JP5714111B2 - 酸化鉄ナノカプセル、酸化鉄ナノカプセルの製造方法及びこれを利用したｍｒｉ造影剤 - Google Patents

Description

本発明は、対照度に優れたＭＲＩ造影剤用酸化鉄ナノカプセル及びその製造方法に関し、詳細に、少ない量で優れた対照度を有し、生体滞留時間が適合し、機能化が容易なＭＲＩ造影剤用酸化鉄ナノカプセル及びその製造方法に関する。

超常磁性ナノ粒子は、特に、ナノ−バイオ分野において磁気共鳴画像（ＭＲＩ）造影剤、細胞分離、磁気温熱治療（Hyperthermia）、薬物伝達、バイオセンサーなどの多様な応用分野に適用が可能であるから、多くの注目を受けている。

超常磁性ナノ粒子の合成方法には、共沈法（coprecipitation）、水熱合成法（hydrothermal synthesis）、熱分解法（thermal decomposition）などがあり、共沈法及び水熱合成法は、塩化鉄（ＩＩ）と塩化鉄（ＩＩＩ）溶液を水溶上において直接反応して沈殿させる方法であって、酸化鉄ナノ粒子を容易に製造できるものの、サイズを制御し難いという短所がある。

ヒョン・テクファン等（Ｈｙｅｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．）は、特許文献１（ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４００９）にて無毒性の金属塩を反応物として利用して均一なナノ粒子をサイズ選択過程無しで大量合成する熱分解方法を開発した。しかしながら、この方法は、ナノ粒子の表面にオレエート（oleate）が付着されて水相中に分散し難いので、バイオ研究応用がむずかしいという短所がある。

疎水性リガンドが付着された金属酸化物ナノ粒子を水相中に分散するための方法として、リガンド交換技術（ligand exchange）、両親媒性物質を利用したセルフアセンブリー（self-assembly）ナノ粒子製造技術、高分子を利用したカプセル化技術（Encapsulation）などがある。

ＡＭＡＧ社のＦｅｒｉｄｅｘ、Ｂａｙｅｒ−Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社のＲｅｓｏｖｉｓｔとして代表される従来の商用超常磁性ナノ粒子系肝造影剤は、共沈法で製造したものであって、造影性能を表す酸化鉄ナノ粒子のサイズを調節し難く、サイズ分布が均一でないから、造影剤の対照度の向上がむずかしいという短所がある。また、酸化鉄が封入されたカプセルの形状及びサイズの調節が容易でないから、静脈注射の際、生体内の分布を調節し難い。

チョン・ジンウなどは、特許文献２（韓国公開特許第１０−２００６−００２１５３６）において熱分解法で合成した酸化鉄ナノ粒子を多作用基リガンドで安定化する水溶性ナノ粒子製造技術を開示した。前記方法は、付着領域−交差連結領域−活性成分結合領域からなるリガンドをオレエートと交換する方法により酸化鉄ナノ粒子を個別的にコーティングするので、肝造影剤に適したサイズに制御し難く、Ｔ２弛緩性能を向上させる酸化鉄ナノ粒子の凝集効果を認めることができない。

ハム・スンジュなどは、特許文献３（韓国登録特許第０８１９３７７）において熱分解法で合成したナノ粒子を両親媒性化合物で水分散させて造影剤として使用する技術を開示した。前記方法は、疎水性−親水性部分を含む両親媒性化合物として磁性ナノ粒子を捕集する方法であって、物質が両親媒性化合物に限定され、造影剤として求められるナノ粒子のサイズ、サイズ分布、酸化鉄ナノ粒子の封入率などを制御し難いので、造影性能の向上が困難である。

ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）は、乳酸（lactic acid）とグリコール酸（glycolic acid）との共重合体であり、優れた生体適合性と生分解性特性により注射剤としてＦＤＡ承認を得た物質であって、最近、多様な薬物伝達分野及び医療分野に応用されている。ＰＬＧＡは、周辺の水分子と加水分解反応を起こして、エステル結合（ester linkage）が切れ分解される特性を表し、これによって、数カ月以内に分解されて生体から容易に排出される。

本発明は、対照度に優れた肝診断用ＭＲＩ造影剤に関し、さらに詳細には、生分解性高分子を利用してオレイン酸がコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を均一なサイズにコーティングする製造方法を開発し、これをＭＲＩ肝造影剤として利用する方法についたものである。

ＫＡＩＳＴのキム・ジョンドク教授が２００５年に出願した韓国登録特許第０７０２６７１（特許文献４）は、生分解性高分子のうちの一つであるＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡなどを利用して酸化鉄ナノ粒子を乳化−拡散方法でカプセル化する方法を開示したが、共沈法で製造した酸化鉄ナノ粒子を使用している。したがって、酸化鉄ナノ粒子の表面にオレエートが付着されない形態であり、これをカプセル化に適用する方法が異なる。また、最大封入率が５％を超過する場合に、ナノ粒子の凝集現象によりカプセルのサイズが大きくなり、これを調節できないという問題が生じると記述している。

Ｂ．Ｓ．Ｊｅｏｎ等は、２００９年発表した論文（J.Nanosci.Nanotechnol.,9,7118-7122(2009)；非特許文献１）においてナノ粒子の表面に付着される有機酸の種類をオレイン酸、ドデカン酸、オクタン酸などで調節して、乳化−拡散法の封入率を増加させながらもナノ粒子のサイズを維持する方法を開示しているが、最大封入率が７重量％に限定されると記述している。

上述したように、市販されている肝造影剤は、共沈法で製造した超常磁性酸化鉄ナノ粒子を使用し、最近開発されている熱分解方法で製造した酸化鉄ナノ粒子は、結晶性が高く均一なサイズを有するので、磁化度とＭＲ造影性能が高いという長所があるが、製造工程上疎水性であるオレエートがナノ粒子の表面に付着されて水溶液に分散が難しく、したがってバイオ応用分野に適用し難いという短所がある。

特に、バイオ応用研究の中でも造影剤のような注射剤の剤形は、最終粒子のサイズ及びサイズ分布、ゼータ電位、密度などの物理化学的特性により、薬物動力学（Pharmacokinetics）が大きく変わるので、これを目的通りに正確に調節する技術が必要である。

オレエートが付着された酸化鉄ナノ粒子を水溶液に分散させるために、リガンド交換、両親媒性物質を利用した高分子ミセル、リポソーム、デンドリマーなどを利用する多様な方法が研究されたが、ＭＲ対照度が充分でなく、粒子サイズの調節が容易でないから、生体内での時間の経過によるＭＲ挙動が均一でないという短所がある。

また、酸化鉄ナノ粒子の分散方法で混ざらない二相（Ｏ／Ｗ）を強制乳化させた後、有機溶媒が濃度差により水相への拡散を進行する時に、有機溶媒に溶解されていた高分子と活性物質とが共に拡散されて高分子カプセルを形成する乳化−拡散法があるが、オレエートが付着された酸化鉄ナノ粒子は、部分水混和性溶媒への分散が難しいから、封入率が低いという短所がある。

特に、封入率が０．５重量％より低い場合に、１ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの造影剤を製造するために、２００ｍｇカプセル／ｍｌ以上の濃度で製造しなければならないので、注射剤の浸透圧と粘度が高まることによって、注射時に痛みを伴ったり激しい場合に浸透圧ショックを起こすことができる。

また、生体注入時にナノカプセルのサイズが大きなマイクロメータサイズのカプセルは、毛細血管を塞いで組織の壊死を誘発する等の副作用が発生してナノカプセルの均一度を調節することが極めて重要である。

国際出願ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４００９号 韓国公開特許第１０−２００６−００２１５３６号 韓国登録特許第０８１９３７７号 韓国登録特許第０７０２６７１号

Ｊ．Ｎａｎｏｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９，７１１８−７１２２（２００９）

本発明は、上述した問題点を解決するために案出されたものであって、伝統的な乳化−拡散法の限界であった低い封入率問題を解決して、高い封入率を有するものの、カプセルのサイズが小さく、極めて均一な酸化鉄ナノカプセル及びその製造方法を提供することであり、水溶液内で極めて優れた安定性を有し、組織への吸収及び分布が再現性あるように調節され、低い濃度で非常に優れたＭＲＩ造影性能を有し、生体内副作用が防止されて、安全性に優れた酸化鉄ナノカプセル及びその製造方法を提供することであり、本発明に係る酸化鉄ナノカプセルを含有するＭＲＩ造影剤を提供することである。

以下、本発明の酸化鉄ナノカプセル、その製造方法及びこれを利用した造影剤を詳細に説明する。このとき、使用される技術用語及び科学用語において他の定義がないならば、この発明が属する技術分野における通常の知識を有した者が通常理解している意味を有し、下記の説明において本発明の要旨を不明にする恐れがある公知機能及び構成についての説明は省略する。

本発明に係る酸化鉄ナノカプセルは、疎水性リガンド（ligand）が結合された複数の酸化鉄ナノ粒子が生分解性高分子及び界面活性剤を含むカプセル物質に封入された酸化鉄ナノカプセルであり、下記の関係式１、２、３、４及び５を満たす特徴がある。

（関係式１）
５≦１００＊Ｄ_ｍ（ＩＯ）／Ｃ_ｖ（ＩＯ）
（関係式２）
２．５≦１００＊Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）／Ｃ_ｖ（Ｃａｐ）
（関係式３）
０．５重量％≦Ｆ（ＩＯ）≦５０重量％
（関係式４）
１ｎｍ≦Ｄ_ｍ（ＩＯ）≦２５ｎｍ
（関係式５）
５０ｎｍ≦Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）≦２００ｎｍ
（前記関係式１中、Ｄ_ｍ（ＩＯ）は、酸化鉄ナノ粒子の平均サイズであり、Ｃ_ｖ（ＩＯ）は、酸化鉄ナノ粒子のサイズ分布において標準偏差（standard deviation）で、前記関係式２中、前記Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）は、酸化鉄ナノカプセルの平均サイズであり、Ｃ_ｖ（Ｃａｐ）は、酸化鉄ナノカプセルのサイズ分布において標準偏差であり、前記関係式３中、Ｆ（ＩＯ）は、酸化鉄ナノカプセルで封入された酸化鉄ナノ粒子の重量％であり、前記関係式４中、Ｄ_ｍ（ＩＯ）は、関係式１の定義と同一で、前記関係式５中、Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）は、関係式２の定義と同一である。）

このとき、前記サイズは、直径を意味し、Ｄ_ｍ（ＩＯ）は、疎水性リガンドが付着された状態の酸化鉄ナノ粒子の平均直径を意味し、Ｃ_ｖ（ＩＯ）において酸化鉄ナノ粒子のサイズ分布は、疎水性リガンドが付着された状態の酸化鉄ナノ粒子の直径分布を意味し、Ｆ（ＩＯ）は、複数の酸化鉄ナノカプセルに封入された酸化鉄ナノ粒子の平均封入量を意味する。

上述したように、本発明の酸化鉄ナノカプセルに封入された疎水性リガンドが付着された酸化鉄ナノ粒子は、関係式４を満たす特徴がある。直径が１ｎｍ未満である酸化鉄は、磁化値が極めて小さいから、Ｔ２造影性能が大きく低下して、造影剤として使用し難く、直径が２５ｎｍを超過する場合に、酸化鉄ナノ粒子の磁化値は高いが、強磁性体になって外部磁場が除去された状態でも残留磁化を維持するので、粒子間凝集がひどく起きることができるから造影剤としての使用に適していない。

前記酸化鉄ナノ粒子の表面に結合された前記疎水性リガンドは、前記酸化鉄ナノ粒子の表面を安定化させる役割を果たし、前記酸化鉄ナノ粒子と結合された前記疎水性リガンドは、オレイン酸（oleic acid）、ステアリン酸（stearic acid）、ラウリン酸（lauric acid）、パルミチン酸（palmitic acid）、オクタン酸（octanoic acid）及びデカン酸（decanoic acid）の中から選ばれるいずれか一つまたはこれらの混合物を含む。

前記疎水性リガンドが結合された酸化鉄ナノ粒子において、疎水性リガンドの質量比率は５重量％ないし６０重量％であり、好ましくは１０重量％ないし４０重量％、さらに好ましくは２０重量％ないし３０重量％である。

疎水性リガンドが５重量％未満である場合に、酸化鉄ナノ粒子の表面を十分に覆うことができなくて、酸化鉄粒子の凝集及び沈殿を防止できないから、溶媒への分散性を低下させ、疎水性リガンドが６０重量％超過の場合に、カプセル内の封入率を大きく減少させるという短所がある。

また、本発明において、酸化鉄ナノカプセルに封入される疎水性リガンドが付着された酸化鉄ナノ粒子は、関係式１を満たすという特徴がある。前記関係式１中、１００＊Ｄ_ｍ（ＩＯ）／Ｃ_ｖ（ＩＯ）は、酸化鉄ナノ粒子の均一度（uniformity）を意味する。前記均一度は、１００／変動係数（Ｃ．Ｖ．；Coefficient of Variance）で定義され、前記変動係数は、標準偏差／平均値で定義される。これにより、前記関係式１の酸化鉄ナノ粒子の均一度は、１００／酸化鉄ナノ粒子の変動係数であり、前記酸化鉄ナノ粒子の変動係数は、酸化鉄ナノ粒子サイズ分布での標準偏差／酸化鉄ナノ粒子の平均サイズとなる。

前記酸化鉄ナノ粒子の均一度が前記関係式１を満たすことによって、前記酸化鉄ナノカプセルに封入される酸化鉄ナノ粒子が５０ｎｍ以上の均一なサイズに凝集（aggregation）されて、造影性能（Ｒ２）を増加させるようになる。

さらに詳細に、酸化鉄ナノ粒子の均一度が５以上である場合に、溶解性が一定な、目標サイズだけの酸化鉄粒子を使用するから、カプセル内封入率を増加させてカプセルの造影性能を増加させることができ、均一度が５以下である場合に目標サイズの他、ナノ粒子の比率が高まるようになって、造影性能が低下する。すなわち、目標サイズより小さなナノ粒子は磁化度が低いから、カプセルの造影性能を低下させる結果を表し、目標サイズより大きなナノ粒子は、溶媒への分散性が低下するので、カプセルへの封入率を減少させて、凝集効果（Aggregation effect）が消えるにともなって造影性能が低下する。

製造例１において製造した均一度が１０．１である１０ｎｍ酸化鉄ナノ粒子を利用して得たＴ２弛緩性能は３４５．７ｍＭ^−１ｓ^−１であったが、製造例１で製造した１０ｎｍ酸化鉄ナノ粒子と製造例２で製造した４ｎｍ酸化鉄ナノ粒子とを混合して、均一度が２．８に低い混合ナノ粒子を利用して製造したナノカプセルは、Ｔ２弛緩性能が２０２．８ｍＭ^−１ｓ^−１で造影性能が顕著に減少する。

上述したように、本発明の酸化鉄ナノカプセルは、関係式５を満たす特徴がある。本発明に係る酸化鉄ナノカプセルを含有する造影剤を血管に注入する場合、生体内吸収（Absorption）、分布（Distribution）、代謝（Metabolism）及び除去（Elimination）は、酸化鉄ナノカプセルのサイズに大きく影響を受ける。直径が５０ｎｍ未満であるナノカプセルは、多量のナノカプセルが目的する組織の他にリンパ節に分布する危険があり、直径が２００ｎｍを超過する場合、ナノカプセルにより血管がふさがる危険があり、肝組織への吸水率が低いために、造影剤、特に肝造影剤としての使用に適していない。

また、本発明において、酸化鉄ナノカプセルは、関係式２を満たす特徴がある。前記関係式２中、１００＊Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）／Ｃ（Ｃａｐ）は、酸化鉄ナノカプセルの均一度（uniformity）を意味し、詳細に前記関係式２の酸化鉄ナノカプセルの均一度は、１００／酸化鉄ナノカプセルの変動係数であり、前記酸化鉄ナノカプセルの変動係数は、酸化鉄ナノカプセルサイズ分布での標準偏差／酸化鉄ナノカプセルの平均サイズとなる。

前記酸化鉄ナノカプセルの均一度が前記関係式２を満たすことによって、ＭＲＩ造影のための注入時に、目的する組織以外の組織への吸収を抑制でき、これにより同じ注入量で目的する組織を優れた造影性能で観察できるようになる。

上述したように、本発明の酸化鉄ナノカプセルは、関係式３を満たす特徴がある。本発明の酸化鉄ナノカプセルは、前記関係式３のようにナノカプセルに非常に高含有量で酸化鉄ナノ粒子が封入されていることによって、低い濃度で本発明の酸化鉄ナノカプセルを含有する造影剤でも非常に優れた造影性能を有するという特徴があり、特に、商用造影剤の人体投与量である０．４２ｍｇ Ｆｅ／Ｋｇを基準としても、造影剤に含まれた酸化鉄ナノカプセルの濃度を画期的に低くすることができる。本発明の酸化鉄ナノカプセルが前記関係式３を満たすことによって、造影剤の原価低減はもちろん、造影剤の人体投入により引き起こされる副作用及びショックが防止される特徴がある。

さらに特徴的に、前記酸化鉄ナノカプセルは、下記の関係式６及び７をさらに満たす。
（関係式６）
１０≦１００＊Ｄ_ｍ（ＩＯ）／Ｃ_ｖ（ＩＯ）
（関係式７）
５≦１００＊Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）／Ｃ_ｖ（Ｃａｐ）
（前記関係式６のＤ_ｍ（ＩＯ）及びＣ_ｖ（ＩＯ）は、関係式１の定義と同一であり、前記関係式７のＤ_ｍ（Ｃａｐ）及びＣ_ｖ（Ｃａｐ）は、関係式２の定義と同一である。）

本発明の酸化鉄ナノカプセルに封入される酸化鉄ナノ粒子の均一度が前記関係式６を満たすことによって、ナノカプセルで封入される複数の酸化鉄ナノ粒子がより均一に凝集され、また、酸化鉄ナノカプセルの均一度が前記関係式７を満たすことによって、目的する組織以外の他組織にナノカプセルが吸収されて、造影性能を低下させることをさらに効果的に防止する。このとき、前記関係式６または７において前記酸化鉄ナノ粒子の均一度は実質的に１０００以下で、前記ナノカプセルの均一度は１０００以下である。

より特徴的に、本発明に係る酸化鉄ナノカプセルは、下記の関係式８をさらに満たす。
（関係式８）
７重量％≦Ｆ（ＩＯ）≦３５重量％
（前記関係式８のＦ（ＩＯ）は、関係式３の定義と同一である。）

このとき、前記高い酸化鉄ナノ粒子の封入量は、有機溶媒に０．１ないし２０重量％、好ましくは０．５ないし８重量％の酸化鉄ナノ粒子が分散され、０．１ないし２０重量％、好ましくは０．５ないし８重量％、さらに好ましくは０．５ないし４重量％の生分解性高分子が溶解された酸化鉄ナノ粒子分散液と、界面活性剤水溶液とを混合及び乳化して乳化液を製造し、前記乳化液に水を投入して前記酸化鉄ナノカプセルを製造することによって達成される特徴がある。

本発明において酸化鉄ナノ粒子のカプセル化物質は、生分解性高分子を含む。生分解性高分子は、人体に無害であり、生体適合性に優れたものであれば何でも使用可能であり、その例としてポリラクチド（Polylactide、ＰＬＡ）、ポリグリコリド（Polyglycolide、ＰＧＡ）、及びこれらの共重合体であるポリラクチド−コ−グリコリド（poly(lactide-co-glycolide)、ＰＬＧＡ）の中から選ばれるか、またはこれらの混合物を使用することができる。

特に、ＰＬＧＡは、人体での無害性、安定性及び生体親和性が確認されており、ＦＤＡで注射剤として承認を受けた物質であって疎水性を有するので、水によく溶けない薬物の伝達体として多くの研究がなされている。また、ＰＬＡとＰＧＡの比率に応じて生体内での分解速度を調節できるので、疎水性リガンドが付着された酸化鉄ナノ粒子を捕集して生体に伝達するのに適切なカプセル化物質の一つである。

生分解性高分子の分子量（Ｍｗ）は、１，０００ないし２５０，０００であることを使用することができ、好ましくは２，０００ないし１００，０００であり、さらに好ましくは５，０００ないし２０，０００であることを使用することができる。

本発明において酸化鉄ナノ粒子のカプセル化物質は、界面活性剤を含有し、前記界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、アルキルジフェニルオキシドジスルホネートの中から選ばれるいずれか一つまたはこれらの混合物を含む。前記カプセル化物質に含まれていた界面活性剤は、高分子−酸化鉄ナノ粒子有機溶液のエマルション形成及びナノサイズへの拡散役割を行い、前記酸化鉄ナノカプセルの生体安定性及び分散安定性のために、前記カプセル化物質に含まれた生分解性高分子：界面活性剤の重量比は１００：１０ないし１００００、好ましく１００：１００ないし１０００であることが好ましい。

本発明は、上述した酸化鉄ナノカプセルを含有するＭＲＩ用Ｔ２造影剤を提供し、さらに特徴的に上述した酸化鉄ナノカプセルを含有するＭＲＩ用Ｔ２肝造影剤を提供する。

本発明に係るＭＲＩ用Ｔ２造影剤は、上述したサイズ及び分布を有する超常磁性酸化鉄ナノ粒子が極めて高い封入率で封入された酸化鉄ナノカプセルを含有することによって、低い濃度で非常に高いＴ２造影効果を有し、酸化鉄ナノカプセルのサイズ及び分布が制御されて目的する組織に効果的に分布して造影性能を向上させ、人体内の副作用が防止されるという効果がある。本発明の酸化鉄ナノカプセルを含有した造影剤において、上記目的する組織は肝臓である特徴がある。

以下、本発明に係る酸化鉄ナノカプセルの製造方法を詳述する。本出願人は、後述する第１様態及び第２様態の製造方法を基盤に努力に努力を重ねて数多くの実験を繰り返した結果、酸化鉄ナノ粒子の封入率を制御する主因子、封入される酸化鉄ナノ粒子の凝集を制御する主因子、酸化鉄ナノカプセルのサイズ及び分布を制御する主因子を導き出した。

本発明に係る酸化鉄ナノカプセルの製造方法は、乳化拡散法（emulsification-diffusion method）を利用して製造され、本発明に係る製造方法の第１様態である下記の製造方法（Ｉ）及び本発明に係る製造方法の第２様態である下記の製造方法（ＩＩ）を含む。

詳細に、本発明に係る酸化鉄ナノカプセルの製造方法（Ｉ）は、ａ１）生分解性高分子を極性有機溶媒に溶解した後、前記極性有機溶媒に疎水性リガンドが結合された酸化鉄ナノ粒子を添加し超音波処理して、酸化鉄ナノ粒子分散液を製造するステップと、ｂ）前記酸化鉄ナノ粒子分散液と界面活性剤水溶液とを混合して乳化し、乳化液を得る乳化ステップと、ｃ）前記乳化液に水を添加して酸化鉄ナノカプセルを製造する拡散ステップと、を含んで行われる特徴がある。

さらに詳細に、本発明の第１様態は、乳化拡散法の有機相（Oil phase）を提供する、水と部分的に混和する特性（部分水混和性、partially water-miscible）を有する、極性有機溶媒（第１溶媒）に生分解性高分子をまず溶解して、有機溶媒の極性が弱まった生分解性高分子溶解液を製造した後、前記生分解性高分子溶解液に疎水性リガンドが結合された酸化鉄ナノ粒子を添加し超音波処理（ultrasonication）して、酸化鉄ナノ粒子分散液を製造する。

以後、乳化拡散法の水相（Water phase）を提供する水に界面活性剤を溶解させて製造された界面活性剤水溶液と前記酸化鉄ナノ粒子分散液とを混合して、均質機（homogenizer）を利用して乳化するステップが行われる。

前記乳化ステップにて製造された乳化液に水を添加して、前記乳化液の酸化鉄−生分解性高分子−界面活性剤を水相に拡散させて酸化鉄ナノカプセルを製造する。

詳細に、本発明に係る酸化鉄ナノカプセルの製造方法（ＩＩ）は、ａ２）生分解性高分子を極性有機溶媒に溶解するステップと、ａ３）前記極性有機溶媒より沸点の低い非極性有機溶媒に疎水性リガンドが結合された酸化鉄ナノ粒子を分散するステップと、ａ４）生分解性高分子が溶解された極性有機溶媒と酸化鉄ナノ粒子が分散された非極性有機溶媒とを混合した後、蒸留により非極性有機溶媒を除去して酸化鉄ナノ粒子分散液を製造するステップと、ｂ）前記酸化鉄ナノ粒子分散液と界面活性剤水溶液とを混合して乳化し、乳化液を得る乳化ステップと、ｃ）前記乳化液に水を添加して、酸化鉄ナノカプセルを製造する拡散ステップとを含んで行われる特徴がある。

上述した第１様態または第２様態において、前記製造方法は、ｃ）ステップ後、透析及び凍結乾燥により酸化鉄ナノカプセル粉末を製造するステップがさらに行われることができる。

関係式１及び関係式４を満たす酸化鉄ナノ粒子であり、前記酸化鉄ナノ粒子分散液に用いられる酸化鉄ナノ粒子は、疎水性リガンドが表面に結合された酸化鉄ナノ粒子であって、鉄を中心原子にして疎水性有機酸基がリガンドで結合されている鉄錯体を熱分解して製造されることが好ましい。

前記酸化鉄ナノカプセルのサイズ及び分布は、前記乳化ステップ及び拡散ステップのそれぞれにおいて行われる撹拌により制御される特徴がある。詳細に、本発明に係る酸化鉄ナノカプセルを製造するために、前記乳化ステップの撹拌は、８０００ｒｐｍ以上、好ましく８０００ｒｐｍないし２６０００ｒｐｍであり、前記拡散ステップの撹拌は、１００ｒｐｍ以上、好ましく１００ｒｐｍないし２５００ｒｐｍで行われる。

さらに詳細に、均質機による乳化工程は、２分ないし１５分の時間の間に８，０００ｒｐｍ以上、好ましく８０００ｒｐｍないし２６０００ｒｐｍの撹拌速度で反応物を撹拌することが好ましい。撹拌時間が２分未満である場合に混合溶液が十分に撹拌されない場合もあり、撹拌時間が１５分以上の場合に、水と接触した高分子の硬化現象により、拡散工程でカプセルが円滑に拡散されない場合もある。撹拌速度が８，０００ｒｐｍ未満である場合に、初期エマルションの液滴サイズが増加して拡散工程を行っても最終カプセルのサイズが３００ｎｍ以上になるという問題がある。

本発明に係る製造方法における前記拡散ステップは、乳化された溶液に水を添加して溶媒と酸化鉄−高分子−界面活性剤粒子を拡散させてナノカプセルを製造するステップである。乳化溶液に水を添加すると、エマルションは、周囲の水が多くなりながら瞬間的に過飽和状態を経験するようになり、数百ｎｍサイズの小さな有機溶媒塊がエマルションの表面から分離されて、最終的にカプセルを形成する。このとき、前記拡散ステップにて投入される水は、乳化ステップにて製造された乳化液の体積を基準に２倍ないし１５倍の水が投入されることが好ましい。

このとき、水の投入により行われる拡散ステップでの撹拌速度は、１００ｒｐｍ以上、好ましく１００ｒｐｍないし２５００ｒｐｍであることが好ましい。撹拌速度が１００ｒｐｍ未満である場合に、剪断力が小さくてエマルションの周囲環境を速く変えることができないために、カプセルの平均サイズが増加し、サイズの均一度が増加するという問題がある。

特徴的に、本発明の製造方法のうち、第２様態において、前記酸化鉄ナノカプセルのサイズ及び分布は、前記ａ４）ステップの蒸留後に残留する非極性有機溶媒の残留量により制御される。このとき、蒸留温度は、前記非極性有機溶媒の沸点より高く、前記極性有機溶媒の沸点より低い温度であることが好ましい

前記蒸留により、沸点の低い非極性有機溶媒が選択的に除去されるが、このとき、蒸留時間を調節して残留する非極性有機溶媒の量を制御できる。前記極性有機溶媒に残留する非極性有機溶媒の量は、乳化ステップでのエマルションサイズ及び分布だけでなく、拡散ステップにおいて酸化鉄−高分子−界面活性剤粒子の拡散駆動力に影響を及ぼし、ナノカプセルのサイズ及び分布を制御する。

ナノカプセルのサイズ及び分布を制御するために、前記ａ４）ステップでの蒸留により、極性有機溶媒：非極性有機溶媒の体積比は、１００：１以下に、実質的に１００：０．００１〜１に制御されることが好ましい。このとき、前記蒸留による極性有機溶媒：非極性有機溶媒の体積比を制御すると同時に、上述した前記乳化ステップ及び拡散ステップのそれぞれで行われる撹拌条件もまた満たすことが好ましい。

本発明に係る製造方法（第１様態または第２様態を含む）において、前記酸化鉄ナノカプセルに封入された酸化鉄ナノ粒子の封入量は、前記ナノ粒子分散液の酸化鉄ナノ粒子の濃度及び生分解性高分子の濃度により制御されるという特徴がある。また、前記ナノカプセルに封入される酸化鉄ナノ粒子の凝集度もまた前記酸化鉄ナノ粒子分散液に含まれた酸化鉄ナノ粒子の濃度及び生分解性高分子の濃度により制御される。前記関係式８を満たす酸化鉄ナノカプセルを製造するために、前記ナノ粒子分散液は、０．１ないし２０重量％、好ましく０．５ないし８重量の酸化鉄ナノ粒子及び０．１ないし２０重量％、好ましく０．５ないし８重量％、さらに好ましく０．５ないし４重量％の生分解性高分子を含有することを特徴がある。

前記極性有機溶媒は、水と部分的に混ざる特性（部分水混和性）を有する有機溶媒であって、エチルアセテート、メチレンクロライド、ジメチルスルホキシド、プロピレンカーボネート及びベンジルアルコールの中から選ばれるいずれか一つまたはこれらの混合物を含む。

本発明の第２様態において、前記非極性有機溶媒は、前記極性有機溶媒より極性が低い有機溶媒のことを意味し、ヘキサン、ヘプタン、ペンタン及びオクタンの中から選ばれるいずれか一つまたはこれらの混合物を含む。

前記生分解性高分子は、ポリラクチド（polylactide）、ポリグリコリド（polyglycolide）及びポリラクチド−コ−グリコリド（poly(lactide-co-glycolide)）の中から選ばれるいずれか一つまたはこれらの混合物を含み、前記界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム（sodium lauryl sulfate）、ポリビニルアルコール（polyvinylalcohol）、ポロキサマー（poloxamer）、ポリソルベート（polysorbate）、アルキルジフェニルオキシドジスルホネート（alkyldiphenyloxide disulfonate）の中から選ばれるいずれか一つまたはこれらの混合物を含む。

このとき、前記界面活性剤水溶液の濃度は、１ないし１０重量％であり、前記乳化液において前記生分解性高分子：界面活性剤の重量比は１００：１０ないし１００００、好ましく１００：１００ないし１０００であることが好ましい。

本発明は、伝統的な乳化−拡散法の限界であった低い封入率問題を解決して、疎水性リガンドが付着された酸化鉄ナノ粒子も非常に高い封入率で高分子／界面活性剤ナノカプセルに封入される特徴がある。特に、伝統的な乳化−拡散法の場合、封入率が５重量％以上のとき、酸化鉄ナノ粒子間の凝集によってナノカプセルの平均サイズが大きくなり、サイズ均一度が小さくなり、それによりナノカプセルの水溶液内の安定性が大きく減少して、数時間内に速く沈殿がおきる現象があった。しかしながら、本発明は、封入率が高まっても平均サイズを２００ｎｍ以内にしつつサイズ均一度が５以上であるナノカプセルを作ることができ、ナノカプセルの水溶液内安定性が大きく増加して、数日内にも沈殿がおきない。

本発明に係るナノカプセルをＭＲＩ造影剤として適用する際、カプセル内の酸化鉄ナノ粒子の凝集効果（Aggregation effect）を上げることができるので、造影性能を既存の造影剤の造影性能限界を超えることができる水準に上げることができる。また、同時にカプセルのサイズを調節できるので、造影剤として利用する際、目的組織への吸収及び分布を再現性あるように調節でき、サイズ均一度が高いから２００ｎｍ以上の大きな粒子の形成を防止するので、生体内で毛細血管を塞ぐ現象などの副作用を阻止できるから、安全性が極めて優れている。また、酸化鉄ナノ粒子の高い封入率は、全体造影剤の濃度を下げ、それにより浸透圧と粘度を下げることができるので、造影剤を投与される患者の安全と便宜性を大きく増加させる。

製造例１で製造された疎水性リガンドが付着された酸化鉄ナノ粒子の透過電子顕微鏡写真である。 製造例２で製造された疎水性リガンドが付着された酸化鉄ナノ粒子の透過電子顕微鏡写真である。 実施例１で製造されたＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの水相分散イメージで、カプセル化前・後の分散様相を観察した光学写真である。 実施例１で製造されたＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの透過電子顕微鏡写真である。 実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの体外造影性能評価を示したグラフ及び磁気共鳴画像である。商用造影剤であるＦｅｒｉｄｅｘの結果を比較として示す図である。 実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの体内造影性能評価を示した磁気共鳴画像であり、ｐｒｅ、１ＨＲ、２ＨＲは注入前、注入後１時間、注入後２時間に測定された結果を意味する。 実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの投与量別体内造影性能評価を示したグラフであり、商用造影剤であるＦｅｒｉｄｅｘの結果を比較として示す図である。 実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの封入率別体内造影性能評価を示したグラフであり、商用造影剤であるＲｅｓｏｖｉｓｔの結果を比較として示す図である。 実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルのサイズ別体内造影性能評価を示したグラフであり、商用造影剤であるＲｅｓｏｖｉｓｔの結果を比較として示す図である。 実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの濃度と培養時間の経過による細胞生存率を示すグラフであり、商用造影剤であるＦｅｒｉｄｅｘの結果を比較として示す図である。 比較例１で製造した酸化鉄ナノ粒子の均一度が２．８のＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの透過電子顕微鏡写真である。 比較例２で製造した酸化鉄ナノ粒子の封入率が０．５重量％以下であるＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの透過電子顕微鏡写真である。 比較例３で製造したサイズが２００ｎｍ以上であるＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの体内造影性能評価イメージとグラフを示す図である。

以下、本発明を下記の実施例及び比較例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
さらに、前記技術の当業者は、本発明の根本的な概念とその実行を容易に修正または変更できる。

（製造例１）
オレエートが付着された１０ｎｍ単分散酸化鉄ナノ粒子の大量生産
塩化鉄１０．８ｇとオレイン酸ナトリウム３６．５ｇをエタノール８０ｍｌ、蒸留水６０ｍｌ、ヘキサン１４０ｍｌを含む混合溶媒に溶解させ、５７℃にその混合物を加熱し、１時間の間に同じ温度に維持させた。この過程の間に、水相で初期の緋色が澄み、初期の透明な有機相が赤い光を帯びるが、これはオレイン酸鉄錯体を含む上部有機層が分離され、その後前記ヘキサンは蒸発され、その結果、粘性を有した液体形態になった。オレイン酸鉄錯体３６ｇ（製造された粘性を有した液体）をオクタデセン２００ｇとオレイン酸５．７ｇの混合物に添加した。

前記結果により生じた混合物を真空で室温から２．５℃／ｍｉｎの昇温速度で７０℃まで加熱した後、同じ温度で１時間の間に維持させることによって、反応物以外の残余溶媒と水分を除去した。その後、窒素雰囲気下で２．５℃／ｍｉｎの速度で３２０℃まで加熱した後、同じ温度で１時間の間に維持しながら熟成させ、この過程を経る間に激烈に反応がおき、初期の赤色溶液が黒褐色になるが、これはオレイン酸鉄錯体が完全に分解され、酸化鉄ナノ粒子が生成されたことを表す。反応が終了した後、自然冷却過程を経ながら自動点火温度以下（１５０℃）になったとき、空気を注入して酸化させた。

前記結果として生じたナノ粒子を含む溶液は、室温まで冷却され、体積比１：５のヘキサンとアセトン混合溶液を母液の体積の３倍に該当する量を加えて黒い色沈殿物が生じ、その後遠心分離（ｒｐｍ＝２，０００）により分離された。

前記結果として生じた上層液を捨てた。この洗浄過程は、最小２回以上繰り返し、前記残余物に含まれたヘキサン及びアセトンは乾燥により除去し、この結果として生じた生産物は、ヘキサン中に容易に再分散される酸化鉄ナノ粒子を形成した。図１に最終生成された酸化鉄ナノ粒子の透過電子顕微鏡イメージを示し、平均サイズは１０ｎｍ、サイズ均一度は１０．１であった。

（製造例２）
オレエートが付着された４ｎｍ単分散酸化鉄ナノ粒子の大量生産
溶媒としてヘキサデセン１００ｇを使用したことと、最終昇温温度が２８０℃であることを除いては、製造例１に記載されたことと同じ工程を利用して酸化鉄ナノ粒子を大量合成した。

前記結果として生じたナノ粒子は、ヘキサンやトルエンのような無極性有機溶媒に容易に再分散された。図２に最終生成された酸化鉄ナノ粒子の透過電子顕微鏡イメージを示し、これを分析した結果、平均サイズは４ｎｍ、サイズ均一度は６．１５であった。

生分解性高分子溶液の溶解度変化を利用したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの製造
高分子末端がカルボキシル基で分子量が５，０００であるＰＬＧＡ２００ｍｇをエチルアセテート１０ｍｌに入れて、１０分間撹拌して完全に溶解させた。製造例１で製造された単分散酸化鉄ナノ粒子２００ｍｇを前記溶液に添加した後、４５℃で６０分間超音波処理してＰＬＧＡ−酸化鉄ナノ粒子溶液を製造した。酸化鉄ナノ粒子が溶媒に完全に分散されなかったときには、不透明な褐色を表し５分以内に大部分が沈殿するが、酸化鉄ナノ粒子が超音波処理により完全に分散された場合には、濃く透明な黒色光を表し、数日以上沈殿物が生じなかった。

製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノ粒子溶液１０ｍｌをプルロニックＦ−１２７（Ｐ２４４３，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｓ Ｎｏ．１０ ９００３−１１−６）５重量％水溶液２０ｍｌと混合して、均質機２０，０００ｒｐｍで７分間乳化させた。乳化過程が終わった溶液を時間の遅滞無しで直ちに２００ｍｌビーカーに入れて５００ｒｐｍで撹拌しながら、１００ｍｌの蒸留水を一度に添加した後に２０分間撹拌を維持した。以後、製造された溶液を透析膜に入れて２日間撹拌し反応残余物を除去した後、−２０℃で凍結した後に凍結乾燥してナノカプセル粉末を得た。

図３は、前記製造方法で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの水相分散イメージである。カプセル化前にオレエートが付着された酸化鉄ナノ粒子がヘキサン層にだけ分布したことに対して、カプセル化後にＰＬＧＡとプルロニックＦ−１２７に安定化したナノカプセルは、水層に安定的に分布することを観察でき、数週間沈殿なしで安定であることを観察した。

図４は、前記製造方法で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの透過電子顕微鏡イメージであって、カプセルの平均サイズが１１１．６ｎｍであり、サイズ均一度は１２．５で非常に均一に生成され、酸化鉄ナノ粒子がカプセル中に１０．３重量％の封入率で均一に分布することを観察した。

非極性有機溶媒と蒸留を利用したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの製造
高分子末端がカルボキシル基で分子量が２０，０００であるＰＬＧＡ２００ｍｇをエチルアセテート１５０ｍｌに入れて１０分間撹拌して完全に溶解させて第１溶液を製造し、製造例１で生産された単分散酸化鉄ナノ粒子２００ｍｇを非極性有機溶媒であるヘキサン１００ｍｌに添加して１時間の間に超音波処理して、完全に分散させて第２溶液を製造した。以後、第１溶液と第２溶液とを混合して３０分間撹拌し、二溶液が相分離無しで完全に混合されることを観察した。

第１溶液と第２溶液とが混合された混合溶液をヘキサンの沸点より高くエチルアセテートの沸点より低い７２度に加熱して、残留溶液が約１０ｍｌになるまで蒸留して、ＰＬＧＡ−酸化鉄ナノ粒子溶液を製造した。ヘキサンは、エチルアセテートと共沸点を有し、共に蒸留されるが、気化速度がさらに速いので、最終溶液が１０ｍｌ残った場合に残留ヘキサンの比率は１体積％以下であり、酸化鉄ナノ粒子が最終残留したエチルアセテートに分散されることを確認した。

製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノ粒子溶液１０ｍｌをプルロニックＦ−１２７ ５重量％水溶液２０ｍｌと混合して均質機２０，０００ｒｐｍで７分間乳化させた。乳化過程が終わった溶液を時間の遅滞無しで直ちに２００ｍｌのビーカーに入れて５００ｒｐｍで撹拌しながら１００ｍｌの蒸留水を一度に添加した後、２０分間撹拌を維持した。以後、製造された溶液を透析膜に入れて２日間撹拌し、反応残余物を除去した後、−２０℃で凍結した後凍結乾燥してナノカプセル粉末を得た。

本実験方法により製造されたＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルのうち、酸化鉄ナノ粒子の封入率は１０．３重量％で非常に高いながらも、平均サイズ１７８．４ｎｍ、サイズ均一度７．２に極めて均一なナノカプセルを製造することができた。

封入率が大きなＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの製造
ＰＬＧＡ４０ｍｇ、エチルアセテート３ｍｌ、酸化鉄ナノ粒子２００ｍｇ、プルロニックＦ−１２７ ５重量％水溶液６ｍｌ、乳化時の撹拌速度２６，０００ｒｐｍを使用したことを除いては、実施例１に記載されたことと同じ工程を利用してナノカプセルを製造した。

本実験方法により製造されたＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルは、平均サイズ１６８．９ｎｍ、サイズ均一度６．４に均一なサイズのカプセルが形成された。特に酸化鉄ナノ粒子の封入率は、既存の乳化−拡散合成法で酸化鉄ナノ粒子の凝集により限界点と考えられた７重量％を大きく超えて２７．４重量％に非常に高く現れた。

平均サイズが小さなＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの製造
ＰＬＧＡ４０ｍｇ、エチルアセテート３ｍｌ、酸化鉄ナノ粒子４０ｍｇ、プルロニックＦ−１２７ ５重量％水溶液６ｍｌ、乳化時の撹拌速度２６，０００ｒｐｍを使用したことを除いては、実施例１に記載されたことと同じ工程を利用してナノカプセルを製造した。

本実験方法により製造されたＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルのうち、酸化鉄ナノ粒子の封入率は８．８重量％に非常に高く、平均サイズ９０．９ｎｍ、サイズ均一度７．２に非常に小さいながらも均一なナノカプセルが製造された。

ナノカプセルの体外磁気共鳴弛緩性能の測定
実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルを利用して、ＭＲＩ Ｔ２肝造影剤として使用可能性を評価するために、４．７Ｔ磁気共鳴画像診断機（Biospec 47/40,Bruker Biospin ＭＲＩ GmbH）でＢＧＡ１２ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｏｉｌを利用して、体外（invitro）Ｔ２弛緩性能を評価した。酸化鉄−ＰＬＧＡナノカプセル粉末の鉄濃度をＩＣＰ−ＡＥＳを介して分析した後、これを０．０１Ｍ ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline，ｐＨ７．４）溶液に１〜４μｇＦｅ／ｍｌの濃度で分散した。最初の溶液を１／２ずつ希薄して全体５種のサンプルを製造した後、これを２５０μｌのチューブに入れて一度にＴ２弛緩時間を測定した。Ｔ２弛緩時間の測定は、ＭＳＭＥ（Multi Slice Multi Echo sequence）パルス列を利用し、具体的なパラメーターは、次の通りである。

ＴＲ（repetition time）＝１０，０００ｍｓ，ＴＥ（echo time）＝８〜２０４８ｍｓ（８ｍｓ間隔で２５６回）、ＦＯＶ＝６０ｘ４０ｍｍ，Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ＝０．２３４ｘ０．１５６ｍｍ／ｐｉｘｅｌ，ｓｌｉｃｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ＝１ｍｍ，ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ＝１，Ｍａｔｒｉｘ ｓｉｚｅ＝１２８ｘ１２８

図５は、実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの体外造影性能評価を示したグラフ及び磁気共鳴画像であって、本発明の製造方法で作ったカプセルの造影性能が商用造影剤に比べて非常に高いことを確認することができる。

ナノカプセルの体内磁気共鳴弛緩性能の測定
実施例１で製造した酸化鉄−ＰＬＧＡナノカプセルを利用して、ＭＲＩ Ｔ２肝造影剤として使用可能性を評価するために、４．７Ｔ磁気共鳴画像診断機（Biospec 47/40，Bruker Biospin ＭＲＩ GmbH）でＢＧＡ１２ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｏｉｌを利用して体内（invivo）Ｔ２弛緩性能を評価した。

体内ＭＲ実験は、５週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃｍｏｕｓｅを利用して行い、マウスの体重は、約２０〜２５ｇであった。マウスを麻酔した後ＭＲＩ機器に水平に入れてＣｏｒｏｎａｌ ｐｌａｎｅを観察し、同じ面の肝組織を詳細に観察するために、全体実験時間の間に呼吸麻酔してマウスの動きがほぼない状態を維持した。酸化鉄−ＰＬＧＡナノカプセル粉末の鉄濃度は、ＩＣＰ−ＡＥＳを介して分析した後、０．０１Ｍ ＰＢＳ溶液に分散させ、作られたＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセル溶液２００μｌをマウスの尾静脈（tail vein）を介して一度に注入し、最終溶液の容量（dosage）は、マウスの重さを考慮して１ｍｇ Ｆｅ／ｋｇになるように実験した。Ｔ２弛緩時間測定は、ＲＡＲＥ（Rapid Acquisition with Refocused Echoes）パルス列を利用し、具体的なパラメーターは次の通りである。

ＴＲ（repetition time）＝３，５００ｍｓ，ＴＥ（echo time）＝３６ｍｓ，ＦＯＶ＝６０ｘ４０ｍｍ，Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ＝０．２３４ｘ０．１５６ｍｍ／ｐｉｘｅｌ，ｓｌｉｃｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ＝１ｍｍ，ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ＝４，Ｍａｔｒｉｘｓｉｚｅ＝２５６ｘ２５６

ＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルのＴ２減衰効果を定量的に評価するために、肝組織の一断面を選定して肝部分全体をＲＯＩ（Region of Interests）に選定し、信号強度（Signal Intensity，ＳＩ）を分析した。獲得した信号強度の信頼度を最大化させるために、アガロース（Agarose）１重量％溶液を２００μｌのチューブに入れて冷却させて固形化させた後、マウスの腹腔周辺に固定して対照群として利用した。ＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルのＴ２弛緩性能は、下記式１で計算してグラフで示した。

［式１］
Ｔ２減衰効果（△Ｒ２）＝１００＊［１−（ＳＮＲ）_ｔ／（ＳＮＲ）_０］（ＳＮＲ：Signal to Noise Ratio）
（ＳＮＲ）_ｔ＝（ＳＩ ｏｆ ＲＯＩ）_ｔ／（ＳＩ ｏｆ Ａｇａｒｏｓｅ）_ｔ
（ＳＮＲ）_０＝（ＳＩ ｏｆ ＲＯＩ）_０／（ＳＩ ｏｆ Ａｇａｒｏｓｅ）_０

前記式１中、ＳＩ ｏｆ ＲＯＩは、関心領域である肝での信号強度を意味し、ＳＩ ｏｆ Ａｇａｒｏｓｅは、肝組織に対する対照群として利用するアガロースの信号強度を意味し、ｔは、造影剤投入後にｔ時間が経過した後の信号強度を意味し、０は、造影剤投入直前の信号強度を意味する。

実施例１において製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルと商用造影剤の造影性能を図４に比較して示した。商用造影剤の最大Ｔ２減衰効果は、（△Ｒ２_ｍａｘ）約５８％であることに対して、本発明により製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルは、最大減衰効果が約７３％に現れて商用造影剤に比べてＴ２減衰効果が非常に優れたことを観察し、少ない量でも肝疾患部位を正確に診断できることを確認した。

図６は、実施例１において製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの体内造影性能評価を示した磁気共鳴画像であって、本発明の製造方法で作ったカプセルの体内造影性能が商用造影剤に比べて非常に高いことを確認することができる。

図７は、実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの投与量別体内造影性能評価を示したグラフであって、本発明の製造方法で作ったカプセルの体内造影性能が投与量別に調節され、商用造影剤に比べてすべての投与量範囲で高いことを確認することができる。特に、商用造影剤の人体投与量である０．４２ｍｇ Ｆｅ／ｋｇで商用造影剤に比べて造影性能が顕著であることを観察できる。

図８は、実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの封入率別体内造影性能評価を示したグラフであって、本発明の製造方法で作ったカプセルの体内造影性能が封入率により調節されることを確認することができる。特に、酸化鉄ナノ粒子の封入率が１９重量％〜２７重量％である場合に、封入率が１１重量％以下であるカプセルに比べて高いことを観察できる。

図９は、実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルのサイズ別体内造影性能評価を示したグラフであって、本発明の製造方法で作ったカプセルの体内造影性能がカプセルのサイズにより調節されることを確認することができる。特に、カプセルのサイズが１００ｎｍ以下に小さな場合に、造影性能が増加することを観察でき、したがって、カプセルのサイズ及びサイズ均一度の調節が非常に重要な変数であることが分かる。

ナノカプセルの細胞毒性の測定
実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの毒性を評価するために、細胞毒性評価試験であるＭＴＴ［3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）］ａｓｓａｙを行った。人間の腎臓細胞株であるＨＥＫ２９３細胞と肝細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を使用して試験を行い、両細胞株とも試験容器の表面に付着して増殖する付着型細胞（adherent cell）で９６−ｗｅｌｌで１ｘ１０５の密度で種菌した。

前記細胞を２４時間の間に培養した後に培地を除去した後、９７６２ｐｐｍのＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルを最大濃度にして１９ｐｐｍまで半分ずつ希釈した総９種の溶液１２．５μｌと、培養液８７．５μｌをそれぞれのｗｅｌｌに添加した。これを２４時間の間に培養させた後、培地を除去しＭＴＴ溶液２０μｌを添加して４時間の間に培養した。最後に、可溶化（solubilization）溶液１００μｌを添加して培養した後、５５０ｎｍの吸光度を測定して細胞の生存率を測定した。

図１０に示したように、実施例１で製造したＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの濃度と培養時間に関係なく、すべての細胞株で高い生存率を見せて、本発明に基づいたＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセル造影剤使用濃度の３００倍以上でも細胞毒性がないことを確認した。

（比較例１）
酸化鉄ナノ粒子の均一度が１０以下であるＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセル
４ｎｍ酸化鉄ナノ粒子１００ｍｇと１０ｎｍ酸化鉄ナノ粒子１００ｍｇとを混合して使用したことを除いては、前記実施例１に記載されたことと同じ方法で製造した酸化鉄ナノ粒子溶液１０ｍｌを利用し、実施例３に記載されたことと同じ工程を利用してナノカプセルを製造し、酸化鉄ナノ粒子のサイズ均一度は、２．８であった。

図１１は、酸化鉄ナノ粒子の均一度が２．８であるＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの透過電子顕微鏡イメージを示している。平均サイズが４ｎｍである酸化鉄ナノ粒子２５重量％と１０ｎｍである酸化鉄ナノ粒子７５重量％が封入されているカプセルの平均サイズは１４６ｎｍであり、カプセルのサイズ均一度は約５．１２に均一であるが、酸化鉄ナノ粒子の均一度が低くてＴ２弛緩性能が２０２．８ｍＭ^−１ｓ^−１に測定され、これは１０ｎｍ酸化鉄ナノ粒子のみを利用して得たＴ２弛緩性能３４５．７ｍＭ^−１ｓ^−１に比べて大きく低い値である。

（比較例２）
封入率が０．５重量％以下であるＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセル
酸化鉄ナノ粒子４ｍｇを使用したことを除いては、前記実施例１に記載されたことと同じ方法で製造した酸化鉄ナノ粒子溶液１０ｍｌを利用し、実施例３に記載されたことと同じ工程を利用してナノカプセルを製造した。

図１２は、酸化鉄ナノ粒子の封入率が０．５重量％以下であるＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの透過電子顕微鏡イメージを示している。平均サイズが１０ｎｍで、サイズ均一度が１０以上である酸化鉄ナノ粒子をカプセル化した結果、平均サイズが１４７．６ｎｍで、サイズ均一度が２０である極めて均一なＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルが製造されたが、酸化鉄の比率が極めて低いので、造影剤として利用が制限される。

（比較例３）
平均サイズが２００ｎｍ以上であるＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセル
前記実施例１で製造した酸化鉄ナノ粒子溶液１０ｍｌを利用し、乳化時の撹拌速度を７，０００ｒｐｍで実施したことを除いては、実施例３に記載されたことと同じ工程を利用してナノカプセルを製造した。

図１３は、サイズが２００ｎｍ以上であるＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルの体内造影性能評価イメージとグラフを示している。平均サイズが１０ｎｍで、サイズ均一度が１０以上である酸化鉄ナノ粒子をカプセル化した結果、平均サイズが５２０．９ｎｍで、サイズ均一度が２．２であるＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルが製造された。カプセルのサイズは、１００ｎｍから数μｍまで多様に現れ、特に２００ｎｍ以上のＰＬＧＡ−酸化鉄ナノカプセルは、Ｔ２弛緩性能が低下し、肝への分布が小さくなるので、最大Ｔ２減衰効果は（△
Ｒ２_ｍａｘ）約３４％に過ぎなかった。

本発明では、特定の事項と限定された実施例および図面によって説明したが、これは、本発明のより全般的な理解を助けるために提供されるものに過ぎず、本発明は、前記実施例に限定されず、本発明が属する分野で通常の知識を有した者であれば、このような記載から様々な修正および変形が可能である。

Claims (22)

1. 疎水性リガンドが結合された複数の酸化鉄ナノ粒子が生分解性高分子及び界面活性剤を含むカプセル物質に封入された酸化鉄ナノカプセルであり、下記の関係式１、２、３、４及び５を満たし、前記生分解性高分子が、ポリラクチド（polylactide）、ポリグリコリド（polyglycolide）及びポリラクチド−コ−グリコリド（poly(lactide-co-glycolide)）の中から選ばれる１又は２以上を含む、酸化鉄ナノカプセル。
   （関係式１）
   １０≦１００＊Ｄ_ｍ（ＩＯ）／Ｃ_ｖ（ＩＯ）
   （関係式２）
   ２．５≦１００＊Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）／Ｃ_ｖ（Ｃａｐ）
   （関係式３）
   ７重量％≦Ｆ（ＩＯ）≦３５重量％
   （関係式４）
   １ｎｍ≦Ｄ_ｍ（ＩＯ）≦２５ｎｍ
   （関係式５）
   ５０ｎｍ≦Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）≦２００ｎｍ
   （前記関係式１中、Ｄ_ｍ（ＩＯ）は、酸化鉄ナノ粒子の平均サイズであり、Ｃ_ｖ（ＩＯ）は、酸化鉄ナノ粒子のサイズ分布において標準偏差であり、前記関係式２中、前記Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）は、酸化鉄ナノカプセルの平均サイズであり、Ｃ_ｖ（Ｃａｐ）は、酸化鉄ナノカプセルのサイズ分布において標準偏差で、前記関係式３中、Ｆ（ＩＯ）は、酸化鉄ナノカプセルに封入された酸化鉄ナノ粒子の重量％であり、前記関係式４中、Ｄ_ｍ（ＩＯ）は、前記関係式１の定義と同一で、前記関係式５中、Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）は、前記関係式２の定義と同一である。）
2. 下記の関係式７をさらに満たすことを特徴とする請求項１に記載の酸化鉄ナノカプセル。
   （関係式７）
   ５≦１００＊Ｄ_ｍ（Ｃａｐ）／Ｃ_ｖ（Ｃａｐ）
   （前記関係式７のＤ_ｍ（Ｃａｐ）及びＣ_ｖ（Ｃａｐ）は、関係式２の定義と同一である。）
3. 有機溶媒に０．１ないし２０重量％の酸化鉄ナノ粒子が分散され０．１ないし２０重量％の生分解性高分子が溶解された酸化鉄ナノ粒子分散液と、界面活性剤水溶液とを混合及び乳化して乳化液を製造し、前記乳化液に水を添加して製造されたことを特徴とする請求項１又は２に記載の酸化鉄ナノカプセル。
4. 疎水性リガンドは、オレイン酸（oleic acid）、ステアリン酸（stearic acid）、ラウリン酸（lauric acid）、パルミチン酸（palmitic acid）、オクタン酸（octanoic acid）及びデカン酸（decanoic acid）の中から選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酸化鉄ナノカプセル。
5. 界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート及びアルキルジフェニルオキシドジスルホネートの中から選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の酸化鉄ナノカプセル。
6. 生分解性高分子の分子量（Ｍｗ）は、１，０００ないし２５０，０００であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の酸化鉄ナノカプセル。
7. 請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の酸化鉄ナノカプセルを含有するＭＲＩ Ｔ２造影剤。
8. 請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の酸化鉄ナノカプセルを含有するＭＲＩ Ｔ２肝造影剤。
9. 下記のａ１）〜ｃ）ステップを含んだ乳化拡散法を利用した酸化鉄ナノカプセルの製造方法であって、
   ａ１）生分解性高分子を極性有機溶媒に溶解した後、前記極性有機溶媒に疎水性リガンドが結合された酸化鉄ナノ粒子を添加し超音波処理して、酸化鉄ナノ粒子分散液を製造するステップ、
   ｂ）前記酸化鉄ナノ粒子分散液と界面活性剤水溶液とを混合して乳化し、乳化液を得る乳化ステップ、
   ｃ）前記乳化液に水を添加して、酸化鉄ナノカプセルを製造する拡散ステップ
   前記ステップａ１）の酸化鉄ナノ粒子が下記の関係式１及び４を満たし、前記生分解性高分子がポリラクチド、ポリグリコリド及びポリラクチド−コ−グリコリドの中から選ばれる１又は２以上を含む、酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
   （関係式１）
   １０≦１００＊Ｄ _ｍ （ＩＯ）／Ｃ _ｖ （ＩＯ）
   （関係式４）
   １ｎｍ≦Ｄ _ｍ （ＩＯ）≦２５ｎｍ
   （前記関係式１中、Ｄ _ｍ （ＩＯ）は、酸化鉄ナノ粒子の平均サイズであり、Ｃ _ｖ （ＩＯ）は、酸化鉄ナノ粒子のサイズ分布において標準偏差であり、前記関係式４中、Ｄ _ｍ （ＩＯ）は、前記関係式１の定義と同一である）
10. 下記のａ２）〜ｃ）ステップを含んだ乳化拡散法を利用した酸化鉄ナノカプセルの製造方法であって、
    ａ２）生分解性高分子を極性有機溶媒に溶解するステップ、
    ａ３）前記極性有機溶媒より沸点の低い非極性有機溶媒に疎水性リガンドが結合された酸化鉄ナノ粒子を分散するステップ、
    ａ４）前記生分解性高分子が溶解された極性有機溶媒と前記酸化鉄ナノ粒子が分散された非極性有機溶媒とを混合した後、蒸留により前記非極性有機溶媒を除去して酸化鉄ナノ粒子分散液を製造するステップ、
    ｂ）前記酸化鉄ナノ粒子分散液と界面活性剤水溶液とを混合して乳化し、乳化液を得る乳化ステップ、
    ｃ）前記乳化液に水を添加して酸化鉄ナノカプセルを製造する拡散ステップ
    前記ステップａ３）の酸化鉄ナノ粒子が下記の関係式１及び４を満たし、前記生分解性高分子がポリラクチド、ポリグリコリド及びポリラクチド−コ−グリコリドの中から選択される１又は２以上を含む、酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
    （関係式１）
    １０≦１００＊Ｄ _ｍ （ＩＯ）／Ｃ _ｖ （ＩＯ）
    （関係式４）
    １ｎｍ≦Ｄ _ｍ （ＩＯ）≦２５ｎｍ
    （前記関係式１中、Ｄ _ｍ （ＩＯ）は、酸化鉄ナノ粒子の平均サイズであり、Ｃ _ｖ （ＩＯ）は、酸化鉄ナノ粒子のサイズ分布において標準偏差であり、前記関係式４中、Ｄ _ｍ （ＩＯ）は、前記関係式１の定義と同一である。）
11. ｃ）ステップ後、透析及び凍結乾燥により酸化鉄ナノカプセル粉末を製造するステップがさらに行われることを特徴とする請求項９又は１０に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
12. 酸化鉄ナノカプセルのサイズ及び分布は、乳化ステップ及び拡散ステップのそれぞれにおいて行われる撹拌により制御されることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
13. 乳化ステップの撹拌は８０００ｒｐｍ以上で行われ、拡散ステップの撹拌は１００ｒｐｍ以上で行われることを特徴とする請求項１２に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
14. 酸化鉄ナノカプセルのサイズ及び分布は、ａ４）ステップの蒸留後に残留する非極性有機溶媒の残留量により制御されることを特徴とする請求項１０に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
15. ａ４）ステップでの蒸留により極性有機溶媒：非極性有機溶媒の体積比は、１００：１以下に制御されることを特徴とする請求項１４に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
16. 酸化鉄ナノカプセルに封入された酸化鉄ナノ粒子の封入量は、酸化鉄ナノ粒子分散液の酸化鉄ナノ粒子の濃度及び生分解性高分子の濃度により制御されることを特徴とする請求項９〜１５のいずれかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
17. 酸化鉄ナノ粒子分散液は、０．１ないし２０重量％の酸化鉄ナノ粒子及び０．１ないし２０重量％の生分解性高分子を含有することを特徴とする請求項９〜１６のいずれかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
18. 疎水性リガンドが結合された酸化鉄ナノ粒子は、熱分解法で製造されたことを特徴とする請求項９〜１７のいずれかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
19. 極性有機溶媒は、エチルアセテート、メチレンクロライド、ジメチルスルホキシド、プロピレンカーボネート及びベンジルアルコールの中から選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする請求項９〜１８のいずれかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
20. 非極性有機溶媒は、ヘキサン、ヘプタン、ペンタン及びオクタンの中から選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする請求項１０に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
21. 界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポロキサマー、ポリソルベート、アルキルジフェニルオキシドジスルホネートの中から選ばれる１又は２以上を含むことを特徴とする請求項９〜２０のいずれかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
22. 界面活性剤水溶液の濃度は、１ないし１０重量％であり、乳化液の生分解性高分子：界面活性剤の重量比は１００：１０ないし１００００であることを特徴とする請求項９〜２１のいずれかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。