JP5845493B2 - ｍｉＲＮＡ導入による新規ｈｉＰＳＣ作製法 - Google Patents

Description

本発明は、新規のｓｍａｌｌ ＲＮＡ、多能性幹細胞誘導剤、悪性腫瘍治療薬、または多能性幹細胞等に関する。

ｉＰＳ細胞の作成技術は、近年の医療業界で特に注目されている分野である。代表的なｉＰＳ細胞の作成技術としては、特許文献１に記載の方法が挙げられる。この文献には、４つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ）を細胞に導入することでｉＰＳ細胞を作成したことが記載されている。この技術が開発された頃から、ｉＰＳ細胞に関連する研究成果の報告数は急速に増えている。例えば、特許文献２には、３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２）と、１つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−372等）を細胞に導入することでｉＰＳ細胞を作成したことが記載されている。非特許文献１には、上記の４つまたは３つの遺伝子を導入する場合にｉＰＳ化させる細胞のｐ５３遺伝子を欠損させておくと、ｉＰＳ細胞の作成効率が上昇したことが記載されている。非特許文献２には、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのクラスター（ｍｉＲ−３０２ａ〜ｍｉＲ−３０２ｄ）を導入することで、癌細胞からｉＰＳ細胞を作成したことが記載されている。

一方で、製薬会社が近年特に資金を投入している分野は、癌分野である。癌はメカニズムが複雑で不明な点が多く、他の疾患に比べて有効な治療薬が少ない。そのため、この分野の新規の治療薬の開発が待たれている。本願発明者らは非特許文献３において、癌のバイオマーカーとしてｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを適用できることを報告している。また非特許文献４において、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現はＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡと関連しており、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡに対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡによってｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現量が減少することを報告している。

国際公開第２００７／０６９６６６号 国際公開第２００９／０７５１１９号

'Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.' Hong et al., Nature. 2009 Aug 27;460(7259):1132-5. Epub 2009 Aug 9. 'Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state.' Lin et al., RNA. 2008 Oct;14(10):2115-24. Epub 2008 Aug 28. 'A novel biomarker TERT mRNA is applicable for early detection of hepatoma.' Miura et al., BMC Gastroenterol. 2010 May 18;10:46. 'A noncoding RNA gene on chromosome 10p15.3 may function upstream of hTERT.' Miura et al., BMC Mol Biol. 2009 Feb 2;10:5.

しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
上記文献においてｉＰＳ細胞の作成方法が徐々に明らかになってきているが、より効率的に、より高品質のｉＰＳ細胞を開発するには、新しい作成方法を明らかにし、ｉＰＳ細胞に関する情報を蓄積していく必要があった。

個々の文献について見てみると、特許文献１では癌原遺伝子であるｃ−Ｍｙｃを使用しているため、ｉＰＳ細胞が癌化するリスクを秘めていた。特許文献２ではｃ−Ｍｙｃを使用していないが、遺伝子３つとｍｉＲＮＡ１つを細胞に導入させる工程は、複雑であり効率的な作成方法とはいえなかった。非特許文献１ではｃ−Ｍｙｃを使用していないが、癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子を欠損させているので、細胞の癌化や不安定化等のリスクを負っていた。非特許文献２は、ｍｉＲ−３０２のクラスターを使用しているが、ｍｉＲ−３０２は腫瘍抑制因子であるＰＴＥＮ（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10）を標的とするｍｉＲＮＡであることが報告されている（Poliseno et al., Sci Signal. 2010 Apr 13;3(117):ra29）。そのため細胞の癌化のリスクを負っていた。

一方で、上記文献において悪性腫瘍のメカニズムが徐々に明らかになってきているが、それだけでは十分とはいえず、新規の医薬品または治療戦略立案のためには、新しい抗悪性腫瘍物質を明らかにし、悪性腫瘍に関する情報を蓄積していく必要があった。

非特許文献３および４では、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡが癌形成に関連していることと、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡに対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡによってｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡが減少することが記載されているが、癌に治療効果のある物質は何ら明らかにされていない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、多能性幹細胞を誘導する新規の化合物を提供することを目的とする。または、未分化細胞マーカー発現調節剤を提供することを目的とする。また別の目的は、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤を提供することである。また他の目的は、新規の悪性腫瘍治療薬を提供することである。また他の目的は、新規の多能性幹細胞を提供することである。

本発明によれば、配列番号４１の塩基配列を含む１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤が提供される。

この多能性幹細胞誘導剤は、後述する実施例で、細胞を多能性幹細胞へ誘導することが実証されている１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、この多能性幹細胞誘導剤を用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導することができる。

また本発明によれば、配列番号４１の塩基配列を含む、ｓｍａｌｌ ＲＮＡを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤が提供される。

この多能性幹細胞誘導剤は、後述する実施例で細胞を多能性幹細胞へ誘導することが実証されているｓｍａｌｌ ＲＮＡを含有する。そのため、この多能性幹細胞誘導剤を用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導することができる。

また本発明によれば、配列番号４３の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤が提供される。

この多能性幹細胞誘導剤は、後述する実施例で細胞を多能性幹細胞へ誘導することが実証されているポリヌクレオチドを含有する。そのため、この多能性幹細胞誘導剤を用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導することができる。

また本発明によれば、配列番号４１の塩基配列を含む、１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有し、未分化細胞マーカーの発現を調節する、未分化細胞マーカー発現調節剤が提供される。

この未分化細胞マーカー発現調節剤は、後述する実施例で細胞内の未分化細胞マーカーを促進または抑制することが実証されている１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、この未分化細胞マーカー発現調節剤を用いれば、細胞内の未分化細胞マーカーの発現量を調節することができる。

また本発明によれば、配列番号４１の塩基配列を含む、１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有し、多能性幹細胞におけるｐ５３の発現量を促進する、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤が提供される。

このｐ５３発現促進剤は、後述する実施例で多能性幹細胞におけるｐ５３の発現量を促進することが実証されている１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、このｐ５３発現促進剤を用いれば、多能性幹細胞におけるｐ５３の発現量を促進することができる。

また本発明によれば、配列番号４１の塩基配列を含む、１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法が提供される。

この生産方法は、後述する実施例で多能性幹細胞を作成するために利用できることが実証されている。そのため、この生産方法を用いれば、多能性幹細胞を生産することができる。

また本発明によれば、配列番４１の塩基配列を含む、１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有する、悪性腫瘍の治療薬が提供される。

この悪性腫瘍の治療薬は、後述する実施例で悪性腫瘍を抑制することが実証されている１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、この悪性腫瘍の治療薬を用いれば、悪性腫瘍の治療をすることができる。

また本発明によれば、配列番号４１の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。

このベクターを利用すれば、配列番号４１を含む、１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを発現させることができる。そのため、このベクターを用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導、未分化細胞マーカーの発現量の調節、多能性幹細胞のｐ５３の発現量を促進、または癌悪性腫瘍の治療をするための物質を生産することができる。

また本発明によれば、配列番号４１の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、多能性幹細胞誘導用、未分化細胞マーカー発現調節用、多能性幹細胞のｐ５３発現促進用、または悪性腫瘍の治療用のキットが提供される。

このキットを利用すれば、後述する実施例において、細胞を多能性幹細胞へ誘導すること、未分化細胞マーカーの発現量を調節すること、多能性幹細胞におけるｐ５３の発現量を促進すること、または悪性腫瘍を抑制することが実証されている１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを簡易に使用することができる。そのため、このキットを用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導、未分化細胞マーカーの発現量の調節、多能性幹細胞のｐ５３の発現量を促進、または悪性腫瘍の治療をすることができる。

なお、上記のいずれかの多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、ｐ５３発現促進剤、多能性幹細胞の生産方法、悪性腫瘍の治療薬、ベクター、およびキットにおいて、配列番号４１の塩基配列の１〜３個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていたとしてもよい。または、配列番号４２の塩基配列の１〜５個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていたとしてもよい。または、配列番号４３の塩基配列の１〜４個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていたとしてもよい。

本発明によれば、多能性幹細胞を誘導する新規の化合物が得られる。または、未分化細胞マーカーの発現を調節する新規の化合物が得られる。または、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤が得られる。または、新規の悪性腫瘍治療薬が得られる。

図１Ａは、ＲＧＭ２４９の２次元構造を表した図である。 図１Ｂは、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡとＲＧＭ２４９ｍ−１ ｓｈＲＮＡの２次元構造を表した図である。 図１Ｃは、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡ皮下注射後の腫瘍ボリュームの変化を調査した結果である。 図１Ｄは、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡプラスミド等を皮下注射した際の、腫瘍ボリュームの目視的な観察結果である。 図２Ａは、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡプラスミド等を皮下注射から３５日後に、腫瘍で発現している遺伝子の発現抑制効果を調査した結果である。 図２Ｂは、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡプラスミド等を静脈注射から２８日後に、腫瘍で発現している遺伝子の発現抑制効果を調査した結果である。 図３Ａは、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡと、内部の３つのｍｉＲＮＡに相当する部位を表した結果である。 図３Ｂは、３つのｍｉＲＮＡの２次構造を表した図である。 図３Ｃは、３つのｍｉＲＮＡと、３つのｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖との配列を比較した結果である。 図３Ｄは、３つのｓｉＲＮＡをＨＭＶ−Ｉへトランスフェクションした後の、癌細胞増殖の抑制効果を調査した結果である。 図３Ｅは、３ｓｉＲＮＡ混合物を同時にトランスフェクションしたＨＭＶ−ＩからＲＮＡ抽出を行い、ｍｉＲ−４７、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１９７の発現レベルを調査した結果である。 図３Ｆは、３ｓｉＲＮＡ混合物による形質転換体の転写発現プロファイリングを、癌、多分化能、幹細胞性に関連する遺伝子について評価した結果である。 図４は、３ｓｉＲＮＡ混合物＋ＤＤＳの皮下投与による、ＨＭＶ−Ｉ細胞の増殖性の抑制を調査した結果である。 図５Ａは、評価した腫瘍のあるパーツ表した図である。 図５Ｂは、３ｓｉＲＮＡ混合物による、ｍｉＲ−４７、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１９７それぞれの発現抑制効果を評価した結果である。 図５Ｃは、ｓｉＲＮＡで処理した腫瘍を顕微鏡で観察した写真である。 図５Ｄは、３ｓｉＲＮＡ混合物を投与した場合の腫瘍、分化、多能性の関連遺伝子の転写レベルを調査した結果である。 図６Ａは、ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡを２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションした後、顕微鏡で観察した写真である。 図６Ｂは、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄの２次構造を表した図である。 図６Ｃは、ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした２９３ＦＴ細胞を、顕微鏡で免疫組織化学的に観察した写真である。 図６Ｄは、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄをＨＴ１０８０細胞にウイルスベクターで感染させ、強制発現させた後、免疫組織科学的試験で未分化マーカーの発現量を観察した結果である。 図６Ｅは、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄをＴ９８Ｇ細胞にウイルスベクターで感染させ、強制発現させた後、免疫組織科学的試験で未分化マーカーの発現量を観察した結果である。 図６Ｆは、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄをＰＫ−４５ｐ細胞にウイルスベクターで感染させ、強制発現させた後、免疫組織科学的試験で未分化マーカーの発現量を観察した結果である。 図７Ａは、ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡとｈｓａ−ｍｉｒ−５２０を用いて作成したｉＰＳ細胞における各種遺伝子の転写量を調査した結果である。 図７Ｂは、ｈｉＰＳＣと２９３ＦＴ細胞におけるｍｉＲＮＡ−１９７とｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄの、ｍｉＲＮＡ発現レベルの関連性をツーステップリアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ（ｎ＝５）で評価した結果である。 図８Ａは、293FT細胞へのhas-mir-520dのウイルス導入後に出現した浮遊細胞集団を顕微鏡的に評価した結果である。 図８Ｂは、520d-293FTの幹性化転換を免疫細胞化学に基づき確認した結果である。 図８Ｃは、520d-293FTのGFP陽性とNANOG陽性状態を調査した結果である。 図９Ａは、細胞のp53、hTERT等の発現量をRT-PCRで調査した結果である。 図９Ｂは、細胞のp53、hTERT等の発現量をウエスタンブロットで調査した結果である。 図９Ｃは、細胞のｍｉＲＮＡの発現量を調査した結果である。 図９Ｄは、has-mir-520dの過剰発現時の細胞のｍｉＲＮＡの発現量を調査した結果である。 図１０Ａは、293FT、mock-293FT、520d-293FTの細胞周期解析の結果である。 図１０Ｂは、293FT、mock-293FT、520d-293FTにおけるDNMT 1、HDAC、Sin3A、MBD3の発現量比を調査した結果である。 図１１Ａは、520d-HLFの形態学的変化を調査した結果である。 図１１Ｂは、520d-HLFにおける各種mRNAの発現量比を調査した結果である。 図１１Ｃは、mock-HLF、520d-HLFの浸潤する性質を調査した結果である。 図１１Ｄは、HLF、mock-HLF、520d-HLFにおける各種蛋白質の発現量を、ウエスタンブロットで調査した結果である。 図１２Ａは、mock-HLF、520d-HLFの細胞周期解析の結果である。 図１２Ｂは、HLF、hiPSC、520d-HLFにおける各種mRNAの発現量比を調査した結果である。 図１３は、HLF、mock-HLF、520d-HLFにおけるDNMT 1、HDAC、Sin3A、MBD3の発現量比を調査した結果である。 図１４Ａは、腫瘍形成を示す写真である。 図１４Ｂは、白色結節を示す写真である。 図１４Ｃは、正常肝組織へと転換したことを示す写真である。 図１４Ｄは、腺腫様過形成を示す写真である。 図１４Ｅは、生成した奇形腫と肝組織を示す写真である。 図１５は、520d-HLFの分化を調査した結果である。 図１６は、520d-HLFを骨分化誘導した結果である。 図１７は、has-mir-520dウイルスが感染したHuh7の形態学的変化等を調査した結果である。 図１８は、has-mir-520dウイルスが感染したT98Gの形態学的変化等を調査した結果である。 図１９は、has-mir-520dウイルスが感染したPK-9の形態学的変化等を調査した結果である。 図２０は、has-mir-520dウイルスが感染したHT1080の形態学的変化等を調査した結果である。 図２１は、siRNA生成ウイルス感染後のHMV-1において、MTT assayを実施した結果である。 図２２は、siRNA生成ウイルス感染後のHMV-1の蛍光顕微鏡写真と増殖曲線である。 図２３は、siRNA生成ウイルス感染後のHMV-1において、colony formation assayを実施した結果である。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については、繰り返しの煩雑を避けるために適宜説明を省略する。

（１）特定の塩基配列を含むポリヌクレオチド
本発明の一実施形態は、配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドである。この１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、後述する実施例で細胞を多能性幹細胞に誘導することが示唆されている。そのため、この１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。

また、この１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、後述する実施例で未分化細胞マーカーの発現の促進または抑制をすること、多能性幹細胞におけるｐ５３の発現量を促進すること、または悪性腫瘍の抑制に効果があることが示唆されている。そのため、この１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。または、この１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、多能性幹細胞のｐ５３の発現量を促進するために好適に使用できる。または、この１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。

他の実施形態は、配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤である。ここで、配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果は、上述したとおりである。そのため、この多能性幹細胞誘導剤は、細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。または、この多能性幹細胞誘導剤は、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。または、この多能性幹細胞誘導剤は、多能性幹細胞のｐ５３の発現量を促進するために好適に使用できる。または、この多能性幹細胞誘導剤は、悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。

他の実施形態は、配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有する、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤、または悪性腫瘍の治療薬である。ここで、配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果は、上述したとおりである。そのため、この未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤、または悪性腫瘍の治療薬は、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。または、それらは細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。または、それらは多能性幹細胞のｐ５３の発現量を促進するために好適に使用できる。または、それらは悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。

他の実施形態は、配列番号４１の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有する、ｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。ここで、配列番号４１の塩基配列を含むポリヌクレオチドの有する効果は、上記の配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果と同様である。そのため、このｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。または、このｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。または、このｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、多能性幹細胞のｐ５３の発現量を促進するために好適に使用できる。または、このｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。

他の実施形態は、配列番号４１の塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有する、ベクターである。このベクターは、上記の配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドを発現、又は生産するために好適に使用できる。そのため、このベクターは上記の配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の用途（多能性幹細胞誘導剤、治療薬等）に使用できる。

またこのベクターは、さらに、配列番号４２の塩基配列に相補的な塩基配列を含んでいてもよい。この場合、配列番号４１の塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、塩基対を形成可能なポリヌクレオチドを発現、又は生産するために好適に使用できる。また、配列番号４１の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現、又は生産するために好適に使用できる。

上記の配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、さらに、配列番号４２の塩基配列を含んでいてもよい。この場合、上記の配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドが発揮する、ＲＮＡｉまたはｍｉＲＮＡの作用効率が上昇すると考えられる。なぜならば、配列番号４１の塩基配列と配列番号４２の塩基配列とが塩基対を形成することで、ＲＩＳＣに取り込まれやすくなると考えられるためである。また、上記の、１または複数本鎖が１本鎖である場合には、ｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの構造をとることができる。また、配列番号４２の塩基配列を含む場合、上記の配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドがより安定化されると考えられる。また、上記の配列番号４１の塩基配列を含む、１または複数本鎖のポリヌクレオチドが、配列番号４１の塩基配列からなるＲＮＡ鎖の相補鎖を含んでいても同様の効果が得られると考えられる。さらには、配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、配列番号４３の塩基配列を含む１本鎖のポリヌクレオチドであってもよい。この場合、ｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして好適に使用できる。

他の実施形態は、配列番号４３の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、後述する実施例で細胞を多能性幹細胞に誘導すること、未分化細胞マーカーの発現の促進または抑制をすること、多能性幹細胞におけるｐ５３の発現量を促進すること、または悪性腫瘍の抑制に効果があることが示唆されている。そのため、このポリヌクレオチドは、多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤、悪性腫瘍の治療薬の用途に使用できる。また、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはベクターとしても使用可能である。

また、配列番号１、２、３、８、または４４〜４７の１つ以上の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、上述したような配列番号４１の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果と、同様の効果を発揮しうることが、後述する実施例で示唆されている。そのため、多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤、悪性腫瘍の治療薬、ｓｉＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）もしくはｓｈＲＮＡ（またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）、またはベクターの用途に使用できる。なお、配列番号１、２、３、８、または４４〜４７の１つ以上の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、それらの相補鎖、またはそれぞれ配列番号４、５、６、９、または４８〜５１の１つ以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドをさらに含んでいても良い。また、配列番号８の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、配列番号１０の塩基配列を含む１本鎖のポリヌクレオチドであってもよい。また、配列番号４４〜４７の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号５２〜５５もしくはそれぞれ５６〜５９の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドであってもよい。

これと同様のことは、配列番号７の塩基配列を含むＲＮＡ鎖を、ダイサーで処理して得られるＲＮＡ鎖に対して相補的な塩基配列（以下、「ダイサー処理後の相補的な塩基配列」と称することもある）を含む、１または複数本鎖のポリヌクレオチドでもいえる。即ち、ダイサー処理後の相補的な塩基配列を含む、１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤、悪性腫瘍の治療薬、ｓｉＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）もしくはｓｈＲＮＡ（またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）、またはベクターの用途に使用できる。この１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、ダイサー処理後の相補的な塩基配列に相補的な配列をさらに含んでいても良い。また、ダイサー処理後の相補的な塩基配列は、配列番号１１、１２、および１３からなる群から選ばれる１種以上の塩基配列を含むＲＮＡ鎖に対して、ＲＮＡｉ作用を有する１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドであっても良い。

これと同様のことは、配列番号７の塩基配列を含むＲＮＡ鎖に対してＲＮＡｉ作用を有する１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドでもいえる。即ち、配列番号７の塩基配列を含むＲＮＡ鎖に対してＲＮＡｉ作用を有する１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドは、多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤、悪性腫瘍の治療薬、ｓｉＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）もしくはｓｈＲＮＡ（またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）、またはベクターの用途に使用できる。

（２）実施形態に係るポリヌクレオチドが導入された細胞
他の実施形態は、上記のいずれかの１または複数本鎖のポリヌクレオチド、または上記のいずれかのベクターが導入された細胞である。この細胞は多能性が誘導されているため、再生医療等の医療材料や研究材料として好適に使用できる。

またこの細胞は、外来性のｃ−Ｍｙｃが無く、内在性のｐ５３が発現しているため、悪性腫瘍化のリスクが低い。このｐ５３の発現量は、例えば、ｈｉＰＳＣのＨＰＳ０００２：２５３Ｇ１株のｐ５３発現量に対して、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0、5.0、10、100、または1000倍であるが、それらに限定されない。またこの発現量は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。また、ｐ５３の発現量の測定方法は、測定精度および簡便性の面からリアルタイムＰＣＲが好ましい。詳しい測定条件については、後述する実施例におけるリアルタイムＰＣＲの測定条件を用いることができる。

（３）多能性幹細胞及びその生産方法
他の実施形態は、上記のいずれかの１または複数本鎖のポリヌクレオチドを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法である。又は、上記のいずれかのベクターを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法である。この方法を適切に用いれば、多能性幹細胞を生産することができる。なおポリヌクレオチドまたはベクターの細胞への導入、および培養方法は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルス（アデノウイルス、レトロウイルス、ＨＩＶ等）を用いた方法、またはマイクロインジェクションなどを使用できる［改訂第４版 新 遺伝子工学ハンドブック， 羊土社（２００３）：１５２−１７９．］。また薬剤耐性やセルソーター等を利用して、導入された細胞のみを選択することができる。培地は、例えば、霊長類ES細胞用培地（コスモ・バイオ社）や通常のヒト細胞用の培地（例えば、DMEMやRPMIベースの培地）等を使用できる。一般的にＥＳ細胞を樹立する際にはフィーダー細胞と共培養することが多いが、本実施形態の多能性幹細胞はフィーダー細胞の非存在下でも樹立可能である。フィーダー細胞は、例えばEuropean Collection of Cell Culturesより入手できる。さらに、本実施形態の多能性幹細胞は、いずれもF-12 HAM[DMEM(15mM HEPES＋１ｍM Sodium Pyruvate+pyridoxine+NaHCO3+5mML-glutamine)], RPMI-1640+L-glutamine, DMEM+high glucose+L-glutamine+0.1mM NEAA および REPROSTEM(REPROCell社)：bFGF 3-10ng/mlからなる群から選ばれる１種以上の培地で３７℃、５％ ＣＯ2、１０％ ＦＢＳの条件で培養可能である。そのため、いわゆるｉＰＳ細胞の有する培養上の困難性を克服することにも成功している。

他の実施形態は、上記生産方法で得られる多能性幹細胞である。または、ＨＰＳ０００２：２５３Ｇ１株に比べて内在性のｐ５３の発現量が増大している、多能性幹細胞である。または、上記のいずれかの１または複数本鎖のポリヌクレオチドの発現量が増大している、多能性幹細胞である。これらの細胞は、内在性のｐ５３が発現しているため、悪性腫瘍化のリスクが低い。

（４）実施形態に係るポリヌクレオチドに関連する配列
ここで、上記の配列番号１〜１０、および４１〜５９の塩基配列は、ある程度であれば変異を受けていてもよい。そのような変異を有している塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。変異型の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、人工的に作成することが可能であり、その場合には改変型の塩基配列を含むポリヌクレオチドと呼ぶこともできる。

なお、ＲＮＡｉやｍｉＲＮＡ等の用途で用いる場合には、配列番号４〜６、９、４２、４８〜５１、および５６〜５９の塩基配列の変異は、配列番号１〜３、８、４１、４４〜４７、および５２〜５５の塩基配列の変異より大きくても、その機能に変動が生じにくい。なぜならば、配列番号１〜３、８、４１、４４〜４７、および５２〜５５の塩基配列は、ＲＮＡｉやｍｉＲＮＡ等の機能を特徴付ける重要な配列であるが、一方で、配列番号４〜６、９、４２、４８〜５１、および５６〜５９の塩基配列は補助的な配列なためである。

また、上記の配列番号１〜１０、および４１〜５９の塩基配列は、それぞれの塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であっても良い。そのような塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。ここで上記「１もしくは数個」は好ましくは１０個以下であり、より好ましくは５個以下であり、より好ましくは４個以下であり、より好ましくは３個以下であり、より好ましくは２個以下であり、さらに好ましくは１個である。なぜならば、上記「１もしくは数個」が少ないほど、野生型に近い特性を有していることになるからである。なお、上記「付加」には挿入の概念を含む。

また、上記の配列番号１〜１０、および４１〜５９の塩基配列は、それぞれの塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列であっても良い。そのような塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。ここで上記「８０％以上」は好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。なぜならば、上記「８０％以上」が大きいほど、野生型に近い特性を有していることになるからである。

また、上記の配列番号１〜１０、および４１〜５９の塩基配列は、それぞれの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであっても良い。そのような塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む１または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。

本明細書において「相同性」とは、２つもしくは複数間の塩基配列の同一の塩基数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定したものである。割合を算定する前には、比較する塩基配列群の塩基配列を整列させ、同一の割合を最大にするために必要である場合は塩基配列の一部に間隙を導入する。また、最適に整列した状態において、オーバーラップする塩基を含めた全塩基に対する、同一の塩基数の割合を意味する。整列のための方法、割合の算定方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られており、一般的な配列分析プログラム（例えば、GENETYX、GeneChip Sequence Analysisなど）を使用して測定することができる。

本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、例えば（１）洗浄のための低イオン強度と高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いる、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、および７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いる、または（３）４２℃において５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸と、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での洗浄および５５℃のホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣにてストリンジェントな洗浄を含む条件であっても良い。また中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中において、３７℃で一晩インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中３７〜５０℃でのフィルターの洗浄のような条件である。なお、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者によって容易に決定でき、一般的にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存する。一般に、長いプローブは適当なアニーリングのために高温を必要とし、短いプローブは低温を必要とする。また一般に、ストリンジェンシーは塩濃度に逆比例する。

通常、遺伝子工学や生命工学の分野では、ポリヌクレオチド中の塩基がある程度の変異や欠失等をしていても、野生型と同様の機能が保たれることが知られている。また、２つのポリヌクレオチド間での塩基のミスマッチについてもある程度許容されることが知られている。後述する実施例においても、実際にポリヌクレオチド中の塩基の欠失や、ミスマッチが存在する。例えば、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡに１塩基の欠失があっても、悪性腫瘍抑制効果がみられている（図１Ｂ、図１Ｄ）。このことは、ある程度の欠失等が生じても、野生型と同様の機能が保たれることを示唆している。ｍｉＲ−４７ ｓｉＲＮＡの配列をみると、ガイド鎖とパッセンジャー鎖の間に３つのミスマッチが存在している（図３Ｂ）。ｍｉＲ−１０１ ｓｉＲＮＡの配列をみると、ガイド鎖とパッセンジャー鎖間に１つのミスマッチが存在している（図３Ｂ）。ｍｉＲ−４７とｍｉＲ−４７ ｓｉＲＮＡのガイド鎖の間に３つのミスマッチが存在している（図３Ｃ）。これらのことは、ＲＮＡｉまたはｍｉＲＮＡの機能は、２本鎖がある程度ミスマッチを有していても生じることを示唆している。

（５）実施形態に係るポリヌクレオチドに関連するその他の特徴
本明細書において「多能性幹細胞」とは、多能性を有しており、様々な細胞へ分化することができる細胞である。例えば、国際公開第２００７／０６９６６６号や、文献［Hong et al., Nature. 2009 Aug 27;460(7259):1132-5. Epub 2009 Aug 9.］に生産方法や特性の例が記載されている。また、多能性幹細胞は当業者であれば認識できるが、例えば、ヒト人工多能性幹細胞であるhiPSC（HPS0002 253G1）に比べて、いずれかの未分化マーカーを同程度かそれ以上発現している細胞を含む。

本明細書において「未分化細胞マーカー」とは、未分化の細胞で特異的に発現しているＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖、または蛋白質等の化合物の総称である。例えば、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＰＲＯＭ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−１、ＡＬＰ、ｅＲａｓ、Ｅｓｇ１、Ｅｃａｔ１、Ｆｇｆ４、Ｇｄｆ３、ＲＥＸ−１などが挙げられる。多能性幹細胞マーカーということもある。

本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）やｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、短鎖または長鎖の１または複数本鎖ＲＮＡ等によって、標的遺伝子やｍＲＮＡ等の機能が抑制される現象である。一般的に、この抑制は配列特異的であり、様々な生物種に存在する。ｓｉＲＮＡを用いた場合の、典型的な哺乳類におけるＲＮＡｉのメカニズムは以下の通りである。まず、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入すると、ｓｉＲＮＡの一本鎖化が起こり、その後ＲＩＳＣ（RNA-induced Silencing Complex）を形成する。ＲＩＳＣは取り込まれた１本鎖ＲＮＡをガイド分子として、この１本鎖ＲＮＡと相補性の高い配列を持つ標的ＲＮＡ鎖を認識する。標的ＲＮＡ鎖はＲＩＳＣ内のＡＧＯ２によって、ｓｉＲＮＡの中心部分で切断される。その後、切断された標的ＲＮＡ鎖は分解される。以上が典型的なメカニズムであるが、その他に、生体内のｍｉＲＮＡを標的として抑制した例が文献［Krutzfeldt et al., Nucleic Acids Res. 2007;35(9):2885-92. Epub 2007 Apr 16.］に記載されている。なお、本明細書において「ＲＮＡｉ作用を有する分子」は、ＲＮＡｉ作用を引き起こすことができる分子であり、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等を含む。

本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡｉを引き起こす２本鎖のポリヌクレオチドである。一般的にｓｉＲＮＡの２本鎖はガイド鎖とパッセンジャー鎖に分けることができ、ガイド鎖がＲＩＳＣに取り込まれる。ＲＩＳＣに取り込まれたガイド鎖は、標的ＲＮＡを認識するために使われる。ＲＮＡｉ研究では主に人工的に作成したものが使用されるが、生体内において内在的に存在するものも知られている。

本明細書において「ｍｉＲＮＡ（microＲＮＡ）」とは、ｓｉＲＮＡと類似の機能を有しているポリヌクレオチドであり、標的ＲＮＡ鎖の翻訳抑制や分解をすることが知られている。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの前駆体である。ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡとの違いは、一般的に生成経路と、詳細なメカニズムにある。生体内におけるｍｉＲＮＡの典型的な生成経路は以下の通りである。まず、ｍｉＲＮＡ遺伝子から長いｐｒｉ−ＲＮＡ（primary ｍｉＲＮＡ）として転写される。このｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの中には、後にｍｉＲＮＡになる配列が含まれており、その部分はヘアピン構造をとっている。このヘアピン構造の根本をＤｒｏｓｈａが切断する。切り出されたヘアピンはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる。このｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはＥｘｐｏｒｔｉｎ−５によって細胞質に運ばれる。次に細胞質においてＤｉｃｅｒがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを切断することで２本鎖のｍｉＲＮＡができ、さらにこれが１本鎖化してＲＩＳＣを形成する。この１本鎖ＲＮＡがガイド分子として働いて、標的ＲＮＡ鎖を認識し、切断または翻訳抑制する。以上が典型的なｍｉＲＮＡの生成経路である。なお、本明細書において「ｍｉＲＮＡ作用を有する分子」は、ｍｉＲＮＡ作用を引き起こすことができる分子であり、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ等を含む。

本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、ヘアピン状に折りたたまれた構造（ヘアピン様構造）を形成可能な１本鎖のポリヌクレオチドであり、ＲＮＡｉを誘導する機能を有する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと類似の構造をしており、通常細胞内ではＤｉｃｅｒによって切断され、ｓｉＲＮＡが切り出される。このｓｉＲＮＡによって標的ＲＮＡの切断が生じることが知られている。

本明細書において「ｓｍａｌｌ ＲＮＡ」とは、比較的小さいＲＮＡをいい、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、１または複数本鎖の低分子ＲＮＡなどを挙げることができるが、それらに限定されない。塩基数は、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、または100塩基であるが、それらに限定されない。またこの塩基数は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。

本明細書において「ダイサー（Dicer）」は、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡ等の前駆体を切断して、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡ等を切りだす機能を有している酵素を含む。例えば、ｄｓＲＮＡをｓｉＲＮＡへ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡへ、ｓｈＲＮＡをｓｉＲＮＡへと導くことができる。また、ダイサーは上記以外のいくつかの機能を有していることが知られている。

上記の１または複数本鎖は、１本鎖または２本鎖であってもよい。この場合、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡのメカニズムを利用することができる。

上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、いずれかを個々で使用してもよいが、２つ以上を併用してもよい。そのような場合でも、多能性幹細胞誘導剤、未分化細胞マーカー発現調節剤、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤、または悪性腫瘍の治療薬として好適に使用できる。なお２つ以上を併用する場合の併用割合は特に限定しない。

上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉ作用を有していてもよい。この場合、標的とするＲＮＡ鎖をＲＮＡｉ作用によって分解することが可能である。

上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、ｓｍａｌｌ ＲＮＡであってもよい。この場合、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低い。インターフェロン応答とは、一般的に細胞が２重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を感知することによって抗ウイルス状態になる現象として知られている。長鎖のｄｓＲＮＡを細胞に導入した場合に、ｄｓＲＮＡ応答性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）が活性化し、インターフェロン反応が誘導されることが報告されている（Gil et al., Apoptosis. 2000 Apr;5(2):107-14.）。その結果、非特異的な遺伝子発現の抑制やアポトーシスが誘導されるといわれている。

上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、または500ヌクレオチドであるが、それらに限定されない。この数は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。この数が１５以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、この数が１００以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。この現象は、ヌクレオチド数が少ないほど生じにくいと考えられる。

上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、１本鎖の場合にはｓｈＲＮＡであってもよく、２本鎖の場合にはｓｉＲＮＡであってもよい。この場合、標的とするＲＮＡ鎖をＲＮＡｉ作用によって分解することが可能である。また、塩基対を形成しているため、ＲＩＳＣに取り込まれやすくなり効率的にＲＮＡｉが生じる（Martinez et al., Cell. 2002 Sep 6;110(5):563-74.）。また、２本鎖の場合には、ｍｉＲＮＡであっても良い。この場合、標的とするＲＮＡ鎖をｍｉＲＮＡ作用によってサイレンシングすることが可能である。また、１本鎖でｓｈＲＮＡのようなへアピン構造を有していない場合であってもよい。そのような構造でも、標的ＲＮＡ鎖の発現抑制を奏することが文献［Hohjoh et al., FEBS Lett. 2002 Jun 19;521(1-3):195-9.］に記載されている。

また、上記ｓｈＲＮＡは３５以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。３５以上であれば、ｓｈＲＮＡに特有のへアピン様構造を精度よく形成できる可能性が高まる。また、上記ｓｈＲＮＡは１００以下のヌクレオチドから構成されていてもよい。１００以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。但し、一般的にｓｈＲＮＡと構造および機能が類似しているｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの多くが、１００ヌクレオチド程度またはそれ以上の長さを有していることから、ｓｈＲＮＡの長さは必ずしも１００ヌクレオチド以下でなくても、ｓｈＲＮＡとして機能できると考えられる。また、文献［Lin et al., RNA. 2008 Oct;14(10):2115-24. Epub 2008 Aug 28.］には、人工的にｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを４つ結合させた大きな分子でも機能できることが示唆されている。そのため、この数はｓｈＲＮＡとして機能できれば限定されず、例えば、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、または500ヌクレオチドである。またこの数は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。また、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡも同様の理由から、ｓｈＲＮＡと同程度の数のヌクレオチドを有していても良い。

また、上記ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのガイド鎖は１５以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。１５以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、それらガイド鎖は４０以下のヌクレオチドから構成されていてもよい。４０以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。この数は、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または40ヌクレオチドであるが、それらに限定されない。またこの数は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。

上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、１〜５ヌクレオチドからなるオーバーハングを含んでいてもよい。この場合、ＲＮＡｉの効率が上昇すると考えられる。この数は、例えば５、４、３、２、または１ヌクレオチドであるが、それらに限定されない。またこの数は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。

上記のベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、ＨＩＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス由来のベクター、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、pSUPER（OligoEngine社）、BLOCK-it Inducible H1 RNAi Entry Vector（インビトロジェン社）、pRNATin-H1.4/Lenti (GenScript, corp., NJ, USA)などを用いることができる。

上記の多能性幹細胞誘導剤は、体細胞を多能性幹細胞へ誘導する機能を有していてもよい。この場合、体細胞から多能性幹細胞を作成することができる。本明細書において「体細胞」とは、生殖細胞を除いた他の細胞のことで、皮膚由来の細胞、線維芽細胞等が含まれる。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において「多能性幹細胞誘導剤」とは、細胞を多能性幹細のような多能性を有している細胞に近づける作用を持った物質のことである。本明細書において「リプログラミング」とは細胞を多能性幹細のような多能性を有している細胞に近づける作用のことである。

上記の多能性幹細胞誘導剤は、悪性腫瘍細胞を多能性幹細胞へ誘導する誘導剤であってもよい。この場合、悪性腫瘍細胞から多能性幹細胞を作成することができる。本明細書において「悪性腫瘍」とは、正常な細胞が突然変異を起こして増殖を続けることで起こる疾患を含む。また、癌腫、肉腫を含む。悪性腫瘍は全身のあらゆる臓器や組織から生じ、悪性腫瘍細胞が増殖すると、かたまりとなって周囲の正常な組織に侵入し破壊することが知られている。癌は、例えば、肺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、胆道癌、乳癌、大腸癌、小腸癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、尿管癌、腎盂癌、尿管癌、陰茎癌、精巣癌、脳腫瘍、中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、頭頸部癌（口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、鼻腔・副鼻腔癌、唾液腺癌、甲状腺癌等）、グリオーマ、多形性膠芽腫、皮膚癌、メラノーマ、甲状腺癌、唾液腺癌、血液の癌、または悪性リンパ腫などを含む。

上記の多能性幹細胞誘導剤は、肝臓癌、膵臓癌、線維肉腫、多形性膠芽腫、メラノーマからなる群から選ばれる１種以上の悪性腫瘍の細胞を多能性幹細胞へ誘導する誘導剤であってもよい。この場合、それらの悪性腫瘍細胞から多能性幹細胞を作成することができる。悪性腫瘍細胞を多能性幹細胞へ誘導することはこれまでにほとんど報告されておらず、新しい革新的な悪性腫瘍の治療方法として期待できる。

上記の多能性幹細胞は、内在性のｐ５３を発現していてもよい。この場合、悪性腫瘍化が生じにくいと考えられる。なお、ｐ５３の発現量は、コントロール試料（例えば、ｐ５３ノックアウト細胞、正常細胞、またはそれらに由来する試料等）に比べて有意に高発現していることが好ましい。明細書において「有意に」とは、例えばコントロール群と被検査群との間の統計学的有意差をスチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定を使用して評価し、ｐ＜０．０５であるときを含む。本明細書において「コントロール群」とは、被検査群と異なる条件下に置かれた試料のことであり、当該技術分野において通常使用される範囲内の概念で表すことができる。

ｐ５３は一般的に悪性腫瘍抑制遺伝子に分類される遺伝子であり、ＤＮＡが損傷したときに活性化されて、細胞分裂の停止と損傷の修復を誘導する機能が知られている。一方で、ｐ５３をノックアウトやノックダウンさせると、ｉＰＳ細胞の作成効率が上昇することが報告されている（Zhao et al., Cell Stem Cell. 2008 Nov 6;3(5):475-9.、 Hong et al., Nature. 2009 Aug 27;460(7259):1132-5. Epub 2009 Aug 9.）。これらことは、ｐ５３による悪性腫瘍抑制とｉＰＳ細胞作成の効率化は、トレードオフの関係にあることを示している。また、ｐ５３を欠損したＥＳ細胞は染色体が不安定であることや、分化誘導に対して抵抗性を持つことが報告されている（Lin et al., Nat Cell Biol. 2005 Feb;7(2):165-71. Epub 2004 Dec 26.）。これは分化誘導後に未分化細胞が残存する可能性が高いことを意味している。そのため、再生医療においてｐ５３を欠損させた細胞を移植した場合に、悪性腫瘍形成のリスクが高まると考えられる。従って、この面からもｐ５３は細胞にとって重要な分子であることがわかる。

本明細書において「内在性」とは、被検物質が細胞の内部のメカニズムに由来して存在していることを表している。例えば、細胞内で恒常的に発現している蛋白質は、その発現した蛋白質に限っては内在性に含まれる。

上記の未分化細胞マーカー発現調節剤において、未分化細胞マーカーはＫｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＰＲＯＭ１からなる群から選ばれる１種以上の未分化細胞マーカーであってもよい。未分化細胞マーカーや各種蛋白質は、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）などの公知の方法を用いて検出することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ鎖を鋳型に逆転写を行い、生成されたｃＤＮＡに対してＰＣＲを行う方法である。なお、トータルＲＮＡは細胞からグアニジンチオシアネート法、市販の試薬またはキットを使用して抽出できる。細胞は、インビトロジェン株式会社、三光純薬株式会社、タカラバイオ株式会社等から購入できる。また未分化細胞マーカーや各種蛋白質は、さらにリアルタイムＰＣＲと組み合わせて検出することもできる。そのような方法は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲによって増幅する核酸をリアルタイムでモニタリングする方法である。例えば、文献［原理からよくわかるリアルタイムＰＣＲ実験ガイド、羊土社、２００７／１２］に記載の手順によって行うことができる。上記モニタリングの方法としては、インターカレーション法、ハイブリダイゼーション法、ＬＵＸ（Light Upon eXtensyon）法などが挙げられる。インターカレーション法の典型的な方法は、ＳＹＢＲ(r) Ｇｒｅｅｎ Ｉなどの蛍光物質が二本鎖の核酸に入り込み、励起光の照射によって発光を発する特性を利用して核酸量を測定する方法である。蛍光の強さは核酸の量に比例して強くなるため、蛍光強度を測定することによって核酸の増幅量を知る事ができる。また、リアルタイムＰＣＲを使用した定量方法では、大きく分けて絶対定量法と相対定量法の２つの定量方法がありそれらを適宜使用できる。

本明細書において「発現調節剤」とは、標的蛋白質またはｍＲＮＡの発現量を増加または減少させることが可能な物質を含む。ここで、増加または減少する量は、コントロール細胞に比べて有意差があることが好ましい。

上記の悪性腫瘍の治療薬は、さらに、ＤＤＳ（Drug Delivery System）を含んでいてもよい。この場合、ポリヌクレオチドを細胞内に効率的に導入できる。ＤＤＳとしては、ゼラチンハイドロゲルまたはアテロコラーゲンを含む。本明細書において「ゼラチンハイドロゲル」とは、ゼラチンを原料としたハイドロゲルでＤＤＳとして使用できる。ゼラチンハイドロゲルは生体適合性、生体吸収性に優れている。本明細書において「アテロコラーゲン」とは、アテロコラーゲンを原料としたＤＤＳである。細胞への導入効率や安全性に優れている。アテロコラーゲンとは、一般的にコラーゲンに含まれるテロペプチドを酵素的に分解したもので、免疫反応を誘発し難い。

上記の悪性腫瘍の治療薬において、悪性腫瘍は肝臓癌、肺癌、膵臓癌、線維肉腫、多形性膠芽腫、メラノーマからなる群から選ばれる１種以上の悪性腫瘍であってもよい。この場合、それらの悪性腫瘍の治療が可能になる。特にこれらの悪性腫瘍はいずれも革新的な治療方法が無いために、上記の悪性腫瘍の治療薬は有望な治療薬である。

本明細書において「肝臓癌」とは、肝臓の細胞が増殖を続けることで起こる疾患を含む。肝臓癌を生起させることができる肝細胞は胆管、門静脈のような血管の細胞、樹状細胞または肝細胞を含む。また、原発性肝癌と転移性肝癌を含む。原発性肝癌の多くは肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）であることが知られている。

本明細書において「肺癌」とは、気管、気管支、肺胞の上皮細胞等に発生する悪性腫瘍を含み、病理学的には、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌、小細胞癌に分類できる。進展形式や治療反応性などが小細胞癌とその他の癌とでは異なるため、腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌はまとめて非小細胞癌とも呼ばれる。カルチノイドや円柱種など、小細胞癌および非小細胞癌に含まれない少数の腫瘍もある。

本明細書において「膵臓癌」とは、膵臓から発生した悪性腫瘍を含む。膵臓は、膵液を産生する腺房、膵液を運ぶ膵管、および内分泌腺であるランゲルハンス島などからなる。癌はいずれの組織からも発生しうる。例えば、浸潤性膵管癌、膵内分泌腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、腺房細胞癌、漿液性嚢胞腺癌等が挙げられる。

本明細書において「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する悪性腫瘍を含む。例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、皮膚線維肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、胞巣状軟部肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、顆粒球肉腫、ユーイング肉腫、骨原発の線維肉腫、悪性骨巨細胞腫、骨原発の脂肪肉腫、骨原発の血管肉腫等が挙げられる。

本明細書において「グリオーマ」とは、神経膠細胞から発生する悪性腫瘍を含む。例えば、星状膠細胞系腫瘍、稀突起膠細胞系腫瘍、上衣系腫瘍、脈絡叢腫瘍、多形性膠芽腫等が挙げられる。

本明細書において「メラノーマ」とは、皮膚、眼窩内組織、口腔粘膜上皮などに発生するメラノサイト由来の悪性腫瘍を含む。例えば、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、末端黒子型黒色腫等が挙げられる。

本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドもしくは塩基、またはそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチドおよび塩基は、ＤＮＡ塩基またはＲＮＡ塩基を含む。上記の等価物は、例えばＤＮＡ塩基またはＲＮＡ塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、またはヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。「ＤＮＡ鎖」とは、ＤＮＡ塩基またはそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。「ＲＮＡ鎖」とは、ＲＮＡ塩基またはそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。「塩基配列」とは、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドまたはその等価物の配列である。一般的に塩基配列は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）によって表すことができる。また、ＴとＵ（ウラシル）は、用途に合わせて互いに読み替えることが可能である。例えば、代表的なデータベースであるNCBI Reference Sequenceにおいて、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖の塩基配列を表すときにＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔが用いられている。なお、ポリヌクレオチドはＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成可能である。その他、ＤＮＡ塩基またはＲＮＡ塩基合成の受託会社（例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等）から購入することもできる。また、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはそれらをコードするベクターの合成も各メーカーに委託することができる。

そのようなｓｉＲＮＡ等のデザインには、Stealth RNAi designer（Invitrogen）やsiDirect 2.0（Naito et al., BMC Bioinformatics. 2009 Nov 30;10:392.）等を使用できる。ＲＮＡｉ作用またはｍｉＲＮＡ作用の確認は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ鎖発現量の定量によって行なうことができる。または、ノザンブロットによるＲＮＡ鎖発現量の解析や、ウェスタンブロットによる蛋白量の解析・表現型の観察等の方法でも行うことができる。特にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる方法が効率的である。

本明細書において「相補鎖」とは、一つのポルヌクレオチドに対して、ハイブリダイズすることが可能な相補性の高い他のポリヌクレオチドである。本明細書において「ハイブリダイズ」とは、複数のポリヌクレオチド間において、塩基間の水素結合等によって塩基対ができる性質のことを表す。塩基対はワトソン・クリック型塩基対、フーグスティーン型塩基対、または任意の他の配列特異的な形で生じうる。２つの１本鎖がハイブリダイズした状態は２本鎖と呼ばれる。また「相補的」とは、例えば一つのポリヌクレオチドに対して、ＡにはＴ、ＧにはＣが対応する形で、他のポリヌクレオチドがハイブリダイズすることが可能な形態を含む。

本明細書において「治療」とは、被験者の疾患または疾患に伴う１つ以上の症状の、予防または症状改善効果を発揮しうることをいう。

本明細書において「被験者」とは、ヒトもしくはその他哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、サル、チンパンジー、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなど）を含む。好ましくは、マウス、ラット、サル、チンパンジー、またはヒトであり、特に好ましくはヒトである。なぜならば、ヒトであればヒトの疾患の治療や、ヒト用の治療薬または診断薬の開発等に、上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドを利用できるためである。また、マウス、ラット、サル、およびチンパンジーは、世界中で研究用のモデル動物として汎用され多くの特性が明らかになっているため、これらの生物に対して、上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドの薬効薬理を調査することで、より優れた治療薬等の開発のために特に有用な情報が得られる。

また、上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドを治療薬または予防薬として使用する場合、単独で投与することも可能ではあるが、通常はＤＤＳまたは薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。また、上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドを直接使用せずに、上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドの前駆体を投与することも可能である。

また、上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドを生体に投与する際の投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、腹腔内、眼内または静脈内などの非経口投与をあげることができ、全身または局部的に投与することができる。投与経路は、好ましくは非経口投与あげることができる。後述する実施例のように、皮下または静脈内投与であっても良い。この場合、１または複数本鎖のポリヌクレオチドが患部へ到達する効率が高い。

その他の投与形態としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、注射剤、座剤、噴霧剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。さらに、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。

非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製することができる。また、噴霧剤は上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体、などを用いて調製することができる。この担体としては具体的には乳糖、グリセリンなどが例示できる。上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤と、用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤化が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

また、上記の治療薬または予防薬は、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。

また、投与方法は被験者の年齢、症状、対象臓器等により適宜選択することができる。上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤を含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、被験者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。体重１ｋｇあたりの投与量は、例えば0.0001、0.01、1、50、100、250、500、または1000ｍｇである。この投与量は、ここで例示したいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与量は目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なる。投与量、投与方法は、被験者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。また、適切な化学療法薬と併用で投与してもよい。

上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドは、悪性細胞の抑制等の効果を通して、畜産において動物の成育を補助するための添加剤などにも使用できる。

また本発明の他の実施形態は、上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドを含む、試薬またはキットである。この試薬またはキットは、上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果を通して、研究用の試薬もしくはキット、または医療用のキットとして使用できる。たとえば、ｉＰＳ細胞作成用、人工臓器作成用、悪性腫瘍細胞抑制用、未分化マーカー発現調節用、またはｐ５３発現細胞作成用の添加物、補助物質として使用できる。また、キットには上記の１または複数本鎖のポリヌクレオチドを用いる際の使用方法もしくは使用例を記載した指示書、その指示書の所在を記載した文面、または種々のバッファーを含んでいてもよい。
なお、本発明の一実施形態は、以下の（１）〜（３３）のいずれかの実施形態を含んでいてもよい。
（１）
配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜３個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
を含む１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。
（２）
前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ作用を有する、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（３）
前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、ｓｍａｌｌ ＲＮＡである、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（４）
前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、１本鎖または２本鎖のＲＮＡ鎖である、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（５）
前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、１５以上のヌクレオチドからなる、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（６）
前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、１００以下のヌクレオチドからなる、（５）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（７）
前記１本鎖のポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡであり、前記２本鎖のポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（８）
前記ｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが３５〜１００ヌクレオチドからなり、前記ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのガイド鎖が１５〜４０ヌクレオチドからなる、（７）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（９）
前記ｓｈＲＮＡ、前記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、および前記ｍｉＲＮＡが、１〜５ヌクレオチドからなるオーバーハングを含む、（７）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（１０）
前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、さらに、配列番号４２の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜５個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含む、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（１１）
前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、さらに、配列番号４１の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖を含む、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（１２）
前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、１本鎖のポリヌクレオチドであり、且つｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（１３）
前記１本鎖のポリヌクレオチドが、配列番号４３の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜４個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含む、（１２）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（１４）
配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜３個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
を含むｓｍａｌｌ ＲＮＡを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。
（１５）
ａ）配列番号４３の塩基配列、
ｂ）配列番号４３の塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列、
ｃ）配列番号４３の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
ｄ）配列番号４３の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列、
からなる群から選ばれる１種以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。
（１６）
体細胞を多能性幹細胞へ誘導する、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（１７）
悪性腫瘍細胞を多能性幹細胞へ誘導する、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（１８）
前記悪性腫瘍が、肝臓癌、膵臓癌、線維肉腫、多形性膠芽腫、メラノーマからなる群から選ばれる１種以上の悪性腫瘍である、（１７）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（１９）
前記多能性幹細胞が、内在性のｐ５３を発現している、（１）に記載の多能性幹細胞誘導剤。
（２０）
配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜３個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
を含む１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有し、未分化細胞マーカーの発現を調節する、未分化細胞マーカー発現調節剤。
（２１）
（２０）に記載の未分化細胞マーカー発現調節剤であって、前記未分化細胞マーカーが、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＰＲＯＭ１からなる群から選ばれる１種以上の未分化細胞マーカーである、未分化細胞マーカー発現調節剤。
（２２）
配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜３個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
を含む１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有し、多能性幹細胞におけるｐ５３の発現量を促進する、多能性幹細胞のｐ５３発現促進剤。
（２３）
配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜３個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
を含む１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法。
（２４）
（２３）に記載の生産方法で得られる、多能性幹細胞。
（２５）
ＨＰＳ０００２：２５３Ｇ１株に比べて内在性のｐ５３の発現量が増大している、（２４）に記載の多能性幹細胞。
（２６）
フィーダー細胞の非存在下で培養可能である、（２５）に記載の多能性幹細胞。
（２７）
配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜３個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
を含む１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドを含有する、悪性腫瘍の治療薬。
（２８）
（２７）に記載の悪性腫瘍の治療薬であって、前記悪性腫瘍が、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、線維肉腫、多形性膠芽腫、メラノーマからなる群から選ばれる１種以上の悪性腫瘍である、悪性腫瘍の治療薬。
（２９）
前記悪性腫瘍が肉腫である、（２７）に記載の悪性腫瘍の治療薬。
（３０）
配列番号４１の塩基配列に相補的な塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜３個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（３１）
（３０）に記載のベクターを含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。
（３２）
（３０）に記載のベクターを含む、悪性腫瘍の治療薬。
（３３）
配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜３個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、
多能性幹細胞誘導用、未分化細胞マーカー発現調節用、多能性幹細胞のｐ５３発現促進用、または悪性腫瘍の治療用のキット。

以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。

以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜実施例１：ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡのマウスへの投与と、抗癌作用の評価＞
（１−１）ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡの作成
Stealth RNAi designer(Invitrogen, CA, USA)によってＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡの配列をデザインし、BLOCK-it Inducible H1 RNAi Entry Vector (Invitrogen, CA, USA)を用いてＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡを生成するベクター（ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡプラスミド）を作成した。このＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡは、生体内においてＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡに対するＲＮＡｉを誘導するように設計されたｓｍａｌｌ ＲＮＡである。

ここで、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡの塩基配列は、5'-GGAAAACUAAAAUGAGAGAAUGGGUGUCCAAGAGGACAAGUUCAUGCUCACCCGGUGAUGAGAGUUUGAUUGCAGAAUAAGGCUAGACAAAGGGAAGCUGAACAUGACCAAAGCCAUGUGACAUCGUAUGAUCCUCGAAUCUCACAGUAUCUAUGUAUCUAUAAUCAGAUACAUCCCUAGACUUUCCAGGAAUUCUGGUACUUCACGAGGAUGUGAGAAGACUCUGAACAAAAUAAUACACUGCUCGUG-3'（配列番号７）である。ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡプラスミド内のトップストランドにおいて、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡをコードする配列は、5'-CACCGCAGAATAAGGCTAGACAAAGCGAACTTTGTCTAGCCTTATTCTGC-3'（配列番号１１）である。ボトムストランドにおいて、上記トップストランドと２重鎖を形成している配列は、5'-AAAAGCAGAATAAGGCTAGACAAAGTTCGCTTTGTCTAGCCTTATTCTGC-3'（配列番号１２）である。図１ＡにＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡの２次構造と、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡのターゲット部位を示す。

ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡの塩基配列は、5'-GCAGAAUAAGGCUAGACAAAGUUCGCUUUGUCUAGCCUUAUUCUGCGGUG-3'（配列番号１０）である。プラスミドから転写後はヘアピン様構造を形成すると考えられる（図１Ｂ）。図中の下線部は、水素結合を形成可能な部分である。ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡの塩基配列において、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡの一部に相補的な配列は、5'-CUUUGUCUAGCCUUAUUCUGC-3'（配列番号８）である。この配列番号８に相当する部分は、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡの塩基配列中の5'-GCAGAAUAAGGCUAGACAAAG-3'（配列番号９）と水素結合を形成し、へアピン様構造を形成すると考えられる。ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡによってＲＮＡｉを誘導する際には、この配列番号８に相当する部分がＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡに対してハイブリダイズすると考えられる。UUCGはループ部分に相当する。GGUGはオーバーハングしていると考えられる。

また、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡのチミンの一つが欠損したＲＧＭ２４９ｍ−１ ｓｈＲＮＡを発現するベクター（ＲＧＭ２４９ｍ−１ ｓｈＲＮＡプラスミド）を作成した。ＲＧＭ２４９ｍ−１ ｓｈＲＮＡプラスミド内のトップストランドにおいて、ＲＧＭ２４９ｍ−１ ｓｈＲＮＡをコードする配列は、5'-CACCGCAGAATAAGGCTAGACAAAGCGAACTTTGTCAGCCTTATTCTGC-3'（配列番号１３）である。ボトムストランドにおいて、上記トップストランドと２重鎖を形成している配列は、5'-AAAAGCAGAATAAGGCTGACAAAGTTCGCTTTGTCTAGCCTTATTCTGC-3'（配列番号１４）である。コントロールにはＬａｃＺ ｓｈＲＮＡを使用した。

ＲＧＭ２４９ｍ−１ ｓｈＲＮＡの塩基配列は、5'-GCAGAAUAAGGCUGACAAAGUUCGCUUUGUCUAGCCUUAUUCUGCGGUG-3'（配列番号１５）である。配列番号１５の塩基配列が配列番号１０の塩基配列と異なるのは、配列番号１０の５末端から１４番目のＡが欠失している点である。ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡに一部に相補的な配列は、上記ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡの場合と同じである。

（１−２）ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡの腫瘍抑制効果
胸腺欠損マウスの右側腹に、ＨＬＦ細胞を皮下注射によって播種した。またそのマウスの右側腹に、５日毎にＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡプラスミド＋ＤＤＳ、ＲＧＭ２４９ｍ−１ ｓｈＲＮＡプラスミド＋ＤＤＳ、またはＬａｃＺ ｓｈＲＮＡプラスミド＋ＤＤＳを皮下注射した。この皮下注射は、ＤＤＳ１ｍｇ当たり数μg〜数十μgの生理活性物質を混ぜ、マウス20〜30gに対して行った。このときの腫瘍ボリュームの変化を調査した（図１Ｃ）。その結果、投与から２１日後、ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡグループと比較してＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡグループによる有意な腫瘍抑制効果が見られた。なお、ＤＤＳ（Drug Delivery System）としてはカチオン化ゼラチンハイドロゲル（ＭｅｄＧｅｌ社製）を使用した。プラスミドとＤＤＳは、メーカーのプロトコールに従い各１００ｎＭで混合した。グラフには標準誤差を示してある。データ（ｎ＝５）はマン・ホイットニーテストによって分析した（Ｐ＜０．０１）。また、最初の投与から４週間後、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡグループは、ＲＧＭ２４９−ｍ１ ｓｈＲＮＡグループとＬａｃＺ ｓｈＲＮＡグループに比較して、有意に腫瘍抑制効果を示した（Ｐ＝０．０３４、Ｐ＝０．０２１）。

図１Ｄの３つの写真は、上記それぞれのプラスミドを皮下注射した際の、腫瘍ボリュームの目視的な観察結果である。皮下注射から約２８日後に、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡグループは平均で８０％の抑制効果を示していた。また、ＲＧＭ２４９ｍ−１ ｓｈＲＮＡグループは平均で５０％未満に腫瘍ボリュームを抑制していた。

（１−３）ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡ投与によるｍＲＮＡ発現の抑制効果
（１−３−１）皮下投与
また皮下注射から３５日後に、腫瘍で発現している遺伝子の発現抑制効果を調査した（図２Ａ）。細胞からmirVana miRNA Isolation kitを用いてｍｉＲＮＡを抽出した後、Mir-X^TM miRNA qRT-PCR SYBR^(R) Kitを用いてｍｉＲＮＡの発現量を調べた。その結果、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡプラスミド＋ＤＤＳ、またはＲＧＭ２４９ｍ−１ ｓｈＲＮＡプラスミド＋ＤＤＳを投与した場合において、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡおよびｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現レベルが、ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡと比較して有意に低下していた（ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡとｈＴＥＲＴｍＲＮＡのＰ値は、それぞれＰ＝０．０３６、Ｐ＝０．０２５）。これらのデータはマン・ホイットニーテストによって分析した。クローズドの四角はＲＧＭ２４９の発現を示し、オープンの四角はｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現を示す。

（１−３−２）尾静脈投与
一方で、上記のそれぞれのプラスミドを尾静脈へ静脈注射した場合において、２８日後に腫瘍で発現している遺伝子の発現抑制効果を調査した（図２Ｂ）。ＤＤＳには、アテロコラーゲン（AteloGene^TM）（Jo, J., Yamamoto et al., J Nanosci Nanotechnol 6, 2853-2859 (2006).、Takeshita et al., Mol Ther 18, 181-187 (2010).）を用いた。プラスミドとＤＤＳは、メーカーのプロトコールに従い各１００μＭで混合した。その結果、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡプラスミド＋ＤＤＳを投与した場合において、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡおよびｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現レベルが、ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡと比較して有意に低下していた。これらのデータはマン・ホイットニーテストによって分析した（Ｐ＜０．０５）。クローズドの四角はＲＧＭ２４９の発現を示し、オープンの四角はｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現を示す。以上のように、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡグループにおけるＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡとｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現は、ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡグループと比較して、両方とも有意に抑制された（それぞれＰ＝０．０４９、０．０４６）。

（１−４）ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡ投与による癌転移抑制効果
また静脈注射から２８日後に、肝臓の内外の結節を目視的に観察した。ＨＬＦ細胞のみのグループ（data not shown）と、ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡグループにおいて癌結節が目視的に見られた。また、顕微鏡でみた場合、全てのマウスの肝臓または肺に転移性の病巣が、１匹のマウスで左腎への転移が見られた。

目視的に観察した結果、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡグループでは、１匹のマウスでのみ肝臓に結節の存在が確認された（表１）。また、１匹のマウスでのみ腎臓に結節を有していることが確認された。この結果は、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡグループが他のグループと比較して腫瘍形成と転移を抑制したことを表す。即ち、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡグループは静脈注射で与えたときに腹腔内の発癌を抑制した。また、注入されたヒト由来の腫瘍を、ヒト特異的なＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡを標的として治療したことを意味する。

以上の結果より、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡをＲＮＡｉ作用によって分解すると、癌抑制と腫瘍減少、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの減少、および癌の転移抑制に効果があることが示された。このことから、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡが、癌になんらかのメカニズムを経て影響していると考えられた。またＲＧＭ２４９ｍ−１ ｓｈＲＮＡは、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡに比べて若干効果は劣るが、癌の抑制効果を奏する等、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡと類似の効果を有していた。次に、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡから生成されるｍｉＲＮＡと、そのｍｉＲＮＡに対するｓｉＲＮＡによる癌への影響を調べた。

＜実施例２：３つのｓｉＲＮＡによる癌細胞増殖抑制と、未分化マーカーへの影響の評価＞
（２−１）ｍｉＲ−４７ ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１０１ ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡのコンストラクト
RGM249を、pRNAT-U6.1/neoベクター(GenScript USA社、ニュージャージー、米国)に連結した。T7 RNAポリメラーゼにより生成されたRGM249 mRNAを、Dicer酵素(Genlantis社、カリフォルニア、米国)を使用して消化した。miRNAを、mirVANA miRNA単離キット(日本Ambion社、東京、日本)により分画し、 ヒト抗Ago2ビーズを用いたmiRNA単離キット(和光純薬工業株式会社、東京、日本)を用いて精製した。また、小RNAがAgo2に結合しない可能性があるため抗Ago2を用いずにも精製した。消化したsmall RNAsを、miRCAT-microRNAクローニングキット(Integrated DNA Technologies社、アイオワ、米国)を使用してクローニングし、TOPOベクター(Invitrogen社、カリフォルニア、米国)を使用してシークエンシングした。そして、二次構造を予測した(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)。small RNAsの配列相同性を、miRBasを使用して検討した。以上の結果、ｍｉＲ−４７、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１９７の３つのｍｉＲＮＡが得られた。ｍｉＲＮＡ前駆遺伝子であるＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡと、内部の３つのｍｉＲＮＡに相当する部位を図３Ａに示す。

ｍｉＲ−４７の塩基配列は5'-CUCACCCGGUGAUGAGAGUUUGAUU-3'（配列番号１６）、ｍｉＲ−１０１の塩基配列は5'-AACAUGACCAAAGCCAUGUG-3'（配列番号１７）、ｍｉＲ−１９７の塩基配列は5'-GUACUUCACGAGGAUGUG-3'（配列番号１８）である。

上記３つのｍｉＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを生成するコンストラクト（ｓｈＲＮＡ）を作成する場合、pRNATin-H1.4/Lentiを使用した。また、３つのｓｉＲＮＡ（ｍｉＲ−４７ ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１０１ ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎｅｒを用いて合成した。各ｓｉＲＮＡの推定２次構造を図３Ｂに示す。ｍｉＲ−４７ ｓｉＲＮＡの塩基配列はセンス鎖が5'-CUCACCCGGUGAUGAGAGUUUGA-3'（配列番号４）、アンチセンス鎖が5'-AAUCAAACUCUCACCGGGUGAG-3' （配列番号１）である。ｍｉＲ−１０１ ｓｉＲＮＡの塩基配列はセンス鎖が5'-AACAUGACCAAAGCCCAUGUGUU-3'（配列番号１９）、アンチセンス鎖が5'-CACAUGGCUUUGGUCAUGUU-3' （配列番号２）である。ｍｉＲ−１０１ ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、３'末端においてチミンが２塩基突出している。この２塩基を除いた配列は、5'-AACAUGACCAAAGCCCAUGUG-3'（配列番号５）である。ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡの塩基配列はセンス鎖が5'-GUACUUCACGAGGAUGUGUU-3'（配列番号２０）、アンチセンス鎖が5'-CACAUCCUCGUGAAGUAC-3'（配列番号３）である。ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、３'末端においてチミンが２塩基突出している。この２塩基を除いた配列は、５'−GUACUUCACGAGGAUGUG−３'（配列番号６）である。また、３つのｍｉＲＮＡと、３つのｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖との配列比較を図３Ｃに示す。

（２−２）細胞増殖の抑制効果
ｍｉＲ−４７ ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１０１ ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡ、またはそれらの混合物（３ｓｉＲＮＡ混合物）各５０ｎＭを高レベルのＲＧＭ２４９を発現するＨＭＶ−Ｉへトランスフェクションした。トランスフェクションにはＦｕＧｅｎｅキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。トランスフェクションから２４時間経過後の形質転換体を収集した。

細胞数を測定した結果、ＤＤＳで処理したコントロール細胞と比較して、それぞれのｓｉＲＮＡを単独で使用した場合に、若干の癌細胞増殖の抑制効果がみられた（図３Ｄ）。さらには、３ｓｉＲＮＡ混合物をトランスフェクションした場合、癌細胞増殖の顕著な抑制効果がみられた。これは、３つのｓｉＲＮＡが相乗的に働いたためと考えられる。一方で、ｓｉＲＮＡを２つ組み合わせて使用した場合には、同等の効果は見られなかった。このことは、２つでは相乗効果が生じにくく、むしろ１つ当たりの濃度が低くなったことが癌細胞増殖の抑制効果を弱めたと考えられる。

この結果から、３つのｍｉＲＮＡを阻害すると、癌細胞の増殖抑制効果があることが強く示唆された。この結果は実施例１とも矛盾なく、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡが３つのｍｉＲＮＡに分解され、その３つのｍｉＲＮＡが癌に関与するメカニズムが、生体内で働いていると考えられる。上記の３つのｓｉＲＮＡはこのメカニズムを遮断することで、癌細胞の増殖抑制効果を発揮したと考えられる。

（２−３）ｓｉＲＮＡによるｍｉＲＮＡ発現レベルの変化
上記（２−２）において３ｓｉＲＮＡ混合物を同時にトランスフェクションしたＨＭＶ−ＩからＲＮＡ抽出を行い、ｍｉＲ−４７、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１９７の発現レベルを調査した（図３Ｅ）。

（２−４）ｓｉＲＮＡによる未分化マーカー量の変化
形質転換体の転写発現プロファイリングを、癌（ｈＴＥＲＴ、ｃ−Ｍｙｃ、ｐ５３）、多分化能（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）、幹細胞性（ＰＲＯＭ１）に関連する遺伝子について評価した（図３Ｆ）。３ｓｉＲＮＡ混合物を使用した場合、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｈＴＥＲＴ、ｐ５３遺伝子は３ｓｉＲＮＡ混合物による処理に伴いアップレギュレイトし、ｃ−ＭｙｃとＫｌｆ４遺伝子はダウンレギュレイトした。一方でＰＲＯＭ１への影響は見られなかった。またｍｉＲ−４７ ｓｉＲＮＡは、Ｏｃｔ３／４およびｈＴＥＲＴ遺伝子をアップレギュレイトし、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４遺伝子をダウンレギュレイトした。図３Ｄ中の＊は、ｍＲＮＡの発現をβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡと比較した時に有意差があることを示す。

以上の結果、ｍｉＲ−４７ ｓｉＲＮＡの使用によって未分化マーカー（Ｏｃｔ３／４）の発現がアップレギュレイトしたことから、ＨＭＶ−Ｉは未分化状態に変換したか、少なくとも未分化状態に誘導されたと考えられる。また、癌遺伝子であるｃ−Ｍｙｃがダウンレギュレイトしたことから、未分化状態に誘導された細胞は癌化が抑制された状態にあると考えられる。

さらには、３ｓｉＲＮＡ混合物を使用した場合には、２つの未分化マーカー（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２）の発現がアップレギュレイトした。ｃ−ＭｙｃはｍｉＲ−４７ ｓｉＲＮＡを使用した場合と同様に、ダウンレギュレイトした。また、癌抑制遺伝子であるｐ５３がアップレギュレイトした。即ち、未分化状態に誘導された細胞は、ｃ−Ｍｙｃおよびｐ５３の両面から癌化が抑制された状態にあると考えられる。

以上の結果から、３つのｍｉＲＮＡは、癌と、分化のメカニズムに関与していることが示唆された。また、３つのｓｉＲＮＡは癌抑制と、癌細胞のリプログラミングの機能を有していることが示唆された。次に、ｓｉＲＮＡをマウスに投与することで、癌抑制と癌細胞のリプログラミングについてさらに詳しく調査した。

＜実施例３：３ｓｉＲＮＡ混合物のマウスへの投与と、抗癌作用の評価＞
（３−１）ｓｉＲＮＡの皮下投与
３ｓｉＲＮＡ混合物＋ＤＤＳの皮下投与は、ＤＤＳのみのコントロール投与に比べて、ＨＭＶ−Ｉ細胞の増殖性の抑制を示した（Kruskal-WallisテストにおいてＰ＜０．０１、ｎ＝５）（図４）。この試験には胸腺欠損マウスを用いた。ＤＤＳはアテロコラーゲン（ＡｔｅｌｏＧｅｎｅ^TM）を用いた。３ｓｉＲＮＡ混合物とＤＤＳは、メーカーのプロトコールに従い各１００μＭで混合した。図４中の上部に示した写真は、ＲＮＡを含まないアテロコラーゲン（ｍｏｃｋ）を皮下注射したときの写真である。下部に示した写真は、３ｓｉＲＮＡ混合物＋ＤＤＳを皮下注射したときの写真である。＊はＲＮＡを含まないものとｓｉＲＮＡを含むものの間に有意差（Ｐ＜０．０１）があることを示す。また、コントロールマウスは肺（１５．８±１．９ 結節）と腹腔内（０．８±０．６ 結節）に複数の結節を示した（表２）。いくつかの転移性の病巣が腹腔内および腹腔外で観察され、皮下浸潤も観察された。

（３−２）ｓｉＲＮＡの静脈投与
胸腺欠損マウスにＨＬＦ細胞を投与した後１週間後から、３ｓｉＲＮＡ混合物＋ＤＤＳを毎週静脈注射した。マウス当たりに１×１０^７細胞を含む２００ μｌをインジェクションした。ＤＤＳはアテロコラーゲン（ＡｔｅｌｏＧｅｎｅ^TM）を使用した。３ｓｉＲＮＡ混合物とＤＤＳは、メーカーのプロトコールに従い各１００μＭで混合した。２８日後にその動物を屠殺し、肝内腫瘍と腹腔内転移の試験を行なった（表３）。この結果、３ｓｉＲＮＡ混合物＋ＤＤＳの静脈投与は、ＨＭＶ−１細胞の抗転移能を有意に誘導した（Ｐ＜０．０５、肺と肝臓それぞれ）。肝臓と肺では転移がほとんど見られず、１匹のマウスのみで腹腔内への転移が見られた。

以上の結果、３ｓｉＲＮＡ混合物をマウスに投与することで、癌の増殖と、転移を有意に抑制できることが示された。

＜実施例４：３ｓｉＲＮＡ混合物のマウスへの投与と、未分化マーカーの発現レベルの評価＞
（４−１）腫瘍におけるｍｉＲＮＡとｍＲＮＡの発現レベルの評価方法
ｓｉＲＮＡで処理した腫瘍を用いてｍｉＲ−４７、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１９７の発現レベルの評価を以下の通り行った。ｍｉＲＮＡの発現量は、細胞または組織からmirVana miRNA Isolation kit を用いてｍｉＲＮＡを抽出した後、Mir-X^TM miRNA qRT-PCR SYBR^(R) Kit を用いて調べた。これにより、ｓｉＲＮＡによるｍｉＲＮＡの発現抑制効果、およびｍｉＲＮＡの発現量の変化を確認した。

ｍＲＮＡを定量化するために用いたプライマーセットの配列を表４に示す。ウエスタンブロット法はｉ−Ｂｌｏｔゲル転写システムを用いて行った。抗体（抗ｈＴＥＲＴ抗体、抗ｐ５３抗体、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体、抗Ｏｃｔ４抗体、抗ＰＲＯＭ１抗体）は１：５００倍に希釈し、抗βアクチン抗体は１：１０００倍に希釈した。LAS-4000を使用して、化学発光シグナルを1分以内に検出した。

（４−１−１）皮下投与
皮下による異種移植によって、３つのｍｉＲＮＡの抑制効果を実証した。前記異種移植は、1 × 10⁷個のHMV-I細胞を右側腹へ接種することにより確立した。触知できる腫瘍は播種から７日後に確認できた。１０匹のマウスをランダムに２グループに分け、３ｓｉＲＮＡ混合物（１００ μＭ）（ｎ＝５）、または等量のＤＤＳ（ｎ＝５）を投与した。３ｓｉＲＮＡ混合物をトランスフェクションした細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖が抑制された。５週間後、腫瘍を分析するためにマウスを屠殺した。腫瘍ボリュームはボリューム ＝ π／６×横幅×縦幅×高さの式によって評価した。

（４−１−２）尾静脈投与
ｓｉＲＮＡ混合物（４００ μＭ）またはＤＤＳで処理する１週間前に、ＨＭＶ−Ｉ細胞（１×１０^７ 細胞）を胸腺欠損マウスの尾静脈にインジェクションした。ｓｉＲＮＡ混合物またはＤＤＳは毎週投与し、腫瘍ボリュームまたは転移を５週間後に調査した。全てのマウスはJapanese Association for Accreditation for Laboratory Animal Care-approved facilitiesで保管および飼育した。動物実験および取り扱いはfederal Institutional Animal Care and Use Committee guidelinesを厳格に遵守した。

図５Ａに示すように腫瘍のあるパーツ毎に分けて評価した。１は表面、２は内部、３は中央部分である。なお腫瘍はもろいため、わけ方はおおよそのものである。

（４−２）腫瘍におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの評価結果
腫瘍内のＲＮＡの定量化、および高い再現性のシークエンシングを行ない、３ｓｉＲＮＡ混合物による、ｍｉＲ−４７、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１９７それぞれの発現抑制効果を評価した結果を図５Ｂに示す。データはクラスカル・ワーリステスト（ｎ＝５）を用いて分析した。＊はＤＤＳ処理した腫瘍に対してｍｉＲＮＡ発現レベルに有意差（Ｐ＜０．０１）があることを示す。３つのｍｉＲＮＡはの量は、３ｓｉＲＮＡ混合物を投与することによって減少する傾向が見られた。

（４−３）ヘマトキシリン・エオシン染色
上記（４−１−２）で得られた腫瘍について、顕微鏡による調査結果（ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン染色）； ×４００）を図５Ｃに示す。上部はコントロールを、下部はｓｉＲＮＡで処理した腫瘍を示す。ｓｉＲＮＡで処理した腫瘍はＨＭＶ−Ｉ細胞で減少し、フィブロシスによる置き換わりに伴って腫瘍は壊死し、新血管新生は抑制された。

（４−４）腫瘍における未分化マーカーの発現レベルの評価結果
上記（４−１−２）で得られた腫瘍について、腫瘍、分化、多能性の関連遺伝子の転写レベルを試験した結果を図５Ｄに示す（＊： Ｐ＜０．０５， ＊＊： Ｐ＜０．０１）。Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｐ５３、ｈＴＥＲＴ、ＰＲＯＭ１、Ｓｏｘ２は多能性、腫瘍形成、または癌幹細胞性に関与すると考えられる。２^−△△法を用いてβ−ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡの発現を比較した。図５Ｄ中においてＣｎｔｌはコントロール（ＤＤＳのみ）を表し、３ ｍｉｘは３ｓｉＲＮＡ混合物＋ＤＤＳを表す。この結果、３ｓｉＲＮＡ混合物はｐ５３およびＳｏｘ２のｍＲＮＡの上昇を誘導した。一方で、ｈＴＥＲＴ、ＰＲＯＭ１、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４は減少した。

以上の結果、３ｓｉＲＮＡ混合物をマウスに投与することで、３つのｍｉＲＮＡはダウンレギュレイトし、未分化マーカーであるＳｏｘ２と、癌抑制遺伝子であるｐ５３はアップレギュレイトすることが示された。次に、免疫組織科学的試験を利用して、癌細胞のリプログラミングについてさらに詳細に調査した。

＜実施例５：癌細胞のリプログラミングと、ｉＰＳ細胞の評価＞
（５−１）ｍｉＲＮＡ−１９７の抑制と、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄのアップレギュレーションの評価
ＦｕＧｅｎｅキット（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡを２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションした後、顕微鏡で観察した（図６Ａ）。また、ウイルスベクター（ｐＭＩＲＮＡ１、System Bioscience:SBI社製）を用いて、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄ（Accession：MI0003164）をヒトの線維芽細胞細胞（ＴＩＧ−１−２０）に感染させた後、顕微鏡で観察した。このｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄは、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡをトランスフェクションすることによってアップレギュレイトされるｍｉＲＮＡである（A noncoding RNA gene on chromosome 10p15.3 may function upstream of hTERT. Miura et al., BMC Mol Biol. 2009 Feb 2;10:5.）。上記ウイルスベクターから発現するｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄの塩基配列は5'-UCUCAAGCUGUGAGUCUACAAAGGGAAGCCCUUUCUGUUGUCUAAAAGAAAAGAAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGUUACGGUUUGAGA-3'（配列番号４３）である。その推定２次構造を図６Ｂに示す。この配列において、ガイド鎖に相当する配列は5'-UCUACAAAGGGAAGCCCUUUCUG-3'（配列番号４１）、パッセンジャー鎖に相当する配列は5'-AAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGU-3'（配列番号４２）である。

ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡとｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄの発現量は、各ＲＮＡ鎖とともに発現しているＧＦＰプロテインを検出することで評価した。図６Ａの上部はｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡで処理した細胞の写真である（拡大率： ×４０）。円形細胞が培地に出現した後、ＥＳ細胞のための培地（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社）に移して観察した。下部は、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄで処理した細胞の写真である（拡大率： ×１００）。以上により、ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡとｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄの発現が確認された。こうして、ｍｉＲＮＡ−１９７の抑制またはｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄのアップレギュレーションを行った。

（５−２）ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡ投与後の未分化マーカーの発現量の評価
ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした２９３ＦＴ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）を、顕微鏡で免疫組織化学的に観察した結果を図６Ｃに示す。図６Ｃは未分化マーカーであるＯｃｔ４とＮＡＮＯＧを検出している。上部（０ｈｒ）の３つは、トランスフェクションしていない２９３ＦＴ細胞を顕微鏡（拡大率： ×４０）で観察した写真である。左の列は身染色、真ん中の列は抗Ｏｃｔ４抗体によるローダミン染色、右の列は抗ＮＡＮＯＧ抗体によるローダミン染色を施した結果である。細胞の染色は各１週間行った。

真ん中（２４ｈｒ）の３つは、未分化状態の細胞をｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡで誘導してから２４時間後に、顕微鏡で免疫組織化学的に観察した写真である。下部（４８ｈｒ）の３つは、４８時間後に、同様に顕微鏡で免疫組織化学的に観察した写真である。その結果、Ｏｃｔ４（真ん中の列、拡大率： ×１００）とＮＡＮＯＧ（右の列、拡大率： ×２００）が強く発現していた。

以上の結果、ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡで処理した２９３ＦＴ細胞は、Ｏｃｔ４またはＮＡＮＯＧを発現したことから、リプログラミングされ、ｉＰＳ細胞化したと考えられる。またその効率も良く、１０^６細胞から２０〜１００程度のｉＰＳ細胞が作成できた。この２９３ＦＴ細胞は、一般的にＥＳ細胞やｉＰＳ細胞にみられる細胞形状を有していた。また、培地中で７日後も未分化状態を維持していた。ｉＰＳ細胞化した２９３ＦＴ細胞は、ＥＳ細胞用培養液で培養できるが、一般培養用の培養液でも十分培養可能であった。フィーダー細胞は不要であり、培養面のコーティングはコラーゲンでもマトリゲルでもよかった。

（５−３）ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄ投与後の未分化マーカーの発現量の評価
ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄを各種癌細胞にウイルスベクター（ｐＭＩＲＮＡ１、System Bioscience:SBI社製）で感染させ、強制発現させた。その後、上述の免疫組織科学的試験と同様の方法で未分化マーカーの発現量を観察した。その結果を図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆに示す。使用した癌細胞は、ＨＴ１０８０細胞（ヒト線維肉腫細胞株）、Ｔ９８Ｇ細胞（ヒトグリオーマ細胞株）、ＰＫ−４５ｐ細胞（ヒト膵臓癌由来細胞株）、ＨＭＶ−Ｉ細胞（ヒト悪性黒色腫由来細胞株）、ＨＬＦ細胞（ヒト肝癌由来細胞株）である。またＨＭＶ−Ｉ細胞、およびＨＬＦ細胞においては、未分化マーカーであるＯｃｔ４またはＮＡＮＯＧを発現していた。

以上の結果、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄで処理した癌細胞は、リプログラミングされ、ｉＰＳ細胞化したと考えられる。なおこのｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄを強制発現させた癌細胞は、一般的にＥＳ細胞やｉＰＳ細胞にみられる細胞形状を有していた。

（５−４）生成したｉＰＳ細胞の各種遺伝子発現量の評価、およびｈｉＰＳＣとの比較
上記ようにして生成したｉＰＳ細胞における各種遺伝子の転写量を図７Ａに示す。ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡで処理した２９３ＦＴ細胞、およびｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄが過剰発現した２９３ＦＴ細胞における各種遺伝子の転写量は同じであった。図７Ａは、その２つの細胞の転写量を、ｈｉＰＳＣ（ＨＰＳ０００２ ２５３Ｇ１）（'Generation of mouse-induced pluripotent stem cells with plasmid vectors.' Okita et al., Nat Protoc 5, 418-428 (2010).）の発現量に対して比較した結果である。転写レベルはワンステップリアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲで調査した。図中、ｈｉＰＳＣの発現量を０として表している。上部は、２９３ＦＴ細胞用の培地において２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションまたは感染させてから４８時間後の転写量である。下部は、その後２週間、ＥＳ細胞のための培地で維持したときの転写量である。

トランスフェクションまたは感染させてから４８時間後、Ｏｃｔ４、ｐ５３、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡは、ｈｉＰＳＣに比べてハイレベルで発現していた。その後２週間、ＥＳ細胞のための培地で維持後は、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡのみハイレベルで発現していた。他の遺伝子は、２週間後ｈｉＰＳＣとほとんど同レベルの発現量であった。

ｈｉＰＳＣと２９３ＦＴ細胞におけるｍｉＲＮＡ−１９７とｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄの、ｍｉＲＮＡ発現レベルの関連性をツーステップリアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ （ｎ＝５）で評価した結果を図７Ｂに示す。左のパネルはｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄの発現量を示す。左から、ｈｉＰＳＣ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄを過剰発現している２９３ＦＴ細胞、ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡで処理した２９３ＦＴ細胞、２９３ＦＴ細胞である。また右のパネルはｍｉＲＮＡ−１９７の発現量を示す。これにより形質転換体におけるｍｉＲＮＡ−１９７サイレンシングとｍｉｒ−５２０ｄ過剰発現を確認した。

左のパネルから、生成したｉＰＳ細胞のｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄの発現量はｈｉＰＳＣと類似していることがわかる。一方で、２９３ＦＴ細胞においてはｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄの発現量は有意にダウンレギュレイトしていることがわかる。右のパネルからは、生成したｉＰＳ細胞はｍｉＲＮＡ−１９７をｈｉＰＳＣと同じくらい弱く発現していることがわかる。一方で、２９３ＦＴ細胞においてはｍｉＲＮＡ−１９７を他の細胞と比較して１０倍多く発現していた。

＜実施例６：＞hsa-mir-520dに関する実験方法と結果
（６−１）細胞
in vitroとin vivoにおけるhsa-mir-520d発現の効果を評価するために、複数種類の細胞株とレンチウイルスベクターとを使用した。ヒトメサンギウム細胞株である293FTは、日本Invitrogen社(東京、日本)から提供され、10%FBS、0.1mM MEM非必須アミノ酸溶液、2mM L-グルタミン、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。強力なRGM249発現を有するヒト未成熟または未分化肝細胞株(HLF)とRGM249の弱い発現を有する高分化肝癌細胞株(Huh7)を、アメリカ培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)から購入し、10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI培地中で培養した。ウイルス処理により形質転換した細胞の未分化状態を維持するため、5ng/mlのbFGF-2を有するReproStem培地(ReproCell社、東京、日本)中で、細胞を培養した。ヒト誘導多能性幹細胞(HPS0001、HPS0002)は、理研バイオリソースセンターの細胞バンク(Riken Bioresource Center Cell Bank)から提供された。

（６−２）レンチウイルスベクター作製、及びトランスフェクション
pMIRNA1-mir-520d/GFP(20μg)(System Biosciences社、Mountain View、米国)とモック(mock)ベクターとしてのpCDH(20μg)とを各々、(10cm培養プレートあたり5 × 10⁶細胞の)293FT細胞へトランスフェクトした。 上清中のウイルス粒子を回収するために、4℃、120分間、170000 × gで遠心後、ウイルスペレットを回収し、Lenti-XTM(商標)qRT-PCR滴定キット(Clontech社、カリフォルニア、米国)を使用して力価測定を行った。293FTまたはHLF細胞へのレンチウイルス感染のために、10cm培養プレート当たり100万個のウイルスを使用した。ポジティブコントロールとして使用したRGM249miRNA-197 siRNAを、ステルスRNAiデザイナー(Stealth RNAi designer)(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)を用いて設計し、FuGENE HDトランスフェクション試薬(Roche Diagnostics社、バーゼル、スイス)を用いて、50nMの合成オリゴヌクレオチドを、293FT細胞へトランスフェクトした。また、520d-HLF細胞が骨芽細胞へと分化誘導することを確認するために、通常のRPMI1640培地中に2Mのpurmorphamineを添加して、その細胞を一週間処理した。

（６−３）免疫不全マウスとin vivo試験方法
レンチウイルス感染後のHLFを回収し、1マウス当たり5 × 10⁷個のHLF細胞を、各々のマウスの腹腔内および皮下(右側腹)へ接種した。注入体積は、200μlであった。6週齢の免疫不全マウス(KSN/Slc)(清水実験材料株式会社、京都、日本)を、4週間通常給餌した。KSN/Slcマウスを、100 mg/kgのネンブタールを腹腔内注射することにより麻酔し、解剖および組織学的検査のために屠殺した。皮下への異種移植を使用して、hsa-mir-520dの抑制効果を実証した。体積評価は、以下の式を使用して決定した:体積 = π/6 × 幅 × 長さ × 高さ。全ての動物は、日本実験動物管理公認協会承認施設で保管および飼育した。動物の研究と取り扱いについては国際動物実験委員会のガイドラインを厳格に遵守した。

（６−４）RT-PCR
small RNA分画を含んだトータルRNAを、培養細胞またはホモジェナイズしたマウス組織から、mirVana miRNA分離キット(Ambion社、オースチン、米国)を使用して抽出した。Mir-X(商標)miRNA qRT-PCR SYBR(登録商標)キット(Clontech社、Mountain View、米国)を製造元のマニュアル(Clontech)に従って使用することにより、成熟型miRNAsの定量を実施した。U6 small nuclear RNAをインターナルコントロールとして使用した。トータルRNA(50ng/μl)を、OneStep RT-PCRキット(日本QIAGEN社、東京、日本)を用いて逆転写および増幅した。PCR解析とデータ収集解析とは、LineGene(東洋紡、名古屋、日本)を使用して実施した。サンプルの発現レベルを、検量線方法（2^-ΔΔ法）を使用して決定した。全てのデータ(hTERTのものを除く)を、インターナルコントロールであるβ-アクチンに対して標準化した。hTERTの推定は、本発明者が以前開発した定量方法に従って、コピー数により行った。そのRNA定量を、シークエンシングによって、高い再現性をもって確認した。miRNA(25ng/μl)を、Mir-X miRNA qRT-PCR SYBRキット(タカラバイオ(株)、東京、日本)を使用して定量した。siRNAによる抑制を確認するために、miRNA発現変化を評価した。mRNAまたはmiRNA定量用のプライマー配列を、表４に示す。有意差を、*: P<0.05、**: P<0.01として示した。

（６−５）ウエスタンブロット
20μg/μlのタンパク質とi-Blotゲル転写システムとを用いてウエスタンブロット解析した。製造元のマニュアルに従って、抗β-アクチン抗体以外の抗体(抗hTERT抗体、抗p53抗体、抗Oct4抗体、抗DICER1抗体、抗AID抗体、抗Alb抗体、および抗GFAP抗体)を1:500倍に希釈し、抗β-アクチン抗体を1:1,000倍に希釈した。LAS-4000(富士フイルム、東京、日本)を使用して、化学発光シグナルを1分以内に検出した。

（６−６）免疫細胞化学
製造元(R&D Systems社、ミネアポリス、米国)のマニュアルに従って、多能性幹細胞マーカー(抗Oct3/4抗体および抗NANOG抗体)ならびに胚性幹細胞マーカー抗体パネル(Embryonic Stem Cell Marker Antibody Panel)を用いて、免疫組織化学的検査を実施した。293FT細胞およびHLF細胞に、miRNA-197に対するsiRNAもしくはhas-mir-520dを含むレンチウイルス粒子をトランスフェクトまたは感染させた。浮遊するトランスフェクタント(つまり、トランスフェクトされた細胞)を回収し、顕微鏡観察用の新しい培養プレートまたは免疫染色用スライドチャンバーに移した。Huh7においても、293FTとHLFと同一の処理を、免疫細胞化学検査のために行った。

（６−７）免疫組織化学
免疫組織化学解析のために、4%パラフォルムアルデヒド中で固定された肝臓組織標本を、常法により処理した。この試験で用いられたモノクローナル抗体は、以下のものである:抗アルブミン抗体(Sigma社、セントルイス、米国)、抗AFP抗体(Sigma社)、および抗GFAP抗体(Sigma社)。ネガティブコントロールとしては、一次抗体を省略して染色工程を実行した。発現の程度は、病理専門家が評価した。

（６−８）細胞周期解析
細胞周期解析を実行するために、単一細胞懸濁物を、冷却したPBSで一度洗浄した。細胞ペレットを、その後、穏やかにチューブを振とうすることによりほぐして、ddH2O中の3.7%ホルマリンを滴下して固定した。細胞を、少なくとも一晩、-20℃でインキュベートした。固定後、細胞を冷却したPBSを用いて二回洗浄してEtOHを除去した。その後、細胞を、100U/mlのRNaseA含有PBS中に、1 × 10⁶細胞/mlにて再懸濁し、37℃で50分間インキュベートした。50μg/mlのヨウ化プロピジウムを直接加えて、光を遮蔽して氷上において40分間インキュベートした。DNA含量を、EXPO32 ADC解析ソフトウエアを搭載したフローサイトメーター(EPICS ALTRA; Beckman Coulter社)により解析した。DNA含量は、pMIRNA1-mir-520d/GFPクローンをトランスフェクト後に、約20000イベントで評価した。GFP陽性細胞を、Moflo XDPセルソーター(EPICS ALTRA、Beckman Coulter社)により分取(ソート)した。

（６−９）組織学的検査
腫瘍体積、ならびに肺、肝臓、腹腔内、および後腹膜腔への転移がんを、明視野イメージング機能を備えた解剖顕微鏡下または肉眼で検査および計測した。組織サンプルは、10%緩衝ホルマリン溶液中で一晩固定し、PBSで洗浄し、70%エタノールへ移した。その後、パラフィンに包埋し、薄切し、ヘマトキシリン・エオシンを用いて染色した。

（６−１０）細胞における蛍光検出
レンチウイルスmir-520d発現ベクターによる感染効率を評価するために、緑色蛍光発現を検出した。

（６−１１）統計解析
一観察変数を有し、P<0.05を有意なものと見なすMann-Whitney Uテストを用いて、3つの群(コントロール群、モック(mock)群、およびmir-520d群)間で比較した。*: P<0.05、**: P<0.01である。

（６−１２）結果
（６−１２−１）293FT細胞へのhas-mir-520dのウイルス感染によるin vitro試験
表現系の変化を、顕微鏡的に評価した。図８Ａは、293FT細胞へのhas-mir-520dのウイルス導入後に出現した浮遊細胞集団を示す。GFP陽性浮遊細胞(図８Ａ（ａ）)を、ES細胞用のフィーダー細胞不含有培地中で培養し、GFP発現を有するトランスフェクタントの増殖過程をタイムラプスモードで観察した(図８Ａ（ｃ）)。has-mir-520dがウイルス感染した293FT細胞は、24時間以内にシート状の層を形成した。幹性化転換を、免疫細胞化学(図８Ｂ)に基づき確認した。GFP陽性細胞は、抗Oct4抗体により強く染色された。3日から1週間後、細胞はより大きなコロニーに生育し、NANOG陽性状態を維持していた(図８Ｃ)。トランスフェクタントの遺伝子発現を、RT-PCR、Western blot、および定量的miRNA RT-PCRにより評価した。

ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSCs)またはRGM249 miRNA197 siRNAによるトランスフェクタントと比較すると、has-mir-520dが過剰発現した293FT(520d-293FT)は、p53とRGM249とを強力に転写的にアップレギュレートし、Oct4とhTERTとをより弱く発現した。293FTと比較すると、p53、RGM249、およびOct4は、より強くアップレギュレートされるが、hTERTは、同じレベルで発現されていた(図９Ａ)。ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSCs)と比較すると、浮遊状態にある520d-293FTでは、p53とOct4とがより強く転写的にアップレギュレートされていた。hTERTは、同等に発現されていた。293FT (0日目)と比較すると、p53とOct4とは、より強くアップレギュレートされていたが、hTERTは同じレベルで発現されていた(図９Ｂ)。Dicer1はアップレギュレートされていて、そのことは、520dが成熟する過程にDicer1が必要なことを示唆した。さらに、520d-293FTにてhas-mir-520dの過剰発現と、およびRGM249 miRNA-197 siRNAによるトランスフェクタント中におけるRGM249 miRNA-197の抑制とを確認後では、RGM249 miRNA-197発現はhiPSC中でのものと同等であった。2種類のオリゴヌクレオチドを用いて処理することにより、hiPSCレベルのmiRNA発現を有する細胞へと、293FT細胞を有意に誘導した(図９Ｃ)。has-mir-520dの過剰発現は、RGM249 miRNA-197のダウンレギュレーションを生じた(図９Ｄ）。has-mir-520dのウイルス感染後、293FTは、培地中の接着性細胞もしくは浮遊性細胞のいずれか中で、mir-520dを安定的に発現した。ウイルス感染効率は、GFP陽性細胞ソーティングを用いて決定したところ、99.2%以上であった(データは示されない)。このことは、これらが、in vivo用に適応できる材料であることも示唆している。細胞周期解析によると、293FTおよびモックウイルス感染293FT(mock-293FT)と比較して、520d-293FTは、G0期が増加し、S期が減少していた(図１０Ａ)。520d-293FT細胞中のエピジェネティックマーカー(HDAC:ヒストン脱アセチル化酵素、Sin3A、およびMBD3:メチル-CpG結合ドメインタンパク質3) は、mock-293FTと比較した場合、高レベルで有意に維持されていた(P<0.01)。しかし、DNMT 1(DNA(シトシン-5-)-メチルトランスフェラーゼ)は、293FTまたはmock-293FT中でのものと同程度であった(図１０Ｂ)。

（６−１２−２）HLF細胞へのhas-mir-520dウイルス感染によるin vitro試験
has-mir-520d発現ベクターを受容したHLF細胞（以下「520d-HLF」と称することもある）を、10cmプレート当たり20〜50個の新規細胞集団へと転換した。図１１Ａ(左上図)に形態学的変化を示す。これらの細胞は、GFP(右上)および多能性マーカー(右下)を発現していた。その中で、Oct4およびNANOGは、転写的にアップレギュレートされていた。対照的に、RGM249、CD44、Alb、およびp53は、有意にダウンレギュレートされていた(**: P<0.01;図１１Ｂ)。浸潤アッセイにおいては、多能性マーカー陽性細胞のほとんどは、フィブロネクチン膜(6穴プレート当たり5μg/ml)を通過して移動することはできなかった。対照的に、mock-HLF細胞は、容易に移動することができた(図１１Ｃ)。ウエスタンブロットは、Oct4およびp53のアップレギュレーションを示した。has-mir-520d発現HLF(520d-HLF)細胞中で、DICER1が抑制されていた(図１１Ｄ)。mock-HLF細胞と比較した場合、520d-HLF細胞では、メチル化マーカー(HDAC、Sin3A、およびMBD3)が有意に低いレベルで維持されていた(P<0.01) (図１１Ｂ)。細胞周期解析によると、mock-HLFと比較して、520d-HLF細胞はS期が増加し、G0期が減少していたことを示した(図１２Ａ)。mir-520dを安定的に発現する10クローンのHLF細胞を、ES用培地で一ヶ月間に渡り培養した後には、HLFのものと比べて、520d-HLF細胞中でのhTERTおよびアルブミン(Alb)はダウンレギュレートされていた。520d-HLF細胞中での、Oct4およびp53はアップレギュレートされていた。がん幹細胞マーカー(PROM1:CD133)は、HLF、hiPSC、520d-HLF細胞間では有意差はなかった(図１２Ｂ)。CD44発現は有意に減少していた(P<0.01) (データは示されない)。さらにまた、mir-520dによるHuh7細胞(高分化肝癌細胞株)における多能性誘導を検証した。小さく丸い細胞集団におけるOct4およびNANOG発現は、モックベクターによる誘導と比較して、より上昇していた。また、2μMのpurmorphamine添加により、ALP、SPP1、およびIBSPのアップレギュレーションを有する骨芽細胞へと、520d-HLF細胞を誘導した。

図１３はHLF細胞の場合の初期化レベルを検討するためのグラフである。293FT細胞と共通しているのは、AID, DNMT1の発現レベルのみであり、293FTではHDAC, Sin3A, MBD3が有意に発現を高めるのに対し、HLFではそれらの発現が有意に低下した。

（６−１２−３）has-mir-520dウイルスが感染したHLF細胞によるin vivo試験
has-mir-520dのレンチウイルス発現ベクターまたはモックベクターにより、HLF細胞を感染したのち、その細胞(5 × 10⁷細胞)を、免疫不全マウス(KSN/Slc)の腹腔内間隙へ注射した。has-mir-520dを発現したHLF細胞を注入したマウス群の75%は、腹腔内または注射針の刺入部分に沿って腫瘍を形成した(図１４Ａ)。対照的に、100%のモック感染群は、白色結節(HE染色(×40)にて組織学的に未分化肝癌細胞)を、腹腔内または肝臓に形成した(図１４Ｂ)。12.5%(1/8)のマウス群中の520d-HLF細胞は、(肝細胞索、中心静脈、胆管(右図;白矢印)を有し、部分的に腺腫様過形成を内部に有する(図１４Ｄ)(右から2番目の図))正常肝組織へと転換した(図１４Ｃ、下図:HE染色組織標本)。37.5%(3/8)のHLF細胞は、表皮を有する類皮嚢胞と、汗腺(左図;白矢印)(図１４Ａ、図１４Ｄ、および図１４Ｃ上図;HE染色組織標本)とおよび皮脂腺(左から2番目;白矢印)とからなる奇形腫に形質転換した。生成した奇形腫と肝組織は、GFPタンパク質を発現していた(図１４Ｅ)(左図:HEおよび右図:GFP)。肝組織中のほとんど全ての肝細胞がヒトアルブミンを強く発現しているのを免疫組織化学染色により確認した。肝星細胞(HSC)/筋線維芽細胞(MFs)のマーカーである、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)およびアルファフェトプロテイン(AFP)は、弱く発現していた。このことは、一ヶ月間に、520d-HLF細胞が未成熟肝組織へと分化したことを示唆する。50%(4/8)は、全く腫瘍および特定組織を形成しなかった。

（６−１２−４）has-mir-520dウイルスが感染したHLF細胞の分化
また、免疫組織化学的分析により、未分化な肝臓組織のマーカーを用いて肝組織を構成する肝細胞、胆管、静脈、星細胞などの存在を確認できた（図１５）。骨分化誘導によりOsteopontin, sialoprotein陽性の骨芽細胞を得たことから、内・中・外胚葉へ分化できる間葉系幹細胞（MSC）に形質転換できた。（図１６）。

（６−１２−５）has-mir-520dウイルスが感染した各種悪性腫瘍細胞の評価
図１７は高分化型肝癌（Ｈｕｈ７）細胞について評価した結果である。肝癌細胞においては分化度に関わらず、同等に多能性マーカー強陽性に変化させることができた。図１８は多形性膠芽腫（Ｔ９８Ｇ）細胞について評価した結果である。未分化脳腫瘍においても幹性誘導し、in vivoで腫瘍を形成せずに正常組織に生着した。図１９は膵癌（ＰＫ−９）細胞について評価した結果である。膵癌においても幹性誘導が見られた。図２０は線維肉腫（ＨＴ１０８０）細胞について評価した結果である。非上皮性悪性腫瘍である肉腫細胞(ＨＴ１０８０)をも幹性誘導し、脂肪細胞へ分化させることができた。

＜実施例７： hsa-mir-192 siRNA等に関する実験方法と結果＞
（７−１）細胞
HMV-I(ヒト悪性黒色腫)
T98G（ヒト神経膠芽腫）
HT1080（ヒト線維芽肉腫）
Pk-45（ヒト肝臓癌）

（７−２）検討したmiRNA

（７−３）ｓｈＲＮＡ
表５のｍｉＲＮＡに対するｓｈＲＮＡ（hsa-mir-192 shRNA、hsa-mir-196a-1 shRNA、hsa-mir-423-3p shRNA、has-mir-222 shRNA）をコードするベクターは、GenScript corp.,（NJ, USA）から購入した。このベクターは、pRNATin-H1.4/Lenti (GenScript, corp.,)に上記ｓｈＲＮＡをコードする塩基配列が組込まれたものである（以下、「siRNA生成ウイルス）と証することもある）。細胞に導入後、shRNAを発現し、さらにsiRNAを生成することができる。

（７−４）ｓｉＲＮＡ
表５のｍｉＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（hsa-mir-192 siRNA、hsa-mir-196a-1 siRNA、hsa-mir-423-3p siRNA、has-mir-222 siRNA）は、Stealth RNAi designer（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって入手した。配列を表６に示す。これらｓｉＲＮＡが細胞増殖抑制等の効果を有していることを確認した後、上記（７−３）のｓｈＲＮＡでさらに細胞増殖抑制等の効果がみられるかどうかを検証するという流れで実験を行った。

なお、hsa-mir-192 siRNA、hsa-mir-196a-1 siRNA、hsa-mir-423-3p siRNA、has-mir-222 siRNA（hsa-mir-192 siRNA等）のアンチセンス鎖において、表５のｍｉＲＮＡの配列に対して、相補的な関係にある部分の配列を表７に示す。この相補的な部分が、ＲＮＡｉ又はｍｉＲＮＡの作用において特に重要な部分と考えられる。また、さらにその部分に相補的なセンス鎖の配列を併せて示す。

（７−５）細胞へのレンチウイルスのinfection
細胞へのinfectionは、まず、293FTまたは293H細胞へレンチウイルスベクター(pRNATin-H1.4/Lenti)をtransfectionし、上清を回収し、遺伝子実験施設にある超遠心機で、27,000rpm、2時間遠心してウイルスを回収し、ペレットをPBSに溶解し、力価を検討後、−80度で保存した。そのウイルスを用いて、力価に基づき、各50μlずつ細胞に感染させた。また、3種類のsiRNA ( has-mir-196a-1 siRNA / has-mir-423-3p siRNA / has-mir-222 siRNA) 共感染または4種類のsiRNA (hsa-mir-192 siRNA / has-mir-196a-1 siRNA / has-mir-423-3p siRNA / has-mir-222 siRNA)共感染では、1種類のウイルス粒子が有効に作用する力価で感染させた。

（７−６）RNAの抽出
mirVana(tm) miRNA Isolation Kit ( Ambion , TX , USA )を使用してmiRNA , totalRNAを抽出した。washした細胞にTorizol Reagent（ Life Technologies Carlabad , CA , USA ）を添加し、3分間インキュベート後Torizol Reagentの1/5量のchloroform（ ニッポンジーン , Tokyo , Japan ）を添加した。15秒間振盪後、14,000rpmで15分間遠心を行った。得られた上清の1/10量の100%エタノールを加え、数回転倒混和しspin columnに入れ、10,000g で15秒遠心した。カラムをwashするためmiRNA Wash Solution 1を700μl加え、10,000g で15秒遠心した。更にWash Solution 2/3を500μl加え、同様に遠心した。この作業を２回繰り返し、あらかじめ、95度に温めておいたRNase , DNase Free Waterを100μl加え、同様に遠心、そして、この過程を２回繰り返した。その後、真空濃縮を40分間し、そのうち2μlを使用し、NanoDrop（ バイオメディカルサイエンス, Tokyo, Japan ）を用いて濃度を測定した。

（７−７）real time RT-PCR
RGM249 , hTERT , Sox2 , p53 , c-Myc , Oct4 , PROM1の7種類の発現を調べるためにQIAGEN OneStep RT-PCR Kit ( Qiagen , Tokyo , Japan )を使用した。GAPDH , β-actinをコントロールとした。検討した遺伝子は多能性関連マーカー、未分化マーカー及び分化マーカー、テロメレース関連遺伝子を使用した。

（７−８）蛋白質抽出
PBS(-)でwashした細胞をtrypsin処理した後、エッペンドルフチューブに回収し、蛋白分解酵素阻害剤 Complete, Mini ( Roche Japan , Tokyo , Japan ) を含むCell Lysis Buffer ( SIGMA , Tokyo , Japan ) 22μlを加え、たんぱく質抽出液を得た。そのうちの2μlをNanoDropを用いて濃度測定に使用した。

（７−９）Western Blot解析
iBlot^TM ドライブロッティングシステム（ Invitorogen , Tokyo , Japan ）を使用し、電気泳動したゲルをセミドライ状態でメンブレンに転写した。その後WesternBreeze(r)イムノディテクションキット（ Invitorogen , Tokyo , Japan ）を使用し、ブロッキング30分、リンス5分×2、一次抗体60分、wash 5分×4、二次抗体30分、wash 5分×4、リンス2分×2を行った。そして、ケミルミネッセンス2.5mlをメンブレンに添加し5分後、遺伝子実験施設のLas-1000plus (FUJIFILM , Kanagawa , Japan ) で検出した。

（７−１０）cell cycle 解析
1×10⁶個の細胞をwashした後、trypsin処理し15mlチューブに回収した。その後、95%エタノールを5ml加え、オーバーナイトで固定した。翌日1μg/mlのRNaseを1ml加え、１時間37度でインキュベートした後、PIを5μl加え、30分以上4度、遮光で遺伝子実験施設のEPICS ALTRA ( Beckman coulter , Tokyo Japan ) で解析を行った。

（７−１１）MTT assay
PBS ( - )で washした細胞をtrypsin処理した後、96wallプレートに1×10⁶個の細胞を100μlずつ蒔いた。Promega社のCellTiter96^（R) Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kitを使用して細胞増殖能を検討した。

（７−１２）colony formation assay
soft agerを使用して、形質転換を起こした細胞の足場依存性及び腫瘍形成能を検討した。60mmディッシュにボトムアガロース( 0.5-0.6% )を2-3ml入れ、ある固形化した後、トップアガロース( 0.4% )で重層した。そして、そのディッシュに細胞を播き、1-2週間培養し、その後、細胞をカウントした。

（７−１３）miRNA の定量
Takara ( Tokyo , Japan ) 社のmir-x miRNA定量kitを用いて定量した。指定されたプロトコールに準じて施行した。

（７−１４）ゲノムへのウイルスベクターの取り込み検討
感染効率はレンチウイルスベクターの情報に準じて評価した。感染をGFP発現に関して蛍光顕微鏡で可視化して判定し、neomycinの導入、miRNAの導入を感染細胞の一部よりDNAまたはRNAを抽出し、PCRで増幅後、電気泳動で可視化して評価した。ゲノムへの取り込み部位の検討は施行しなかった。

（７−１５）実験結果
（７−１５−１）siRNA生成Lentivirus感染後のHMV-1におけるMTT assay
各siRNA生成ウイルスを感染させたHMV-1でのMTT assayを3日間施行した（図２１）。3種類のsiRNA ( has-mir-196a-1 siRNA / has-mir-423-3p siRNA / has-mir-222 siRNA) 共感染または4種類のsiRNA (hsa-mir-192 siRNA / has-mir-196a-1 siRNA / has-mir-423-3p siRNA / has-mir-222 siRNA)共感染細胞で有意に増殖抑制を確認した。統計学的有意差を* ( p<0.05 ) で示した ( Mann-Whitney test ) 。

（７−１５−２）siRNA生成Lentivirus感染2週間後でのHMV-1の蛍光顕微鏡写真と増殖曲線
各siRNA生成ウイルス感染による導入はmiRNA発現を阻害した。また、細胞の増殖抑制を示す経時的変化を示した（図２２）。図中のトップパネルは、1週間後のmockとhsa-mir-196a-1 / hsa-mir-423-3p / hsa-mir-222でのGFP検出のための蛍光顕微鏡写真である。図中のボトムパネルは、ウイルス感染後の HMV-1の増殖曲線である。コントロール、mock、hsa-mir-192、hsa-mir-196a-1 siRNA、hsa-mir-222 siRNAと比較して、3種類のsiRNA ( has-mir-196a-1 siRNA / has-mir-423-3p siRNA / has-mir-222 siRNA) 共感染または4種類のsiRNA (hsa-mir-192 siRNA / has-mir-196a-1 siRNA / has-mir-423-3p siRNA / has-mir-222 siRNA)共感染で顕著な増殖抑制を観察し、感染細胞は3週間以内にアポトーシスに至った。

（７−１５−３）HMV-1のsiRNA生成レンチウイルス感染における colony formation assay
miRNAに対するsiRNAを生成するウイルスベクターに感染させ、siRNAが導入されたHMV-1において、腫瘍形成能を評価するためにsoft agerを用いて、colony formation assayを行った（図２３）。コントロールではコロニーを多数形成しているのに対し、hsa-mir-192単独導入、4種類 (has-mir-192 / -196a-1 / -423-3p / -222 ) のmiRNAの共発現で、顕著にコロニー形成能が抑制された。hsa-mir-192に対するsiRNAでは途中までコロニー形成を認めたが、その後、増殖は止まり、そのまま細胞の断片化を起こしてアポトーシスに至った。また、4 種類 (has-mir-192 / -196a-1 / -423-3p / -222)の共感染ではコロニーを形成することはなかった。

以上の実施例における各種材料および操作方法は、特に記載のない限り、以下の通り行なった。
・アンタゴマーの合成
アンタゴマー（ｍｉＲＮＡを標的としたｓｍａｌｌ ＲＮＡ）のデザインと合成はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Stealth RNAi designer (https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)）とＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社へ委託した（pRNATin-H1.4/Lenti, pRNAT-T6.1/neo）。ｓｈＲＮＡ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇベクターはBLOCK-it Inducible H1 RNAi Entry Vector （Invitrogen, CA, USA）を用いて、プロトコールに沿って作成した。

・セルライン
ＨＬＦ細胞ラインとＨＭＶ−Ｉ細胞ラインはAmerican Type Culture CollectionとTohoku Universityからそれぞれ購入し、１０％ ＦＢＳと１％ ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。アンタゴマー処理の場合、ＨＭＶ−１細胞を５０ ｎＭのａｎｔａｇｏｍｉｒとともにインキュベーションした。

・ＲＮＡｉ
FuGene HD transfection Reagent （Roche Diagnostic GmbH）を使用して、ＨＬＦまたはＨＭＶ−Ｉ細胞に、５０ ｎＭ ｓｉＲＮＡ、コントロールのオリゴヌクレオチド、または空のベクターをトランスフェクションした。ダイサー（Ｄicer enzyme）はＧｅｎｌａｎｔｉｓから購入し、プロトコールに沿って使用した。３つのｍｉＲＮＡは、ダイサーで消化したものをmiRCAT-microRNA cloning kit （Integrated DNA Technologies）でクローニングすることによって得た。免疫不全マウスは、Charles riverからCAnN Cg-Foxn1 BALB/c-nuを、SHIMIZU Laboratory Supplies Co., Ltd．からKSN/Slcを購入した。

・ＲＮＡの単離とｍｉＲＮＡの定量
トータルＲＮＡ、ｓｍａｌｌ ＲＮＡフラクションは、培養細胞またはホモジナイズしたマウス組織から、mirVana miRNA Isolation Kit （Ambion）を用いて抽出した。ｍｉＲＮＡの成熟化の定量は、Mir-X^TM miRNA qRT-PCR SYBR^(R) kit （Takara Bio Company）を用いて説明書に従って行った。U6 small nuclear RNAをインターナルコントロールとして使用した。

・ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ
トータルＲＮＡは、OneStep RT-PCR kit （QIAGEＮ）を用いて逆転写及び増幅させた。ＰＣＲとデータ収集分析はLineGene （TOYOBO）を用いて行った。サンプルの発現レベルは、検量線方法（2^-ΔΔ法）を使用して決定した。全てのデータ(hTERTおよびRGM249のものを除く)を、インターナルコントロールであるβ-アクチンに対して標準化した。hTERTおよびRGM249の推定は、本発明者が以前開発した定量方法に従って、コピー数により行った。mRNAに関しては50ng/μlで、small RNAに関しては100ng/μlで試験した。

・免疫ブロッティング
ウエスタンブロット解析をi-Blotゲル転写システム(Invitrogen社)を使用して実行した。目的バイオマーカー遺伝子に対するそれぞれの抗体を、製造元のマニュアルに従った希釈率を用いて使用した。20μgの細胞抽出物を試験した。

・腫瘍形成および転移に関する実験
取大学動物実験委員会で承認されたプロトコルに基づいて、動物実験を実施した。腫瘍細胞接種、検死、および組織学的解析を、実験方法セクションに記載したように実施した。播種から７日後、ショートサイレンスオリゴヌクレオチドによる処理を、マウスの尾静脈または右側腹の皮下に、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ （１００μＭ）を週一回のペースで４〜５週にわたって行なった。腫瘍を摘出して計量した。腫瘍体積、ならびに肺、肝臓、腹腔内、および腹腔外(postperitoneal)転移がんを、明視野イメージング機能を備えた解剖顕微鏡下または肉眼で検査および計測した。組織サンプルは、10%緩衝ホルマリン溶液中で一晩固定し、PBSで洗浄し、70%エタノールへ移した。その後、パラフィンに包埋し、薄切し、ヘマトキシリン・エオシンを用いて染色した。転移プロセスの後期ステージにおけるantagomirの効果を評価するために、胸腺欠損マウスの尾静脈を介するかまたは皮下に腫瘍細胞を移植した。次に、腫瘍細胞移植7日後に、同所性の実験に使用したと同一の用量と頻度でantagomir治療を開始した。静脈内投与の場合は全身性転移によって、または、皮下接種の場合は肝臓転移もしくは腹腔内転移によって、マウスは30日目には瀕死の状態になり、安楽死させた。

・毒性の評価
胸腺欠損マウスを、１グループにつき５匹に分けて、ＰＢＳ＋ＤＤＳまたは５０ μＭのアンタゴマーを、週一回のペースで４〜５週間にわたって６回、静脈投与した。体重は２週に１回のペースで測定した。マウスは最後の投与後６日で安楽死させ、組織を収集した。全血の一定分量をＥＤＴＡで処理したチューブに集めた。遠心分離により血球細胞を除去して、血漿を得た。サンプルを、オリンパス社製Bioanalyzerを使用して解析し、血液の生化学的値を測定した。全ての可能な病理状態に関して、肺または肝臓の切片を検査した。

・ヒト正常細胞への誘導
ｍｉＲＮＡ−４７、−１０１、−１９７に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることにより、293FT細胞はヒト正常細胞へと誘導された。その後、ＲＴ−ＰＣＲとウエスタンブロット法を用いて関連遺伝子の発現の変化を評価した。

・免疫組織化学試験
製造元(R&D Systems、ミネアポリス、米国)のマニュアルに従って、未分化マーカー(抗Oct-4抗体)ならびに胚性幹細胞マーカー抗体パネル(Embryonic Stem Cell Marker Antibody Panel)を用いて、免疫組織化学検査を実施した。細胞に、miRNA-197に対するsiRNAをトランスフェクトまたは感染した。浮遊するトランスフェクタントを回収し、顕微鏡観察用の新しい培養プレートまたは免疫染色用スライドチャンバーに移した。

・ｈｉＰＳＣ（Human-induced pluripotent stem cells）
ヒト人工多能性幹細胞であるｈｉＰＳＣ（HPS0002 253G1）はRiken Bioresource Center Cell Bank（'Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.' Nakagawa M et al., Nat Biotechnol 26, 101-106 (2008)）から提供された。

・培養条件
ｍｉＲ−１９７ ｓｉＲＮＡまたはｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄを導入して作成した多能性幹細胞は、ＥＳ細胞用培養液で培養できるが、F-12 HAM[DMEM(15mM HEPES＋１ｍM Sodium Pyruvate+pyridoxine+NaHCO3+5mML-glutamine)], RPMI-1640+L-glutamine, DMEM+high glucose+L-glutamine+0.1mM NEAA およびREPROSTEM(REPROCell社)：bFGF 3-10ng/mlからなる群から選ばれる１種以上の培地で３７℃、５％ＣＯ₂、１０％ＦＢＳの条件で培養可能であった。

・フローサイトメトリー
miRNA-197に対応するsiRNAをトランスフェクトした293FT細胞を使用して、トリプシンにより分離脱着した細胞上で、フローサイトメトリーを実行した。単一細胞懸濁物を、冷却したPBSで一度洗浄した。細胞ペレットを、その後、穏やかにチューブを振とうすることによりほぐして、ddH2O中の冷却70%EtOHを滴下して固定した。細胞を、少なくとも一晩、-20℃でインキュベートした。固定後、細胞を冷却したPBSを用いて二回洗浄してEtOHを除去した。その後、細胞を、100U/mlのRNAaseA含有PBS中に、1 × 10⁶細胞/mlにて再懸濁し、37℃で50分間インキュベートした。50μg/mlのヨウ化プロピジウムを直接加えて、光を遮蔽して氷上において40分間インキュベートした。DNA含量を、フローサイトメーター(EPICS ALTRA; Beckman Coulter社)により解析した。リプログラムされた細胞の発現を評価するために、EXPO32 ADC解析ソフトウエアを搭載したフローサイトメーターにより、siRNA-197をトランスフェクション後、約20000イベントで、iPS細胞を評価した。GFP発現細胞もしくはPE陽性細胞のフローサイトメトリーを用いた精製に関しては、ウイルストランスダクション過程の完了24時間後に、(未分化状態を維持して2週間培養後の)293FT細胞またはHLF細胞を、5%FCSを添加したリン酸緩衝液(PBS)中に再懸濁した。PE抱合抗アルカリホスファターゼ(ALP)抗体で、細胞を染色後、GFP陽性細胞またはPE陽性細胞を、Moflo XDP(Beckman Coulter社、カリフォルニア、米国)を使用して分取および解析した。1×10⁸細胞を、アルゴンレーザー(488nm、100mW)を用いて、フォワードスキャッター、サイドスキャッター、ならびにPEおよびGFP蛍光に関して解析した。検出器としては、各々、GFPに関してはFL1を、PEに関してはFL2を使用した。

・頭蓋内注入方法
免疫不全マウスをペントバルビタールナトリウム(50mg/kg、腹腔内注射)を用いて麻酔し、定位固定装置中に配置した。外科手術中、動物の体温を、加熱パッドを使用して、37℃に維持した。頭蓋を露出し、左線条体の上に、小規模な開頭を作製した。ポリエチレンの管を介して10μlのハミルトンシリンジに連結された30Gの注射針を、細胞移植用に使用した。注射針を、左線条体に定位的に挿入(ブレグマからA(前方) 0.5mm、L(側方) 2.0mm、D(深さ) 2.5mm)し、5μlの細胞懸濁物(10⁸細胞/μl)を圧力注射した。注射後、その注射針をゆっくりと引き抜いて、頭蓋の孔を、歯科用セメントを用いて被覆した。切開部を、6-0プロレン(Prolene)を用いて縫合した。外科手術から回復後、動物を元の飼育ケージへと戻した。

＜結果の考察＞
以上の結果を踏まえて考察する。実施例の結果、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡは悪性腫瘍の増殖抑制、悪性腫瘍の転移抑制、細胞内ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡ量の抑制、または細胞内ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ量の抑制の効果を有していることが示された。また、３つのｓｉＲＮＡは、悪性腫瘍の増殖抑制、悪性腫瘍の転移抑制、細胞内の３つのｍｉＲＮＡ量の抑制、未分化マーカーのアップレギュレイト、ｐ５３のアップレギュレイト、または正常細胞もしくは悪性腫瘍細胞のリプログラミングの効果を有していることが示された。ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄは、未分化マーカーのアップレギュレイト、ｐ５３のアップレギュレイト、または正常細胞もしくは悪性腫瘍細胞のリプログラミング、悪性腫瘍の増殖抑制等の効果を有していることが示された。また、hsa-mir-192 siRNA等についても類似の効果が見られた。マウスで見られた悪性腫瘍の抑制は、悪性腫瘍細胞のリプログラミングが要因のひとつであると考えられる。また、未分化型だけでなく高分化型肝癌細胞でもOct4陽性かつNANOG陽性細胞になり、分化型によらない幹性化効果が見られた。なお、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡと３つのｓｉＲＮＡは、ＲＧＭ２４９ ｍＲＮＡから始まるカスケードを遮断する点で機能が共通しており、この機能が上記の悪性腫瘍の抑制や悪性腫瘍細胞のリプログラミング等の効果に関与していると考えられる。ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄはこのときアップレギュレイトしていると考えられる。以上から、ＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡ、３つのｓｉＲＮＡ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄ、hsa-mir-192 siRNA等はいずれも悪性腫瘍治療に好適に使用できると考えられる。

さらには、これらｓｍａｌｌ ＲＮＡは体内外で細胞を多能性幹細胞へと誘導する誘導剤、または多能性幹細胞を生産するための試薬として好適に使用できると考えられる。特に、癌遺伝子を使用しない点、悪性腫瘍細胞をリプログラミングできる点、単剤でリプログラミングできる点、ｐ５３のアップレギュレイトが生じる点、または培養時にフィーダー細胞が不要である点において従来の多能性幹細胞を生産するために研究されてきた化合物よりも優れた特性を有していると考えられる。

特に悪性腫瘍細胞のリプログラミングについては世界的にほとんど研究成果がでていない領域であり、今後の悪性腫瘍治療の新たな可能性を秘めている。また、ｐ５３については、そのノックアウトやノックダウンがｉＰＳ細胞の作成効率を上昇させることが報告されている（Zhao et al., Cell Stem Cell. 2008 Nov 6;3(5):475-9.、 Hong et al., Nature. 2009 Aug 27;460(7259):1132-5. Epub 2009 Aug 9.）ため、上記ｓｍａｌｌ ＲＮＡを用いて得られた多能性幹細胞が、ｐ５３をアップレギュレイトしていたことは驚くべき結果であった。そしてこの多能性幹細胞は、ｐ５３が発現しているため悪性腫瘍化しにくいと考えられる。

なお、上記ｓｍａｌｌ ＲＮＡを導入した細胞の腫瘍化は、導入後未分化維持環境を持続させる場合に生じ、生体内では腫瘍は発生しにくかった。そのため、細胞にｓｍａｌｌ ＲＮＡ導入後は１週間以内に治療に用いることが好ましい。

またＲＧＭ２４９ ｓｈＲＮＡ、３つのｓｉＲＮＡ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄは、それぞれへアピン様構造の１本鎖、２本鎖、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ様構造の１本鎖からなっている。このことは、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが機能するときの２次構造は必ずしも固定されたものではなく、ある程度の範囲を許容できることを示唆している。

なお上記実施例において３つのｓｉＲＮＡ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄ、またはｈｓａ−ｍｉｒ−１９２ ｓｉＲＮＡ等は、標的ＲＮＡ鎖をＲＮＡｉまたはｍｉＲＮＡの作用でサイレンシングしていると考えられる。しかし仮に他のメカニズムが働いていたとしても、３つのｓｉＲＮＡのセンス鎖（配列番号４、配列番号５、または配列番号６）およびアンチセンス鎖（配列番号１、配列番号２、または配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５２０ｄ（配列番号４３）、またはｈｓａ−ｍｉｒ−１９２ ｓｉＲＮＡ等（配列番号４４等）を使用すれば、上記のような効果が得られることは明らかである。または、ここで示されない標的ＲＮＡ鎖と反応していても同様である。

以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

Claims (25)

1. 配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、を含む１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドと、
   アテロコラーゲンと、
   を含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。
2. 前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ作用を有する、請求項１に記載の多能性幹細胞誘導剤。
3. 前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、ｓｍａｌｌ ＲＮＡである、請求項１又は２に記載の多能性幹細胞誘導剤。
4. 前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、１本鎖または２本鎖のＲＮＡ鎖である、請求項１〜３いずれかに記載の多能性幹細胞誘導剤。
5. 前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、１５以上のヌクレオチドからなる、請求項１〜４いずれかに記載の多能性幹細胞誘導剤。
6. 前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、１００以下のヌクレオチドからなる、請求項５に記載の多能性幹細胞誘導剤。
7. 前記１本鎖のポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡであり、前記２本鎖のポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項１〜６いずれかに記載の多能性幹細胞誘導剤。
8. 前記ｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが３５〜１００ヌクレオチドからなり、前記ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのガイド鎖が１５〜４０ヌクレオチドからなる、請求項７に記載の多能性幹細胞誘導剤。
9. 前記ｓｈＲＮＡ、前記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、および前記ｍｉＲＮＡが、１〜５ヌクレオチドからなるオーバーハングを含む、請求項７又は８に記載の多能性幹細胞誘導剤。
10. 前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、さらに、配列番号４２の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜５個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含む、
    請求項１〜９いずれかに記載の多能性幹細胞誘導剤。
11. 前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、さらに、配列番号４１の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖を含む、請求項１〜９いずれかに記載の多能性幹細胞誘導剤。
12. 前記１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドが、１本鎖のポリヌクレオチドであり、且つｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである、請求項１〜１０いずれかに記載の多能性幹細胞誘導剤。
13. 前記１本鎖のポリヌクレオチドが、配列番号４３の塩基配列、またはその塩基配列に対して１〜４個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含む、
    請求項１２に記載の多能性幹細胞誘導剤。
14. 配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
    を含むｓｍａｌｌ ＲＮＡと、
    アテロコラーゲンと、
    を含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。
15. ａ）配列番号４３の塩基配列、
    ｂ）配列番号４３の塩基配列に対して、９８％以上の相同性を有する塩基配列、
    ｃ）配列番号４３の塩基配列において１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
    からなる群から選ばれる１種以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドと、
    アテロコラーゲンと、
    を含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。
16. 体細胞を多能性幹細胞へ誘導する、請求項１〜１５いずれかに記載の多能性幹細胞誘導剤。
17. 悪性腫瘍細胞を多能性幹細胞へ誘導する、請求項１〜１５いずれかに記載の多能性幹細胞誘導剤。
18. 前記悪性腫瘍が、肝臓癌、膵臓癌、肉腫、グリオーマ、メラノーマからなる群から選ばれる１種以上の悪性腫瘍である、請求項１７に記載の多能性幹細胞誘導剤。
19. 前記多能性幹細胞が、内在性のｐ５３を発現している、請求項１〜１８いずれかに記載の多能性幹細胞誘導剤。
20. 配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
    を含む１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドと、
    アテロコラーゲンと、
    を含有し、未分化細胞マーカーの発現を調節する、未分化細胞マーカー発現調節剤。
21. 請求項２０に記載の未分化細胞マーカー発現調節剤であって、
    前記未分化細胞マーカーが、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＰＲＯＭ１からなる群から選ばれる１種以上の未分化細胞マーカーである、未分化細胞マーカー発現調節剤。
22. 配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、を含む１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドと、
    アテロコラーゲンと、
    を含有する、肝臓癌、肺癌、肉腫、グリオーマ、メラノーマからなる群から選ばれる１種以上の悪性腫瘍の治療薬。
23. 配列番号４１の塩基配列に相補的な塩基配列、またはその塩基配列に対して１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターと、
    アテロコラーゲンと、
    を含有し、細胞を多能性幹細胞へ誘導する、多能性幹細胞誘導剤。
24. 配列番号４１の塩基配列に相補的な塩基配列、またはその塩基配列に対して１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターと、
    アテロコラーゲンと、
    を含む、肝臓癌、肺癌、肉腫、グリオーマ、メラノーマからなる群から選ばれる１種以上の悪性腫瘍の治療薬。
25. 配列番号４１の塩基配列、またはその塩基配列に対して１個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチドと、
    アテロコラーゲンと、
    を含む、多能性幹細胞誘導用、未分化細胞マーカー発現調節用、または肝臓癌、肺癌、肉腫、グリオーマ、メラノーマからなる群から選ばれる１種以上の悪性腫瘍の治療用のキット。