およびHCDR2領域を同時に最適化し、それにより、フレームワークを一定に維持した。成熟ライブラリーのクローニング前に、すべての親Fab断片を、XbaI/EcoRI制限酵素部位で、発現ベクターpMORPH(登録商標)X9_MHからCysDisplay(商標)成熟ベクターpMORPH(登録商標)25に移した。このベクターは、システイン残基にN末端で融合したファージタンパク質pIIIおよびFd抗体鎖に融合したC末端システインを提供し、その結果、ファージ表面上における各Fab断片のジスルフィド結合ディスプレイを可能にする。
下記の成熟ライブラリーからの抗体提示ファージを、別々のパニングおよびスクリーニングにかけた:
リード1: MOR04525 (L-CDR3成熟)
リード1: MOR04525 (H-CDR2成熟)
リード2: MOR04529 (L-CDR3成熟)
リード2: MOR04529 (H-CDR2成熟)
8月齢の雌OF1/ICマウス(n=16/群, Charles River, France)に、抗スクレロスチン抗体MOR05813 (24.5 mg/kg, mIgG2a)またはアイソタイプコントロール抗体(抗PC-mIgG2a)を、週2回静脈内投与した。コントロール群は、100 μ/kg PTH(1-34)またはビヒクル(PBS + 0.1% BSA)の毎日の静脈内投与を受けた。すべての動物について、2.5週間、処理を続けた。組織形態計測的解析のための時間点で、半分の動物(n = 8 / 群)を安楽死させた。これらの動物は、骨形成力学の組織形態学的計測評価のために、解剖前10日および3日に蛍光色素マーカーを投与された。残りの動物(n = 8 / 群)について、5週まで処理を続けた。
Biacore交差妨害アッセイ
下記には、一般に、抗体もしくは他の結合剤が交差妨害を起こすか、または本発明による抗体を交差妨害する可能性があるかを決定するための適当なBiacoreアッセイを記載している。該アッセイが本明細書に記載されたスクレロスチン結合剤のいずれかと共に使用され得ることは、十分に認識されている。
抗スクレロスチン抗体もしくは他のスクレロスチン結合剤の交差妨害はまた、ELISAアッセイを用いることにより検出され得る。
96ウェルマイクロタイター未処理プレートを、PBSで希釈した100 μl/ウェルのLRP6/Fc (1 μg/ml, R&D Systems, Cat#1505-LR)で被覆した。非特異的結合(NSB)のコントロールとして、数個のウェルを、100 μl/ウェルのPBSで満たした。プレートをプラスチックフィルムで覆い、室温で一晩、インキュベートした。被覆後、プレートを、PBS中の200μl/ウェル 0.05% Tween 20 (Fluka, Cat#93773)で3回洗浄し、ウェルを、TBS中の300μl/ウェル SuperBlock blocking buffer (Pierce, Cat#37535)を加えることにより、37℃で1時間、ブロッキングした。インキュベーション後、ブロッキング溶液を除去し、PBS中の1% BSAで希釈した100μl/ウェルのスクレロスチン(E.coli由来, Novartis; 1 - 1000ng/ml)を加えた。プレートを、室温で2時間インキュベートし、その後、PBS中の200μl/ウェル0.05% Tween 20で、3回洗浄した。その後、PBS中の1% BSAで希釈した100μl/ウェルの抗スクレロスチン抗体(1μg/ml)を加え、プレートを、室温で2時間インキュベートし、その後、PBS中の200μl/ウェル 0.05% Tween 20で3回洗浄した。最後に、PBS中の1% BSA (Sigma Cat. Nb.:A-7888)で希釈した100μl/ウェルのALP共役抗Goat IgG Ab (1:5000; Sigma Cat#A-7888)を、室温で1時間加えて、その後、プレートを、PBS中の200μl/ウェル 0.05% Tween 20で3回洗浄した。ALPを決定するために、100μl/ウェルのALP基質(Sigma, Cat#S0942)溶液(5ml ジエタノールアミン基質バッファー1xあたり1錠; Pierce, Cat#34064)を90分間プレートに加えて、吸光度を405nmで測定した。
LRP6 / スクレロスチンELISAは、LRP6に結合するスクレロスチンの能力に基づく。さらに作製されたFabを特徴づけるために、FabおよびIgGの選択物を本アッセイで試験した。R&Dから入手した抗スクレロスチン抗体(1000 ng/ml = 〜7nM)の存在下で、LRP6に結合するスクレロスチン(0.9 nM)は、コントロールと比較して、68%まで阻害された(データは示していない)。MOR05813_IgG2 lambdaは、90 nMで、LRP6へのスクレロスチン結合を90%まで阻害したが、ネガティブコントロールとして使用された抗リゾチームIgGは、LRP6へのスクレロスチン結合に影響を与えなかった(図20)。
MOR05813 + ゾレドロン酸
8月齢の雌OF1/ICマウス(n=10/群, Charles River, France)を、卵巣切除してエストロゲン枯渇による骨減少を誘導するか、またはインタクトのままにしておいた。該動物に、抗スクレロスチン抗体MOR05813 (24 mg/kg, h/mIgG2a)またはコントロール抗体(抗PC-h/mIgG2a, インタクトおよびOVXコントロール群)を、週2回静脈内投与した。さらなる群は、ゾレドロン酸単独(100 μg/kg)もしくは抗スクレロスチン抗体MOR05813と組み合わせて、単一適用を受けた。3.5週間(7回の適用で)、抗体処理を続けた。
4.5月齢の雌OF1/ICマウス(n=10/群, Charles River, France)に、抗スクレロスチン抗体MOR05813 (10 mg/kg, h/mIgG2a)またはコントロール抗体(抗PC-h/mIgG2a, インタクトおよびOVXコントロール群)を、週2回静脈内投与した。さらなる群は、7週にわたるアレンドロン酸プレ処理(4 μg/kg/日; 5日/週)を受け、その後、コントロール抗体または抗スクレロスチン抗体MOR05813を受けた。3.5週間(7回の適用で)、抗体処理を続けた。
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本発明は、以下の態様を包含する。
[1]
以下を含む、単離抗体またはその抗原結合部分:
(a) 配列番号4に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDR1;
(b) 配列番号15に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDR2;
(c) 配列番号26に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDR3;
(d) 配列番号37に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDR1;
(e) 配列番号48に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDR2; および
(f) 配列番号59に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDR3。
[2]
上記[1]に記載の抗体またはその抗原結合部分であって、
a) 1nM未満のK D でスクレロスチンポリペプチドに結合する;
c) 細胞に基づくWntシグナル伝達アッセイにおいて、スクレロスチンの阻害効果を妨害する;
d) 細胞に基づく石灰化アッセイにおいて、スクレロスチンの阻害効果を妨害する;
e) 溶液阻害アッセイにおいて、LRP6/スクレロスチン相互作用を阻害する; および/または
f) 細胞に基づく機能性アッセイにおいて、BMP6により誘導されるSmad1リン酸化に対するスクレロスチンの阻害効果を妨害する
ものである、抗体またはその抗原結合部分。
[3]
上記[1]または[2]に記載の抗体またはその抗原結合部分であって、
a) スクレロスチンの存在下、HEK293細胞株における細胞に基づくWntシグナル伝達アッセイにおいて測定される100nM未満のIC 50 ;
b) スクレロスチンの存在下、MC3T3細胞におけるBMP2誘導石灰化アッセイにおいて測定される500nM未満のIC 50 ;
c) LRP6/スクレロスチンELISAにおいて測定される10nM未満のIC 50 ; および/または
d) スクレロスチンの存在下、MC3T3-E1細胞株におけるBMP6 Smad1リン酸化アッセイにおいて測定される500nM未満のIC 50
を有するものである、抗体またはその抗原結合部分。
[4]
以下を含む、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分:
a) 配列番号70に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するVHポリペプチド配列; または
b) 配列番号81に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するVLポリペプチド配列。
[5]
配列番号81に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するVLポリペプチド配列および配列番号70に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するVHポリペプチド配列を含む、上記[4]に記載の抗体またはその抗原結合部分。
[6]
配列番号81に示すアミノ酸配列を有するVLポリペプチド配列および配列番号70に示すアミノ酸配列を有するVHポリペプチド配列を含む、上記[5]に記載の抗体またはその抗原結合部分。
[7]
以下を含む、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分:
a) 配列番号114に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有する全長重鎖アミノ酸配列; または
b) 配列番号125に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有する全長軽鎖アミノ酸配列。
[8]
配列番号125に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有する全長軽鎖アミノ酸配列および配列番号114に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有する全長重鎖アミノ酸配列を含む、上記[7]に記載の抗体またはその抗原結合部分。
[9]
配列番号125に示すアミノ酸配列を有する全長軽鎖アミノ酸配列および配列番号114に示すアミノ酸配列を有する全長重鎖アミノ酸配列を含む、上記[8]に記載の抗体またはその抗原結合部分。
[10]
ヒト抗体またはヒト化抗体である、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
[11]
IgM、IgEまたはIgGアイソタイプのものである、上記[10]に記載の抗体。
[12]
IgG1またはIgG2アイソタイプのものである、上記[11]に記載の抗体。
[13]
治療上有効量の上記[1]〜[12]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分を1以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む医薬組成物。
[14]
さらなる活性成分を含む、上記[13]に記載の医薬組成物。
[15]
上記[1]〜[12]のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分をコードする単離ポリヌクレオチド配列。
[16]
上記[15]に記載の1以上のポリヌクレオチド配列を含むクローニングまたは発現ベクター。
[17]
配列番号133-154からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列または少なくとも1つのCDR領域をコードする断片を含む、上記[16]に記載のベクター。
[18]
上記[17]に記載の1以上のクローニングまたは発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
[19]
上記[18]に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、抗体またはその抗原結合部分の製造方法。
[20]
上記[1]〜[12]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分を含む診断キット。
[21]
スクレロスチンにより仲介されるか、または増加したレベルのスクレロスチンと関連する病的障害を処置するための、上記[13]〜[14]のいずれかに記載の医薬組成物。
[22]
病的障害が、原発性および続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症(OI)、虚血壊死(骨壊死)、骨折および移植治癒(歯科インプラントおよび股関節インプラント)、他の障害による骨減少、例えば、HIV感染、癌もしくは関節炎に付随する骨減少を含む群より選択される、上記[21]に記載の医薬組成物。
[23]
スクレロスチンにより仲介されるか、または増加したレベルのスクレロスチンと関連する病的障害の処置のための医薬の製造における、上記[1]〜[12]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分の使用。
[24]
病的障害が、原発性および続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症(OI)、虚血壊死(骨壊死)、骨折および移植治癒(歯科インプラントおよび股関節インプラント)、他の障害による骨減少、例えば、HIV感染、癌もしくは関節炎に付随する骨減少を含む群より選択される、上記[23]に記載の使用。
[25]
スクレロスチンにより仲介されるか、または増加したレベルのスクレロスチンと関連する病的障害の処置における使用のための、上記[1]〜[12]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分。
[26]
病的障害が、原発性および続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症(OI)、虚血壊死(骨壊死)、骨折および移植治癒(歯科インプラントおよび股関節インプラント)、他の障害による骨減少、例えば、HIV感染、癌もしくは関節炎に付随する骨減少を含む群より選択される、上記[25]に記載の抗体またはその抗原結合部分。
Claims (26)
- 以下を含む、単離抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分:
(a) 配列番号4に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDR1;
(b) 配列番号15に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDR2;
(c) 配列番号26に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域CDR3;
(d) 配列番号37に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDR1;
(e) 配列番号48に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDR2; および
(f) 配列番号59に示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域CDR3。 - 請求項1に記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分であって、
a) 1nM未満のKDでスクレロスチンポリペプチドに結合する;
c) 細胞に基づくWntシグナル伝達アッセイにおいて、スクレロスチンの阻害効果を妨害する;
d) 細胞に基づく石灰化アッセイにおいて、スクレロスチンの阻害効果を妨害する;
e) 溶液阻害アッセイにおいて、LRP6/スクレロスチン相互作用を阻害する; および/または
f) 細胞に基づく機能性アッセイにおいて、BMP6により誘導されるSmad1リン酸化に対するスクレロスチンの阻害効果を妨害する
ものである、抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分。 - 請求項1または2に記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分であって、
a) スクレロスチンの存在下、HEK293細胞株における細胞に基づくWntシグナル伝達アッセイにおいて測定される100nM未満のIC50;
b) スクレロスチンの存在下、MC3T3細胞におけるBMP2誘導石灰化アッセイにおいて測定される500nM未満のIC50;
c) LRP6/スクレロスチンELISAにおいて測定される10nM未満のIC50; および/または
d) スクレロスチンの存在下、MC3T3-E1細胞株におけるBMP6 Smad1リン酸化アッセイにおいて測定される500nM未満のIC50
を有するものである、抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分。 - 以下を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分:
a) 配列番号70に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するVHポリペプチド配列; または
b) 配列番号81に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するVLポリペプチド配列。 - 配列番号81に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するVLポリペプチド配列および配列番号70に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有するVHポリペプチド配列を含む、請求項4に記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号81に示すアミノ酸配列を有するVLポリペプチド配列および配列番号70に示すアミノ酸配列を有するVHポリペプチド配列を含む、請求項5に記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分。
- 以下を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分:
a) 配列番号114に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有する全長重鎖アミノ酸配列; または
b) 配列番号125に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有する全長軽鎖アミノ酸配列。 - 配列番号125に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有する全長軽鎖アミノ酸配列および配列番号114に示すアミノ酸配列と少なくとも95パーセントの配列同一性を有する全長重鎖アミノ酸配列を含む、請求項7に記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号125に示すアミノ酸配列を有する全長軽鎖アミノ酸配列および配列番号114に示すアミノ酸配列を有する全長重鎖アミノ酸配列を含む、請求項8に記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分。
- ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項1〜5のいずれかに記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分。
- IgM、IgEまたはIgGアイソタイプのものである、請求項10に記載の抗スクレロスチン抗体。
- IgG1またはIgG2アイソタイプのものである、請求項11に記載の抗スクレロスチン抗体。
- 治療上有効量の請求項1〜12のいずれかに記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分を1以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む医薬組成物。
- さらなる活性成分を含む、請求項13に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜12のいずれかに記載の抗体または抗原結合部分をコードする単離ポリヌクレオチド。
- 請求項15に記載の1以上のポリヌクレオチドを含むクローニングまたは発現ベクター。
- 配列番号133-154からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列または少なくとも1つのCDR領域をコードする断片を含む、請求項16に記載のベクター。
- 請求項17に記載の1以上のクローニングまたは発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分の製造方法であって、請求項18に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離することを含む、方法。
- 請求項1〜12のいずれかに記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分を含む診断キット。
- スクレロスチンにより仲介されるか、または増加したレベルのスクレロスチンと関連する病的障害を処置するための、請求項13〜14のいずれかに記載の医薬組成物。
- 病的障害が、原発性および続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症(OI)、虚血壊死(骨壊死)、骨折および移植治癒(歯科インプラントおよび股関節インプラント)、他の障害による骨減少、例えば、HIV感染、癌もしくは関節炎に付随する骨減少を含む群より選択される、請求項21に記載の医薬組成物。
- スクレロスチンにより仲介されるか、または増加したレベルのスクレロスチンと関連する病的障害の処置のための医薬の製造における、請求項1〜12のいずれかに記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分の使用。
- 病的障害が、原発性および続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症(OI)、虚血壊死(骨壊死)、骨折および移植治癒(歯科インプラントおよび股関節インプラント)、他の障害による骨減少、例えば、HIV感染、癌もしくは関節炎に付随する骨減少を含む群より選択される、請求項23に記載の使用。
- スクレロスチンにより仲介されるか、または増加したレベルのスクレロスチンと関連する病的障害の処置における使用のための、請求項1〜12のいずれかに記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分。
- 病的障害が、原発性および続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症(OI)、虚血壊死(骨壊死)、骨折および移植治癒(歯科インプラントおよび股関節インプラント)、他の障害による骨減少、例えば、HIV感染、癌もしくは関節炎に付随する骨減少を含む群より選択される、請求項25に記載の抗スクレロスチン抗体またはその抗原結合部分。
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