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JP5785686B2 - 複数の性質をエンジニアリングするための部位評価ライブラリーを用いた、配列と活性との関係の系統的な評価 - Google Patents

複数の性質をエンジニアリングするための部位評価ライブラリーを用いた、配列と活性との関係の系統的な評価 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明はタンパク質エンジニアリングのための方法を提供する。具体的には、本発明は部位評価ライブラリーを用いる方法を提供する。
本分野において、各種タンパク質エンジニアリング方法が知られている。通常、タンパク質は所望のタンパク質の性質を得るために修飾される。大部分の方法において、タンパク質をコードしているクローン遺伝子の核酸配列を変異させて、修飾された遺伝子が変異体を発現させ、所望の活性についてスクリーニングされる。時折、変異体の性質は野生型タンパク質の性質と比較される。
歴史的には、タンパク質設計プロセスは所望の製品のための最良の配列を、全てのタンパク質の中で見つけるという課題と等しく発達してきた。この課題は非常に困難であり、「NPハード」と言われている。複雑な理論において、クラスPにおいて定義されているこの課題は、それらの問題のための容易且つ効果的な多項式時間アルゴリズムであると考えられている。NPハード問題は効果的な多項式時間アルゴリズムが近年知られていないという問題であり、もし、任意のNPハード問題が解消したならば、全てのNPハード問題も解消するだろう(Pierce and Winfree,Protein Engineer.,15:779-782 [2002])。ライブラリーの構築及びスクリーニングのための最近の戦略は全配列にわたりまたは タンパク質内の決められた位置において無作為に多様化するタンパク質配列を生成するこ とを含む。これらのライブラリーは、通常、所望本来の性質に対しては「負」である多数のメンバーを有し、相対的に僅かな正の変異を見つけるために多くのスクリーニングを必要とする。通常、ネガティブミューテーションは無視され、ポジティブメンバーに対して配列情報が得られる。
飽和突然変異誘発(Estell et al.,in World Biotech Report 1984,vol. 2:
USA, Online Publications,London [1984],pages 181-187; and Wells et al,Gene 34:315-323 [1985])はタンパク質中の幾つかの性質を最適化する変異誘発のために、タンパク質空間を探すにの用いることができる技術のうちのひとつである。幾つ かのグループが飽和突然誘発変異により変化させるべき部位を同定するための発展した方 法を有している。(Reetz et al,Angew. Chem. Int. Edn.,44:4192-4196 [2005]; Kato et al.,J. MoI. Biol.,351 :683-692 [2005]; and Sandberg et al.s Proc. Natl. Acad. Sci.,90:8367-8371 [1993])。しかし、部位を特定するための一般化された方法は提言されていない。
更に、大部分のタンパク質エンジニアリング方法は多くのアミノ酸変異誘発オプションを生成するので、所望のタンパク質性質を生成するために数多くの変異体のスクリーニングが必要とされてきた。通常、スクリーニングは有益な変異体を生成するために何度も繰り返されている。したがって、大部分の方法は骨の折れる時間のかかるものであった。効率的で所望の結果を得ることのできるタンパク質エンジニアリング方法が引き続き必要とされている。
本発明はタンパク質エンジニアリングのための方法を提供する。具体的には、本発明は部位評価ライブラリーを用いた方法を提供する。特に、本発明は所望の性質を最適化するライブラリーを合理的かつ効率的に設計するために、多数の所望の性質について得られた情報を用いるための方法を提供する。幾つかの態様において、本発明は少なくとも2つの所望の性質について改善されたライブラリーを設計するための手段を提供する。
本発明は、タンパク質の所望の性質を改善するのに関連したタンパク質のアミノ酸配列内の位置を同定するための手段を提供する。幾つかの好適な態様において、本発明は改善 された性質とともに所望の性質を有するタンパク質を製造するために好ましい変異体を同 定するための手段を提供する。幾つかの追加的な好ましい態様において、本発明は野生型 タンパク質よりも特定のパーセンテージの改良を有するアミノ酸ポジションおよび変異誘 発を同定するための手段を提供する(例えば、1つの性質について野生型タンパク質より も110%優れている)。更なる好適な態様において、本発明は少なくとも1つの改良された性質及び少なくとも1つの追加的な野生型タンパク質より有意には劣らない性質を(例えば、1つの性質について野生型タンパク質よりも110%優れており、他の性質において野生型タンパク質の90%より悪くない)を提供する変異体を同定する手段を提供する。更なる好適な態様において、ライブラリーはこの情報にもとづいて構築される。幾つかの態様において、このライブラリーは同定された変異体の全てを用いて構築される。一方他の態様において、このライブラリーは同定された変異体のサブセットを用いて構築される。すなわち、このライブラリー特定の数及びタイプの変異体で構築されることは意図していない。
本発明はタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、所望の試験方法において、少なくとも1つの所望の性質についてタンパク質へのライブラリーを試験する工程、少なくとも1つの所望の性質について値の範囲を同定する工程、所望の試験における好ましい結果に関係する値の範囲内の最小値を同定する工程、及び少なくとも1つの所望の性質の範囲内における最小値を上回る少なくとも1つの変異を有する複数のタンパク質変異体を提供する工程、それゆえ、少なくとも1つの変異を含むタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程を含むタンパク質エンジニアリングのための方法を提供する。このライブラリーは所望の試験における好ましい結果を有するメンバーを多く含む。幾つかの態様において、この好ましい結果は、前述の第一の工程で定義される試験で観察される最大値よりも50%、60%、70%、80%、90%、又は95%大きい値に相当する。幾つかの代替的な態様において、1つ以上の所望の試験が本発明の方法に用いられる。幾つかの好適な態様において、タンパク質は酵素である。幾つかの特定の好適な態様において、この酵素は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ及びリパーゼから選択される。
本発明は、タンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、所望の試験において少なくとも2つの所望の性質について変異体のライブラリーを試験する工程、少なくとも2つ タンパク質の性質についての値の範囲を同定する工程、所望の試験における好適な結果に関係する値の範囲内における最小値を同定する工程、及び少なくとも2つの所望の性質の範囲内の最小値を上回る複数のタンパク質変異体を提供する工程、それゆえ、所望の試験において好適な結果を有するメンバーに富むタンパク質変異体のライブラリーが提供される。請求項5の方法は、好適な結果が前述の第一工程において定義された試験で観察された最大値の50%、60%、70%、80%、90%、又は95%大きい値に相当する。幾つかの好適な態様において、前記タンパク質は酵素である。幾つかの特定の好適な態様において、この酵素は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ及びリパーゼから選択される。
本発明は野生型タンパク質及びこの野生型タンパク質のタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程、前記タンパク質変異体のライブラリー及び野生型タンパク質を所望の試験において少なくとも1つの所望の性質について試験をする工程、この少なくとも1つの所望の性質に関する値の範囲を同定する工程、所望の試験での好適な結果に関係する値の範囲を同定する工程、所望の試験の好適な結果に関係する値の範囲の中の最小値を決める工程、野生型について得られた結果と比較して好ましい結果を有するタンパク質変異体を同定する工程(好ましい結果とは所望の改善された性質である。)、及び所望の少なくとも1つの性質の範囲の最小値を超える複数のタンパク質変異体を提供し、それゆえ、所望の試験において、好ましい結果を有するメンバーの多い改善されたタンパク質変異体のライブラリーを提供する工程を含む、タンパク質エンジニアリングのための方法提供する。幾つかのの好適な態様において、前記メンバーは更にパフォーマンスインデックスを決定する工程を更に含む。このパフォーマンスインデックスは改善されたタンパク質変異体のそれぞれについて得られた値を野生型タンパク質について得られた値で割ることにより決定される。幾つかの特に好適な態様において、前記方法は更に改善されたタンパク質変異体を同定する工程を更に含む。前記改善されたタンパク質変異体は所望の試験において1.1より大きいパフォーマンスインデックス値を有する。幾つかの追加的な態様において、このタンパク質は酵素である。幾つかの特に好適な態様において、前記酵素はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される。幾つかの代替的な態様において、前記タンパク質は抗体及び成長因子から選択される。更なる追加的な態様において、野生型タンパク質はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される酵素の成熟体である。幾つかの好適な態様において、前記所望の性質は、電荷、洗浄性能、硬表面洗浄性能、熱安定性、貯蔵安定性、洗剤安定性、基質結合性、酵素抑制、発現レベル、反応速度、及び基質分解性から選択される。幾つかの態様において、野生型タンパク質及びタンパク質変異体は少なくとも1つの洗浄組成物の成分である。幾つかの好適な態様において、洗浄性能は5乃至12.0のpHを有する粉末又は液体洗剤に製剤化された洗浄組成物中で試験される。
本発明はタンパク質折りたたみの中において親タンパク質の改善された変異体を生成するための方法も提供する。前記方法は、所望のアッセイにおいて所望の性質の範囲にわた タンパク質折りたたみ内で試験タンパク質の複数の変異体をアッセイする工程、所望のアッセイにおいて好ましい結果に関係する所望の性質の範囲内の最小値を同定する工程、所望のアッセイにおいてタンパク質折りたたみの親タンパク質をアッセイする工程、及び、改善された変異体が所望の性質の範囲の最小値を超えるように、親タンパク質のアミノ酸置換を導入して、親タンパク質の改善された変異体を生成する工程、を含む。幾つかの好適な態様において、前記親タンパク質及び試験されるタンパク質は異なる。幾つかの態様において、前記方法は、パフォーマンスインデックスを決定する工程を含む。このパフォーマンスインデックスは、改善されたタンパク質について得られた値を親タンパク質について得られた価で割ることにより決定される。幾つかの態様において、試験タンパク質及び親タンパク質は酵素である。幾つかの好適な態様において、この酵素は、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される。いくつかの代替的な態様に おいて、試験されたタンパク質及び親タンパク質は抗体及び成長因子から選択される。更なる追加的な好適な態様において、親タンパク質はプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼから選択される酵素の成熟体である。幾つかの好適な態様において、所望の性質は、電荷、洗浄性能、硬表面洗浄性能、熱安定性、貯蔵安定性、洗剤安定性、基質結合性、酵素抑制、発現レベル、反応速度、及び基質分解性から選択される。幾つかの態様において試験された及び親タンパク質は少なくとも1つの洗剤組成物の成分である。幾つかの代替的な態様において、改善された変異体は洗浄組成物の成分となる。幾つかの好適な態様において、洗浄性能は、5乃至12.0のpHを有する粉末及び液体に製剤化される洗剤組成物中で試験される。
図1は各性質について得られた2851の△△Gappの分布を示す。
図2Aは4つの部位において、1000のランダムに選択された変異体の組合せについての、LAS安定性及びケラチン活性についての△△Gappの値の予測される分布を、このライブラリーのランダムに選択された64のメンバーについての△△Gappの実際の分布との比較を計算した結果を示す。
図2Bはこのライブラリーからランダムに選択された64のメンバーについて観察された実際の分布を示す。
発明の詳細な説明
本発明はタンパク質エンジニアリングのための方法を提供する。具体的には、本発明は部位評価ライブラリーを用いた方法を提供する。
具体的な目的のために、特定の製品について最適であるタンパク質を生成するために、タンパク質配列中の最良配列を見つけることは常に必要ではない。大部分の製品について、解決すべき課題は、いくつかの性質に必要とされる最小値に見合う又はこれを超える少なくとも1つのタンパク質配列を同定することである。このためには、任意の所望の性質について都合の悪い変異の知識だけでなく、特定の性質に好適な変異の知識が必要である。本発明は初期の性質を改善し、所望の限度内に他の性質の値を維持するために修飾する ことができるタンパク質において、これらの位置を同定することにより目標を達成するた めの手段を提供する。
本発明は、各部位において、「部位評価ライブラリー」を構築して、タンパク質の所望の性質の全てについて、全ての位置を評価するための手段を提供する。好適な態様において、これらのライブラリーは、各部位において、9乃至19の変異を含み、タンパク質を改変し、ライブラリーの構築に用いるために、各位置を評価する。各性質は、親酵素について測定され、野生型に対する各変異体についての見せかけの自由エネルギーのが評価される。これらのデルタデルタG(即ち、△△G)の見かけの値は、加算性を評価するために用いる。
変異体を解析するための理想的な方法は、所望の方法において、親タンパク質に対する変異体につての自由エネルギーの差を考慮することである。プロセスのためのギブス自由 エネルギーは、システムにより実行可能な仕事の最大量を表している。親酵素に対する エネルギーの変化(△△G)は以下の様である。
式1
Figure 0005785686
式中、kvariantは、変異体酵素の速度定数であり、kparentは親酵素の速度定数であり、Rは気体法則定数であり、Tは絶対温度である。大部分のアッセイは真の自由エネルギーを決定するようには構築されていないので、我々は以下の数量を用いた。
式2
Figure 0005785686
式中、Pvariantは変異体のパフォーマンスバリューであり、Pparentは同じ条件下での親酵素のパフォーマンスバリューである。△△Gappバリューはデータの分布及び加算性について、△△Gと同様な挙動を示すと考えられる。しかしながら、△△Gは親酵素と比較したときの変異体により実行される仕事の最大量であるので、△△Gappの量は通常△△Gを小さく見積もり、2つの追加的な位置の性質は、それらの△△ Gバリューを一緒に加算することにより予測される値よりも大きくなるであろうという、 相乗効果にみえる結果を導く。
本発明の方法は、並行して複数の性質を改善するのに用いる、効果的なライブラリーを設計するのに用いる。189アミノ酸よりなるセリンプロテアーゼである「ASP」が、本明細書で説明されるけれども、本方法は任意所望のタンパク質エンジニアリングに適用することができる。SAPプロテアーゼはセリンプロテアーゼのS1Eファミリー(Rawlings et al.,Nucleic Acids Res.,34:D270-D272 [2006])内に属し、ストレプトグリシン(streptogrisins)の相同体である。セルロモナス株(Cellulomonas strain)69B4(DSM983316035)由来の成熟セリンプロテアーゼ酵素は、以下に示すように、189アミノ酸長(配列番号2(SEQ ID NO:2)であり、His32、Asp56、及びSer137からなる触媒トリアドを有する(触媒トリアドを太字下線で示す。)
式3
Figure 0005785686
部位評価ライブラリー(ESLs)は12乃至19の置換を189個の部位のそれぞれに導入して、本明細書で説明するように構築される。189個の部位について2851の変異体を3つの異なる活性アッセイ及び2つの異なる安定性アッセイを用いて解析された。これらは1つの部位当たり、平均15の変異体である。

SEL変異体の評価データ
表1はタンパク質中の1つの位置、すなわち、14位についてのデータを示す。
Figure 0005785686
全ての位置について野生型アミノ酸は参照位置として列挙した部位14において、014Rが野生型である。R014Xは測定されたそれぞれの変異を示す。各性質について、親酵素に対して、16回測定を行い、△△Gappの平均値及び標準偏差を決定した。親酵素の平均値(μparent)を0とし、△△Gappに対する標準偏差(σpa rentが決定された。これらの値はこの分子の各位置におけるそれぞれの性質につい ての参照として用いられた。表1はR014Rラインを列挙している。
2851の変異体に対する結果の概要を表2に示す。変異体は2つのクラス、「アップ」及び「ダウン」に分けられた。△△Gappが負又は0であれば、変異体は「アップ」であり、△△Gappが正であれば、変異体は「ダウン」である。変異体が「アップ」又は「ダウン」である可能性は、up又はdownのいずれかであった変異体の数をカウントし、この数を変異体の総数で割ることにより(すなわち、ASPの場合は2851)決定した。特定の性質について、変異体がダウンである確立(即ち、pダウン)は84乃至94%の範囲であったと分かった。特定の性質について、変異体がup(すなわちup)である可能性は、6乃至16%の範囲であったと分かった。これらのデータは、1つの特性に良い突然変異を蓄積は、他のすべての特性がより悪くなるであろうということを必要としていることを示す。
Figure 0005785686
各性質について得られた2851の△△Gappの値の分布を図1に示す。幾つかの態様において、全ての性質についての分布は2つ以上のガウス分布の合計としてモデル化さ れた。このことは文献中に報告されているライブラリーの自由エネルギーの分布に一致している(Lancet et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8367-8371 [1993]; and Lu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1410-1415 [2001])。従って、各性質についての平均△△G app すべて親酵素よりも相当悪くなる。親の活性の1%以下の活性(△△Gapp>2.7)を有するそれぞれの変異体について、この値は、アッセイシステム固有の誤差により、任意で1%とされた各性質について、親酵素の1%以下を有する変異体の数が非常に多かった。これらのデータについて、および親酵素の5%より高い活性を示す変異体のサブセットについて、平均値及び標準偏差を計算した。(表3を参照のこと。)
2851個の変異体の各性質についての平均△△G app は0.9から1.5Kcal/molまで変動した。この範囲は親酵素の活性の20%乃至7%に相当する。
これらの分布はメンバー当たり平均1つの変異を有するランダムライブラリー中に期待される△△Gapp値の分布も表していることに気づくことが重要である
Figure 0005785686
部位評価データは性質の間の関係の証明として試験された。各性質の△△Gappの値を他のそれぞれの他の性質についてプロットし、相関係数を計算し、表4に示した。タンパク質基質上の2つの活性測定は相関性があり(r=0.77)、合成ペプチド基質AAPF上の活性を有するいずれかのタンパク質の相関が低かった(r=0.53)。2つの安定性の測定値は活性の測定値にも相関しておらず、お互いに相関してもいなかった。
Figure 0005785686
SELポジションデータの評価
アミノ酸配列内の位置を解析するために、2つのタイプの部位を定義した。「アンプロダクティブ」部位は親酵素よりも優れている変異を有していない。一方、「プロダクティブ」部位は、親酵素よりも優れている少なくとも1つの置換を有している。表5はASPの189個の位置の中の各性質についてのプロダクティブ及びアンプロダクティブ部位の数を示す。部位がプロダクティブであろうという可能性はプロダクティブ部位の数を部位の総数(189個)で割って計算される。任意の変異が親酵素よりも優れているという可能性は低いけれども(即ち、6%乃至28%)、所与の部位が少なくとも1つのアップ である可能性は非常に高い。
Figure 0005785686
ASPにおいて、進化において保存又は変更された配列部位だけでなく、どのようにしてプロダクティブ及びアンプロダクティブ部位が構造特性(例えば、埋没アミノ酸、相互作用しているアミノ酸、活性部位の近くなど、)を参照しながら分布したのかを決定することは興味深い。このことを決定するために、ASPの構造を試験し、20の非重複相同体に対して、配列をアラインした(Edgar, Nucl. Acids Res.,32:1792-1797 [2004])。結果を表6に示す。
Figure 0005785686
調査した性質に対して、プロダクティブ部位がASPの疎水性コアには見られなかった ことは特筆すべきことである。カゼイン活性について大部分のプロダクティブ部位は、触媒トリアドに近い部位にはないことも興味深い。1つのカゼインプロダクティブ(P118)部位のみが基質に接触していた。カゼインプロダクティブ部位の残りの部分はタンパ ク質全体の全体のフレキシブル表面ループ上に分布している。ケラチン活性についてのプロダクティブ部位は活性部位の近くには見られなかった。これらの部位は分子全体の表面に広がっていることが発見された。ケラチンプロダクティブの最も近いのはR014であり、触媒セリンからほぼ13A離れている(S137、Ca−Caディスタンス)。
LAS安定性プロダクティブ部位の位置は例えば、全体のフレキシブル表面ループ中に広がった全体枠に続いている。このことは、1つの例外を除いて、熱安定性プロダクティブ部位についても当てはまる。その例外は、C033はアミノ酸配列中のH032にワンデルワールス接触しており、H032に連続的に隣接している。
配列アラインメントに基づいて、部位をASPに対して、「保存」(20配列中違いなし)、「可変」(20アミノ酸配列中6又はそれ以上のアミノ酸配列が異なる)、「挿入又は欠失部位」に定義した。期待される数を、部位が所与の条件に適合し、所与の性質についてプロダクティブ又はアンプロダクティブのいずれかである可能性から計算した。期待された数に対する観察された割合を計算した。1.4を超える数及び0.6を下回る数は部位の特定のクラスのオーバーリプレゼンテイション又はアンダーリプレゼンテーションのいずれかの指標と考えられる。各部位の数にマッチして10のランダムに生成されたデータの結果に基づいて、カットオフバリューが選択される。埋没残査、及び幾つかの接触を有する残査は、LAS安定性だけでなく2つのタンパク質基質におけるプロテアーゼ活性について、アンプロダクティブ部位と強く関係付けられる。驚くことに、活性部位の近くの位置はプロダクティブよりもアンプロダクティブであるということが発見された。配列アラインメントにおいて、タンパク質基質上の活性及びLAS安定性について、特にアンプロダクティブであるようなことが発見され、一方、高い可変部位及び挿入又は欠失部位は活性についてプロダクティブであり、安定性については僅かに効果があった。
実施例5で説明するように、性質間の相関に関わらず、任意の性質について有害な変異体は他の性質について有害な変異体であった。僅かな数の部位(5−10%)のみが、全ての性質について悪い変異を有していた。これらの部位を「ホールド」と定義され、進化において保存されている。このことは、任意の性質について有益な突然変異の同定はその性質について本当の予測可能なスクリーンを必要とするが、任意の性質に対して有害であろう突然変異の同定は任意(ANY)のスクリーンを用いて行うことを、示唆している。単純化されたタンパク質エンジニアリングストラテジーはSELを構築し、単純な活性及び/又は安定性スクリーンを用いたスクリーンである。有害な突然変異体を同定し、幾つかの有害な突然変異を有するそれらの部位をライブラリー及び突然変異の組合せを構築して、複数の性質を改善する。タンパク質表面のピッキング部位を僅かな相互作用を有し、プロダクティブ部位の大部分を提供する配列アラインメントにおいて変動的である。多くの接触を有し、進化において強く保存された分子の内部の部位は有害な変異を有している可能性が高く、避けるべきである。コンピューター及び/又は電気的方法、及び/又はプログラム等を含むがこれらに限定されない、配列解析及び/又は構造情報を得るための任意の好適な方法を本発明に用いることができる。
表5に示す表は、2つの性質についての相関係数に従って、2つの性質のそれぞれについて、5%より活性の高い及び5%より活性の低い変異体の数の対での比較である。3つの酵素、即ち、ASP、ACT、及びNPReからの結果を示した。しかしながら、本発明を特定の酵素に限定することを意図しない。ここで説明する方法は任意のタンパク質に用いることができる。
酵素(ASP、ACT、及びNPRe)及びアッセイシステムについての詳細は米国特許出願Ser.Nos.10/576,331、10/581,014、11/581,102、及び11/583,334に記載されている。これらの文献全体を参照により本明細書に援用する。更に、2007年6月6日に出願された米国仮特許出願Ser No.60/933,312に、本発明に関係して用いることができる。本明細書で用いる性質はカゼイン活性(CAS)、ケラチン活性(KER)、AAPF活性(AAPF)、LAS安定性、ASPに対する熱安定性、並びにACTについての過酸形成(PAF)、及び過酸分解(PAD)である。これらの実験において、相関が見られたのは(相関係数>0.5)ASPに対するCAS,KER、及びAAPFのみである。他の全ては相関が無かった(相関係数<0.3)。性質については相関がかなったものの、2つの性質に対して有害であろう変異の可能性は、たまたま期待されたよりも高い。表において、チャンスに基づいて基体される変異体の観察された数の計算された割合を示す。1を超えるマスは正の相関を示し、1より少ない数は負の相関を示す。
ライブラリーデザイン
幾つかの特に好適な態様において、部位評価ライブラリーは組合せライブラリーデザインに用いる。従来のライブラリー構築においては、ランダムライブラリーが構築され、1つの性質に対して多くのライブラリーのメンバーをスクリーニングして、それらを組合せ、この工程を繰り返していた。幾つかの研究において発見されているように(Bloom et
ah, Curr. Opin. Struct. Biol.,15:447-452 [2005]; Bloom et ah,Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 103:5869-5874 [2006];and Guo et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :9205-9210 [2004]参照のこと)、1つの性質においてポジティブな変異体の蓄積は、他の性質について好ましくない結果となる。任意の変異体が任意の性質についてアップである可能性は少なく、任意の変異体がダウンである確立が高く、(>85%)及び活性を高める3以上の蓄積が幾つかの他の性質を減らすことが非常に高いことから、変異体このことは、表2からも容易に理解できる。
しかしながら、この問題は複数の性質について好ましいライブラリーを構築するための部位評価データを用いることによって避けることができる。アンプロダクティブ部位は組合せライブラリーに含まれていない。プロダクティブ部位は更にアップである変異体のパーセンテージで分類される。LAS安定性及びケラチン活性についてアップである変異体の高いパーセンテージを有する4つの非相互作用部位のグループが一度に両者の性質を改善するためのライブラリーを設計するために用いられた(表7参照)。
Figure 0005785686
これらの部位の加算性を仮定すると、予想される△△Gappの値はライブラリーから計算され、実際のライブラリーについて決定された値と比較される。幾つかの態様において、この性質について付加的であるこれらの部位について、この結果は典型的に合致している。しかし、他の態様において、予想と合致しない結果において、矛盾する方法がこれらの部位の相互作用、性質の非加算性、及び/又は用いたアッセイの適合性についての情報を提供する。
4つの部位において1000のランダムに選択された変異体の組合せについての、LAS安定性及びケラチン活性についての、△△Gappの値の予想される分布を計算し、ライブラリーのランダムに選択された664のメンバーの△△Gappの実際の分布と比較した。この結果を図2Aに示す。図2Bはこのライブラリーのランダムに選択された64について観察された実際の分布を示す。このライブラリーは明らかに、LAS安定性及びケラチン安定性の両者について親酵素よりも優れているメンバーを数多く有する。これらの部位の加算性と一致して、ケラチン活性について観察された平均値は0.02Kcalで、この値は予測された値の−0.01Kcalに非常に合致していた。LAS安定性の結果から、標準偏差は同様であったが、−1.13の観察された平均値は有意に予測値の−0.28を上回った。
Figure 0005785686
LAS安定性の場合、SEL変異体についてのオリジナルアッセイは真の△△Gの値を低く評価した。インキュベーション温度を25℃から35℃に変更してアッセイを行った。このようにしたのは、大部分のライブラリーのメンバーがアッセイ条件下において安定であり、条件をより過酷にするためである。△△Gappの値はこれにより補正された、しかし、補正された可能性は、依然として△△Gの値を低く見積もり、部位はおそらく依然としてLAS安定性に対して加算的であり、標準偏差の一致を与えていた。
定義
特に言及しない限り、本発明の実施は、分子生物学、タンパク質エンジニアリング、微生物学、及び組み換えDNAにおける当業者が通常用いる従来技術を含む。そのような技術は当業者に良く知られているものであり、多くの文献及び参考となる研究に記載されている(Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition (Cold Spring Harbor),[1989]); and Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology" [1987]参照のこと)。本明細書で言及されている、全ての特許、特許出願、文献及び/又は刊行物は参照により本明細書に援用される。
別に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的文言は、本発明の属する分野における当業者により理解されているのと同様の意味で用いられる。例えば、Singleton and Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); and Hale and Marham,The
Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY (1991)は本発明に用いる文言の多くについての一般的な辞書である。本明細書で言及しているものと同じか同等である任意の方法及び物質を本発明の実施に用いることができるが、本明細書では、好適な方法及び物質について記載している。従って、以下で定義される文言は明細書全体を参照することでより深く定義されるものである。本明細書において、単数は、明らかに言及していない限り、複数も含む。別に定義しない限り、核酸配列は左から右に向かって、5’末端から3’末端になるように記載する。アミノ酸配列は左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端となるように記載する。本発明をここに言及する特定の方法、手順、及び試薬に限定することは意図していない。それらは当業者により用いられる文脈上の意味に依存して変化することを理解されたい。
本発明の実施には、特に定義しない限り、当業者の知識の範囲内である、タンパク質精製、分子生物学、微生物学、組み換えDNA技術、及びタンパク質配列決定の従来技術が用いられる。
更に、本明細書における標題は本発明の各種側面又は態様を限定するものではない。本発明は明細書全体を参照することで理解されるべきである。すなわち、以下で定義する門限は明細書全体を参照することでよりよく定義される。しかしながら、本発明の迅速な理解のために、以下に多くの文言の定義を記載する。
本明細書において、「プロテアーゼ」及び「タンパク質分解活性」の語は、ペプチド又はペプチド結合を有する基質を加水分解する能力を有するタンパク質又はペプチド又はを意味する。タンパク質分解活性を測定するための良く知られた方法は数多くある(Kalisz, "Microbial Proteinases,"In: Fiechter(ed.),Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,[1988])。例えば、タンパク質分解活性は市販の基質を加水分解する個々のプロテアーゼの能力を解析して比較することにより、確認される。プロテアーゼ又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質は、ジメチルカゼイン(シグマ C−9801)、ウシコラーゲン(シグマ C−9879)、ウシエラスチン(シグマ E−1625)、及びウシケラチン(ICN Biomedical 902111)を含むがこれらに限定されない。これらの基質を用いた比色分析は当業者に良く知られている(WO 99/34011 及び U.S. Pat. No. 6,376,450,参照のこと。これらの文献を参照により本明細書に援用する。)pNAアッセイ(例えば、Del Mar et ah,Anal Biochem.,99:316-320 [1979]参照)もグラジエント溶離をする間に収集される分画の活性酵素濃度を決定するのに有用である。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質である、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−p−ニトロアラニン(sAAPF−pNA)を加水分解したときに放出されるp−ニトロアラニンの割合を測定する。加水分解反応からの黄色の生成速度が410nmの比色計で測定され、活性酵素の濃度が計算される。更に、280nmの吸光度はタンパク質の総濃度を測定するのに用いることができる。活性酵素/総タンパク質の比が酵素の精製度を示す。
本明細書において、「ASPタンパク質」、「Aspプロテアーゼ」、及び「Asp」はセリンプロテアーゼを意味する。幾つかの好適な態様においてAspプロテアーゼはセルロモナス(Cellulomonas)株96B4から得られた96B4プロテアーゼとして設計されたプロテアーゼである。従って、好適な態様において、「96B4プロテアーゼ」の語は配列番号2(SEQ ID NO:2)で提供されるアミノ酸配列と実質的に同一な配列を有するセルロモナス(Celluromonas)株96B4(DSM16035)由来の自然発生成熟プロテアーゼを意味する。代替的な態様において、本発明はASPプロテアーゼの一部分を提供する。
セルロモナス(Cellulomonas)タンパク質ホモログの語は、セルロモナス(Cellulomonas)株96B4由来の成熟タンパク質に対するアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を有する自然発生プロテアーゼ、又はそのような自然発生プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列、及びそのような核酸は配列によりコードされるセリンプロテアーゼの機能特性を保持していプロテアーゼを意味する。幾つかの態様において、これらのプロテアーゼホモログはセルロモナジン(cellulomonadin)と言う。
「プロテアーゼ変異体」、「ASP変異体」、「ASPプロテアーゼ変異体」、及び「96Bプロテアーゼ変異体」の語は、野生型ASPと、特にその機能において同様であるが、野生型プロテアーゼの配列とは異なる配列となるようにそれらのアミノ酸はいえるにおいて変異を有するプロテアーゼを表す言葉として本明細書において用いる。
本明細書において「セルロモナス(Cellulomonas)種」の語はCellulomonadaceae, Suborder Micrococcineae, Order Actinomycetales,Class Actinobacteriaのファミリーのメンバーとして分類されるグラム陰性バクテリアである「セルロモナス(Cellulomonas)」属に属する全ての種を意味する。従って、再分類された種をこの属に含まれる。
本明細書において、「バシルス属」は「バシルス」属に属すると当業者により認識されている全ての種を含む。この例としては、バチルススブチリス(B. subtilis)、バチルスリケニホルミス(B. licheniformis)、バチルスレンタス(B. lentus)、バチスルブレビス(B. brevis)、バチルスステアロセレモフィリス(B. stearothermophilus)、バチルスアルカノフィリス(B. alkalophilus)、バチルスアミロロケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、バチルスクラウシ(B. clausii)、バチルスハロデュランス(B. halodurans)、バチルスメガテリウム(B. megaterium)、バチルスコアギュランス(B. coagulans)、バチルスサーキュランス(B. circulans)、バチルレンタス(B, lautus)及びバチルススリンギエンシス(B. thuringiensis)を含むがこれらに限定されない。バシルス属は分類上再編成され続けている。従って、バチルスステアロセレモフィリス(B. stearothermophilus)のように、依然はバチルス属に分類されていたけれども、現在はゲオバシルスステアロセレモフィリス(Geobacillus stearothermophilus)と呼ばれているものも含むがこれらに限定されない。酸素の存在下で耐性のある内性胞子を生成することはバシルス属の特徴であると定義されている。しかしながらこの特徴は、近年分類されたアリシクロバチルス(Alicyclobacitlus)、アンピバチリルス(Amphibacillus)、アネウニバチスル(Aneurinibacillus)、アノキシバチスル(Anoxybacillus)、ブレビバチルス(Brevibacillus)、フィロバチルス(Filobacillus)、グラシリバシルル(Gracilibacillus)、ハロバチルス(Halobacillus)、パエニバチルス(Paenibacillus)、サリバチルス(Salibacillus)、セルモバチルス(Thermobacillits)、ウレイバチルス(Ureibacillus)、及びバージバチルス(Virgibacillus)についても当てはまる。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」の語は、本明細書において、リブヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれかである、任意の長さの核酸のポリマーを意味し、互換的に用いられる。この語は、一重鎖、二重鎖、又は三重鎖DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA−RNAハイブリッド、又はプリン又はピリジン塩基を含むポリマー、又は他の天然の、化学的に、生物学的に修飾された、非天然の又は誘導されたヌクレオチド塩基を含むがこれらに限定されない。以下にポリヌクレオチドの非限定的な例を示す。遺伝子、遺伝子フラグメント、染色体フラグメント、EST、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、リボゾーム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列より単離されたDNA、任意の配列より単離されたRNA、核酸プローブ、及びプライマー。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド、及びヌクレオチドアナログ、ウラシル、他の糖、及びフルオロリボゾーム及びチオール、及びヌクレオチド分岐等の修飾されたヌクレオチドを含む。代替的な態様において、ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により阻害されたヌクレオチド配列を含む。
本明細書において、「DNA構築物」及び「DNAの軽質転換」の語は宿主細胞又は有機体に配列を導入するために用いるDNAを意味するために互換的に使用される。このDNAはPCRによりin vitroで生成されるか又は当業者に知られている他の好適な方法で生成される。特に好適な態様において、DNA構築物は所望の配列を含む(例えば、挿入配列として)。幾つかの態様において、この配列は制御エレメント等(例えば、プロモーター)の付加的なエレメントに作動可能に結合している。更なる好適な態様において、この軽質転換しているDNAは末端に付加している非相同配列を含む(例えば、スタッファー配列又はフランク)。幾つかの態様において、挿入配列の末端を閉じて、軽質転換DNAが閉鎖環を形成する。この軽質転換は配位野生型であってもよく、変異体又は修飾されていてもよい。幾つかの態様においてDNA構築物は宿主細胞染色体に相同な配列を含み。他の態様において、このDNA構築物は非相同配列を含む。一旦DNA構築物がin vitroで構築されると、それは、1)異種の配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入するため、及び/又は2)宿主細胞の染色体の領域を変異させるため(即ち、内性の配列を異種の配列で置換る)、及び/又は3)標的遺伝子を欠失させるため、及び/又は4)宿主細胞に組換えプラスミドを導入するために用いられる。
本明細書において、「発現カセット」及び「発現ベクター」の語は、標的細胞内で特定の核酸の転写をさせることができる一連の特定の核酸エレメントで、組み得て的又は合成的に生成された核酸構築物を意味する。この組み換え発現カセットはプラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウイルス、又は核酸フラグメントに取り込まれる。通常、発現ベクターの組換え発現か設置部分は、他の配列の中で、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。好適な態様において、発現ベクターは宿主細胞内でヘテロDNAを取り込み発現する能力を有している。多くの真核及び原核発現ベクターが市販されている。好適な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。「発現カセット」の語は、「DNA構築物」と同じ意味に用いられ、これらの語は同義である。適切な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。
本明細書において、「ベクター」の語は核酸を1つ以上のタイプの細胞に導入するために設計されたポリヌクレオチド構築物を意味する。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、及びカセット等を含む。幾つかの態様において、このポリヌクレオチド構築物は、適した宿主の中でDNAの発現に影響を与えることができる好適なプロ配列(例えば、分泌等)に作動可能に結合しているプロテアーゼ(例えば、プロテアーゼ前駆体及び成熟プロテアーゼ)をコードするDNA配列を含む。
本明細書において、「プラスミド」の語は、クローニングベクターとして用いる環状二本鎖(ds)DNA構築体であり、種々の原核及び真核生物内で染色体外自己複製遺伝子要素を形成し、又は他の宿主細胞に組み込むことができるものを意味する。
本明細書において、核酸配列を宿主細胞に導入する意味で用いられる、「導入する」の語は宿主細胞に核酸配列を輸送するのに適した任意の方法を意味する。そのような導入するための方法は、プロトプラスト融合、形質感染、形質変換、結合、及び形質導入を含むがこれらに限定されない(例えば、Ferrari et al., "Genetics, " in Hardwood
et al, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pages 57-72,
[1989]参照)。
細胞に対して用いる「形質転換された」、「安定に形質転換された」又は「遺伝子導入された」の語は、そのゲノム内に、又は数世代にわたり維持されているエピソームプラスミドとして、組み込まれている本発明の異種核酸配列を有する細胞を意味する。
核酸は、他の核酸配列と機能的な位置にある場合に「作動可能に結合する」という。例えば、シグナルペプチドをコードするDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に結合し、プロモーターは、配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に結合するという。一般に、「作動可能に結合」とは、結合するDNA配列が隣接することを意味し、セクレタリーリーダーの場合には、隣接し、且つリーディングフレーム(reading frame)中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接を有しない。結合は都合のよい制限部位で結合されることにより行われる。そのような部位がない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来の方法により用いられる。
本明細書において、「遺伝子」の語は、ポリヌクレオチドをコードし、個々のコード配列(エキソン)の間の介在配列(イントロン)だけでなく、コード領域の前及び後ろに続く領域を含むポリヌクレオチド(例えば、DNAフラグメント)を意味する。
本明細書において、「相同遺伝子」の語は異なるが通常関連性を有している一組の遺伝子を意味する。これらはお互いに対応し、お互いに同一であるか非常に似ている。この語は遺伝子複製により分離された遺伝子(パラロガス)の他に、スペーシエーションにより分離された遺伝子(即ち、新たな種の発達)(例えば、オーソログ遺伝子)種により分離された遺伝子も含む。
本明細書において「オーソログ」及び「オーソロガス遺伝子」の語はスペーシエーションにより共通の遺伝子の祖先から進化した遺伝子を意味する(即ち、ホモロガス遺伝子)。通常、オーソロガスは進化の過程において同じ機能を保持している。オーソロガスの同定は新たに配列決定されたゲノムにおいて遺伝子の機能を予測するのに有用である。
本明細書において、「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」の語はゲノム内の複製により関係している遺伝子を意味する。オーソロガスは進化の過程で同じ機能を保持しているのに対し、パラロガスは、幾つかの機能はオリジナルのものに関連しているが、更に新たな機能を獲得している。パラロガス遺伝子の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、及びトロンビンをコードしている遺伝子を含むがこれらに限定されない。これらは全て、セリンプロテアーゼであり同じ種を起源とする。
本明細書において、タンパク質は同じ配列において、同じトポロジー結合を有する同じ主要2次構造を有しているならば、共通の「折りたたみ」を有する。同じ折りたたみを有する異なるタンパク質は2次構造の末端エレメント及びサイズ及び立体構造において異なるターン領域を有する。幾つかのケースにおいて、これらの異なる末端領域は構造の半分を占めるであろう。同じホールドカテゴリに置かれたタンパク質は共通の進化の祖先を有しているわけではない(例えば、特定のパックは位置及びチェーントポロジーを好む例えば、の物理的及び化学的由来の構造的類似性)。
本明細書において、「ホモロジー」の語は類似又は同一な配列を意味し、同一であることが好ましい。このホモロジーは当業者において標準的な方法で測定することができる(例えば、Smith and Waterman,Adv. Appl. Math.,2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. MoI. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988];programs such as GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, Madison, WI); and Devereux et ah,Nucl. Acid Res.,12:387-395 [1984]参照のこと)。
本明細書において、「アナロガス配列」の語は遺伝子の機能がセルロモナス(Cellulomonas)株69B4プロテアーゼに基づく遺伝子と本質的に同じであることを意味する。追加的に、アナロガス遺伝子は、セルロモナス(Cellulomonas)株69B4プロテアーゼの配列に対して、少なくとも45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、905、95%、97%、98%、99%、又は100%の配列同等性を有している。あるいは、アナロガス配列はセルロモナス(Cellulomonas)株69B4プロテアーゼに見られる遺伝子の70乃至100%の間のアラインメントを有し、及び/又はセルロモナス(Cellulomonas)株69B4染色体における遺伝子に配列される領域において5乃至10の間の遺伝子を有している。追加的な態様において、1つ以上の前述の性質がこの配列に適用される。アナロガス配列は配列アラインメントの既知の方法により決定される。通常行われているアラインメントはBLASTである。上と下に示したように、配列をアラインするのに他の方法も用いられる。
有用なアルゴリズムの1例はPILEUPである。PILEUPはプログレッシブ、ペアワイズアラインメントを用いて関係する配列のグループから複数の配列アラインメントを作り出す。このアラインメントを作り出すためにクラスタリング関係を示す系統樹もプロットすることができる。PILEUPはFeng及びDoolittleのプログレッシブアラインメント方法の簡略化したものを用いる(Feng and Doolittle,J. MoI. Evol.,35:351-360 [1987])。この方はHiggins及びSharpにより説明されるものと類似している(Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-153 [1989])。有用なPILEUPパラメーターは3.00のデフォルトギャップ、0.10のデフォルトギャップレングスウエイト、及び重量測定されたエンドギャップを用いる。
他の有用なアルゴリズムはBLASTアルゴリズムであり、Altstchul等により説明されている(Altschul et ah, J. MoI. Biol.,215:403-410, [1990]; and Karlin et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993])。特に有用なBALSTプログラムはWU−BLAST−2プログラムであり(Altschul et
al., Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996]参照)、WU−BLAST−2は大部分がデフォルトの値である幾つかのサーチパラメーターを用いる。調節可能なパラメーターは以下の値に設定されている:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワードスレッシュホールド(T)=11。HSP S及びHSPSパラメーターは動的値であり、特定の配列のコンポシシヨン及び所望の配列をサーチされる所望の配列に対する特定のデータベースのコンポジションに依存してプログラム自身により確立される。しかしながら、この値は感受性を高めるために調節することができる。「より長い」配列は配列された領域において最も実際的な残基を有するものである(アラインメントスコアを最大化するためにWU−Blast−2により導入されたギャップは無視される)。
従って、「核酸配列の相同性のパーセンテージ(%)」の語は初期の配列(即ち、所望の配列)の核酸残基に同一である候補配列中の核酸残基のパーセンテージであると定義される。好適な方法はデフォルトパラメータが設定され、オーバーラップスパン、及びオーバーラップフラクションがそれぞれ1及び0.125に設定されているWU−BLAST−2のBLASTINモジュールを用いる。
本明細書において、「組み換え」の語は、異種核酸配列の導入により修飾されている又はそのように修飾されて細胞由来の、細胞又はベクターを意味する。したがって、例えば、組み換え細胞は、自然発生細胞(非組み換え)の中に見られるのと同一遺伝子を発現している、又は計画された人為的介入の結果、天然遺伝子を過剰に発現した、未発現のままにする、又はまったく発現しない。「組み換え」、「組み換されている」及び「組み換え」核酸配列を生成することは、通常2つ以上の核酸フラグメントをキメラ遺伝子が生じるように組み立てることを意味する。
好適な態様において、変異体DNA配列は少なくとも1つのコドンにおいて飽和突然変異誘発を用いて生成される。他の好適な態様において、変異体DNA配列は野生型配列に対して、50%より多い、55%より多い、60%より多い、65%より多い、70%より多い、75%より多い、80%より多い、85%より多い、90%より多い、95%より多い、又は98%より多い配列相同性を有する。代替的な態様において、変異体DNAは、例えば、放射線、ニトロソグアニジン(nitrosoguanidine)等の既知の変異法を用いてin vivoで生成される、所望のDNA配列がその後単離され、本明細書に定義される方法に用いられる。
本明細書において、「増幅」及び「遺伝子増幅」の語は特定のDNA配列が増幅された遺伝子がゲノム中の初期に存在する遺伝子のコピー数よりも多くなるように、不均衡に複製されるプロセスを意味する。幾つかの態様において、試薬(例えば、抑制可能な酵素の抑制剤)の存在下の育成により細胞の選択がその薬物の育成のために必要な遺伝子生成物をコードする内因性の遺伝子の増幅、この遺伝子産物をコードする外因性(即ち、挿入)配列の増幅により、又は両者により、細胞の選択が行われる。
「増幅」はテンプレート特異性と含む核酸複製の特別なケースである。非特異的テンプレート複製で構築される(即ち、テンプレート依存性ではあるが特定のテンプレートには依存していない)。テンプレート特異性は、本明細書において、複製の忠実性(即ち、プロパーポリヌクレオチド配列の合成)及び(リボ又はデオキシ)ヌクレオチドとは区別して用いられる。テンプレート特性はしばしば、「標的」特性とも言われる。標的配列が他の核酸以外から分かれたものであるような意味において「標的」である。増幅技術は主にこの分類のために設計されている。
本明細書において、「プライマー」の語は、核酸即ち、とランドに相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下(即ち、ヌクレオチドの存在、及びDNAポリメラーゼのような誘導剤の下、好適な温度、及びpH)におかれた場合に、合成の開始点として作用することができる、制限消化精製により自然発生する、又は合成的に生成されたオリゴヌクレオチドを意味する。このプライマーは増幅の最大効率のためには好ましくは1本鎖DNAポリメラーゼが好ましいが、代替的には2本鎖DNAでもよい。もし、2本鎖DNAを用いる場合には、このプライマーを初めに伸長生成物に用いる前に各鎖を分離する処理を行う。好ましくは、このプライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。このプライマーは誘導剤の存在下で伸長生成物の合成を準備するために十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは温度、プライマーの源、及び用いる方法に依存する。
本明細書において、「プローブ」の語は、他の所望のオリグヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、精製制限消化のように自然発生的に、合成的に、組み換え的に、又はPCR増幅により得られたオリグヌクレオチドを意味する。プローブは1本鎖又は2本鎖でもよい。プローブは特定の遺伝子配列の検出、同定、オリグヌクレオチド単離に有用である。本発明に用いる任意のプローブは、酵素(例えば、酵素ベースの組織学的アッセイの他、ELIZA)、蛍光法、放射線法、及び発光法を含むがこれらに限定されない任意の検出システムにおいて、検出すことができるように、「レポーター分子」で標識される。本発明を特定の検出法又は標識に限定することは意図しない。
本明細書において「標的」の語は、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるためのプライマーにより結合される核酸領域を意味する。従って、「標的」は他の核酸配列から区別される。「セグメント」は標的配列の中の核酸の領域であると定義される。
本明細書において、「ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)」の語は、クローニング又は精製をせずに、ゲノムDNAの混合物中で、標的配列のセグメントの濃度を高めるための方法を含み、参照により本明細書に援用される米国特許Nos.4,683,202、4,683,195、及び4、965,188の方法を意味する。この標的配列を増幅するための方法は、DNA混合物に過剰量の2つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、所望の標的配列に接触させ、続いてDNAポリメラーゼの存在下で適切な加熱サイクルを行うことを含む。2つのプライマーは2本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。好適な増幅のために、混合物を変性させて、標的配列内のそれらに相補的な配列にアニールする。アニールに続いて、ポリメラーゼを用いてプライマーを伸長させて、新たな相補的な鎖を形成する。変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼ伸長の工程は、高濃度の所望の標的配列の増幅されたセグメントを得るために何回も繰り返すことができる(即ち、変性、アニーリング、及び伸長の工程は1つのサイクルを形成し、多くのサイクルを行うことができる)。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、お互いにに関してプライマーの相対的な位置より決定することができ、それゆえ、この長さは制御可能なパラメーターである。このプロセスは繰り返すことができることから、この方は「ポリメラーゼ連鎖反応」(本明細書において、PCRという。)と呼ばれている。標的配列の所望の増幅セグメントが混合物中では(濃度について言うと)主な配列となることから、これらのことをPCR増幅物と言う。
本明細書おいて、「増幅試薬」の語は、プライマー、核酸、及び増幅用酵素以外に必要な増幅のための試薬を意味する。通常、増幅試薬の他の成分と一緒に反応管(テストチューブ、マイクロウェル等)内に含まれている。
本明細書において、「RT−PCR」の語はRNA配列の複製及び増幅することを意味する。この方において、逆方向転写をPCRに組合せ、熱安定性ポリメラーゼを用いる1つの酵素的な方法を用いる。この方法は米国特許No.5、322、770に記載されており、該特許を参照により本明細書に援用する。RT−PCRにおいて、RNAテンプレートはポリメラーゼの逆転写活性によりcDNAに転換され、その後、(PCR方法に見られるように)ポリメラーゼの重合活性によりそれらを増幅する。
本明細書において、「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」の語は特定のヌクレオチド配列で、またはその付近でそれぞれの2本鎖DNAを切断するバクテリア酵素を意味する。
「制限部位」とは、所与のエンドヌクレアーゼにより認識され切断される核酸配列を意味し、しばしば、この部位はDNAフラグメントに挿入される部位でもある。本発明の特定の態様において、制限部位は選択マーカーにエンジニアされ、DNA構築物の5’末端及び3’末端に導入される。
「相同組み換え」の語は2つのDNA分子又は一対の染色体の間のDNAフラグメントを同一の部位又は近くの部位の核酸配列を交換することを意味する。特定の態様において、染色体取込は相同組み換えである。
本明細書において、「アミノ酸」は、ペプチド又はタンパク質配列、あるいはそれらの一部分を意味する。「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」の語は互換的に使用される。
本明細書において、「所望のタンパク質」及び「所望のポリペプチド」の語は所望の及び/又はアッセイされるタンパク質又はポリペプチドを意味する。幾つかの態様において、所望のタンパク質は細胞内で発現され、他の態様においてはそれは分泌タンパク質である。特に好適な態様において、これらの酵素は本発明のセリンプロテアーゼを含む。幾つかの態様において、所望のタンパク質はシグナルペプチドに融合する分泌されたプロテアーゼである(即ち、分泌されるタンパク質上のアミノ末端伸長)。ほとんど全ての分泌されたタンパク質は、膜を横断するタンパク質前駆体を標的とする、又はこの輸送に重要な役割をしているアミノ末端タンパク質伸長を用いる。この伸長は膜輸送の間又は膜輸送に引き続き、シグナルペプチダーゼにより、タンパク質を分解するように除去される。
ポリヌクレオチドは、天然の状態において又は当業者により既知の方法で操作される場合、それが転写及び/又は翻訳されてRNA、ポリペプチド、又はそれらのフラグメントを生成する場合、RNA又はポリペプチドを「コードする」と言う。そのような核酸のアンチセンスストランドもこの配列をコードする。当業者に知られているように、DNAはRNAポリメラーゼにより転写され、RNAを生成する。しかし、RNAは逆転写酵素により逆転写されて、DNAを生成することもできる。従って、DNAはRNAをコードし、その逆も成立する。
「宿主株」又は「宿主細胞」の語は本発明においては、DNAを含む発現ベクターに好適な宿主を意味する。
酵素は、野生型細胞において発現されるレベルよりも高いレベルで細胞内で発現された場合、「過剰発現」しているという。
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は本明細書において互換的に使用される。本明細書において、アミノ酸を示す3つのコードはIUPAC−IUBJoint Commission on Biochemical Normenclature(JCBN)により規定された3文字コードを使用する。遺伝子コードの退縮により、1つのポリペプチドが1つ以上の核酸配列によりコードされることは理解されている。
「プロシークエンス」はプロテアーゼの分泌に必要な、シグナル配列と成熟プロテアーゼの間のアミノ酸配列である。プロ配列の切断が成熟活性プロテアーゼとなる。
「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」の語はタンパク質の成熟又は前駆型の分泌において、参加する核酸配列及び/又はアミノ酸配列の任意の配列である。シグナル配列の定義は、機能的なものであり、タンパク質の分泌に影響を与えるタンパク質遺伝子のN末端部分によりコードされるアミノ酸配列の全てを含むことを意味する。これらは、しばしば、しかし一般的ではないが、タンパク質のN末タンパク質又は前駆体タンパク質のN末部分に結合する。このシグナル配列は内因性でも、外因性のものでもよい。このシグナル配列はタンパク質(例えば、プロテアーゼ)に関係するものでもよいし、又の分泌例えば、をコードしている遺伝子由来のものでもよい。例示的なシグナル配列の例としては、バチルスレンタス(Bacillus lentus)(ATCC21536)由来スブチリシンのシグナル配列の残りに融合するバチルススブチリス(Bacillus subtilis)由来のシグナル配列の最初の7つのアミノ酸残基を含む。
「ハイブリッドシグナル配列」の語は、発現される遺伝子のシグナル配列に融合する発現宿主から得られる配列の一部分であるシグナル配列を意味する。幾つかの態様において、合成配列が用いられる。
「成熟」の語は、タンパク質又はペプチドの最終的な機能形態を意味する。例えば、本発明のプロテアーゼの成熟形態は配列番号(SEQ IDNO:2)の1乃至189の位置に同一なアミノ酸配列を少なくとも含む。
タンパク質又はペプチドの「前駆体」はタンパク質のアミノ又はカルボニル末端に作動可能に結合しているプロ配列を有するタンパク質の成熟形態を意味する。この前駆体は、プロ配列のアミノ末端に作動可能に結合している「シグナル」配列も有する。この前駆体は翻訳後活性において含まれる付加的なポリヌクレオチド(例えば、タンパク質又はポリペプチドの成熟形態から切り離されたポリペプチド)も有する。
「自然発生酵素」は自然に見られるのと同一な修飾されていないアミノ酸配列を有する酵素を意味する。自然発生酵素は天然酵素、特定の微生物中で自然発生的に発現さる
又は見られる酵素を含む。
「〜由来の」又は「〜より得られた」の語は、問題の有機体の株より生成された又は生成可能なプロテアーゼだけでなく、そのような株から単離されたDNA配列、及びそのようなDNA配列を含む宿主有機体により生成されたプロテアーゼも含む。更に、この語は合成DNA及び/又はcDNAのよりコードされるプロテアーゼを含み、このプロテアーゼは問題のプロテアーゼの同定された性質を有する。例えば、「セルロモナス(Cellulomonas)由来のプロテアーゼはセルロモナス(Cellulomonas)により自然発生的に生成されたタンパク質分解活性を有する酵素のほかに、セルロモナス(Cellulomonas)源により同様に生成されたセリンプロテアーゼ、前記セリンプロテアーゼをコードする核酸配列を有する形質転換された非セルロモナス(Cellulomonas)有機体により生成された遺伝子的エンジニア技術の使用は含まない。
この定義の範囲内において、「誘導体」の語は、誘導体が野生型、天然、又親同様の目的のために有用な誘導体であるという意味において、野生型、天然、又は親において見られるタンパク質分解活性の性質を有している。セリンプロテアーゼの機能的な誘導体は自然発生、合成、又は組み換え的に生成されたポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含み、それらは、本発明のセリンプロテアーゼの一般的な性質を有する。
「機能的な誘導体」の語はセリンプロテアーゼをコードする核酸の機能的な性質を有する核酸の誘導体を意味する。本発明のセリンプロテアーゼをコードする核酸配列の機能的な誘導体は天然発生、合成、又は組み換え的に生成された核酸又はフラグメントを含み、本発明のセリンプロテアーゼ性質をコードする。本発明のセリンプロテアーゼをコードする野生型核酸は自然発生対立遺伝子及び当分野で知られている遺伝子コードの退縮に基づく相同体を含む。
2つの核酸配列又はポリヌクレオチド配列に対して用いる「同一」の語は、以下の1つの配列比較又は配列解析アルゴリズムを用いて測定したときに、最大対応配列したときに2つの配列における残基が同じであることを意味する。
「最適アラインメント」の語は、最も高い同一性のパーセンテージスコアを有するアラインメントを意味する。
2つのアミノ酸、ポリヌクレオチド、及び/又は遺伝子配列に対して用いる「配列相同性」、「アミノ酸配列相同性パーセント」、「遺伝子配列相同性のパーセント」及び/又は「核酸/ポリヌクレオチド配列の相同性のパーセント」の語は配列を最適にアラインメントしたときに2つの配列において同一な残基のパーセンテージを意味する。従って、80%のアミノ酸配列相同性は最適にアラインメントされたポリヌクレオチド配列において80%のアミノ酸が同一であることを意味する。
2つの核酸又はポリヌクレオチドに対して用いる「実質的に同一」であるとは、標準的なパラメーターを用いてプログラム又はアルゴリズム(例えば、BLAST、ALIGN、CLUSTAL)対象の配列と比較したときに、少なくとも70%の配列相同性、好ましくは少なくとも75%の配列相同性、好ましくは少なくとも805の配列相同性、好ましくは少なくとも85%の配列相同性、好ましくは少なくとも90%の配列相同性、好ましくは少なくとも95%の配列相同性、好ましくは少なくとも97%の配列相同性、好ましくは少なくとも98%の配列相同性、及び好ましくは少なくとも99%の配列相同性を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。2つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるという同定は第一ポリヌクレオチドが免疫学的に第二ポリペプチドに交差反応性があることでわかる。通常、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドが免疫学的に交差反応性がある。従って、2つのポリペプチドが保存置換によってのみ違う場合は、ポリペプチドは第二ポリペプチドに対して実質的に同一であると言う。2つの核酸配列が実質的に同一である他の同定は、2つの分子が過酷な条件においてハイブリダイズすることで同定できる(例えば、中程度から高度に過酷な条件)。
「等しい」の語は、中程度から高度に過酷な条件下で、配列番号1(SEQ ID NO:1)に示すような配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチドによりコードされるセリンプロテアーゼ酵素を意味する。例えば、等しい成熟セリンプロテアーゼは配列番号2(SEQ ID NO:2)で定義されるアミノ酸配列を有するセルロモナス(Cellulomonas)セリンプロテアーゼに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも01%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも975、少なくとも98%、及び/又は少なくとも99%の配列相同性を有する。
「単離された」又は「精製された」の語は本来の環境(例えば、それが自然派生的なものであるならば自然環境)から切り離されている物質に対して用いる。例えば、この物質は、自然発生又は野生型有機体と比較したときに低い又は高い濃度で存在するか、又は自然発生又は野生型有機体から発現する上では通常存在しない成分と組み合わされ存在する場合、「精製」されていると言う。例えば、生きている動物中にある自然派生ポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていない。しかし自然システムにおいて共存している物質の幾つか又は全てを分離した、同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていると言う。幾つかの態様において、そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、及び/又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物一部であり、更にそのようなベクター又は組成物において、単離されたものは自然環境の一部ではない。好適な態様において、核酸又はタンパク質は、電気泳動又はブロットにおいて1つのバンドか検出された場合には、精製されていると言う。
「単離された」の語は、DNA配列に対して用いる場合、本来の遺伝的環境から単離されているDNA配列を意味し、従って、これは他の外来又は不要なコード配列を有しておらず、遺伝的なエンジニアリングによりタンパク質を生成することに用いるのに有用である。そのような単離された分子はそれらの本来の環境から分離されており、cDNA及び/又はゲノムクローンを含む。本発明の単離されたDNA分子は通常関連している他の遺伝子を含まないが、プロモーター及びターミネーターとしての自然発生5’末端及び3’を含む。関係のある領域の同定は、当業者に良く知られており(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985])参照のこと)。「単離されたDNA配列」の語は、代替的に「クローンされたDNA配列」と言うこともある。
「単離された」の語は、タンパク質について用いる場合、その本来の環境以外の環境で見られるタンパク質を意味する。好適な態様において、単離されたタンパク質は実質的に他のタンパク質、特に他の相同タンパク質を含まない。単離されたタンパク質は、DSD−PAGEにより、10%より、好ましくは20%より、更に好ましくは30%より高く精製されている。本発明の更なる側面は、SDS−PAGEにより、より高度に(即ち、40%より高く、60%より高く、80%より高く、90%より高く、95%より高く、97%より高く、及び99%より高く)精製されたタンパク質を含む。
本明細書において、「組合せ変異誘発」の語は初期配列の変異体のライブラリーを生成する方法を意味する。これらのライブラリーにおいて、変異体は変異体のあらかじめ決められたセットから選択される1つ又は幾つかの変異を含む。更に、この方法は変異体のあらかじめ決められたメンバーではないランダム変異体を導入する手段を提供する。幾つかの態様において、この方法は2000年10月26日にファイルされた米国特許出願番号09/699.250に記載の方法を含む。この文献を参照により本明細書に援用する。代替的な態様において、組合せ変異誘発法は市販のキットを含む(例えば、QuikChange(商標)Multisite,Stratagene,San Diego,CA)。
本明細書において、「変異体のライブラリー」の語は、それらのゲノムの大部分が同一であるが、1つ異常の遺伝子の別の相同体を含む細胞の集団を意味する。そのようなライブラリーは、例えば、改善された性質を有する遺伝子又はオペロンを同定するのに用いることができる。
本明細書において、「開始遺伝子」は本発明に用いる改善された又は変更された所望のタンパク質をコードする所望の遺伝子を意味する。
本明細書において、「複数配列アラインメント(MSA)」はアルゴリズム(例えば、Clustal W)を用いて配列させる開始遺伝子の複数の相同体の配列を意味する。
本明細書において「コンセンサス配列」及び「カノニカル配列」の語は比較される特定のタンパク質又は所望の配列の全ての変異体に対しての原型であるアミノ酸配列を意味する。この語は所望のDNA配列中に最も多く存在する核酸配列も意味する。遺伝子の各位置に対して、コンセンサス配列はMSAにおける位置において最も豊富なアミノ酸を与える。
本明細書において、「コンセンサス変異」の語は開始遺伝子の配列とコンセンサス配列における違いを意味する。コンセンサス変異は開始遺伝子の配列とMSAにより得られたコンセンサス配列を比較することにより同定される。幾つかの態様において、コンセンサス変異はコンセンサス配列により類似するように開始遺伝子に導入される。コンセンサス 変異は、開始遺伝子におけるアミノ酸を、開始剤遺伝子におけるアミノ酸の頻度に関係する位置において、MSAに見られるよりもより高い品詞であるアミノ酸に変更するアミノ酸変異を含む。従って、コンセンサス変異は、MSAにおいけるアミノ酸よりも豊富に存在するアミノ酸で開始遺伝子のアミノ酸を置き換える、単一のアミノ酸変異を含む。
本明細書において、「イニシャルヒット(initial hit)の語は組合せコンセンサス変異誘発ライブラリーをスクリーニングすることにより同定された変異体を意味する。好適な態様において、イニシャルヒットは開始遺伝子と比較して、改善された性能を有する。
本明細書において「改善されたヒット(improved hit)」は、高められた組合せコンセンサス変異体ライブラリーをスクリーニングすることで同定された変異体を意味する。
本明細書において「改善された変異体」及び「性能が高められた変異体」の語は開始遺伝子に導入したときに、改善された性能を示す変異体を意味する。幾つかの好適な態様において、これらの変異体は本発明のスクリーニング工程の間に同定されたシークエンシングヒット(sequencing hit)により同定された。大部分の態様において、ヒット中により頻繁に見られる変異体はスクリーニングされていない組合せコンセンサス変異誘発ライブラリーと比較したときに、改善された変異体である。
本明細書において、「高められた組合せコンセンサス変異誘発ライブラリー」の語は、CCM変異誘発及びスクリーニングの初期のラウンドから得られたスクリーニング及び/又は配列決定に基づいて設計され、構築されたCCMライブラリーを意味する。幾つかの態様において、高められたCCMライブラリーはCCMの初期のラウンドから得られたイニシャルヒットの配列に基づいている。更なる態様において、高められたCCMは変異誘発及び配列の初期ラウンドから得られたイニシャルヒットにおいて頻繁に見られる変異を好ましくするように設計される。いくつかの好適な態様において、初期のCCMライブラリーにおいて用いた他のプライマーに対して性能が劣る変異体をコードするプライマーを省略する又は性能が高い変異体をコードするプライマーの濃度を高めることにより、達成することができる。
本明細書において「性能が劣る変異体」の語は、スクリーンされていない組合せコンセンサス変異体ライブラリーと比較してスクリーニングから得られたヒットにおいてより頻繁に見られない組み換えコンセンサス変異体ライブラリーにおける変異体を意味する。好適な態様において、スクリーニングプロセスは「性能が劣る変異」を含む変異体の多く除去及び/又は減らす。
本明細書において、「機能アッセイ」の語は、タンパク質活性の同定を提供するアッセイを意味する。特定の好適な態様において、この語は、タンパク質が、有用な性能において機能する能力について解析するためのアッセイシステムを意味する。例えば、酵素の場合、機能アッセイは反応を触媒する酵素の有効性を決定することを含む。
本明細書において、「標的性質」の語は、開始遺伝子の変更する性質を意味する。本発明を特定の標的性質に限定することは意図しない。しかしながら、幾つかの好適な態様において、この標的性質は遺伝子生成物の安定性である(例えば、変性、タンパク質分解性、又の分解因子に対する安定性)。他の態様において、生産宿主における生産レベルが変更される。即ち、開始遺伝子の任意の性質を本発明に用いることができる。
本明細書において用いる「性質」又は核酸に対して用いる同義語は分泌又は検出することができる拡散の任意の性質又は属性を意味する。これらの性質は、ポリペプチドへの結合に影響する性質、特定の核酸を含む細胞に与えられた性質、遺伝子転写に影響する性質(例えば、プロモーター強度、プロモーター認識、プロモーター調節、エンハンサー機能)、RNAプロセシングに影響する性質(例えば、RNAスプライシング、RNA安定性、RNAコンフォメーション、及び/又は転写後調節)、翻訳に影響する性質(例えば、レベル、調節、mRNAのリボゾームタンパク質への結合、翻訳後調節)を含むがこれらに限定されない。例えば、核酸の転写因子についての結合部位、ポリメラーゼ、調節因子等は所望の性質を生成するために又は好ましくない性質を同定するために、変更される。
本明細書において用いる「性質」又は(タンパク質を含む)ポリペプチドに対して用いるこれと同義語は分泌又は検出されるポリペプチドの任意の性質又は属性を意味する。この性質は、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、アルカリ安定性、pH活性プロファイル、タンパク質分解に対する安定性、KM、Kcat、Kcat/KM比、タンパク質折りたたみ、免疫誘発性、リガンドへの結合する性質、レセプターへの結合性能、分泌性能、細胞表面への提示能力、オリゴマー化性能、シグナル性能、細胞増幅の刺激性能、細胞増殖の抑制性能、アポトーシス誘発性能、リン酸化又はグリコシル化により修飾される能力、及び/又は病気を治癒する能力等を含むがこれらに限定されない。
本明細書において、「スクリーニング」の語は、通常用いられる意味において、複数の工程プロセスを意味する。第一ステップにおいて、変異体核酸又は変異体ポリペプチドが提供される。第二の工程において、変異体核酸又は変異体ポリペプチドの性質が決定される。第三の工程において、決定された性質が対応する核酸の性質、対応する自然発生ポリペプチドの性質、又は変異体核酸の生成のための開始剤物質(例えば、開始配列)と比較される。
変更された性質を有する核酸又はタンパク質を得るためにのスクリーニング手順は開始物質及び促進を意図する変異体拡散の生成の修飾に依存する。従って、当業者は本発明はスクリーンされる特定の態様に限定することは意図されず、以下の例は例示のみであることを理解するだろう。任意の特定の性質のためのスクリーニングの方法は当分野で知られている。例えば、結合、pH、特異性等を変異の前と後で測定することができる。これらの変化が変異を示している。好ましくは、スクリーニングは、チップ、ファージディスプレイ、及び複数基質及び/又はインジケーターを含むがこれらに限定されない、複数のサンプルを同時にスクリーニングすることを含む、高い処理能力の方法で行われる。
本明細書において、幾つかの態様において、スクリーニングは変異体の集団から所望の変異体を豊富に含むようにするための選択工程を含む。これらの態様の例は、宿主微生物の生育に有利な変異低の選択の他、ファージディスプレイ、又は変異体をそれらの結合能又は触媒性質に基づき変異体の集団から捕捉することができる他のディスプレイ法を含む。好適な態様において、変異体のライブラリーはストレスに曝され(熱、プロテアーゼ、変性)引き続き、已然としてインタクトである変異体をスクリーニングにおいて同定し、又は選択により高濃度化する。この語は選択のための任意の好適な手段を含むことを意図する。即ち、本発明を特定のスクリーニング方法に限定することは意図しない。
本明細書において、「標的ランダム化」の語は1つ又は幾つかの位置がランダム化されている複数の配列を生成する工程を意味する。幾つかの態様において、ランダム化は完全に位置をランダム化する(即ち、4つのヌクレオチドのA、T、G、及びCがランダムな位置にある)。代替的な態様において、ヌクレオチドのランダム化は4つのヌクレオチドのサブセットに限定される。標的ランダム化は所望の1つ又は幾つかの位置をコードする1つ又は幾つかの配列のコドンに適用することができる。発現したときに、得られたライブラリーが1つ以上のアミノ酸部位が、ランダム化コドンのランダム化スキームによち決定されるように、20全てのアミノ酸又はアミノ酸のサブセットの混合物を含むことができるように、タンパク質集団を生成する。幾つかの態様において、標的ランダム化から得られた集団の個々のメンバーは、標的にされた又はランダム化挿入又は欠失されたコドンに依存してアミノ酸のメンバーが異なる。更なる態様において、合成アミノ酸は生成されたタンパク質の集団の中に含まれる。幾つかの好適な態様において、標的ランダム化の結果得られた集団の主なメンバーは初期の遺伝子よりもコンセンサス配列に対して配列相同性が高い。幾つかの態様において、この配列は1つ以上の所望のタンパク質をコードする。代替的な態様において、タンパク質は異なる生物学的機能を有する。幾つかの好適な態様において、インカミング配列は少なくとも1つの選択可能なマーカーを含む。この配列は所望の1つ以上のタンパク質をコードすることができる。それはほかの生物学的機能を有する。多くの場合。インカミング配列は、抗生物質耐性を付与する遺伝子等の選択マーカーを含む。
「修飾配列」及び「修飾遺伝子」の語は本明細書において互換的に使用され、欠失、挿入、又は自然発生核酸配列を阻害を含む配列を意味する。幾つかの好適な態様において、修飾配列の発現生成物は切断されたタンパク質である(例えば、修飾が配列の切断又は阻害である場合)。幾つかの特に好適な態様において、切断されたタンパク質は生物活性を有する。代替的な態様において、修飾配列の発現生成物は伸長されたタンパク質である(例えば、修飾が核酸配列内へ挿入を含む場合)。幾つかの態様において、挿入は切断タンパク質を生成する(例えば、挿入が停止コドンの情報となる場合)。従って、挿入は発現性生物としては、切断タンパク質又は伸長タンパク質のいずれかになる。
本明細書において、「変異体配列」及び「変異体遺伝子」の語は互換的に使用され、宿主細胞の野生型配列において生じる少なくとも1つのコドンの変更を有する配列を意味する。変異配列の発現性生物は野生型に対して変更されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。発現性生物は変更された機能的な能力を有する(例えば、高められた酵素活性)。
「変異プライマー」又は「変異オリゴヌクレオチド」の語は(本明細書において互換的に使用され)、テンプレート配列の一部分に対応し、それらにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド組成物を意味する。変異体プライマーに関して、このプライマーは正確にテンプレート核酸に一致しない。プライマー中に1つ以上のミスマッチを核酸ライブラリーに所望の変異を導入するために用いる。本明細書において「非変異プライマー」又は「非変異オリゴヌクレオチド」の語は、核酸テンプレートに正確に一致するオリゴヌクレオチド組成物を意味する。本発明の幾つかの態様において、変異プライマーのみを用いる。本発明の他の好適な態様において、プライマーは変異プライマーにおける少なくとも1つの領域について、オリグヌクレオチド混合物中に非変異プライマーが含まれるように設計される。少なくとも1つの変異プライマーに対応する変異プライマー及び非変異プライマーの混合物を添加することにより、各種組合せ変異パターンが存在する核酸ライブラリーを生成することができる。例えば、変異体核酸ライブラリーのいくつかのメンバーが特定の部位においてそれらの前駆体配列を有し、他のメンバーそのような部位で変異していることが望まれる場合、非変異プライマーは所与の残査に対しての核酸ライブラリー内の非変異メンバーの特定のレベルを得ることができる能力を提供する。本発明の方法は、通常10乃至50ベースの間の長さ、好ましくは約15乃至45ベースの間の長さの変異体及び非変異オリゴヌクレオチドを用いる。しかしながら、所望の変異誘発を行うためには10ベースより短い又は50ベースより長いプライマーを用いることが必要である。変異及び非変異プライマーに関して、対応するオリゴヌクレオチドの長さに同一である必要はないが、加えられる変異に対応する領域において、重複のみが見られる。プライマーは本発明により予め決められた比で添加される。例えば、得られたライブラリーが有意なレベルの特定の変異を有し、同じ又は別の部位において、より少ない量の別の変異を有することが望ましい場合、添加するプライマーの量を調節することで、所望の偏ったライブラリーを生成することができる。あるいは、より少ない又はより多い量の非変異プライマーの添加により。変異核酸ライブラリーにおいて生成される対応する変異体を調節することができる。
本明細書において、「隣接している変異」の語は、同じオリゴヌクレオチドプライマー内に存在する変異を意味する。例えば、隣接している変異は隣にあるか又はお互いに近い場所にある。しかしながら、これらは同じプライマーにより得られた変異体テンプレート核酸に導入される。
本明細書において、「隣接していない変異」の語は別のオリゴヌクレオチドプライマーに存在する変異を意味する。例えば、隣接してない変異は別々に調節されたオリゴヌクレオチドプライマーにより得られたテンプレート核酸に導入される。
本明細書において、「野生型配列」又は「野生型遺伝子」の語は、互換的に用いられ、宿主細胞内に自然発生的に本来存在する配列を意味する。幾つかの態様において、この野生型配列はタンパク質エンジニアリングプロジェクトの開始点である所望の配列である。この野生型配列は相同の又は異種のタンパク質のいずれかをコードする。相同タンパク質は本発明を用いずに宿主細胞が生成するものである。異種タンパク質は本発明に寄らなければ宿主細胞が生成することができないものである。
本明細書において、「抗体」の語はイムノグロブリンを意味する。抗体は、抗体を生成するために好ましい特定の種から直接得られたイムノグロブリンを含むがこれらに限定されない。更に、本明細書は修飾された抗体も含む。この語は、インタクト抗体が結合するエピトープに結合する能力を有する抗体フラグメントを意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ(抗ID)抗体を含む。抗体フラグメントは相補決定領域(CDR)、1本鎖フラグメント可変領域(scFv)、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)を含む。ポリクローナル及びモノクローナル抗体も本発明に含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
「酸化安定性」の語は、例えば、漂白剤又は酸化剤に曝され又は接触させる間のような、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間に、所与の時間、特定の酵素活性の量を維持する本発明のプロテアーゼを意味する。幾つかの態様において、このプロテアーゼは少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%のタンパク質活性分解活性を、例えば、少なくとも1分、3分、5分、8分、12分、16分、20分等の特定の間漂白剤又は酸化剤に接触させた後に有している。幾つかの態様において、この安定性は実施例において測定される。
「キレート安定性」の語は例えば、キレート剤に曝され又は接触させる間のような、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間に、所与の時間、特定の酵素活性の量を維持する本発明のプロテアーゼを意味する。幾つかの態様において、このプロテアーゼは少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%のタンパク質活性分解活性を、例えば、少なくとも10分、20分、40分、60分、100分等の特定のキレート剤に接触させた後に有している。幾つかの態様において、キレート剤安定性は実施例において測定される。
「熱安定性」の語は、例えば、温度を変更させた場合に、タンパク質分解、加水分解、洗浄又は本発明の他の工程の間に、所与の時間、特定の酵素活性の量を維持する本発明のプロテアーゼを意味する。変更させた温度は温度の上昇及び下降を含む。いくつかの態様において、このプロテアーゼは、変更させた温度に特定の時間、例えば、少なくとも60分、120分、180分、240分、300分等曝されたあとに、少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%のタンパク質活性分解活性を有している。幾つかの態様において、この熱安定性は実施例において測定される。
酸化安定性、キレート安定性、熱安定性、及び/又はpH安定性について用いる「高められた安定性」の語は他のセリンプロテアーゼ(例えば、スブチリシンプロテアーゼ)及び/又は野生型酵素と比較した時に、所定の時間、より高い活性を維持するタンパク質を意味する。
酸化安定性、キレート安定性、熱安定性、及び/又はpH安定性について用いる「減少した安定性」の語は、他のセリンプロテアーゼ(例えば、スブチリシンプロテアーゼ)及び/又は野生型酵素と比較した時に、所定の時間、より低い活性を維持するタンパク質を意味する。
「洗浄活性」の語は、本発明のタンパク質分解、洗浄、又は他のプロセスの間の条件下でプロテアーゼにより達成される洗浄性能を意味する。幾つかの態様において、洗浄性能は、例えば、ガラス、血液、ミルク、又はタマゴのタンパク質等の酵素感受性のある汚れを評価する各種洗浄アッセイを用い、これらの汚れを標準的な洗浄条件に曝した後に、各種クロマトグラフ、分光高度計、又は他の等しい方法を用いて評価される。例示的なアッセイは実施例で行う方法のほかに、WO99/34011、及び米国特許No.6,605,458(これらの文献を参照により本明細書に援用する)に記載されているがこれらに限定されない。
プロテアーゼの「洗浄に有効な量」の語は特定の洗浄組成物において望ましい酵素活性のレベルを達成するプロテアーゼの量を意味する。そのような有効量は当業者に容易に理解され、用いるプロテアーゼ、洗浄製品、洗浄組成物の特定の組成、及び液体又は乾燥組成物(例えば、粉末、バー)が必要とされているかどうかなどの多くの要因に基づく。
本明細書で用いる「洗浄添加物」の語は、組成物に用いられるプロテアーゼ酵素に特に相性のよい物質である、所望の洗浄組成物の特定のタイプ及び製品の形状(例えば、液体、下流、粉末、バー、スプレー、タブレット、ゲル、又は発泡組成物)のために選択された、任意の液体、固形又は気体物質を意味する。幾つかの態様において、顆粒組成物は、「コンパクト」形態であり、他の態様において、液体組成物は「濃縮」形態である。
洗浄活性に関して用いる「高められた性能」の語は、標準的な洗浄サイクル及び/又は複数の洗浄サイクルの後に評価された場合、タマゴ、ミルク、草、又は血液等の特定の酵素に感受性のある汚れの線上活性がより高い又は大きいことを意味する。
洗浄活性に関して用いる「減少した性能」の語は、標準的な洗浄サイクルの後に評価した場合、タマゴ、ミルク、草、又は血液等の特定の酵素に感受性のある汚れの洗浄活性が減少又はより少なくなっていることを意味する。
洗浄活性に関して用いる「比較可能な性能」の語は、OPTIMASE(商標)protease (Genencor),PURAFECT(商標)protease products(Genencor),SAVINASE(商標) protease(Novozymes), BPN'-variants(U.S.Pat. No. Re 34,606),RELASE(商標),DURAZYME(商標), EVERLASE(商標), KANNASE(商標) protease(Novozymes),
MAXACAL(商標),MAXAPEM(商標), PROPERASE(商標) proteases(Genencor; U.S. Pat. No. Re 34,606,and U.S. Pat. Nos.5,700,676;5,955,340;6,312,936;and6,482,628),and B. lentus variant protease products を含むがこれらに限定されない比較可能なスブチリシンプロテアーゼ(例えば、市販のプロテアーゼ)の洗浄活性の少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%の洗浄活性を意味する。例示的なスブチリシンプロテアーゼ変異体は、BPNの76、101、103、104、120、159、167、170、194、195、217、235、236、245、248、及び/又は252の位置に等しい残基の置換又は欠失を含むがこれらに限定されない。洗浄性能は、標準的な洗浄サイクル条件の後に分光光度計、又は他の解析技術により決定され、草、血液、又はミルク等の酵素に感受性のある汚れを考慮した各種洗浄アッセイにおいてこれらのスブチリシンと本発明のプロテアーゼを比較することにより決定される。
本明細書において「布製品洗浄用組成物」の語は洗濯用添加剤組成物及び汚れた布製品(例えば、衣類、繊維、及び他の布製品)を浸す及び/又は前処理するのに用いるのに好適な組成物を含む、手洗い又は機械洗いのための洗濯用組成物を意味する。
本明細書において、「非布製品洗浄用組成物」の語は、布製品以外の表面を洗浄する組成物を意味し、食器洗浄用組成物、口腔洗浄用組成物、歯磨き用組成物、及びパーソナルケア組成物を含むがこれらに限定されない。
本明細書における洗浄組成物の「コンパクト」形態は、密度についていうとコンパクトであり、組成物の観点からは、無機充填塩の量に最も良く反映されている。無機充填塩は粉末形態の洗浄用組成物の従来の成分である。従来の洗浄組成物において、充填塩は組成物全体に対して、通常17乃至35%の量で存在する。対照的に、コンパクト組成物において、充填塩は15%を超えない量で存在する。幾つかの態様において、この充填塩は10%を超えない量で存在し、又はより好ましくは組成物の重量により5%である。幾つかの態様において、無機充填塩は硫酸又は塩素のアルカリ及びアルカリ土類金属塩である。好適な充填剤点在は硫酸ナトリウムである。
本発明は以下の実施例においてより詳細に説明される。これらの実施例は特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。添付の図は明細書及び発明の説明の一部分をなす。本明細書において参照された全ての文献は、参照により本明細書に援用される。以下の実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
以下の実施例において、以下に示す略語を用いる。PI (プロテイナーゼインヒビター)、ppm(100万分の1);M(モルの);mM(ミリモルの);μM(マイクロモルの);nM(ナノモルの);mol(モル);mmol(ミリモル);μmol(マイクロモル);nmol(ナノモル);gm(グラム);mg(ミリグラム);μg(マイクログラム);pg(ピコグラム);L(リットル);ml及びmL(ミリリットル);μl及びμL(マイクロリットル);cm(セントメートル);mm(ミリメートル);μm(マイクロメートル);nm(ナノメートル);U(単位);V(ボルト);MW(分子量);sec(秒);min(s)(分); h(s)及びhr(s)(時間);℃(摂氏温度);QS(十分量);ND(行わず);NA(適用せず);rpm(1分間当たりの回転数);HO(水);dHO(脱イオン水);HCl(塩酸);aa(アミノ酸);bp(ベースペア);kb(キロベースペア);kD(キロダルトン);cDNA(コピー又は相補DNA);DNA(デオキシリボヌクレオチド);ssDNA(1本鎖DNA);dsDNA(2本鎖DNA);dNTP(デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩);RNA(リボ核酸);NgCl(塩化マグネシウム);NaCl(塩化ナトリウム);w/v(容量対重量);v/v(重量対重量);g(重力);OD(光学密度);ダルベッコのリン酸緩衝液(Dulbecco‘s phosphate buffered solution)(DPBS);SOC(2% バクトトリプトン(Bacto−Tryptone),0.5%バクトイースト抽出物(Bacto Yeast Extract)、10mM NaCl、2.5mM KCl);テリフィックブロス(Terrific Broth)(TB;12g/l バクトトリプトン(Bacto Tryptone)、24g/lグリセロール、2.31g/1KHPO、及び12.54g/l KHPO); OD280(280nmにおける光学密度); OD60O(600nmにおける光学密度); A405(405nmにおける吸光度); Vmax(酵素触媒反応の最大初期速度); PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動); PBS(リン酸緩衝生理食塩水[150mM NaCl、10mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2]); PBST(PBS+0.25% TWEEN(商標)20); PEG(ポリエチレングリコール); PCR(ポリメラーゼ連鎖反応); RT−PCR(逆転写PCR); SDS(ドデシルナトリウム硫酸塩);Tris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン); HEPES(N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N−[2−エタンスルホニック酸]; HBS(HEPES緩衝生理食塩水);Tris−HCl(トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン-ヒドロクロライド);トリシン(Tricine)(N−[トリス−(ヒドロキシメチル)-メチル]-グリシン);CHES(2−(N−シクロ−ヘキシルアミノ)エタン−スルホン酸);TAPS(3−{[トリス−(ヒドロキシメチル)−メチル]−アミノ}−プロパンスルホン酸);CAPS(3−(シクロ−ヘキシルアミノ)−プロパン-スルホン酸;DMSO(ジメチルスルホキサイド); DTT(1,4−ジチオ−DL−スレイトール);SA(シナピニック酸)(s,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシけい皮酸);TCA(トリクロロ酢酸);Glut及びGSH(還元グルタチオン);GSSG(酸化グルタチオン); TCEP(トリス[2−カルボキシメチル]フォスフィン);Ci(キュリー);mCi(ミリキュリー);μCi(マイクロキュリー);HPLC(高圧液体クロマトグラフィー);
RP−HPLC(逆相高圧液体クロマトグラフィー);TLC(薄層クロマトグラフィー);MALDI−TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間分析);Ts(トシル);Bn(ベンジル);Ph(フェニル);Ms(メシル);Et(エチル)、Me(メチル);Taq(サーマスアクチス(Thermits aquaticus)DNAポリメラーゼ);クレノウ(Klenow)(DNAポリメラーゼIラージ(クレノウ)フラグメント);EGTA(エチレングリコール−ビス(β−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N‘−四酢酸);EDTA(エチレンジアミン四酢酸);ブラ(bla) (βガラクトシダーゼ又はアンピシリン耐性遺伝子);HDL(高密度流体);MJリサーチ(MJ Research)(MJリサーチ、レノ、ネバダ);ベースクリア(Baseclear)(ベースクリア・ビーブイ・インク、レイデン、オランダ);パーセプティブ(PerSeptive)(パーセプティブバイオシステムズ、フレーミングハム、マサチューセッツ);サーモフィニガン(ThermoFinnigan)(サーモフィニガン,サンジョーズ,カリフォルニア);アルゴ(Argo)(アルゴバイオアナリティカ,モリスプレインズ,ニュジャージ);セイツEKS(Seitz EKS)(セイツシケン(SeitzSchenk)フィルターシステムズ GmbH, バートクロイツナハ, ドイツ);パル(Pall)(パルグループ(Pall Corp), イーストヒルズ, ニュヨーク);スペクトラム(Spectrum)(スペクトラムラボラトリーズ、ドミングランコ(Dominguez Rancho)、カリフォルニニア);モレキュラートラクチャー(Molecular Structure)(モレキュラーストラクチャーグループ、ウッドランド、テキサス);アセライズ(Accelrys)(アセライズインク、サンディエゴ、カリフォルニア);ケミカルコンピューティング(Chemical Computing)(ケミカルコンピューティンググループ、モントリオール、カナダ);ニューブランクウィシュ(New Brunswick) (ニューブランクウィシュ社、エジソン、ニュージャージ);CFT(建材試験センター(Center for Test Materials),フラールディンゲン,オランダ);プロクターアンドギャンブル(Procter & Gamble)(プロクターアンドギャンブル社、シンシナティー、オハイオ);GEヘルスケア(GE
Healthcare)(GEヘルスケア,チャルフォントストリート、チャイルズ,イギリス);DNA2.0(DNA2.0,メロンパーク,カリフォルニア);OXOID(オキソイド(Oxoid)、ベージングストーク,ハンプシャー,イギリス);メガザイム(Megazyme)(メガザイム・インターナショナル・アイルランド社、ベイビジネスパーク、ウィックロー、アイルランド);フィンザイムズ(Finnzymes)(フィンザイムズ・オイ、エスポー、フィンランド);ケルコ(Kelco)(CPケルコ、ウイルミントン、デラウェア);コーニング(Corning)(コーニングライフサイエンス、コーニング、ニューヨーク);(NEN(NENライフサイエンスプロダクツ、ボストン、マサチューセッツ);ファルマAS(Pharma AS)(ファルマAS,オスロ、ノルウェイ);ダイナル(Dynal)(ダイナル,オスロ,ノルウェイ);バイオシンセシス(Bio−Synthesis)(バイオシンセシス、ルイスビル、テキサス);ATCC(アメリカン・タイプ・カルチャー・kレクション、ロックビル、メリーランド);ギブコ/BRL(Gibco/BRL)(ギブコ/BRL、グランドアイランド、ニュヨーク);シグマ(Sigma)(シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ);ファルマシア(Pharmacia)(ファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニュジャージ);NCBI(全米バイオテクノロジー情報センター);アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)(アプライドバイオシステムズ,フォスターシティー,カリフルニア);BDバイオサイエンス及びクロンテック(BD Biosciences 及び/又はClontech)(BDバイオラボサイエンス クロンテックラボラトリーズ、パルアルト、カリフォルニア);オペロンテクノロギーズ(Operon Technologies)(オペロンテクノロジーズ社、アラメダ、カリフォルニア;MWGバイオテック(MWG Biotech)(MWGバイオテック、ハイポイント、ノースカロライナ);オリゴズEtc(Oligos Etc)(オリゴズEtc社、ウィルソンビル,オレゴン);バケム(Bachem)(バケムバイオサイエンス社、キングオブプルシア、ペンシルバニア);ディフコ(Difco)(ディフコラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン州);メディアテック(Mediatech) (メディアテック、ハーンドン、バージニア);サンタクルーズ(Santa Cruz)(サンタクルーズバイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア);オキソイド(Oxoid)(オキソイド社、オグデンスバーグ、ニューヨーク);ワージントン(Worthington)(ワージントンバイオケミカルグループ、フリーホルド、ニュジャージ);ギブコBRL(ライフテクノロジー社、ゲイサーズバーグ、メリーランド);ミリポア(Millipore)(ミリポア、ビルリカ、マサチューセッツ);バイオラド(Bio−Rad)(バイオラド、ハーロキューズ、カリフォルニア);インビトロジェン(Invitrogen)(インビトロジェングループ、サンディエゴ、カリフォルニア);NEB(ニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)、ベバリー、マサチューセッツ);シグマ(Sigma)(シグマケミカル社、セントルイス、ミズリー);ピアス(Pierce)(ピアスバイオテクノロジー、ロックフォード、イリノイ);タカラ(Takara)(タカラ・バイオ・インク、大津、日本);ロシュ(Roche)(ホフマン・ロシュ,バーゼル,スイス);EMサイエンス(EM Science)(EMサイエンス、ギボスタウン、ニュジャージー);キアゲン(Qiagen)(キアゲン社、ベレニカ,カリフォルニア);バイオデザイン(Biodesign)(バイオデザイン社、ソーコ、メイン);アプタゲン(Aptagen)(アプタゲン社、ヘンドン、バージニア);ソーバル(Sorvall)(ケンドロラブラトリーによるソーバルブランド製品、アッシュビル、ノーソカロライナ);モレキュラーデバイス(Molecular Devices)(モレキュラーデバイスグループ、サニーベル、カリフォルニア);R&Dシステムズ(R&D Systems)(R&Dシステムズ、ミメアポリス, ミネソタ);ストラタジェン(Stratagene)(ストラタジェンクロニングシステム,ラホーヤ,カリフォルニア);マーシュ(Marsh)(マーシュバイオサイエンス、ロチェスター、ニューヨーク);ジーンアート(Geneart)(ジーンアートGmbH、レーゲンスブルク,ドイツ);ババイオテック(Bio−Tek)(バイオテックインスツルメンツ、ウィヌースキー、バーモント);ビアコア(Biacore)(ビアコア社,ピスカタウェイ、ニュージャージ);ペプロテック(PeproTech)(ペプロテック,ロッキーヒル,ニュージャージ);シンペップ(SynPep)(シンペップ,ダブリン,アイルランド);ニューオブジェクティブ(New Objective)(ニューオブジェクティブブランド;サイエンティフィックインスツルメンツサービス社、リンゴーズ,ニュージャージ);ウォーターズ(Waters)(ウォーターズ社、ミルフォールド、マサチューセッツ);マトリックスサイエンス(Matrix Science)(マトリックスサイエンス、ボストン、マサチューセッツ);ディオネックス(Dionex)(ディオネックスグループ、サニーベル、カリフォルニア);モンサント(Monsanto)(モンサント社、セントルイス
、ミズリー);ウインターシェル(Wintershall)(ウインターシェルAG、カッセル,ドイツ);BASF(BASF社、フローハムパーク,ニュージャージー);ハンツマン(Huntsman)(ハンツマンファーマスーティカル社、ソルトレイクシティー、ユタ);エニケム(Enichem)(エニケムイベリカ,バルセロナ、スペイン);フルカケムAG(Fluka Chemie AG)(フルカケムAG、ブッシュ,スイス);ギストブロカデス(Gist−Brocades)(ギストブロカデス,NV,デルト,オランダ);ダウコーニング(Dow Corning) (ダウコーニンググループ、ミッドランド、ミネソタ)、及びマイクロソフト(Microsoft)(マイクオソフト社、レドモンド、ワシントン)。
以下の実施例に用いる野生型セリンプロテアーゼについての詳細は、US04/39006及びUS04/39066に記載されている。これらの文献を参照により本明細書に援用する。
実施例1
アッセイ
以下の実施例において、タンパク質同定、適合性ベース試験、安定性ベース試験等の各種試験を行った。明確にするために、アッセイ方法を以下で定義し、個々の実施例で引用する。本発明を開発する間に行われた任意の試験におけるプロトコルの各種変更は実施例で説明する。
A.96ウェルマイクロタイタープレートにおけるタンパク質含量決定のためのTCAアッセイ
このアッセイは230RPMの振とう速度及び湿気の高い空気を通気して、33℃で4日間育成したマイクロタイタープレートからのフルターろ過した培養液の上清を用いて開始した。新しい96ウェルフラットボトムのプレートをアッセイに用いた。第一に、100μL/ウェルの0.25N HClをウェルに添加する。その後50μLのフィルターろ過した培養ブロスをウェルに添加する。「ブランク」の値を決定するために、光散乱/405nmにおける吸光度をその後決定する(プレート反応器において5秒混合する)。
試験のために100μL/ウェルの15%(W/v)TCAをプレートに添加し、室温で5乃至30分間インキュベーションする。光散乱/405nmにおける吸光度をその後決定する(プレート反応器において5秒混合する)。
TCAを含む試験の値からブランク(TCAを含まない)の値を引いて、計算を行った。必要であるならば、既知の変換因子を用いてクローンのAAFPアッセイを用いてTCAの値をキャリブレーションすることにより標準曲線を作成した。しかしながら、TCAの値は50乃至500ppnではタンパク質の濃度に比例する。従って、優れた性能の変異体の選択の目的のための酵素性能に対して直接的にプロットすることができる。
B.96ウェルマイクロタイタープレートにおけるプロテアーゼのsuc−AAPF−pNAアッセイ
このアッセイシステムにおいて用いる試薬溶液は、
1.0.005%TWEEN(商標)―80(トリス緩衝液)を含む100mMトリス/HCl、pH8.6、
2.10mMCaCl及び0.005%TWEEN(商標)−80(トリス緩衝液)を含む100mMトリス、pH8.6、
3.DMSO中160mMsuc−AAPF−pNA(suc−AAPF−pNAストック溶液)(シグマ:S−7388)
suc−AAPF−pNAワーキング溶液を調製するために、1ml AAPFストックを100mlトリス緩衝液に添加し少なくとも10秒間よく混合する。
このアッセイは10μlの希釈プロテアーゼ溶液を各ウェルに添加し、その後190μlの1mg/mlAAPFワーキング溶液を添加して行う。この溶液を5秒間混合し、25℃で、MTPリーダーに410nmにおける吸光度の変化を測定する。このプロテアーゼ活性はAUで示す(活性=△OD・min−1.ml−1)。
C.ケラチン加水分解活性
このアッセイシステムにおいて用いた試薬を以下に示す。
ケラチン:INC902111
洗剤:1.6gの洗剤を1000mlの水に溶解する(pH=8.2)、1190mgのHEPESの他に0.6mlのCaCl/MgClの10,000gpgを添加して、硬度及びバッファー強度をそれぞれ、6gpg及び5mMになるようにする。pHはNaOHで8.2になるように調整する。ピルリルスルホン酸(TNBS)、シグマP−2297(水中5%溶液)
試薬A:45.4gのNa10H O(メルク6308)及び15mlの4N NaOHを最終容量が1000mlになるように溶解する(必要に応じて加熱する)
試薬B:35.2gのNaHPO1HO(メルク6346)及び0.6gMa SO (メルク6657)を最終容量が1000mlになるように溶解する。
方法
インキュベーションの前に一度に少しの部分をとりながらケラチンを100μmの篩にかける。その後、10gの100μm未満のケラチンをpHを8.2に維持しながら、室温で、20分間洗剤溶液中で添加した。最後に、この懸濁液を室温で20分間遠心分離した(Sorvall、GSAローター、13,000rpm)。この工程を繰り返した。最後に、ぬれた沈殿物を相容量が200mlになるように洗剤中に懸濁した。インキュベーションの前に、マイクロタイタープレート(MTP)を1ウェル当たり200μlのバイオヒットマルチチャンネルピペットと1200μlのチップを用いて基質で満たした(200μlを6回分注する。ケラチンの沈殿を防ぐためにこの操作はできるだけ早く行う。)。その後、10μlのフィルターろ過した培養物をMTPを含む基質に添加した。このプレートをタップで多い、インキュベーター中で20℃、3時間、350rpm(Innova4330[ニューブランスウィック])で培養した。インキュベーションの後、このプレートを3分間、3000rpm(シグマ 6K遠心分離器)で遠心分離した。インキュバータから第一のプレートを除去する前約15分に、TNBS試薬を試薬A50ml当たり1mlTNBS溶液を混合して調製した。
MTpを1ウェル当たり60μlのTNBS試薬で満たした。インキュベートしたプレートから、10μlをTNBS試薬Aを含むMTPに移した。このプレートをタップで覆い、室温及び500rpmでベンチシェーカー(BMGサーモスター)中で20分間振とうした。最後に、200μlの試薬Bをウェルに添加して、シェーカーで1分混合し、MTPリーダーを用いて405nmの吸光度を測定した。
ケラチン加水分解活性の計算
得られた吸光度の値を(実質的に酵素のない)ブランクの値で補正した。得られた吸光度加水分解活性の測定提供する。各サンプル(変異体)のパフォーマンスインデックスを計算した。このパフォーマンスインデックスを同じタンパク質濃度の変異体のパフォーマンス(実際の値)と標準酵素のパフォーマンス(理論的な値)を比較した。更に、標準的な酵素のラングミュアの式のパラメーターを用いて理論的な値が計算できる。1より大きいパフォーマンスインデックス(PI)は好ましい変異体(標準(例えば、野生型)と比較して)であり、1のPIは標準と同じ性能の変異体を示し、1未満のPIは標準より悪い変異体を示す。従って、このPIは、特定の環境に用いるのに好ましくない変異体の他に好ましいのも示す。
D.ジメチルカゼイン加水分解アッセイ(96ウェル)
このアッセイシステムに用いた試薬を以下に示す;
ジメチルカゼイン(DMC):シグマC−9801
TWEEN(商標)−80:シグマP−8074
PIPES緩衝液(遊離酸):15.1gのシグマP−1851を960mlの水に溶かす、4N NaOHを用いてpHを7.0に調節する、1mlの5%TWEEN(商標)−80を添加して容量を1000mlにする。PIPES及びTWEEN(商標)−80の最終濃度はそれぞれ50mM及び0.005%である
ピクリルスルホン酸(TNBS):シグマP−2297(水中5%溶液)
試薬A:45.4gのNa 10H O(メルク6308)及び15mlの4N NaOHを最終容量が1000mlになるように溶解する(必要に応じて加熱する)
試薬B:35.2gのNaHPO1HO(メルク6346)及び0.6gMa SO (メルク6657)を最終容量が1000mlになるように溶解する
方法
基質を調節するために。4gのDMCを400mlのPIPES緩衝液に溶解した。フィルターろ過した培養上清をPIPES緩衝液で希釈して、対照の最終濃度が育成プレート中20ppmにした。その後、10μlの希釈した各上清をMTPのウェル中にある200μlの基質に添加した。このMTPプレートをタップで覆い、数秒攪拌して、攪拌をせずに37℃のオーブン内で2時間置いた。
このオーブンから第一のプレートを取り出す15分前に、試薬A50ml当たり1mlのTNBS溶液を混合してTNBS試薬を調製した。MTPを1ウェル当たり60μlのフィルターろ過した上清で満たした。インキュベートしたプレートを数秒振とうして、10μlをTNBS試薬Aを含むMTPに移した。このプレートをタップで覆い、室温及び500rpmでベンチシェーカー(BMGサーモスター)中で20分間振とうした。最後に、200μlの試薬Bをウェルに添加して、シェーカーで1分混合し、MTPリーダーを用いて405nmの吸光度を測定した。
ジメチルカゼイン加水分解活性の計算
得られた吸光度の値を(実質的に酵素のない)ブランクの値で補正した。得られた吸光度を加水分解活性の測定に提供する。サンプルの任意の活性は確定しているタンパク質の濃度で吸光度を割ることにより計算した。
E.熱安定性アッセイ
このアッセイは緩衝された培養上清の過熱後及び前のジメチルカゼイン加水分解に基づいている。ジメチルカゼイン加水分解アッセイで説明したのと同じ化学物質及び試薬溶液を用いた。
方法
フィルターろ過された上清を20ppmのPIPES緩衝液(育成プレートにおける対照の濃度に基づいて)で希釈した。その後、50μlの各希釈上清を空のMTPに入れた。このMTPプレートをiEMSインキュベーター/シェーカーHT中で60℃、400rpmで90分間、インキュベーションした。このプレートを氷上で5分間冷却した。その後、10μlの溶液を1ウェル当たり200μlのジメチルカゼインを含む基質新しいMTPに添加した。このMTPをタップで覆い、数秒攪拌した後、攪拌を行わずに2時間37℃のオーブン内に置いた。DMC加水分解アッセイで用いたものと同じ検出方法を用いた。
熱安定性の計算
サンプルの残余活性を最終の吸光度と開始の吸光度の比で示す。これらの吸光度はブランクで補正されている。
F.LAS安定性
LAS安定性は、0.06%LAS(ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム)の存在下で試験プロテアーゼをインキュベーションした後に測定し、残余活性をAAPFアッセイに用いて決定した。
試薬
ドデシルベンゼンスルホネート、硫酸ナトリウム(=LAS):シグマD−2525
TWEEN(商標)−80:シグマP−8074
TRIS緩衝液(遊離酸):6.35gのシグマT−1378を960mlの水に溶解した、pHを4N HClで8.2に調節した。TRISの最終濃度は52.5mMである
LASストック溶液:MQ水中10.5%LAS溶液(=10.5g/100mlMQ)
TRIS緩衝液:100mM/pH8.6(1000mMTris/0.005%Tween80)
TRIS−Ca緩衝液:pH8.6(100mM Tris/10mMCaCl/0.005%Tween80)
設備機器
フラットボトムMTP:Constar(#9017)
バイオメリックFX
ASYSマルチピペッター
スペクトラマックスMTPリーダー
iEMSインキュベーター/シェーカー
イノバ4330インキュベーター/シェーカー
バイオヒットマルチチャンネルピペッター
BMGサーモスターシェーカー
方法
0.063%LAS溶液を52.5mMトリス緩衝液pH8.2中で調製した。このAAPSワーキング溶液は、1mlの100mg/ml AAPFストック溶液(DMSO中)を100ml(100mM)TRIS緩衝液、pH8.6に添加して調製した。上清を希釈するために、フラットボトムプレートを希釈緩衝液で満たし、上清の一部分を添加して、よく混合した。希釈の比は育成プレート中のASP対照の濃度に依存する(AAPF活性)。所望のタンパク質濃度は80ppmであった。
10μlの希釈した上清を1ウェル当たり190μlの0.063%LASに添加した。このMTPをタップで覆い、数秒振とうし、25℃又は35℃の温度で、200rpmの攪拌速度のインキュベーター(イノーバ4230)に60分置いた。初期活性(t=10分)を、インキュベーションの10分後に各ウェルの混合物を190μlのAAPFワーキング溶液を含む新しいMTPに移すことにより決定した。これらの溶液を混合してAAPF活性をMTPリーダー(25℃において5分間で25回測定する)を用い測定した。
最終活性(t=60)をインキュベーションの60分後にインキュベーションプレートから別の10μlの溶液を除去して決定した。このAAPF活性を上で述べたのと同様の方法で決定した。計算は以下のように行った;
残余活性(%)=[t=60の値]*100/[t=10の値]
実施例2
グラム陰性アルカリ性バクテリア69B4から69B4プロテアーゼの生成
この実施例は、本発明により提供される、新規なプロテアーゼ69B4の単離に用いたセルロモナス(Cellulomonas)株96B4について説明する。このアルカリ性微生物であるセルロモナス(Cellulomonas)株69B4(DMS16035)は(gL−1)を含むアルカリカゼイン培地状で37℃で単離された。(例えば、Duckworth et al,FEMS Microbiol. Ecol.,19:181-191[1996]参照のこと)
グルコース(メルク1.08342):10
ペプトン(ディフコ0118):5
イースト抽出物(ディフコ0127):5
HPO:1
MgSO・7HO:0.2
NaCl:40
NaCO:10
カゼイン:20
アガー:20。
セルロモナス(Cellulomonas)株69B4を育成するために、以下の追加的なアルカリインキュベーション培地も用いた
グラントアルカリ性培地(GMA)溶液A(gL −1
グルコース(メルク1.08342):10
ペプトン(ディフコ0118):5
イースト抽出物(ディフコ0127):5
HPO:1
MgSO・7HO:0.2
800mlの脱イオン水に溶解し、オートクレーブで滅菌した
GMA溶液B(gL
NaCl:40
NaCO:10
200mlの脱イオン水に溶解し、オートクレーブで滅菌した。
混合溶液A(800ml)と混合溶液B(200ml)を混合して完全なGAM培地を調製した。固形培地はアガロース(2%w/v)を添加することにより調製できる。
育成条件
培養物の新しく凍結されたグリセロールバイアル(−80℃で20%v/vの凍結グリセロールとして貯蔵)から、アガロースプレート中に、上で説明したグラントアルカリ性培地(GAM)の上にオキュレーションループを用いて、微生物を接種し、少なくとも2日間37℃で育成した。1つのコロニーをpH10で100mlGMAを含む500ml振とうフラスコに接種するのに用いた。(目視により)良好な育成がえら得れるまで、1乃至2日間、ロータリーシェーカーを用いてこのフラスコを37℃でインキュベートした。その後、100mlの培養物のブロスを5リットルのGMAを含む7リットルの発酵槽に接種するのに用いた。この発酵槽はプロテアーゼの最大生産量を得るために、37℃で2乃至3日間稼動させた。十分に通気した条件を、約500rpmで回転するインペラー領域に5L/分の速度で空気をインジェクションし続けることにより維持した。塩を用いてpHを10に設定したが、発酵の間には調整はしていない。
69B4粗酵素サンプルの調製
培養ブロスを発酵槽より回収し、10℃、500×gで30分間遠心分離して、細胞を除去した。得られた上清を、SeitzEKS(SeitzEKSフィルターシステム)上でデプス(depth)ろ過により精製した。得られた滅菌図にの培養物の上清を10kDaをカットオフする(パルオメガ10kDaミニカセット(Pall)を用いたウルトラフィルトレーションにより、約10倍に濃縮した。得られた濃縮粗69B4サンプルを更なる使用に供するまで−20℃で貯蔵した。
精製
細胞が分離された培養ブロスは8kDの分子量をカットオフする(MWCO)スペクトラ−プロ7(スペクトラム)透析チューブを用いて、20mM(2−(4−モルフォリノ)−エタンスルホン酸(MES)、pH4.5、1mMCaCl2について透析された。この透析は、一晩又は好ましくはのサンプルの伝導性がMES緩衝液の伝導率以下になるまで行った。透析された酵素サンプルは10×100mm(7.845ml)のPOROS高密度スルホプロピル(HS)20(20ミクロン)カチオン交換カラム(パーセプティブバイオシンセシス)を有するBio Cad VISION(アプライドバイオシステム)を用いて精製した。あらかじめ5ml/分で平衡化したカラムに酵素を負荷した後に、このカラムを25カラム容量の25mMMES、pH6.2、1mMCaCl2乃至25mM CN−[2−ヒドロキシメチル]ピペリジン−N’−[2−エタン]スルホン酸[C8H18N2O4S、CAS#7365−45−9](HEPES)pH8.0、1mMCaCl2のpH勾配で、40ml/分で洗浄した。分画(8ml)を収集した。pH8の洗浄ステップは、5カラム容量に固定されており、勾配(35カラム容量の同じ緩衝液で、0乃至100mM NaCl)用いて溶出した。分画中のプロテアーゼ活性はpNAアッセイ(sAAPF−pNAアッセイ;DelMarら、上記)を用いてモニターした。40mMNaClで溶出されたプロテアーゼ活性を濃縮し、20mM MES、pH5.8、1mMCaCl2へと、(5K WMCO VIVAサイエンス 20ml
濃縮器を用いて)バッファー交換を行った。この物質を酵素の特徴づけを行うために用いた。
実施例3
バチルススブチリス(B.subtilis)におけるASPプロテアーゼ生産
バチルススブチリス(B.subtilis)における69B4プロテアーゼ(本明細書において「ASP」、「Asp」、「ASPプロテアーゼ」、及び「Aspプロテアーゼ」とも言う)を生産するために行う実験は米国特許出願Ser.No.10/576,331に記載されている。この文献を参照により本明細書に援用する。
このDNA配列(合成ASP DNA配列)を以下に示す。コドンの使用についてはバチルス種に適合させ、この配列は野生型ASP前駆体タンパク質をコードしている。
式4
Figure 0005785686
上記の配列において、太字は成熟タンパク質をコードするDNAを示し、標準的なフォントはリーダー配列を示し、下線により示されるものはN末端及びC末端プロ配列を示す。
合成ASP遺伝子の発現
合成ASP遺伝子の発現は米国特許出願Ser.No.10/576,331に記載されている。この文献を参照により本明細書に援用する。
実施例4
組合せ変異及び複数変異ライブラリーの生成
本実施例において、組合せ変異及び複数変異ライブラリーを構築するのに用いる方法を記載する。
組合せ変異の構築
ASPの組合せ変異の構築は米国特許出願Ser.No.10/576,331に記載されている。本文献を参照により本明細書に援用する。
複数変異ライブラリー構築物
反応におけるプライマー濃度以外はストラタジェンQCMSキットに従って複数変異ライブラリーを構築した。具体的には、1μLのメチル化された精製pUC18−ASPプラスミド(約70ng)を滅菌脱イオン水、1,5μLのdNTP、2.5μLの10×緩衝液、1μLの酵素ブレンド、及び1.0μLの変異体プライマー混合物と混合した(合計で、100pmolのプライマー濃度になる)。このプライマー混合物を18の変異プライマーのそれぞれについて10μL(100pmol/μL)、を用いて調製し、ストラタジェンにより推奨されているように、このライブラリーに50ngの各プライマーを転化して、変異誘発の前の段階でいくらかの変異誘発を得た。従って、この方法は変異誘発の段階において各反応中に100pmolのプライマーを含むように変更されている。サイクル条件は、薄壁の0.2mlPCRチューブを用いてMJリサーチPTC−200熱サイクル器を用いて、95℃を1分、これに続き、95℃を1分、55℃を1分、及び65℃を12分のサイクルを30サイクル行った。反応生成物を1μLのDpnI(QCMS付属)で、37℃で一晩インキュベートして制限消化した。更に0.5μLのDpnIを添加し、1時間反応物をインキュベートした。
続いて、ライブラリーDNA(変異された1本鎖pUC18−ASP生成物)を電気穿孔法により適合したE.coli細胞(インビトロジェン、カタログNo.C4040−52、One Shot(商標)TOP10Electrocomp(商標)E.Coli,dam+)に導入し、100mg/Lアンピシリンを含むアラープレート上で選択育成を行い、E.coli細胞内にASP複数変異ライブラリーを形成する。(数千のうちの数十の)コロニーを収穫し、キアゲン スピン ミニピレップDNAキット(カタログNo.27106)を用いて、キアゲン ミニピレップキットマニュアルに従い、プラスミドDNAを調製した。このミニピレップDNAを、キットに付属している50μLのキアゲンEB緩衝液で溶出した。
ミニプレップDNAはPstI及びHindIIIDNA制限酵素を用いて消化した。ASPライブラリーフラグメント混合物(PstI×HindIII)をゲル精製し、インビトロジェンT4 DNAリガーゼ(カタログNo.15224−025)を用いて、粘着末端の一般的なクローニングのためのプロトコルに従って、4154ベースペアのHindIII×PatIpHPLベクターフラグメント内でクローン化した。他のアプローチにおいて、合成ASPライブラリーフラグメントをGeneArtにより生成した。これらのASPライブラリーフラグメントもPstI及びHindIIIで消化され、リガーゼ反応により、4154ベースペアのHindIII×PatIpHPLベクターフラグメント内でクローン化した。
このリガーゼ反応混合物を直接バチルス(Bacillus)細胞に導入するために、DNAライブラリー(HPLT内でクローン化されたASPライブラリーフラグメント混合物)をTempliPhi キット(アマシャム、カタログ#25−6400)を用いて増幅した。この目的のために、1μLのリゲーション反応混合物をTempliPhi
キットに付属の5μLのサンプル緩衝液と混合して、95℃で3分間加熱して、DNAを変性させた。この反応物を氷上に2分間置き、その後、遠沈させた。次に、5μLの反応緩衝液及びTempliPhi キットに付属の0.2μLのphi29ポリメラーゼを加えて、反応物をMJリサーチPCRマシーン内で30℃、4時間、インキュベートした。phi29酵素は前記PCRマシーンで、65℃で10分間、インキュベートすることにより、加熱させて失活させた。
ライブラリーをバチルス(Bacillus)に形質転換するために、0.1μLのTempliPhi キット反応生成物を500μLの適合するバチルススブチリス(B.subtilis)細胞(△aprE、△nprE、oppA、△spoIIE、degUHy32、△amyE::(xylR、pxylA−comK)と混合し、1時間、37℃で激しく振とうし、この100μL及び500μLを20ppmの硫酸ネオマイシン(シグマ、カタログNo.N−1876;1グラム当り732μgのネオマイシンを含む)及び0.5%スキムミルクを含むHI−アガープレートに置いた。ライブラリーからの75のコロニー配列決定のために取り出された。
変異誘発は成功し、14%のクローンだけが、骨格配列と同じであり(R0141−A064K−T086K−T116E−R123F)、約3%のクローンが更なる変異を有していた。配列決定された残りのクローン(72%)は全てが変異体で、これらのうちの約94%が独特の変異体であった。このライブラリーの配列決定の結果を以下の表9に示す。
Figure 0005785686
Figure 0005785686

Figure 0005785686
実施例5
複数の性質についての有害な変異の相関関係
この実施例において、任意の性質に対して有害な変異体はあらゆる他の性質について有害な変異体と相関関係があるという、主題を例示する。ここで示されるように、わずかな数の部位のみが(5乃至10%)、全ての性質において悪くなる変異を有していた。これらの部位は折りたたみと定義し、進化において保存されている。このことは、任意の性質について有用な変異を同定することはその性質について真の予測可能なスクリーニングを必要とするが、任意の性質について有害であると思われる変異体の同定は、本発明の方法を含むがこれらに限定されない、任意のスクリーニングを用いることで達成できることを示唆している。
変異体酵素(ASP、ACT、及びNPRe)は本明細書及び米国特許出願Ser.Nos.10/576,331、10/581,014、11/581,334に記載の方法を用いて生成される。これらの文献を参照により本明細書に援用する。以下に示す表は、5%より高い活性を有する変異体の数と、5%より低い活性を有する変異体の数を、2つの性質について相関係数により対比較を行ったものである。この実施例で用いたアッセイシステムはこのアプリケーションに提供される。本明細書において用いる性質は、ASPに対するカゼイン活性(CA)、ケラチン活性(KER)、AAPF活性(AAPF9、LAS安定性(LAS)、及び熱安定性、並びにACTについての過酸形成(PAF)、及び過酸分解性(PAD)である。
以下の表において、相関があるとされた性質は(相関係数>0.5)、ASPについてのCAS、KER、及びAAPFだけである。他の全ては相関していなかった(相関係数<0.3)。相関していなかったという事実に関わらず、変異体が2つの性質について有害であろうという可能性は、たまたま予期されたものよりも高かった。表において、可能性に基づいて予測される観察される変異体の数の計算による割合を示す。1よりおおきい数は正の相関を示し、1未満の数は負の相関を示す。
Figure 0005785686
Figure 0005785686
Figure 0005785686
Figure 0005785686
Figure 0005785686
Figure 0005785686

Claims (7)

  1. 親タンパク質の変異体のタンパク質エンジニアリングのための方法であって、
    a)親タンパク質と前記親タンパク質のタンパク質変異体の部位評価ライブラリーとを提供する工程であって、前記部位評価ライブラリーが所望の1つの位置において修飾された親タンパク質の変異体からなることを特徴とする工程、
    b)所望のそれぞれの試験における、少なくとも2つの所望の性質について、前記タンパク質変異体のライブラリーと親タンパク質とを試験する工程、
    c)前記所望の試験において、前記変異体について得られた値を前記親タンパク質について得られた値で割って、前記少なくとも2つの所望の性質のパフォーマンスインデックスの値を決定して、前記親タンパク質と比較した前記タンパク質変異体についての見かけの自由エネルギーの差(△△Gapp)を提供する、工程
    d)2つ以上の所望の位置における変異を組み合わせてなるタンパク質変異体について、前記少なくとも2つの所望の性質のパフォーマンスインデックスの予測値を決定する工程であって、前記2つ以上の所望の位置が、前記少なくとも2つの所望の性質のいずれかにおけるアンプロダクティブ部位を含まないことを特徴とし、前記2つ以上の位置における変異を組み合わせてなる変異体についての予測されるパフォーマンスインデックスの予測値を、前記c)において提供された前記2つ以上の所望の位置におけるそれぞれの変異の△△G app の値を加えた値に基づいて得ることを特徴とする工程、及び
    e)工程d)で決定されたパフォーマンスインデックスの予測値に基づき、2つ以上の変異を組み合わせてなり、前記親タンパク質と比較して改善された第一の性質と親タンパク質と比較して少なくとも90%である第二の性質とを有することが予測されるタンパク質変異体を同定し、それゆえ少なくとも1つの所望の性質を有するメンバーが豊富なタンパク質変異体ライブラリーを提供する工程、を含む方法。
  2. 前記所望の性質が、電荷、洗浄性能、硬表面洗浄性能、熱安定性、貯蔵安定性、洗剤安定性、基質結合性、酵素抑制、発現レベル、反応速度、及び基質分解性から選択される、請求項1の方法。
  3. 前記親タンパク質が酵素である、請求項1の方法。
  4. 前記酵素がプロテアーゼ、トランスフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、及びリパーゼである、請求項1の方法。
  5. 前記親タンパク質が抗体及び成長因子から選択される請求項1の方法。
  6. 前記親タンパク質及びタンパク質変異体が少なくとも1つの洗剤成分の成分である、求項1の方法。
  7. 前記洗浄性能がpH5乃至12.0のpHを有する粉末又は液体洗剤に製剤化された洗浄組成物中で試験される、請求項2の方法。
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