JP5977921B2

JP5977921B2 - 核酸を精製することを目的とした装置、システムおよび方法

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Publication number: JP5977921B2
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Description

本発明は、化学物質の精製、さらに、より具体的には、化学的な精製および分析を実施するための装置、方法およびシステムに関する。より具体的には、本発明によって提供される装置、方法およびシステムは核酸の精製および分析において、またより具体的にはこのような精製および分析を実施するためのマイクロ流動装置に対して、特に有用な用途を有する。本発明は、分析化学、裁判化学、マイクロ流動およびマイクロスケール装置、医学、および公衆衛生の分野において用途を有する。

高度に小型化した化学装置の創成を目的とした半導体製造技術の拡張（Ｂｅａｃｈ，Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ他、２００７年）によって、特に複雑な混合物中に微量濃度で存在する化学物質を高い精度と正確度で同定する手段を提供することにより、分析化学における変革を創出している。この変革においては、このような装置が迅速で、携帯可能で、且つ経済的な生物学的検出器を提供し、化学的処理、医薬品、法科学、および国防において注目すべき影響を示した。このような装置の例は、微粒子の捕集および同定を目的とした装置（Ｗｉｃｋ、２００７年）、分子的夾雑物の検出を目的とした装置（Ｋｎｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｒｏｄｉｅｒ他、２００７年）、およびタンパク質を検出する装置（Ｔｅｒｒｙ，Ｓｃｕｄｄｅｒ他、２００４年；Ｄｅｓｈｍｕｋｈ２００６年）を含む。その他の装置は、自動化システム内でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて核酸を分離および／または増幅するために、流体技術を用いる。このような装置の例は、キアゲン（ドイツ、ヒルデン）、ロシュ（スイス、バーゼル）アプライド・バイオシステムズ（カリフォルニア州フォスターシティ）、アイダホ・テクノロジーズ（ユタ州ソルトレイクシティ）、およびセファイド（カリフォルニア州サニーベール）より市販されているものである。

しかし、あらゆる分析処理と同様に、処理前にサンプルを調製することは良好な性能を得るために極めて重要である。複雑な因子があまりにも多く存在することおよび目的の分析物をマスクする可能性のある物質の濃度によって、堅牢な検出がほとんど不可能になることもある。この問題は、非常に複雑で不均一な混合物である細胞ライセートの核酸含有量の分析を試みる場合に特に懸念される（Ｃｏｌｐａｎ、２００１年）。携帯型分析装置は遠心分離機および分離カラムなどといった一般的な実験補助装置が利用できない場所で使用されると予測されるので、それらの装置が関係する場合、調製作業はさらに困難となる。それらの場合、意義のある結果を提供するためには、血液または尿サンプルなどの粗サンプルをろ過するための何らかの手段が重要である。流体技術に基づく現行の装置、特に上述のキアゲンの装置は、柔らかく変形しやすいガラスフィルターを使用し、支持基材を必要とする。フィルターは、サンプルから核酸を効率よく補足するために、典型的には約１から３ミクロンの間の小さな孔径を有する。孔径が小さいことから、フィルターはまた比較的薄く、サンプルを小さな孔径に通過させる際の流体流動抵抗を低減するために、典型的には厚さ２ｍｍ未満である。キアゲンの方法では、サンプルは典型的にはグアニジンなどのカオトロピック剤と混合され、さらに遠心力を用いて混合物をガラスフィルターに通過させ、その中で流体は一方向のみに流れる。核酸はガラスフィルターに結合し、エタノールまたはイソプロパノールで洗浄され、続いて約ｐＨ８．０の１０ｍＭトリスバッファーまたは水を用いて遊離される。しかし、流体流動により作り出される抵抗およびより大きな流量による目詰まりの可能性のため、小さな孔径により処理できるサンプルの量が制限される。したがって、キアゲン装置などの装置は容易に損傷されるか、さもなければ容易に効力がなくなる。さらに、これらの特性によってサンプル投入量、検査できるサンプルの種類、大容量サンプル、濃度係数、および単純な流動の一体化が制限される。

処理前のサンプルろ過にはより大きなガラスフィルターが使用されてきた。たとえば、米国特許第４，９１２，０３４号（Ｋａｌｒａ，Ｐａｗｌａｋ他、１９９０年）は、グラスファイバーより製造されたオプションプレフィルターアセンブリを含む、液状サンプル中の標的分析物を検出するためのイムノアッセイを記載する。しかし、この装置はマイクロ流動装置ではなく、マイクロスケールＰＣＲ反応前のフィルターとしてガラスフリットを用いることを示しても示唆してもいない。米国特許第４，９２３，９７８号（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ、１９９０年）は、水性ＤＮＡサンプルより望ましくないタンパク質およびタンパク質−ＤＮＡ複合体を除去するためのグラスファイバーフィルターの事前使用を記載するものの、このようなファイバーは結合能力が低いことを指摘し、批判的な態度である（カラム２を参照）。実際、‘９７８号特許では、このようなろ過を実施するために非常に異なる材料を主張していた。米国特許第６，２７４，３７１号（Ｃｏｌｐａｎ、２００１年）は、核酸分析の前に細胞ライセートから望ましくない不純物を除去するための好ましいろ過剤として、シリカゲル、酸化アルミニウム、および珪藻土を記載する。米国特許第６，８００，７５２号（Ｔｉｔｔｇｅｎ、２００４年）は、クロマトグラフィ材料が担体およびイオン交換機能を有し、担体がプラスチックフリットなどの支持材上に繊維性材料を含む、核酸を含む混合物を分離するために当該材料を用いることを記載する。

しかしながら、その結果としてこうした装置の現世代の制限を克服し、核酸を分離および同定するために有効な流動装置を提供するニーズが残る。本発明は、これらおよび他のニーズを満たす。

以下の先行技術文献は、その全文を参照文献として且つあらゆる目的で本明細書に援用する。

米国特許第７，１８９，３５８号（Ｂｅａｃｈ，Ｒ．Ａ．，Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｒ．Ｐ．他（２００７年）．ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＭｉｃｒｏｐｕｍｐＡｎａｌｙｓｉｓＣｈｉｐａｎｄＭｅｔｈｏｄｏｆＭａｋｉｎｇｔｈｅＳａｍｅ）米国特許第６，２７４，３７１号（Ｃｏｌｐａｎ，Ｍ．（２００１年）．ＰｒｏｃｅｓｓａｎｄｄｅｖｉｃｅｆｏｒｔｈｅＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＳｕｃｈａｓＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，ｆｒｏｍ２０ＮａｔｕｒａｌＳｏｕｒｃｅｓ）米国特許第６，９８９，１３０号（Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ａ．Ｊ．（２００６年）．ＭｅｔｈｏｄａｎｄＡｕｔｏｍａｔｅｄＦｌｕｉｄｉｃＳｙｓｔｅｍｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳａｍｐｌｅ）米国特許第４，９１２，０３４号（Ｋａｌｒａ，Ｋ．Ｌ．，Ｐａｗｌａｋ，Ｋ．他（１９９０年）．ＩｍｎｎｉｎｏａｓｓａｙＴｅｓｔＤｅｖｉｃｅａｎｄＭｅｔｈｏｄ）米国特許第７，２０８，１２３号（Ｋｎｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．Ａ．，Ｒｏｄｉｅｒ，Ｄ．他（２００７年）．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇＳｙｓｔｅｍａｎｄＭｅｔｈｏｄ）米国特許第４，９２３，９７８号（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ｒ．Ｍ．（１９９０年）．ＰｒｏｃｅｓｓｆｏｒＰｕｒｌｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ）米国特許第６，７９０，６５２号（Ｔｅｒｒｙ，Ｂ．Ｒ．，Ｓｃｕｄｄｅｒ，Ｋ．Ｍ．他（２００４年）．ＭｅｔｈｏｄａｎｄＡｐｐａｒａｔｕｓｆｏｒＨｉｇｈＤｅｎｓｉｔｙＦｏｒｍａｔＳｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒＢｉｏａｃｔｉｖｅＭｏｌｅｃｕｌｅｓ）米国特許第６，８００，７５２号（Ｔｉｔｔｇｅｎ，Ｉ（２００４年）．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＭａｔｅｒｉａｌａｎｄａＭｅｔｈｏｄＵｓｉｎｇｔｈｅＳａｍｅ）米国特許第７，２５０，１３８号（Ｗｉｃｋ，Ｃ．Ｈ．（２００７年）．ＭｅｔｈｏｄａｎｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇａｎｄＲｅｃｏｒｄｉｎｇＳｕｂｍｉｃｒｏｎＳｉｚｅｄＰａｒｔｉｃｌｅｓ）

第１の態様においては、本発明は核酸および異物を含有する混合物よりこのような核酸を分離するための方法を提供する。本発明における使用に適した核酸は、微生物ＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡを含む。１つの実施形態においては、本発明の方法は核酸を異物から分離するために有効な条件の下で、混合物をガラスフリットに通過させることを含む。より具体的な実施形態においては、ガラスフリットは焼結ガラスフリットである。一部の実施形態においては、ガラスフリットは約２ミクロンと約２２０ミクロンの間の孔径を有し；より具体的な実施形態においては、ガラスフリットは約１５０ミクロンと約２００ミクロンの間の孔径を有し；他のより具体的な実施形態においては、ガラスフリットは約２ミクロンと約１００ミクロンの間の孔径を有し；さらに具体的には、ガラスフリットは約４０ミクロンと約７５ミクロンの間の孔径を有し；他のさらに具体的な実施形態はガラスフリットが約２ミクロンと約２０ミクロンの間の孔径を有するものを含む。他の実施形態においては、本発明の方法は、混合物をガラスフリットに通過させることにより第１のろ過混合物を生成した後、第１のろ過混合物から核酸を分離するために有効な条件の下で、第１のろ過混合物を第２のガラスフリットに通過させることを含む。

第２の態様においては、本発明は核酸および異物を含有する混合物よりこのような核酸をろ過分離するための装置を提供する。一部の実施形態においては、装置は入口および出口を有し；その中に約２ミクロンと約２２０ミクロンの間の孔径を有する少なくとも１つのガラスフリットが排置され、且つ入口と出口の中間の位置に少なくとも１つ配置された中空チャンバーを含む。より具体的な実施形態においては、ガラスフリットは焼結ガラスフリットである。他の実施形態においては、ガラスフリットは焼結ガラスフリットである。一部の実施形態においては、ガラスフリットは約２ミクロンと約２２０ミクロンの間の孔径を有し；より具体的な実施形態においては、ガラスフリットは約１５０ミクロンと約２００ミクロンの間の孔径を有し；他のより具体的な実施形態においては、ガラスフリットは約２ミクロンと約１００ミクロンの間の孔径を有し；さらにより具体的には、ガラスフリットは約４０ミクロンと約７５ミクロンの間の孔径を有し；他のさらに具体的な実施形態はガラスフリットが約２ミクロンと約２０ミクロンの間の孔径を有するものを含む。

第３の態様においては、本発明は核酸および異物を含有する混合物より１つあるいはそれ以上のこのような核酸を同定する流動装置を提供する。一部の実施形態においては、本発明の流動装置は入口、出口、および入口と出口の間にあって入口および出口のそれぞれと連絡する少なくとも１つの流体反応チャンバーを含む。装置は、入口および反応チャンバーに近接する位置に配置され、且つ入口および反応チャンバーのそれぞれと流動的に連絡する少なくとも１つのガラスフリットをさらに含む。ガラスフリットは約２ミクロンと約２２０ミクロンの間の孔径を有する。混合物は入口を経て装置に流入し、ガラスフリットを通過し、そこからろ過生成物として流出した後流体反応チャンバーに流入する。少なくとも１つの流動試薬ディスペンサーがガラスフリットと反応チャンバーの中間かつそれらと流動的に連絡して配置される。より具体的な実施形態においては、ガラスフリットは焼結ガラスフリットである。一部の実施形態においては、ガラスフリットは約２ミクロンと約２２０ミクロンの間の孔径を有し；より具体的な実施形態においては、ガラスフリットは約１５０ミクロンと約２００ミクロンの間の孔径を有し；他のより具体的な実施形態においては、ガラスフリットは約２ミクロンと約１００ミクロンの間の孔径を有し；さらに具体的には、ガラスフリットは約４０ミクロンと約７５ミクロンの間の孔径を有し；他のさらに具体的な実施形態はガラスフリットが約２ミクロンと約２０ミクロンの間の孔径を有するものを含む。他の実施形態においては、流動装置はガラスフリットに近接するヒーターを含む。

これらおよび他の態様および利点は、以下の「発明を実施するための形態」が付属の図面と共に読まれることによって明らかになるであろう。

本発明に従って核酸を精製するためのガラスフリット装置（「フィルターモジュール」）の模式図である。本発明によるフィルターの図示である。図２Ａは本発明に従って核酸を精製するためのガラスフリット装置（「フィルターモジュール」）の例示分解組み立て図である。図２Ｂは同じ装置の破断図である。本発明に従って核酸を精製するためのガラスフリット装置（「中空チャンバー」）の模式図である。本発明によるマイクロアレイ装置の模式図である。本発明に従って核酸を精製および同定するためのプロセスのフローチャートである。サンプル材料（全血中濃度１×１０^５個／ｍＬのＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ細胞１００μＬ）の蛍光をＰＣＲサイクルの関数として測定することにより証明されるところの、図２Ａおよび図２Ｂに示すところの本発明に従った装置の改善された性能特性を図示するグラフである。実線（Ａ）は本発明に従って処理したサンプルの結果を示し；破線（Ｂ）はキアゲンより市販されている装置を用いて処理したサンプルを示し；破線（Ｃ）および（Ｄ）は未処理サンプルおよび陰性対象である。サンプル材料（喀痰中濃度１×１０^４個／ｍＬのＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ細胞５００μＬ）の蛍光をＰＣＲサイクルの関数として測定することにより証明されるところの、図３に示すところの本発明に従った装置の改善された性能特性を図示するグラフである。実線（Ａ）は本発明に従って処理したサンプルの結果を示し；破線（Ｂ）は未処理サンプルを示し；破線（Ｃ）は陰性対象である。

本発明は、タンパク質、小分子、細胞膜断片などの他の物質と複合された核酸混合物から、これを少なくとも部分的に精製するための方法および装置を提供する。

本明細書で用いるところの「核酸」は個々の核酸、および天然に生成するものであれ人工的に合成されたもの（その類似体を含む）であれ、またはその修飾体、特に自然に発生することが知られている修飾体であれ、あらゆる長さを有するＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸の重合鎖を指す。本発明に適した核酸鎖長の例は、ＰＣＲ生成物に適した長さ（例：約５０塩基対（ｂｐ））、およびヒトゲノムＤＮＡ（例：ほぼキロ塩基対（Ｋｂ）からギガ塩基対（Ｇｂ）単位である）を含むが、これに限定されない。従って、用語「核酸」が単独の核酸、さらには、たとえば発現配列タグまたは遺伝子フラグメントといった、小さなヌクレオチドフラグメントフラグメントである天然または人工の連鎖ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびその組み合わせ、さらには個々の遺伝子および染色体全体までも含むゲノム材料を例とするより大きな鎖を包含することが認識されるであろう。より具体的な実施形態においては、核酸は細菌またはウイルスなどの病原体に由来する。このような病原体はヒトおよび動物に対して有害なものを含む。一部の実施形態においては、前者のうち病原体は兵器化された天然発生病原体を含む生物兵器として使用されるものである。一部の実施形態においては、核酸は微生物ＤＮＡを含む。本発明の１つの実施形態においては、微生物ＤＮＡはＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓに由来する。他の実施形態においては、核酸はヒトまたは動物に由来する。一部の実施形態においては、核酸はヒトゲノムＤＮＡを含む。

第１の態様においては、本発明は核酸および異物を含有する混合物よりこのような核酸を分離するための方法を提供する。一部の実施形態においては、本発明の方法は、異物から核酸をほぼ分離するために有効な条件下で、入口および出口が同一で且つその中に少なくとも１つの多孔質フィルターが排置され；混合物を前記入口および出口を有する中空チャンバーに通過させることを含む。本明細書で用いるところの「異物」は、サンプル中の核酸とは異なるすべての物質を指す。このような異物の例は、タンパク質、デンプン、脂質、金属イオン、および膜フラグメントなどのようなより大きな細胞構造を含むが、これに限定されない。本明細書で用いるところの語句「ほぼ分離する」は、一部の実施形態においては、異物に対する純度が少なくとも３０％の核酸を提供する、より具体的な実施形態においては、異物に対する純度が少なくとも５０％の核酸を提供する、さらにより具体的な実施形態においては、異物に対する純度が少なくとも７０％の核酸を提供する、さらにより具体的な実施形態においては、異物に対する純度が少なくとも９５％の核酸を提供する、またさらにより具体的な実施形態においては、異物に対する純度が少なくとも９９％の核酸を提供する分離を指す。

本明細書に記載の本発明の多様な実施形態において、ガラスフリットは当業者に既知であるか、または以下に記載するような市販されている標準的な方法を用いて標準的な材料より製造される。一部の実施形態においては、ガラスフリットはほぼ約１ｍｍと約２０ｍｍの間の、より具体的には約２ｍｍと約５ｍｍの間の、さらにより具体的には約２ｍｍと約３ｍｍの間の厚さを有する。本明細書に記載の多様な実施形態を含む、本発明と共に使用するのに適した典型的なガラスフリットの孔径は、約２ミクロンと約２００ミクロンの間である。より具体的な実施形態においては、孔径は約１５０ミクロンと約２００ミクロンの間である。他のより具体的な実施形態においては、孔径は約２ミクロンと約１００ミクロンの間、さらにより具体的には約４０ミクロンと約７５ミクロンの間である。他の実施形態は、孔径が約２ミクロン〜約２０ミクロンの間であるものを含む。微生物ＤＮＡを包含する用途に対しては、約１０ミクロンと約１５ミクロンの間のガラスフリットサイズが適している。ヒトゲノム用途に対してはより大きなフリット孔径を用いることができる。適切なガラスフリットは焼結ガラス（即ち、焼結されたガラス）より構成され、典型的には化学用ガラス器具に用いられ、かつロブ（ドイツ）より市販されている。このようなガラスフリットの選択および製造は当業者に理解されるであろう。

その他の実施形態においては、ガラスフリットは多孔質フィルターによって置き換えられるか、またはこれと組み合わせて使用される。本明細書で用いるところの「多孔質フィルター」は、液状物に含有される少なくとも１つの物質を選択的に通過させるあらゆる材料を指す。より具体的には、「多孔質フィルター」は核酸を含有する液状物よりこのような核酸をほぼ除去することができる材料を指す。適切な多孔質フィルターの例は、核酸を捕捉するよう設計されたろ紙（例：ＦＴＡペーパー、ワットマンより入手可能）、グラスファイバー、ガラスビーズ、インビトロジェンより入手可能なチャージスイッチテクノロジーコーティングビーズ、酸化アルミニウムフィルターおよび多孔質モノリスポリマーを含むが、これに限定されない。こうした材料および製品は当業者に周知である。一部の実施形態においては、多孔質フィルターはガラスフリットからなる。さらに具体的な実施形態においては、ガラスフリットは焼結ガラスフリット（即ち、焼結されたガラスフリット）である。ガラスフリットまたは焼結ガラスフリットにろ過機能を提供するのに適したその他の適切な材料はシリコンおよびＸＴＲＡＢＩＮＤ（Ｘｔｒａｎａ社、コロラド州ブルームフィールド）である。このような材料が本発明のろ過機能を実施するための設計は、当業者にとって明らかであろう。

一つの実施形態においては、上述のガラスフリットはフリットホルダーまたは流動モジュールに一括化されている。こうしたホルダーまたはモジュールの１つの典型的な実施例は、図１の１０００の破断図に示されている。この図では、まさに上述の通りのガラスフリット（１００４）がハウジング（１００８）の内部に留置されている。ハウジングは入口（１０１２）を含み、そこから目的の核酸を含む流体混合物が流入し、且つ本明細書に記載するところのガラスフリットと相互作用し、ハウジングの出口（１０１６）を通過する第１のろ過混合物を生成する。フィルターホルダーまたはモジュールから流出した後、第１のろ過混合物は以下に記載するような出口と流動的に接触する他のチャンバー、または捕集器に進むことができる。一部の実施形態においては、１０２０に示すヒーターが任意に含まれる。このような装置の設計および製造は当業者に理解されるであろう。

本発明のこの態様の第２の実施形態は、図２Ａおよび図２Ｂに示される。このような装置の設計および製造は当業者に既知である。図２Ａは、上部ハウジングボディ（２００２）および下部ハウジングボディー（２００４）を含む、フリットホルダーの１つの実施形態の分解組み立て図（２０００）である。下部ハウジングボディは、図２Ｂにより詳細に記載されており、その中に上述のガラスフリット（２００８）が１つあるいはそれ以上排置されている陥凹（２００６）を含む。ガラスフリットは、ガスケット（２０１０，２０１２）を用いてハウジングボディに収容される。下部ハウジングボディ（２００４）は、分離する核酸を含有する材料がそこを経てガラスフリットに導入される入口（示さず）、および廃棄物および精製された核酸がそこよりフィルターモジュールから流出する出口（２０１４）も含む。図２Ｂはフリットハウジングの破断面である。この図では、上述の通りの要素に加えて、ガラスフリットおよび出口を通過する材料の流動を方向付ける導管と共に、入口（２０１８）を示す。

他の態様においては、本発明は核酸および異物を含有する混合物よりこのような核酸を分離するための装置を提供する。本発明によるこのようなフィルターの１つの実施形態は、図３の３０００に示す。この図では、核酸を含む混合物がその中を通過する第１の開口部（３００８）および第２の開口部（３０１２）を有する中空チャンバー（３００４）、および少なくとも部分的に分離された混合物がそこから流出する出口がある。入口と出口の間には、中空チャンバーの内部容積の少なくとも一部を経て軸方向に延伸する上述のガラスフリット（３０１８）があり、その範囲は３０１６に示すとおりである。一部の実施形態においては、このようなフリットが１つまたはそれ以上使用される。さらに他の実施形態においては、少なくとも１つのガラスフリットが焼結ガラスによって製造される。このような装置の設計および製造は当業者に既知である。

一部のより具体的な実施形態においては、中空チャンバーの一方の末端が円錐台形状を有し材料が始めに第２の開口部より取り込まれ、ガラスフリットを通過し、さらにろ過された後フリット上のチャンバーの一部に保持されるよう、チャンバーがピペッティング器具の末端、たとえばピペットチップなどと嵌合するように寸法取りされる。一部の実施形態においては、フリットの上部のチャンバーの一部に保持されたサンプルはフリットを通過して第２の開口部（３０１２）を通過して戻る。

他の実施形態においては、上述のピペットチップはフリットを加熱して混合物からの核酸の分離を促進するよう設計された加熱装置と組み合わされる。より具体的な実施形態においては、ヒーターはピペットチップの内部に嵌合するよう寸法取りされる。このような装置の設計および製造は当業者に既知である。

さらに他の実施形態においては、ピペットチップは電子ピペッターまたはロボット式ピペッティングワークステーションと対になってフリットを通過する流量を制御する。一部の実施形態においては、電子ピペッターは手持ち式装置である。このような装置の設計、製造および操作は当業者に既知である。

本発明の一部の実施形態においては、２つあるいはそれ以上の多孔質フィルターを組み合わせて用いる。より具体的な実施形態においては、各層は異なる孔径を有する。具体的な作用理論と関連付けることを所望することなく、フィルターの孔径がより大きければより大きな粒子を補足するので、プレフィルターの役割を果たすことができる。たとえば、４０ミクロン〜６０ミクロン孔径のフィルターを１０ミクロン〜１５ミクロン孔径のフィルターと直列に用いて、サンプル（例：血液）よりヒトゲノムＤＮＡを枯渇させて微生物ＤＮＡを分離することも可能である。４０ミクロン〜６０ミクロン孔径のフィルターによって大量のヒトＤＮＡを除去することにより、ヒトゲノムＤＮＡは大きく干渉できるほど高濃度に存在しなくなるので、低コピーの微生物ＤＮＡを１０ミクロン〜１５ミクロン孔径のフィルターとより良好に結合させて分析をより堅牢にすることができる（例：全ゲノム増幅によって）。多孔質フィルターは上述のピペットチップ内にあってそれぞれ約５ｍｍの厚さおよび直径を有してもよい。一部の実施形態においては、２つあるいはそれ以上の多孔質フィルターを融着させてほぼモノリス的な構造を形成する。このような装置の設計、製造および操作は当業者に既知である。

フィルターがピペット内に排置されるより具体的な実施形態においては、より大きな孔径を有するガラスフリットはピペットチップの入口により近く排置される。ここでも特定の作用理論と関連付けることは所望しないものの、当業者はより大きな孔径のフィルターをピペットチップ入口により近く配置することによって、フリット内でより均一な核酸結合の分布を提供することができることを認識するであろう。比較することによって、当業者は、核酸がフリットに流入したそのときに最初に接触する可能性がより高いので、そうしなければ核酸がピペットチップ開口部に最も近い領域でフリットと結合する傾向を示すことを予測するであろう。

さらに他の態様においては、本発明は本発明に従って核酸を分析するためのマイクロ流動装置を提供する。このようなマイクロ流動装置の一つの実施形態を図４の４０００に示す。本明細書に記載のフリットホルダー（４００２）が提供される。上流には、溶離バッファー（４００４）の供給源と流動的に連絡するフリットホルダー、塩酸グアニジン（Ｇｕ）レザバー（４００６）およびＧｕ混合塔（４００８）、ＧｕおよびＧｕ混合塔からの流動がバルブ（４０１０）によって制御される。Ｇｕ混合塔はさらにエタノール−空気供給源（４０１２）と流動的に連絡する。当業者は、Ｇｕ以外のカオトロープを本発明と共に使用できることを認識するであろう。さらに、サンプル捕集塔（４０１６）と流動的に連絡するビーズビーター（４０１４）もあり、さらに入口チェックバルブ（４０１８）および電気端子（４０２０）の方とも流動的に連絡する。これらの要素からの流出はバルブ４０２２によって制御される。

図４を続けて参照すると、フリットホルダー（４００２）の下流には廃液タンク（４０２４）があり、ここへの流動はバルブ（４０２６）によって制御される。フリットホルダーより下流の流動も、流路の第１の分枝に沿った溶離塔（４０３０）およびチェックバルブ（４０３２）；および第２の分枝に沿ったもう１つのバルブ（４０３４）への流動を制御する、第２のバルブによって制御される。バルブ４０３４から下流に続いて、１つあるいはそれ以上のＰＣＲ試薬レザバー（４０３６）およびＰＣＲチャンバー（４０４０）に至るバルブ（４０３８）がある。ＰＣＲチャンバーの下流には、ＰＣＲチャンバーからハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーレザバー（４０４８）および廃液容器（４０５２）とも流動的に連絡するマイクロアレイチャンバー（４０４８）に至る流動を、バルブ４０４６と共に制御するバルブ（４０４２）がある。このような装置の設計および製造は当業者に既知である。

図４に関して記載された装置の操作は、図５の５０００に示されたフローチャートにより例示される。粗サンプル、たとえば目標の細胞を含有する喀痰サンプルなどを入手した後（５００２）、ビーズビーター４０１４を用いて細胞を溶解し（５００４）、混合物がフリット４００２を通過して核酸を精製し（５００６）ＰＣＲチャンバー４０４０によって増幅し（５００８）、さらにマイクロアレイチャンバー４０５０で検出する（５０１０）。

本発明は、特定の理論あるいは操作と関連付けることなく、結合能力を高めるために比較的厚く、流体抵抗を低くし、流量を速め、臨床および環境サンプル中の粒子に対する抵抗を高めるために比較的大きな多孔質を含み、かつ堅牢な操作および一体化された単純な製造のために疎な材料（例：シリカゲル、珪藻土、グラスビーズ）およびもろく壊れやすい材料（例：ファイバーフィルター、メンブランフィルター、シリコンマイクロ構造体）によって構成されない堅牢で自己支持性のフリット構造を実践することによって上記のニーズを満たす。

以下の実施例は、本発明のいくつかの態様を例示し、本発明の実施において当該技術の当業者を助けることを目的として提供される。これらの実施例は、いかなる方法でも決して本発明の範囲を制限すると見なされない。

（１．本発明の装置を用いるためのプロトコル）
図２Ａおよび２Ｂを参照し、本発明に従った精製および検出を実践するためのプロトコルを以下に提供する。
１．ガラスフリットをホルダーに挿入する（本発明の４つの異なる多孔性：小孔径、中孔径、大孔径および特大孔径のうちの１つ）。ハウジングを緊止する。
２．サンプル５００μＬ（１０^４コピー／ｍＬ）と６Ｍグアニジン５００μＬ（ｐＨ６．５）を混合する。
３．１ｍＬシリンジを用いて流量１００μＬ／分で混合液（１ｍＬ）をフリットに通過させる。５ｍＬシリンジを用い、手作業で空気をフリットに通過させてサンプルをパージする。
４．１ｍＬシリンジを用いて、１ｍＬ／分の流量で７０％エタノール１ｍＬ（ＥｔＯＨ）を通過させて結合した核酸を洗う。５ｍＬシリンジを用い、手作業で空気をフリットに通過させてＥｔＯＨをパージする。
５．１ｍＬシリンジを用いて、バッファーが出口の配管から見え始めるまで、１００μＬ／分で溶離バッファー（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）をフリットホルダーに慎重に通過させる。
６．ヒートブロックをフリットホルダーの下に置き、７０℃で３分間加熱する。
７．３分後、溶離バッファーをフリットホルダーに通過させ続ける。ＰＣＲ分析用の分画を捕集する（５０μＬ〜１００μＬ）。
８．フリットホルダーに１０％漂白剤（希釈後１週間以上経過していない）１ｍＬ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５ｍＬおよび水５ｍＬでフリットホルダーを洗い流す。フリットを交換する。

（２．発明を実践するための第２のプロトコル）
図３を参照し、本発明に従って精製および検出を実践するためのプロトコルを以下に提供する。
１．バイアルＡに入った６Ｍグアニジン５００μＬにサンプル５００μＬを加える。ボルテックスを用いて混合する。
２．包埋されたフリットを有する１．２ｍＬのピペットチップを電子ピペッター（ギルソンコンセプト）に着接する。
３．電子ピペッターのスピードを１（最低スピード）に設定する。バイアルＡのサンプル混合物を１ｍＬ吸引する。サンプル混合物ボーラスをフリットに完全に通過させる。サンプル混合物ボーラスは速やかにフリットの上部に定着するであろう。
４．サンプルをバイアルＡに再度注入する。サンプルボーラス混合物は完全にバイアルに再排出されるであろう。
５．手順３および４を４回繰り返す。
６．電子ピペッターのスピードを５（最高スピード）に設定する。バイアルＢに入った７０％エタノール１ｍＬを吸引および分注してフリットに結合した核酸を洗う。４回繰り返す。
７．チップをエタノール溶液上に配置して痕跡量のエタノールを除去する。空気を５回吸引および排出してフリットを乾燥させる。
８．１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μＬを収容するバイアルＣを７０℃に設定したヒートブロック内に留置する。５分間加熱する。
９．電子ピペッターのスピードを１に設定する。溶離バッファーの吸引とバイアルＣへの再注入を５回実施して、フリットから核酸を除去する。

（３．本発明の優れた成果の証明）
本発明の材料および方法を用いて全血および喀痰中のＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ｂａ）を処理した、こうしたプロトコルを用いた２つの実験の結果を図６および７に示す。

図６においては、本発明の方法および装置（図２Ａおよび２Ｂ）を用いて処理したサンプル（折れ線Ａ）は、キアゲンより市販されている装置を用いて処理したサンプル（折れ線Ｂ）より優れていた。折れ線ＣおよびＤはそれぞれ未処理投入サンプルおよび陰性対象である。当該実験においては、全血中１０^５個／ｍＬのＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ細胞１００μＬを、本明細書記載の中孔径（１５μ孔径）に通過させるかまたはキアゲン装置に投入して、さらに約５０μＬの溶離液を捕集しＰＣＲを用いて分析した。図に示すように、本発明の材料および方法を用いて処理したサンプルは、ＰＣＲ増幅を約２５サイクル実施した後、先行技術装置を用いて処理したサンプルによる結果を明らかに且つ大きく上回った。

図７は、喀痰内のＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ細胞サンプルを本発明の材料および方法を用いて処理した、このような方法と装置（図３）を用いた他の実験の結果を図示する。本発明の方法および装置を用いたサンプル（折れ線Ａ）は、未処理サンプル（折れ線Ｂ）より優れていた。折れ線Ｃは対照である。当該実験においては、喀痰中１０^４個／ｍＬのＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ細胞５００μＬを、本明細書に記載の中孔径フリットに通過させて投入し、約１００μＬの溶離液を捕集し定量的リアルタイムＰＣＲを用いて分析した。図に示すように、本発明の材料および方法を用いて処理したサンプルは、ＰＣＲ増幅を約２７サイクル実施した後、未処理サンプルによる結果を明らかに且つ大きく上回った。

上述の方法および装置を用いて、表２に列挙する多様な基質（すなわちサンプルの種類）に添加した表１に列挙する多様な生体に由来するＤＮＡおよび／またはＲＮＡを良好に同定した。
表１
ウイルス性ウマ脳炎（ＶＥＥ）
ワクシニアウイルス
Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ
アデノウイルス
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
インフルエンザＡ
インフルエンザＢ
アデノウイルス＋Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの混合物
インフルエンザＡおよびアデノウイルスの混合物

以下の材料は本発明の方法および装置を用いて良好に分析された。
表２
水／ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１、１．０ｍＭＥＤＴＡバッファー）
スワブ抽出物
喀痰
鼻腔洗浄液
全血

（結論）
本発明は、先行技術を上回るいくつかの利点を提供する：１）流体を移動させるための遠心分離または高圧を必要としない単純化された方法および装置、２）流動を完全な分析システム内に一体化するためのモジュラー装置、３）低い流体抵抗を維持しながら複雑なサンプルを処理するための大孔径、４）流体が双方向に移動できることによる高い抽出および溶離効率、５）他の支持構造の必要性を取り除く剛性、および６）連続サンプルに対して装置を再利用することを可能とする耐久性。本明細書には多様な具体的実施形態および実施例が記載されているが、当業者は本開示の趣旨または範囲から離れることなく本発明の多くの異なる実践を達成できることを理解するであろう。たとえば、ガラスフリットの代わりに核酸に親和性のある他の材料を使用することも可能であり、またガラスフリットを修飾してグアニジンなどのカオトロープ塩を用いることなく核酸の誘因を改善することもできる。ガラスフリットは微生物および毒素を抽出する固定化抗体を含有することもできる。さらに他の変法が当業者に明らかとなるであろう。

Claims

核酸、カオトロピック剤および異物を含有する混合物より該核酸を分離するための方法であって：中空チャンバーの内部容積を通過して前記混合物を流動させることを含み；前記中空チャンバーがその中に前記核酸と結合する少なくとも１つの焼結ガラスフリットを配置され、前記異物から前記核酸をほぼ分離するために有効な条件の下で前記混合物が前記焼結ガラスフリットを通過して流れるよう前記焼結ガラスフリットが前記中空チャンバー内に配置され、前記中空チャンバーの中には前記少なくとも１つの焼結ガラスフリット以外には前記核酸と結合する部材は存在せず、
前記混合物が４０ミクロン〜６０ミクロン孔径の第１の焼結ガラスフリットを通過して前記流動をすることにより第１のろ過混合物が生成し、且つ、前記第１のろ過混合物から前記核酸を分離するために有効な条件の下で１０ミクロン〜１５ミクロン孔径の第２の焼結ガラスフリットを通過して前記の第１のろ過混合物を流動させることをさらに含む、前記方法。
前記核酸が微生物ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。