JP5855564B2 - オルソポックスウイルスの製造および精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、ウイルスの製造および精製の分野に関する。本発明は特に、野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルス(Orthopoxvirus)を、製造および精製する方法に関する。

オルソポックスウイルスは、主に独特な形態、大型のＤＮＡゲノム、および複製の場が細胞質であることによって区別される、直径２００ないし３００ｎｍの複雑なエンベロープウイルスである。コペンハーゲンワクシニアウイルス（Vaccinia Virus：ＶＶ）株（GOEBEL et al., 1990, Virol. 179, 247-266 and 517-563; JOHNSON et al., 1993, Virol. 196, 381-401）および改変ワクシニアウイルスアンカラ（modified Vaccinia Virus Ankara：ＭＶＡ）株（ANTOINE et al., 1998, Virol. 244, 365-396）を含むオルソポックスウイルスの数種のメンバーのゲノムが、マッピングおよび配列決定されている。ＶＶは、そのおおよそ１００がウイルス集合に関連する約２００のタンパク質をコードする、約１９２ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞における、ワクシニアウイルスアンカラ株の５００を超える連続継代によって製造された、高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株である（MAYR et al., 1975, Infection 3, 6-16）。ＭＶＡウイルスは、寄託番号Ｎ^６０２Ｉ−７２１により、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託された。ＭＶＡゲノムの完全配列を決定し、かつコペンハーゲンＶＶゲノムと比較することによって、ウイルスゲノム内に起こった変化の正確な同定、ならびにＯＲＦ（Open Reading Frame：翻訳領域）の断片化を誘導する７個の欠失（ＩないしＶＩＩ）および多数の変異を定義することが可能になる（ANTOINE et al., 1998, Virology 244, 365-396）。

組み換え生ワクチン開発用のベクターとしてのオルソポックスウイルスの使用は、安全性への懸念および規制による影響を受けてきた。ワクチン接種にオルソポックスウイルスを使用する前には、ウイルスの精製が必要になる。利用できるオルソポックスウイルスの製造方法は、細胞株（例えばＨｅｌａＳ３）、発育鶏卵、またはニワトリ胚線維芽細胞（Chicken Embryo Fibroblast：ＣＥＦ）内でのウイルスの複製を含んでなる。ウイルスの複製後に培地を廃棄し、細胞を溶解して細胞から放出したオルソポックスウイルスをスクロースクッション遠心分離（sucrose cushion centrifugation）によって精製する（KOTWAL and ABRAHAM; poxvirus growth, Purification and tittering in Vaccinia Virus and Poxvirology, 2004, 101-108, Humana Press Inc., Totowa; NJ; USA）。

国際公開第０７／１４７５２８号には、標的とする感染特異性をもたない野生型、弱毒化、および／または組み換えＭＶＡを製造する方法が記載されており、これはパッケージング細胞（例えばＣＥＦ；細胞株）の培養を用意すること、前記培養細胞を感染させること、前記感染細胞を培養すること、製造されたＭＶＡを、培養上清および／またはパッケージング細胞から回収すること、ならびに深層濾過、精密濾過、および透析濾過によってウイルスをさらに精製することを含んでなる。国際公開第０７／１４７５２８号には、深層濾過、精密濾過、および透析濾過を行う際に、ヌクレアーゼの使用、さらに詳細にはヌクレアーゼとしてのBenzonase（登録商標）の使用は必要でないことが明記される。

国際公開第０８／１３８５３３号には、生物学的に活性のあるワクシニアウイルスを精製する方法が記載されており、これはリガンドが結合する固相基質へ、液相培養に含まれるワクシニアウイルスを負荷すること、基質を洗浄すること、およびウイルスを溶出することを含んでなる。

オルソポックスウイルスの製造および精製のための数種の方法について記載されているにもかかわらず、代替法はなお必要とされている。本発明はこのような方法を提供する。

本出願の全体にわたって用いられる「オルソポックスウイルス」は、痘瘡ウイルス；ワクシニアウイルス（ＶＶ）、例えばワクシニアウイル株：エルストリー、ウェスタンリザーブ、ワイス、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＣＢＯＨ、パリ、コペンハーゲン；ならびにそれらの誘導体、例えば改変ワクシニアウイルスアンカラ（modified Vaccinia Virus Ankara：ＭＶＡ）、特にＭＶＡ５７５（ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７）およびＭＶＡ−ＢＮ（ＥＣＡＣＣ Ｖ０００８３００８）を指す。本発明によるオルソポックスウイルスは、未熟ウイルス（immature virus：ＩＶ）、細胞内成熟ウイルス（intracellular mature virus：ＩＭＶ）、細胞内エンベロープウイルス（intracellular enveloped virus：ＩＥＶ）、細胞結合エンベロープウイルス（cell-associated enveloped virus：ＣＥＶ）、または細胞外エンベロープウイルス（extracellular enveloped virus：ＥＥＶ）（SMITH et al. (2002), J. Gen. Virol., 83, 2915-2931）を区別しない。

本出願の全体にわたって用いられる単数に関する言及（「ａ」および「ａｎ」）は、文脈が明らかに他を指示しない限り、それらが参照される構成要素または工程の「少なくとも１」、「少なくとも第１」、「１以上」、または「複数」を意味する意向で用いられる。

本出願の全体にわたって用いられる「および／または」は、本明細書のいずれの箇所で用いられる場合でも、「および」、「または」、および前記の語により接続される要素のその他のいずれの組み合わせも意味する。

本出願の全体にわたって用いられる「含んでなる（comprising）」および「含んでなる（comprise）」は、産物、組成物、および方法が、参照される構成要素または工程を含むが、他を除外しないことを意味するように意図される。「から本質的になる」が、産物、組成物、および方法を定義するために用いられる際、いずれの必須な意義のあるその他の構成要素または工程も除外されることを意味する。従って、列挙される構成要素から本質的になる組成物は、微量の混入物および薬剤的に許容される担体を除外しないであろう。「からなる」は、その他の構成要素または工程について、微量の要素にとどまらず除外することを意味する。

本出願の全体にわたって用いられる「約」または「おおよそ」は、所定の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％を意味する。

本発明は、野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造および精製する方法（すなわち方法Ａ）に関し、この方法は以下の工程を含んでなる：
ａ）パッケージング細胞の培養物を用意し、
ｂ）培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させ、
ｃ）感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養し、
ｄ）１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートし、
ｅ）培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収し、
ｆ）単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害し、かつ工程ｅ）で回収されたオルソポックスウイルスが工程ｇ）において陰イオン交換吸着剤へ吸着することを避けるのに適切な条件下で、前記オルソポックスウイルスに一価の塩を添加し、
ｇ）核酸の捕捉を可能にするのに適切な条件下で、工程ｆ）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを接触させ、
ｈ）細胞片の除去を可能にするのに適切な条件下で、工程ｇ）で得られた混合物を清澄化し、
ｉ）陰イオン交換吸着剤に残るオルソポックスウイルスを、通過画分（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）中に回収するのに適切な条件下で、陰イオン交換吸着剤を一価の塩を含んでなる溶液により洗浄し、
ｊ）工程ｈ）で得られた通過画分と工程ｉ）で得られた通過画分を濃縮し、
ｋ）工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過(diafiltrating)すること。

好ましい実施形態によれば、本発明の方法は動物性産物（パッケージング細胞を除く）を用いない。本出願の全体にわたって用いられる「動物性産物」は、生存する生命体の動物細胞内で、または動物細胞から製造されたいずれの化合物または化合物の集積も指す。

好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、ワクチンの無菌性についての規制基準の完全な順守を確実にする、無菌的な工業規模の製造過程に適している。

本出願の全体にわたって用いられる「弱毒化オルソポックスウイルス」は、目的とする被験体内におけるその病原性が実質的に減少するように改変された、いずれのオルソポックスウイルスも指す。好ましくはオルソポックスウイルスは、臨床的観点から非病原性となる程度まで、すなわち、オルソポックスウイルスに曝露された被験体が、対照被験体に比較して統計学的に有意に増大したレベルの病態を示さない程度まで弱毒化される。本発明の好ましい実施形態によれば、弱毒化オルソポックスウイルスは弱毒化ＶＶまたは弱毒化ＭＶＡである。

本出願の全体にわたって用いられる「組み換えオルソポックスウイルス」は、そのゲノム内に挿入された外来性配列を含んでなるオルソポックスウイルスを指す。本明細書で用いられる外来性配列は、親ウイルスに天然に存在しない核酸を指す。

本出願の全体にわたって用いられる「パッケージング細胞」は、製造されるべきオルソポックスウイルスを感染させられる細胞を指す。パッケージング細胞は、初代細胞、組み換え細胞、および／または細胞株であってよい。例えば、組み換えウイルスベクターを持たない組み換えウイルスの製造に必要な要素を含む、組み換え細胞を用いることができる。

本発明の好ましい実施形態によれば、パッケージング細胞は不死化細胞株である。本出願の全体にわたって用いられる「不死化細胞株」は、培養によりヘイフリック限界を超えて増殖する細胞株を指す。

本発明によれば、不死化細胞はカモ科(Anatidae family)またはキジ科ファミリーに属する鳥類細胞から好ましく得られる。カモ科の中でも、バリケン属またはマガモ属に属する細胞が特に好ましい。さらに好ましいものは、ノバリケン(Cairina moschata)またはマガモ種に属する不死化鳥類細胞株(immortalized avian cell lines)である。

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、パッケージング細胞は、カモ科、好ましくはノバリケン種に属する鳥類細胞から得られた不死化鳥類細胞株である。

本発明による好ましいノバリケン不死化鳥類細胞株は、国際公開第２００７／０７７２５６号に記載される、テロメラーゼ逆転写酵素（telomerase reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含んでなるノバリケン不死化鳥類細胞株である。以下の不死化鳥類細胞株が特に好ましい：
−受託番号０８０６０５０２により欧州細胞培養収集機関（European Collection of Cell Cultures：ＥＣＡＣＣ）に寄託されるＴ３−１７４９０（図２、３、および４を参照）またはその誘導体；
−受託番号０８０６０５０１により欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に寄託されるＴ６−１７４９０（図５、６、および７を参照）またはその誘導体。

本発明によるその他の好ましいノバリケン不死化鳥類細胞株は、国際公開第２００９／００４０１６号に記載される、Ｅ１Ａ核酸配列およびテロメラーゼ逆転写酵素（telomerase reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含んでなるノバリケン不死化鳥類細胞株である。

本出願の全体にわたって用いられる、寄託された不死化鳥類細胞株の「誘導体(derivative)」は、「関心のある物質」をコードする核酸配列を含んでなる不死化鳥類細胞株を指す。本明細書で用いられる「関心のある物質」は、薬理的活性のあるタンパク質、例えば増殖因子、増殖制御因子、抗体、抗原、免疫化もしくはワクチン接種などに有用なそれらの誘導体、インターロイキン、インスリン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターフェロン（インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ）、血液凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子；第ＩＸ因子；ｔＰＡ）またはそれらの組み合わせを含んでよいが、これらに限定されない。

本発明の方法に使用されてよいその他の不死化細胞株は：
−米国特許第５，８７９，９２４号に記載される、１０日齢のイーストランシング系統（ＥＬＬ−Ｏ）卵由来の自然発生不死化ニワトリ細胞株である、ＤＦ１細胞株；
−国際公開第２００５／００７８４０号に記載される、増殖因子および支持細胞層から徐々に分離した胚性幹細胞由来のＥｂｘニワトリ細胞株；
−カモ胚永久細胞株である、ＤＥＣ９９細胞株（Ivanov et al. Experimental Pathology and Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences）である。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、パッケージング細胞は初代細胞である。本出願の全体にわたって用いられる「初代細胞」は、動物もしくはヒトの組織、臓器、または生命体から新たに分離された細胞を指し、この細胞は継続的かつ無制限に複製および分裂することができない。通常、初代細胞は細胞培養において１００回未満、しばしば５０回未満、しばしば２５回未満分裂する。従って、初代細胞は不死化現象を起こさない。初代細胞には動物線維芽細胞または臍帯血リンパ球が含まれるが、これらに限定されない。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、パッケージング細胞は初代または二次的な鳥類細胞、好ましくはニワトリ胚線維芽細胞（chicken embryo fibroblast：ＣＥＦ）である。

本発明によれば、パッケージング細胞の培養物を用意するために用いられる培地（すなわち工程ａ）において）、前記培養細胞にオルソポックスウイルスを感染させるために用いられる培地（すなわち工程ｂ）において）、および前記の感染させたパッケージング細胞を培養するために用いられる培地（すなわち工程ｃ）において）は、同じかまたは異なってよい。

好ましい実施形態によれば、本発明で用いられる細胞用培地は動物性産物を含まない。動物性産物を含まない多くの培地について既に記載されており、それらのうちの幾つかは市販されている。例えば、293 SFM II；無血清培地馴化293-F 細胞；無血清培地馴化293-H 細胞；293fectin（商標）トランスフェクション試薬；CD 293 AGT(商標)；CD 293 培地；FreeStyle（商標）293 発現システム；FreeStyle（商標）293培地；無血清培地馴化FreeStyle（商標）293-F細胞；アデノウイルス発現培地（Adenovirus Expression Medium: AEM）；PER.C6（登録商標）細胞用増殖培地；CD 293 AGT（商標）；CD 293 培地；無血清培地馴化COS-7L 細胞；EPISERF(登録商標)培地；OptiPro(商標)SFM；VP-SFM；VP-SFM AGT（商標）（全てInvitrogenより市販）が、本発明の過程における細胞用培地として用いられてよい。本発明で用いられる動物性産物を含まない細胞用培地は、自家製の培地であってもよい。
パッケージング細胞の培養物を用意する工程ａ）は当業者に公知である。

パッケージング細胞が不死化細胞株である場合、前記不死化細胞株は適切な培地中で培養される。この方法は、表面に接着しての増殖、（微小）担体の存在下または非存在下での懸濁液中の増殖、またはそれらの組み合わせを含んでなってよい。培養は、例えばディッシュ、ローラーボトル、またはバイオリアクター内で、バッチ、フェドバッチ、連続系、ホローファイバーなどを用いて行うことができる。細胞培養を通してウイルスを大量製造するために、当該技術分野では、細胞を（微小）担体の存在下または非存在下で懸濁液中にて増殖可能にすることが好ましく、かつ動物性産物を含まない培地中にて培養可能にすることが好ましい。本発明で使用される細胞用培地は、好ましくは動物性産物を含まない。前述のように、動物性産物を含まない多くの培地について既に記載されており、それらのうちの幾つかは市販されている。

パッケージング細胞がＣＥＦである場合、前記ＣＥＦは特定病原体除去（Specific Pathogen Free：ＳＰＦ）卵から好ましく抽出される。ＳＰＦ卵は、例えばCharles River Laboratories（ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国）から市販されている。前記卵は、好ましくは９日齢を超え、より好ましくは１０ないし１４日齢、さらに好ましくは１２日齢である。胚抽出に先立ち、卵は好ましく消毒される。卵を消毒するための多くの方法および製品が、先行技術から入手できる。ホルモル溶液中でのインキュベーション（例えば２％ホルモル、１分）に続く、７０％エタノールによる洗浄が特に好ましい。次に胚の細胞を分離して純化する。本発明の好ましい実施形態によれば、胚の細胞は、細胞間基質を破壊するための酵素による消化工程に供される。この目的のため、細胞間基質を消化できる酵素の使用が特に有用である。本発明による好ましい酵素には、トリプシン、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびノイラミニダーゼが含まれるがこれらに限定されない。本発明による、ＣＥＦを調製するために用いられる酵素は、好ましくは組み換え由来である。酵素は単独、または組み合わせて使用できる。本発明の好ましい実施形態によれば、ディスパーゼとトリプシン（例えば、Gibco（商標）のTrypLE select）の組み合わせが用いられる。当業者は、細胞を効率的に分離するための酵素濃度、温度、およびインキュベーションの長さを決定することができる。ＣＥＦ培養の用意には、混入物を除去するための濾過工程および／または遠心分離工程をさらに含むことができる。本発明によれば、得られた初代ＣＥＦは、直接使用できるかまたは１回のさらなる細胞継代後の二次的なＣＥＦとして使用できる。ＣＥＦ（すなわち初代または二次的な）は、次に適切な細胞用培地中で培養される。本発明で用いられる細胞用培地は、好ましくは動物性産物を含まない。前述のように、動物性産物を含まない多くの培地について既に記載されており、それらのうちの幾つかは市販されている。本発明によれば、ＣＥＦはＶＰ−ＳＦＭ細胞用培地（Invitrogen）中で好ましく培養される。感染に先立ち、ＣＥＦは好ましくは１ないし５日間、より好ましくは１ないし２日間、さらに好ましくは２日間培養される。ＣＥＦは、好ましくは３０℃ないし３６．５℃の温度にて培養される。

パッケージング細胞の培養物（工程ａ）で用意される）においてオルソポックスウイルスを感染させる工程ｂ）は、当業者に公知である。本出願の全体にわたって用いられる「感染」は、ウイルス核酸の細胞への移行を指し、ここでウイルス性核酸が複製され、ウイルスタンパク質が合成されるか、または新たなウイルス粒子が集合する。当業者は、特定のウイルス製造のために最も適切なパッケージング細胞を選択することができる。好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、オルソポックスウイルス、好ましくはＭＶＡまたはＶＶの製造のために、国際公開第２００７／０７７２５６号もしくは国際公開第２００９／００４０１６号に記載される、ＣＥＦまたは不死化鳥類細胞株の使用を含んでなる。パッケージング細胞の培養物（工程ａで用意される）においてオルソポックスウイルスを感染させる工程ｂ）は、前記パッケージング細胞の培養物を用意するために（すなわち工程ａにおいて）用いられる細胞用培地と同じかまたは異なってよい適切な細胞用培地中で行われる。本発明に用いられる細胞用培地は、好ましくは動物性産物を含まない。前述のように、動物性産物を含まない多くの培地について既に記載されており、それらのうちの幾つかは市販されている。パッケージング細胞がＣＥＦの場合、ＣＥＦの培養における感染の工程ｂ）は、イーグル基礎培地（Invitrogen）中で行われる。細胞用培地１リットルあたり、好ましくは０．５ないし１．５、より好ましくは１．１ないし１．３、さらに好ましくは、約１．２胚が播種される。製造するオルソポックスウイルスがＭＶＡである特定の実施形態によれば、ＭＶＡは、好ましくは０．００１ないし０．１、より好ましくは０．０３ないし０．０７、さらに好ましくは約０．０５のＭＯＩにおいて、細胞培養容器へ播種される。製造するオルソポックスウイルスがＶＶである別の特定の実施形態によれば、ＶＶは、好ましくは０．０００１ないし０．１、より好ましくは約０．０００１のＭＯＩにおいて、細胞培養容器へ播種される。

感染させたパッケージング細胞（工程ｂ）から）を子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養する工程ｃ）は、当業者に公知である。

パッケージング細胞がＣＥＦの場合、感染させたＣＥＦを培養する工程ｃ）は、前記ＣＥＦの培養の用意に用いられる細胞用培地（すなわち工程ａ）において）と同じかまたは異なってよく、かつ前記ＣＥＦの培養におけるオルソポックスウイルスの感染に用いられる細胞用培地（すなわち工程ｂ）において）と同じかまたは異なってよい、適切な細胞用培地中で行われる。本発明に用いられる細胞用培地は、好ましくは動物性産物を含まない。前述のように、動物性産物を含まない多くの培地について既に記載されており、それらのうちの幾つかは市販されている。本発明によれば、感染させたＣＥＦの培養はイーグル基礎培地（Invitrogen）中で行われる。感染させたＣＥＦは、好ましくは１ないし６日間、より好ましくは２ないし４日間、さらに好ましくは３日間培養される。感染させたＣＥＦは、好ましくは３７℃未満、より好ましくは３０℃ないし３６．５℃の温度にて培養される。

１以上のヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）の存在下でのインキュベーションである工程ｄ）は、溶液中に存在する核酸（例えばＤＮＡ；ＲＮＡ）を分解するために行われる。本発明に好ましく用いられるヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、以下のようにそれらの基質に基づいて分類できる：ＤＮＡを分解するデオキシリボヌクレアーゼ（deoxyribonuclease：ＤＮａｓｅ）；ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼ（ribonuclease：ＲＮａｓｅ）；ならびにＤＮＡおよびＲＮＡを分解するエンドヌクレアーゼ。エンドヌクレアーゼＤＮａｓｅには、ＤＮａｓｅＩ、ＤＮａｓｅＩＩ、およびエンドデオキシリボヌクレアーゼＩＶが含まれるが、これらに限定されない。エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅには、ＲＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮＡｓｅＥ、ＲＮＡｓｅＦ、およびＲＮＡｓｅＰが含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡおよびＲＮＡを分解するエンドヌクレアーゼにはBenzonase（登録商標）が含まれるが、これに限定されない。本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｃ）で製造されたオルソポックスウイルスをインキュベートする工程ｄ）は、Benzonase（登録商標）の存在下で行われる。Benzonase（登録商標）は、特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合を加水分解することによって、核酸（例えばＤＮＡ；ＲＮＡ）を分解する。消化の完了により、溶液中に存在する全ての遊離核酸（例えばＤＮＡ；ＲＮＡ）は、長さが３ないし８塩基の５’−１リン酸末端オリゴヌクレオチドに短縮される。Benzonase（登録商標）は、タンパク質分解活性を持たない。本発明で用いられるBenzonase（登録商標）は、好ましくは薬剤的に許容される。薬剤的に許容されるBenzonase（登録商標）は市販されている（EurogentecのME-0280-10を参照；Merckの、例えば1.01653.0001を参照）。

本発明による、単数または複数のヌクレアーゼの作用の好ましい条件は：
−７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５、より好ましくは８．０のｐＨ；
−１ないし２ｍＭの範囲、好ましくは２ｍＭである、Ｍｇ^２＋およびＭｎ^２＋、好ましくはＭｇ^２＋から選択される補助因子の濃度である（実施例１に記載される）。

本発明の好ましい実施形態によれば、ヌクレアーゼは、２２℃ないし２８℃の温度、好ましくは２３℃ないし２７℃の温度、より好ましくは２４℃ないし２６℃の温度、さらに好ましくは２５℃の温度にてインキュベートされる（実施例１に記載される）。この実施形態によれば、工程ｄ）の持続時間は、好ましくは１ないし５時間、より好ましくは２時間である（実施例１に記載される）。

本発明の好ましい別の実施形態によれば、ヌクレアーゼは、２℃ないし８℃の温度、好ましくは３℃ないし７℃の温度、より好ましくは４℃ないし６℃の温度、さらに好ましくは５℃の温度にてインキュベートされる。この別の実施形態によれば、工程ｄ）の持続時間は、好ましくは１０ないし２０時間、より好ましくは１８時間である。

本発明によれば、工程ｄ）で用いられる単数または複数のヌクレアーゼの濃度は、５ないし１００Ｕ／ｍｌの範囲、好ましくは５ないし５０Ｕ／ｍｌの範囲、より好ましくは１０Ｕ／ｍｌである。図１に示すように、５０Ｕ／ｍｌ Benzonase（登録商標）の使用に比較すると、同条件下での１０Ｕ／ｍｌ Benzonase（登録商標）の使用により、２時間の処理後（温度２５℃；２ｍＭ Ｍｇ^２＋；ｐＨ８）、驚くべきことにＤＮＡ濃度は同等に減少する。

本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｄ）は、１以上の界面活性剤の添加をさらに含んでなる。界面活性剤には、Tween、Triton X-100（モノエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、サポニン、SDS、Brij 96、ポリドカノール、Ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、および炭酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。工程ｄ）で用いられる好ましい界面活性剤はTweenである。Tweenには、Tween 20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、Tween 80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、およびTween 85（ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート）が含まれるが、これらに限定されない。工程ｄ）で用いられる好ましいTweenはTween 80である。本発明によれば、工程ｄ）で用いられる単数または複数の界面活性剤の濃度は、１０ないし１００μｇ／Ｌの範囲、好ましくは１０ないし５５μｇ／Ｌの範囲である。

製造され、単数または複数のヌクレアーゼによって予め処理されたオルソポックスウイルスを、次に培養上清および／またはパッケージング細胞から回収する。

オルソポックスウイルスをパッケージング細胞から回収する際（すなわちパッケージング細胞のみから、またはパッケージング細胞および上清から）、工程ｅ）に先立ち、パッケージング細胞膜を破壊する工程があってよい。この工程において、パッケージング細胞からのオルソポックスウイルスの遊離が導かれる。パッケージング細胞膜の破壊は、当業者に公知の様々な技術によって誘導できる。これらの技術は、凍結／融解、低浸透圧性溶解、超音波処理（ソニケーターの使用による）、および顕微溶液化（マイクロフルイダイザーの使用による）を含んでなるが、これらに限定されない。ソニケーターは、例えばHeraeus PSP、Biologies、Misonix、またはGlenMillsから市販されている。本発明に用いられる好ましいソニケーターは、SONITUBE 20 kHz型SM 20-120-3、SONITUBE 36 kHz型SM 35/3WU、およびSONITUBE 35 kHz型SM 35-400-3（Heraeus PSP）である。マイクロフルイダイザーは、例えばMicrofluidics Corporationから市販されている。パッケージング細胞膜は、SLM Amincoフレンチプレスを用いてもまた破壊できる。パッケージング細胞膜は、高速ホモジナイザーを用いてもまた破壊できる。高速ホモジナイザーは、例えばSilverson Machines、またはIka-Labotechnikから市販されている。本発明に用いられる好ましい高速ホモジナイザーはSILVERSON L4R（Silverson Machines）である。パッケージング細胞膜の破壊後に得られる混合物は、パッケージング細胞から放出された核酸（例えばＤＮＡ）の、予め添加された（工程ｄ）において）単数または複数のヌクレアーゼによる分解を可能にするため、攪拌しながら少なくとも１時間、さらにインキュベートすることができる。従って本発明の特定の実施形態によれば、工程ｅ）の前に、
１．好ましくは高速ホモジナイザーを用いてまたは超音波処理によって、パッケージング細胞膜を破壊し、
２．工程１）で得られる混合物を少なくとも１時間インキュベートし、工程ｄ）において添加された単数または複数のヌクレアーゼにより、パッケージング細胞から放出された核酸（例えばＤＮＡ）を分解する。

本発明によれば、工程２）の持続時間は、好ましくは１ないし５時間、より好ましくは２時間である（実施例１に記載される）。

本発明によれば、単数または複数のヌクレアーゼ（工程ｄ）において予め添加された）は、工程２）の間に、２２℃ないし２８℃の温度、好ましくは２３℃ないし２７℃の温度、より好ましくは２４℃ないし２６℃の温度、さらに好ましくは２５℃の温度にてインキュベートされる（実施例１に記載される）。

工程ｅ）で回収されたオルソポックスウイルスに一価の塩を添加する工程ｆ）は、適切な条件下で：
−単数または複数のヌクレアーゼ活性を阻害すること；および
−工程ｇ）においてオルソポックスウイルスの陰イオン交換吸着剤への吸着を避けること、すなわち、１０％を超えるオルソポックスウイルスの陰イオン交換吸着剤への吸着を避けることを可能にする。従って、工程ｇ）では核酸（例えばＤＮＡ）のみが陰イオン交換吸着剤へ吸着され得る。

一価の塩にはＮａＣｌおよびＫＣｌが含まれるが、これらに限定されない。工程ｆ）で用いられる好ましい一価の塩はＮａＣｌである。本発明によれば、工程ｆ）における一価の塩の濃度は、２００ないし３００ｍＭ、好ましくは２５０ｍＭまたは３００ｍＭの範囲である。本発明によれば、工程ｆ）は７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる。本発明によれば、工程ｅ）で回収されたオルソポックスウイルスに一価の塩を添加する工程ｆ）は、２５０ｍＭ、好ましくは３００ｍＭのＮａＣｌがｐＨ８．０において用いられる、実施例１に記載される条件によって好ましく行われる。

工程ｆ）で得られた混合物を適切な条件下で陰イオン交換吸着剤と接触させる工程ｇ）では、前記混合物に含まれる核酸（例えばＤＮＡ）の捕捉が可能になる。工程ｆ）で行った処理のため、オルソポックスウイルスは陰イオン交換吸着剤に捕捉されない。

本発明によれば、工程ｇ）は７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる（実施例１に記載される）。

本発明によれば、工程ｇ）の持続時間は、好ましくは１ないし３時間、より好ましくは１時間である（実施例１に記載される）。

本発明によれば、工程ｇ）で用いられる陰イオン交換吸着剤の官能基は、一級、二級、三級、および四級アミノ基、例えばジメチルアミノエチル（dimethylaminoethyl：ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（diethylaminoethyl：ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）、トリエチルアミノエチル（triethylaminoethyl：ＴＥＡＥ）、−Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−Ｎ＋−（ＣＨ_３）_３基（Ｑ基とも名付けられる；Streamline（登録商標）樹脂、Pharmaciaを参照）、およびその他の基、例えば形式正電荷を既に有するか、または７．０ないし９．０のｐＨ範囲内で有し得るポリエチレンイミン（polyethyleneimine：ＰＥＩ）である。工程ｇ）で用いられる好ましい陰イオン交換吸着剤の官能基は、ジメチルアミノエチル（dimethylaminoethyl：ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（diethylaminoethyl：ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）、およびトリエチルアミノエチル（triethylaminoethyl：ＴＥＡＥ）からなる群から選択され、より好ましくはトリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）である。

工程ｇ）で用いられる陰イオン交換吸着剤は、例えばビーズ型基質または膜に存在してよい。

本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｇ）で用いられる陰イオン交換吸着剤はビーズ型基質に存在する。基質は例えば、アガロース、親水性ポリマー、セルロース、デキストラン、シリカであってよい。鎖（例えばデキストラン鎖）が基質に結合される。上述の官能基は、化学的に安定な結合（例えばエーテル結合）を通して鎖に結合する。ビーズ型基質の好ましい官能基は、トリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）である。本発明によれば、ビーズ型基質のビーズの直径は、清澄化工程ｈ）で用いられるフィルターの孔径よりも大きい。従ってビーズ型基質のビーズの直径は、好ましくは８μｍよりも大きく、より好ましくは５０μｍないし１５０μｍの直径、さらに好ましくは９０μｍないし１２０μｍの直径、さらに一層好ましくは１２０μｍの直径である。本発明の特性に基づき、工程ｈ）での清澄化の間に、オルソポックスウイルス（直径２００〜３００ｎｍ）はフィルターの孔径を通過するであろう（すなわち、オルソポックスウイルスは通過画分中に回収されるであろう）。本発明に用いられるビーズ型基質の陰イオン交換吸着剤は、好ましくはオートクレーブ可能である。オートクレーブ可能なビーズ型基質の陰イオン交換吸着剤については、既に記載されており、それらのうちの幾つかは、例えばUNOsphere（登録商標）Q (BioRad)、UNOsphere（登録商標）S (BioRad)、STREAMLINE（商標）Q Sepharose（登録商標）XL (Amersham Biosciences)、STREAMLINE（商標）SP Sepharose（登録商標）XL (Amersham Biosciences)、またはBioSepra（登録商標）Q hyperZ (Pall Corporation)として市販されている。本発明による、好ましいオートクレーブ可能なビーズ型基質の陰イオン交換吸着剤は、UNOsphere（登録商標）Q (BioRad)である。UNOsphere（登録商標）Q (BioRad)は、直径１２０μｍで、トリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）官能基を有する親水性球状高分子ビーズである。工程ｆ）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを接触させる工程ｇ）は、陰イオン交換吸着剤がビーズ型基質にある前記交換吸着剤を用いて、実施例１に記載の条件により好ましく行われ、ここではUNOsphere（登録商標）Q (BioRad)が用いられる。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、工程ｇ）で用いられる陰イオン交換吸着剤は膜に存在する。膜の官能基は以前に記載した通りであってよい。好ましい膜の官能基はトリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）である。本発明によれば、膜の孔径はオルソポックスウイルスの直径（すなわち２００ｎｍ）よりも大きい。従って、オルソポックスウイルスは通過画分中に回収されるであろう。この点から、本発明によれば膜の孔径は１ないし５μｍであり、好ましくは３μｍの孔径である。本発明による膜の陰イオン交換吸着剤は、好ましくはオートクレーブ可能である。オートクレーブ可能な膜の陰イオン交換吸着剤については、既に記載されており、それらのうちの幾つかは、例えばSartobind（登録商標）75 Q (Sartorius)、CUNO PolyNet（商標）フィルター (例えばPolyNet（商標）PB P010、P020、P030、P050) または CUNO Betapure（商標）フィルター (例えばBetapure（商標）Z13-020、Z13-030、Z13-050)として市販されている。本発明による、好ましいオートクレーブ可能な膜の陰イオン交換吸着剤は、Sartobind（登録商標）75 Q (Sartorius)である。

膜である陰イオン交換吸着剤を用いて工程ｇ）を行う際、それに続く清澄化の工程ｈ）（細胞片の除去を可能にする）は必要ではない。細胞片は、１ないし５μｍの孔径、好ましくは３μｍの孔径を有する膜によって保持される。

工程ｇ）で得られた混合物を清澄化する工程ｈ）により、適切な条件下での細胞片の除去が可能になる。本発明によれば、工程ｈ）での清澄化は深層濾過により好ましく行われる。深層濾過には、１以上の市販の製品、例えばSartoriusから市販されているSartopure（登録商標）フィルター(例えばSartopure（登録商標）PP2)、CUNO Incorporated APシリーズの深層フィルター(例えばAP01)、CUNO Incorporated CPシリーズの深層フィルター(例えばCP10, CP30, CP50, CP60, CP70, CP90)、CUNO Incorporated HPシリーズの深層フィルター(例えばHP10, HP30, HP50, HP60, HP70, HP90)、CUNO Incorporated Calif.シリーズの深層フィルター(例えばCA10, CA30, CA50, CA60, CA70, CA90)、CUNO Incorporated SPシリーズの深層フィルター(例えばSP10, SP30, SP50, SP60, SP70, SP90)、CUNO DelipidおよびDelipid Plusフィルター、Millipore Corporation CEシリーズの深層フィルター(例えばCE15, CE20, CE25, CE30, CE35, CE40, CE45, CE50, CE70, CE75)、Millipore Corporation DEシリーズの深層フィルター(例えばDE25, DE30, DE35, DE40, DE45, DE50, DE55, DE560, DE65, DE70, DE75)、Millipore Corporation HCフィルター(例えばA1HC, B1HC, COHC)、CUNO PolyNet（商標）フィルター(例えばPolyNet（商標）PB P050, P100, P200, P300, P400, P500, P700)、Millipore ClarigardおよびPolygardフィルター、CUNO Life Assureフィルター、ManCel Associates深層フィルター(例えばPR 12 UP, PR12, PR 5 UP);およびPALLまたはSeitzSchenk Incorporatedフィルターの使用が含まれるが、これらに限定されない。利用可能な深層フィルターユニットの清澄化能を改善するためには、孔径が小さくなる２以上のユニットを組み合わせると役立ち得る。この実施形態によれば、清澄化される混合物は、第１の深層フィルターユニットを通過してより大きな混入物を保持し、続いて第２の深層フィルターユニットを通過する。この点から、本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｈ）の清澄化は深層濾過により、好ましくは孔径８μｍのフィルターと孔径５μｍのフィルターを組み合わせて行われる。本発明で用いられる、孔径８μｍおよび５μｍの好ましいフィルターは、Sartoriusから市販されているSartopure（登録商標）フィルター（Sartopure（登録商標）PP2）である。深層濾過は、少なくとも１Ｌ／分の流速、好ましくは１Ｌ／分の流速で行われ得る。本発明によれば、工程ｈ）は７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ、好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる。工程ｇ）で得られた混合物を清澄化する工程ｈ）は、実施例１に記載される条件により好ましく行われ、ここで清澄化は、孔径８μｍのフィルターと孔径５μｍのフィルターを組み合わせた深層濾過により、流速１Ｌ／分で行われる。

工程ｈ）での清澄化の間に、オルソポックスウイルス（直径２００〜３００ｎｍ）はフィルターの孔径を通過する。従って、オルソポックスウイルスは通過画分中に回収される。

陰イオン交換吸着剤を一価の塩を含んでなる溶液で洗浄する工程ｉ）により、残存するオルソポックスウイルスの適切な条件下での通過画分中への回収が可能になる。使用される一価の塩にはＮａＣｌおよびＫＣｌが含まれるが、これらに限定されない。工程ｉ）で用いられる好ましい一価の塩はＮａＣｌである。本発明によれば、工程ｉ）で用いられる一価の塩の濃度は２００ないし３００ｍＭの範囲、好ましくは２５０ｍＭまたは３００ｍＭである。本発明によれば、工程ｉ）は７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる。本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｉ）で用いられる一価の塩を含んでなる溶液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ グルタミン酸ナトリウム、および生理的なモル浸透圧濃度（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（すなわちＳＯ８緩衝液）を含んでなる、薬剤的に許容される溶液である。本発明のその他の好ましい実施形態によれば、工程ｉ）で用いられる一価の塩を含んでなる溶液は、例えばＴｒｉｓ緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、またはリン酸緩衝液を含んでなる、薬剤的に許容される溶液である。陰イオン交換吸着剤を一価の塩を含んでなる溶液で洗浄する工程ｉ）は、好ましくは実施例１に記載される条件に従って行われ、ここで洗浄は２５０ｍＭ、好ましくは３００ｍＭのＮａＣｌを含んでなる、薬剤的に許容されるＳＯ８緩衝液により行われる。

工程ｈ）で得られた通過画分と工程ｉ）で得られた通過画分を濃縮する工程ｊ）により、前記通過画分に存在するタンパク質の除去が可能になる。

本発明の好ましい実施形態によれば、濃縮工程ｊ）は精密濾過により行われる。精密濾過は、大分子を濃縮及び精製する、圧力駆動の膜による処理である。さらに詳細には、溶液は、濃縮水中のオルソポックスウイルスを除外するが小分子（例えばタンパク質）は透過水中へとフィルターを通過するように選択された孔径のフィルターを通過する。精密濾過によって、濃縮溶液の容量は減少する。この点から、精密濾過は、０．２μｍ未満の孔径、好ましくは０．０９ないし０．１５μｍの孔径、より好ましくは０．１μｍの孔径を有するフィルターを用いて行われる。本発明で用いられるフィルターは、好ましくはオートクレーブ可能である。工程ｊ）で用いられるオートクレーブ可能なフィルターは例えば、Prostak Microfiltration Modules (Millipore)のように市販されており、なかでもProstak Microfiltration Module PSVVAG021、PSVVAG041、およびSK2P12E1が好ましい。工程ｈ）で得られた通過画分と工程ｉ）で得られた通過画分を濃縮する工程ｊ）は、好ましくは実施例１に記載される条件に従って行われ、ここで濃縮は０．１μｍの孔径を有するフィルターを用いる精密濾過によって行われる。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、濃縮工程ｊ）は限外濾過によって行われる。本発明による限外濾過は、好ましくはクロスフロー濾過である。クロスフロー濾過の原理は当業者に公知である（例えば、Richards, G. P. and Goldmintz, D., J. Virol. Methods (1982), 4 (3), pages 147-153. "Evaluation of a cross-flow filtration technique for extraction of polioviruses from inoculated oyster tissue homogenates"を参照）。

工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分（例えば濃縮工程ｋ）を精密濾過または限外濾過によって行った際の濃縮水）を透析濾過する工程ｋ）は精密濾過の改善であり、オルソポックスウイルスを含んでなる前期画分を、前期画分中の不純物の濃度を減少させる効果のある溶液によって希釈することに関する。オルソポックスウイルスを含んでなる画分の希釈により、前記画分からさらに不純物を洗い流すことが可能になる。透析濾過は、バッチモード、半連続モード、または連続モードで実行され得ることが理解される。透析濾過工程ｋ）は、オルソポックスウイルスが含まれる緩衝液の交換に都合よく用いることができる。例えば、精製過程で用いた緩衝液を薬剤的に許容される緩衝液と交換するために有用となり得る。本発明によれば、精密濾過は、０．２μｍ未満の孔径、好ましくは０．０９ないし０．１５μｍの孔径、より好ましくは０．１μｍの孔径を有するフィルターを用いて行われる。本発明で用いられるフィルターは、好ましくはオートクレーブ可能である。工程ｋ）で用いられるオートクレーブ可能なフィルターは例えば、Prostak Microfiltration Modules (Millipore)のように市販されており、なかでもProstak Microfiltration Module PSVVAG021、PSVVAG041、およびSK2P12E1が好ましい。工程ｊ）で得られた通過画分を透析濾過する工程ｋ）は、好ましくは実施例１に記載される条件に従って行われ、ここで透析濾過は０．１μｍの孔径を有するフィルターを用いて行われる。

工程ｊ）の濃縮と工程ｋ）の透析濾過は、同じ型のフィルターを用いて都合よく行うことができる。

本発明の方法Ａは：
１．ゲル濾過工程（すなわち工程ｌ））；および
２．透析濾過工程（すなわち工程ｍ））をさらに含んでいてよい。

ゲル濾過工程（すなわち工程ｌ）：本発明によれば、工程ｋ）で得られたサンプルは、３ないし１６０μｍ、好都合には８０ないし１６０μｍ、好ましくは４０ないし１０５μｍ、より好ましくは２５ないし７５μｍ、さらに好ましくは２０ないし８０μｍ、さらに一層好ましくは２０ないし６０μｍの直径を有するビーズを含んでなる固体支持体において処理される。本発明によれば、前記支持体は、オルソポックスウイルスがビーズ内へ入らないように、オルソポックスウイルスの直径（すなわち２００〜３００ｎｍ）に対して閉ざされた多孔度を有する。一方で、より小さなサイズの分子はビーズ内へ入り、その移動は遅くなる。

ゲル濾過工程ｌ）で用いられる支持体は、例えばアガロース、デキストラン、アクリルアミド、シリカ、エチレングリコール／メタクリル酸塩共重合体、またはそれらの混合物、例えばアガロースとデキストランの混合物を基礎とすることができる。本発明によれば、支持体は官能基なしで好ましく用いられる。ゲル濾過クロマトグラフィー支持体は、例えば:
・エチレングリコール／メタクリル酸塩ゲル濾過クロマトグラフィー支持体（例えば、２０ないし６０μｍのビーズ直径を有するToyopearl（登録商標）HW 55、Toyopearl（登録商標）HW 65、およびToyopearl（登録商標）HW 75、Tosohaas）；
・アリルデキストラン／メチレンビスアクリルアミドゲル濾過クロマトグラフィー支持体（例えば、２５ないし７５μｍのビーズ直径を有するSephacryl（商標）S300 HR；２５ないし７５μｍのビーズ直径を有するSephacryl（商標）S400 HR；２５ないし７５μｍのビーズ直径を有するSephacryl（商標）S500 HR；４０ないし１０５μｍのビーズ直径を有するSephacryl（商標）S1000 SF、全てPharmaciaから市販される)；
・Ｎ−アクリルアミノヒドロキシプロパンジオールゲル濾過クロマトグラフィー支持体（例えば、８０ないし１６０μｍのビーズ直径を有するTrisacryl、Biosepra）；
・アガロースゲル濾過クロマトグラフィー支持体（例えば、２０ないし８０μｍのビーズ直径を有するMacro-Prep SE、Bio-Rad）
として市販される。

エチレングリコール／メタクリル酸塩ゲル濾過クロマトグラフィー支持体（例えば、２０ないし６０μｍのビーズ直径を有するToyopearl（登録商標）HW 55、Toyopearl（登録商標）HW 65、およびToyopearl（登録商標）HW 75、Tosohaas）が好ましい。

本発明のゲル濾過工程ｌ）に好ましい条件は：
−２００ｍＭないし２Ｍの範囲、好ましくは２００ｍＭないし１Ｍの範囲、より好ましくは５００ｍＭである、ＮａＣｌおよびＫＣｌから選択され、好ましくはＮａＣｌである一価の塩の濃度；
−７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５、より好ましくは８．０のｐＨである。

透析濾過工程ｍ）は、透析濾過工程ｋ）で以前に記載した方法および条件によって行われる。

本発明によれば、以前に記載した方法Ａの工程ｆ）から工程ｌ）の各工程の前に、１以上の安定剤の存在下で、オルソポックスウイルスを含んでなるサンプルをインキュベートする工程があってよい。本明細書で用いられる「安定剤」は、オルソポックスウイルスの保存を可能にする薬剤を指す。安定剤には、糖類（例えば、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタキオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトール、グリセロール）、アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ；Ｌｅｕ；Ｌｙｓ；Ａｒｇ；Ａｓｐ；Ｖａｌ；Ｇｌｕ）、界面活性剤（例えば、Triton X-100; Tween、例えばTween 20、Tween 80、またはTween 85）および塩（例えばＮａＣｌ；ＫＣｌ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態によれば、このインキュベーション工程で用いられる安定剤は糖類、好ましくはサッカロースである。本発明によれば、このインキュベーション工程で用いられるサッカロースの濃度は２５ないし１００ｇ／Ｌの範囲、好ましくは５０ｇ／Ｌである。本発明によれば、単数または複数の安定剤は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ グルタミン酸ナトリウム、および生理的なモル浸透圧濃度（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（すなわちＳＯ８緩衝液）を含んでなる、薬剤的に許容される溶液からなる溶液に含まれてよい。本発明によれば、単数または複数の安定剤は、例えばＴｒｉｓ緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、またはリン酸緩衝液を含んでなる、薬剤的に許容される溶液からなる溶液に含まれてよい。本発明によれば、安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程は、７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる。本発明によれば、安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程の持続時間は、１ないし２０時間、好ましくは１８時間である。本発明によれば、安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程は、２℃ないし８℃の温度、好ましくは３℃ないし７℃の温度、より好ましくは４℃ないし６℃の温度、より好ましくは５℃の温度において行われる。安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程は、実施例１に記載するように、５０ｇ／Ｌサッカロースの存在下で、１８時間、５℃の温度において好ましく行われる。

本発明の方法Ａの別の実施形態によれば、以前に記載したように、清澄化工程（工程ｈ））は、オルソポックスウイルスを培養上清および／またはパッケージング細胞から回収する工程ｅ）の後で行われる。

本発明の別の実施形態によれば、単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害するため、および工程ｅ）で回収されたオルソポックスウイルスが工程ｇ）において陰イオン交換吸着剤へ吸着することを避けるために、前記オルソポックスウイルスに適切な条件下で一価の塩を添加する工程ｆ）は行われない。

この点から、本発明は、野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造および精製する方法（すなわち方法Ｂ）にも関し、この方法は以下の工程を含んでなる：
ａ’）パッケージング細胞の培養物を用意すること；
ｂ’）培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させること；
ｃ’）感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養すること；
ｄ’）１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートすること；
ｅ’）培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収すること；
ｆ’）工程ｅ’）で回収されたオルソポックスウイルスを、
１．単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害できる１以上の薬剤、および所望により
２．１以上の安定剤
の存在下でインキュベートすること；
ｇ’）オルソポックスウイルスおよび核酸の捕捉を可能にするため、工程ｆ’）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを適切な条件下で接触させること；
ｈ’）細胞片の除去を可能にするため、工程ｇ’）で得られた混合物を適切な条件下で清澄化すること；
ｉ’）オルソポックスウイルスを、一価の塩を含んでなる溶液により溶出すること；
ｊ’）工程ｉ’）で得られた混合物を濃縮すること；
ｋ’）工程ｊ’）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過すること。

パッケージング細胞の培養物を用意する工程ａ’）については、以前に記載したパッケージング細胞の培養物を用意する工程ａ）を参照されたい。

培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させる工程ｂ’）については、以前に記載した培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させる工程ｂ）を参照されたい。

感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養する工程ｃ’）については、以前に記載した感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養する工程ｃ）を参照されたい。

１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートする工程ｄ’）については、以前に記載した１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートする工程ｄ）を参照されたい。

培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収する工程ｅ’）については、以前に記載した培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収する工程ｅ）を参照されたい。

工程ｅ’）で回収されたオルソポックスウイルスを次に、
１．単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害できる１以上の薬剤、および所望により
２．１以上の安定剤の存在下でインキュベートする（工程ｆ’））。

ヌクレアーゼ活性を阻害できる薬剤には、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸塩（ethylenediamine tetraacetate：ＥＤＴＡ）；ジエチレントリアミン五酢酸塩（diethylenetriamine pentaacetate：ＤＴＰＡ）；ニトリロ三酢酸塩（nitrilotriacetic acid：ＮＴＡ））、一価の塩（例えばＮａＣｌまたはＫＣｌ）、プロテアーゼ、リン酸塩、一価の陽イオン（例えば、Ｎａ^＋；Ｌｉ^＋；Ｋ^＋；Ａｇ^＋）、塩酸グアニジン、および硫酸アンモニウムが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、またはＮＴＡのようなキレート剤は、以前に記載したように、単数または複数のヌクレアーゼ活性に必須の補助因子を構成する金属イオン（例えば、Ｍｇ^２＋；Ｍｎ^２＋）を除去する。一価の塩（例えばＮａＣｌまたはＫＣｌ）は、５０ないし１５０ｍＭ、好ましくは約１００ｍＭの濃度でヌクレアーゼを不活性化する。リン酸塩および／または一価の陽イオン（例えば、Ｎａ^＋；Ｌｉ^＋；Ｋ^＋；Ａｇ^＋）は、約１００ｍＭ、または１００ｍＭを超える濃度でヌクレアーゼを不活性化する。塩酸グアニジンおよび硫酸アンモニウムは、１００ｍＭを超える濃度でヌクレアーゼを不活性化する。本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｆ’）においてヌクレアーゼ活性を阻害できる薬剤はキレート剤であり、より好ましくはエチレンジアミン四酢酸塩（ethylenediamine tetraacetate：ＥＤＴＡ）である。本発明によれば、工程ｆ’）で用いられるＥＤＴＡの濃度は５ないし２０ｍＭの範囲、好ましくは１０ｍＭである。本発明の別の好ましい実施形態によれば、工程ｆ’）においてヌクレアーゼ活性を阻害できる薬剤は一価の塩、好ましくはＮａＣｌ、より好ましくは１００ｍＭのＮａＣｌである。本発明の別の好ましい実施形態によれば、工程ｆ’）においてヌクレアーゼ活性を阻害できる薬剤は一価の塩およびキレート剤、好ましくはＮａＣｌおよびＥＤＴＡ、より好ましくは１００ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＥＤＴＡである（実施例４に記載される）。

本発明によれば、工程ｆ’）は７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる（実施例４に記載される）。

本発明によれば、工程ｆ’）は、２℃ないし８℃の温度、好ましくは３℃ないし７℃の温度、より好ましくは４℃ないし６℃の温度、さらに好ましくは５℃の温度において行われる。本発明によれば、工程ｆ’）の持続時間は５分ないし２０時間である。好ましくは１ないし３時間、より好ましくは１時間である。本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｆ’）の持続時間は２ないし２０時間、好ましくは１８時間である。この実施形態によれば、工程ｅ’）で得られたオルソポックスウイルスは、単数または複数のヌクレアーゼ活性を阻害できる１以上の薬剤に加え、１以上の安定剤の存在下でもインキュベートされる（以前に記載される）。工程ｆ’）における安定剤とは、前記工程ｆ’）において単数または複数のヌクレアーゼ活性を阻害できる単数または複数の薬剤による処理の間に、オルソポックスウイルスの保存を可能にする薬剤を指す。安定剤には、糖類（例えば、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタキオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトール、グリセロール）、アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ；Ｌｅｕ；Ｌｙｓ；Ａｒｇ；Ａｓｐ；Ｖａｌ；Ｇｌｕ）、界面活性剤（例えば、Triton X-100; Tween、例えばTween 20、Tween 80、またはTween 85）および塩（例えばＮａＣｌ；ＫＣｌ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｆ’）で用いられる安定剤は糖類、好ましくはサッカロースである。本発明によれば、工程ｆ’）で用いられるサッカロースの濃度は２５ないし１００ｇ／Ｌの範囲、好ましくは５０ｇ／Ｌである。本発明によれば、単数または複数の安定剤は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ グルタミン酸ナトリウム、および生理的なモル浸透圧濃度（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（すなわちＳＯ８緩衝液）を含んでなる、薬剤的に許容される溶液からなる溶液に含まれてよい。本発明によれば、単数または複数の安定剤は、例えばＴｒｉｓ緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、またはリン酸緩衝液を含んでなる、薬剤的に許容される溶液からなる溶液に含まれてよい。

工程ｆ’）で得られた混合物を適切な条件下で陰イオン交換吸着剤と接触させる工程ｇ’）では、前記オルソポックスウイルスおよび前記混合物に含まれる核酸（例えばＤＮＡ）の捕捉が可能になる。

本発明によれば、工程ｇ’）は７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる（実施例４に記載される）。

本発明によれば、工程ｇ’）の持続時間は、好ましくは１ないし３時間、より好ましくは１時間である（実施例４に記載される）。

本発明によれば、工程ｇ’）で用いられる陰イオン交換吸着剤の官能基は、一級、二級、三級、および四級アミノ基、例えばジメチルアミノエチル（dimethylaminoethyl：ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（diethylaminoethyl：ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）、トリエチルアミノエチル（triethylaminoethyl：ＴＥＡＥ）、−Ｒ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−Ｎ＋−（ＣＨ_３）_３基（Ｑ基とも名付けられる；Streamline（登録商標）樹脂、Pharmaciaを参照）、およびその他の基、例えば形式正電荷を既に有するか、または７．０ないし９．０のｐＨ範囲内で有し得るポリエチレンイミン（polyethyleneimine：ＰＥＩ）である。工程ｇ’）で用いられる好ましい陰イオン交換吸着剤の官能基は、ジメチルアミノエチル（dimethylaminoethyl：ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（diethylaminoethyl：ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）、およびトリエチルアミノエチル（triethylaminoethyl：ＴＥＡＥ）からなる群から選択され、より好ましくはトリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）である。

工程ｇ’）で用いられる陰イオン交換吸着剤は、例えばビーズ型基質または膜に存在してよい。

本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｇ’）で用いられる陰イオン交換吸着剤はビーズ型基質に存在する。基質は例えば、アガロース、親水性ポリマー、セルロース、デキストラン、シリカであってよい。鎖（例えばデキストラン鎖）が基質に結合される。上述の官能基は、化学的に安定な結合（例えばエーテル結合）を通して鎖に結合する。ビーズ型基質の好ましい官能基は、トリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）である。本発明によれば、ビーズ型基質のビーズの直径は、工程ｈ’）での清澄化に用いられるフィルターの孔径よりも大きい。従ってビーズ型基質のビーズの直径は、好ましくは８μｍよりも大きく、より好ましくは５０μｍないし１５０μｍの直径、さらに好ましくは９０μｍないし１２０μｍの直径、さらに一層好ましくは１２０μｍの直径である。本発明の特性に基づき、オルソポックスウイルスを有するビーズ型基質のビーズおよび細胞片は、工程ｈ’）での清澄化の間にフィルターによって保持され得る。本発明に用いられるビーズ型基質の陰イオン交換吸着剤は、好ましくはオートクレーブ可能である。オートクレーブ可能なビーズ型基質の陰イオン交換吸着剤については、既に記載されており、それらのうちの幾つかは、例えばUNOsphere（登録商標）Q (BioRad)、UNOsphere（登録商標）S (BioRad)、STREAMLINE（商標）Q Sepharose（登録商標）XL (Amersham Biosciences)、STREAMLINE（商標）SP Sepharose（登録商標）XL (Amersham Biosciences)、またはBioSepra（登録商標）Q hyperZ (Pall Corporation)として市販されている。本発明による、好ましいオートクレーブ可能なビーズ型基質の陰イオン交換吸着剤は、UNOsphere（登録商標）Q (BioRad)およびBioSepra（登録商標）Q hyperZ (Pall Corporation)である。UNOsphere（登録商標）Q (BioRad)は、直径１２０μｍで、トリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）官能基を有する親水性球状高分子ビーズである。BioSepra（登録商標）Q hyperZ (Pa
ll Corporation)は、直径約７５μｍで四級アミンＱ官能基を有する、高密度で多孔性のジルコニウムジオキシドビーズである。工程ｆ’）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを接触させる工程ｇ’）は、陰イオン交換吸着剤がビーズ型基質にある前記交換吸着剤を用いて、実施例４に記載の条件により好ましく行われ、ここではBioSepra（登録商標）Q hyperZ (Pall Corporation)が用いられる。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、工程ｇ’）で用いられる陰イオン交換吸着剤は膜に存在する。膜の官能基は以前に記載した通りであってよい。好ましい膜の官能基はトリメチルアミノエチル（trimethylaminoethyl：ＴＭＡＥ）である。本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｇ’）で用いられる膜の孔径は１ないし５μｍであり、好ましくは３μｍの孔径である。本発明の別の好ましい実施形態によれば、工程ｇ’）で用いられる膜の孔径はオルソポックスウイルスのサイズ（すなわち２００ｎｍ）よりも小さく、さらに詳細には０．１μｍの孔径である。膜に存在する多くの陰イオン交換吸着剤については既に記載されており、それらのうちの幾つかは、例えばSartobind（登録商標）75 Q(Sartorius)のように市販されている。本発明による膜の陰イオン交換吸着剤は、好ましくはオートクレーブ可能である。オートクレーブ可能な膜の陰イオン交換吸着剤については、既に記載されており、それらのうちの幾つかは、例えばSartobind（登録商標）75 Q (Sartorius)として市販されている。本発明による、好ましいオートクレーブ可能な膜の陰イオン交換吸着剤は、Sartobind（登録商標）75 Q (Sartorius)である。

陰イオン交換膜である陰イオン交換吸着剤を用いて工程ｇ’）を行う際、それに続く清澄化の工程ｈ’）（細胞片の除去を可能にする）は必要ではない。細胞片は、工程ｆ）で用いられる陰イオン交換膜によって保持される（以前に記載される）。

工程ｇ’）で得られた混合物を清澄化する工程ｈ’）については、以前に記載した工程ｇ）で得られた混合物を清澄化する工程ｈ）を参照されたい。

本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｇ’）をビーズ型基質である陰イオン交換吸着剤を用いて行う際、工程ｈ’）の前に、オルソポックスウイルスを有する前記ビーズ型基質の除去を可能にする工程があってよい。この点から前記の工程は、例えばビーズ型基質のビーズのサイズよりも小さな孔径を有するフィルターバッグを用いて行われる。本発明によれば、フィルターバッグの孔径は１０ないし１００μｍ、好ましくは２５ないし１００μｍ、より好ましくは５０μｍである。本発明に用いられるフィルターバッグは、好ましくはオートクレーブ可能である。オートクレーブ可能なフィルターバッグについては既に記載されており、かつそれらのうちの幾つかは市販されており、例えば、ポリエステル布フィルターバッグ（例えばNB EES 0010、0025、0050、0100）、ポリエステル／ポリプロピレン布フィルターバッグ（例えばNB PES 0010、0025、0050、0100）およびナイロン単繊維布フィルターバッグ（例えばNB NYS 0025、0050、0100）である、CUNO（商標）布フィルターバッグ(CUNO)が好ましい。

オルソポックスウイルスを一価の塩を含んでなる溶液で溶出する工程ｉ’）により、捕捉されたオルソポックスウイルスの陰イオン交換吸着剤からの回収が可能になる。使用される一価の塩にはＮａＣｌおよびＫＣｌが含まれるが、これらに限定されない。工程ｉ’）で用いられる好ましい一価の塩はＮａＣｌである。本発明の一実施形態によれば、溶出は、好ましくは０ないし２．５Ｍ、より好ましくは０ないし２Ｍ、さらに好ましくは０ないし１．５Ｍの範囲の、一価の塩の濃度勾配を増大させることによって行われる。本発明の別の実施形態によれば、溶出は、１Ｍ未満、好ましくは３００ｍＭないし７５０ｍＭ、より好ましくは５００ｍＭの一価の塩の濃度における１ステップ溶出によって行われる。本発明によれば、工程ｉ’）は７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる。本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｉ’）で用いられる一価の塩を含んでなる溶液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ グルタミン酸ナトリウム、および生理的なモル浸透圧濃度（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（すなわちＳＯ８緩衝液）を含んでなる、薬剤的に許容される溶液である。本発明のその他の好ましい実施形態によれば、工程ｉ’）で用いられる一価の塩を含んでなる溶液は、例えばＴｒｉｓ緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、またはリン酸緩衝液を含んでなる、薬剤的に許容される溶液である。オルソポックスウイルスを一価の塩を含んでなる溶液で溶出する工程ｉ’）は、好ましくは実施例４に記載される条件に従って行われ、ここで溶出は、ＳＯ８緩衝液中の増大するＮａＣｌ濃度勾配（３００ｍＭ；４００ｍＭ；５００ｍＭ）により行われる。

工程ｉ’）で得られた混合物を濃縮する工程ｊ’）により、前記通過画分に存在するタンパク質の除去が可能になる。

本発明の好ましい実施形態によれば、濃縮工程ｊ’）は精密濾過により行われる（以前に工程ｊ）で記載される）。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、濃縮工程ｊ’）は限外濾過により行われる（以前に工程ｊ）で記載される）。

工程ｊ’）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過する工程ｋ’）については、以前に記載した工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過する工程ｋ）を参照されたい。

本発明の方法Ｂは：
１．ゲル濾過工程（すなわち工程ｌ’））；および
２．透析濾過工程（すなわち工程ｍ’））をさらに含んでなってよい。

ゲル濾過工程ｌ’）については、ゲル濾過工程ｌ）を参照されたい。

透析濾過工程ｍ’）については、透析濾過工程ｍ）を参照されたい。

本発明によれば、以前に記載した方法Ｂの工程ｆ’）から工程ｌ’）の各工程の前に、１以上の安定剤の存在下で、オルソポックスウイルスを含んでなるサンプルをインキュベートする工程があってよい。本明細書で用いられる「安定剤」は、オルソポックスウイルスの保存を可能にする薬剤を指す。安定剤には、糖類（例えば、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタキオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトール、グリセロール）、アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ；Ｌｅｕ；Ｌｙｓ；Ａｒｇ；Ａｓｐ；Ｖａｌ；Ｇｌｕ）、界面活性剤（例えば、Triton X-100; Tween、例えばTween 20、Tween 80、またはTween 85）および塩（例えばＮａＣｌ；ＫＣｌ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態によれば、このインキュベーション工程で用いられる安定剤は糖類、より好ましくはサッカロースである。本発明によれば、このインキュベーション工程で用いられるサッカロースの濃度は２５ないし１００ｇ／Ｌの範囲、好ましくは５０ｇ／Ｌである。本発明によれば、単数または複数の安定剤は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ グルタミン酸ナトリウム、および生理的なモル浸透圧濃度（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（すなわちＳＯ８緩衝液）を含んでなる、薬剤的に許容される溶液からなる溶液に含まれてよい。本発明によれば、単数または複数の安定剤は、例えばＴｒｉｓ緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、またはリン酸緩衝液を含んでなる、薬剤的に許容される溶液からなる溶液に含まれてよい。本発明によれば、安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程は、７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる。本発明によれば、安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程の持続時間は、１ないし２０時間、好ましくは１８時間である。本発明によれば、安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程は、２℃ないし８℃の温度、好ましくは３℃ないし７℃の温度、より好ましくは４℃ないし６℃の温度、さらに好ましくは５℃の温度において行われる。安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程は、５０ｇ／Ｌサッカロースの存在下で、１８時間、５℃の温度において好ましく行われる。

本発明の方法Ｂの別の実施形態によれば、以前に記載したように、清澄化工程（工程ｈ’））は、オルソポックスウイルスを培養上清および／またはパッケージング細胞から回収する工程ｅ’）の後で行われる。

本発明はまた、以前に記載したように、方法Ａの単数または複数の工程と方法Ｂの単数または複数の工程とを組み合わせた方法にも関する。

この点から、本発明はさらに詳細に、野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造および精製する方法（すなわち方法Ｃ）に関し、この方法は以下の工程を含んでなる：
ａ’’）パッケージング細胞の培養物を用意すること；
ｂ’’）培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させること；
ｃ’’）感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養すること；
ｄ’’）１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートすること；
ｅ’’）培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収すること；
ｆ’’）工程ｅ’’）で回収されたオルソポックスウイルスを、
１．単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害できる１以上の薬剤、および所望により
２．１以上の安定剤；
の存在下でインキュベートすること；
ｇ’’）前記オルソポックスウイルスおよび核酸の捕捉を可能にするため、工程ｆ’’）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを適切な条件下で接触させること；
ｈ’’）細胞片の除去を可能にするため、工程ｇ’’）で得られた混合物を適切な条件下で清澄化すること；
ｉ’’）オルソポックスウイルスを、一価の塩を含んでなる溶液により溶出すること；
ｊ’’）工程ｉ’’）で溶出されたオルソポックスウイルスが工程ｋ’’）において陰イオン交換吸着剤へ吸着することを避けるために、前記オルソポックスウイルスに一価の塩を添加すること；
ｋ’’）核酸の捕捉を可能にするため、工程ｊ’’）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを適切な条件下で接触させること；
ｌ’’）通過画分中に残るオルソポックスウイルスを回収するため、陰イオン交換吸着剤を適切な条件下で一価の塩を含んでなる溶液により洗浄すること；
ｍ’’）工程ｌ’’）で得られた通過画分を濃縮すること；
ｎ’’）工程ｍ’’）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過すること。

パッケージング細胞の培養物を用意する工程ａ’’）については、以前に記載したパッケージング細胞の培養物を用意する工程ａ）を参照されたい。

培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させる工程ｂ’’）については、以前に記載した培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させる工程ｂ）を参照されたい。

感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養する工程ｃ’’）については、以前に記載した感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養する工程ｃ）を参照されたい。

１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートする工程ｄ’’）については、以前に記載した１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートする工程ｄ）を参照されたい。

培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収する工程ｅ’’）については、以前に記載した培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収する工程ｅ）を参照されたい。

工程ｅ’’）で回収されたオルソポックスウイルスを、（１）単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害できる１以上の薬剤、および所望により（２）１以上の安定剤の存在下でインキュベートする工程ｆ’’）については、以前に記載した、工程ｅ’）で回収されたオルソポックスウイルスを、（１）単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害できる１以上の薬剤、および所望により（２）１以上の安定剤の存在下でインキュベートする工程ｆ’）を参照されたい。

前記オルソポックスウイルスおよび核酸の捕捉を可能にするため、工程ｆ’’）で得られた混合物を適切な条件下で陰イオン交換吸着剤と接触させる工程ｇ’’）については、以前に記載した、前記オルソポックスウイルスおよび核酸の捕捉を可能にするため、工程ｆ’）で得られた混合物を適切な条件下で陰イオン交換吸着剤と接触させる工程ｇ’）を参照されたい。

工程ｇ’’）で得られた混合物を清澄化する工程ｈ’’）については、以前に記載した工程ｇ）で得られた混合物を清澄化する工程ｈ）を参照されたい。

オルソポックスウイルスを一価の塩を含んでなる溶液で溶出する工程ｉ’’）については、以前に記載したオルソポックスウイルスを一価の塩を含んでなる溶液で溶出する工程ｉ’）を参照されたい。

以前に工程ｉ’’）で溶出されたオルソポックスウイルスに一価の塩を添加する工程ｊ’’）は、適切な条件下で、工程ｋ’’）において前記オルソポックスウイルスの陰イオン交換吸着剤への吸着を避けること（すなわち、１０％を超えるオルソポックスウイルスの陰イオン交換吸着剤への吸着を避けること）を可能にする。従って、工程ｋ’’）では核酸（例えばＤＮＡ）のみが陰イオン交換吸着剤へ吸着され得る。一価の塩にはＮａＣｌおよびＫＣｌが含まれるが、これらに限定されない。工程ｊ’’）で用いられる好ましい一価の塩はＮａＣｌである。本発明によれば、工程ｊ’’）における一価の塩の濃度は、２００ないし３００ｍＭ、好ましくは２５０ｍＭまたは３００ｍＭの範囲である。本発明によれば、工程ｊ’’）は７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる。

核酸の捕捉が可能になる、工程ｊ’’）で得られた混合物を適切な条件下で陰イオン交換吸着剤と接触させる工程ｋ’’）については、以前に記載した核酸の捕捉が可能になる、工程ｆ）で得られた混合物を適切な条件下で陰イオン交換吸着剤と接触させる工程ｇ）を参照されたい。

陰イオン交換吸着剤に残るオルソポックスウイルスを通過画分中へ回収するため、陰イオン交換吸着剤を適切な条件下で一価の塩を含んでなる溶液により洗浄する工程ｌ’’）については、以前に記載した、陰イオン交換吸着剤に残るオルソポックスウイルスを通過画分中へ回収するため、陰イオン交換吸着剤を適切な条件下で一価の塩を含んでなる溶液により洗浄する工程ｉ）を参照されたい。

工程ｌ’’）で得られた通過画分を濃縮する工程ｍ’’）により、前記通過画分に存在するタンパク質の除去が可能になる。本発明の好ましい実施形態によれば、濃縮工程ｍ’’）は精密濾過により行われる（以前に工程ｊ）で記載される）。本発明の別の好ましい実施形態によれば、濃縮工程ｍ’’）は限外濾過により行われる（以前に工程ｊ）で記載される）。

工程ｍ’’）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過する工程ｎ’’）については、以前に記載した工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過する工程ｋ）を参照されたい。

本発明の方法Ｃは：
１．ゲル濾過工程（すなわち工程ｏ’’））；および
２．透析濾過工程（すなわち工程ｐ’’））をさらに含んでなってよい。

ゲル濾過工程ｏ’’）については、ゲル濾過工程ｌ）を参照されたい。

透析濾過工程ｐ’’）については、透析濾過工程ｍ）を参照されたい。

本発明によれば、以前に記載した方法Ｃの工程ｆ’’）から工程ｐ’’）の各工程（好ましくは工程ｋ’’）から工程ｐ’’）の各工程）の前に、１以上の安定剤の存在下で、オルソポックスウイルスを含んでなるサンプルをインキュベートする工程があってよい。本明細書で用いられる「安定剤」は、オルソポックスウイルスの保存を可能にする薬剤を指す。安定剤には、糖類（例えば、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ソルビトール、スタキオース、ラフィノース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトール、グリセロール）、アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ；Ｌｅｕ；Ｌｙｓ；Ａｒｇ；Ａｓｐ；Ｖａｌ；Ｇｌｕ）、界面活性剤（例えば、Triton X-100; Tween、例えばTween 20、Tween 80、またはTween 85）および塩（例えばＮａＣｌ；ＫＣｌ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態によれば、このインキュベーション工程で用いられる安定剤は糖類、より好ましくはサッカロースである。本発明によれば、このインキュベーション工程で用いられるサッカロースの濃度は２５ないし１００ｇ／Ｌの範囲、好ましくは５０ｇ／Ｌである。本発明によれば、単数または複数の安定剤は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、１０ｍＭ グルタミン酸ナトリウム、および生理的なモル浸透圧濃度（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（すなわちＳＯ８緩衝液）を含んでなる、薬剤的に許容される溶液からなる溶液に含まれてよい。本発明によれば、単数または複数の安定剤は、例えばＴｒｉｓ緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、またはリン酸緩衝液を含んでなる、薬剤的に許容される溶液からなる溶液に含まれてよい。本発明によれば、安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程は、７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる。本発明によれば、安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程の持続時間は、１ないし２０時間、好ましくは１８時間である。本発明によれば、安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程は、２℃ないし８℃の温度、好ましくは３℃ないし７℃の温度、より好ましくは４℃ないし６℃の温度、さらに好ましくは５℃の温度において行われる。安定剤の存在下でのこのインキュベーション工程は、５０ｇ／Ｌサッカロースの存在下で、１８時間、５℃の温度において好ましく行われる。

本発明の方法Ｃの別の実施形態によれば、以前に記載したように、清澄化工程（工程ｈ’’））は、オルソポックスウイルスを培養上清および／またはパッケージング細胞から回収する工程ｅ’’）の後で行われる。

本発明によれば、本発明の方法の各工程の後で得られたオルソポックスウイルスを含んでなるサンプルは、当業者に公知である凍結によって保存されてよい。

本発明によれば、本発明の方法は７．０ないし９．０、好ましくは７．５ないし８．５のｐＨ、より好ましくは８．０のｐＨにおいて行われる。

本発明の好ましい実施形態によれば、オルソポックスウイルスはワクシニアウイルス（Vaccinia Virus：ＶＶ）である。本発明による好ましいＶＶは、例えば特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２０（欠陥のあるＩ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子を含んでなるＶＶについて記載される、国際公開第２００９／０６５５４６号）またはＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２１（欠陥のあるＦ２Ｌ遺伝子を含んでなるＶＶについて記載される、国際公開第２００９／０６５５４７号）に記載されるＶＶである。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、オルソポックスウイルスは改変ワクシニアウイルスアンカラ（modified Vaccinia Virus Ankara：ＭＶＡ）である。本発明による好ましいＭＶＡは、寄託番号Ｎ^○Ｉ−７２１により、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託されたＭＶＡ、ＭＶＡ ５７５（ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７）、およびＭＶＡ−ＢＮ（ＥＣＡＣＣ Ｖ０００８３００８）である。

「組み換えオルソポックスウイルス」との語は、そのゲノムに挿入された外来性配列を含んでなるオルソポックスウイルスを指す。本明細書で用いられる外来性配列は、親オルソポックスウイルスに天然に存在しない核酸を指す。一実施形態によれば、外来性配列は、直接的または間接的に細胞傷害性機能を有する分子をコードする。「直接的または間接的」な細胞傷害性によって本発明者らが意味するものは、それ自体が毒性であり得る（例えばリシン、腫瘍壊死因子（tumour necrosis factor：ＴＮＦ）、インターロイキン−２（interleukin-2：ＩＬ２）、インターフェロン−ガンマ（interferon-gamma：ＩＦＮγ）、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、シュードモナス外毒素Ａ）、または毒性の産物を形成するために代謝され得る、または毒性の産物を形成するための何かとして作用し得る、外来性配列によってコードされる分子である。リシンｃＤＮＡの配列は、Lamb et al（Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-270）に開示される。

本発明の好ましい実施形態によれば、外来性配列は自殺遺伝子である。自殺遺伝子は、比較的に無毒性のプロドラッグを毒性の薬物に変換できるタンパク質をコードする。例えば、酵素、シトシンデアミナーゼは５−フルオロシトシン（5-fluorocytosine：５−ＦＣ）を５−フルオロウラシル（5-fluorouracil：５−ＦＵ）に変換し（Mullen et al (1922) PNAS 89, 33）；単純ヘルペス酵素であるチミジンキナーゼは、抗ウイルス剤であるガンシクロビル（ganciclovir：ＧＣＶ）またはアシクロビルによる治療に対して細胞を感受性にする（Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608）。いずれの生命体、例えば大腸菌または出芽酵母、のシトシンデアミナーゼも用いられてよい。従って本発明の好ましい実施形態によれば、自殺遺伝子は、参照によって本明細書に取り込まれる特許出願、国際公開第９９／５４４８１号、国際公開第０５／０７８５７号、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２０、およびＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２１に記載される、シトシンデアミナーゼ活性を有するタンパク質、より好ましくはＦＣＵ１タンパク質またはＦＣＵ１−８タンパク質をコードする。

この点から、本発明の方法に従って製造される好ましい組み換えオルソポックスウイルスは：
・ＭＶＡ−ＦＣＵ１（国際公開第９９／５４４８１号を参照）、ＴＧ４０２３とも称される；
・ＭＶＡ−ＦＣＵ１−８（国際公開第０５／０７８５７号を参照）；および
・ＶＶ−ＦＣＵ１、ここで前記ＶＶは、さらに詳細には、欠陥のあるＩ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子、および欠陥のあるＪ２Ｒ遺伝子（ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２０／国際公開第２００９／０６５５４６号、およびＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７２１／国際公開第２００９／０６５５４７号を参照）を含んでなる、である。

プロドラッグ／酵素の組み合わせのその他の例には、Bagshawe et al（国際公開第８８／０７３７８号）により開示される、様々なアルキル化剤およびシュードモナス菌種のＣＰＧ２酵素、ならびにEpenetos & Rowlinson-Busza（国際公開第９１／１１２０１号）により開示される、シアン形成プロドラッグ（例えばアミグダリン）および植物由来のベータグルコシダーゼが含まれる。本発明のこの実施形態に有用な酵素には、リン酸塩を含むプロドラッグの、遊離薬物への変換に有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩を含むプロドラッグの、遊離薬物への変換に有用なアリールスルファターゼ；ペプチドを含むプロドラッグの、遊離薬物への変換に有用なプロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（例えばカテプシンＢおよびＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグの変換に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化されたプロドラッグの、遊離薬物への変換に有用な炭水化物切断酵素、例えばベータガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；ベータラクタムによって誘導体化された薬物の、遊離薬物への変換に有用なベータラクタマーゼ；および、それらのアミン窒素が、フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基それぞれによって誘導体化された薬物の、遊離薬物への変換に有用なペニシリンアミダーゼ、例えばペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼが含まれるがこれらに限定されない。あるいは、当該技術分野においてアブザイムとして公知である、酵素活性を有する抗体もまた、本発明のプロドラッグの遊離活性薬物への変換に用いることができる（Massey R. et al., Nature, 1987, 328, 457-458）。同様にプロドラッグには、上に挙げたプロドラッグ、例えばリン酸塩を含むプロドラッグ、チオリン酸塩を含むプロドラッグ、硫酸塩を含むプロドラッグ、ペプチドを含むプロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾されたプロドラッグ、グリコシル化されたプロドラッグ、ベータラクタムを含むプロドラッグ、所望により置換されたフェノキシアセトアミドを含むプロドラッグまたは所望により置換されたフェニルアセトアミドを含むプロドラッグ、５−フルオロシトシン、およびその他の変換できる５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるがこれらに限定されない。本発明において使用するための、プロドラッグ型に誘導体化できる細胞傷害性薬物の例には、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、シスプラチンおよびシスプラチン類似体、ブレオマイシン、エスペラミシン（例えば米国特許第４，６７５，１８７号を参照）、５−フルオロウラシル、メルファラン、およびその他の関連するナイトロジェンマスタードが含まれるがこれらに限定されない。

さらなる実施形態によれば、外因性遺伝子は、標的となるＲＮＡまたはＤＮＡを切断できるリボザイムをコードする。切断される標的ＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞の機能に必須のＲＮＡまたはＤＮＡである可能性があり、その切断によって細胞死がもたらされるか、または切断されるＲＮＡまたはＤＮＡは、望ましくないタンパク質、例えば癌遺伝子産物をコードするＲＮＡまたはＤＮＡである可能性があり、このＲＮＡまたはＤＮＡの切断によって細胞の癌化が阻止され得る。

さらなる実施形態によれば、外因性遺伝子はアンチセンスＲＮＡをコードする。「アンチセンスＲＮＡ」によって本発明者らが意味するものは、タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子にハイブリダイズして発現に干渉するか、または細胞内の別のＲＮＡ分子、例えばプレｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡもしくはｒＲＮＡにハイブリダイズするか、またはハイブリダイズして、遺伝子からの発現に干渉するＲＮＡ分子である。

本発明の別の実施形態によれば、外来性配列によって、標的細胞の欠陥のある遺伝子の機能が置換される。数千の、欠陥のある遺伝子が原因となるヒトを含む哺乳類の遺伝性疾患が受け継がれている。このような遺伝性疾患の例には、ＣＦＴＲ遺伝子の変異が知られている嚢胞性線維症；ジストロフィン遺伝子の変異が知られているデュシェンヌ型筋ジストロフィー；ＨｂＡ遺伝子の変異が知られている鎌状赤血球症が含まれる。多くの型の癌は、欠陥のある遺伝子、特に癌原遺伝子および変異を起こしている腫瘍抑制遺伝子によって引き起こされる。癌原遺伝子の例は、ｒａｓ、ｓｒｃ、ｂｃｌなど；腫瘍抑制遺伝子の例は、ｐ５３およびＲｂである。

本発明のさらなる実施形態によれば、外来性配列は腫瘍関連抗原（Tumor Associated Antigen：ＴＡＡ）をコードする。ＴＡＡは、同じ型の組織において、非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞に高い頻度または密度で検出される分子を指す。ＴＡＡの例には、ＣＥＡ、ＭＡＲＴ１、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＧＰ−１００、ＭＵＣ１（参照により本明細書に取り込まれる、国際公開第９２／０７０００号、国際公開第９５／０９２４１号、およびRochlitz et al. J Gene Med. 2003 Aug;5(8):690-9 を参照）、ＭＵＣ２、点突然変異したｒａｓ癌遺伝子、正常または点突然変異したｐ５３、過剰発現したｐ５３、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、Ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２、ＢＲＣＡ Ｉ、ＢＲＣＡ ＩＩ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、サバイビン、およびＬＲＰが含まれるが、これらに限定されない。さらに好ましい実施形態によれば、ＴＡＡはＭＵＣ１である。

本発明の別の実施形態によれば、外因性遺伝子は抗原をコードする。本明細書で用いる「抗原」は、抗体が結合するリガンドを指す；抗原自体が免疫原性である必要はない。好ましくは、抗原は、例えばＨＩＶ−１、（例えばｇｐ１２０またはｇｐ１６０）、いずれのネコ免疫不全ウイルス、ヒトまたは動物の疱疹ウイルス、例えばｇＤもしくはその誘導体またはＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７のような前初期タンパク質、サイトメガロウイルス（例えばｇＢまたはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えばｇｐＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ）のようなウイルス由来、またはＢ型肝炎ウイルス（hepatitis B virus：ＨＢＶ）、例えばＢ型肝炎表面抗原もしくはその誘導体、Ａ型肝炎ウイルス（hepatitis A virus：ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus：ＨＣＶ；国際公開第０４／１１１０８２号を参照；選択的にはｊａ種の遺伝子型１ｂ株に由来する非構造ＨＣＶタンパク質）、および肝炎Ｅウイルス（hepatitis E virus：ＨＥＶ）のような肝炎ウイルス由来、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパピローマウイルス（Human Papilloma Virus：ＨＰＶ；国際公開第９０／１０４５９号、国際公開第９５／０９２４１号、国際公開第９８／０４７０５号、国際公開第９９／０３８８５号、国際公開第０７／１２１８９４号、および国際公開第０７／１２１８９４号を参照；ＨＰＶ１６株由来のＥ６およびＥ７タンパク質が好ましい；Liu et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Oct 5; 101 Suppl 2:14567-71も参照）もしくはインフルエンザウイルスのようなその他のウイルス性病原体由来、サルモネラ、ナイセリア、ボレリア（例えばＯｓｐＡもしくはＯｓｐＢ、またはそれらの誘導体）、またはクラミジア、またはボルデテラ、例えばＰ．６９、ＰＴおよびＦＨＡのような細菌性病原体由来、またはプラスモジウムもしくはトキソプラズマのような寄生虫由来である。さらに好ましい実施形態によれば、抗原はＨＣＶまたはＨＰＶから選択される。

この点から、本発明の方法によって製造される好ましい組み換えオルソポックスウイルスは、ＭＶＡ−ＨＣＶ（国際公開第０４／１１１０８２号を参照）であり、これはＴＧ４０４０とも称される。

組み換えオルソポックスウイルスは、１を超える外来性配列を含んでなってよく、外来性配列それぞれが１を超える分子をコードしてよい。例えば同じ組み換えオルソポックスウイルス内に、例えばＴＡＡ（以前に記載される）または抗原（以前に記載される）をコードする外来性配列と、サイトカイン（例えばインターロイキン（interleukin：ＩＬ、例えばＩＬ２）；腫瘍壊死因子（tumour necrosis factor：ＴＮＦ）；インターフェロン−（interferon：ＩＦＮ）；コロニー刺激因子（colony stimulating factor：ＣＳＦ））をコードする外来性配列とが付随すると有用であり得る。

この点から、本発明の方法によって製造される好ましい組み換えオルソポックスウイルスは：
・ＭＶＡ−［ＭＵＣ１−ＩＬ２］（国際公開第９２／０７０００号および国際公開第９５／０９２４１号を参照）、ＴＧ４０１０とも称される；および
・ＭＶＡ−［ＨＰＶ−ＩＬ２］（国際公開第９０／１０４５９号、国際公開第９５／０９２４１号、国際公開第９８／０４７０５号、国際公開第９９／０３８８５号、国際公開第０７／１２１８９４号、および国際公開第０７／１２１８９４号を参照）、ＴＧ４００１とも称される、である。

好都合には、組み換えオルソポックスウイルスは単数または複数の外来性配列の発現に必要なエレメントをさらに含んでなる。発現に必要なエレメントは、ヌクレオチド配列のＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能にするエレメント一式、特に、本発明の組み換えオルソポックスウイルスを感染させる細胞内で有効なプロモーター配列および／または調節性配列、ならびに所望により、前記ポリペプチドの細胞表面への排出および発現を可能にするために必要な配列を含んでなる。これらのエレメントは、誘導性または恒常的であってよい。言うまでもなく、プロモーターは、選択された組み換えオルソポックスウイルスおよびホスト細胞に適応させる。例として言及され得るものは、ワクシニアウイルスプロモーター、ｐ７．５Ｋ、ｐＨ５Ｒ、ｐＫ１Ｌ、ｐ２８、ｐ１１、または前記プロモーターの組み合わせである。このようなプロモーター配列に関する多くの情報が、文献により提供される。必要なエレメントはさらに、ホスト細胞における外来性配列の発現またはその維持を改善する追加のエレメントを含むことができる。特に、イントロン配列（国際公開第９４／２９４７１号）、分泌シグナル配列、核局在化配列、ＩＲＥＳ型翻訳の再開始のための内部部位、転写終結のためのポリＡ配列について言及され得る。

本発明はまた、医薬組成物、好ましくはワクチンとして使用するための、本発明の方法によって得られる、精製された野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスにも関する。

本明細書で用いられる「医薬組成物」は、薬剤的に許容される担体を含んでなる組成物を指す。前記の薬剤的に許容される担体は、好ましくは、例えばスクロース溶液のように、等張、低浸透圧性、または弱い高浸透圧性であり、比較的低いイオン強度を有する。さらにこのような担体は、いずれの溶媒、または水性もしくは部分的に水性の液体、例えば非発熱性の無菌水も含み得る。加えて医薬組成物のｐＨは、in vivoでの使用条件を満たすように調整および緩衝される。医薬組成物はまた、薬剤的に許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤、同様に可溶化剤、安定剤、および保存剤も含んでよい。注射による投与のためには、製剤は水性、非水性、または等張溶液であることが好ましい。これは、液体または使用時に適切な希釈剤によって再構成できる乾燥型（粉末、凍結乾燥物など）として、単一用量または複数用量において提供され得る。

本発明はまた、癌、感染症、および／または自己免疫疾患を治療および／または予防するための、本発明の方法によって得られる、精製された野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスにも関する。

本明細書で用いられる「癌」は、肺癌（例えば小細胞肺癌、および非小細胞肺癌）、気管支癌、食道癌、咽頭癌、頭頚部癌（例えば、咽頭癌、口唇癌、鼻腔および副鼻腔癌、ならびに咽喉癌）、口腔癌（例えば舌癌）、胃の癌（例えば胃癌）、腸癌、胃腸の癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、肝臓癌、膵臓癌、尿路癌、膀胱癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、腺癌、皮膚癌、例えばメラノーマ）、眼の癌（例えば網膜芽細胞腫）、脳の癌（例えば、神経膠腫、髄芽腫、および大脳星状細胞腫）、中枢神経系の癌、リンパ腫（例えば皮膚Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン症候群、および非ホジキンリンパ腫）、骨癌、白血病、乳癌、生殖器癌、子宮頸癌（例えば子宮頸部上皮内腫瘍）、子宮癌（例えば子宮内膜癌）、卵巣癌、膣癌、外陰部の癌、前立腺癌、精巣癌を指すが、これらに限定されない。「癌」はまた、パピローマウイルス誘導性の癌、疱疹ウイルス誘導性の腫瘍、ＥＢＶ誘導性のＢ細胞リンパ腫、Ｂ型肝炎誘導性の腫瘍、ＨＴＬＶ−１誘導性のリンパ腫、およびＨＴＬＶ−２誘導性のリンパ腫を含むが、これらに限定されないウイルス誘導性の腫瘍も指す。

本明細書で用いられる「感染症」は、感染性の生命体によって引き起こされるいずれの疾病も指す。感染性の生命体には、ウイルス（例えば、一本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus：ＨＩＶ）、Ａ、Ｂ、およびＣ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus：ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus：ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial virus：ＲＳＶ）、エプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus：ＥＢＶ）、またはヒトパピローマウイルス（human papilloma virus：ＨＰＶ））、寄生虫（例えば、プラスモジウム種、リーシュマニア種、住血吸虫種、またはトリパノソーマ種のような原生動物および後生動物の病原体）、細菌（例えば、マイコバクテリア、特に結核菌、サルモネラ菌、連鎖球菌、大腸菌、またはブドウ球菌）、真菌（例えば、カンジダ種またはアスペルギルス種）、ニューモシスチス・カリニ、およびプリオンが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で用いられる「自己免疫疾患」は、二つの一般的な型：「全身性自己免疫疾患」（すなわち、多くの臓器または組織を損傷する疾患）、および「限局性自己免疫疾患」（すなわち、単一の臓器または組織のみを損傷する疾患）を指す。しかしながら、「限局性自己免疫疾患」の結果は、間接的にその他の身体臓器およびシステムに影響を及ぼすことによって全身性となり得る。「全身性自己免疫疾患」には、関節、およびおそらくは肺および皮膚に発症する関節リウマチ；皮膚、関節、腎臓、心臓、脳、赤血球、同様にその他の組織及び臓器に発症する全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus：ＳＬＥ）を含む狼瘡；皮膚、腸、および肺に発症する強皮症；唾液腺、涙腺、および関節に発症するシェーグレン症候群；肺および腎臓に発症するグッドパスチャー症候群；洞、肺、および腎臓に発症するウェゲナー肉芽腫症；大筋肉群に発症するリウマチ性多発筋痛症、および側頭動脈炎／頭頚部の動脈に発症する巨細胞性動脈炎が含まれるが、これらに限定されない。「限局性自己免疫疾患」には、膵島に発症する１型糖尿病；甲状腺に発症する橋本甲状腺炎およびグレーブス病；消化管に発症するセリアック病、クローン病、および潰瘍性大腸炎；中枢神経系に発症する多発性硬化症（multiple sclerosis：ＭＳ）およびギラン・バレー症候群；副腎に発症するアジソン病；肝臓に発症する原発性胆管硬化症（primary biliary sclerosis）、硬化性胆管炎、および自己免疫性肝炎；ならびに手指、足指、鼻、耳に発症するレイノー現象が含まれるが、これらに限定されない。

本発明はまた、本発明の方法によって得られる、精製された野生型，弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを含んでなる医薬組成物、好ましくはワクチンにも関する。本発明によれば前記医薬組成物は、癌、感染症、および／または自己免疫疾患の治療および／または予防を意図する。

本発明はまた、癌、感染症、および／または自己免疫疾患の治療および／または予防のための医薬組成物、好ましくはワクチンを製造するための、本発明の方法によって得られる、精製された野生型，弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスの使用にも関する。

医薬組成物、特にワクチンは、局所的、非経口、または消化管経路による投与のために、従来法によって製造されてよい。投与経路は、例えば胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、鼻腔内、肺内、または気管内経路であってよい。後の三つの実施形態には、エアロゾルまたは滴下による投与が都合よい。投与は、単一用量で、または一定の時間間隔の後に１回もしくは数回繰り返して行われてよい。投与に適切な経路および投薬量は、様々なパラメーター、例えば個体、治療される疾病、または導入に関心がもたれる単数もしくは複数の遺伝子、の関数として変動する。第１の可能性によれば、医薬組成物、特にワクチンはin vivoで直接投与され得る（例えば、静脈内注射により、到達可能な腫瘍内へ、または治療用もしくは予防用ワクチン接種のために末梢、皮下において）。患者から細胞を回収すること（骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋肉細胞など）、先行技術に従ってそれらをin vitroでトランスフェクトすること、およびそれらを患者へ再投与することである、ex vivoでのアプローチを採用することも可能である。さらに、適切かつ本発明の範囲から逸脱することなく、医薬組成物、特にワクチンに含まれる様々な成分を、異なる経路によって同時または連続的に投与することが想定される。

本発明はまた、本発明の方法に従って、野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造するための、カモ科ファミリーに属する鳥類細胞から得た不死化鳥類細胞株の使用にも関する。カモ科の中でも、バリケン属またはマガモ属に属する細胞が特に好ましい。さらに好ましいものは、ノバリケンまたはマガモ種に属する不死化鳥類細胞株である。

本発明の好ましい実施形態によれば、ノバリケン不死化鳥類細胞株は、国際公開第２００７／０７７２５６号に記載される、テロメラーゼ逆転写酵素（telomerase reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含んでなるノバリケン不死化鳥類細胞株である。以下の不死化鳥類細胞株が特に好ましい：
−受託番号０８０６０５０２により欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に寄託されるＴ３−１７４９０（図２、３、および４を参照）またはその誘導体；
−受託番号０８０６０５０１により欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に寄託されるＴ６−１７４９０（図５、６、および７を参照）またはその誘導体。

この点から、本発明はまた:
・本発明の方法に従って、野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造するための、テロメラーゼ逆転写酵素（telomerase reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含んでなるノバリケン不死化鳥類細胞株の使用
・本発明の方法に従って、野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造するための、受託番号０８０６０５０２により欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に寄託されるＴ３−１７４９０ノバリケン不死化鳥類細胞株（実施例２に記載される）またはその誘導体の使用
・本発明の方法に従って、野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造するための、受託番号０８０６０５０１により欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に寄託されるＴ６−１７４９０ノバリケン不死化鳥類細胞株（実施例３に記載される）またはその誘導体の使用にも関する。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、ノバリケン不死化鳥類細胞株は、国際公開第２００９／００４０１６号に記載される、Ｅ１Ａ核酸配列およびテロメラーゼ逆転写酵素（telomerase reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含んでなるノバリケン不死化鳥類細胞株である。

この点から、本発明はまた、本発明の方法に従って、野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造するための、Ｅ１Ａ核酸配列およびテロメラーゼ逆転写酵素（telomerase reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含んでなるノバリケン不死化鳥類細胞株の使用にも関する。

本出願の全体にわたって用いられる、寄託された不死化鳥類細胞株の「誘導体」は、「関心のある物質」をコードする核酸配列を含んでなる不死化鳥類細胞株を指す。本明細書で用いられる「関心のある物質」は、薬理的活性のあるタンパク質、例えば増殖因子、増殖制御因子、抗体、抗原、免疫化もしくはワクチン接種などに有用なそれらの誘導体、インターロイキン、インスリン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターフェロン（インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ）、血液凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子；第ＩＸ因子；ｔＰＡ）またはそれらの組み合わせを含んでよいが、これらに限定されない。

Benzonase（登録商標）エンドヌクレアーゼ活性における、様々なBenzonase（登録商標）濃度（すなわち１０ｍＭ；５０ｍＭ）の効果を示した図である（温度２５℃；Ｍｇ^２＋２ｍＭ；ｐＨ８）。 Ｔ３−１７４９０（ＥＣＡＣＣ ０８０６０５０２）ノバリケン不死化鳥類細胞株（継代３９）の、光学顕微鏡による画像処理を示した図である。 Ｔ３−１７４９０（ＥＣＡＣＣ ０８０６０５０２）ノバリケン不死化鳥類細胞株の増殖曲線を示した図である（継代７から継代７５まで）。 Ｔ３−１７４９０（ＥＣＡＣＣ ０８０６０５０２）ノバリケン不死化鳥類細胞株における、集団倍加時間の漸進的変化を示した図である（継代７から継代７５まで）。 Ｔ６−１７４９０（ＥＣＡＣＣ ０８０６０５０１）（継代４５）の、光学顕微鏡による画像処理を示した図である。 Ｔ６−１７４９０（ＥＣＡＣＣ ０８０６０５０１）ノバリケン不死化鳥類細胞株の増殖曲線を示した図である（継代１５から継代５１まで）。 Ｔ６−１７４９０（ＥＣＡＣＣ ０８０６０５０１）ノバリケン不死化鳥類細胞株における、集団倍加時間の漸進的変化を示した図である（継代１６から継代５１まで）。

本発明の例証のため、以下の実施例を提供する。実施例は、本発明の範囲をどのようにも限定しようと意図するものではない。

実施例１：方法Ａ
工程ａ）：パッケージング細胞の培養物を用意する
ＳＰＦ卵６６個を、２％ホルモル溶液中で６０秒インキュベートした。７０％エタノールで洗浄後、卵を開き、胚を抽出および解体した。得られた組織を、次にディスパーゼ（ＵＩ／ｍｌ）およびトリプルセレクト（ＵＩ／ｍｌ）によって３６．５℃、１２０分消化した。未消化組織を除去するために混合物を濾過し、ＣＥＦを遠心分離（２３００ｒｐｍ、１５分）によって回収した。ＣＥＦを、５５ＬのVP-SFM (Invitrogen)中で２日間３６．５℃にてインキュベートした。

工程ｂ）：培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させる
次に細胞用培地を廃棄し、ＭＶＡ−［ＭＵＣ１−ＩＬ２］、ＴＧ４０１０とも称される（０．０５ＭＯＩ）（寄託番号Ｎ^○Ｉ−７２１により、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託されたＭＶＡ）を、５５Ｌのイーグル基礎培地（Invitrogen）中に加えた。

工程ｃ）：感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養する
次に、感染させたＣＥＦを３日間３６．５℃にてインキュベートした。

工程ｄ）：１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートする
次に、ＭＶＡ子孫を含んでなる感染させたＣＥＦを、１０Ｕ／ｍｌまたは５０Ｕ／ｍｌのBenzonase（登録商標）(Merck；参照1.01653.0001）存在下で、以下の条件：
−攪拌しながら、温度２５℃にて２時間；
−Ｍｇ^２＋２ｍＭ；
−ｐＨ８．０によりインキュベートした。

工程ｅ）：培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収する
細胞用培地およびＣＥＦを回収した。次に混合物を１５分間、１１ｍｌ／分にて、Silverson（著作権）L4R高速ホモジナイザー（Silverson）によるか、または７５分間、１５００ｍｌ／分にて、SONITUBE 36 kHz型 SM 35/3WU (Heraeus PSP)によってホモジナイズした。
得られた混合物を次に２時間、攪拌しながら温度２５℃、ｐＨ８．０にてインキュベートした。

工程ｆ）：単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害するため、および工程ｅ）で回収されたオルソポックスウイルスが工程ｇ）において陰イオン交換吸着剤へ吸着することを避けるために、前記オルソポックスウイルスに適切な条件下で一価の塩を添加する
得られた混合物を次にＮａＣｌ ２５０ｍＭの存在下で、ｐＨ８．０にてインキュベートした。

工程ｇ）：核酸の捕捉を可能にするため、工程ｆ）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを適切な条件下で接触させる
得られた混合物を次にUNOsphere（登録商標）Q (BioRad)に加えた。UNOsphere（登録商標）Q (BioRad)ビーズ型基質を、最初に無菌水で洗浄した後、Ｔｒｉｓ １０ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）中でオートクレーブして、次にＮａＣｌ、２５０ｍＭまたは３００ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）によって平衡化した。
次にUNOsphere（登録商標）Q (BioRad) ビーズ型基質を、蠕動のWatson-Marlowポンプ(参照323ES/4D, 520S; Watson-Marlow)を用いて、Flexboy（登録商標）バッグ(参照FFB101961 ; Sartorius Stedim biotech)内に含まれる、工程ｆ）で得られた混合物に加えた。
UNOsphere（登録商標）Q (BioRad)ビーズ型基質および工程ｆ）で得られた混合物を、１時間ゆっくりと攪拌しながら、室温（２０℃ないし２２℃）にて接触させた。

工程ｈ）：細胞片の除去を可能にするため、工程ｇ）で得られた混合物を適切な条件下で清澄化する
得られた混合物を次に、Sartopure（登録商標）PP2、８μｍ(Sartorius)とSartopure（登録商標）PP2、５μｍ(Sartorius)を組み合わせた深層濾過により、流速１Ｌ／分で清澄化した。

工程ｉ）：陰イオン交換吸着剤に残るオルソポックスウイルスを、通過画分中に回収するのに適切な条件下で、陰イオン交換吸着剤を一価の塩を含んでなる溶液により洗浄する
次に、UNOsphere（登録商標）(BioRad)を、ＳＯ８緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；スクロース ５％（ｗ／ｖ）；１０ｍＭ グルタミン酸ナトリウム；生理的なモル浸透圧濃度（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ８．０）中のＮａＣｌ ２５０ｍＭまたは３００ｍＭ（ｖ／ｖ）により、蠕動のWatson-Marlowポンプ(参照323ES/4D, 520S; Watson-Marlow)を用いて洗浄した。
次に、工程ｈ）で得られた通過画分と工程ｉ）で得られた通過画分を一晩（すなわち１８時間）５℃にて、最終濃度５０ｇ／Ｌのサッカロース存在下でインキュベートした。

工程ｊ）：工程ｈ）で得られた通過画分と工程ｉ）で得られた通過画分を濃縮する
工程ｈ）で得られた通過画分と工程ｉ）で得られた通過画分を、次に０．１μｍ Prostak Microfiltration Module (参照PSVVAG021, Millipore)を通して１８倍に濃縮した。

工程ｋ）：工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過する
次に濃縮水を同じモジュール、すなわち０．１μｍ Prostak Microfiltration Module (参照PSVVAG021, Millipore)において透析濾過した。
ＤＮＡの定量は、Quant-iT（商標）Picogreen（登録商標）dsDNA Assays Kit (カタログ番号P7589、Invitrogen)を用いて行った。
結果：残存ＤＮＡは検出されなかった。

実施例２：本発明の方法に従ってオルソポックスウイルスを製造するための、Ｔ３−１７４９０不死化ノバリケン細胞株（受託番号０８０６０５０２によりＥＣＡＣＣに寄託される）の使用。
Ｔ３−１７４９０細胞（継代３９）は、均一な線維芽細胞様の形態を有する（図２）。静的な単層は１００％コンフルエンスになるまで安定であり、次に接触阻止が起こる。細胞の検査によると、マイコプラズマ混入および細菌混入は陰性であった。Ｔ３−１７４９０細胞株の増殖曲線（継代７から継代７５）（図３）により、継代１９から継代７５までの連続的な指数関数的増殖が示される。集団倍加時間（population doubling time：ＰＤＴ）の漸進的変化に焦点を当てると、進行的な安定化と減少が観察され、特に最近の１０継代の間では、４８時間の点におけるＰＤＴの安定化が観察される（図４）。集団倍加に対応する数（集団倍加数(population doubling level, PDL)）を、２つの指数関数的増殖段階の累積によって算出した：７５継代の間に、細胞は少なくとも１４７の集団倍加（population doublings：ＰＤ）を行った。初代細胞が老化を始める前の集団倍加数は、組織および種に依存する。一般に上限は５０ないし６０ＰＤであるとされている。従ってＴ３−１７４９０細胞はヘイフリック限界をはるかに越えており、結果的に不死化細胞株と称される。
注：
・集団倍加数（population doubling level：ＰＤＬ）は、細胞世代数を指す（現存量の２倍増加）。ＰＤＬ算出：ＰＤＬ＝Ｌｎ（最終の／最初の細胞数）／Ｌｎ（２）；
・集団倍加時間（population doubling time：ＰＤＴ）、世代時間とも称される、は、１集団が倍加するために必要とされる時間である。ＰＤＴ算出：ＰＤＴ＝Δｔ^＊Ｌｎ（２）／Ｌｎ（最終の／最初の細胞数）。

実施例３：本発明の方法に従ってオルソポックスウイルスを製造するための、Ｔ６−１７４９０不死化ノバリケン細胞株（受託番号０８０６０５０１によりＥＣＡＣＣに寄託される）の使用。
Ｔ６−１７４９０細胞（継代４５）は、均一な線維芽細胞様の形態を有する（図５）。静的な単層は１００％コンフルエンスになるまで安定であり、次に接触阻止が起こる。細胞の検査によると、マイコプラズマ混入および細菌混入は陰性であった。Ｔ６−１７４９０細胞株の増殖曲線（継代１５から継代５１）（図６）により、継代１９からの連続的な指数関数的増殖が示される。この期間に測定した集団倍加時間（population doubling time：ＰＤＴ）は、進行的に減少した。平均ＰＤＴは、９４時間（継代２０から３５）から５２時間（継代３６から５１）となった（図７）。５１継代に対応する算出した集団倍加の数（ＰＤＬ）は、少なくとも７１集団倍加であった。従ってＴ６−１７４９０細胞はヘイフリック限界をはるかに越えており、結果的に不死化細胞株と称される。
注：
・集団倍加数（population doubling level：ＰＤＬ）は、細胞世代数を指す（現存量の２倍増加）。ＰＤＬ算出：ＰＤＬ＝Ｌｎ（最終の／最初の細胞数）／Ｌｎ（２）；
・集団倍加時間（population doubling time：ＰＤＴ）、世代時間とも称される、は、１集団が倍加するために必要とされる時間である。ＰＤＴ算出：ＰＤＴ＝Δｔ^＊Ｌｎ（２）／Ｌｎ（最終の／最初の細胞数）。

実施例４：方法Ｂ
工程ａ’）：パッケージング細胞の培養物を用意する
ＳＰＦ卵６６個を、２％ホルモル溶液中で６０秒インキュベートした。７０％エタノールで洗浄後、卵を開き、胚を抽出および解体した。得られた組織を、次にディスパーゼ（ＵＩ／ｍｌ）およびトリプルセレクト（ＵＩ／ｍｌ）によって３６．５℃、１２０分消化した。未消化組織を除去するために混合物を濾過し、ＣＥＦを遠心分離（２３００ｒｐｍ、１５分）によって回収した。ＣＥＦを、５５ＬのVP-SFM (Invitrogen)中で２日間３６．５℃にてインキュベートした。

工程ｂ’）：培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させる
次に細胞用培地を廃棄し、ＭＶＡ−［ＭＵＣ１−ＩＬ２］、ＴＧ４０１０とも称される（０．０５ＭＯＩ）（寄託番号Ｎ^○Ｉ−７２１により、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）に寄託されたＭＶＡ）を、５５Ｌのイーグル基礎培地（Invitrogen）中に加えた。

工程ｃ’）：感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養する
次に、感染させたＣＥＦを３日間３６．５℃にてインキュベートした。

工程ｄ’）：１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートする
次に、ＭＶＡ子孫を含んでなる感染させたＣＥＦを、１０Ｕ／ｍｌのBenzonase（登録商標）(Merck；参照1.01653.0001）存在下で、以下の条件：
−攪拌しながら、温度２５℃にて２時間；
−Ｍｇ^２＋２ｍＭ；
−ｐＨ８．０によりインキュベートした。

工程ｅ’）：培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収する
細胞用培地およびＣＥＦを回収した。次に混合物を１５分間、１１ｍｌ／分にて、Silverson（著作権）L4R高速ホモジナイザー（Silverson）によるか、または７５分間、１５００ｍｌ／分にて、SONITUBE 36 kHz型 SM 35/3WU (Heraeus PSP)によってホモジナイズした。

工程ｆ’）：工程ｅ’）で回収されたオルソポックスウイルスを、単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害できる１以上の薬剤の存在下でインキュベートする
得られた混合物を次にＮａＣｌ １００ｍＭおよびＥＤＴＡ １０ｍＭの存在下で、ｐＨ８．０にてインキュベートした。

工程ｇ’）：前記オルソポックスウイルスおよび核酸の捕捉を可能にするため、工程ｆ’）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを適切な条件下で接触させる
得られた混合物を次にBioSepra（登録商標）Q hyperZ (Pall Corporation)に加えた。BioSepra（登録商標）Q hyperZ (Pall Corporation)ビーズ型基質を、最初に無菌水で洗浄した後、次にＮａＯＨ ０．５Ｎにより消毒して、Ｔｒｉｓ １０ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄して、次にＴｒｉｓ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １０ｍＭ、サッカロース５％緩衝液（ｐＨ８．０）によって平衡化した。
次にBioSepra（登録商標）Q hyperZ (Pall Corporation)ビーズ型基質を、蠕動のWatson-Marlowポンプ(参照323ES/4D, 520S; Watson-Marlow)を用いて、Flexboy（登録商標）バッグ(参照FFB101961 ; Sartorius Stedim biotech)内に含まれる、工程ｆ’）で得られた混合物に加えた。
BioSepra（登録商標）Q hyperZ (Pall Corporation)ビーズ型基質および工程ｆ’）で得られた混合物を、１時間ゆっくりと攪拌しながら、室温（２０℃ないし２２℃）にて接触させた。

工程ｈ’）：細胞片の除去を可能にするため、工程ｇ’）で得られた混合物を適切な条件下で清澄化する
得られた混合物を次に、Sartopure（登録商標）PP2、８μｍ(Sartorius)とSartopure（登録商標）PP2、５μｍ(Sartorius)を組み合わせた深層濾過により、流速１Ｌ／分で清澄化した。

工程ｉ’）：オルソポックスウイルスを、一価の塩を含んでなる溶液により溶出する
オルソポックスウイルスを、ＳＯ８緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；スクロース ５％（ｗ／ｖ）；１０ｍＭ グルタミン酸ナトリウム；生理的なモル浸透圧濃度（２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ８．０）中の増大するＮａＣｌ濃度勾配（３００ｍＭ；４００ｍＭ；５００ｍＭ）により、蠕動のWatson-Marlowポンプ(参照323ES/4D, 520S; Watson-Marlow)を用いて溶出した。

工程ｊ’）：工程ｉ’）で得られた混合物を濃縮する
工程ｉ’）で得られた溶出液を、次に０．１μｍ Prostak Microfiltration Module (参照PSVVAG021, Millipore)を通して１８倍に濃縮した。

工程ｋ’）：工程ｊ’）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過する
次に濃縮水を同じモジュール、すなわち０．１μｍ Prostak Microfiltration Module (参照PSVVAG021, Millipore)において透析濾過した。
ＤＮＡの定量は、Quant-iT（商標）Picogreen（登録商標）dsDNA Assays Kit (カタログ番号P7589、Invitrogen)を用いて行った。
結果：残存ＤＮＡは検出されなかった。

上記の全ての書類（例えば、特許、特許出願、出版物）は、引用することにより本明細書の一部とされる。本発明の様々な改変および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかとなるであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記述してきたが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態によって不当に制限されるべきではないことが理解されなければならない。実際に、本発明を実行するために記載された様式についての、当業者に自明である様々な改変は、以下の請求項の範囲内にあることが意図される。

Claims (28)

1. 野生型、弱毒化、および／または組み換えオルソポックスウイルスを製造および精製する方法であって、以下の工程：
   ａ）パッケージング細胞の培養物を用意し、
   ｂ）培養パッケージング細胞にオルソポックスウイルスを感染させ、
   ｃ）感染させたパッケージング細胞を、子孫オルソポックスウイルスが製造されるまで培養し、
   ｄ）１以上のヌクレアーゼの存在下でインキュベートし、
   ｅ）培養上清および／またはパッケージング細胞からオルソポックスウイルスを回収し、
   ｆ）単数または複数のヌクレアーゼの活性を阻害しかつ工程ｇ）においてオルソポックスウイルスが陰イオン交換吸着剤へ吸着することを避けるのに適切な条件下で、工程ｅ）で回収されたオルソポックスウイルスに一価の塩を添加し、
   ｇ）核酸の捕捉を可能にするのに適切な条件下で、工程ｆ）で得られた混合物と陰イオン交換吸着剤とを接触させること
   を含んでなる、方法。
2. 以下の工程：
   ｈ）細胞片の除去を可能にするのに適切な条件下で、工程ｇ）で得られた混合物を清澄化し、
   ｊ）工程ｈ）で得られた通過画分を濃縮し、
   ｋ）工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過することを、さらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
3. 以下の工程：
   ｈ）細胞片の除去を可能にするのに適切な条件下で、工程ｇ）で得られた混合物を清澄化し、
   ｉ）陰イオン交換吸着剤に残るオルソポックスウイルスを、通過画分中に回収するのに適切な条件下で、陰イオン交換吸着剤を一価の塩を含んでなる溶液により洗浄し、
   ｊ）工程ｈ）で得られた通過画分および工程ｉ）で得られた通過画分を濃縮し、
   ｋ）工程ｊ）で得られたオルソポックスウイルスを含んでなる画分を透析濾過することを、さらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
4. パッケージング細胞が、不死化細胞株である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. パッケージング細胞が、不死化鳥類細胞株である、請求項４に記載の方法。
6. 不死化鳥類細胞株が、動物性産物を含まない培地中にて微小担体の非存在下で懸濁液中にて増殖可能である、請求項５に記載の方法。
7. 不死化鳥類細胞株が、ノバリケン種に属する鳥類細胞から得られる、請求項５に記載の方法。
8. 不死化鳥類細胞株が、テロメラーゼ逆転写酵素（telomerase reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）をコードする核酸を含んでなる、請求項７に記載の方法。
9. 不死化鳥類細胞株が、
   ・受託番号０８０６０５０２により欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に寄託されるＴ３−１７４９０もしくはその誘導体、または、
   ・受託番号０８０６０５０１により欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）に寄託されるＴ６−１７４９０もしくはその誘導体である、
   請求項８に記載の方法。
10. 不死化鳥類細胞株が、Ｅ１Ａ核酸およびテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸を含んでなる、請求項７に記載の方法。
11. パッケージング細胞が、初代または二次的な鳥類細胞である、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
12. パッケージング細胞が、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）である、請求項１１に記載の方法。
13. ｐＨが７．０ないし９．０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
14. ヌクレアーゼがBenzonase（登録商標）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
15. 単数または複数のヌクレアーゼの濃度が、５ないし１００Ｕ／ｍｌの範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
16. オルソポックスウイルスを回収する工程の前に、
    １）パッケージング細胞膜を破壊し、かつ
    ２）工程１）で得られる混合物を少なくとも１時間インキュベートし、予め添加された単数または複数のヌクレアーゼにより、パッケージング細胞から放出された核酸を分解する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
17. パッケージング細胞膜を破壊する工程が、高速ホモジナイザーを用いてまたは超音波処理によって行われる、請求項１６に記載の方法。
18. 陰イオン交換吸着剤が、清澄化工程で用いられるフィルターの孔径よりも大きな直径を有するビーズ型基質に存在する、請求項２または請求項３に記載の方法。
19. 陰イオン交換吸着剤が、８μｍよりも大きな直径を有するビーズ型基質に存在する、請求項１８に記載の方法。
20. 陰イオン交換吸着剤の官能基が、ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）、およびトリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
21. 清澄化工程が、深層濾過により行われる、請求項２または請求項３に記載の方法。
22. 深層濾過が、孔径８μｍのフィルターと孔径５μｍのフィルターを組み合わせて行われる、請求項２１に記載の方法。
23. 濃縮工程が、０．０９ないし０．１５μｍの孔径を有するフィルターを用いる精密濾過により行われる、請求項２または請求項３に記載の方法。
24. 透析濾過工程が、０．０９ないし０．１５μｍの孔径を有するフィルターを用いて行われる、請求項２または請求項３に記載の方法。
25. １．ゲル濾過工程；および
    ２．透析濾過工程を
    さらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
26. 工程ｆ）で用いられる一価の塩がＮａＣｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
27. 工程ｆ）で用いられる一価の塩の濃度が、５０ないし１５０ｍＭの範囲である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記オルソポックスウイルスがワクシニアウイルスまたは改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。

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