JP5870404B2 - 癌治療のためのドック・ロック（ｄｎｌ）ワクチン - Google Patents

Description

本出願は、米国特許法３５条１１９（ｅ）に基づき、２００８年８月２０日に出願された米国特許仮出願番号第６１／０９０，４８７号の優先権を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、多発性骨髄腫のような癌を治療するために、樹状細胞により、ｉｎ ｖｉｖｏにて抗原を標的とするワクチンの設計および生成に関する。好ましい実施形態では、ワクチンは、ドック・ロック（ＤＮＬ）法により生成され、ここでエフェクター部分は、ＡＫＡＰタンパク質由来のアンカードメイン（ＡＤ）、並びにプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）由来の二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）部分に付着させる。ＤＮＬ複合体は、ＤＤＤ部分が自発的に二量体化してＡＤ部分に結合すると生成され、結果としてＤＤＤおよびＡＤ結合エフェクターの間が２：１の化学量論比を持つ複合体となる。より好ましい実施形態では、エフェクター部分は、抗ＣＤ７４抗体およびＣＤ２０異種抗原のような腫瘍関連異種抗原を含む。最も好ましい実施形態では、抗ＣＤ７４抗体はｈＬＬ１抗体である。ＤＮＬコンストラクトは、多発性骨髄腫（ＭＭ）のような癌に対抗するワクチンを生成するため、および多発性骨髄腫または他のＣＤ２０を発現する癌を伴う患者のＣＤ２０陽性癌細胞のような腫瘍抗原を発現する細胞に対抗して免疫反応を誘発するため、医薬組成物を調製するのに有用である。

多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄における腫瘍性形質細胞のクローン増殖により特徴付けられる血液系腫瘍である。多くの化学療法剤に反応するものの、ＭＭは標準的療法または大用量の化学療法でも生き残り、化学療法剤に耐性を持つＭＭ癌幹細胞の少数集団が存続することに起因して、ほぼ不治のままであり、患者の大多数は最終的に再発する（Ｒｅｅｃｅら，Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，２００８，４９：１４７０−８５）。この少数のＭＭ癌幹細胞は、微小残存病変を構成して再発を引き起こし、結局は治療が全て失敗に終わる。従って、ＭＭ癌幹細胞を根絶するにはＭＭの長期にわたる抑制または治療でさえ提供する場合がある。

最近では、特徴的な形質細胞表面抗原ＣＤ１３８を発現しないが、Ｂ細胞抗原ＣＤ２０を発現する少数集団のクローン形質Ｂ細胞がＭＭ患者のＭＭ細胞株および原発性骨髄の両方から同定された（Ｍａｔｓｕｉら，Ｂｌｏｏｄ ２００４，１０３：２３３２−６）。この少数集団の細胞は、複数の臨床治療用の抗ミエローマ剤に耐性を持ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍａｔｓｕｉら，Ｂｌｏｏｄ ２００４，１０３：２３３２−６；Ｍａｔｓｕｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８，６８：１９０−７）、および３Ｄ培養モデル（Ｋｉｒｓｈｎｅｒら，Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１２：２９３５−４５）にてクローン原性増殖することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏと、第一次移植および第二次移植の両方にて、移植が行われたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスと、においてＭＭ細胞へと分化することができる（Ｍａｔｓｕｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８，６８：１９０−７）。従って、これらＣＤ１３８^ｎｅｇＣＤ２０^＋細胞は、推定的に多発性骨髄腫癌幹細胞を提示することを示唆している（ＨｕｆｆおよびＭａｔｓｕｉ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６：２８９５−９００）。

他の癌幹細胞と同様に、ＭＭ癌幹細胞は多様な化学療法剤に難治性であり、腫瘍の再増殖および再発の原因になる（ＨｕｆｆおよびＭａｔｓｕｉ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６：２８９５−９００；ＹａｎｇおよびＣｈａｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．２００８，２６：７４１−５５）。ＭＭ幹細胞のような癌幹細胞を選択的に標的とし、根絶することができる戦略およびアプローチが必要である。癌幹細胞の多剤耐性を有する理由から、免疫療法およびワクチン接種は、特に標準的治療および／または幹細胞移植後の、腫瘍量が大幅に減少したときにこれらの細胞を根絶する可能性のある治療法を提供し得る。多発性骨髄腫の治療を目的とする、特に、ＭＭ癌幹細胞に対抗する免疫反応を誘発し、ＭＭ癌幹細胞を阻害または根絶することができる有効な組成物、並びに免疫療法およびワクチン接種が必要である。さらには、一般的な癌の治療を目的とする有効な組成物、並びに免疫療法およびワクチン接種法が必要である。

本発明は、ＭＭ幹細胞のような癌幹細胞に対抗するワクチンのための方法および組成物を開示し、当該方法および組成物は、ドック・ロック（ＤＮＬ）法（Ｃｈａｎｇら、２００７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３：５５８６ｓ−９１ｓ）を使用して調製される。ＤＮＬ技術は、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用に適した、安定し、一定の種々の複合体を生成するために使用されてきた。好ましい実施形態では、ＤＮＬ複合体は、二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）部分またはアンカードメイン（ＡＤ）部分に付着するｈＬＬ１抗体のような抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。ＤＤＤ部分は自発的に二量化し、各ＤＤＤ二量体はＡＤ部分に結合する。より好ましい実施形態では、以下の発明を実施するための形態で説明するように、相補的なＡＤ部分またはＤＤＤ部分はＣＤ２０異種抗原に付着し、抗ＣＤ７４部分およびＣＤ２０異種抗原部分を含むＤＮＬ複合体の構造になる。しかし、当業者は、癌に応じて、異なる異種抗原および／または抗体もしくは抗体フラグメントが使用されてよいことを理解するだろう。抗体成分は、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）にＤＮＬ複合体を向け、一方、異種抗原の成分が、標的抗原を発現する細胞に対抗する免疫反応を呼び起こすように処理される。

抗体または抗体フラグメントに対して異なる構造および異なる比率の標的抗原（例えばＣＤ２０）を備えるさまざまな種類のＤＮＬ複合体は、米国特許第７，５５０，１４３号（２８段落３０行目から４４段落２８行目まで参照により本明細書に組み込まれる）、米国特許第７，５２１，０５６号（５８段落１行目から８４段落４５行目まで参照により本明細書に組み込まれる）、米国特許第７，５３４，８６６号（３１段落１行目から３６段落３８行目まで参照により本明細書に組み込まれる）、米国特許第７，５２７，７８７号（６１段落５１行目から９４段落６５行目まで参照により本明細書に組み込まれる）、および米国特許出願公報第２００９／００６０８２号（段落［００３５］から［００９７］まで参照により本明細書に組み込まれる）に開示された方法および組成物のように、請求する方法および組成物の範囲内で構築され、使用されてよい。三量体、四量体、五量体、六量体、および他の構造体から成るＤＮＬ複合体が、先に記載した査定済み特許に報告されている。

最も好ましい実施形態では、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトは、軽鎖可変の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ；配列番号１）、ＣＤＲ２（ＴＶＳＮＲＦＳ；配列番号２）、およびＣＤＲ３（ＳＱＳＳＨＶＰＰＴ；配列番号３）、並びに重鎖可変領域のＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＶＮ；配列番号４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ；配列番号５）、およびＣＤＲ３（ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ；配列番号６）を備えるヒト化またはキメラのＬＬｌ抗ＣＤ７４抗体もしくはそれらの抗原結合性フラグメントを含む。請求するＤＮＬ複合体における使用に適したヒト化ＬＬ１（ｈＬＬ１）抗ＣＤ７４抗体は、米国特許第７，３１２，３１８号に開示されており、当該内容の３５段落１行目から４２段落２７行目まで、かつ図１から図４までが参照により本明細書に組み込まれる。代替的に、他の抗ＣＤ７４抗体、または他のＡＰＣもしくはＤＣ関連抗原に対抗する抗体が使用されてよい。

マウスＣＤ２０配列（配列番号：７）のような、抗癌ワクチン用のＤＮＬ複合体における使用に適したさまざまなＣＤ２０異種抗原配列が当技術分野で知られている。使用できる可能性のある他のＣＤ２０のアミノ酸配列は、技術者であれば、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のタンパク質データベース（ＮＣＢＩ目録第ＮＰ ０３１６６７；Ｐ１９４３７；ＡＡＡ３７３９４；ＢＡＥ４７０６８；ＡＢＡ２９６３１；ＢＡＤ７７８０９を参照されたい）のような、周知されている公共のデータベースを介して容易に入手できる。配列本明細書ではマウスＣＤ２０配列を記載しているが、技術者であれば、ＣＤ２０のアミノ酸配列が知られており、幅広い種から容易に入手でき、かつ抗癌ワクチン用のＤＮＬ複合体に組み込むことができることを理解するだろう。しかし、技術者であれば、他の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が当技術分野で知られており、異なるＴＡＡを発現する腫瘍に対抗する免疫反応を誘起するように、ＤＮＬ複合体において使用されてよいことを理解するだろう。

使用できる可能性のある公知のＴＡＡは、限定されないが、炭酸脱水酵素ＩＸ、αフェトプロテイン、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−Ｉ、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤｌ１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、大腸−特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＦＩｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐｌ００、ＧＲＯＢ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭｌ．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−Ｉ）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、インスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ−４抗体に特異的な抗原、胎盤増殖因子、ｐ５３、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ−抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、ｃＭＥＴ、癌遺伝子マーカー、および癌遺伝子産物（例えばＳｅｎｓｉら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６，１２：５０２３−３２；Ｐａｒｍｉａｎｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７，１７８：１９７５−７９；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００５，５４：１８７−２０７を参照されたい）を含む。マウスタンパク質のアミノ酸配列のような、異種抗原のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースのような公共データベースから容易に獲得できるだろう。

技術者であれば、知られている他の抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントが、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトに組み込まれる可能性があることをさらに理解するだろう。好ましい実施形態では、抗体は、ＡＰＣ、より好ましくは樹状細胞によって発現された抗原に結合する。当技術分野で知られている樹状細胞に関連する種々の抗原は、限定されないが、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＣＤ３４、ＣＤ７４、ＣＤ２０５、ＴＬＲ２（ｔｏｌｌ様受容体２）、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４、およびＨＬＡ−ＤＲを含む。好ましい実施形態では、標的抗原はＣＤ７４である。しかし、樹状細胞と関連すると知られている他の種類の標的抗原、および、そのような任意の別の抗原を標的とする抗体を組み込んだ抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトが、請求する方法および組成物において使用されてよい。幾つかの実施形態では、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトは、抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合性フラグメント、および別の抗樹状細胞抗体またはフラグメントを含み得る。抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトにおいて使用され得る例示的な抗体は、限定されないがｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）およびｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ、米国特許出願第１１／３６８，２９６号）を含み、各実施例部分は、参照により本明細書に組み込まれる。

キメラ抗体の使用は、ヒト抗体の定常領域配列を保有し、従ってマウス抗体と同程度に強いヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を誘発しないため好ましい。ヒト化抗体の使用は、ＨＡＭＡ反応を誘起する可能性をさらに引き下げるため、より一層好ましい。以下に考察するように、対応するヒト抗体のフレームワークおよび定常領域配列と、マウスのフレームワークおよび定常領域配列を置換することによりマウス抗体をヒト化する技術は、当技術分野で周知されており、多くのマウス抗癌用抗体に適用されてきた。抗体ヒト化は、１つ以上のヒトフレームワークのアミノ酸残基を親マウスのフレームワーク領域配列に由来する、対応する残基と置換することも含み得る。また、下記に考察するように、ヒト抗体を産生する技術も周知されており、そのような抗体は、対象の抗癌ワクチン用コンストラクトに組み込まれてよい。

特定の実施形態では、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトは、抗癌ワクチン用コンストラクトを投与する前か、同時か、または投与した後に、少なくとも１つの治療薬と併用して投与されてよい。好ましい実施形態では、治療薬は、抗癌ワクチン用の前に投与される。しかし、別の実施形態では、治療薬は、ＤＮＬコンストラクトとともに同時投与されてよく、または抱合されてよい。以下により詳細に考察するように、当技術分野で知られている任意の治療薬は、限定されないが、放射性核種、免疫調節剤、抗血管新生薬、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス促進剤、光活性治療薬、細胞毒薬物、化学療法剤、毒物、または他の抗体もしくはそれらの抗原結合性フラグメントを含む、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトと併せて使用されてよい。

好ましい実施形態では、治療薬は薬物または毒物のような細胞毒薬物である。薬物は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、シクロオキシゲナーゼ−２阻害薬、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位化合物、ビンカアルカロイド、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、ＳＮ−３８、ドキソルビシンおよびそれらの類似体、代謝拮抗剤、アルキル化剤、有糸分裂阻害薬、抗血管新生薬、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、アポトーシス促進剤、メトトレキサート、ＣＰＴ−１１、並びにそれらの組み合わせから成る群から選択されることも好ましい。

別の好ましい実施形態では、治療薬は、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素および緑膿菌内毒素、並びにそれらの組み合わせから成る群から選択される毒物である。または、免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。

他の好ましい実施形態では、治療薬は、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２１１Ａｔ、^６２Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^１１１Ａｇ、^６７Ｇａ、^１４２Ｐｒ、^１５３Ｓｍ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９Ｒｅ、^２１２Ｐｂ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^７７Ａｓ、^８９Ｓｒ、^９９Ｍｏ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１６９Ｅｒ、^１９４Ｉｒ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、および^２１１Ｐｂ、並びにそれらの組み合わせから成る群から選択される放射性核種である。オージェ放出粒子を伴って、実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、１−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、およびＩｒ−１９２が挙げられる。有利にβ粒子を放出する核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。α粒子を生成しながら実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。そのような放射性核種は、限定されないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、およびＦｍ−２５５を含む。有利にα粒子を放出する放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。有用な、可能性のある追加的放射性同位元素は、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^７５Ｂｒ、^１９８Ａｕ、^２２４Ａｃ、^１２６Ｉ、^１３３Ｉ、^７７Ｂｒ、^１１３ｍＩｎ、^９５Ｒｕ、^９７Ｒｕ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｕ、^１０７Ｈｇ、^２０３Ｈｇ、^１２１ｍＴｅ、^１２２ｍＴｅ、^１２５ｍＴｅ、^１６５Ｔｍ、^１６７Ｔｍ、^１６８Ｔｍ、^１９７Ｐｔ、^１０９Ｐｄ、^１０５Ｒｈ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｈｏ、^１９９Ａｕ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５１Ｃｒ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^２０１Ｔｌ、^２２５Ａｃ、^７６Ｂｒ、^１６９Ｙｂなどを含む。他の実施形態では、治療薬は、色素原および色素から成る群から選択される光活性治療薬である。

代替的に、治療薬は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、αグリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸異性化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、βガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼから成る群から選択される酵素である。そのような酵素は、例えば、比較的非毒性形態で投与されるプロドラッグと併用して使用されてよく、酵素により標的部位にて細胞毒薬物へと変換され得る。他の代替的な手段では、薬物は、対象の内因性酵素により、毒性を下げて変換されるが、治療用酵素により細胞毒性へと再変換されてもよい。

好ましい実施形態では、抗癌ワクチン用ＤＮＬ複合体は、多発性骨髄腫の治療に有用であるが、技術者であれば、ＣＤ２０／抗ＣＤ７４コンストラクトがＢ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫のような、他の形態のＣＤ２０^＋癌のような、他の種類の病気に対して潜在的に有用であり得ることを理解するだろう。ＣＤ２０以外の腫瘍関連異種抗原が使用される場合、技術者は、ＴＡＡに関連する任意の種類の癌が、請求するＤＮＬ複合体を使用して標的とされ得ることを理解するだろう。

さらに他の実施形態は、抗体−ＤＤＤ融合タンパク質もしくは異種抗原−ＤＤＤ融合タンパク質、または抗体−ＡＤ融合タンパク質もしくは異種抗原−ＡＤ融合タンパク質のような融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、当該ＤＮＡ配列を含むベクターおよび宿主細胞、並びに抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトを産生する融合タンパク質を作製する方法に関する。関連する実施形態は、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクト、抗体−ＤＤＤ融合タンパク質もしくは異種抗原−ＤＤＤ融合タンパク質、または抗体−ＡＤ融合タンパク質もしくは異種抗原−ＡＤ融合タンパク質を作製するに有用な融合タンパク質を含む。別の実施形態では、ＤＮＬ複合体のサブユニット成分は、例えば、抗体または抗体フラグメントおよびＤＤＤペプチド、またはＣＤ２０異種抗原およびＡＤペプチドの化学的架橋により形成され得る。特定の実施形態については、融合タンパク質または化学的に架橋した抱合体は、診断薬のようなレポーター部分に付着され得る。種々の診断薬は、放射性核種、コントラスト剤、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、酵素、および光活動性診断薬などが当技術分野で知られている。

好ましくは、診断薬は、２０〜４，０００ｋｅＶの間のエネルギーを持つ放射性核種、または^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^ｌ８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、^８３Ｓｒ、または他のγ-、β-、もしくは陽電子放射体から成る群から選択される放射性核種である。

診断薬は、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）のような常磁性イオン、またはバリウム、ジアトリゾ酸、ヨード化ケシ油エチルエステル、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、イオセタム酸、イオダミド、イオジパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセム酸、ヨーセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメチン酸、イオタズル、イオテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾ酸、プロピリオドン、および塩化タリウムのような放射線不透過性物質も好ましい。

さらに他の実施形態では、診断薬は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンから成る群から選択される蛍光標識化合物、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルから成る群から選択される化学発光標識化合物、またはルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンから成る群から選択される生物発光化合物である。

ヒト血液のＤＣサブセット、Ｂ細胞、および単球におけるｈＬＬ１の特異的結合を示す図である。 ヒト血液のＤＣサブセット、Ｂ細胞、および単球におけるｈＬＬ１の特異的結合を示す図である。 ヒト血液のＤＣサブセット、Ｂ細胞、および単球におけるｈＬＬ１の特異的結合を示す図である。 ヒト単球に由来する未熟ＤＣ対成熟ＤＣにおけるＣＤ７４発現、および当該ＤＣを用いたｈＬＬ１の結合効率を示す図である。 ヒト単球に由来する未熟ＤＣ対成熟ＤＣにおけるＣＤ７４発現、および当該ＤＣを用いたｈＬＬ１の結合効率を示す図である。 ヒト単球に由来する未熟ＤＣ対成熟ＤＣにおけるＣＤ７４発現、および当該ＤＣを用いたｈＬＬ１の結合効率を示す図である。 Ｂ細胞の悪性Ｄａｕｄｉ細胞および正常なＤＣに関するｈＬＬ１細胞毒性効果の対象比較を示す図である。 Ｂ細胞の悪性Ｄａｕｄｉ細胞および正常なＤＣに関するｈＬＬ１細胞毒性効果の対象比較を示す図である。 Ｂ細胞の悪性Ｄａｕｄｉ細胞および正常なＤＣに関するｈＬＬ１細胞毒性効果の対象比較を示す図である。 Ｂ細胞の悪性Ｄａｕｄｉ細胞および正常なＤＣに関するｈＬＬ１細胞毒性効果の対象比較を示す図である。 ｈＬＬ１によるＤＣの構造上の成熟の増進抑制を示す図である。 ｈＬＬ１によるＤＣの構造上の成熟の増進抑制を示す図である。 ＤＣ媒介したＴ細胞増殖に関してｈＬＬ１の著しい影響が無いことを示す図である。 ＤＣ媒介したＴ細胞増殖に関してｈＬＬ１の著しい影響が無いことを示す図である。 ＤＣ媒介したＴ細胞増殖に関してｈＬＬ１の著しい影響が無いことを示す図である。 ＤＣ媒介したＴ細胞増殖に関してｈＬＬ１の著しい影響が無いことを示す図である。 ＤＣ媒介したＴ細胞増殖に関してｈＬＬ１の著しい影響が無いことを示す図である。 ＤＣ媒介したＴ細胞増殖に関してｈＬＬ１の著しい影響が無いことを示す図である。 ｈＬＬ１治療したＤＣがＴｈ１エフェクター細胞へと好ましく分化することによるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞両極性を示す図である。

定義
本明細書で使用するように、内容が単数のみであると明確にしない限り、「１つ（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「前記（ｔｈｅ）」という用語は、単数または複数を指す。

本明細書で使用するように、「約」という用語は、値のプラスマイナス１０％の範囲にあることを意味する。例えば、「約１００」とは、９０〜１１０の間の任意の数を指す。

抗体とは、全長の（例えば、正常の免疫グロブリン遺伝子フラグメントの組み換えプロセスにより自然に発生または形成される）免疫ブログリン分子（例えばＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントなどの免疫ブログリン分子の免疫活性、抗原結合部分を指す。

抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのような抗体の一部分である。構造に関わらず、抗体フラグメントは、正常な抗体に認識される同一の抗原と結合する。そのため、当該用語は「抗原結合抗体フラグメント」と同意語として使用される。「抗体フラグメント」という用語は、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドのリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質）により連結される、さまざまな領域の重鎖および軽鎖、並びに組み換え一本鎖のポリペプチド分子から成る「Ｆｖ」フラグメントのような、可変領域から成る単離されたフラグメントも含む。本明細書で使用するように、「抗体フラグメント」という用語は、Ｆｃフラグメントまたは単一のアミノ酸残基のように、抗原結合活性を持たない抗体部分を含まない。例えば、単一ドメインの抗体フラグメントのような他の抗体フラグメントは、当技術分野で知られており、請求するコンストラクトに使用されてよい（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら，ＴＩＢＳ ２６：２３０−２３５、２００１；Ｙａｕら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ ２８１：１６１−７５、２００３；Ｍａａｓｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ ３２４：１３−２５、２００７を参照されたい）。

抗体融合タンパク質という用語は、組み換えにより産生された抗原結合分子を指し、同一または異なる特異性を有する同一または異なる単鎖の抗体または抗体フラグメントのセグメントが連結される。融合タンパク質の原子価は、融合タンパク質が単一の抗原またはエピトープを有する結合アームまたは結合部位の数、すなわち一価、二価、三価、または多価を示す。抗体融合タンパク質の多価性により、複数の相互作用を利用して抗原に結合することができ、従って抗原に結合する結合力を高めることができることを意味する。特異性は、抗体融合タンパク質が結合できる抗原またはエピトープの数、すなわち単一特異性、二特異性、三特異性、多特異性を示す。これらの定義を用いると、天然抗体、例えばＩｇＧは、２つの結合アームを有する二価であるが、１つのエピトープに結合するので単一特異性である。単一特異性で多価の融合タンパク質は、１つのエピトープに対し２つ以上の結合部位を有するが、１つのエピトープにしか結合しない。融合タンパク質は、単一抗体成分、異種抗体成分または複数の複製物の同一抗体成分の、多価的な組み合わせまたは多特異的な組み合わせを備え得る。融合タンパク質は、付加的に抗体または抗体フラグメントおよび治療薬を含み得る。そのような融合タンパク質に適している治療薬の例は、免疫調節剤および免疫調節毒物を含む。好ましい毒物の１つは、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、好ましくは組み換えＲＮａｓｅを含む。しかし、用語は限定されるものではなく、種々のタンパク質またはペプチドのエフェクターが融合タンパク質に組み込まれてよい。限定されるものではないが、別の例では、融合タンパク質は、以下に考察するようなＤＮＬコンストラクトを産生するＡＤ配列またはＤＤＤ配列を含んでよい。

キメラ抗体とは、１つの種に由来する抗体、好ましくはげっ歯類の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を備える可変ドメインを含有し、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体に由来する組み換えタンパク質である。動物を適用する場合、キメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌのような他種の抗体に由来してよい。

ヒト化抗体は組み換えタンパク質であり、１つの種、例えばげっ歯類の抗体に由来する抗体のＣＤＲが、げっ歯類の抗体の重鎖および軽鎖の可変鎖から、ヒトの重鎖および軽鎖可変ドメイン（例えばフレームワーク領域配列）に移植される。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。特定の実施形態では、親（げっ歯類）抗体に由来する限定した数のフレームワーク領域のアミノ酸残基が、ヒト抗体フレームワーク領域配列へと置換され得る。

ヒト抗体は、例えば、抗原性誘発に応える特異的ヒト抗体を産生するように「遺伝子操作」されたトランスジェニックマウスから獲得された抗体である。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座の要素は、内因性マウスの重鎖および軽鎖の遺伝子座の標的破壊を含有する胚幹細胞株に由来するマウスの株に導入される。トランスジェニックマウスは、特定の抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、マウスはヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生させるために使用することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を獲得する方法は、Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６（１９９４）、およびＴａｙｌｏｒら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）により説明されている。完全ヒト抗体が、遺伝子または染色体トランスフェクション法とともにファージ提示技術によって構築することもでき、それら全ては当技術分野で知られている。予防接種を受けていないドナーの免疫ブログリン可変ドメインの遺伝子レパートリーからｉｎ ｖｉｔｒｏにてヒト抗体およびそのフラグメントを作製することについては、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。この技術では、抗体の可変ドメイン遺伝子は、線維状のバクテリオファージの主要または微量どちらかの外被タンパク質遺伝子へとフレーム内にてクローンニングされ、ファージ粒子の表面上で、機能的抗体フラグメントとして提示される。線維状の粒子は、一本鎖ＤＮＡのファージゲノムの複製を含有しているので、抗体の機能的特性に基づく選択は、その特性を提示する抗体をコードする遺伝子を選択することになる。この方法では、ファージは幾つかのＢ細胞特性を模倣する。ファージ提示は種々の構成で行うことができ、概説として、例えば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化させたＢ細胞から生成されてもよい。米国特許第５，５６７，６１０号および米国特許第５，２２９，２７５号を参照されたく、それらの実施例部分は参照により本明細書に組み込まれる。

図１は、ヒト血液のＤＣサブセット、Ｂ細胞、および単球におけるｈＬＬ１の特異的結合を示す。（Ａ）異なるＡＰＣサブセットに対するゲート戦略。（Ｂ）ＡＰＣにおけるＣＤ７４発現。（Ｃ）細胞上のｈＬＬ１の結合効率。数値は平均蛍光強度を示す。
図２は、ヒト単球に由来する未熟ＤＣ対成熟ＤＣにおけるＣＤ７４発現、および当該ＤＣを用いたｈＬＬ１の結合効率を示す。ヒト単球に由来するＤＣ（ｈＧＭ−ＣＳＦおよびｈＩＬ−４の存在下で培養５日後）は、ＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ７４抗体またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識したｈＬＬ１を用いて染色し、併せてＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８３に対して蛍光標識したｍＡｂｓを用いて染色した。ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞をゲートおよび分析した。（Ａ）未熟ＤＣおよびＬＰＳ成熟ＤＣにおけるＣＤ７４発現。（Ｂ）未熟ＤＣ対ＬＰＳ成熟ＤＣのｈＬＬ１結合。（Ｃ）未熟ＤＣおよびＬＰＳ成熟ＤＣにおけるＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、およびｈＬＬ１結合の発現比較。
図３は、Ｂ細胞の悪性Ｄａｕｄｉ細胞および正常なＤＣに関するｈＬＬ１細胞毒性効果の対象比較を示す。（Ａ）ＤａｕｄｉおよびＤＣに関するｈＬＬ１の効果比較（Ｂ）広範な用量におけるＤＣの細胞生存に関するｈＬＬ１の効果。（Ｃ）Ｄａｕｄｉ細胞に関するｈＬＬ１の細胞毒性効果（Ｄ）顕微鏡画像は、ＤＣ生存率に関してｈＬＬ１の効果が無いことを示す。
図４は、ｈＬＬ１によるＤＣの構造上の成熟の増進抑制を示す。ｈＧＭ−ＣＳＦおよびｈＩＬ−４の存在下で、ヒト単球に由来する５日後のＤＣからＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞集団をゲートした。（Ａ）フローサイトメトリーにより抗原提示分子ＨＬＡ−ＤＲ、副刺激分子ＣＤ５４およびＣＤ８６の発現を測定した。（Ｂ）抗原提示分子ＨＬＡ−ＤＲ、副刺激分子ＣＤ５４およびＣＤ８６の発現レベル。
図５は、ＤＣ媒介したＴ細胞増殖に関してｈＬＬ１の著しい影響が無いことを示す。ＣＦＳＥ標識した同種異系ＰＢＭＣを用いて、８日（Ａ）または１１日（Ｂ）にわたりｈＬＬ１治療したＤＣを共培養した。ＣＤ４に対してＰｅｒｃｐ抱合したｍＡｂを用いて拡大したＴ細胞を染色した。全Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ４−Ｔ細胞の細胞増殖を分析した。
図６は、ｈＬＬ１治療したＤＣがＴｈ１エフェクター細胞へと好ましく分化することによるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞両極性を示す。電磁ビーズ（ＭＡＣＳ）を用い、枯渇カラムを使用してヒトＰＢＭＣから単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｈＬＬ１治療した同種異系ＤＣとともに共培養した。異なる時間点（１１日目、１３日目、１８日目）にて細胞を採取し、ＰＭＡおよびイオノマイシンを用いて刺激し、蛍光標識したｈＩＦＮ−ｇａｍｍａおよびｈＩＬ−４抗体を用いて染色し、細胞内サイトカインを用いて分析した。Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ０細胞集団をゲートし、分析した。ｈＬＬ１治療したＤＣまたはＧＡＨ架橋してｈＬＬ１治療したＤＣにより刺激したＴ細胞におけるフローサイトカイン産生を測定した。（Ｃ）ＤＣ／Ｔ培養の異なるに日数後における、ＧＡＨによる架橋の有り無しでの、２人のドナーにおけるＴｈ１反応のデータを示す。（Ｄ）ｈＬＬ１によるＴｈ１集団の増加に対する線量効果曲線。

多発性骨髄腫および他の癌を治療するワクチン
ＣＤ２０は通常、Ｂ細胞株期の細胞に発現する。最近では、ＣＤ２０がＭＭ細胞株または臨床検体から単離した少数集団のＭＭ細胞において発現し、当該ＣＤ２０は特徴的な形質細胞表面抗原ＣＤ１３８を発現しないがコロニー形成する高い潜在力を有し、かつ多様な臨床用抗骨髄腫薬に耐性を持つことが報告された（Ｍａｔｓｕｉら、Ｂｌｏｏｄ ２００４，１０３：２３３２−６；Ｍａｔｓｕｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８，６８：１９０−７）。これらＣＤ２０＋ＣＤ１３８-細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび３−Ｄ培養モデルにおいてクローン性増殖することができ（Ｋｉｒｓｈｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１２：２９３５−４５）、ｉｎ ｖｉｔｒｏと、一次移植および二次移植の間、移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルとにおいてＭＭ細胞へと分化させることができる。従って、これらＣＤ１３８^ｎｅｇＣＤ２０＋細胞は、推定的な多発性骨髄腫癌幹細胞を提示することが示唆されてきた。

癌の免疫療法のために、免疫寛容を絶つ手段として異種抗原を用いて免疫化すること
多くの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、本質的に免疫原性ではない組織分化抗原を提示する。高い親和性を備えるこれらＴＡＡ／自己抗原を認識するＴ細胞は、胸腺にてクローン的に欠落するか、末梢にてアネルギー化される。しかし、異種抗原を用いた免疫化により、相同性の自己抗原に対抗する免疫寛容を克服できることが示されてきた。第一相臨床試験では、組み換えマウスＰＡＰにより活性させた樹状細胞を用いて免疫化した２１人の前立腺癌の患者のうち１１人の患者は、相同性の自己抗原に反応するＩ型Ｔ細胞増殖性応答を発達させ、６人の患者は、以前まで進行していた前立腺癌が臨床的に安定した（Ｆｏｎｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，１６７（１２）：７１５０−６）。これらの結果は、異種抗原による免疫化がヒトの自己抗原に対する寛容性を遮断させることができ、結果として臨床的に著しい抗腫瘍効果を与えることを証明している。

免疫療法の標的およびＭＭに対するワクチン接種としてのＣＤ２０
前述のように、ＣＤ２０はＭＭ癌幹細胞の証明となる。自己抗原は、ほとんどの分化段階で正常なＢ細胞に発現するが、免疫寛容に起因してワクチン戦略により標的することが理論的に困難である。しかし、Ｂ細胞リンパ腫の腫瘍に挑むモデル作りにおいて、ＣＤ２０に対抗する異種ＤＮＡワクチンにより、成功したワクチン接種が実現されてきた。Ｂ細胞に対抗する自己免疫は、ＣＤ２０を標的とするワクチンにより誘発することができたが、Ｂ細胞プールは主要組織および決定組織ではなく、系統の前駆細胞から補充することができるため、大きな問題を起こすものではない。これらを考慮すると、ＣＤ２０を標的とする治療ワクチンは、ＭＭ癌幹細胞の選択的根絶に有効である。

ＭＭ幹細胞を根絶する潜在的モダリティとしてのモノクローナル抗ＣＤ２０抗体
ＣＤ２０＋ＭＭ前駆細胞の発見は、ＭＭ患者におけるリツキシマブ、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の有効性を試験する、幾つかの小規模な臨床治験を促進させてきた。Ｋａｐｏｏｒら（Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００８，１４１：１３５−４８）により概説されているように、リツキシマブを用いた抗ＣＤ２０治療は、多発性骨髄腫を伴うＣＤ２０＋患者のおよそ１０％において部分的に反応を引き出す。また、１０カ月〜２７カ月の期間にわたり、ＣＤ２０＋患者の５０％〜５７％において疾患が安定化するという予備的証拠がある（Ｋａｐｏｏｒら（Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００８，１４１：１３５−４８）。さらに、Ｂｅｒｇｕａら（Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００８，２２：１０８２−３）による症例報告では、リツキシマブが化学療法と併用して使用され、免疫表現型、または骨髄穿刺もしくは骨髄生検のいずれかにて治療後の微小残存病変は見出されず、ＣＤ２０＋形質細胞が消滅したことを実証した。これらの結果は、大規模な臨床治験を納得させ、骨髄腫におけるこの戦略の役割を確立させている。ＣＴＬ反応を誘発するので、ワクチンアプローチは、ＣＤ２０ＭＭ幹細胞に対抗するモノクローナル抗体治療を補うことが予想される。

ワクチン接種および免疫寛容を絶つ効率的な戦略としての、ｉｎ ｖｉｖｏにおける樹状細胞および他抗原提示細胞に対する抗原の標的
プロフェッショナルな抗原提示細胞として、樹状細胞（ＤＣ）は先天性免疫および獲得性免疫の編成において極めて重要な役割を果たし、効果的なワクチンを作製するために利用されてきた（Ｖｕｌｉｎｋら，Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８，９９：３６３−４０７；Ｏ’Ｎｅｉｌｌら，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，３６：１３１−４１）。Ｉｎ ｖｉｖｏにて、ＤＣに対して抗原を標的とすることにより、骨の折れる高価なｅｘ ｖｉｖｏでの抗原負荷および培養を避け、ＤＣに基づいた免疫療法を大規模に適用することを促すことができるので、ＤＣに基づいたワクチン接種への有望なアプローチを意味する（Ｔａｃｋｅｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７，７：７９０−８０２）。より著しくは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＤＣを標的とするワクチン接種は、抗腫瘍免疫反応を引き出すことに一層効率的であり、動物モデルにおいて腫瘍増殖を制御することに一層効果的である（Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００７， ３０：７１５−７２６）。ＤＣに加え、Ｂ細胞もＴｈ１／Ｔｈ２細胞を初回刺激し（Ｍｏｒｒｉｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，１５２：３７７７−３７８５；Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１６２：５６９５−５７０３）、相互提示を介してＣＤ８Ｔ細胞を活性化することができる可能性のある、別の種類の抗原提示細胞である（Ｈｅｉｔら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２：１５０１−１５０７；Ｙａｎら，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５，１７：８６９−７７３）。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＢ細胞に対して抗原を標的とすることによりＭＵＣｌの免疫寛容を絶つことが近頃報告された（Ｄｉｎｇら，Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１２：２８１７−２５）。

ワクチン接種を標的とする可能性のある受容体としてのＣＤ７４
マンノース受容体のようなＤＣ上に発現した幾つかの受容体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗原を標的とする対象として使用されてきた（Ｈｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７，１７８，６２５９−６２６７；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２，２８４５−２８５２）、ＣＤ２０５（Ｂｏｎｉｆａｚら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００４，１９９：８１５−２４）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（Ｔａｃｋｅｎら，Ｂｌｏｏｄ ２００５，１０６：１２７８−８５）、およびＬＯＸｌ（Ｄｅｉｎｅｓｔｅら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００２，１７，３５３−３６２）など。ＣＤ７４はＭＨＣ ＩＩを正しくフォールディングし、エンドソームにＭＨＣＩＩ−ＣＤ７４複合体を標的させるのに必須のII型内在性膜タンパク質である（Ｓｔｅｉｎら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７，１３：５５５６ｓ−５５６３ｓ；Ｍａｔｚａら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３， ２４（５）：２６４−８）。ＣＤ７４発現は、ＤＣに制限されないが、ほとんど全ての抗原提示細胞に見出される（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９０，８７：７６９８−７０２；Ｃｌａｒｋら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１４８（１１）：３３２７−３５）。ＡＰＣにおけるＣＤ７４の広範な発現は、Ｂ細胞のような他のＡＰＣに抗原を標的とすることが免疫寛容を絶つと報告されてきたので、骨髄ＤＣでのただ１つの発現に対して幾つかの有利性を提供し得（Ｄｉｎｇら，Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１２：２８１７−２５）、相互提示抗原ナイーブＣＤ８Ｔ細胞へと形質細胞様のＤＣ相互提示抗原に標的する。より重要なことに、ＣＤ７４も濾胞状ＤＣに発現し（Ｃｌａｒｋら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１４８（１１）：３３２７−３５）、Ｂ細胞に対して抗原提示するに重要なＤＣサブセットである（Ｔｅｗら，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１９９７，１５６：３９−５２）。この発現プロファイルにより、ＣＤ７４は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて標的とするワクチン接種のための優秀な候補となる。

ドック・ロック技術プラットフォームの新規標的ツールとしてのヒト化抗ＣＤ７４モノクローナル抗体ｈＬＬ１
以下にさらに詳細に考察するＤＮＬ技術は、任意選択したエフェクター部分を共有結合性複合体または非共有結合性複合体へと実質的に結合させる手段を提供する（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．２００８，４９：１５８−６３；Ｒｏｓｓｉら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００６，１０３（１８）：６８４１−６）。ＤＮＬ法は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と反応するＦａｂフラグメントを含有する幾つかの三価、二価特異的結合タンパク質を生成させ、プレターゲティング戦略を介して改善した癌画像診断、放射性免疫療法に成功的に使用されてきた（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．２００８，４９：１５８−６３）。

ｈＬＬ１は、ヒトＣＤ７４に対抗するヒト化モノクローナル抗体である（Ｌｅｕｎｇら，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５，３２：１４１６−１４２７；Ｌｏｓｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ １９９７，８０：２６６０−２６６６；Ｓｔｅｉｎら、Ｂｌｏｏｄ ２００４，１０４：３７０５−１１）。第二抗体による架橋結合の存在下では、このＭＡｂは、Ｂ細胞悪性腫瘍に対抗する細胞毒性を示す。裸のｈＬＬ１もＭＭマウスモデルの腫瘍増殖を制御することができる。しかし、出願人らの最近のデータでは、架橋結合の有り無しで、ｈＬＬ１はヒト単球由来のＤＣに対抗する細胞毒性が無いことを実証している。しかし、出願人らの準備中のデータでは、ｈＬＬ１が血中のＤＣおよびＢ細胞の異なるサブセットを効率的に結合させることができることを示している。ｈＬＬ１は、アジュバンド活性を有し、標的ツールとして使用するにふさわしい候補であり得ることを示唆しながら、ＤＣ成熟を適度に誘発し、Ｔｈ１エフェクター細胞へとナイーブＴ細胞分化を極性化することができる。これにより、ＤＮＬによりもたらしたｈＬＬ１抗体を介して、ＡＰＣを標的とするＤＮＬに基づいた腫瘍用ワクチンを構築することが可能となり、かつ実現することができる。

癌幹細胞を選択的に除去する免疫療法
癌幹細胞は自己複製することができ、無制限に増殖する能力を保有し、多様な治療手段に耐性を持つ。癌幹細胞が免疫療法に対して感応性である場合、差し迫った興味深い質問が挙げられる。白血病の症例では、ＣＤ８（＋）非主要組織適合性の抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球クローンはヒト急性骨髄性白血病の幹細胞を排除することができることが報告された（Ｂｏｎｎｅｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９，９６：８６３９−８６４４）。つい最近では、Ｒｏｓｉｎｓｋｉら（Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１１：４８１７−２６）により、ＤＤＸ３６をコードするＨ−Ｙエピトープが白血病性幹細胞により発現され、ＤＤＸ３６特異的ＣＴＬにより認識することができ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてヒト急性白血病の移植を防ぐことができることが報告された（Ｒｏｓｉｎｓｋｉら，Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１１:４８１７−２６）。別の報告では、ＮＯＤ／ＳＣＩＤγｃ^ｎｕｌｌマウスへのｍＨＡ骨髄性白血病の幹細胞の移植は、ｍＨＡ特異的ＣＴＬクローンを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるプレインキュベーションにより完全に阻害されることを示している（Ｋａｗａｓｅら，Ｂｌｏｏｄ ２００７，１１０：１０５５−６３）。これらの結果は、免疫療法が、この悪性腫瘍の長期間にわたる抑制または治療でさえ実現するということに必要とされる、ＭＭ幹細胞を含む癌幹細胞を選択的に根絶する可能性のある、効果的な手段であるという見込みを浮き彫りにしている。

ドック・ロック（ＤＮＬ）法
ＤＮＬ法は、ｃＡＭＰ依存的タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットとＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のアンカードメイン（ＡＤ）との間に生じる特異的なタンパク質／タンパク質の相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４．ＷｏｎｇおよびＳｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。Ｒサブユニットへの二次メッセンジャーｃＡＭＰの結合により引き起こされる、最もよく研究されたシグナル伝達経路の１つにおいて中心的な役割を果たすＰＫＡは、１９６８年に、まずウサギ骨格筋から単離された（Ｗａｌｓｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性型に保持された２つの触媒サブユニットから成る（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは２種類のＲサブユニット（ＲＩおよびＲＩＩ）を用いて認められ、各種類はαアイソフォームおよびβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。Ｒサブユニットは、安定した二量体としてのみ単離され、二量化ドメインは最初の４４アミノ末端残基から成ることが示された（Ｎｅｗｌｏｎら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。ＲサブユニットへのｃＡＭＰの結合により、セリン／スレオニンキナーゼ活性の広域スペクトルに対して活発な触媒サブユニットを遊離させ、これがＡＫＡＰとのそのドッキングを介してＰＫＡの区分を通って選択した基質へと配向させる（Ｓｃｏｔｔら，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５；２１５６１）。

最初のＡＫＡＰである微小管結合タンパク質−２が１９８４年に特性が明らかになってから（Ｌｏｈｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）、細胞膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア、および小胞体を含むさまざまな細胞内部位に局在する、５０を上回るＡＫＡＰが、酵母からヒトに及ぶ種の多種多様な構造体を用いて同定されてきた（ＷｏｎｇおよびＳｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡについての、ＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性ヘリックスである（Ｃａｒｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個体のＡＫＡＰにおいてかなりばらつきがあり、２〜９０ｎＭに及ぶＲＩＩ二量体についての結合親和性も報告されている（Ａｌｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。興味深いことに、ＡＫＡＰは二量体Ｒサブユニットにしか結合しないようである。ヒトＲＩＩαについて、ＡＤは２３アミノ末端残基により形成された疎水性表面に結合する（ＣｏｌｌｅｄｇｅおよびＳｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）。従って、ヒトＲＩＩαの二量体形成ドメインおよびＡＫＡＰ結合ドメインは、どちらも同じＮ末端４４アミノ酸配列内に位置し（Ｎｅｗｌｏｎら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．２００１；２０：１６５１）、本明細書ではＤＤＤと呼ぶ。

ヒトＲＩＩαのＤＤＤおよびリンカーモジュールとしてのＡＫＡＰのＡＤ
以下にＡおよびＢと呼ぶ任意の２つの実体を非共有結合性複合体へとドッキングして、ジスフィルド結合の形成を促す戦略的位置においてＤＤＤおよびＡＤ両方にシステイン残基を導入することにより、さらに安定した繋留構造へとロックする、優れた一対のリンカーモジュールとしてヒトＲＩＩαのＤＤＤおよびＡＫＡＰのＡＤを利用するプラットフォーム技術を開発した。「ドック・ロック」アプローチの一般的方法論は以下の通りである。実体Ａは、Ａの前駆物質にＤＤＤ配列を連結させることにより構築され、結果として以下に本明細書でａと呼ばれる第１コンポーネントになる。ＤＤＤ配列は自発的な二量体の形成に影響を与えるので、従ってＡはａ_２から構成される。実体ＢはＢの前駆物質にＡＤ配列を連結させることにより構築され、結果として以下に本明細書でｂと呼ばれる第２コンポーネントになる。ａ_２に含有されるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含有されるＡＤ配列に結合させるためのドッキング部位を作り出し、従って、ａ_２およびｂの迅速な結合を促してａ_２ｂから構成される二成分の三量体複合体を形成する。この結合の事象は、ジスフィルド架橋を介して２つの実体を共有結合的に固定する後の反応によって不可逆的に産生され、これにより最初の結合相互作用による反応性のチオール基が、ＤＤＤおよびＡＤ上に近接して集まって部位特異的にライゲーションするので、効果的な局所集中するという原理に基づき非常に効果的に生じる（Ｃｈｍｕｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）

好ましい実施形態では、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトは、ａ_２ｂ構造の変異に基づき、ｈＬＬ１抗体またはフラグメントのような抗ＣＤ７４抗体またはＦ（ａｂ’）_２もしくはＦ（ａｂ）_２抗体フラグメントの各重鎖は、そのＣ末端にてＡＤ部分の１つの複製に付着する。抗体またはフラグメントごとに重鎖が２つあるので、抗体またはフラグメントごとに２つのＡＤ部分が存在する。ＣＤ２０異種抗原は、相補的にＤＤＤ部分に付着する。ＤＤＤ部分の二量化後、各ＤＤＤ二量体は、ＩｇＧ抗体またはＦ（ａｂ’）_２もしくはＦ（ａｂ）２フラグメントに付着するようにＡＤ部分の１つに結合し、結果としてＩｇＧまたはＦ（ａｂ’）_２もしくはＦ（ａｂ）_２ユニットごと、化学量論的に４つのＣＤ２０異種抗原になる。しかし、技術者であれば、ＡＤ配列へのＣＤ２０の付着およびＤＤＤ部分への抗ＣＤ７４ＭＡｂまたはフラグメントの付着のような別の複合体が利用されてよく、結果として化学量論的に異なるエフェクター部分になることを理解するだろう。例えば、ＩｇＧ抗体またはＦ（ａｂ’）_２フラグメントの各重鎖のＣ末端にＤＤＤ配列を付着させ、ＣＤ２０異種抗原にＡＤ配列を付着させることにより、ＤＮＬ複合体は、１つのＣＤ２０分子と１つの抗ＣＤ７４抗体またはフラグメントとを含んで構築されてよい。

２つの前駆物質の官能基から離れてＤＤＤおよびＡＤを付着させることにより、そのような部位特異的なライゲーションは、２つの前駆物質の本来の活性を防ぐようになるものと予想される。このアプローチは、実質的にモジュラーであり、可能性として、部位特異的および共有結合的に広範な物質を連結させることができる。

以下の実施例で例示されるような好ましい実施形態では、エフェクター部分はタンパク質またはペプチドであり、ＤＤＤユニットまたはＡＤユニットに連結させて融合タンパク質またはペプチドを形成することができる。目的の融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を産生する核酸合成、ハイブリダイゼーション、および／または増幅を含む、融合タンパク質を作製するための種々の方法が知られている。そのような二本鎖核酸は、標準的な分子生物学の技術を用いて、融合タンパク質を産生する発現ベクター内に挿入され得る（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ ^ｎｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照されたい）。そのような好ましい実施形態では、ＡＤ部分および／またはＤＤＤ部分は、エフェクタータンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のどちらかに付着されてよい。しかし、技術者であれば、エフェクター部分へのＡＤ部分またはＤＤＤ部分の付着部位は、その生理学的活性に関わるエフェクター部分のエフェクター部分およびその一部（単数および複数）の化学的性質に依存して変化させてよいことを理解するだろう。例えば、ＡＤ部分またはＤＤＤ部分は、抗原結合活性を維持しながら抗体または抗体フラグメントのＮ末端またはＣ末端のどちらかに付着され得るが、Ｃ末端位置への付着はＡＤ部分またはＤＤＤ部分を抗原結合部位から離れて位置決めを行い、結果として一層強力な相互結合作用をもたらすようである（例えばＣｈａｎｇら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７，１３：５５８６ｓ−９１ｓ）。さまざまなエフェクター部分の部位特異的付着は、二価架橋結合試薬および／または他の化学的抱合技術の使用のように、当技術分野で知られている技術を使用して行われてよい。

抗体および抗体フラグメント
さまざまな実施形態では、抗体または抗体の抗原結合性フラグメントは、抗癌ワクチン用のＤＮＬ複合体に組み込まれ得る。抗原結合性抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのように当技術分野で周知されており、そのように知られている任意のフラグメントが使用されてよい。本明細書で使用するように、抗原結合性抗体フラグメントとは、未変化の抗体または親抗体により認識される同一抗原と結合する抗体の任意のフラグメントを指す。実質的に目的とする任意の抗体またはフラグメントを抱合させる、ＡＤおよび／またはＤＤＤ調製する技術が知られている（例えば米国特許第７，５２７，７８７号）。

「裸の」抗体またはそのフラグメントと言われる、治療薬に抱合されていない抗体またはそのフラグメントが使用されてよい。別の実施形態では、抗体またはフラグメントは、１つ以上治療薬のおよび／または診断薬に抱合されてよい。そのような広範な種類の治療薬および診断薬は、以下で詳細に考察するように当技術分野で知られており、そのように知られている任意の治療薬または診断薬が使用されてよい。

ＣＤ７４のような実質的に任意の標的抗原に対抗するモノクローナル抗体を調製する技術は、当技術分野で周知されている。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）,並びにＣｏｌｉｇａｎら(ｅｄｓ.)，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１，ｐａｇｅｓ２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９１））を参照されたい。簡単に述べると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物を用いてマウスに注入することと、Ｂリンパ球を獲得するために脾臓を取り出すことと、ハイブリドーマを産生するように骨髄腫細胞を用いてＢリンパ球を融合することと、ハイブリドーマをクローニングすることと、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択することと、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養から抗体を単離することとにより獲得できる。

ＭＡｂは、既に確立された種々の技術によりハイブリドーマ培養から単離し、精製することができる。そのような単離技術は、タンパク質Ａセルファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを含む。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎの２．７．１ページ〜２．７．１２ページと２．９．１ページ〜２．９．３ページとを参照されたい。また、Ｂａｉｎｅｓら、ｉｎ ＭＥＴＨＯＤｓ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，７９ページ〜１０４ページの“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ），”（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）も参照されたい。

まず免疫原に対する抗体を生じさせた後、抗体を配列決定し、続いて組み換え技術により調製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は、当業者に周知されている。使用する抗体成分は、マウス定常領域の免疫原性と結合する可能性のある問題が取り払われたヒト化、キメラ、またはヒト抗体に由来する。

キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域に置換されている組み換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与されると、低い免疫原性および高い安定性を呈する。マウス免疫ブログリンの可変ドメインをクローニングする一般的な技術は、例えばＯｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：３８３３（１９８９）に開示されている。キメラ抗体を構築する技術は、当業者に周知されている。一例として、Ｌｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１３：４６９（１９９４）は、マウスＬＬ２のＶκおよびＶ_Ｈドメイン、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ配列をそれぞれヒトκおよびＩｇＧ_Ｉ定常領域ドメインと組み合わせることによりＬＬ２キメラを産生させた。

ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂ産生する技術は、当技術分野で周知されている（例えばＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら,Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８），Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２），Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）,およびＳｉｎｇｅｒら,Ｊ．ｌｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）を参照されたい）。キメラまたはマウスのモノクローナル抗体は、マウス免疫ブログリンの重鎖および軽鎖の可変鎖由来のマウスＣＤＲをヒト抗体の対応する可変ドメインに移植することによりヒト化され得る。キメラモノクローナル抗体のマウスのフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列と置換される。単にヒトＦＲにマウスＣＤＲを移植するだけでは、抗体親和性が低下するか、失われてしまうという結果に陥ることがあり、マウス抗体の本来の親和性を回復させるために付加的な修飾が必要な場合がある。これは、そのエピトープに良好な結合親和性を持つ抗体を獲得するように、ＦＲ領域にある１つ以上のヒト残基をマウスの対応物と置換することにより成し遂げることができる。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６（１９９１）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）を参照されたい。一般的に、これらマウスの対応物と異なり、１つ以上のＣＤＲのアミノ酸残基に近接または接触して配置されたヒトＦＲのアミノ酸残基は、置換の候補であろう。

ヒトＬＬ１（ｈＬＬ１）抗ＣＤ７４抗体は、米国特許第７，３１２，３１８号により開示されており、３５段落１行目から４２段落２７行目まで、および図１から図４までが参照により本明細書に組み込まれる。

ヒト抗体
組み合わせアプローチまたはヒト免疫ブログリンの遺伝子座を用いて形質変換したトランジェニック動物のどちらかを使用して完全ヒト抗体を産生する方法は、当技術分野で知られている（例えばＭａｎｃｉｎｉら，２００４，Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８；ＣｏｎｒａｄおよびＳｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６；ＢｒｅｋｋｅおよびＬｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４−５０）。完全ヒト抗体はまた、遺伝子形質変換法または染色体変換法とともに、ファージ提示技術により構築することもでき、これら全てが当技術分野で知られている。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。そのような完全ヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体よりも少ない副作用さえ呈し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて本質的に内在性のヒト抗体として機能すると予想される。特定の実施形態では、請求する方法および手順は、そのような技術により産生されるヒト抗体を利用してよい。

１つの代替的な手段では、ファージ提示技術はヒト抗体を生成するために使用されてよい（例えばＤａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら、２００５，Ｇｅｎｅｔ．ＭｏＩ Ｒｅｓ．４：１２６−４０）。ヒト抗体は健常なヒト、または癌のような特定の疾患状態を呈するヒトから生成させてよい（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら、２００５）。疾患を持つ個体からヒト抗体を構築する有利性は、循環する抗体レパートリーが、疾患関連抗原に対抗する抗体に向かって偏り得ることである。

限定されない、この方法論の一例では、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）により骨肉種の患者に由来するヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージ提示ライブラリーが構築された。一般的に、総ＲＮＡは循環血中のリンパ球から獲得された（同著者）。組み換えＦａｂはμ鎖、γ鎖、およびκ鎖の抗体レパートリーからクローニングされ、ファージ提示ライブラリーに挿入された（同著者）。ＲＮＡはｃＤＮＡへと変換され、重鎖および軽鎖の免疫ブログリン配列に対する特異的プライマーを使用してＦａｂのｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用される（Ｍａｒｋｓら、１９９１，Ｊ ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７）。ライブラリー構築はＡｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら（２０００，Ｉｎ：Ｐｈａｒｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓら(ｅｄｓ)，１^ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ｐｐ．９．１〜９．２２）に従い行われた。最終的なＦａｂフラグメントは制限酵素を用いて消化され、ファージ提示ライブラリーを作製するためにバクテリオファージゲノムに挿入された。そのようなライブラリーは、当技術分野で知られているような準的なファージ提示方法によりスクリーニングされ得る（例えばＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，1９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４−３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｔｈｅ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９−１６２を参照されたい）。

ファージ提示は、種々のフォーマットにて行うことができ、それらの概説として、例えばＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５５６４−５７１（１９９３を）参照されたい。ヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて活性化したＢ細胞により生成されてもよい。米国特許第５，５６７，６１０号および米国特許第５，２２９，２７５号を参照されたく、それら全体は参照により本明細書に組み込まれる。技術者であれば、これらの技術が例示的なものであり、ヒト抗体または抗体フラグメントを作製およびスクリーニングする、知られている任意の方法が利用されてよいことを理解するだろう。

別の代替的な手段では、ヒト抗体を産生するように遺伝子改変されたトランジェニック動物は、標準的な免疫化プロトコルを使用して、本質的に任意の免疫原性の標的に対して抗体を生成するために使用されてよい。トランスジェニックマウスからヒト抗体を獲得する方法は、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６（１９９４），およびＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）により開示されている。限定されないそのようなシステムの例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えばＧｒｅｅｎら、１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および類似の動物では、マウス抗体の遺伝子は、不活性化され、機能的なヒト抗体遺伝子により置換され、一方、残りのマウス免疫システムはインタクトなままである。

ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、アクセサリー遺伝子および制御配列とともに、可変領域配列の大部分を含む、ヒトＩｇＨおよびＩｇｋａｐｐａ遺伝子座の一部を含有する生殖系列を形成したＹＡＣ（酵母人工染色体）を用いて形質転換された。ヒト可変領域レパートリーは、Ｂ細胞を産生する抗体を生成するために使用され得、公知の技術によりハイブリドーマへとプロセシングされ得る。標的抗原を用いて免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、正常の免疫反応によりヒト抗体を産生し、先に考察した標準的な技術により採取および／または産生させ得る。種々のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株が利用でき、その各々は異なるクラスの抗体を産生することができる。遺伝子導入により産生されたヒト抗体は、正常のヒト抗体の薬物動態特性を保持しながら、治療可能性を示した（Ｇｒｅｅｎら，１９９９）。技術者であれば、請求する組成物および方法はＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）のシステムの使用に限定されるものではなく、ヒト抗体を産生するように遺伝子改変された任意のトランジェニック動物を利用してよいことを理解するだろう。

抗体フラグメント
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により生成することができる。抗体フラグメントはＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどのような抗体の抗原結合タンパク質である。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは抗体分子のペプシン消化により産生することができ、Ｆａｂ’フラグメントはＦ（ａｂ’）_２フラグメントのジスフィルド架橋を減少させることにより生成することができる。代替的に、Ｆａｂ’の発現ライブラリーを構築することができ（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７４−１２８１）、それにより所望の特性を用いてモノクローナルＦａｂ’フラグメントを迅速かつ容易に同定することができる。Ｆ（ａｂ）_２フラグメントはジスフィルド還元により獲得された抗体およびＦａｂフラグメントのパパイン分解により生成され得る。

単鎖のＦｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを備える。ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、標的結合部位を形成するように結合する。これら２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）によりさらに共有結合的に連結される。ｓｃＦｖ分子を作製し、好適なペプチドリンカーを設計する方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．ＲａａｇおよびＭ．Ｗｈｉｔｌｏｗ，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｆｖｓ”ＦＡＳＥＢ Ｖｏｌ ９：７３−８０（１９９５）、並びにＲ．Ｅ．ＢｉｒｄおよびＢ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ，”ＴＩＢＴＥＣＨ，ＶｏＩ ９：１３２−１３７（１９９１）に説明されている。

単一ドメイン抗体を作製する技術も、例えば、Ｃｏｓｓｉｎｓら（２００６，Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆ ５１：２５３−２５９）に説明されるように、当技術分野で知られている。単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）は、標準的な免疫化技術により、例えばラクダ、アルパカ、またはラマから獲得され得る（例えばＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、ＴＩＢＳ ２６：２３０−２３５，２００１；Ｙａｕら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８１：１６１−７５，２００３；Ｍａａｓｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２４：１３−２５，２００７を参照されたい）。ＶＨＨは、強力な抗原結合能力を有し、従来のＶＨ−ＶＬペアを寄せ付けない新規のエピトープと相互作用することができる可能性を有する（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら，２００１）。アルパカ血清中のＩｇＧは、約５０％ラクダ科の重鎖がＩｇＧのみの抗体を含有する（ＨＣＡｂ）（Ｍａａｓｓら２００７）。アルパカはＴＮＦ−αのような公知の抗原を用いて免疫化され得、ＶＨＨは単離させて標的抗原に結合および中和させることができる（Ｍａａｓｓら，２００７）。実質的に全てのアルパカＶＨＨコーディング配列を増幅させるＰＣＲプライマーが同定されており、コンストラクトアルパカＶＨＨファージ提示ライブラリーを構築するために使用され得、これは当技術分野で周知されている標準的なバイオパニング技術により、抗体フラグメントを単離するために使用することができる。（Ｍａａｓｓら，２００７）。

抗体フラグメントは、完全長の抗体のタンパク質加水分解性、またはそのフラグメントをコードするＤＮＡを持つ大腸菌もしくは別の宿主での発現により調製することができる。抗体フラグメントは、従来方法により、完全長の抗体のペプシンまたはパパイン消化により獲得することができる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号、並びにそれらに含まれた参考文献により説明されている。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９），Ｅｄｅｌｍａｎら，ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ ＶＯＬ．１，ページ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７），およびＣｏｌｉｇａｎの２．８．１ページ〜２．８．１０ページと２．１０．ページ〜２．１０．４．ページを参照されたい。

公知の抗体
特定の実施形態では、ＣＤ７４に加えて、他の抗原性標的に対抗する抗体が抗癌ワクチン用ＤＮＬ複合体に組み込まれ得る。腫瘍関連抗原に対抗する種々様々な抗体が知られており、商業上の供給源から獲得されてよい。例えば、ハイブリドーマ株を分泌するいくつかの抗体はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手できる。例えば米国特許第７，３１２，３１８号；米国特許第７，２８２，５６７号；米国特許第７，１５１，１６４号；米国特許第７，０７４，４０３号；米国特許第７，０６０，８０２号；米国特許第７，０５６，５０９号；米国特許第７，０４９，０６０号；米国特許第７，０４５，１３２号；米国特許第７，０４１，８０３号；米国特許第７，０４１，８０２号；米国特許第７，０４１，２９３号；米国特許第７，０３８，０１８号；米国特許第７，０３７，４９８号；米国特許第７，０１２，１３３号；米国特許第７，００１，５９８号；米国特許第６，９９８，４６８号；米国特許第６，９９４，９７６号；米国特許第６，９９４，８５２号；米国特許第６，９８９，２４１号；米国特許第６，９７４，８６３号；米国特許第６，９６５，０１８号；米国特許第６，９６４，８５４号；米国特許第６，９６２，９８１号；米号国特許第６，９６２，８１３号；米国特許第６，９５６，１０７号；米国特許第６，９５１，９２４号；米国特許第６，９４９，２４４号；米国特許第６，９４６，１２９号；米国特許第６，９４３，０２０号；米国特許第６，９３９，５４７号；米国特許第６，９２１，６４５号；米国特許第６，９２１，６４５号；米国特許第６，９２１，５３３号；米国特許第６，９１９，４３３号；米国特許第６，９１９，０７８号；米国特許第６，９１６，４７５号；米国特許第６，９０５，６８１号；米国特許第６，８９９，８７９号；米国特許第６，８９３，６２５号；米国特許第６，８８７，４６８号；米国特許第６，８８７，４６６号；米国特許第６，８８４，５９４号；米国特許第６，８８１，４０５号；米国特許第６，８７８，８１２号；米国特許第６，８７５，５８０号；米国特許第６，８７２，５６８号；米国特許第６，８６７，００６号；米国特許第６，８６４，０６２号；米国特許第６，８６１，５１１号；米国特許第６，８６１，２２７号；米国特許第６，８６１，２２６号；米国特許第６，８３８，２８２号；米国特許第６，８３５，５４９号；米国特許第６，８３５，３７０号；米国特許第６，８２４，７８０号；米国特許第６，８２４，７７８号；米国特許第６，８１２，２０６号；米国特許第６，７９３，９２４号；米国特許第６，７８３，７５８号；米国特許第６，７７０，４５０；米国特許第６，７６７，７１１号；米国特許第６，７６４，６８８号；米国特許第６，７６４，６８１号；米国特許第６，７６４，６７９号；米国特許第６，７４３，８９８号；米国特許第６，７３３，９８１号；米国特許第６，７３０，３０７号；米国特許第６，７２０，１５号；米国特許第６，７１６，９６６号；米国特許第６，７０９，６５３号；米国特許第６，６９３，１７６号；米国特許第６，６９２，９０８号；米国特許第６，６８９，６０７号；米国特許第６，６８９，３６２号；米国特許第６，６８９，３５５号；米国特許第６，６８２，７３７号；米国特許第６，６８２，７３６号；米国特許第６，６８２号，７３４号；米国特許第６，６７３，３４４号；米国特許第６，６５３，１０４号；米国特許第６，６５２，８５２号；米国特許第６，６３５，４８２号；米国特許第６，６３０，１４４号；米国特許第６，６１０，８３３号；米国特許第６，６１０，２９４号；米国特許第６，６０５，４４１号；米国特許第６，６０５，２７９号；米国特許第６，５９６，８５２号；米国特許第６，５９２，８６８号；米国特許第６，５７６，７４５号；米国特許第６，５７２；８５６号；米国特許第６，５６６，０７６号；米国特許第６，５６２，６１８号；米国特許第６，５４５，１３０号；米国特許第６，５４４，７４９号；米国特許第６，５３４，０５８号；米国特許第６，５２８，６２５号；米国特許第６，５２８，２６９号；米国特許第６，５２１，２２７号；米国特許第６，５１８，４０４号；米国特許第６，５１１，６６５号；米国特許第６，４９１，９１５号；米国特許第６，４８８，９３０号；米国特許第６，４８２，５９８号；米国特許第６，４８２，４０８号；米国特許第６，４７９，２４７号；米国特許第６，４６８，５３１号；米国特許第６，４６８，５２９号；米国特許第６，４６５，１７３号；米国特許第６，４６１，８２３号；米国特許第６，４５８，３５６号；米国特許第６，４５５，０４４号；米国特許第６，４５５，０４０号；米国特許第６，４５１，３１０号；米国特許第６，４４４，２０６号；米国特許第６，４４１，１４３号；米国特許第６，４３２，４０４号；米国特許第６，４３２，４０２号；米国特許第６，４１９，９２８号；米国特許第６，４１３，７２６号；米国特許第６，４０６，６９４号；米国特許第６，４０３，７７０号；米国特許第６，４０３，０９１号；米国特許第６，３９５，２７６号；米国特許第６，３９５，２７４号；米国特許第６，３８７，３５０号；米国特許第６，３８３，７５９号；米国特許第６，３８３，４８４号；米国特許第６，３７６，６５４号；米国特許第６，３７２，２１５号；米国特許第６，３５９，１２６号；米国特許第６，３５５，４８１号；米国特許第６，３５５，４４４号；米国特許第６，３５５，２４５号；米国特許第６，３５５，２４４号；米国特許第６，３４６，２４６号；米国特許第６，３４４，１９８号；米国特許第６，３４０，５７１号；米国特許第６，３４０，４５９号；米国特許第６，３３１，１７５号；米国特許第６，３０６，３９３号；米国特許第６，２５４，８６８号；米国特許第６，１８７，２８７号；米国特許第６，１８３，７４４号；米国特許第６，１２９，９１４号；米国特許第６，１２０，７６７号；米国特許第６，０９６，２８９号；米国特許第６，０７７，４９９号；米国特許第５，９２２，３０２号；米国特許第５，８７４，５４０号；米国特許第５，８１４，４４０号；米国特許第５，７９８，２２９号；米国特許第５，７８９，５５４号；米国特許第５，７７６，４５６号；米国特許第５，７３６，１１９号；米国特許第５，７１６，５９５号；米国特許第５，６７７，１３６号；米国特許第５，５８７，４５９号；米国特許第５，４４３，９５３号；米国特許第５，５２５，３３８号を参照されたい。これらは例示にすぎず、種々様々な他の抗体およびそれらのハイブリドーマが当技術分野で知られている。技術者であれば、ほぼ全ての腫瘍関連抗原に対抗する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマが、選択した疾患に関連する目的の抗原に対抗する抗体について、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ、および／またはＵＳＰＴＯのデータベースから単に検索するだけで獲得することができ得ることを理解するだろう。クローニングした抗体の抗原結合ドメインは、当技術分野で周知されている標準的な技術を使用して、発現ベクターへと増幅され、切り出され、結合され、適応する宿主細胞へと形質転換され、そしてタンパク質を産生するために使用されてよい。

アミノ酸置換
特定の実施形態では、開示する方法および組成物は、１つ以上の置換アミノ酸残基を用いたタンパク質またはペプチドの産生および使用に関する。例えば、以下の実施例で考察するように、ＡＤ部分および／またはＤＤＤ部分の配列は、ＤＮＬ複合体形成および／またはＤＮＬ複合体のｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性を改善するように変化させてよい。他の実施形態では、天然、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体の構造的、物理的、および／または治療的特徴は、１つ以上のアミノ酸残基を置換することにより最適化されてよい。例えば、ヒト化抗体の機能的特徴は、限定数のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸を、対応する親マウス抗体のＦＲアミノ酸と置換することにより向上され得ることが当技術分野で周知されている。これは、フレームワーク領域のアミノ酸残基がＣＤＲ残基にごく近接しているときに特に当てはまる。

他の場合、標的抗原に対する結合親和性のような抗体の治療的特性、その標的抗原からの抗体の解離またはオフ率、あるいは抗体によるＣＤＣ（補体依存型の細胞毒性）またはＡＤＣＣ（抗体依存型の細胞毒性）の導入の効果性でさえも、限定数のアミノ酸置換により最適化されてよい。

技術者であれば、一般的に、アミノ酸置換は典型的には、アミノ酸を比較的類似する特性の別のアミノ酸（すなわち、同類のアミノ酸置換）と置換することに関することを知っているだろう。タンパク質構造および機能について、さまざまなアミノ酸の特性およびアミノ酸置換の効果が、当技術分野における広範な研究および情報の対象になっている。

例えば、アミノ酸の疎水性親水性の指標が検討されてよい（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１５７：１０５−１３２）。アミノ酸の関連する疎水性親水性特性は、結果生じるタンパク質の二次構造に関与しており、次に他の分子とのタンパク質の相互作用を規定する。各アミノ酸は、疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性の指標が割り当てられ（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。同類置換の作製では、疎水性親水性の指標は、±２内のアミノ酸の使用が好ましく、±１内が一層好ましく、±０．５内がさらに好ましい。

アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性が考慮されてもよい（例えば米国特許第４，５５４，１０１号）。親水性の値は、アミノ酸残基：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０）；グルタミン酸（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５＋−．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）に割り当てられた。アミノ酸を類似する他の親水基と置換することは好ましい。

他に考慮すべきはアミノ酸側鎖の大きさを含む。例えばアミノ酸をグリシンまたはセリンのような小型の側鎖と置換すること、アミノ酸を例えばトリプトファンまたはチロシンのようなかさ高い側鎖と置換することは一般的に好ましくない。

タンパク質二次構造についてさまざまなアミノ酸残基の影響も考慮される。実証的研究により、αヘリックス、βシート、または逆向ターンの二次構造を採択するタンパク質ドメインの性質について、異なるアミノ酸残基の影響が特定されており、当技術分野で知られている（例えばＣｈｏｕ＆Ｆａｓｍａｎ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−２４５；１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６；１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４を参照されたい）。

そのような考慮および広範な実証的研究に基づいて、同類アミノ酸置換の表が構築されており、当技術分野で知られている。例えば、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；バリン、ロイシンおよびイソロイシンである。代替的に、アラニン（Ａ）ロイシン、イソロイシン、バリン；アルギニン（Ｒ）グルタミン、アスパラギン、リジン；アスパラギン（Ｎ）ヒスチジン、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、グルタミン；アスパラギン酸（Ｄ）アスパラギン、グルタミン酸；システイン（Ｃ）アラニン、セリン；グルタミン（Ｑ）グルタミン酸、アスパラギン；グルタミン酸（Ｅ）グルタミン、アスパラギン酸；グリシン（Ｇ）アラニン；ヒスチジン（Ｈ）アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン；イソロイシン（Ｉ）バリン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン；ロイシン（Ｌ）バリン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン；リジン（Ｋ）グルタミン、アスパラギン、アルギニン；メチオニン（Ｍ）フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン；フェニルアラニン（Ｆ）ロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン、チロシン；プロリン（Ｐ）アラニン；セリン（Ｓ）、スレオニン；スレオニン（Ｔ）セリン；トリプトファン（Ｗ）フェニルアラニン、チロシン；チロシン（Ｙ）トリプトファン、フェニルアラニン、スレオニン、セリン；バリン（Ｖ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アラニンである。

他に考慮されるアミノ酸置換は、残基がタンパク質内に在るか暴露溶剤であるかどうかを含む。内部残基について、同類置換は、アスパラギン酸およびアスパラギン；セリンおよびスレオニン；セリンおよびアラニン；スレオニン及びアラニン、アラニンおよびグリシン；イソロイシンおよびバリン；バリンおよびロイシン；ロイシンおよびイソロイシン；ロイシンおよびメチオニン；フェニルアラニンおよびチロシン；チロシンおよびトリプトファンを含む（例えばｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕのＰＲＯＷＬウェブサイトを参照されたい）。暴露溶剤の残基について、同類置換は、アスパラギン酸およびアスパラギン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；グルタミン酸およびグルタミン；グルタミン酸およびアラニン；グリシンおよびアスパラギン；アラニンおよびプロリン；アラニンおよびグリシン；アラニンおよびセリン；アラニンおよびリジン；セリンおよびスレオニン；リジンおよびアルギニン；バリンおよびロイシン；ロイシンおよびイソロイシン；イソロイシンおよびバリン；フェニルアラニンおよびチロシンを含む（例えばｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕのＰＲＯＷＬウェブサイトを参照されたい）。ＰＡＭ２５０スコアリング・マトリクス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリクス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリクス、ＭｃＬａｃｈ１ａｎマトリクス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリクス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリクス、Ｍｉｙａｔａマトリクス、Ｆｉｔｃｈマトリクス、Ｊｏｎｅｓマトリクス、Ｒａｏマトリクス、Ｌｅｖｉｎマトリクス、およびＲｉｓｌｅｒマトリクスのようなさまざまなマトリクスが、アミノ酸置換の選択を支援するように構築されてきた（例えばｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕのＰＲＯＷＬウェブサイトを参照されたい）。

アミノ酸置換の決定には、正電荷の残基（例えばヒスチジン、アルギニン、およびリジン）と負電荷の残基（例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）との間のイオン結合（塩橋）、または近接するシステイン残基間のジスフィルド結合の形成のような、分子間結合または分子内結合の存在を検討してもよい。

コードされたタンパク質配列において、他の任意のアミノ酸について任意のアミノ酸を置換する方法は周知されており、技術者にとっては、例えば部位特異的変異誘発の技術か、またはアミノ酸置換をコードし、発現ベクターのコンストラクトへとスプライシングするオリゴヌクレオチドの合成および集合による通例の実験方法事項である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ ^ｎｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９.）。

治療薬
特定の実施形態では、細胞毒薬物、抗血管新生薬、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒物、酵素、または他の試薬のような治療薬が、本明細書で説明する抗癌ワクチン用ＤＮＬ複合体に対する補助療法として使用されてよい。有用な薬物は、有糸分裂阻害薬、抗キナーゼ、アルキル化、代謝拮抗薬、抗生物質、アルカロイド、抗血管新生、アポトーシス促進剤、およびそれらの併用から成る群から選択される薬理学的特性を保有し得る。

有用な例示的薬物は、５−フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、コックス２抑制剤、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロオキシゲナーゼ−２阻害薬、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２―ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレイル−フロクスウリジン（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テモゾロミド（ＤＴＩＣの水性型）、トランスプラチン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビンカアルカロイドを含んでよい。

有用な毒素は、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、オンコナーゼなどのリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、および緑膿菌内毒素を含んでよい。

特定の実施形態では、治療薬は免疫調節剤でよい。免疫調節剤は、提示されると、身体の免疫システムを変えるか、抑制するか、または刺激する薬剤である。免疫調節剤有用免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせを含んでよい。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）のような造血性因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子、インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン、およびＳ１因子と呼ばれる幹細胞増殖因子が特に有用である。

さまざまな実施形態では、治療薬は、リンホカイン、モノカインのようなサイトカイン、増殖因子、および従来のポリペプチドホルモンを１つ以上含んでよい。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のような糖タンパク質ホルモン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体化ホルモン（ＬＨのような）糖タンパク質ホルモン；胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、幹細胞増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管抑制因子；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βのような神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのような形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン−α、−β、−γのようなインターフェロン；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−ｌα、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５のようなインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、ｋｉｔ−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αのようなＴＮＦ）、およびＬＴを含む。有用なケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰｌ−ａｌｐｈａ、ＭＩＰｌ−Ｂｅｔａ、およびＩＰ−１０を含んでよい。

アンジオスタチン、バスキュロスタチン（ｂａｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン、スマピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰＩＧＦペプチドおよび抗体、抗血管性増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｉｔ−１抗体およびペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭｌＯｌ、マリマスタット、ペントサンポリ硫酸、アンジオポエチン−２、インターフェロン−ａｌｐｈａ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノマイド（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンジオスタチン、シドホビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第４因子、またはミノサイクリンを含む抗血管新生薬は有用である。

他の有用な治療薬は、ｂｃｌ−２またはｐ５３のような、好ましくは癌遺伝子および癌遺伝子産物に対して向けられるオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでよい。治療学的オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡの形態が好ましい。

診断薬
診断薬は、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤、および光活性化剤から成る群から選択されてよい。そのような診断薬は周知されており、そのような任意の診断薬が使用されてよい。限定されない診断薬の例は、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^{１５４−１５８}Ｇｄ、^３２Ｐ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^５１Ｍｎ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、^８３Ｓｒ、または他のγ放射体、β放射体、陽電子放射体のような放射性核種を含んでよい。有用な常磁性イオンは、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、またはエルビウム（ＩＩＩ）を含んでよい。金属コントラスト剤は、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、またはビスマス（ＩＩＩ）を含んでよい。超音波コントラスト剤は、ガス充填したリポソームのようなリポソームを含んでよい。放射線不透過性診断薬は、バリウム化合物、ガリウム化合物、およびタリウム化合物のような化合物から選択されてよい。種々様々な蛍光ラベルは当技術分野で知られており、限定されないがフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、Ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンを含む。有用な化学発光ラベルは、ルミノール、イソルミノール、芳香族系アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、またはシュウ酸エステルを含んでよい。

免疫複合体
特定の実施形態では、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトは、１つ以上の治療薬または診断薬と抱合させてよい。治療薬は同一である必要はなく、例えば薬物および放射性同位体のように異なっていてもよい。例えば、^１３１Ｉは、抗体または融合タンパク質のチロシン、およびリジン残基のイプシロンアミノ基に付着させた薬物に組み込むことができる。治療薬および診断薬は、例えば、還元型のＳＨ基および／または炭水化物側鎖を加えることもできる。抗体または融合タンパク質を用いた、共有結合性または非共有結合性抱合体の治療薬または診断薬を作製する広範な方法は当技術分野で知られており、そのような任意の方法が利用されてよい。

治療薬または診断薬は、ジスフィルド結合の形成を介して還元型の抗体成分のヒンジ領域に付着させることができる。代替的に、そのような薬剤は、Ｎ−サクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二機能架橋剤を使用して不着させることができるＹｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：２４４（１９９４）。そのように抱合する一般的な技術は、当技術分野で周知されている。例えば、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮｓ，Ｂｉｒｃｈら（ｅｄｓ．），１８７−２３０ページ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ,Ｒｉｔｔｅｒら（ｅｄｓ．），６０−８４ページ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照されたい。代替的に、治療薬または診断薬は、炭水化物部分を介して抗体のＦｃ領域に抱合することができる。炭水化物群は、チオール基に結合される同一薬剤のローディングを高めるために使用することができ、または糖鎖は、異なる治療薬または診断薬を結合させるように使用することができる。

抗体の炭水化物部分を介して抗体成分にペプチド抱合する方法は当業者に周知されている。例えば、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４７：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１（１９９０）；およびＳｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたく、それら全内容は参照により本明細書に組み込まれる。一般的な方法は、少なくとも１つの遊離型アミン官能基を有する担体ポリマーを持った酸化型の炭水化物部分を有する抗体成分の反応に関わる。この反応により、まずシッフ塩基（イミン）結合が生じ、還元によって二級アミンへと安定化させて最終的な抱合体を形成させることができる。

免疫複合体の抗体成分として使用される抗体が抗体フラグメントである場合、Ｆｃ領域は無くてもよい。しかし、炭水化物部分を完全長の抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域に導入することは可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：５９１９（１９９５）；Ｈａｎｓｅｎら、米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５），Ｌｅｕｎｇら、米国特許第６，２５４，８６８号を参照されたく、それら全内容が参照により本明細書に組み込まれる。改変した糖鎖は、治療薬または診断薬を加えるために使用することができる。

幾つかの実施形態では、抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質にキレート剤を付着してよく、放射性核種のような治療薬または診断薬をキレートさせるために使用されてよい。例示的なキレート剤は、限定されないがＤＴＰＡ（Ｍｘ−ＤＴＰＡなど）、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、またはＮＯＴＡ含む。タンパク質に金属または他のリガンドを付着させるためにキレート剤を抱合し、使用する方法は当技術分野で周知されている（例えば米国特許出願第１２／１１２，２８９号を参照されたく、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）。

特定の実施形態では、放射性金属または常磁性イオンは、イオンを結合させる多様なキレート基に付着され得る、長い尾部を有する試薬と反応させることによりタンパク質またはペプチドに付着されてよい。そのような尾部は、この目的に有用だと知られているポリリジン、多糖類のようなポリマー、または例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシムなどの基のような、キレート基に結合させることができるペンダント基を有する他の誘導体化したか、もしくは誘導体化できる鎖である。

キレート剤は、米国特許第４，８２４，６５９号に開示されるような抗体またはペプチドに直接連結されてよく、当該内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。特に有用な金属キレートの併用は、２−ベンジルＤＴＰＡ並びにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含み、放射性イメージングには、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^１８Ｆ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^９９ｍＴｃ、^９４ｍＴｃ、^１１Ｃ、^１３Ｎ，^１５Ｏ、^７６Ｂｒのような、一般的に６０ｋｅＶ〜４，０００ｋｅＶに及ぶエネルギーの診断用同位元素とともに使用される。同一のキレートは、マンガン、鉄、およびガドリニウムのような非放射性金属を用いて複合されるとＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡのような大環状のキレートは、種々の金属および放射性金属、特に、ガリウム、イットリウム、および銅それぞれの放射性核種に有用である。そのような金属キレート複合体は、目的の金属へとリングの大きさを仕立てることにより非常に安定的に作製することがでる。放射免疫療法（ＲＡＩＴ）用^２２３Ｒａのような、安定的に核種を結合させることを目的とする大環状ポリエーテルのような他のリング型キレートが網羅されている。

つい最近では、ＰＥＴ走査技術において、例えば、Ｆ−１８のアルミニウムのような金属または他の原子と反応させる、有用な^１８Ｆ標識化方法が開示された^１８Ｆ−Ａｌ抱合体は、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、またはＮＥＴＡのようなキレート基と複合され得、直接抗体に付着されるか、またはプレターゲッティング法において標識標的が可能なコンストラクトに使用される。そのようなＦ１８標識化は、２００８年４月３０日に出願された米国特許出願第１２／１１２，２８９号に開示されており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

薬物療法の方法
さまざまな実施形態は、ヒト、イヌおよびネコのような家庭用ペットまたはコンパニオンペットのような哺乳類などの対象における多発性骨髄腫のような癌を治療する方法に関する。方法は、対象に、治療的に有効量の抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトを投与することを含み得る。好ましい実施形態では、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトは、以下の実施例にてさらに詳細に説明するような、抗ＣＤ７４抗体またはそのフラグメントおよびＣＤ２０異種抗原を含有する。

抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトの投与は、標的細胞の表面上で別の抗原と結合または反応する治療的に有効量の別の抗体を同時的または経時的に投与することにより追加することができる。好ましい追加のＭＡｂは、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＣＤ３４、ＣＤ７４、ＣＤ２０５、ＴＬＲ２（ｔｏｌｌ様受容体２）、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４、およびＨＬＡ−ＤＲと反応するＭＡｂから成る群から選択される、少なくとも１つのヒト化ＭＡｂ、キメラＭＡｂ、またはヒトＭＡｂを含む。有用なさまざまな抗体は、先に考察したように当業者に知られている。例えば、Ｇｈｅｔｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６１０（１９８８）；Ｈｅｋｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２：３６４（１９９１）；Ｌｏｎｇｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：３５３（１９９６）、米国特許第５，７９８，５５４号；米国特許第６，１８７，２８７号；米国特許第６，３０６，３９３号；米国特許第６，６７６，９２４号；米国特許第７，１０９，３０４号；米国特許第７，１５１，１６４号；米国特許第７，２３０，０８４号；米国特許第７，２３０，０８５号；米国特許第７，２３８，７８５号；米国特許第７，２３８，７８６号；米国特許第７，２８２，５６７号；米国特許第７，３００，６５５号；米国特許第７，３１２，３１８号；並びに米国特許出願公開第２００８０１３１３６３号；米国特許出願公開第２００８００８９８３８号；米国特許出願公開第２００７０１７２９２０号；米国特許出願公開第２００６０１９３８６５号；米国特許出願公開第２００６０２１０４７５号；米国特許出願公開第２００８０１３８３３３号；および米国特許出願公開第２００８０１４６７８４号を参照されたく、引用した各特許および特許出願の実施例部分は、参照により本明細書に組み込まれる。

別の実施形態では、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＣＤ３４、ＣＤ２０５、ＴＬＲ２（ｔｏｌｌ様受容体２）、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４、またはＨＬＡ−ＤＲのような別の樹状細胞抗原に対抗する抗体またはそのフラグメントは、ＤＮＬ複合体の抗ＣＤ７４抗体に置換されてよい。そのような抗体は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関または抗体を販売するベンダーのような公共の情報源から獲得され得る。例えば、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＣＤ３４、ＢＤＣＡ−２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９に対抗する抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入され得る。ＣＤ２０５およびＢＤＣＡ−３に対抗する抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）から購入され得る。抗体を販売する他の数多くの供給源が技術者に知られている。

抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクト治療は、少なくとも１つの治療薬の同時的または経時的投与とともにさらに追加することができる。多発性骨髄腫を治療するために使用される治療薬は、デキサメタゾン、サリドマイド／デキサメタゾン、シクロホスファミド、ＶＡＤ（ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびデキサメタゾン）、ＤＶｄ（ＤＯＸＩＬ（登録商標）（ＰＥＧ化ドキソルビシン）、ビンクリスチン、小規模計画のデキサメタゾン）、ＢＣＮＵ、メルファラン、カルムスチン、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））、プレドニゾン、およびコルチコステロイドを含む。個々の治療薬は、ＣＰ（シクロホスファミド、プレドニゾン）、ＣＴ（シクロホスファミド、サリドマイド）、ＶＢＭＣＰ（ビンクリスチン、ＢＣＮＵ、メルファラン、シクロホスファミド、メルファラン、ＶＭＣＰ（ビンクリスチン、メルファラン、シクロホスファミド、プレドニゾン）、ＤＴ−ＰＡＣＥ（デキサメタゾン、サリドマイド、シスプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド）、ＭＰＴ（メルファラン、プレドニゾン、サリドマイド）、ＣＶＡＤ（シクロホスファミドおよびＶＡＤ）、ＥＤＡＰ（エトポシド、デキサメタゾン、シタラビン、シスプラチン）、ＭＴＤ（メルファラン、サリドマイド、デキサメタゾン）、ＶＴ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、サリドマイド）、ＶＤＴ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、ドキソルビシン、サリドマイド）、ＶＡＤＴ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、アドリアマイシン、サリドマイド、デキサメタゾン）、またはＤＣＥＰ（デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチン）のような当技術分野で知られている治療薬を単独で、またはさまざまに併用して使用してよい。

幹細胞を移植する前の多発性骨髄腫の化学療法は、導入療法と呼ばれる。本明細書で記載する特定の化学療法剤は、他の導入療法よりも一層適している。ＭＭ用の導入療法に有用な化学療法の例は、デキサメタゾン、サリドマイド／デキサメタゾン、シクロホスファミド、ＶＡＤ、およびＤＶｄを含む。ＭＭは、しばしば化学療法に耐性を持つので、治療薬の投与は、従来の化学療法で使用する用量よりも高容量になる場合がある。そのような高用量の化学療法は、大抵は骨髄毒性に至り、幹細胞移植と併せて使用されることがよくある。ＭＭの化学療法について、用量およびスケジュールは当技術分野で周知されており、そのように知られている任意の用量および／またはスケジュールは、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトの投与と併せて利用されてよい。

ＤＮＬワクチンがＭＭに加えて他の種類の癌に使用される場合、他の化学療法レジメンが知られている。例えば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ^２のシクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ^２のエトポシド、および１５０ｍｇ−２００ｍｇ／ｍ^２のカルムスチン）が非ホジキンリンパ腫を治療するための使用されるレジメンである。Ｐａｔｔｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．５１：１８（１９９３）。他の適した併用化学療法レジメンは当業者に周知されている。例えば、Ｆｒｅｅｄｍａｎら，“Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，”ｉｎ ＣＡＮＣＥＲ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＶＯＬＵＭＥ ２，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈｏｌｌａｎｄら（ｅｄｓ．），２０２８〜２０６８ページ（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９３）を参照されたい。例として、中程度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療する第一世代の化学療法レジメンは、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾン）、およびＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）を含む。有用な第二世代の化学療法レジメンは、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、およびロイコボリン）であり、適した第三世代レジメンはＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン、およびロイコボリン）である。他の種類の癌に対して有用な化学療法剤は、限定されないが、５−フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、コックス２抑制剤、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロオキシゲナーゼ−２阻害薬、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２―ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレイル−フロクスウリジン（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドマイド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソウレア、フェニルブチレート、プリカマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テモゾロミド（ＤＴＩＣの水性型）、トランスプラチン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビンカアルカロイドを含む。

調合
抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトは、薬理学的に有用な組成物を調製する公知の方法に従って調合することができ、それにより抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトは、薬理学的に適した賦形剤を用いて混合物に混合される。無菌リン酸緩衝食塩水は薬理学的に適した賦形剤の一例である。他の適した賦形剤は当業者に周知されている。例えば、Ａｎｓｅｌら、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０），およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、並びにそれらの改訂版を参照されたい。

抗癌ワクチンは、例えばボーラス投与または持続投与による静脈内投与用に調合することができる。注射用の製剤は、保存剤を加えたアンプルまたは複数回投与用の容器などの単位剤形で提供することができる。組成物は、油性または水性のビヒクル状態の懸濁液、溶解液、または乳濁液のような形態を用いることができ、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような調合用の薬剤を包含させることができる。代替的に、活性成分は、使用前に無菌の脱パイロゲン水などの適したビヒクルを用いて構築するために粉末状にすることができる。

追加の薬理学的方法は、抗癌ワクチンが作用する持続期間を制御するために用いられ得る。制御用放出製剤は、複合体へのポリマーの使用を介して調製させるか、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトを吸着させることができる。例えば、生体適合性ポリマーは、ポリ（エチレン酢酸ビニル共重合体）でできたマトリクス、並びにステアリン酸二量体およびセバシン酸のポリ酸無水物共重合体マトリクスを含む（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４４６（１９９２））。そのようなマトリクスから遊離する割合は、抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトの分子量、マトリクス内の抗癌ワクチンの量、および分散粒子の大きさに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら，上記を参照されたい。他の固形の剤形は、ＡｎｓｅｌらＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０），およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、並びにそれらの改訂版に説明されている。

抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトはまた、哺乳類の皮下に投与されてもよく、または他の非経口経路でも投与されてよい。さらに、投与は持続投与でよく、または単回もしくは複数回の急速投与でよい。好ましくは、抗癌ワクチンは、皮下注射による単回または複数回の急速投与として投与される。

一般的に、ヒトに投与される抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクトの用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態、およびそれまでの医療経緯病歴のような要因次第で変わるだろう。単回投与として約１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲の抗癌ワクチン用ＤＮＬコンストラクト用量をレシピエントに提供することが望ましいが、しかしながら、より少量またはより多量の用量も、状況に応じた指示がある場合に投与されてよい。７０ｋｇの患者には１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量であるが、例えば、１．７ｍの患者には７０〜１，４００ｍｇまたは４１〜８２４ｍｇ／ｍ^２用量である。用量は、免疫反応を誘発するため、必要に応じて繰り返されてよい。

好ましい実施形態では、ワクチンＤＮＬコンストラクトは、癌の治療に有用である。癌の例は、限定されないが、細胞腫、リンパ腫、神経膠芽腫、メラノーマ、肉腫、および白血病、ミエローマ、つまりリンパ系腫瘍を含む。そのような癌のより詳細な例を下記に記載し、これらは扁平上皮癌（例えば上皮の扁平上皮癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃の癌つまり胃癌、膵癌、多型性神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌，肝臓癌、肝細胞癌、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、分化型の甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌つまり子宮癌、唾液腺細胞腫、腎臓癌つまり腎癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌と同様に頭頸部癌を含む。「癌」という用語は、原発性悪性細胞または腫瘍（例えば、細胞が元々悪性または腫瘍である部位以外の対象の身体部位に遊走しなかった細胞または腫瘍）、および二次的な悪性細胞または腫瘍（例えば転移により発症した腫瘍、最初の腫瘍部位と異なる二次的部位への悪性細胞または腫瘍細胞の転移）を含む。

癌または悪性腫瘍の他の例は、限定されないが、急性小児リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟部組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂癌および尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝癌、小児急性リンパ性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児リンパ性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児原発性肝癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視覚路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、膵内分泌部島細胞細胞腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、外分泌膵癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆汁膀胱癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞性腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内メラノーマ、島細胞癌、島細胞膵癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇癌および口腔癌、肝癌、肺癌、リンパ球増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性の乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、転移性潜在性原発性の扁平上皮性頸部癌、転移性原発性の扁平上皮性頸部癌、転移性の扁平上皮性頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨髄性の白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性の扁平上皮性頸部癌、中咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉種／悪性線維性組織球腫、骨の骨肉種／悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、パラプロテイン血症、真性多血症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂癌および尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮性頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、移行細胞性腎盂癌および尿管癌、移行性腎盂癌および尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂の細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、腟癌、視覚路および視床下部性神経膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、並びに、腫瘍症に加え、先に記載した臓器系にある、他の任意の過剰増殖性疾患を含む。

本明細書で説明し、請求する方法および組成物は、限定されるものではないが、先に説明した疾患悪性状態または前癌状態を治療し、腫瘍性状態または悪性状態の進行を防ぐために使用されてよい。そのような使用とは、公知の状態、または進行に先立って、腫瘍症または癌、特に、過形成、化生、または最も詳細には異形成から成る非腫瘍性細胞増殖が発症したと予想される状態での使用を指す（そのような異常な増殖状態の概説は、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＡｎｇｅｌｌ，Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８−７９（１９７６）を参照されたい）。

異形成は、癌の前兆であることが頻繁にあり、主に上皮に認められる。これは最も秩序の無い非腫瘍性細胞増殖の形態であり、各細胞の均一性および細胞の構造上の位置の欠損を伴う。特徴的な異形成は、慢性的な刺激つまり炎症の存在によって生じる。治療できる異形成疾患は、限定されないが、無汗性外胚葉異形成症、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指状異形成、気管支肺異形成、大脳異形成、頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋骨軟骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳−眼部異形成、骨端欠損異形成、多発性骨端、点状軟骨異形成症、上皮異形成、顔面生殖異形成、下顎の家族性線維性異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、骨の線維性異形成、セメント質骨異形成、遺伝性腎臓−網膜異形成、発汗外胚葉性異形成、無汗性外胚葉異形成、リンパ性減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、Ｍｏｎｄｉｎｉ異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯原性異形成、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質異形成、多発性線維性異形成、偽軟骨発育不全性脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成、および心室橈骨異形成を含む。

治療できるさらなる前腫瘍疾患は、限定されないが、良性悪性増殖疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープまたは腺腫、および食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫の皮膚病（Ｆａｒｍｅｒ’ｓＳｋｉｎ）、日光口唇炎、および日光性角化症を含む。

好ましい実施形態では、本発明の方法は、癌、詳細には先に記載した癌の増殖、進行、および／または転移を阻害するために使用される。

さらなる過剰増殖疾患、疾患、および／または状態は、限定されないが、白血病（急性白血病（例えば急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球、前骨髄球、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む）、慢性白血病（例えば慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病））、真性多血症、リンパ腫（例えばホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病のような悪性腫瘍および関連疾患、並びに限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺細胞腫、嚢腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、睾丸腫瘍、肺癌、肺小細胞癌、膀胱癌、上皮細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、希突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、および網膜芽細胞腫のような肉腫および細胞腫を含む固形腫瘍の進行および／または転移を含む。

キット
さまざまな実施形態は患者の病変組織を標的とするか、または診断するのに適した要素を包含するキットに関係し得る。例示的なキットは、本明細書で説明した少なくとも１つ以上の抗癌ワクチン用コンストラクトを包含してよい。投与するための要素を包含する組成物は、経口送達するように、消化管を介した送達用に調合されていない場合、何らかの他の経路を介してキット要素を送達することができる機器が含まれてよい。非経口投与のような適用するためのある種の機器は、対象の身体内に組成物を注入する注射器である。吸入機器が使用されてもよい。特定の実施形態では、治療薬は、無菌の液剤または凍結乾燥製剤を包含する、予め充填した注射器または自動注射ペンの形態で提供されてよい。

キット要素は一緒に梱包されるか、または２つ以上の容器に分けて梱包されてよい。幾つかの実施形態では、容器は、再構成に適した、無菌の凍結乾燥製剤の組成物を含めたバイアルでよい。キットは、他の試薬を再構成および／または希釈するに適した１つ以上の緩衝剤を含めてもよい。使用され得る他の容器は、限定されないが、パウチ、トレー、ボックス、チューブなどを含む。キット要素は、容器内が無菌で梱包され得、維持され得る。含むことができる別の要素は、使用に際し、キットを使用する者への取扱説明書である。

発現ベクター
さらに他の実施形態は、抗癌ワクチン用のコンストラクトまたはその成分の融合タンパク質をコードする核酸を含むＤＮＡ配列に関する。融合タンパク質は、以下の実施例でより詳細に考察するような、ＤＮＬコンストラクトの形成に利用されるＡＤペプチドおよびＤＤＤペプチドのような、異なるペプチドまたはタンパク質に付着された抗ＣＤ７４抗体またはＣＤ２０異種抗原を含む。代替的に、コードされた融合タンパク質は、異なる抗体または異種抗原に付着されたＤＤＤ部分またはＡＤ部分を含んでよい。

さまざまな実施形態は、ＤＮＡコード配列を含む発現ベクターに関連する。ベクターは、キメラ、ヒト化、またはヒト可変領域配列に付着され得るヒト免疫ブログリンの軽鎖定常部および重鎖定常部、並びにヒンジ領域をコードする配列を含み得る。ベクターは、選択した宿主細胞、エンハンサー、シグナル、またはリーダー配列にてコードされたタンパク質（単数または複数）を発現するプロモータを付加的に含む。特に有用なベクターは、ｐｄＨＬ２またはＧＳである。より好ましくは、軽鎖定常部および重鎖定常部、並びにヒンジ領域は、ヒトＥＵミエローマの免疫ブログリンに由来し、アロタイプ位置にて、随意に、少なくとも１つのアミノ酸が異なるＩｇＧ１アロタイプに認められるものに変化され、ＥＵメンバーシステムに基づくＥＵ重鎖のうち、随意に２５３個のアミノ酸がアラニンに置換されてよい。Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８−８５（１９６９）を参照されたい。他の実施形態では、ＩｇＧｌ配列は、ＩｇＧ４配列に変換され得る。

技術者であれば、操作されたタンパク質を発現するように発現コンストラクト遺伝子操作し、宿主細胞に挿入する方法は、当技術分野で周知されており、通例の実験事項であることを理解するだろう。宿主細胞およびクローンニングした抗体またはフラグメントを発現させる方法は、例えば２００５年７月２５日に出願された米国特許出願第１１／１８７，８６３号、２００５年１０月２０日に出願された米国特許出願第１１／２５３，６６６号、および２００６年７月１４日に出願された米国特許出願第１１／４８７，２１５号に説明されており、各実施例部分は参照により本明細書に組み込まれる。

実施例
以下の実施例は解説のために提供するものであり、本発明の請求に限定されるものではない。

実施例１．ドック・ロック（ＤＮＬ）コンストラクトの調製
ＤＤＤおよびＡＤ融合タンパク質
ＤＮＬ技術は、実質的に任意の抗体またはそれらのフラグメントもしくは他のエフェクター部分を含む、二量体、三量体、四量体、六量体などを作製するために使用できる。特定の好ましい実施形態では、ＩｇＧ抗体、Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメント、およびＣＤ２０異種抗原のような異種抗原は、二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列またはアンカードメイン（ＡＤ）配列のいずれかを含む融合タンパク質として産生されてよい。好ましい実施形態では、ＤＤＤ部分およびＡＤ部分は、融合タンパク質として産生されるが、技術者であれば、化学的架橋結合のような他の抱合方法が、請求する方法および組成物の範囲内で利用されてよいことを理解するだろう。

ＤＮＬコンストラクトは、例えば、抗ＣＤ７４抗体のＦａｂ−ＤＤＤ融合タンパク質をＣＤ２０−ＡＤ融合タンパク質と結合させることにより形成されてよい。代替的に、コンストラクトは、ＩｇＧ−ＡＤ融合タンパク質をＣＤ２０−ＤＤＤ融合タンパク質と結合させて作製されてよい。技術は限定されるものではなく、有用な任意のタンパク質またはペプチドが、ＤＮＬコンストラクトに組み込まれるＡＤ融合タンパク質またはＤＤＤ融合タンパク質として産生されてよい。化学的架橋結合を利用する場合、ＡＤおよびＤＤＤ抱合体は、タンパク質またはペプチドに限定されるものではなく、当技術分野で知られている任意の架橋結合を使用してＡＤ配列またはＤＤＤ配列に架橋され得る、任意の分子を含む。

独立したトランジェニック細胞株は、各ＤＤＤ融合タンパク質またはＡＤ融合タンパク質として発達し得る。産生すると、分子は、所望する場合に精製するか、または細胞培養上清液で維持することができる。以下の産物では、任意のＤＤＤ−融合タンパク質分子は、ＤＮＬコンストラクトを生成するように任意のＡＤ−融合タンパク質分子と結合させることができる。異なる種類のコンストラクト、異なるＡＤ配列またはＤＤＤ配列が利用されてよい。例示的なＤＤＤ配列およびＡＤ配列は以下に記載する。

ＤＤＤｌ：ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１０）

ＤＤＤ２：ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１１）

ＡＤｌ：ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１２）

ＡＤ２：ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号１３）

発現ベクター
プラスミドベクターｐｄＨＬ２は、いくつかの抗体および抗体に基づくコンストラクトを産生させるために使用されてきた。Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８９），１２５：１９１−２０２；Ｌｏｓｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｈｉｌａ）（１９９７），８０：２６６０−６を参照されたい。ジシストロニックな哺乳類の発現ベクターは、ＩｇＧの重鎖および軽鎖の合成を目的とする。ベクター配列は、多くの異なるＩｇＧ−ｐｄＨＬ２コンストラクトについては、可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）配列に相違があるだけで、大部分は同じである。当業者に知られている分子生物学的手段を使用して、これらのＩｇＧ発現ベクターは、Ｆａｂ−ＤＤＤ発現ベクターまたはＦａｂ−ＡＤ発現ベクターへと変換することができる。Ｆａｂ−ＤＤＤ発現ベクターを生成させるために、ヒンジ、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインについてのコード配列は、ヒンジの最初の４残基、１４残基のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、およびヒトＲＩＩα（ＤＤＤ１を指す）の最初の４４残基をコードする配列と置換される。Ｆａｂ−ＡＤ発現ベクターを生成させるために、ヒンジ、ＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインについての配列は、ヒンジの最初の４残基、１５残基のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、および１７残基のＡＫＡＰ−ＩＳ（ＡＤ１を指す）と呼ばれる合成ＡＤと置換され、これはバイオインフォマティクスおよびペプチド配列技術を使用して生成され、非常に高い親和性（０．４ｎＭ）でＲＩＩα二量体を結合させることが示された。Ａｌｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ（２００３），１００：４４４５−５０を参照されたい。

２つのシャトルベクターは、以下に説明するように、Ｆａｂ−ＤＤＤ１発現ベクターまたはＦａｂ−ＡＤ１発現ベクターのどちらかにＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターを変換させることを促すように設計した。

ＣＨ１の調製
ＣＨ１ドメインは、テンプレートとしてｐｄＨＬ２プラスミドベクターを使用し、ＰＣＲにより増幅させた。左側ＰＣＲプライマーは、ＣＨ１ドメインの上流（５’）末端およびＳａｃＩＩ制限酵素部位から成り、これはＣＨ１コード配列の５’になる。右側のプライマーは、ヒンジ（ＰＫＳＣ（配列番号２９）の最初の４残基をコードし、続いて４つのグリシンおよび１つのセリンをコードし、最後はＢａｍＨＩ制限酵素部位を持つ２つのコドン（ＧＳ）をコードする配列から成る。ＰＧＥＭＴ（登録商標）ＰＣＲクローニングベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標），Ｉｎｃ．）に４１０ｂｐのＰＣＲアンプライマーをクローンニングし、Ｔ７（５’）の方向に挿入するため、クローンをスクリーニングした。

（Ｇ_４Ｓ）_２ＤＤＤ１（配列番号１４として開示する（Ｇ_４Ｓ）_２）から成る構築物
リンカーペプチドの１１残基に先行してＤＤＤ１のアミノ酸配列をコードするために、まずＢａｍＨＩ制限酵素部位を持つ２つのコドンを用いて、ＳｉｇｍａのＧＥＮＯＳＹＳ（登録商標）（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＫ）により（Ｇ_４Ｓ）_２ＤＤＤ１（配列番号１４として開示する（Ｇ_４Ｓ）_２）と命名した二本鎖のオリゴヌクレオチドを合成した。終止コドンおよびＥａｇI制限酵素部位は３’末端に付加される。コードされたポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１５）

３’末端で３０塩基対分重複する、ＲＩＩＡ１−４４ｔｏｐおよびＲＩＩＡ１−４４ｂｏｔｔｏｍと命名した２つのオリゴヌクレオチドを合成（ＳｉｇｍａのＧＥＮＯＳＹＳ（登録商標））し、１７４ｂｐのＤＤＤ１配列のうち中心の１５４塩基対を含むように結合させた。オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔａｑポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応に晒した。プライマー伸長後、ＰＣＲにより二本鎖を増幅させた。ＰＧＥＭＴ（登録商標）にアンプライマーをクローンニングし、Ｔ７（５’）の方向に挿入するためスクリーニングした。

（Ｇ_４Ｓ）_２‐ＡＤ１（配列番号１４として開示する（Ｇ_４Ｓ）_２）から成る構築物
ＡＤ１のアミノ酸配列をコードするため、リンカーペプチドの１１残基のまえに、ＢａｍＨＩ制限酵素部位を持つ最初の２つのコドンを用いて、ＳｉｇｍａのＧＥＮＯＳＹＳ（登録商標）により（Ｇ_４Ｓ）_２‐ＡＤ１（配列番号１４として開示する（Ｇ_４Ｓ）_２）と命名した二本鎖のオリゴヌクレオチドを合成した。終止コドンおよびＥａｇI制限酵素部位は３’末端に付加される。コードされたポリペプド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１６）

ＡＫＡＰ−ＩＳ ＴｏｐおよびＡＫＡＰ−ＩＳ Ｂｏｔｔｏｍと命名した、上記のペプチド配列をコードする２つの重複する相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、アニールした。ＰＣＲにより二本鎖を増幅させた。ＰＧＥＭＴ（登録商標）ベクターにアンプライマーをクローンニングし、Ｔ７（５’）の方向に挿入するためスクリーニングした。

ＤＤＤ１のＣＨ１とのライゲーション
ＢａｍＨＩ制限酵素およびＮｏｔI制限酵素を用いてＰＧＥＭＴ（登録商標）からＤＤＤ１配列をコードする１９０ｂｐのフラグメントを切り出し、次いでシャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成させるためにＣＨ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）にライゲーションさせた。

ＡＤ１のＣＨ１とのライゲーション
ＢａｍＨＩ制限酵素およびＮｏｔI制限酵素を用いてＰＧＥＭＴ（登録商標）からＡＤ１配列を含む１１０ｂｐのフラグメントを切り出し、次いでシャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成させるためにＣＨ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）の同じ部位にライゲーションさせた。

ｐｄＨＬ２に基づくベクターへのＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のクローニング
このモジュラー設計を用いて、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のどちらかをｐｄＨＬ２ベクターにある任意のＩｇＧコンストラクトに組み込むことができる。重鎖定常ドメイン全体は、ｐｄＨＬ２由来のＳａｃＩＩ／ＥａｇI制限フラグメント（ＣＨ１−ＣＨ３）を取り除き、それをｐＧｅｍＴシャトルベクターそれぞれから切り出されたＣＨ１−ＤＤＤｌまたはＣＨ１−ＡＤｌのＳａｃＩＩ／ＥａｇIフラグメントと置換することにより上述のコンストラクトの１つと置換される。

ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤｌ−ｐｄＨＬ２の構築
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤｌ−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基でできたフレキシブルなＧｌｙ／ＳｅｒペプチドスペーサーによりＦｄのＣＨ１ドメインのカルボキシル基末端に連結されたＡＤ１を持つｈ６７９Ｆａｂを産生させるための発現ベクターである。ＳａｃＩＩおよびＥａｇIを用いてＣＨ１−ＡＤｌ−ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＡＤｌフラグメントと、ＳａｃＩＩ／ＥａｇIフラグメントを置換することによりｈ６７９の可変ドメインを含むｐｄＨＬ２に基づくベクターをｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤｌ−ｐｄＨＬ２に変換した。

ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、融合タンパク質Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４という２つの複製を含む安定な二量体を産生させるための発現ベクターであり、ここでＤＤＤ１は、フレキシブルなペプチドスペーサーによりＣＨ１のカルボキシル基末端にてｈＭＮ−１４Ｆａｂに連結される。ＳａｃＩＩおよびＥａｇIを用いてＣＨ１−ＤＤＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＣＨ３ドメインを取り除き、ＣＨ１−ＤＤＤ１フラグメントを挿入するため、ＳａｃＩＩおよびＥａｇI制限酵素を用いて消化させることにより、ｈＭＮ−１４ＩｇＧを産生させるために使用したプラスミドベクターｈＭＮ−１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２をＣ−ＤＤＤｌ−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２へと変換させた。

同様の技術は、ｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＰＡＭ４、ｈＲｌ、ｈＲＳ７、ｈＭＮ−１４、ｈＭＮ−１５、ｈＡ１９、ｈＡ２０、および他の多くの抗体のような、知られている種々様々な抗体のＦａｂを発現するプラスミドを産生させるために利用されてきた。一般的に、配列をコードする抗体可変領域は、ｐｄＨＬ２発現ベクターに提示され、発現ベクターは、先に説明したＡＤ融合タンパク質またはＤＤＤ融合タンパク質を産生するために変換された。

Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−ｌ４−ｐｄＨＬ２の構築
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を産生させるための発現ベクターであり、１４アミノ酸残基のＧｌｙ／ＳｅｒペプチドリンカーによりｈＭＮ−１４のＦｄのカルボキシル基末端に付加されたＤＤＤ２の二量化およびドッキングドメインを保有する。分泌された融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインとの非共有結合的な相互作用により保持されたｈＭＮ−１４Ｆａｂという２つの同じ複製から構成される。

発現ベクターは以下のように操作した。リンカーペプチド（ＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧ、配列番号１７）、およびＤＤＤ２の１−１３残基の部分についてコード配列を含む、２つの重複する優遇的なオリゴヌクレオチドを合成的に作製した。オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔ４ＰＮＫを用いてリン酸化し、結果として、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔIそれぞれを用いて消化したＤＮＡとライゲーションするのに適した５’末端および３’末端でオーバーハングさせた。

シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成させるために、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）と二本鎖ＤＮＡをライゲーションしョンし、これはＢａｍＨＩおよびＰｓｔIを用いて消化することにより調製した。ＳａｃＩＩおよびＥａｇIを用いてＣＨ１−ＤＤＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）から５０７ｂｐのフラグメント切り出し、ＩｇＧ発現ベクターｈＭＮ−１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２とライゲーションし、これはＳａｃＩＩおよびＥａｇIを用いた消化により調製した。最終的な発現コンストラクトはＣ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２と命名した。類似の技術が、いくつかの異なるヒト化抗体のＦａｂフラグメントからＤＤＤＤ２−融合タンパク質を生成させるために利用されてきた。

ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２の構築
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２は、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を産生させる発現ベクターであり、１４アミノ酸残基のＧｌｙ／ＳｅｒペプチドリンカーによりＣＨ１ドメインのカルボキシル基末端に付加されるＡＤ２のアンカードメイン配列を保有する。ＡＤ２はＡＤ１のアンカードメイン配列の前に１つのシステイン残基を、該ドメインの後に別の１つのシステイン残基を有する。

発現ベクターは以下のように操作した。ＡＤ２のコード配列およびリンカー配列の部分を含む、２つの重複する優遇的なオリゴヌクレオチドを合成的に作製した。オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔ４ＰＮＫを用いてリン酸化し、結果として、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｅIそれぞれを用いて消化したＤＮＡとライゲーションするのに適した５’末端および３’末端でオーバーハングさせた。

シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成させるために、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）に二本鎖ＤＮＡをライゲーションし、これはＢａｍＨＩおよびＳｐｅIを用いて消化することにより調製した。ＳａｃＩＩおよびＥａｇI制限酵素を持つシャトルベクターからＣＨ１およびＡＤ２コード配列を包含する４２９塩基対のフラグメントを切り出し、ｈ６７９−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションし、同じ酵素を用いた消化により調製した。最終的な発現ベクターはｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２である。

ＴＦ２三量体ＤＮＬコンストラクトの生成
ＴＦ２と命名した三量体ＤＮＬコンストラクトを、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４をｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２と反応させることにより獲得した。以下のように、ＴＦ２試験的なバッチを、＞９０％の収率で生成させた。タンパク質Ｌ−精製Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（２００ｍｇ）をｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（６０ｍｇ）と１．４：１のモル比で混合した。総タンパク質濃度は、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で１．５ｍｇ／ｍｌであった。続くステップはＴＣＥＰ還元、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＤＭＳＯ酸化、およびＩＭＰ２９１アフィニティークロマトグラフィーを伴った。ＴＣＥＰの添加前に、ＳＥ−ＨＰＬＣは、ａ_２ｂを形成するという証拠を示さなかった。５ｍＭのＴＣＥＰの添加により、二成分構造と予想される１５７ｋＤａのタンパク質と一致するａ_２ｂ複合体の形成に、迅速に至った。ＩＭＰ２９１アフィニティークロマトグラフィー（不図示）により、ＴＦ２を均一近くまで精製した。ＩＭＰ２９１は、６７９のＦａｂが結合するＨＳＧハプテンを含む合成ペプチドである（Ｒｏｓｓｉら、２００５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：７１２２ｓ−２９ｓ）。ＩＭＰ２９１の結合しなかった分画のＳＥ−ＨＰＬＣ分析により、産物からａ_４、ａ_２、および遊離κ鎖が取り除かれたことが実証された（不図示）。

非還元的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＴＦ２の大部分は、ＩｇＧに近い相対的移動度を持つ、大きな共有結合性構造として存在することが実証された（不図示）。還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＴＦ２の構成ポリペプチドを表すバンドのみが明確である（不図示）ので、非還元性ゲル中の任意の付加的なバンドは、産物に関していることを示す（不図示）。しかし、４種類の各ペプチドの相対的移動度は非常に近似しており、分解できなかった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（不図示）では、１５６，４３４ Ｄａの単一ピークが示されたが、これはＴＦ２の計算上の質量（１５７，３１９ Ｄａ）の９９．５％の範囲内にある。

ＴＦ２の機能性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析により測定した。ＴＦ２、Ｃ−ＤＤＤｌ−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤｌ（非共有結合性ａ_２ｂ複合体の対照サンプルとして使用）、またはＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ２（還元されていないａ_２成分およびｂ成分の対照サンプルとして使用）を１μｇ／ｍｌ（総タンパク質）に希釈し、ＨＳＧを用いて固定化したセンサーチップ上を通過させた。ＴＦ２についての反応は、２種類の対照サンプルのおよそ二倍であり、対照サンプル中のｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ成分だけがセンサーチップ上に結合したまま残るであろうことを示した。次に、ＷＩ２ＩｇＧの注入では、さらなるシグナル応答性によって示されるように、ｈＭＮ−１４の抗イディオタイプ抗体により、ＴＦ２だけがｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤと強く結合するＤＤＤ−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を有していたことが実証された。センサーチップ上に固定されたＴＦ２へのＷＩ２の結合により生じる反応性のさらなる増加は、２つの完全に機能的な結合部位に相当しており、各々はＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１つのサブユニットに提供されていた。これは、ＷＩ２の２つのＦａｂフラグメントに結合するＴＦ２の能力により確認された（不図示）。

実施例２．Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ発現ベクター
任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターの、Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターへの転換を促進させるためにプラスミドシャトルベクターを作製した。Ｆｃ（Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメイン）について、テンプレートとしてｐｄＨＬ２ベクターを使用し、かつ次のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲにより遺伝子を増幅した。
Ｆｃ ＢｇｌＩＩ 左側
ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧ（配列番号８）
Ｆｃ Ｂａｍ− ＥｃｏＲＩ 右側
ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ（配列番号９）

ｐＧｅｍＴ ＰＣＲクローニングベクター内にアンプライマーをクローニングした（Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＧｅｍＴからＦｃ挿入フラグメントから切り出し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いてｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２（Ｒｏｓｓｉら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００６，１０３：６８４１−６）を消化させることにより調製したＡＤ２−ｐｄＨＬ２とライゲーションさせ、シャトルベクターＦｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２を生成させた。ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターをＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターへと変換するため、前者から８６１ｂｐのＢｓｒＧ Ｉ／Ｎｄｅ Ｉ制限フラグメントを切り出し、Ｆｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターから切り出した９５２ｂｐのＢｓｒＧ Ｉ／Ｎｄｅ Ｉ制限フラグメントと置換した。以下は、組み換えヒト化ＩｇＧ−ＡＤ２モジュールを作製するために生成し、使用したＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターリストの一部である。
Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）
Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）
Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）
Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）
Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＲｌ（抗ＩＧＦ−ｌＲ）
Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈ７３４（抗インジウムＤＴＰＡ）

実施例３．Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧの作製
好適なＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ分泌細胞株のトランスフェクションおよび選択
全ての細胞株をハイブリドーマＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）において増殖させた。ＳａｌＩ制限酵素を用いた消化によりＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクター（３０μｇ）を線状化し、エレクトロポレーション（４５０ボルト、２５μＦ）によりＳｐ２／０−Ａｇｌ４（２．８×１０^６細胞）へとトランスフェクトさせた。ｐｄＨＬ２ベクターは、クローン選択とともにメトトレキサート（ＭＴＸ）を用いて遺伝子増幅ができるジヒドロ葉酸還元用の遺伝子を含む。

次のトランスフェクションで、９６ウェルのプレートに細胞を蒔き、０．２μＭのＭＴＸを含む培地でトランスジェニッククローンを選択した。特異的な抗イディオタイプＭＡｂでコーティングした９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用し、サンドウィッチＥＬＩＳＡにより、Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ産生力についてクローンをスクリーニングした。推定クローンの条件培地をマイクロプレートのウェルに移し、西洋わさびペルオキシターゼ抱合したヤギ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）_２を用いて融合タンパク質の検出を行った（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。最も高いシグナルを出したウェルを拡大し、最終的に産物として使用した。

Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールの作製および精製
融合タンパク質の産物のため、２×１０^５細胞／ｍｌでローラーボトル培養を播種し、細胞生存率が２５％以下に落ちるまで、ローラーボトルインキュベータ中、５％のＣＯ_２のもと、３７℃でインキュベートした（〜１０日）。遠心分離により培養ブロスを清澄させ、濾過し、限外濾過法により５０倍まで濃縮した。Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ分子の精製のため、濃縮した上清液をタンパク質Ａ（ＭＡＢ Ｓｅｌｅｃｔ）のアフィニティーカラムにロードした。ＰＢＳを用いてベースラインまでカラムを洗浄し、０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．５を用いて融合タンパク質を溶出した。

実施例４．ＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）の生成およびＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−ｌ７８）−ｐｄＨＬ２の構築
ＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）−ｐｄＨＬ２は、ＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）用の発現ベクターであり、これはＤＤＤ２−リンカー−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）−ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３０として開示されるＨＨＨＨＨＨ）を含む。マウスＣＤ２０（ｍＣＤ２０）の細胞外ドメインは、ｍＣＤ２０（１３６−１７８）と呼び、以下に示す配列のアミノ酸残基１３６〜１７８を含む。
ＴＬＳＨＦＬＫＭＲＲＬＥＬＩＱＴＳＫＰＹＶＤＩＹＤＣＥＰＳＮＳＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＮ（配列番号１８）

マウスＣＤ２０異種抗原のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＳＧＰＦＰＡＥＰＴＫＧＰＬＡＭＱＰＡＰＫＶＮＬＫＲＴＳＳＬＶＧＰＴＱＳＦＦＭＲＥＳＫＡＬＧＡＶＱＩＭＮＧＬＦＨＩＴＬＧＧＬＬＭＩＰＴＧＶＦＡＰＩＣＬＳＶＷＹＰＬＷＧＧＩＭＹＩＩＳＧＳＬＬＡＡＡＡＥＫＴＳＲＫＳＬＶＫＡＫＶＩＭＳＳＬＳＬＦＡＡＩＳＧＩＩＬＳＩＭＤＩＬＮＭＴＬＳＨＦＬＫＭＲＲＬＥＬＩＱＴＳＫＰＹＶＤＩＹＤＣＥＰＳＮＳＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＮＳＩＱＳＶＦＬＧＩＬＳＡＭＬＩＳＡＦＦＱＫＬＶＴＡＧＩＶＥＮＥＷＫＲＭＣＴＲＳＫＳＮＶＶＬＬＳＡＧＥＫＮＥＱＴＩＫＭＫＥＥＩＩＥＬＳＧＶＳＳＱＰＫＮＥＥＥＩＥＩＩＰＶＱＥＥＥＥＥＥＡＥＩＮＦＰＡＰＰＱＥＱＥＳＬＰＶＥＮＥＩＡＰ（配列番号７）

テンプレートとして全長マウスＣＤ２０のｃＤＮＡクローンを使用し、ＰＣＲによりＢａｍＨｌおよびＸｈｏ１制限酵素部位に隣接したｍＣＤ２０（１３６−１７８）のヌクレオチド配列を含むＤＮＡセグメントを獲得した。２つのプライマーを以下に示す。
上流プライマー：ＢａｍＨＩ＿ｍＣＤ２０プライマー（３０塩基長）
５’−ＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧ（配列番号３１）
下流プライマー：ＸｈｏI ｍＣＤ２０プライマー（３０塩基長）
５’−ＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＧＴＡＧＡＴＧＧＧＧＡ（配列番号３２）

ＰＣＲアンプライマー（１４１ｂｐ）をＰＧＥＭＴ（登録商標）ベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標））にクローニングする。ＸｂａIおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いた消化によりアンプライマーとライゲーションするためにＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２哺乳類の発現ベクター、例えば、Ｎ−ＤＤＤ２−ｈＧ−ＣＳＦ−Ｈｉｓ−ｐｄＨＬ２を調製する。ＸｂａIおよびＢａｍＨＩを用いてＰＧＥＭＴ（登録商標）からｍＣＤ２０アンプライマーを切り出し、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションし、発現ベクターＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（ｌ３６〜１７８）−ｐｄＨＬ２を生成させる。

ＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）を発現するクローンを獲得するためのトランスフェクションおよびスクリーニング
ＳａｌI酵素を用いた消化によりベクターＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）を線状化し、エレクトロポレーションにより安定的にＳｐＥＳＦ骨髄腫細胞にトランスフェクトする（例えば米国特許第７，５３７，９３０号を参照されたく、その実施例部分は参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかのクローンは、ＥＬＩＳＡにより、検出可能レベルのＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）を有することが認められ、その中から最も産生能が高いクローンを選択し、続いて５週間にわたり、０．１〜０．８μＭまでメトトレキサート（ＭＴＸ）濃度を増加させながら増幅させる。この時点で、限定希釈によりサブクローニングし、最も産能が高いサブクローンを拡大する。

０．８μＭのＭＴＸを含む総量２０Ｌの無血清ハイブリドーマＳＦＭを含む３４個のローラーボトルまでクローンを拡大し、末端培養への到達を許す。遠心分離により上清液を清澄させ、濾過する（０．２μＭ）。１Ｘ結合緩衝液（１０ｍＭのイミダゾール、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．５）にディアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）し、固定金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製するために３１０ｍＬまで濃縮させる。濃縮物を３０ｍＬのＮｉ−ＮＴＡカラムにロードし、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を加えた５００ｍＬのＩＸ結合緩衝液を用いて洗浄し、次いで２９０ｍＬ（３０ｍＭのイミダゾール、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．５）を用いて洗浄する。１１０ｍＬ（２５０ｍＭのイミダゾール、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．５）を用いて生成物を溶出する。還元条件のもと、ＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価する。

実施例５．４複製のｍＣＤ２０（１３６−１７８）に連結させたｈＬＬ１ＩｇＧを含む７４−ｍＣＤ２０ＤＮＬワクチンの生成
実施例２および実施例３で説明したように、Ｃ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）を産生させる。コンストラクトは、ｈＬＬ１ＩｇＧの各重鎖のＣ末端に付着させたＡＤ２部分を含む。ＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）は、実施例４で説明したように産生させる。ＤＮＬ反応は、１ｍＭの還元グルタチオンを含むＰＢＳ中で、ｈＬＬ１ＩｇＧ−ＡＤ２およびＤＤＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）を混合することにより行われる。翌日、酸化型グルタチオンを２ｍＭの終末濃度に添加し、２４時間後、反応混合物をタンパク質Ａカラム上で精製させる。この実施形態では、各ＡＤ２部分に２複製のＤＤＤ２−ｍＣＤ２０付着させ、結果として、１つのｈＬＬ１ ＩｇＧ部分および４つのｍＣＤ２０異種抗原部分を含むＤＮＬ複合体が生じる。

代替的な実施形態では、ｈＬＬ１のＦａｂをＤＤＤ２に連結させ、ｍＣＤ２０（１３６−１７８）をＡＤ２に連結させる。先に説明したように、ＤＮＬコンストラクトの形成は、結果としてｈＬＬ１−Ｆ（ａｂ）_２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）と命名されたＭＭワクチンとなり、これはｈＬＬ１の２つのＦａｂ部分に付着された単一のｍＣＤ２０（１３６−１７８）を含む。ＡＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）の生成は、実施例６に説明する。

ＭＭを伴う対象に７４−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）またはｈＬＬ１−Ｆ（ａｂ）_２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）投与することにより、ＣＤｌ３８^ｎｅｇＣＤ２０^＋と推定されるＭＭ幹細胞に対抗する免疫反応を誘発する。免疫反応は、対象のＭＭ疾患細胞を減少または除去するのに効果的である。

実施例６．組み換えＡＤ２−ｍＣＤ２０（１３６−１７８）の生成

ＡＤ２−ｍＣＤ２０（ｌ３６〜１７８）−ｐｄＨＬ２は、組み換えＡＤ２−ｍＣＤ２０（１３６〜１７８）用の発現ベクターであり、ＡＤ２−リンカー−ｍＣＤ２０（１３６〜１７８）−ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３０として開示したＨＨＨＨＨＨ）を含む。テンプレートとして全長マウスＣＤ２０ｃＤＮＡクローンを使用し、かつ以下に示す２つのプライマーを使用して、ＰＣＲによりＢｇｌ２およびＥａｇ１制限酵素部位に隣接したｍＣＤ２０（１３６〜１７８）のヌクレオチド配列を含むＤＮＡセグメントを獲得した。
上流プライマー：Ｂｇｌ２＿ｍＣＤ２０プライマー（３０塩基長）
５’−ＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧ（配列番号３３）
下流プライマー：Ｅａｇ１＿ｍＣＤ２０プライマー（４８塩基長）
５’ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＧＴＧＴＡＧＡＴＧＧ（配列番号３４）

ＰＣＲアンプライマー（１６２ｂｐ）をＰＧＥＭＴ（登録商標）ベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標））にクローニングした。ＡＤ２−ｐｄＨＬ２哺乳類発現ベクター、例えば、Ｎ−ＡＤ２−ｈトンスフェリン−ヒスチジンｐｄＨＬ２は、Ｂｇｌ２制限酵素およびＥａｇ１制限酵素によるアンプライマーを用いたライゲーションのために調製される。Ｂｇｌ２およびＥａｇ１を用いてＰＧＥＭＴ（登録商標）からｍＣＤ２０アンプライマーを切り出し、発現ベクターＡＤ２−ｍＣＤ２０（１３６〜ｌ７８）−ｐｄＨＬ２を生成させるためにＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションさせる。実施例４で説明したように、ＡＤ２−ｍＣＤ２０（１３６〜１７８）を発現するクローンを獲得し、Ｎｉ選択を使用してＡＤ２−ｍＣＤ２０（１３６〜１７８）培養物の上清から精製する。

実施例７．ＡＤおよびＤＤＤ配列変異体
特定の好ましい実施形態では、先に説明したように、ＡＤ２（配列番号１３）およびＤＤＤＤ２（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＤＮＬ複合体にＡＤ配列およびＤＤＤ配列を組み込む。しかし、別の実施形態では、ＡＤ部分および／またはＤＤＤ部分の配列変異は、サイトカイン−ＭＡｂＤＮＬ複合体の構築に利用してよい。ＡＤドメインおよびＤＤＤドメインの構造機能の関係が研究されてきた（例えばＢｕｒｎｓ−Ｈａｍｕｒｏら，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １４：２９８２−９２；Ｃａｒｒら，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１７３３２−３８；Ａｌｔｏら，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：４４４５−５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３９６：２９７−３０６；Ｓｔｏｋｋａら，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４００：４９３−９９；Ｇｏｌｄら，２００６，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４：３８３−９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら，２００６，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４：３９７−４０８を参照されたい）。

例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）は、ＡＤ−ＤＤＤ結合の相互作用の結晶構造を試験し、含有していたいくつかの保存アミノ酸残基を含むヒトＤＤＤ配列は、下記の配列番号３５で下線を付けた二量体形成またはＡＫＡＰ結合のどちらかに重要であるという結論に至った（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら、２００６の図１を参照されたい）。技術者であれば、ＤＤＤ配列の配列変異を設計することにおいて、二量化およびＡＫＡＰ結合に重要性が低い残基として保存アミノ酸置換を作製できつつも、下線を付けた残基が変化してしまうことは回避することを理解するだろう。
プロテインキナーゼＡのヒトＤＤＤ配列
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３５）

Ａｌｔｏら（２００３）は、ＤＤＤについて０．４ｎＭの結合定数を持つ、ＡＫＡＰ−ＩＳ（配列番号１２）と呼ばれるＲＩＩ選択的ＡＤ配列を設計するため、さまざまなＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列のバイオインフォマティクス分析を行った。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列をＰＫＡに結合するＡＫＡＰのペプチドアンタゴニストとして設計した。置換基がＤＤへの結合を減らす傾向のあるＡＫＡＰ−ＩＳ配列の残基を、以下の配列番号１２にて下線を付けた。

ＡＫＡＰ−ＩＳ配列
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１２）
同様に、Ｇｏｌｄ（２００６）は、ＲＩアイソフフォームと比較してＰＫＡのＲＩＩアイソフォームについて、５桁の大きさの高い選択性を示すＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号１９）を発生させるために結晶学およびペプチヂスクリーニングを利用した。下線を付けた残基は、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に関連するアミノ酸置換の位置を示し、ＲＩＩａのＤＤＤ部分への結合を増加した。この配列では、Ｎ末端のＱ残基は残基数４として番号が付され、Ｃ末端のＡ残基の残基数は２０として番号が付されている。置換がＲＩＩａの親和性に作用するように作製できた残基は８、１１、１５、１６、１８、１９、および２０（Ｇｏｌｄら，２００６）であった。別の特定の実施形態では、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、サイトカイン−ＭＡｂのＤＮＬコンストラクトを調製するために、ＡＫＡＰ−ＩＳのＡＤ部分配列に置換してよいことが想定される。ＡＫＡＰ−ＩＳ ＡＤ配列に置換される他の代替的な配列は、配列番号２０〜配列番号２２に示す。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に関する置換基は下線を付ける。配列番号１９に示すＡＫＡＰ−ＩＳ配列と同様に、ＡＤ部分も追加のＮ末端残基のシステインおよびグリシン、並びにＣ末端残基グリシンおよびシステインを含んでよいことが見込まれる。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＹＡＩＨＱＡ（配列番号１９）
代替的なＡＫＡＰ配列
ＱＩＥＹＫＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号２０）
ＱＩＥＹＨＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号２１）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号２２）

Ｓｔｏｋｋａら（２００６）はまた、配列番号２３〜配列番号２５に示す、ＰＫＡに結合するＡＫＡＰのペプチド競合物を開発した。Ｈｔ３１（配列番号２３）、ＲＩＡＤ（配列番号２４）、およびＰＶ−３８（配列番号２５）としてペプチドアンタゴニストを設計した。Ｈｔ−３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに高い親和性を提示し、ＲＩＡＤおよびＰＶ−３８は、ＲＩに高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号２３）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号２４）
ＰＶ−３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号２５）

Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）は、ＰＫＡのＲＩＩ型のＤＤＤに対して０．４ｎＭと同程度に低い結合定数を用いて、ＰＫＡに結合するＡＫＡＰについてさらに他のペプチド競合物を開発した。様々なＡＫＡＰ拮抗ペプチドの配列がＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（参照により本明細書に組み込まれる）の表１に提示されている。異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン中に高く保存された残基は、ＡＫＡＰ ＩＳ配列（配列番号１２）として参照するとともに下線を付けて以下に示す。残基は、Ｃ末端のアラニン残基の付加を持つ、Ａｌｔｏら（２００３）により認められた残基と同じである（Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）の図４を参照されたく、該内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ＲＩＩのＤＤＤ配列に特定の高い親和性を持つペプチドアンタゴニストの配列は、配列番号２６〜２８に示す。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１２）
ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号２６）
ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＴＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号２７）
ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＤＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号２８）

Ｃａｒｒら（２００１）は、ヒトおよび非ヒトタンパク質由来の異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列と異なるＤＤＤ部分のうち、最も高く保存されると予想されるＤＤＤ配列中に同定した残基との間の配列相同性の程度を試験した。これらは、配列番号３５のヒトＰＫＡ ＲＩＩａ ＤＤＤ配列として参照するとともに下線を付けて示す。とりわけ保存された残基は、さらにイタリック体で示す。同一ではないものの、重複する残基はＡＫＡＰタンパク質への結合に重要であることがＫｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）により示唆された。
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３５）

技術者であれば、本明細書で説明したように、一般的に、異なるタンパク質に由来するＤＤＤ配列およびＡＤ配列に高度に保存されたアミノ酸残基は、アミノ酸置換を作製時に一定のままであることが好ましいアミノ酸残基であり、高度でなく保存された残基は、ＡＤおよび配列／またはＤＤＤ配列の配列変異を産生させるように、一層容易に変化し得ることを理解するだろう。

技術者であれば、ＤＮＬコンストラクトの抗体部分またはリンカー部分にある、これらおよび他のアミノ酸置換が、結果生じるＤＮＬコンストラクトの治療的特性および／または薬物動態的特性を向上させるために利用されてよいことを理解するだろう。

実施例８．ＤＣに関するｈＬＬ１の効果−ＡＰＣの異なるサブセットを持つｈＬＬ１の結合効率
初期の研究により、ＣＤ７４は、血中ＤＣ、Ｂ細胞、単球を含むほとんどの抗原提示細胞に発現することが実証された。ＡＰＣ中のＣＤ７４の発現プロファイルをさらに特徴付けるため、我々は、ヒトＰＢＭＣおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、単球由来のＤＣの異なるサブセットにおけるＣＤ７４の発現を試験した。図１Ａに示すゲート戦略を使用して、我々は、血中のＤＣサブセット、骨髄ＤＣ１（ＭＤＣｌ）およびＤＣ２（ＭＤＣ２）、並びに形質細胞様ＤＣ（ＰＤＣ）の全ては、ＭＤＣ２が最も高いレベルのＣＤ７４を発現させながら（図１Ｂ）ＣＤ７４を発現させることを見出した。ＣＤ７４は、ＬＰＳ成熟ＤＣよりもはるかに高いレベルで単球由来の未熟ＤＣ中でも発現した（図２Ａ）。ＣＤ７４発現プロファイルと一致して、ｈＬＬ１は、血中ＤＣサブセット、Ｂ細胞、単球、および単球由来の未熟ＤＣ（図１Ｃ、図２Ｂ）と効率的に結合したが、ＬＰＳ成熟ＤＣ（図２Ｂ、図２Ｃ）とは結合しなかった。これらＡＰＣサブセットにおけるｈＬＬ１の結合効率は、それらのＣＤ７４発現レベルとよく相関している。これらのデータにより、ドック・ロック技術による標的ビヒクルとしてｈＬＬ１１を使用したＡＰＣへの抗原のｉｎ ｖｉｖｏの基盤が提供される。

正常ＤＣではなく、ＣＤ７４を発現する悪性Ｂ細胞に関するｈＬＬ１の細胞毒性効果
図１Ａおよび図１Ｂに示すように、ＣＤ７４は、ｈＬＬ１が効率的に結合しつつ、未熟ＤＣにて高く発現するので、ＣＤ７４を発現するＢ細胞リンパ腫に在る（Ｓｔｅｉｎら，Ｂｌｏｏｄ ２００４，１０４：３７０５−１１）ことが既に示されているように、ｈＬＬ１がＤＣ中に同じ細胞毒性を有するかを疑った。このために、ＭＴＳ分析および顕微イメージングを使用し、Ｂ細胞悪性Ｄａｕｄｉ細胞およびヒト単球由来のＤＣの細胞生存率についてｈＬＬ１の効果を並べて比較した。結果は、ＧＡＨ（ヤギ抗ヒト抗体）、ｈＬＬ１架橋結合用の第２抗体の存在下にて、ＤＣではなくＤａｕｄｉ細胞の細胞生存率を著しく減少させ（図３Ａ）、これは先に示したように、高いレベルのＣＤ７４を正常に発現させることを実証した。顕微イメージングは、ＧＡＨと架橋したｈＬＬ１を用いて治療されたＤａｕｄｉ細胞は、凝集および収縮するようになり、ＤＣは同じように治療した後、正常な形態を維持したことを示す（図３Ｃ、図３Ｄ）。ＧＡＨと架橋したｈＬＬ１によるＤａｕｄｉ細胞に対抗する細胞毒性は、Ｓｔｅｉｎら（２００４）による初期の研究と一致し、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてＢ細胞悪性腫瘍に対して細胞毒性を有することを示した。ＤＣに関し、ｈＬＬ１とＧＡＨとを合わせた細胞毒性による欠失をアポトーシス分析でさらに実証し、これは低二倍体の核集団がＧＨＡと架橋したｈＬＬ１による影響は受けないことを示した（不図示）。

ＤＣについてｈＬＬ１の細胞毒性の欠失をさらに確認するため、我々はフローサイトメトリーを使用してアポトーシス分析を行った。ｈＬＬ１治療した未熟ＤＣから核を獲得し、フローサイトメトリー分析のためにＰＩを用いて染色した。ＰＩを足した粒子をまずゲートし、ＳＳＣの低粒子をゲートアウトすることにより壊死組織片を排除した。アポトーシスについて、低二倍体各集団を測定することにより、結果ゲートした核を分析した（図２Ａ）。結果は、架橋結合（ＧＡＨ、Ｆ（ａｂ’）_２ ＧＡＨ ＩｇＧ Ｆｃγ特異的）について、第２ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）の有り無しで、２人のドナーにおけるＤＣアポトーシスの影響が全く無かった（図２Ｂ、図２Ｃ）ことを実証している。正常な樹状細胞に対してほとんど細胞毒性を有さないＢ細胞悪性腫瘍もまたＣＤ７４の表面抗原を発現することを実証した。

ｈＬＬ１によるＤＣ構成の成熟の増大を緩和すること

ヒトＩｇＧは、ＦｃＲライゲーションを介してＤＣと相互作用することができ、ＦｃＲのサブタイプ（単数または複数）するに依存するＤＣの成熟に逆作用を有する。ヒト化ＩｇＧとしてのｈＬＬ１は、ＣＤ７４だけでなく、ＤＣ上に発現したＦｃＲを介してもヒトＤＣと相互作用し得る。このため、我々は、ｈＬＬ１がＣＤ７４もしくはＦｃＲまたは両方との相互作用を介してＤＣの機能に影響を与えうるのであろうと推測した。このことを調査するため、ｈＧＭ−ＣＳＦおよびｈＩＬ−４の存在下、単球のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養において、ＤＣ構成の成熟についてｈＬＬ１の効果を試験した。

ＤＣ成熟は、通常、その形態学的変化に反映されるため、我々はまた、ｈＬＬ１治療がＤＣの形態に何らかの効果を有するかを試験した。図３Ｂに示されるように、さまざまな日数について異なる用量、ＧＡＨ架橋結合の有り無しでは、ｈＬＬ１で治療したＤＣは、健常かつインタクトであると見受けられた。ｈＬＬ１治療したＤＣは線維状細胞と特徴のある幾らかのわずかな形態学的変化を示し、これはＬＰＳ治療したＤＣ（不図示）に類似するが該ＤＣよりも明らかに少ない。

成熟ＤＣは、主に抗原提示分子および副刺激分子発現の情報制御、変化したサイトカイン産生、並びに向上したＴ細胞刺激能力において未熟ＤＣとは異なるので、次に我々はｈＬＬ１が、ＤＣにおけるＨＬＡ−ＤＲ分子および副刺激分子、ＣＤ５４およびＣＤ８６の発現について何らかの効果を有するかを調査した（図４）。結果は、ｈＬＬ１が、０．０５〜５μｇ／ｍｌの範囲のｈＬＬ１濃度内では、用量に依存する方法でＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４およびＣＤ８６を上方制御することができたことを示す（図４Ａ）。しかし、効果は強力ではなく、ＨＬＡ−ＤＲ分子および副刺激分子のように、ＣＤ５４およびＣＤ８６の発現は、０μｇ／ｍｌに比べて５μｇ／ｍｌのｈＬＬ１では１０％上方制御しただけだった（図４Ｂ）。最も高い濃度（５０μｇ／ｍｌ）では、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４およびＣＤ８６の発現は、５μｇ／ｍｌのｈＬＬ１に比べてさらに上方制御することはなく、わずかに減少した（図４Ｂ）。これらの結果は、ｈＬＬ１が強くはないものの、ＤＣ構成の成熟を向上させることができたことを示している。

ｈＬＬ１治療したＤＣによるＴ細胞拡大に著しい影響は無い
未熟ＤＣおよび成熟ＤＣの機能的な違いとは、成熟ＤＣが、Ｔ細胞増殖および拡大を刺激する、強力な能力を有することである。ＤＣにおいて、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４およびＣＤ８６発現の発現を上方制御することにより、構成の成熟を高めることができるので（図４Ｂ）、我々は、このＤＣが成熟するという効果が、ＤＣにより向上したＴ細胞拡大によって反映させることができるかどうかを測定した。図５に示されるように、０．０５〜５０μｇ／ｍｌのｈＬＬ１で治療したＤＣは、全Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ４−Ｔ細胞を含め、ＤＣを媒介したＴ細胞拡大に影響を与えなかった（図５）。この結果は、ｈＬＬ１により向上したＤＣ構成の成熟が、向上したＴ細胞の刺激力へと変えるほど強くなかったことを示唆している。

ｈＬＬ１治療したＤＣによりＴｈ１エフェクター細胞に向かうナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の極性化
しかし、ＤＣは別の重要な機能、つまり異なるエフェクター細胞、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７とともに、新規に定義されたＴｈ１７−１細胞へと分化させるナイーブＣＤ４Ｔ細胞の極性化を有する。Ｔｈ１細胞は、細胞内の病原体および癌に対抗する細胞性免疫に必須である一方で、Ｔｈ２細胞の誘導は体液性免疫に関与する。ＩＬ−１７を産生するＴｈ１７およびＴｈ１７−１細胞は、特定の病原体および自己免疫性の炎症に対し、免疫における多様な機能を有する他の極性化した細胞集団である。これらのエフェクター細胞の極性化は、主としてＤＣにより分泌されたサイトカイン、いわゆる「シグナル３」を介し、ＤＣ／Ｔ細胞シナプスのＴ細胞に提提示される。ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞は、異なるエフェクター機能を媒介するＴｈ１、ＴＨ２、およびＴｎｐ細胞へと分化することができ、該エフェクのターのうち、Ｔｈ１エフェクター細胞は、癌および感染症に対抗するＣＴＬ反応を維持するのに必須の役割を果たす。我々は、０．０５〜５０μｇ／ｍｌのｈＬＬ１が、ＤＣ構成の成熟を用量に依存する方法ではなく、弱いながらも向上させることができるが、この濃度のｈＬＬ１を用いて治療したＤＣは、ＤＣを媒介したＴ細胞拡大に影響を与えなかったことを示す（図５）。次に、我々は、ｈＬＬ１治療したＤＣがＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の極性化に影響を与えることができるかに興味を抱いた。図５に示されるように、ｈＬＬ１治療したＤＣは、より多くのＴＨ１エフェクター細胞、およびより少ないＴＨ２およびＴｎｐ細胞へと分化するようにＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を極性化させた。これらの結果は、ＤＣがｈＬＬ１によって機能的に調節され得ることを示す。Ｔｈ１は腫瘍および感染症に対抗する獲得免疫に重要な役割を果たすので、ｈＬＬ１は、ワクチン接種で使用する際にアジュバント様の活性を有する。

実施例９．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける７４−ｍＣＤ２０の特性−７４−ｍＣＤ２０によるヒトＰＢＭＣにおけるｈＣＤ２０特異的免疫の誘発
ＣＤ２０は、Ｂ細胞上に発現する正常な自己抗原であり、該抗原は、免疫寛容に起因してワクチン戦略による標的が治療的に困難である。しかし、ＣＤ２０に対する特異的なＴ細胞性免疫反応は、ヒトＣＤ２０のミニ遺伝子（Ｐａｌｏｍｂａら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；１１：３７０−９）、またはヒトＣＤ２０の細胞外ドメインおよびＱＳ２１アジュバントを備える担体タンパク質を含む抱合体（Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｂｌｏｏｄ ２００２；９９：３７４８−５５）をコードする細胞外ドメインを用いたワクチン接種により、担癌マウスにおいて実現できた。他の幾つかの報告では、動物モデルとともに患者におけるＭＵＣｌについて示されるように、異種抗原を使用して免疫寛容を断つ実現可能性も実証されている（Ｄｉｎｇら，Ｂｌｏｏｄ ２００８；１１２：２８１７−２５；Ｓｏａｒｅｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１；１６６：６５５５−６３）（Ｒａｍａｎａｔｈａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００５；５４：２５４−６４）。７４−ｍＣＤ２０が成功するようにｈＣＤ２０特異的免疫を誘発し、ＣＤ２０の免疫寛容を克服することができたかを試験するため、以下の実験を行う。

ｈＧＭ−ＣＳＦおよびｈＩＬ−４の存在下にて、５日間にわたって培養することにより、ＰＢＭＣからヒトＤＣを生成させる。未熟ＤＣを７４−ｍＣＤ２０にロードし、ＬＰＳとＩＦＮ−ｇａｍｍａとを合わせることにより成熟させる。成熟ＤＣは、１０日間にわたり自己ＰＢＭＣを刺激するために使用する。ロードした同じＤＣを用いて毎週２回、再刺激を行う。最後の再刺激後、局在化したＣＤ２０陽性ＭＭ癌幹細胞により刺激してから、サイトカイン反応（ＩＦＮ−ｇａｍｍａ）を測定することによりそれらの抗原特異性のためにＴ細胞を試験する。対照として、ＣＤ２０陰性ＭＭ細胞を使用する。Ｔ細胞は、ＣＤ２０陽性ＭＭ癌幹細胞に対して陽性反応を示すが、対照のＣＤ２０陰性ＭＭ細胞には反応を示さない。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるさまざまな抗原提示細胞の７４−ｍＣＤ２０の特異的結合、内面化、および細胞内の位置
我々の準備中のデータでは、ｈＬＬ１が、骨髄性ＤＣｌおよび骨髄性ＤＣ２、形質細胞様ＤＣ、Ｂ細胞および単球を含むＡＰＣと効率的かつ特異的に結合することが示された。７４−ｍＣＤ２０が、ｈＬＬ１単独としてＡＰＣとの結合に同じ効率性および特異性を有することを確認するため、以下の実験を行った。

７４−ｍＣＤ２０および対照のＭｌ−ｍＣＤ２０（４複製のｍＣＤ２０に連結された抗ＭＵＣｌ抗体ｈＰＡＭ４を含む）を使用する。結合分析を以下のように行った。手短にいうと、ＺＥＮＯＮ（商標）ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８ヒトＩｇＧ標識キット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標））を用い、製造者の説明書に従って１５μｇの７４−ｍＣＤ２０またはＭｌ−ｍＣＤ２０を標識する。標識した調製物を、以下に説明するようにヒトＰＢＭＣを染色するために使用する。

ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（商標）を使用してバフィーコートから単離したヒトＰＢＭＣを、ヒトＦｃＲ遮断試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１：２０希釈）を用い、４℃で１０分間処置する。特異的に標識したｍＡｂを用いて洗浄した細胞を染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（登録商標））により分析する。研究用に使用した、標識したｍＡｂｓは、ＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ７４ｍＡｂ ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８標識した７４−ｍＣＤ２０；ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８標識したＭｌ−ｍＣＤ２０；ＰＥ−抱合した抗ＣＤ１９ｍＡｂ（Ｂ細胞用）；ＰＥ−抱合した抗ＣＤ１４ｍＡｂ（単球用）；およびＢＤＣＡ−Ｉに対するＡＰＣ−抱合したｍＡｂ（ＭＤＣｌ用）、ＢＤＣＡ−２（ＰＤＣ用）、またはＢＤＣＡ−３（ＭＤＣ２用）を含む。Ｂ細胞、単球、ＭＤＣ１、ＭＤＣ２、およびＰＤＣの同定にゲート戦略を使用する。平均蛍光強度
および表面マーカーを発現する陽性細胞集団について、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによりデータを分析した。

ＭＨＣクラスＩＩの提示およびＭＨＣクラスIの交差提示のさらなるプロセシングについて、７４−ｍＣＤ２０がエンドソームに内在化するか確かめるため、以下の実験を行った。７４−ｍＣＤ２０またはＭｌ−ｍＣＤ２０をヒトＰＢＭＣと混合し、４℃で１時間インキュベートし、広範囲の洗浄を行う。次いで細胞を３７℃まで移し、異なる時間点（０、１５、３０、または４５分）で固定し、透過処理をするか、または処理せずにＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）標識した抗ヒトＩｇＧ二次的抗体を用いて染色する。フローサイトメトリーにより平均蛍光を測定し、さまざまな時間点において記録した固定細胞および透過性細胞（内在化および表面結合）から固定細胞（表面結合）中の平均蛍光を差し引いて、内在化した抗体の量を算出する。

結果は、７４−ｍＣＤ２０ＤＮＬ複合体が、ｈＬＬ１単独としてのＡＰＣとの結合について同じ効率性および特異性を有することを示す。

実施例１０．７４−ｍＣＤ２０によるＩｎＶｉｖｏにおけるｈＣＤ２０特異的免疫反応の誘発
照射した新生仔Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスにＣＤ３４＋ヒト臍帯血細胞（ＨＬＡ Ａ１健常ドナー）を肝内注射し、ヒトＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ細胞を含む再構成させたヒト適応型免疫システム用の動物モデルを作製し、一次リンパ器官および二次リンパ器官を構築する（Ｈｕｆｆら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６：２８９５−９００；ＹａｎｇおよびＣｈａｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．２００８，２６：７４１−５５）。これらのマウスは、Ｈｕ−Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスと呼ばれる。

７４−ｍＣＤ２０により誘発された免疫反応を評価するため、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＤＣ成熟用のＣｐＧ（マウス毎に５０μｇ）を併用するか、または併用せずに、７４−ｍＣＤ２０またはＭｌ−ｍＣＤ２０（マウス毎に５０μｇ）を用いて、Ｒａｇ２−／−γｃ−／−マウスに再構築させたヒトＣＤ３４＋細胞を毎週３回免疫化させる。最後の免疫化から５日後、フローサイトメトリーを用いた細胞内サイトカイン染色により評価するようなサイトカイン（ＩＦＮ−ｇａｍｍａ）を産生させるため、各動物の脾細胞を単離し、ＨＬＡ適合ＭＭ癌幹細胞を再刺激する。ターゲット細胞としてのＭＭ癌幹細胞を用いたカルセインＡＭ遊離分析により、ＭＭ癌幹細胞に対抗する特異的細胞毒性評価する。電磁ビーズを使用して、ＭＭ細胞株ＲＰＭＩ１８２２６からＣＤ２０＋ＭＭ癌幹細胞を単離する。アルデヒド脱水素酵素を用いた染色により幹細胞特性を検証する。結果は、７４−ｍＣＤ２０がｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗ｈＣＤ２０特異的免疫反応を誘発することができることを示す。

実施例１１．ＭＭ癌幹細胞に対抗する７４−ｍＣＤ２０の治療可能性：Ｉｎ ＶｉｖｏにおけるｈＰＢＭＣ／ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルまたは養子移入の評価
７４−ｍＣＤ２０の治療効果をｉｎ ｖｉｖｏにおいて評価する最善の方法は、ＭＭ増殖およびヒト適応型免疫システムの発生の両方を支援できるように動物モデルを免疫化することである。ヒトＣＤ３４＋細胞により再構築したＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスは、ＭＭ増殖を支援しないという免疫性に優れているので、ＭＭ幹細胞に対抗する７４−ｍＣＤ２０の治療効果を試験するためにｈＰＢＭＣ／ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルを使用する。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、Ｍａｔｓｕｉらにより、クローン性の多発性骨髄腫幹細胞を移植するために使用されてきた（Ｂｌｏｏｄ ２００４，１０３：２３３２−６；ＣａｎｃｅｒＲｅｓ ２００８，６８：１９０−７）。

ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、腫瘍細胞およびｈＰＢＭＣの共移植により、治療効果を評価するためにも使用される。注入する細胞数を注意深く調節することにより、このモデルは腫瘍増殖およびｈＰＢＭＣ移植の両方を支援することができ、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＤＣ−ＳＩＧＮを標的とするワクチンの効果を試験するために使用されてきた。

４週〜６週齢のメスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）を３００ｃＧｙ（１３７Ｃｓ ｇａｍｍａ照射器を使用して、８４ｃＧｙ／分）で照射する。１２〜１６時間後、背部の尾静脈から局在化したＣＤ２０＋ＭＭ癌幹細胞（２００万）を注入する。一方、ヒトＰＢＭＣ（３００万）、未熟ＤＣ（３万）、およびＤＮＬワクチンの混合物をマウスの皮下に注入する。特定の時間点（日）に、マウスを安楽死させ、長管骨から骨髄を採取し、ヒトＣＤ１３８^＋ＭＭ細胞の染色により移植および治療効果を測定した。

７４−ｍＣＤ２０の治療可能性をさらに評価するためＭＭ幹細胞に対抗する、ワクチンにより誘発した細胞毒性を試験するため、養子導入による代替的な方法を使用した。先に説明したように、７４−ｍＣＤ２０を用いてヒトＣＤ３４＋細胞により再構築したＲａｇ２−／−γｃ−／−マウスを免疫化する。脾細胞を採取し、ＣＤ２０＋ＭＭ癌幹細胞を移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに尾静脈から注入する。特定の時間点（日）に、マウスを安楽死させ、長管骨から骨髄を採取し、ヒトＣＤ１３８＋ＭＭ細胞の染色により移植および治療効果を測定した。結果によれば、７４−ｍＣＤ２０は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＤ２０^＋ＭＭ幹細胞に対抗する免疫反応を誘発することができることが確認される。

実施例１２．ＤＤＤ２−ｍＰＡＰおよびＤＮＬワクチン複合体の生成

実施例４の方法に従い、マウス前立腺酸性ホスファターゼからＤＤＤ２抱合したＰＡＰ異種抗原を生成させる。ＰＡＰ異種抗原を用いた樹状細胞に基づくワクチン接種の効果は、既に開示されている（Ｆｏｎｇら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１，１６７：７１５０−５６）。実施例４に説明したようにＤＤＤ２−ｍＰＡＰ−ｐｄＨＬ２発現ベクターを構築し、実施例４に従い、細胞培養中にＤＤＤ２−ｍＰＡＰ異種抗原融合タンパク質を発現させる。マウス前立腺酸性ホスファターゼ配列は、例えば、ＮＣＢＩデータベースの登録番号ＡＡＦ２３１７１に開示されている。実施例４に説明したように、免疫金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によりＤＤＤ２−ｍＰＡＰ−６ヒスチジン融合タンパク質を発現させ、精製する。

実施例５の方法に従って、複製のＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）および４複製のＤＤＤ２−ｍＰＡＰを含むＤＮＬコンストラクトを調製する。ｈＬＬ１ＩｇＧ部分はｈＬＬ１ ＩｇＧの各重鎖のＣ末端に付着されたＡＤ２配列を含む。ＤＮＬ反応は、１ｍＭの還元グルタチオンを含んだＰＢＳで、ｈＬＬ１ ＩｇＧ−ＡＤ２およびＤＤＤ２−ｍＰＡＰを混合させることにより行った。翌日、２ｍＭの最終濃度に酸化型グルタチオンを添加し、２４時間後、タンパク質Ａカラム上で反応混合物を精製する。２複製のＤＤＤ２−ｍＰＡＰを各ＡＤ２部分に付着させ、１つのｈＬＬ１ ＩｇＧ部分および４つのｍＰＡＰ異種抗原部分を含むＤＮＬ複合体が生じる。

前立腺癌誘発を伴う対象にＤＮＬワクチン抗ＣＤ７４−ｍＰＡＰを投与することにより、前立腺癌幹細胞性を発現するＰＡＰに対抗する免疫反応を誘発する。免疫反応は、対象の前立腺癌細胞を減少または排除するのに効果的である。

実施例１３．ＤＤＤ２−ｍＥＧＦＲおよびＤＮＬワクチン複合体の生成
実施例４の方法に従って、マウスＥＧＦＲからＤＤＤ２抱合したＥＧＦＲ異種抗原を生成する。体液性免疫反応の誘発時におけるＥＧＦＲ異種抗原の効果は、既に開示されている（Ｆａｎｇら，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２００９，２３：１８１−８８）。マウスＥＧＦＲの細胞外ドメインを含むＤＤＤ２−ｍＥＧＦＲ−ｐｄＨＬ２発現ベクターは、実施例４で説明したように構築し、ＤＤＤ２−ｍＥＧＦＲ異種抗原の融合は、実施例４に従い、細胞培養にてタンパク質を発現させる。マウスＥＧＦＲ配列は、例えば、ＮＣＢＩデータベースにて、登録番号ＡＡＧ４３２４１で開示されている。ＤＤＤ２−ｍＥＧＦＲ−６ヒスチジンを融合タンパク質を発現させ、実施例４で説明した免疫金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製する。

実施例５の方法に従い、１複製のＣ_Ｈ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）および４複製のＤＤＤ２−ｍＥＧＦＲを含むＤＮＬコンストラクトを調製する。ｈＬＬ１ＩｇＧ部分は、ｈＬＬ１ ＩｇＧの各重鎖のＣ末端に付着されたＡＤ２配列を含む。ＤＮＬ反応は、１ｍＭの還元型グルタチオンを含むＰＢＳ中にてｈＬＬ１ ＩｇＧ−ＡＤ２およびＤＤＤ２−ｍＥＧＦＲを混合させることにより行われる。翌日、２ｍＭの最終濃度および反応混合物に添加した酸化型グルタチオンを、２４時間後、タンパク質Ａカラム上で精製させる。２複製のＤＤＤ２−ｍＥＧＦＲを各ＡＤ２部分に付着させ、結果として１つのｈＬＬ１ ＩｇＧ部分および４つのｍＥＧＦＲ異種抗原部分を含むＤＮＬ複合体が生じる。

ＥＧＦＲを発現するＮＳＣＬＣを伴う対象にＤＮＬワクチン抗ＣＤ７４−ｍＥＧＦＲを投与することにより、ＥＧＦＲを発現する癌幹細胞に対抗する免疫反応を誘発する。免疫反応は、対象のＥＧＦＲ陽性癌細胞を減少または除去するのに効果的である。

技術者であれば、種々様々な腫瘍関連抗原に対応する異種抗原部分を組み込む、ＤＮＬに基づいたワクチンが、本明細で開示した技術に従って構築され、利用されてよいことを理解するだろう。

本明細書で開示し、請求したあらゆる組成物および方法は、本開示を鑑みると必要以上の実験無しに作製し、使用することができる。組成物および方法は、好ましい実施形態の観点から説明したが、当業者であれば、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱すること無く、本明細書で説明した組成物および方法に対し、かつ方法の工程または工程の順序において、その変形を適用し得ることが明らかである。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤は、同一または類似する結果を達成させながら、本明細書で説明した薬剤と置換されてよい。当業者には明らかな、そのように類似するあらゆる置換および修飾は、付属する請求の範囲により定義するように、本発明の精神、範囲、および概念内にあるとみなされる。

Claims (7)

1. 癌を治療するための医薬を調製するためのＤＮＬ（ドック・ロック）抗癌ワクチン用複合体の使用であって、
   ＤＮＬ複合体が、
   ａ）ＤＤＤ（二量化およびドッキングドメイン）部分に付着され、前記ＤＤＤ部分がヒトプロテインキナーゼＡ調節サブユニットの二量化およびドッキングドメイン由来のペプチド配列を有する、樹状細胞に結合する抗体部分と、
   ｂ）ＡＫＡＰ（Ａキナーゼアンカータンパク質）のアンカードメイン由来のペプチド配列を有する、ＡＤ（アンカードメイン）部分に付着された腫瘍関連異種抗原部分とを備え、
   前記ＤＤＤ部分が、ＤＮＬ複合体を形成するために、前記ＡＤ部分に結合する二量体を形成する複合体であり、
   前記抗体部分が抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、前記腫瘍関連異種抗原がＣＤ２０であり、
   前記癌が、Ｂ細胞癌である、使用。
2. 前記ＤＮＬ複合体が、ＣＤ１３８ ^ｎｅｇ ＣＤ２０ ^＋ ＭＭ幹細胞に対抗する免疫反応を誘発することができる、抗癌ワクチンに使用される請求項１に記載の使用。
3. 癌を治療するための医薬を調製するためのＤＮＬ抗癌ワクチン用複合体の使用であって、
   ＤＮＬ複合体が、
   ｃ）ＡＤ部分に付着され、前記ＡＤ部分がＡＫＡＰ（Ａキナーゼアンカータンパク質）のアンカードメイン由来のペプチド配列を有する、樹状細胞に結合する抗体部分と、
   ｄ）ヒトプロテインキナーゼＡ調節サブユニットの二量化およびドッキングドメインに由来するペプチド配列を有するＤＤＤ部分に付着される腫瘍関連異種抗原部分とを含み、
   前記ＤＤＤ部分がＤＮＬ複合体を形成するように前記ＡＤ部分に結合する二量体を形成する複合体であり、
   前記抗体部分が抗ＣＤ７４抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、前記腫瘍関連異種抗原がＣＤ２０であり、
   前記癌が、Ｂ細胞癌である、使用。
4. 前記抗体部分の各重鎖がそのＣ末端にてＡＤ部分に付着され、前記複合体が１つの抗体部分および４つの腫瘍関連異種抗原部分を含む請求項３に記載の使用。
5. 前記抗体部分が、軽鎖可変の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨ；配列番号１）、ＣＤＲ２（ＴＶＳＮＲＦＳ；配列番号２）、およびＣＤＲ３（ＳＱＳＳＨＶＰＰＴ；配列番号３）、並びに重鎖可変領域ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＶＮ；配列番号４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＰＮＴＧＥＰＴＦＤＤＤＦＫＧ；配列番号：５）、およびＣＤＲ３（ＳＲＧＫＮＥＡＷＦＡＹ；配列番号６）を含むヒト化またはキメラのＬＬ１抗ＣＤ７４抗体もしくはそれらの抗原結合性フラグメントである請求項３に記載の使用。
6. 前記Ｂ細胞癌が、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫から成る群から選択される請求項１〜５の何れか１項に記載の使用。
7. 前記Ｂ細胞癌が、多発性骨髄腫である請求項６に記載の使用。

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