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JP5774474B2 - Ｒｎａへの選択的な５’ライゲーションによるタグの付加 - Google Patents

Ｒｎａへの選択的な５’ライゲーションによるタグの付加 Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
本願は、米国仮出願第６１／０５０，０４６号明細書（２００８年５月２日出願）の優先権を主張するものである。この仮出願の明細書は、参照することによってその全てが本明細書に援用される。
〔発明の分野〕
本発明は、所望のクラスまたはタイプの１つ以上のＲＮＡ分子の５’末端にタグを選択的に付加するための新規な方法、組成物およびキットに関する。それぞれのクラスは、特定の化学的な部分または化学基を、５’ヌクレオチドの５’位置に有するＲＮＡ分子からなる。本方法のいくつかは、本出願人によって発見された、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（ＲＰＰ）と呼ばれる新規なクラスの酵素を用いる。これらの酵素は、５’ポリリン酸基を有するが、５’キャッピングされていないＲＮＡを、５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する。また、本出願人によって発見されたいくつかの新規な方法は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）と呼ばれる別の新規なクラスの酵素を用いる。この酵素は、５’一リン酸基を有するが、５’ポリリン酸基を有さないＲＮＡを、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換する。さらに他の方法は、ＲＰＰ、ＲＭＰおよび／または他の酵素（キャッピング酵素、デキャッピング酵素、および核酸に対するピロホスファターゼが挙げられる。）を単独でまたは連続で組み合わせて用いて、所望のクラスのＲＮＡ分子に、選択的な５’ライゲーションによるタグを付加するための新規な方法を提供する。本方法、本組成物および本キットは、例えば、研究、ヒトまたは非ヒトの診断、あるいはヒトまたは非ヒトの治療に有用である。
〔発明の背景〕
近年の研究において、ヒトゲノムのほとんどの部分（いわゆる「非翻訳領域」も含む。）がＲＮＡに転写されることが示されている（例えば、Genome Research Volume 17, Issue 6: June 2007参照）。その結果、現在、転写された全てのＲＮＡ（ｍＲＮＡ、非翻訳ＲＮＡ（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはそれらのプリｍｉＲＮＡもしくはプレｍｉＲＮＡなど）、および他のＲＮＡ分子（特定されていないＲＮＡを含む。）を含む。）の生物学的な運命および機能を特定したり、特徴付けたり、決定したりすることに非常に関心が持たれている。
また、真核生物における、分化、環境に対する生物学的な応答、および正常な細胞と異常な細胞との他の生物学的なプロセスを理解するために種々のＲＮＡ分子を特定したり、その発現を分析したりすることに以前から関心がもたれている。例えば、各疾患の発症および進行を理解し、あわよくば、疾患または疾患の進行を予防するための処置または方法を発見するために、真核細胞における疾患に関連するＲＮＡ分子を研究することに非常に関心がもたれている。
病原菌、マイコプラズマ、およびウイルスによって引き起こされた真核生物の疾患に関しては、感染の過程、疾患の発症および疾患の進行の間に、宿主および病原体の両方のゲノムにコードされるＲＮＡの生物学的な機能を特定したり、特徴付けたり、決定したりすることに非常に関心がもたれている。
種々のクラスのＲＮＡ分子の５’末端の性質は、それらの生物学的な構造および機能において重要な役割を果たしている。ＲＮＡ分子の５’末端の化学的な部分は、細胞または生体内でのＲＮＡ分子の構造、安定性、生物化学的なプロセシング、輸送、生物学的な機能および運命に影響を及ぼす。種々のクラスのＲＮＡの５’末端にて一般的に発見される化学的な部分としては、三リン酸、一リン酸、ヒドロキシル、およびキャップヌクレオチドが挙げられる。５’末端の特定の化学的な部分は、ＲＮＡの開始点、プロセシング、成熟、および安定性についての重要な手がかりを与える。新たに特定されたＲＮＡにおけるこの部分を特徴付けることは、細胞内でのＲＮＡの役割の示唆さえもし得る。それ故、異なる５’末端の基を含んでいるＲＮＡ分子のクラスを識別し得る方法は、ＲＮＡを特徴付けたり、研究したり、操作したりするための重要なツールである。
例えば、細菌のｍＲＮＡは、５’末端に三リン酸基を典型的に有している。さらに、タンパク質に翻訳されない多くの真核生物のＲＮＡ（「非翻訳ＲＮＡ」または「ｎｃＲＮＡ」と称する。）が記載されており、これらのｎｃＲＮＡの多くが５’末端に三リン酸基を有している。さらに、原核生物および真核生物の低分子のリボソーマルＲＮＡ（例えば、５Ｓ ｒＲＮＡまたは５．８Ｓ ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、５’末端に三リン酸基を典型的に有している。
大部分の真核生物の細胞性ｍＲＮＡおよび大部分の真核生物のウイルス性ｍＲＮＡの転写産物は、それらの５’末端にてキャッピングされている。「キャップ」または「キャップヌクレオチド」は、グアニンヌクレオシドからなる。このグアニンヌクレオシドは、その５’炭素を介して三リン酸基に連結し、この三リン酸基は、順に、ｍＲＮＡの一次転写産物の最も５’側のヌクレオチドの５’炭素に連結している。ほとんどの真核生物では、キャップヌクレオチドにおけるグアニンの７位の窒素がメチル化されている。このように、ほとんどの真核生物の細胞のｍＲＮＡおよびほとんどの真核生物のウイルスのｍＲＮＡは、５’末端に「Ｎ7−メチルグアノシン」、すなわち「ｍ7Ｇ」のキャップまたはキャップヌクレオチドを有している。
真核生物の細胞性およびウイルス性ｍＲＮＡに加えて、いくつかのｎｃＲＮＡもキャッピングされ、いくつかのキャッピングされたｎｃＲＮＡも、真核生物のほとんどのｍＲＮＡのように３’ポリ（Ａ）テールを有している。例えば、Rinn, JL et al.（Cell 129: 1311-1323, 2007）には、キャッピングされ、ポリアデニル化される、２．２キロベースのｎｃＲＮＡが１つ記載されている。このｎｃＲＮＡは、ヒトの１２番染色体のＨＯＸＣ領域にコードされており、「ＨＯＴＡＩＲ」と称され、２番染色体上のＨＯＸＤ遺伝子の発現に対して非常に大きな効果を有している。さらに、サンプル中の、いくつかの真核生物の他のＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ（「ｓｎＲＮＡ」）、およびプレｍｉＲＮＡなど）もキャッピングされ得る。
真核生物の細胞性およびウイルス性のｍＲＮＡ（およびいくつかの他の形態のＲＮＡ）の５’キャップは、ｍＲＮＡの代謝に重要な役割を果たしており、程度の差こそあれ、核内でのｍＲＮＡ転写産物のプロセシングおよび成熟、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、ｍＲＮＡの安定性、ならびにｍＲＮＡからタンパク質への効率的な翻訳のために必要とされる。例えば、キャップは、タンパク質の合成の開始ならびにインビボでの真核生物のｍＲＮＡのプロセシングおよび安定性に極めて重要な役割を果たす。キャップは、５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）の活性に対する耐性をもたらし、キャップが無い場合、ｍＲＮＡは急速に分解してしまう（例えば、Mol. Biol. Med. 5: 1-14, 1988; Cell 32: 681-694, １９８３参照）。したがって、真核細胞へ導入したり（卵母細胞へのマイクロインジェクションまたは細胞へのトランスフェクションを介した導入）、真核細胞で発現させたりするために（例えばインビトロにて）調製されるｍＲＮＡは、キャッピングされるべきである。
真核細胞のウイルス性ＲＮＡの多くは、キャッピングされている場合にのみ感染する。キャッピングされていないウイルス性ＲＮＡ分子（すなわち、ウイルス性ＲＮＡ分子は「キャップ」を有していない。）が細胞内へトランスフェクションまたはマイクロインジェクションを介して導入された場合、細胞性のリボヌクレアーゼによって迅速に分解されてしまう（例えば、Krieg, and Melton, Nucleic Acids Res. 12: 7057, 1984; Drummond, et al. Nucleic Acids Res. 13: 7375, 1979参照）。
多くの真核生物の細胞性遺伝子および真核生物のウイルス性遺伝子の、一次転写産物は、これらの転写産物のコード領域内の介在配列（イントロン）を除去するためのプロセシングを必要とする。キャップの利点はこのようなｍＲＮＡ前駆体の安定性にまで及ぶ。例えば、ｍＲＮＡ前駆体にキャップが存在することによって、酵母におけるｍＲＮＡ前駆体のインビボでのスプライシングが向上する。しかし、ｍＲＮＡ前駆体にキャップが存在することが、インビボでのスプライシング、またはインビトロの酵母スプライシングシステムを用いたスプライシングに必須でないことが示されている（Fresco, LD and Buratowski, S, RNA 2: 584-596, 1996; Schwer, B et al., Nucleic Acids Res. 26: 2050-2057, 1998; Schwer, B and Shuman, S, RNA 2: 574-583, 1996）。スプライシングの向上は、ｍＲＮＡ前駆体の安定性が増加したことに主に起因している。これは、キャップがない場合、ｍＲＮＡ前駆体が５’エキソリボヌクレーゼによって迅速に分解されるからである（Schwer, B, Nucleic Acids Res. 26: 2050-2057, 1998）。したがって、インビトロでのＲＮＡのスプライシングの実験をするために合成された転写産物がキャップされることも、有益である。
キャッピングされたｍＲＮＡは核から輸出された後に細胞質に残存する一方、いくつかの他のＲＮＡ（いくつかのｓｎＲＮＡなど）は、さらにメチル化されたキャップを有し、次いで核内へと輸入される。そして、核内にて、これらのＲＮＡは、ｍＲＮＡ前駆体からのイントロンのスプライシングを受け、ｍＲＮＡのエキソンが生成される（Mattaj, Cell 46: 905-911, 1986; Hamm et al., Cell 62: 569-577, 1990; Fischer, et al., J. Cell Biol. 113: 705-714, 1991）。
スプライシングの反応は、スプライシングされたイントロンのＲＮＡを生成し、このイントロンのＲＮＡは、５’一リン酸基を有するＲＮＡを初期に含んでいる。このように、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング反応によって、初期に生成されたイントロンのＲＮＡ分子の少なくともいくつかも、５’リン酸基を有している。さらに、いくつかの他のＲＮＡ（真核生物またはウイルスがコードするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ならびに真核生物および原核生物の巨大なリボソーマルＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ）（真核生物の１８Ｓおよび２６Ｓまたは２８ＳのｒＲＮＡ、または原核生物の１６Ｓおよび２３ＳのｒＲＮＡが挙げられる。）など）は、５’末端に一リン酸基を有している。
リボヌクレアーゼＡによって分解されるＲＮＡ、およびエンドヌクレアーゼによって処理される他のいくつかのＲＮＡ分子は、５’ヒドロキシル基を有している。
ＲＮＡの５’末端を修飾する酵素は、種々のＲＮＡ分子をインビトロにて特徴付けたり、操作したりするに有用なツールである。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（例えば、ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、シュリンプのアルカリホスファターゼ（USB, Cleveland, OH）、またはアークティック（arctic）のアルカリホスファターゼ（New England Biolabs, MA））は、キャッピングされていない一次ＲＮＡの５’三リン酸基およびｒＲＮＡの５’一リン酸基を５’ヒドロキシル基へ変換し、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを生成するが、キャッピングされたＲＮＡには作用しない。核酸に対するピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ））は、キャッピングされたＲＮＡおよびキャッピングされていないＲＮＡの両方の三リン酸基を切断し、５’の一リン酸基を有するＲＮＡを合成する。デキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはワクシニアウイルスのデキャッピング酵素のＤ９もしくはＤ１０）は、キャッピングされたＲＮＡ（例えば、ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡ）を、５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する。キャッピング酵素（ＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）のキャッピング酵素（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、ポックスウイルスのキャッピング酵素、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素、またはSaccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素であるＲＮＡトリホスファターゼ）は、５’三リン酸基を有するＲＮＡまたは５’二リン酸基を有するＲＮＡをキャッピングされたＲＮＡへ変換する。ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ；例えばＴ４ＰＮＫ）は、ＲＮＡ分子の５’末端上のヒドロキシル基にリン酸基を１つ付加し、ＲＮＡ分子の３’末端の一リン酸基（例えば、リボヌクレアーゼＡの作用によって生成された３’の一リン酸基）を除去する。さらに、５’エキソリボヌクレーゼ（ＸＲＮ；例えば、Saccharomyces cerevisiaeのＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ）は、５’一リン酸化ＲＮＡをモノヌクレオチドへ消化する。しかし、この５’エキソリボヌクレーゼは、５’三リン酸基、５’キャップ、または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを一般に消化しない。
また、ＲＮＡリガーゼの反応特異性も、５’末端に異なる基を有するＲＮＡ分子を区別するに有用なツールであり得る。この酵素は、ドナーであるＲＮＡにおける５’一リン酸基と、アクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）における３’ヒドロキシル基との間に、ホスホジエステル結合を形成することを特異的に触媒する。したがって、５’末端に一リン酸基を有するＲＮＡは、サンプル中に存在してようが、５’三リン酸化ＲＮＡまたは５’キャッピングされたＲＮＡをＴＡＰを用いて処理することによって取得されたものであろうが、ＲＮＡリガーゼを用いて、３’ヒドロキシル基を有するアクセプタの核酸へ連結するためのドナーの基質である。５’末端に三リン酸基、二リン酸基、またはヒドロキシル基を含んでいるか、キャッピングされている５’末端の基を含んでいるＲＮＡ分子は、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）のためのドナー分子として機能しない。また、５’末端にヒドロキシル基を有するＲＮＡは、サンプル中に存在しようが、ＡＰを用いて処理することによって得られたものであろうが、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）のためのドナーの基質としての役割を果たすことができない。同様に、ブロックする基（3'-terminal blocked group）を３’末端に含んでいるＲＮＡ分子（例えば、３’にリン酸基または３’にベータ−メトキシフェニルホスフェート基を有するＲＮＡ分子）は、ＲＮＡリガーゼのためのアクセプタの基質として機能しない。
多くの刊行物には、いわゆる「オリゴキャッピング法」を用いた、ｍ7Ｇによってキャッピングされた真核生物のｍＲＮＡを操作するための、アルカリホスファターゼ、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）、およびＲＮＡリガーゼの使用が開示されている。例えば、オリゴキャッピング法およびその使用は、国際公開第０１０４２８６号パンフレットおよび国際公開第２００７／１１７０３９号パンフレットＡ１、米国特許第５，５９７，７１３号明細書、Suzuki, Y et al., Gene 200: 149-156, 1997、Suzuki, Y and Sugano, S, Methods in Molecular Biology, 175: 143 - 153, 2001, ed. by Starkey, MP and Elaswarapu, R, Humana Press, Totowa, NJ、Fromont-Racine, M et al., Nucleic Acids Res. 21: 1683-4, 1993、およびMaruyama, K and Sugano, S, Gene 138: 171-174, 1994に開示されている。
これらのオリゴキャッピング法では、真核生物の総ＲＮＡ、または単離された、ポリアデニル化されたＲＮＡをＡＰによって処理し、次いでＡＰを不活性化するか、または除去する。ＡＰは、５’三リン酸を有するＲＮＡ（例えばキャッピングされていない一次ＲＮＡ）および５’一リン酸を有するＲＮＡを、５’ヒドロキシルを有するＲＮＡへ変換する。その後、サンプルをＴＡＰによって処理する。このとき、ＴＡＰは、真核細胞の５’キャッピングされたｍＲＮＡを、５’一リン酸を有するｍＲＮＡへ変換する。生じた５’一リン酸化ｍＲＮＡを、次いで、ＲＮＡリガーゼを用いて、アクセプタのオリゴヌクレオチドに「オリゴキャッピングする」（すなわち「５’ライゲーションによりタグを付加する」）。「オリゴキャッピングされた」ｍＲＮＡは、「タグ」が５’末端に結合されており、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとしての役割を果たす。このｍＲＮＡから合成された第一鎖ｃＤＮＡは、３’末端にタグが結合されている。次いで、第一鎖ｃＤＮＡの３’末端に結合されたタグに対して相補的な、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーを用いて、二本鎖のｃＤＮＡを作製する。そして、生じた二本鎖ｃＤＮＡを（例えば、完全長のｃＤＮＡのライブラリーを生成するために）使用することができる。例えば、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを完全長の第一鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて作製したり、完全長の二本鎖ｃＤＮＡ（完全長のｃＤＮＡが挙げられる。）を作製したり、（例えば、ｃＤＮＡ末端のランダムな増幅（random amplification of cDNA ends（５’ＲＡＣＥ））のような方法によって、または配列決定法によって）真核生物のｍＲＮＡの５’末端を特定したりするために、従来技術のオリゴキャッピング法は、ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡへ５’ライゲーションによりタグを付加するに有用である。
しかし、従来技術における現在のオリゴキャッピング法および他の方法は問題点を有している。この問題点の１つは、ＡＰの工程が、５’三リン酸基または５’一リン酸基を有する全ＲＮＡ分子の５’末端を５’ヒドロキシル基へ変更することである（例えば、国際公開第０１０４２８６号パンフレットの図２参照）。これにより、５’一リン酸化（monophosphorylated）されたＲＮＡ分子（例えばｍｉＲＮＡ）がＡＰの工程によって脱リン酸化されてしまい、脱リン酸化後のＲＮＡ分子は、ＲＮＡリガーゼによってアクセプタのオリゴヌクレオチドとライゲーションするためのドナーとしての役割を果たすことができないので、ある種の適用分野にとってＡＰ工程は有利である。しかし、また、ＡＰの工程によって、キャッピングされていないｍＲＮＡ分子および（機能的意義を有しているかもしれない）キャッピングされていない非翻訳の一次ＲＮＡ分子が脱リン酸化されてしまい、脱リン酸後のＲＮＡ分子は、アクセプタのオリゴヌクレオチドとライゲーションするためのドナーとしての役割を果たすことができなくなってしまう。従来技術では、サンプル中の５’三リン酸化されたキャッピングされていないＲＮＡ分子（キャッピングされていないｍＲＮＡおよびキャッピングされていない非翻訳の一次ＲＮＡ）を選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するための方法、ならびに５’ライゲーションによりタグを付加された５’一リン酸化ＲＮＡ分子がサンプル中にないときに、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ分子をｃＤＮＡへ変換するための方法が必要とされている。
さらに、従来技術では、ＲＮＡの一次転写産物から５’三リン酸基を除去することもなく、５’一リン酸基を有するこれらのＲＮＡ分子を選択的に脱リン酸化するための方法が必要とされている。また、望まれないＲＮＡがアクセプタのオリゴヌクレオチドによって５’ライゲーションによりタグを付加されないように、望まれないＲＮＡの５’一リン酸基を選択的に５’ヒドロキシル基へと消化することができる酵素の組成物を使用する、方法、組成物およびキットが必要とされている。このように、ＲＮＡの５’モノホスファターゼの酵素の組成物を使用する、方法、組成物およびキットが必要とされている。
さらに、従来技術にて公知の方法は、ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡ分子を選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するために使用することができる。このため、キャッピングされたＲＮＡ分子も含有しているサンプル中にて、キャッピングされていない一次ＲＮＡ分子を選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するための良好な方法が現在のところ存在しない。これは悲しむべきことである。というのも、真核生物のキャッピングされていない一次ＲＮＡは、細胞の生物学的な活性（遺伝子発現の調節が挙げられる。）に役割を果たすと考えられており、この一次ＲＮＡを特異的にオリゴキャッッピングし（すなわち、「５’ライゲーションによりタグを付加し」）、そして、研究することが望まれているからである。それ故、従来技術では、真核生物のキャッピングされたＲＮＡ分子も含有しているサンプル中にて、真核生物のキャッピングされていない一次ＲＮＡ分子を選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するための方法がさらに必要とされている。
一般に、細菌のｍＲＮＡ分子はキャッピングされていない。しかし、悲しむべきことに、キャッピングされたＲＮＡ分子も含有しているサンプル中にて、キャッピングされていない一次ＲＮＡ分子のみを選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するための良好な方法が従来技術において現在のところ存在しない。このため、真核細胞と関係する病原性の原核生物（マイコプラズマなど）または共生の原核生物（Rhizobiumなど）の遺伝子の発現を研究することが困難である。従来技術では、（例えば、発病のプロセスまたは共生のプロセスの間の原核生物の遺伝子の発現を研究するために）真核生物のキャッピングされたｍＲＮＡ分子に５’ライゲーションによりタグを付加することなく、原核生物の５’ポリリン酸化されたＲＮＡ（真核細胞に存在するか、真核細胞と関係する、細菌またはマイコプラズマ（真核細胞と関係する病原性または共生の原核生物など）のキャッピングされていない一次ＲＮＡ分子が挙げられる。）に選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するための方法が必要とされている。
従来技術では、実用的な目的のために（例えば、医学的または産業的に応用される酵素またはタンパク質を発現するＲＮＡ転写産物を特定するために）ＲＮＡ分子を取得したり、特定したり、特徴付けたり、クローン化したり、発現させたり、研究したり、活用したりするために、種々の環境（例えば、土壌、海、湖、河および他の環境（温度、ｐＨ、元素または化合物の含有量あるいは他の性質が異なるか、極端である条件を有する環境が挙げられる。））からのサンプル中の原核生物の一次ＲＮＡ分子に選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するための方法がさらに必要とされている。例えば、従来公知の方法（例えば、J. Frias-Lopez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3805-3810, 2008に記載の方法）よりも、容易であり、効率的であり、メタトランスクリプトミック（metatranscriptomic）な調査および探究により良好なデータを提供する、５’ライゲーションによりタグを付加する方法が必要とされている。
このように、従来技術では、サンプル中の、望まれないＲＮＡ分子に５’ライゲーションによりタグを付加することなく、望まれるＲＮＡ分子を選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するための方法が必要とされている（例えば、キャッピングされていないＲＮＡおよびキャッピングされたＲＮＡの両方を含有しているサンプル中にて、キャッピングされたＲＮＡ分子ではなく、キャッピングされていない一次ＲＮＡ分子を選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するための方法が必要とされている）。
本発明よりも前には、真核生物のキャッピングされたｍＲＮＡも消化することなく、一次ＲＮＡ（キャッピングされていない真核生物の一次ＲＮＡなど）または細菌のｍＲＮＡの５’三リン酸を、５’一リン酸へ選択的に消化する酵素を用いる方法が従来技術として知られていない。よって、従来技術において知られるオリゴキャッピング法は、キャッピングされていない真核生物の一次ＲＮＡおよび／または原核生物の完全長のｍＲＮＡからｃＤＮＡを選択的に合成したり、キャッピングされていない完全長の真核生物の一次ＲＮＡおよび／または原核生物のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡをクローン化したり、キャッピングされていない完全長の真核生物の一次ＲＮＡおよび／または原核生物のｍＲＮＡからのＲＮＡを増幅したり、あるいはキャッピングされたＲＮＡ分子も含有しているサンプル中にて、キャッピングされていない完全長の真核生物の一次ＲＮＡおよび／または原核生物のｍＲＮＡの正確な５’末端の捕捉および特定をしたりするために使用することができない。従来技術では、所定の条件下においてキャッピングされていない一次ＲＮＡの５’三リン酸基を一リン酸基へ消化することができ、キャッピングされたＲＮＡの５’末端を消化しない酵素組成物を使用する、方法、組成物およびキットが必要とされている。したがって、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼの酵素組成物を使用する、方法、組成物およびキットが必要とされている。
従来技術では、任意の所望の集団のＲＮＡ分子をＲＮＡリガーゼを用いてアクセプタのオリゴヌクレオチドによって５’ライゲーションによりタグを付加したり、完全長の所望のＲＮＡ（例えば、完全長のキャッピングされた真核生物のＲＮＡ、完全長のキャッピングされていない真核生物の一次ＲＮＡ、および／または完全長の原核生物の一次ｍＲＮＡ）からｃＤＮＡを合成したり、このｃＤＮＡをクローン化したり、上記ＲＮＡを増幅したり、（例えば、ｃＤＮＡ末端のランダムな増幅（random amplification of cDNA ends（５’ＲＡＣＥ））、エキソンアレイ（exon array）または他のマイクロアレイのような方法によって、あるいは配列決定法によって）上記所望のＲＮＡの正確な５’末端の捕捉および特定をしたりするために、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼの酵素の組成物および／またはＲＮＡ５’モノホスファターゼの酵素の組成物（従来技術にて公知の他の１つ以上の酵素と組み合わせされた組成物が挙げられる。）を使用する、方法、組成物およびキットが必要とされている。特定のタイプのＲＮＡ分子からタグを付加されたＤＮＡフラグメントを作製したり、核酸の増幅に使用したり、（例えば、マイクロアレイまたはｑＰＣＲを用いて）発現を分析するために標識された標的を作製したり、次世代の配列決定法のためのテンプレートとして使用したりするための良好でより効率的な方法が必要とされている。
〔本発明の要旨〕
いくつかの実施形態において本発明は、サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡを含有しているサンプルであって、５’一リン酸基を有するＲＮＡおよび／またはキャッピングされたＲＮＡおよび／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有していること含んでいるサンプル、（ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、（ｉｉｉ）タグを示すアクセプタのオリゴヌクレオチド、および（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼを提供する工程（Ａ）、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、このサンプルをＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、ならびにアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、キャッピングされたＲＮＡではなく、５’一リン酸基を有するＲＮＡに連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）、を包含している。
他の実施形態において、本発明では、工程（Ａ）にて提供されたサンプルが５’一リン酸基を有するＲＮＡをさらに含有しているが、アクセプタのオリゴヌクレオチドは、工程（Ｂ）にて５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡにのみ連結され、工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されない。この方法は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼを提供するサブ工程、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼと工程（Ｂ）の前に接触させるサブ工程、ならびにＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去するサブ工程をさらに包含している。
他の実施形態において、本方法は、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加する工程をさらに包含している。本方法は、核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素を提供するサブ工程、ならびにサンプル中のキャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換され、これによって、工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に含有されているキャッピングされたＲＮＡにも工程（Ｃ）にて５’ライゲーションによりタグが付加される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素と工程（Ｃ）の前に接触させるサブ工程、をさらに包含している。
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）キャッピングされたＲＮＡを含有しており、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡおよび／または５’一リン酸基を有するＲＮＡおよび／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを必要に応じて含有しているサンプル、（ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、（ｉｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼ、（ｉｖ）核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素、（ｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および（ｖｉ）ＲＮＡリガーゼを提供する工程（Ａ）、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼと接触させる工程（Ｃ）、ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｄ）、工程（Ｄ）のサンプル中のキャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）の後のサンプルを核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素と接触させる工程（Ｅ）、ならびにアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、工程（Ｅ）にて生成された５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結され、工程（Ｂ）にて５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡまたは工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されずに、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡがキャッピングされたＲＮＡから生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｅ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｆ）を包含している。
ある実施形態において、本発明は、キャッピングされたＲＮＡおよび／または５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）キャッピングされたＲＮＡおよび／または５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡを含有しているサンプル、（ｉｉ）核酸に対するピロホスファターゼ、（ｉｉｉ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼを提供する工程（Ａ）、キャッピングされたＲＮＡおよび５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、アルカリホスファターゼと接触されていないサンプルを核酸に対するピロホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、ならびにアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）、を包含している。
特定の実施形態において、工程（Ａ）にて提供されたサンプルが５’一リン酸基を有するＲＮＡをさらに含有しているが、アクセプタのオリゴヌクレオチドは、工程（Ｂ）にて、キャッピングされたＲＮＡから、および／または５’ポリリン酸基を有し、キャッピングされていないＲＮＡから、変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡにのみ連結され、工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されない。この方法は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼを提供するサブ工程、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼと工程（Ｂ）の前に接触させるサブ工程、ならびにＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去するサブ工程、をさらに包含している。
さらなる実施形態において、本発明は、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡおよび５’一リン酸基を有するＲＮＡを含有しているサンプル、（ｉｉ）キャッピング酵素、（ｉｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼ、（ｉｖ）核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素、（ｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および（ｖｉ）ＲＮＡリガーゼを提供する工程（Ａ）、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡがキャッピングされたＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをキャッピング酵素と接触させる工程（Ｂ）、５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼと接触させる工程（Ｃ）、工程（Ｃ）にて用いたＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｄ）、キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）の後のサンプルを核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素と接触させる工程（Ｅ）、ならびにアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｅ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｆ）を包含している。
いくつかの実施形態において、工程（Ａ）にて提供されたサンプルは、キャッピングされたＲＮＡをさらに含有しており、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡは、工程（Ａ）のサンプルに提供されたキャッピングされたＲＮＡ、および工程（Ｂ）においてキャッピングされる、サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡの両方から生成される。
特定の実施形態において、本発明は、サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡおよび５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）キャッピングされたＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡおよび５’一リン酸基を有するＲＮＡを少なくとも含有しているサンプル、（ｉｉ）デキャッピング酵素、（ｉｉｉ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼを提供する工程（Ａ）、キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをデキャッピング酵素と接触させる工程（Ｂ）、アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結され、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）、を包含している。
他の実施形態において、本発明は、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡまたは５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）キャッピングされたＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ、５’一リン酸基を有するＲＮＡ、および／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを含有しているサンプル、（ｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼ、（ｉｉｉ）デキャッピング酵素、（ｉｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および（ｖ）ＲＮＡリガーゼを提供する工程（Ａ）、ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼが活性化され、ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼが触媒する反応が完了され得る条件で十分な時間にわたって、サンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、工程（Ｂ）にて用いたＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｃ）、キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｃ）からのサンプルをデキャッピング酵素と接触させる工程（Ｄ）、ならびにアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が工程（Ｄ）にてキャッピングされたＲＮＡから生成された５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｅ）、を包含している。
他の実施形態において、本方法は、ポリＡポリメラーゼおよびＡＴＰを提供する工程、ならびにポリ（Ａ）テールがサンプル中のＲＮＡ分子の３’末端に付加されて、ポリ（Ａ）テールを有するＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、サンプルをポリＡポリメラーゼおよびＡＴＰと接触させる工程を包含している。
特定の実施形態において、サンプルは、第１のタイプの細胞、第１の状態の細胞、または第１の環境からの細胞に由来するＲＮＡを含有している第１のサンプルを含んでいる。本方法は、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡから、第２のタイプの細胞、第２の状態の細胞、または第２の環境からの細胞に由来する第２のサンプル中にも存在するＲＮＡを除き、これにより、第１のサンプル中のみに存在するが、第２のサンプル中には存在しないＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ分子の集団を生成することをさらに包含している。この方法は、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、および第２のタイプの細胞、第２の条件の細胞、または第２の環境からの細胞に由来するＲＮＡを含有している第２のサンプルを提供する工程（ｉ）、第２のサンプル中のＲＮＡを逆転写することによって第一鎖ｃＤＮＡを調製する工程（ｉｉ）、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡと第２のサンプルからのＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡとの間に、ハイブリダイズした複合体が形成される条件で十分な時間にわたって、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを第２のサンプルからのＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡとアニールさせる工程（ｉｉｉ）、ならびに、ｃＤＮＡがアニールしたＲＮＡが消化され、第１のサンプル中にのみ存在するが、第２のサンプル中には存在しないＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡからなる、除かれた５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、ハイブリダイズした複合体をＲＮａｓｅＨによって処理する工程（ｉｖ）を包含している。
さらなる実施形態において、第１のサンプル中のＲＮＡから５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成するために工程（Ａ）にて提供されたアクセプタのオリゴヌクレオチドは、親和性分子を含んでいる。本方法は、親和性分子に結合可能な親和性に基づき結合する物質が付着している固体表面を提供する工程、ならびに第１のサンプルからの５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが、親和性に基づき結合する物質が付着している固体表面に結合されて、第１のサンプル中のＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが固体表面に捕捉される条件で十分な時間にわたって、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを固体表面と、工程（ｉｖ）の前または後のどちらか一方において接触させる工程、を包含している。
いくつかの実施形態において、本方法は、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成する工程を包含している。この方法は、ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的な第一鎖ｃＤＮＡ（first-strand cDNA）が合成される条件で十分な時間にわたって、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡをＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程を包含している。このような方法としては、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的な、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーを提供する工程、ならびに５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程をさらに包含している方法が挙げられる。例えば、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが配列を含んでおり、この配列の少なくとも３’末端は、（１）インビボにおける細胞またはインビトロのどちらかにおいて、サンプル中のＲＮＡの３’末端または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡの３’末端に転写後に付加されたホモポリマーの配列に対して相補的な配列、（２）１つ以上のＲＮＡ分子の３’末端における公知の配列に対して相補的な配列、（３）１つ以上のＲＮＡ分子の１つ以上の内部配列に対して相補的な配列、（４）全ての可能な配列の集合であって、各配列がランダムである集合、（５）ポリ（Ａ）テールに対して相補的な配列（ポリ（Ａ）テールは、オリゴ（ｄＴ）ｎの配列、オリゴ（ｄＵ）ｎの配列、オリゴ（Ｕ）ｎの配列、オリゴ（ｄＴ）ｎＸのアンカー配列（anchored sequence）、オリゴ（ｄＵ）ｎＸのアンカー配列、およびオリゴ（Ｕ）ｎＸのアンカー配列の中から選択される。）、ならびに、（６）サンプル中のＲＮＡの３’末端または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡの３’末端に付加されたオリゴヌクレオチドのタグに対して相補的な配列、からなる群より選択される配列を示し、ならびに／あるいは第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーは、特定の５’配列をさらに示す。特定の５’配列は、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの３’末端に示される配列の５’である。特定の５’配列は、この特定の５’配列に対して相補的な特定の３’配列を示す第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとして機能することができ、第二鎖ｃＤＮＡの特異的なプライミングのための部位を提供する。
特定の実施形態において、本方法は、ＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩを提供する工程、ならびにＲＮＡが消化される条件で十分な時間にわたって、第一鎖ｃＤＮＡを含有しているサンプルをＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩと接触させる工程をさらに包含している。他の実施形態において、本方法は、ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、ならびに二本鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、第一鎖ｃＤＮＡをＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程をさらに包含している（このような方法としては、工程（Ａ）にて提供されたアクセプタのオリゴヌクレオチドに対して相補的な第一鎖ｃＤＮＡの一部に対して相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、ならびに、二本鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを第一鎖ｃＤＮＡと接触させる工程をさらに包含している方法が挙げられる。ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼは、第一鎖ｃＤＮＡを合成するために提供されたＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと同一であるか、またはＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼは、第一鎖ｃＤＮＡを合成するために提供されたＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと異なる。
特定の実施形態において、アクセプタのオリゴヌクレオチドの５’部分、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分、または第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分は、ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータの一鎖に関する配列を示す。本方法は、ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータを用いてＲＮＡを合成し得るＲＮＡポリメラーゼを提供する工程、ＲＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、二本鎖ｃＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程をさらに包含している。この方法では、ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータの一鎖に関する配列がアクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー、または第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーにおいて示される。
いくつかの実施形態において、アクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡのプライマー、または第二鎖ｃＤＮＡのプライマーは、親和性分子を含んでいるか、または親和性分子に連結されている。そして、本方法は、親和性分子に特異的に結合可能な親和性に基づき結合する物質によって共有結合的または非共有結合的にコーティングされた固体表面を提供する工程、ならびに、親和性分子が、固体表面に連結された親和性に基づき結合する物質と結合される条件で十分な時間にわたって、親和性分子に化学的に連結された、アクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡのプライマーまたは第二鎖ｃＤＮＡのプライマーを、アクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡのプライマーまたは第二鎖ｃＤＮＡのプライマーが関与する工程の前または後のどちらか一方において、接触させる工程をさらに包含している。
さらなる実施形態において、合成されたそれぞれの５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡ、または第二鎖ｃＤＮＡは親和性分子を含んでおり、親和性分子を含んでいる５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡ、または第二鎖ｃＤＮＡは、この親和性分子を固定表面に結合されることによって捕捉、単離または精製される。この方法は、親和性分子を含んでいる、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡまたは第二鎖ｃＤＮＡを固体表面と、親和性分子と固体表面に付着した親和性に基づき結合する物質との結合が促進される試薬の存在下およびこの結合が促進される条件において接触させて、親和性分子を含んでいる、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡまたは第二鎖ｃＤＮＡをこの表面に結合させ、これによって、親和性分子を含んでいる、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡまたは第二鎖ｃＤＮＡを捕捉、単離または精製する工程を包含している。このような方法では、親和性分子がビオチンであり、親和性に基づき結合する物質がアビジンまたはストレプトアビジンであるか、親和性分子がジゴキシゲニンであり、親和性に基づき結合する物質がジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体であることが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本方法は、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（ＲＰＰ）と、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；核酸に対するピロホスファターゼ；デキャッピング酵素；キャッピング酵素；リガーゼ；アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド；ポリＡポリメラーゼ；ポリＵポリメラーゼ；ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）；第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮａｓｅＨ；第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）；５’エキソリボヌクレアーゼ（Ｘｒｎ）；ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）；および５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡ分子であって、これらの基のβまたはγのリン酸が標識されているもの、からなる群より選択される少なくとも１つの他の成分とを備えている。あるいは、このキットは、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））と、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、アルミニウム誘導性のＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、E. coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ（ＲＰＰＩ）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、またはShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ）））、アルカリホスファターゼ（例えば、ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、シュリンプのアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）、またはアークティック（Ａｒｃｔｉｃ）のアルカリホスファターゼ（New England Biolabs ,MA）；核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）；デキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、およびポックスウイルスまたはワクシニアウイルスのデキャッピング酵素（例えば、ワクシニアウイルスのデキャッピング酵素Ｄ９およびＤ１０））、キャッピング酵素（例えば、ポックスウイルスのキャッピング酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素、またはＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）キャッピング酵素のキット、（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））；ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド；ポリＡポリメラーゼ（例えば、例えば、E. coliのポリＡポリメラーゼ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）；ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）（例えば、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＲＴ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、ＡＭＶ ＲＴ、ＭＭＬＶ ＲＴ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））；第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮａｓｅＨ （例えば、E. coliのＲＮａｓｅＨまたはＨＹＢＲＩＤＡＳＥ（登録商標）ＲＮａｓｅＨ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ)；第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）（例えば、Ｔ７型のＲＮＡＰ（例えば、Ｔ７ＲＮＡＰ）、Ｔ３ＲＮＡＰ、またはＳＰ６ＲＮＡＰ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）；５’エキソリボヌクレアーゼ（例えば、ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼ（phosphate-dependent exonuclease）またはSaccharomyces cerevisaeのＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ（ＸｒｎＩ）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）；ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４ＰＮＫ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）；および５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡ分子であって、これらの基のβまたはγのリン酸が標識されているもの、からなる群より選択される少なくとも１つの他の成分とを備えている。また、本キットは、ＲＰＰが、アルミニウム誘導性のＲＰＰ、E. coliのＲＰＰＩ、およびShigellaのＲＰＰＩの中から選択され、上述した少なくとも１つの他の成分が、キットに備えられている場合、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１）であるＲＭＰ；ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ、シュリンプのアルカリホスファターゼおよびアークティックのアルカリホスファターゼの中から選択されるＡＰ；タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）である核酸に対するピロホスファターゼ；酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、ポックスウイルスのデキャッピング酵素およびワクシニアウイルスのデキャッピング酵素（例えば、ワクシニアウイルスのデキャッピング酵素Ｄ９およびＤ１０）の中から選択されるデキャッピング酵素；ポックスウイルスのキャッピング酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素およびＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）キャッピング酵素の中から選択されるキャッピング酵素；Ｔ４ＲＮＡリガーゼおよびバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼの中から選択されるＲＮＡリガーゼ；E. coliのポリＡポリメラーゼおよびSaccharomyces cerevisiaeのポリＡポリメラーゼの中から選択されるポリＡポリメラーゼ；ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴおよびＭＭＬＶ ＲＴの中から選択されるＲＴ；E. coliのＲＮａｓｅＨおよびＨＹＢＲＩＤＡＳＥ（登録商標）ＲＮａｓｅＨの中から選択されるＲＮａｓｅＨ；Ｔ７型のＲＮＡＰ、Ｔ７ＲＮＡＰ、Ｔ３ＲＮＡＰおよびＳＰ６ＲＮＡＰの中から選択されるＲＮＡＰ；ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼおよびSaccharomyces cerevisaeのＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ（ＸｒｎＩ）の中から選択される５’エキソリボヌクレアーゼ；またはＴ４ＰＮＫであるＰＮＫ、からなる群より選択されることを含んでいる。
他の実施形態において、本発明は、サンプル中の２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子の３’末端にポリ（Ａ）テールを付加するための方法を提供する。２’−ＯＭｅ基は、このＲＮＡ分子の３’末端のヌクレオチドに存在する。この方法は、少なくとも１つのモノヌクレオチド−５’−ホスフェート残基（５’−ＸＭＰ）（例えば、５’−ＡＭＰ）が２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子の３’末端に連結される条件で十分な時間にわたって、サンプルを、アデニル化されたモノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）（例えば、アデニル化されたアデノシン５’モノホスフェート、すなわちアデニル化されたジアデノシンピロホスフェート（Ａ５’ｐｐ５’Ａ））およびＴ４ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２、あるいは切断されたＴ４ＲＮＡリガーゼ２）とインキュベートする工程（Ａ）、ならびに、次いで、少なくとも１つのモノヌクレオチド−５’−ホスフェート残基（５’−ＸＭＰ）（例えば、５’−ＡＭＰ）が３’末端に連結された２’ＯＭｅ ＲＮＡ分子の３’末端にポリ（Ａ）テールが付加される条件で十分な時間にわたって、工程（Ａ）からのサンプルをポリメラーゼおよびＡＴＰと接触させる工程（Ｂ）を包含している。
いくつかの実施形態において、本発明は、ホモポリヌクレオチドのテール（すなわち、ポリ（Ｘ）テール）（例えばポリ（Ａ）テール）を、サンプル中の目的のＲＮＡ分子（３’末端のヌクレオチド上に２’ＯＭｅ基を有する目的のＲＮＡ分子、または３’末端のヌクレオチド上に２’ＯＭｅ基を欠いた目的のＲＮＡ分子が挙げられる。）の３’末端に付加するための方法を提供する。この方法は、ライゲーションのドナーであるアデニル化された５’−モノヌクレオチドの（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）（例えば、Ａ５’ｐｐ５’Ａ））からの５’−モノヌクレオチド（５’−ＸＭＰ）残基が、複数回、連続的にライゲーションによって移動された結果として、ホモポリマーのテール（ポリ（Ｘ）テール）（例えば、ポリ（Ａ）テール）が目的のＲＮＡ分子の３’末端に付加される条件で十分な時間にわたって、サンプルを、過剰なモル濃度のアデニル化された５’−モノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）（例えば、アデニル化されたアデノシン−５’−モノホスフェート、すなわちジアデノシンピロホスフェート（Ａ５’ｐｐ５’Ａ））およびＴ４ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２または切断されたＴ４ＲＮＡリガーゼ２）とインキュベートする工程を包含している。
〔図面の説明〕
図１は、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼによって触媒される反応の例を示す図である。
図２は、種々の５’末端の基を有するＲＮＡの基質に対する酵素の活性を示す図である。
図３は、図２に示した酵素によるＲＮＡ基質の反応を示す図である。
図４は、E. coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼの、ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。
〔発明の説明〕
本発明は、研究、ヒトまたは非ヒトの診断的応用、あるいはヒトまたは非ヒトの治療的応用に使用するための、所望のクラスまたはタイプの１つ以上のＲＮＡ分子の５’末端にタグを選択的に付加するための新規な方法、組成物およびキットに関する。各ＲＮＡのクラスは、特定の化学的な部分または基をＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドの５’の位置に有しているＲＮＡ分子からなる。「５’ライゲーションによりタグを付加する」と称される本方法の選択性は、１つ以上の特異的な酵素によってもたらされる。この酵素は、単独でまたは組み合わされて、所望のクラスのＲＮＡ分子のみを５’一リン酸を有するＲＮＡ分子へ選択的に変換する。５’一リン酸を有するＲＮＡ分子は、その後、ＲＮＡリガーゼを用いてアクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）に連結されるためのドナーとしての役割を果たすことができる。他の１つ以上の特異的な酵素は、単独でまたは組み合わされて、望まれないクラスのＲＮＡ分子のみを５’ヒドロキシルを有するＲＮＡ分子へ選択的に変換するが、５’ヒドロキシルを有するＲＮＡ分子は、アクセプタのオリゴヌクレオチドに連結されるためのドナーとしての役割を果たすことができない。例えば、新規の方法は、本出願人によって発見された新規の新しいクラスの酵素であるＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（ＲＰＰ）を用いて５’−キャッピングされたＲＮＡでなく、５’三リン酸を有するＲＮＡを５’一リン酸を有するＲＮＡへ選択的に変換し、次いで、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、５’一リン酸を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することについて開示している。また、出願人によって発見された本方法は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）を用いて、５’三リン酸を有するＲＮＡでなく、５’一リン酸を有するＲＮＡを、ライゲーションのドナーとしての役割を果たすことができない５’ヒドロキシルを有するＲＮＡへ選択的に変換することについて開示している。いくつかの実施形態において、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡは、（例えば、ＤＮＡの配列決定法のための、タグを付加されたテンプレートとして用いたり、クローン化、増幅または他の応用のための完全長のｃＤＮＡを作製したりするために）タグを付加された第一鎖ｃＤＮＡまたは二本鎖ｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとして使用される。ＤＮＡの配列決定法には、例えば、Roche 454、Illumina Solexa、または他の超並列的な配列決定用プラットホーム、あるいは“次世代”の配列決定用プラットホームが用いられる。いくつかの実施形態において、二本鎖ｃＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含んでいる。この場合、本方法は、例えば、ＲＴ−ｑＰＣＴに使用するため、マイクロアレイによる発現分析、プロモータの特定、ＲＮＡのプロセシングの分析、および５’ＲＡＣＥまたは３’ＲＡＣＥのための標的として使用するために、増幅されたセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを合成することをさらに包含している。
いくつかの実施形態において、本方法は、本出願人によって発見された、あるクラスの酵素（ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ）を使用する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、本出願人が設計した新規の細菌ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ酵素（ＲＰＰ）（「ＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ」（「ＲＰＰＩ」））を使用する方法を提供する。タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）とは異なり、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、キャッピングされたＲＮＡ（例えば、ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡ）の三リン酸の架橋を消化せずに、５’三リン酸化ＲＮＡ（5'-triphosphorylated RNA）または５’二リン酸化ＲＮＡ（5'-diphosphorylated RNA）を５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する（図１）。キャッピングされていない一次ＲＮＡまたは５’二リン酸化ＲＮＡをＲＮＡ５’ポリホスファターゼによって処理した後に、ＲＮＡリガーゼを用いて、β、γのリン酸基が脱リン酸化されたＲＮＡに、アクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）をタグとして付加することができる。
我々は、５’一リン酸基を有するＲＮＡを５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換するための、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）の新規な使用を本明細書においてさらに開示する。ＲＭＰは、５’一リン酸を有するＲＮＡ（例えば、ほとんどの真核生物の「マイクロＲＮＡ」、すなわち「ｍｉＲＮＡ」）を５’ヒドロキシルを有するＲＮＡへ変換する。その結果、５’ヒドロキシルを有するＲＮＡは、ライゲーションのためのドナーとしての役割を果たすことができず、５’ライゲーションによってタグを付加されない。ｍｉＲＮＡに加えて、大部分のリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）（１８Ｓおよび２６Ｓ、または２８Ｓの真核生物のｒＲＮＡ、あるいは１６Ｓおよび２３Ｓの原核生物のｒＲＮＡなど）も、５’一リン酸基を有している。出願人は、ＲＭＰ１がこれらのｒＲＮＡ分子から５’一リン酸基を除去し、この目的に使用することができることを見出した。しかし、出願人が見出した他のある方法は、ほとんどのサンプル中における大量のｒＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡは、ほとんどの細胞中において総ＲＮＡの約９５〜９８％を占める。）を除去するためのＲＭＰによる処理よりも、より効率的である。よって、いくつかの好ましい実施形態において、ｒＲＮＡは、本発明の方法において使用されるために提供されたサンプルから（例えば、Invitrogen Life Technologiesからの、ＲＩＢＯＭＩＮＵＳ（登録商標）キットを用いて）除去される。５’ライゲーションによるタグの付加に使用されるために提供されたサンプルが実質的にｒＲＮＡを含有しないようにする代わりの方法を用いてｒＲＮＡを除去することによって、ユーザーは、本方法を用いて、サンプル中にあまり存在しない５’−一リン酸を有する他のＲＮＡ分子（例えばｍｉＲＮＡ）に５’ライゲーションによりタグをより効果的に付加することができる。それ故、本明細書において得に言及しない限り、いくつかの好ましい実施形態において、５’一リン酸化ｒＲＮＡ分子は、本発明の方法の工程（Ａ）にて提供されたサンプルから実質的に除去されていることを理解される。
ＲＰＰおよびＲＭＰは、特定の基を５’末端に有するＲＮＡ分子の実質的に任意の所望の集団を、５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換するために、従来技術において既に公知の他の酵素と組み合わせて用いることができ、次いで、５’一リン酸基を有するＲＮＡに、ＲＮＡリガーゼを用いてアクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドと５’ライゲーションによりタグを付加することができる（例えば図２参照）。また、ＲＰＰおよびＲＭＰは、特定の基を５’末端に有するＲＮＡ分子の実質的に任意の所望の集団を、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換するために、単独でまたは従来技術において既に公知の他の酵素と組み合わせて用いることができる。５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡには、ＲＮＡリガーゼを用いてアクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドと５’ライゲーションによりタグを付加することができない。このように、単独でまたは従来技術において既に公知の他の酵素と組み合わせて用いられるＲＰＰおよびＲＭＰは、５’末端の基の性質に基づいて、ＲＮＡ分子の所望の集団に、高選択的に５’ライゲーションによりタグを付加するための新規な方法を提供する（例えば、図３参照）。本方法の種々の実施形態を以下に示す。しかし、当業者は、本明細書の記載に基づいて、ＲＰＰまたはＲＭＰを、ＲＮＡの５’末端を修飾する従来公知の他の酵素と組み合わせて用いて、特定の集団のＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための他の方法を知ったり、理解したりする。このような他の方法の全ては本発明の範囲に含まれる。
本発明の方法１は、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに、５’ライゲーションによりタグを付加するための方法である。この方法は、（ｉ）５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ（例えば、５’三リン酸基を有するＲＮＡまたは５’二リン酸基を有するＲＮＡ）を含有しているサンプル、（ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、Escherichia coliのＲＰＰＩまたはShigellaのＲＰＰＩ）、（ｉｉｉ）アクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）、ならびに（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）を提供する工程（Ａ）、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、ならびにアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成する条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）、を包含している。
方法１のいくつかの実施形態において、工程（Ａ）において提供されたサンプルは、望まれない５’一リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）をさらに含有しており、工程（Ｂ）において５’ポリリン酸基を有するＲＮＡを５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する前に、または工程（Ｃ）においてアクセプタのオリゴヌクレオチドをＲＮＡに連結する前に、本方法は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１、すなわちＲＭＰ１（EPICENTRE Technologies, Madison, WI））を提供する工程、および望まれないＲＮＡを含有しているサンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼと接触させて、望まれない５’一リン酸基を有するＲＮＡを脱リン酸化し、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡ生成する工程をさらに包含している。５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡは、アクセプタのオリゴヌクレオチドに連結されない（すなわち、５’ライゲーションによりタグを付加されない）。
したがって、本発明の方法２は、工程（Ａ）において、サンプルが５’一リン酸基を有するＲＮＡをさらに含有していること、工程（Ａ）が、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＭＰ１）を提供することをさらに包含していること、ならびに工程（Ｂ）が、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼと、サンプルをＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる前に接触させるサブ工程、およびＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去するサブ工程をさらに包含していること、を除いて方法１と同一である。
方法１または方法２のいくつかの実施形態において、工程（Ａ）において提供されたサンプルは、キャッピングされたＲＮＡまたは５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡからなる望まれないＲＮＡをさらに含有している。望まれないＲＮＡは、工程（Ｂ）において５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換されず、工程（Ｃ）において、オリゴヌクレオチドのアクセプタに連結されず、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが取得されない。
方法１または方法２のいくつかの実施形態（方法３と称する。）において、本方法は、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加する工程をさらに包含している。この方法は、核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素を提供するサブ工程、ならびにサンプル中のキャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換されて、これによって、工程（Ａ）において提供されたサンプルに含まれているキャッピングされたＲＮＡにも、工程（Ｃ）において５’ライゲーションによりタグが付加される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素と工程（Ｃ）の前に接触させるサブ工程、をさらに包含している。
本発明の方法４では、サンプルは、所望のキャッピングされたＲＮＡを含有しており、必要に応じて、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ（例えば、真核生物および／または原核生物の５’三リン酸基もしくは５’二リン酸基を有するＲＮＡ、またはキャッピングされていないプリｍｉＲＮＡまたはキャッピングされていないｍｉＲＮＡ前駆体）、および／または５’一リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を含有している。この方法は、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼを用いて、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡを５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換し、次いで、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡをＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させることによって得られた５’一リン酸基を有するＲＮＡと、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼによる処理の前から５’一リン酸基を有していたサンプル中のＲＮＡとの両方を、ＲＮＡ５’モノホスファターゼを用いて脱リン酸化する。このように、サンプル中のキャッピングされていない一次ＲＮＡおよび５’一リン酸化ＲＮＡを、５’ライゲーションによりタグを付加するための基質でない５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換する。次いで、ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去した後に、サンプルを核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ）またはデキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはＤ９およびＤ１０のワクシニアウイルスのデキャッピング酵素）と接触させて、キャッピングされたＲＮＡを、５’ライゲーションによりタグを付加するための５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する。異なる実施形態において、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡは、天然に生じるもの（例えば真核生物のｍＲＮＡ）であるか、または（例えば原核生物のｍＲＮＡを）キャッピング酵素を用いてインビトロにてキャッピングすることによって生成されたもののどちらか一方である。したがって、いくつかの実施形態において、５’ライゲーションによってタグを付加する方法は、（例えば真正細菌の系における）転写開始部位をマッピングするために有用である。現在、従来技術において公知のＣＡＧＥ法は、原核生物（例えば真性細菌）の転写産物の転写開始部位をマッピングすることができない。従来技術におけるオリゴキャッピング法と比べたときの、本発明の方法４の利点の１つは、必要に応じて、５’一リン酸基を有するＲＮＡを生成する各工程の後に、５’ライゲーションによりタグを付加するためのサンプルからアリコートを採取することによって、サンプル中の（５’末端の性質に基づく）各タイプのＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することができる。この方法は、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡまたはサンプル中の５’一リン酸を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、キャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することができる。
したがって、方法４は、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法である。この方法は、（ｉ）キャッピングされたＲＮＡ（例えば、ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡ）を含有しており、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ（例えば、５’三リン酸を有するＲＮＡおよび／または５’二リン酸基を有するＲＮＡ）および５’一リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を必要に応じて含有している、サンプル、（ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、E. coliのＲＰＰＩまたはShigellaのＲＰＰＩ）、（ｉｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＭＰ１）、（ｉｖ）核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、ＴＡＰ）またはデキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはＤ９およびＤ１０のワクシニアウイルスのデキャッピング酵素）、（ｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）、および（ｖｉ）ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）を提供する工程（Ａ）、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼと接触させる工程（Ｃ）、ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｄ）、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルを核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素と接触させる工程（Ｅ）、ならびにアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、工程（Ｅ）にて生成された５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されるが、工程（Ｂ）において５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡまたは工程（Ａ）において提供されたサンプル中に既に存在する５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されずに、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡがキャッピングされたＲＮＡから生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｅ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｆ）を包含している。
方法４のいくつかの実施形態において、サンプルは、工程（Ｆ）における５’ライゲーションによるタグを付加されない、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有している。
本発明の方法５は、キャッピングされたＲＮＡおよびキャッピングされていない一次５’ポリリン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法である。この方法は、（ｉ）キャッピングされたＲＮＡ（例えば、ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡ）および／または５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ（例えば、５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡ）を含有しているサンプル、（ｉｉ）核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、ＴＡＰ）、（ｉｉｉ）アクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）、ならびに（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）を提供する工程（Ａ）、キャッピングされたＲＮＡおよび５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、アルカリホスファターゼと接触していないサンプルを核酸に対するピロホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、ならびにアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）を包含している。
方法５のいくつかの実施形態において、サンプルは、工程（Ｃ）にて５’ライゲーションによりタグを付加される５’一リン酸基を有するＲＮＡ、または工程（Ｃ）にて５’ライゲーションによりタグを付加されない５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有している。
方法５は、従来技術におけるオリゴキャッピング法と異なっている。というのも、このオリゴキャッピング法は、５’三リン酸を有するＲＮＡを５’ヒドロキシルを有するＲＮＡへＡＰを用いて変換し、５’ヒドロキシルを有するＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼを用いた５’ライゲーションによりタグを付加する（オリゴキャッピング）ための基質として使用することができないからである。本方法５の利点は、この方法５が、５’三リン酸を有するＲＮＡおよび５’一リン酸を有するＲＮＡから、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成できることである。その結果、同一性（例えば配列）、（例えば、サンプル内の他のＲＮＡ分子と比較したときの、および／または１つ以上の他のサンプル中の他のＲＮＡと比較したときの）５’三リン酸化ＲＮＡ分子および５’一リン酸化ＲＮＡ分子の量または相対的な存在量、注釈、および生物学的な機能を分析することができる。キャッピングされていない５’三リン酸を有するＲＮＡまたはキャッピングされていない５’一リン酸を有するＲＮＡは、生物学的に重要な機能を有している可能性がある。一方、従来技術の方法と比較した場合に上記方法の欠点となり得ることは、サンプル中のＲＮＡをＡＰによって処理する工程がないので、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡ分子にも５’ライゲーションによりタグが付加されてしまい、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ分子が、特定の目的にとって興味のないものになってしまうかもしれないことである。
本発明の方法６は、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡおよび５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡの両方に、５’ライゲーションによりタグを付加するための方法である。この方法は、キャッピングされたＲＮＡ（例えば、ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡ）、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ（例えば、真核生物および／原核生物の５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡ）、および５’一リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を含有しているサンプル、（ｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＭＰ１）、（ｉｉｉ）核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、ＴＡＰ）、（ｉｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）、ならびに（ｖ）ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）を提供する工程（Ａ）、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｃ）、キャッピングされたＲＮＡおよび５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｃ）からのサンプルを核酸に対するピロホスファターゼと接触させる工程（Ｄ）、ならびに、アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、工程（Ｄ）にて生成された５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる（Ｅ）工程を包含している。
方法６のいくつかの実施形態において、サンプルは、工程（Ｅ）にて５’ライゲーションによりタグを付加されない、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有している。
方法６は、従来技術におけるオリゴキャッピング法と異なる。というのも、このオリゴキャッピング法は、５’三リン酸を有するＲＮＡを５’ヒドロキシルを有するＲＮＡへＡＰを用いて変換し、５’ヒドロキシルを有するＲＮＡは、ＲＮＡリガーゼを用いたオリゴキャッピングための基質として使用することができないからである。本方法６の利点は、この方法６が、（生物学的に重要な機能を有しているかもしれない）５’三リン酸基を有するＲＮＡから５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成することである。このように、キャッピングされていない５’三リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することによって、同一性（例えば配列）、他のＲＮＡ分子と比較したときの量または相対的な存在量（例えば、別のサンプル中の上記存在量と比較したときのサンプル内の上記存在量）、注釈、および生物学的な機能を分析することができる。本発明の他の利点の１つは、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡを、５’ライゲーションによってタグを付加されない５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換するＲＮＡ５’モノホスファターゼを使用することである。よって、この方法は、特定の目的にとって興味のない５’−一リン酸化ＲＮＡを除去するために用いることができる。
本発明の方法７は、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法である。この方法は、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ（例えば、５’三リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、原核生物のｍＲＮＡ）または５’二リン酸基を有するＲＮＡ）、および５’一リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を含有しているサンプル、（ｉｉ）キャッピング酵素（例えば、ＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）キャッピング酵素システム、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、（ｉｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＭＰ１、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）またはアルカリホスファターゼ（例えば、ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、シュリンプのアルカリホスファターゼ（USB, Cleveland, OH）、またはアークティックのアルカリホスファターゼ（New England Biolabs, MA））、（ｉｖ）核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、ＴＡＰ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））またはデキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはＤ９およびＤ１０のワクシニアウイルスのデキャッピング酵素ｓ）、（ｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）、ならびに（ｖｉ）ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）を提供する工程（Ａ）、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡがキャッピングされたＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをキャッピング酵素と接触させる工程（Ｂ）、５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼと接触させる工程（Ｃ）、工程（Ｃ）にて用いたＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｄ）、キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）の後のサンプルを核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素と接触させる工程（Ｅ）、ならびに、アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｅ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｆ）を包含している。
方法７のいくつかの実施形態において、サンプルは、工程（Ｆ）における５’ライゲーションによるタグを付加されない、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有している。
サンプルをキャッピング酵素によって処理することを包含している方法７の工程（Ｂ）は、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ（例えば、５’三リン酸基を有するＲＮＡ（原核生物の一次ＲＮＡなど）または５’二リン酸基を有するＲＮＡ）からキャッピングされたＲＮＡを生成する。次いで、工程（Ｃ）において、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を、ＲＮＡリガーゼによって５’ライゲーションによりタグを付加されない５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換する。最後に、キャッピングされたＲＮＡを５’一リン酸基を有するＲＮＡへ核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、ＴＡＰ）またはデキャッピング酵素を用いて変換し、そしてＲＮＡリガーゼを用いて５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加する。
本発明の方法８は、工程（Ａ）において提供されたサンプルが、キャッピングされたＲＮＡ（例えば、ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡ（例えば、真核生物のｍＲＮＡ））をさらに含有していること、および工程（Ｆ）において、本方法が、工程（Ａ）のサンプルに提供されたキャッピングされたＲＮＡと、工程（Ｂ）にてキャッピングされる、サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡとの両方から５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成することを除いて、１実施形態の方法７を包含している。方法８のいくつかの実施形態において、サンプルは、工程（Ｆ）における５’ライゲーションによるタグを付加されない、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有している。
核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、ＴＡＰ）が工程（Ａ）にて提供される上述した方法の何れかのいくつかの実施形態（例えば、方法４〜８のいくつかの実施形態）において、本方法は、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡおよび５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、キャッピングされたＲＮＡまたは５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡを含有しているサンプルを核酸に対するピロホスファターゼと接触させる工程の後に、核酸に対するピロホスファターゼを不活性化または除去する工程をさらに包含している。特定の実施形態に関して可能であれば、核酸に対するピロホスファターゼを不活性化することが好ましい。核酸に対するピロホスファターゼの不活性化は、反応混合物の条件を反応後に、核酸に対するピロホスファターゼが不活性であるが、本方法の次の工程に用いられる酵素が活性であるという新たな条件に変更することによって実施される。例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のβ−メルカプトエタノールおよび０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００から構成される反応混合物にて活性である。反応後に、ＴＡＰの反応混合物に、リン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）を終濃度が２０ｍＭになるまで添加することによってｐＨを約７．５に調整する。これによって、ＴＡＰを不活性化することができる。もちろん、本方法の次の工程に用いる酵素がこれらの条件下にて活性であることを確認することが重要である。
本発明の方法９は、サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに、５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡおよび５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法である。この方法は、（ｉ）少なくともキャッピングされたＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ（例えば、５’三リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、原核生物のｍＲＮＡ）または５’二リン酸基を有するＲＮＡ）、および５’一リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を含有しているサンプル、（ｉｉ）デキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはＤ９およびＤ１０のワクシニアウイルスのデキャッピング酵素ｓ）、（ｉｉｉ）アクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）、ならびに（ｉｖ）ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）を提供する工程（Ａ）、キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをデキャッピング酵素と接触させる工程（Ｂ）、ならびにアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）を包含している。
方法９のいくつかの実施形態において、サンプルは、工程（Ｃ）にて５’ライゲーションによりタグを付加されない、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有している。
本発明の方法１０は、サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡまたは５’一リン酸基を有するＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加することなく、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法である。この方法は、（ｉ）少なくとも、キャッピングされたＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡ（例えば、５’三リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、原核生物のｍＲＮＡ）または５’二リン酸基を有するＲＮＡ）、５’一リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）、および／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡを含有しているサンプル、（ｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＭＰ１（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））またはアルカリホスファターゼ（例えば、ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、シュリンプのアルカリホスファターゼ（USB, Cleveland, OH）、またはアークティックのアルカリホスファターゼ（New England Biolabs, MA））、（ｉｉｉ）デキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはＤ９およびＤ１０のワクシニアウイルスのデキャッピング酵素ｓ）、（ｉｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）、ならびに（ｖ）ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）を提供する工程（Ａ）、ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼが活性化され、ＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼが触媒する反応が完了され得る条件で十分な時間にわたって、サンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、工程（Ｂ）にて用いたＲＮＡ５’モノホスファターゼまたはアルカリホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｃ）、キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、サンプルをデキャッピング酵素と接触させる工程（Ｄ）、ならびに、アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、工程（Ｄ）にてキャッピングされたＲＮＡから生成された５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）からのサンプルをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｅ）を包含している。
方法１０のいくつかの実施形態において、サンプルは、工程（Ｅ）にて５’ライゲーションによりタグを付加されない、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有している。
デキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはＤ９およびＤ１０のワクシニアウイルスのデキャッピング酵素ｓ）が工程（Ａ）にて提供される上述した方法の何れかのいくつかの実施形態（例えば、方法４および７〜１０のいくつかの実施形態）において、本方法は、サンプル中のキャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、キャッピングされたＲＮＡを含有しているサンプルをデキャッピング酵素と接触させる工程の後に、デキャッピング酵素を不活性化または除去する工程をさらに包含している。特定の実施形態に関して可能であれば、デキャッピング酵素を不活性化することが好ましい。デキャッピング酵素の不活性化は、反応混合物の条件を反応後に、デキャッピング酵素が不活性であるが、本方法の次の工程に用いられる酵素が活性であるという新たな条件に変更することによって実施される。もちろん、本方法の次の工程に用いる酵素がこれらの条件下にて活性であることを確認することが重要である。
また、本発明は、方法１〜１０のいずれかの実施形態であって、工程（Ａ）において、５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）（例えば、Saccharomyces cerevisaeのＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ（ＸｒｎＩ）、ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））がさらに提供され、サンプル中の５’一リン酸基を有するＲＮＡが消化される条件で十分な時間にわたって、サンプルをＸＲＮと、工程（Ｂ）の前に接触させる、実施形態を包含している。
また、本発明は、方法１〜１０のいずれかの実施形態であって、工程（Ａ）において、５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）（例えば、Saccharomyces cerevisaeのＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ（ＸｒｎＩ）、ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））がさらに提供され、５’一リン酸を有するＲＮＡが消化される条件で十分な時間にわたって、サンプルをＸＲＮと、サンプル中に存在するＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される工程の後に接触させる、実施形態を包含している。これらの実施形態のいくつかにおいて、サンプルをＸＲＮと接触される工程は、上記反応における別の工程（サンプルをＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）と接触させる工程など）に取って代わる。
方法１〜１０のいずれかのいくつかの好ましい実施形態において、工程（Ａ）において提供されたサンプルは、本方法に使用される前に、リボソーマルＲＮＡ（例えば、１８Ｓおよび２６Ｓまたは２８Ｓの真核生物のｒＲＮＡ、あるいは１６Ｓおよび２３Ｓの原核生物のｒＲＮＡ）を除去するために（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮからのＲＩＢＯＭＩＮＵＳ（登録商標）のｒＲＮＡ除去キットまたは別の適切な方法を用いて）処理される。プロトコール（ＲＩＢＯＭＩＮＵＳキットのためのプロトコールなど）を用いてリボソーマルＲＮＡを除去することによって、本発明の方法を用いてサンプル中の目的のＲＮＡ分子（５’一リン酸基を有する目的のＲＮＡ分子が挙げられる。）を容易に分析することができる。
本発明の方法１１は、方法１〜１０のいずれかの実施形態を包含しており（方法１〜１０の任意の実施形態が挙げられる。）、サンプル中の目的のＲＮＡ分子の少なくともいくつかがポリ（Ａ）テールを有していない。この方法は、ポリ（Ａ）テールを、目的のＲＮＡ分子の３’末端に付加する工程をさらに包含している。
いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）テールを付加する方法は、ポリＡポリメラーゼ（例えば、Escherichia coliのポリＡポリメラーゼまたはSaccharomycesのポリＡポリメラーゼ）およびＡＴＰを提供する工程、ならびにサンプル中のＲＮＡ分子の３’末端にポリ（Ａ）テールが付加されて、ポリ（Ａ）テールを有するＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、サンプルをポリＡポリメラーゼおよびＡＴＰと接触させる工程を包含している。
しかし、本出願人は、２’−Ｏ−メチル基（２’ＯＭｅ）を３’末端のヌクレオチドに有しているＲＮＡ分子（例えば、植物ｍｉＲＮＡ、生殖細胞特異的ｐｉｗｉＲＮＡ、内因性ｓｉＲＮＡ）が、E. coliまたはSaccharomycesのポリＡポリメラーゼを用いてもインビトロにてアデニル化されにくいか、アデニル化されないことを発見したが、これは不幸なことである。なぜなら、このような２’Ｏにメチル基が付加されたＲＮＡ（「２’ＯＭｅ−ＲＮＡ」とも称する。）の存在量のプロフィールを作成したり、これらのＲＮＡの機能を特定したり、探究、医学的応用および農業的応用のためにこれらのＲＮＡを用いたりするためにこれらのＲＮＡを調査することに現在、非常に関心がもたれているからである。このような２’ＯＭｅ−ＲＮＡをポリアデニル化すれば、第一鎖ｃＤＮＡを合成したり、その後の他の操作（増幅（例えばＲＮＡの増幅）が挙げられる。）を行ったりするためのプライミング部位を付加することが可能になるし、および／あるいは（次世代または古い世代のシークンシング法（例えばサンガーのシーケンシング法）のためのテンプレートを調製するための）第一鎖ｃＤＮＡまたは二本鎖ｃＤＮＡに配列決定用タグドメインを付加するためのプライミング部位を付加することが可能になる。出願人は、過剰なモル濃度の精製されたジアデノシンピロホスフェート（Ａ５’ｐｐ５’Ａ、アデノシン−５’−モノホスフェートのアデニル化された形態）を、２’ＯＭｅ−ＲＮＡ（例えば、化学的に合成された２’ＯＭｅ−オリゴリボヌクレオチド（IDT, Coralville, IA）、例えば、ｍｉＲ１７３［２’ＯＭｅ］と同一である２’ＯＭｅ−オリゴリボヌクレオチド、Arabidopsis thalianaの２’ＯＭｅ−ｍｉＲＮＡ）およびＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２（EPICENTRE, Madison, WI）とインキュベートした結果、１個または２個のアデノシンのヌクレオチドが３’末端の３’の位置に連結した２’ＯＭｅ−オリゴリボヌクレオチドがほぼ定量的に合成され、次いで、ポリ（Ａ）テール（例えば、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライミング部位としての役割を果たすに適切なポリ（Ａ）テール）が、これらのアデノシンのヌクレオチドによって伸長された２’ＯＭｅ−オリゴリボヌクレオチド分子のほぼ１００％に、製造業者（EPICENTRE, Madison, WI， USA）の指示書に従ったインビトロでの反応にてポリＡポリメラーゼを用いて付加されることを観察している。したがって、サンプル中の５’ライゲーションによりタグを付加されることが望まれるＲＮＡの少なくともいくつかが、３’末端のヌクレオチドに２’ＯＭｅ基を有しており、ポリ（Ａ）テールを付加する工程が、ポリＡポリメラーゼを用いることを包含している方法１１の特定の１実施形態において、本方法は、サンプルをポリＡポリメラーゼおよびＡＴＰと接触させる工程の前に、２’ＯＭｅ基を３’末端のヌクレオチドに有するＲＮＡを含有しているサンプルを、ジアデノシンピロホスフェート（Ａ５’ｐｐ５’Ａ）およびＴ４ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２）と、ＡＴＰまたはＮＡＤの非存在下で、少なくとも１つのアデノシン残基が少なくとも「２’ＯＭｅ基を３’末端のヌクレオチドに有するＲＮＡ」の３’末端に付加される条件で十分な時間にわたって、インキュベートする工程をさらに包含している。
予期せぬことに、本出願人は、２’ＯＭｅ基を３’末端のヌクレオチドに有する目的のＲＮＡを含有しているサンプル（または、２’ＯＭｅ基を３’末端のヌクレオチドに有していない目的のＲＮＡを含有しているサンプル）を、ジアデノシンピロホスフェート（Ａ５’ｐｐ５’Ａ）およびＴ４ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２）と、より長い反応時間にわたってインキュベートした結果、複数のアデノシンが、２’ＯＭｅ基を３’末端のヌクレオチドに有していたＲＮＡに付加されたことをさらに発見した。例えば、実験の１つでは、過剰なモル濃度のジアデノシンピロホスフェート（Ａ５’ｐｐ５’Ａ）およびＴ４ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２）と４時間、反応する間に、およそ１５個〜２０個のアデノシンが５’三リン酸化ＲＮＡ分子（５１ｍｅｒ）のほぼ全てに付加された。したがって、いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）テールをサンプル中の目的のＲＮＡ分子の３’末端に付加する方法１１は、複数のアデノシンを含んでいるポリ（Ａ）テールまたは複数のアデノシンからなるポリ（Ａ）テールが目的のＲＮＡ分子の３’末端に付加される条件で十分な時間にわたって、目的のＲＮＡ分子を含有しているサンプルを過剰なモル濃度のジアデノシンピロホスフェート（Ａ５’ｐｐ５’Ａ）およびＴ４ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２）とインキュベートする工程のみを包含している。
本出願人は、複数のアデノシンを含んでいるポリ（Ａ）テールまたは複数のアデノシンからなるポリ（Ａ）テールが上述したＲＮＡの３’末端に付加される条件で十分な時間にわたって、目的のＲＮＡ分子を含有しているサンプルを過剰なモル濃度のジアデノシンピロホスフェート（Ａ５’ｐｐ５’Ａ）およびＴ４ＲＮＡリガーゼと、インキュベートする工程を包含している方法は、従来技術にて以前から記載されていない新規な方法であると考えている。なお、上記目的のＲＮＡ分子は、例えば、２’ＯＭｅ基を３’末端のヌクレオチドに有するＲＮＡを含んでいる。あるいは、この目的のＲＮＡ分子は任意のＲＮＡ分子を１つ以上含んでおり、任意のＲＮＡ分子は２’ＯＭｅ基を有していてもよいし、有していなくてもよい。Ｔ４ＲＮＡリガーゼは、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２（切断されたＴ４ＲＮＡリガーゼ２が挙げられる。）である。さらに、本出願人は、このような新規な方法は、目的のＲＮＡ分子の５’末端にアクセプタのオリゴヌクレオチドを連結して、５’ライゲーションによりタグを付加するための本方法に関連していないとしても特許性を有していると考えている。
このように、１実施形態の本発明は、ポリ（Ａ）テールをサンプル中の２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子の３’末端に付加するための一般的な方法である。この方法は、少なくとも１つのモノヌクレオチド−５’−ホスフェート残基（５’−ＸＭＰ）（例えば、５’−ＡＭＰ）が２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子の３’末端に連結される条件で十分な時間にわたって、サンプルをアデニル化されたモノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）（例えば、アデニル化されたアデノシン５’モノホスフェート、すなわち、ジアデノシンピロホスフェート（Ａ５’ｐｐ５’Ａ））およびＴ４ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２、または切断されたＴ４ＲＮＡリガーゼ２）とインキュベートする工程（ａ）、ならびに、次いで、３’末端にモノヌクレオチド−５’−ホスフェート残基（５’−ＸＭＰ）（例えば、５’−ＡＭＰ）が少なくとも１つ連結された２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子の３’末端にポリ（Ａ）テールが付加される条件で十分な時間にわたって、工程（ａ）からのサンプルをポリＡポリメラーゼおよびＡＴＰと接触させる工程（ｂ）を包含している。
したがって、別の実施形態の本発明は、ホモポリヌクレオチドのテール（すなわち、ポリ（Ｘ）テール）（例えばポリ（Ａ）テール）をサンプル中の目的のＲＮＡ分子（２’ＯＭｅ基を３’末端のヌクレオチドに有する目的のＲＮＡ分子、または２’ＯＭｅ基を３’末端のヌクレオチドに有していない目的のＲＮＡ分子が挙げられる。）の３’末端に付加するための一般的な方法である。この方法は、ライゲーションのドナーであるアデニル化された５’−モノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）（例えば、Ａ５’ｐｐ５’Ａ））から、５’−モノヌクレオチド（５’−ＸＭＰ）残基が複数の連続的なライゲーションによって目的のＲＮＡ分子の３’末端に移動された結果として、ホモポリマーのテール（ポリ（Ｘ）テール）（例えば、ポリ（Ａ）テール）が目的のＲＮＡ分子の３’末端に付加される条件で十分な時間にわたって、サンプルを過剰なモル濃度のアデニル化された５’−モノヌクレオチド（Ａ５’ｐｐ５’Ｘ）（例えば、アデニル化されたアデノシン−５’−モノホスフェート、すなわちジアデノシンピロホスフェート（Ａ５’ｐｐ５’Ａ））およびＴ４ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ＲＮＡリガーゼ２もしくは切断されたＴ４ＲＮＡリガーゼ２）とインキュベートする工程を包含している。
方法１１のいくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）テールが、方法１〜１０のいずれかにて生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに付加される。方法１１のいくつかの他の実施形態において、ポリ（Ａ）テールをサンプル中のＲＮＡに付加する工程は、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成する前に実施される。
方法１１のいくつかの実施形態において、５’ライゲーションによりタグを付加するためのアクセプタのオリゴヌクレオチドは、５’キャップヌクレオチドを有するアクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、本方法は、ポリ（Ａ）テールを有する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを用いて真核細胞を形質転換して、５’ライゲーションによりタグを付加されたポリ（Ａ）テールを有するＲＮＡを真核細胞にて発現させる工程をさらに包含している。これらの実施形態のいくつかにおいて、５’ライゲーションによりタグを付加されたポリ（Ａ）テールを有するＲＮＡは、サンプル中の、タンパク質をコードするＲＮＡ（原核生物のｍＲＮＡを含んでいるＲＮＡ）から生成されたものであり、このタンパク質が真核細胞にて発現する。
方法１１のさらに別の実施形態において、異なるホモポリマーのテールをサンプル中の３’末端に付加する酵素が方法１〜１０のいずれかに用いられる。例えば、ポリ（Ｕ）テールもしくはポリ（Ｃ）テールもしくはポリ（Ｉ）テールをサンプル中のＲＮＡの３’末端に付加することをもたらす酵素および反応条件を用いることができる。この場合、ホモポリマーのテールにアニールする適切なプライマーを本明細書にて説明する実施形態に用いることができる。プライマーは、本方法に提供され、本方法にて用いられる。ポリＵポリメラーゼ活性を有する酵素は、従来技術において記載されている（例えば、Kwak, Jae Eun and Wickens, M, RNA 13: 860-867, 2007）ホモポリマーのヌクレオチドのテールをサンプル中のＲＮＡの３’末端に付加することができる酵素を、本発明の方法１〜１０のいずれかのために用いることができる。
方法１１は、サンプル中のＲＮＡが異なる配列を示す種々の異なるＲＮＡ分子を含んでいるとしても、ポリ（Ａ）テールまたは別のホモポリマーのテールをサンプル中のＲＮＡの３’末端に付加することによって、サンプル中の全ＲＮＡ分子から第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライミング部位を提供するので、有利であり得る。また、ポリ（Ａ）テール（または別のホモポリマーのテール）がサンプル中のＲＮＡ（または方法１〜１０のいずれかにて生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ）の３’末端に付加されるので、このテールを第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーのプライミング部位として用いることによって、完全長の第一鎖ｃＤＮＡを少なくとも生成できる可能性がある。このようなことは、ＲＮＡまたは５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ内の内部配列がプライミング部位として用いられた場合、起こらない。
ポリ（Ａ）テールまたは他のホモポリマーのテールがサンプル中のＲＮＡ、または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに付加される本明細書に記載の本発明の方法のこれらの実施形態において、用語「５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ」はポリ（Ａ）テールまたは他のホモポリマーのテールを３’末端に有する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡをいうことを本明細書において理解される。
本発明のさらに他の実施形態は、タイプに特異的な、条件に特異的な、または環境に特異的な、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡのみを取得するための方法およびキットを提供する。このようなタイプに特異的な、条件に特異的な、または環境に特異的な、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡは、あるタイプまたは条件または環境の細胞中の５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡであって、別のタイプまたは条件または環境の細胞中のＲＮＡと同一のものを除くことによって、取得される。
したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、ある状態の細胞、ある条件の細胞またはある環境の細胞からのＲＮＡを含有していた第１のサンプルから生成した５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに、第２の状態の細胞、第２の条件の細胞または第２の環境の細胞からのＲＮＡを含有していた第２のサンプルから調製した過剰量のｃＤＮＡをアニールする工程、ならびにｃＤＮＡがアニールされた、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが消化され、ｃＤＮＡがアニールされていない、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが消化されないことによって、ｃＤＮＡと相同な５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが除かれる条件で十分な時間にわたって、ｃＤＮＡがアニールされた、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡをＲＮａｓｅＨと接触させる工程をさらに包含している。いくつかの実施形態において、第１のサンプルからの５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡは、親和性分子が付着または連結したアクセプタのオリゴヌクレオチドを用いて生成されたものである。この場合、上述の除く工程の後に残留する第１のサンプルからの５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡは、第１のサンプルからの５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを含有しているサンプルを、親和性分子と結合することができる親和性に基づき結合する物質が付着した固体表面と接触させる工程の後に回収される。このサンプルを固体表面と接触させることは、親和性分子が、この表面に付着した親和性に基づき結合する物質に結合されることによって除かれる条件で十分な時間にわたって行われる。いくつかの実施形態において、親和性分子がビオチンであり、固体表面に付着した親和性に基づき結合する物質がアビジンまたはストレプトアビジンである。
したがって、いくつかの実施形態の本発明は、あるサンプル中のＲＮＡから５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成するための方法を提供し、上記あるサンプルは、第２のサンプル中のＲＮＡと共通するＲＮＡが除かれたものである。例えば、本発明の方法１２は、方法１〜１１のいずれかの実施形態を包含しており、サンプルが、第１のタイプの細胞、第１の条件の細胞または第１の環境からの細胞に由来するＲＮＡを含有している第１のサンプルを含んでいる。この方法は、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡから、第２のタイプの細胞、第２の条件の細胞、第２の環境からの細胞に由来する第２のサンプル中にも存在するＲＮＡを除くことによって、第１のサンプル中のみに存在するが、第２のサンプル中には存在しないＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ分子の集団を生成することになる。この方法は、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、および第２のタイプの細胞、第２の条件の細胞、または第２の環境からの細胞に由来するＲＮＡを含有している第２のサンプルを提供する工程（ｉ）、第２のサンプル中のＲＮＡを逆転写することによって第一鎖ｃＤＮＡを調製する工程（ｉｉ）、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡと第２のサンプルからのＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡとの間に、ハイブリダイズした複合体が形成される条件で十分な時間にわたって、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを、第２のサンプルからのＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡとアニールさせる工程（ｉｉｉ）、ｃＤＮＡがアニールしたＲＮＡが消化され、第１のサンプル中にのみ存在するが、第２のサンプル中には存在しないＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡからなる、除かれた５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、ハイブリダイズした複合体をＲＮａｓｅＨによって処理する工程（ｉｖ）、ならびにこの除かれた５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを取得する工程（ｖ）を包含している。方法１２のいくつかの実施形態において、本方法は、工程（ｉｖ）の後に、ＲＮａｓｅＨを不活性化または除去する工程をさらに包含している。好ましい実施形態において、ＲＮａｓｅＨは加熱によって不活性化される。
方法１３は方法１２の１実施形態であり、第１のサンプル中のＲＮＡから５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成するために工程（Ａ）に提供されるアクセプタのオリゴヌクレオチドが、親和性分子を含んでいる。この方法は、親和性分子と結合することができる親和性に基づき結合する物質が付着した固体表面を提供する工程、ならびに第１のサンプルからの５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが、親和性に基づき結合する物質が付着した固体表面に結合されて、第１のサンプル中のＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが固体表面に捕捉される条件で十分な時間にわたって、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを固体表面と工程（ｉｖ）の前または後のどちらか一方において接触させる工程をさらに包含している。
したがって、除かれた５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成し、捕捉するための方法１２および１３は、それぞれ、サンプル中の細胞のタイプに特異的な（すなわち、「タイプに特異的な」）、サンプル中の細胞が曝された条件に特異的な（すなわち、「条件に特異的な」）、またはサンプル中の細胞が取得された環境に特異的な（すなわち、「環境に特異的な」）、ＲＮＡ分子の集団を含有しているサンプルを取得する方法を提供する。このＲＮＡ分子の集団（「除かれたＲＮＡ」または「除かれた５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ」と称することもある。」は、さらなる分析または使用にとって有用である。例えば、除かれたＲＮＡは、（例えば、アフィメトリクス（Affymetrix）（Agilent, Illumina）、またはニブルジェンシステムズマイクロアレイチップ（NimbleGen Systems microarray chip）での分析によって）同定され得る。あるいは、除かれたＲＮＡは、（例えば、従来技術におけるサンガーのジデオキシ法や、「ＮｅｘＧｅｎ」の配列決定法のいずれか（Ｒｏｃｈｅからの４５４シークエンサー、Ｉｌｌｕｍｉｎａからのソレキサシークエンサー（Solexa sequencer）、Applied Biosystemsからのソリッドシークエンサー（Solid sequencer）または従来技術における他の任意のシークエンサーおよびシステム）を用いた）配列決定のためのテンプレートとして用いるための第一鎖ｃＤＮＡを調製するための用いられ得る。いくつかの実施形態において、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡは、５’末端に、（例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４Ａのシークエンスアダプターまたはその相補体のための）配列決定用のタグのドメインを示すタグを有しており、第一鎖ｃＤＮＡは、第２の配列決定用のタグのドメインを示す、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーを用いて合成し、これによって、（例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４のプラットホームにて配列決定用のテンプレートとして用いるための）５’および３’にタグが付加された適切な第一鎖ｃＤＮＡ分子を提供する。
さらに、除かれたＲＮＡがある条件を有する細胞（癌細胞など）、あるいは別の臓器の疾患に由来する細胞、あるいは細菌、マイコプラズマ、真菌またはウイルスの病原体に感染された細胞に由来する場合、除かれたＲＮＡは、薬学的な薬物の標的として可能性のある集団を含んでいる。このような集団は、さらに検証されれば、疾患の症状を軽減するか、または疾患を治療する可能性を秘めている医薬を開発するために用いることができる。もちろん、検証された、条件に特異的な標的を、ヒトまたは動物の診断のための検査、アッセイおよびキットを開発するために用いることもできる。また、除かれたＲＮＡは研究にとっても有用である。例えば、１実施形態において、癌の進行を理解したり、治療法および処置を開発したりするために、癌幹細胞からの除かれたＲＮＡを、同一のタイプの正常な細胞からの除かれたＲＮＡ、および／または癌の病変からの幹細胞でない他の癌細胞からの除かれたＲＮＡと比較する。さらに別の実施形態において、除かれたＲＮＡを、キャッピングされ、ポリアデニル化されたＲＮＡを合成するために用いる。このキャッピングされ、ポリアデニル化されたＲＮＡを、疾患を予防または処置するためのワクチンとして使用するための、ＲＮＡを備えた抗原提示細胞（ＡＰＣ）を作製するためにさらに用いる。例えば、いくつかの実施形態において、患者からの腫瘍に由来する癌幹細胞からの除かれたＲＮＡを用いて、同じ患者から調製した樹状細胞の形質転換に用いるためのキャッピングされ、ポリアデニル化されたＲＮＡを作製する。腫瘍に特異的なＲＮＡを備えた樹状細胞はこの腫瘍に特異的な抗原を提示する。腫瘍抗原を提示する樹状細胞は、患者における細胞性免疫反応の誘導を試みるためのワクチンを作製するために、活性化されて用いられる。さらに別の実施形態において、腫瘍抗原を提示する樹状細胞は、培養液中にて細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製するために用いる。このＣＴＬは、患者を処置するための免疫療法のワクチンとして患者に（例えば、静脈内に、皮下に、筋肉内に、腹腔内に、または他の送達経路を介して）投与される。さらに他の実施形態において、除かれたＲＮＡを用いて、タイプに特異的なまたは条件に特異的なタンパク質またはポリペプチドをインビトロの翻訳によって作製する。このタンパク質またはポリペプチドを、疾患を予防または処置するための免疫療法のワクチンを作製するための抗原として使用することができる。
さらに、除かれたＲＮＡが、特定の環境からの細胞（例えば、環境サンプルからの原核のまたは真核の微生物生物）を含有しているサンプルに由来する場合、上述した方法は、核酸分子を同定（例えば、配列決定を）したり、（（例えば、マイクロアレイ、デジタルの次世代の配列決定法、または他の方法を用いて）例えば、あるサンプルからのまたはあるサンプルに由来する１つ以上核酸分子の存在量を測定し、別のサンプル中のこの核酸分子の存在量と比較することによって）核酸分子の相対的な存在量を定量または決定したり、注釈付けを行ったり、上記環境サンプル中に発現した核酸分子の生物学的な機能を発見したりするために用いることができる。また、この場合、上述した方法は、環境サンプルの上述の態様を、（時期が異なるが、同一の場所および環境に由来するものであってもよいし、異なる場所および環境に由来するものであってもよい）他の環境サンプルの上述の態様と比較するために用いることができる。このように、上記方法は、種々のメタトランスクリプトミックな研究（探究、または工業的な応用もしくは商業的な応用に有用な遺伝子の同定が挙げられる。）に用いることができる。
本発明の方法１４は、方法１〜１３のいずれかの実施形態を包含しており、この方法は、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡからの第一鎖ｃＤＮＡを合成することをさらに包含している。この方法は、ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、および第１鎖の５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡをＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程をさらに包含している。
方法１４のいくつかの実施形態において、サンプル中のＲＮＡに対して相補的な第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーは、ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを用いる第一鎖ｃＤＮＡの合成に提供されない。理論に縛られること無く、これらの実施形態において、ｃＤＮＡは、おそらく分子間または分子内のプライミングによって合成される。いくつかの実施形態において、合成されるｃＤＮＡは二本鎖である。理論に縛られること無く、二本鎖ｃＤＮＡはおそらく（例えば、第二鎖ｃＤＮＡの合成をプライミングするためのｃＤＮＡにアニールされるＲＮＡを用いた）分子間のプライミングによって、または（例えば、第二鎖ｃＤＮＡの合成をプライミングするための第一鎖ｃＤＮＡの３’末端におけるヘアピンを用いた）分子内のプライミングによって合成される。
方法１４の他の実施形態において、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが、テンプレートとしての５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを用いて第一鎖ｃＤＮＡの合成をプライミングするために提供される（５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡは、３’末端に、任意のポリ（Ａ）テールまたは他のホモポリマーのテール、あるいはオリゴヌクレオチドのタグのシーケンスを含んでいる。）。したがって、方法１５は、方法１４を包含している。方法１５は、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的な第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーを提供する工程、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程をさらに包含している。
方法１６は、方法１５の実施形態を包含している。方法１６において、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーは、配列を含んでおり、この配列の少なくとも３’末端が、（１）インビボにおける細胞においてまたはインビトロにおいて、サンプル中のＲＮＡの３’末端または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡの３’末端に転写後に付加されたホモポリマーの配列に対して相補的な配列、（２）１つ以上のＲＮＡ分子の３’末端における公知の配列に対して相補的な配列、（３）１つ以上のＲＮＡ分子の１つ以上の内部領域に対して相補的な配列（例えば、１つ以上の特定の内部配列に対して相補的な配列）、（４）全ての可能な配列の集合であって、各配列がランダムである集合（例えば、ランダムヘキサマーの配列またはランダムノナマーの配列が挙げられる。このようなランダムヘキサマーの配列またはランダムノナマーの配列には、ＲＮＡ内の全ての配列に対して相補的なプライマーが少なくとも１つ存在している。）、（５）ポリ（Ａ）テールに対して相補的な配列（例えば、任意の長さの、オリゴ（ｄＴ）ｎの配列、オリゴ（ｄＵ）ｎの配列、オリゴ（Ｕ）ｎの配列、オリゴ（ｄＴ）ｎＸのアンカー配列、オリゴ（ｄＵ）ｎＸのアンカー配列、およびオリゴ（Ｕ）ｎＸのアンカー配列の中から選択される。「ｎ」は、約６〜約２４のヌクレオチドであることが好ましく、「Ｘ」はｄＧ、ｄＣ、およびｄＡのヌクレオチドの混合物であることが好ましい。）、ならびに（６）サンプル中のＲＮＡの３’末端または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡの３’末端に付加されたオリゴヌクレオチドのタグに対して相補的な配列、からなる群から選択される配列を示す。
方法１６のいくつかの好ましい実施形態において、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーは、目的のＲＮＡの３’末端における、ポリ（Ａ）テールまたは他のホモポリマーのテールの配列、あるいはオリゴヌクレオチドのタグの配列に対して相補的である。これらの実施形態は、ＲＮＡ分子の３’末端にアニールする第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが完全長の第一鎖ｃＤＮＡを合成することができる可能性があるので、いくつかの応用にとって好ましい。次いで、二本鎖ｃＤＮＡを作製するために第一鎖ｃＤＮＡを用い、第二鎖ｃＤＮＡが、目的のＲＮＡの５’末端に連結されたアクセプタのオリゴヌクレオチドに対して順に相補的な第一鎖ｃＤＮＡの一部に対して相補的である場合、二本鎖ｃＤＮＡも完全長であり、目的のＲＮＡ分子の真の５’末端および３’末端に対応する配列を含んでいる。いくつかの実施形態におい、ポリ（Ａ）テールをプライミングするための方法は、ポリ（Ａ）テールが、集団内のＲＮＡが異なる配列を含んでいたとしても、これらのＲＮＡの全てに付加され得るので、好ましい。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、サンプル中に天然に生じるもの（例えば、真核生物のｍＲＮＡ（オリゴ（ｄＴ）によって選択されたポリ（Ａ）テールを有する真核細胞のｍＲＮＡが挙げられる。））である。これらの実施形態は、例えば、（クローン化のため、アレイまたはマイクロアレイを用いた遺伝子発現の分析のため、あるいは配列決定のため、あるいは他の分析のために）サンプル中の１つ以上の（全てが挙げられる。）完全長のＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）からｃＤＮＡを作製するに有用である。
方法１６の他のいくつかの実施形態において、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーは、サンプル中のＲＮＡ内の公知の配列に対して相補的である（例えば、ＲＮＡのコード領域の３’末端における公知の配列に対して相補的である。）。この場合、この方法は、特定の遺伝子の発現分析またはクローン化のために、特定のｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製することに有用である。
方法１６の他の実施形態において、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーは、ランダムな配列を示す（例えば、ランダムヘキサマーまたはランダムノナマーのプライマー）。この場合、この方法は、分解したＲＮＡ（ホルマリンによって固定した、パラフィンに包埋された組織切片からの、分解したｍＲＮＡなど）からｃＤＮＡを作製することに用いられる。この方法は、例えば、組織切片における遺伝子の発現分析またはクローン化のために用いられる。また、ランダムな配列を示す第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーは、ｃＤＮＡを作製するための実施形態に用いることもでき、この場合、ＲＮＡの配列は知られていないか、ＲＮＡが異なる配列を示す複数の異なるＲＮＡ分子を含んでいる。
本発明の方法１７は、方法１６の実施形態のいずれかを含んでおり、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが、特定の５’配列をさらに示す方法である。この特定の５’配列は、このプライマーの３’末端に示される配列の５’である。特定の５’配列は、この特定の５’配列に対して相補的な特定の３’配列を示す第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとしての役割を果たすことができ、第二鎖ｃＤＮＡが特異的にプライミングするための部位を提供する。いくつかの実施形態において、特定の５’配列は、１つ以上のタグのドメインを示すタグを含んでいるか、またはこのタグからなる。タグのドメインとしては、例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４配列決定用のプラットホームを用いた超並列的なＤＮＡ配列決定用の、Ｒｏｃｈｅ ４５４の配列決定用のアダプターを示す配列決定用のタグのドメインなどが挙げられる。
本発明の方法１８は、方法１４〜１７のいずれかの実施形態を含んでいる。この方法は、ＲＮａｓｅＨ（例えば、Escherichia coliのＲＮａｓｅＨ、またはＨＹＢＲＩＤＡＳＥ（登録商標）熱安定性のＲＮａｓｅＨ、（EPICENTRE, Madison, WI））およびＲＮａｓｅＩ（例えば、Escherichia coliのＲＮａｓｅＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））を提供する工程、ならびにＲＮＡが消化される条件で十分な時間にわたって、第一鎖ｃＤＮＡを含有しているサンプルをＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩと接触させる工程をさらに包含している。
方法１８は、第一鎖ｃＤＮＡを合成した後の、ハイブリダイズしていないＲＮＡおよびＲＮＡのテンプレートを除去するために用いられる。方法１８のいくつかの好ましい実施形態において、この方法は、ＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩを不活性化または除去する工程をさらに包含している。いくつかの実施形態において、ＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩは、次の工程に進む前に、反応を加熱する（例えば、E. coliのＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩの場合、約１５〜３０分間、７０℃で加熱する）ことによって不活性化される。ＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩによる処理の後に、ＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩの存在が有害でない１つ以上の他の工程が実施されるという方法のいくつかの実施形態において、ＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩを不活性化または除去する工程が省略される。
本発明の方法１９は、方法１４〜１８のいずれかの実施形態を含んでおり、この方法は、ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、および二本鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、第一鎖ｃＤＮＡをＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程を包含している。
方法２０は、方法１４〜１９のいずれかの実施形態を含んでおり、この方法は、二本鎖ｃＤＮＡを合成することをさらに包含している。この方法は、工程（Ａ）にて提供されたアクセプタのオリゴヌクレオチドに対して相補的な第一鎖ｃＤＮＡの一部に対して相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、ならびに二本鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを第一鎖ｃＤＮＡと接触させる工程をさらに包含している。
方法２１は、方法１９または２０の実施形態を含んでおり、ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼが、第一鎖ｃＤＮＡを合成するために提供されたＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと同一である。
方法２１は、方法１９または２０の実施形態を含んでおり、ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼが、第一鎖ｃＤＮＡを合成するために提供されたＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと異なる。
方法２３は、方法１９〜２２のいずれかの実施形態を含んでいる。この方法では、アクセプタのオリゴヌクレオチド（例えば、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド）の５’部分、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分、または第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分が、二本鎖のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼなど））のプロモータの一鎖に関する配列を示す。この方法は、ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータを用いてＲＮＡを合成し得るＲＮＡポリメラーゼを提供する工程、ならびにＲＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、二本鎖ｃＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程をさらに包含している。この方法では、ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータの一鎖に関する配列がアクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー、または第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーにおいて示される。
したがって、方法２３のいくつかの実施形態において、アクセプタのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータの一鎖に関する配列を示し、他の実施形態において、アクセプタのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータの一鎖に関する配列を示さない。
アクセプタのオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのプロモータの一鎖に関する配列を示さない方法２３のいくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータの一鎖に関する配列は、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分によって示され、このプライマーの３’部分は、第一鎖ｃＤＮＡの３’末端におけるタグに相補的であり、アニールする配列を示す。第一鎖ｃＤＮＡの３’末端におけるタグは、順に、本方法の５’ライゲーションによりタグを付加する工程の間に、ＲＮＡリガーゼによって５’一リン酸基を有するＲＮＡに連結された、アクセプタのオリゴヌクレオチドに対して相補的である。したがって、第一鎖ｃＤＮＡの３’末端におけるタグは、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡをＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触する工程の間に、付加される。次いで、二本鎖ＤＮＡを合成する工程の間に、テンプレートとしての第一鎖ｃＤＮＡを用いた、第二鎖ｃＤＮＡのプライマーの伸長、およびテンプレートとしての第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分を用いた第一鎖ｃＤＮＡの伸長の両方をＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼが行うことによって、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータが生成される。いくつかのこれらの実施形態において、二本鎖ｃＤＮＡを用いて合成されたＲＮＡは、本方法の工程（Ａ）において提供されたサンプルに含有されているＲＮＡに対するセンスＲＮＡである。
アクセプタのオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのプロモータの一鎖に関する配列を示さない方法２３のさらに他の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータの一鎖に関する配列は、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分によって示され、このプライマーの３’部分は、本方法を用いて生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的である。これらの実施形態のいくつかにおいて、二本鎖ｃＤＮＡを用いて合成されたＲＮＡは、本方法の工程（Ａ）において提供されたサンプルに含有されているＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡである。
方法２４は、方法１〜２３のいずれかの実施形態を包含しており、アクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡのプライマー、または第二鎖ｃＤＮＡのプライマーが、それぞれ、親和性分子（例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン）を含んでいるか、この親和性分子に連結されている方法である。この方法は、親和性分子と特異的に結合し、特異的な結合のペアを形成し得る親和性に基づき結合する物質（例えば、ビオチンと結合する場合は、ストレプトアビジンまたはアビジン、あるいはジゴキシゲニンと結合する場合は、抗体）によって共有結合的または非共有結合的にコーティングされた固体表面を提供する工程、親和性分子が、固体表面に連結された親和性に基づき結合する物質と結合される条件で十分な時間にわたって、親和性分子に化学的に連結された、それぞれのアクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡのプライマーまたは第二鎖ｃＤＮＡのプライマーを接触させる工程をさらに包含している。この接触は、アクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡのプライマー、または第二鎖ｃＤＮＡのプライマーが用いられる工程の前または後のどちらか一方において行われる。
方法２４に関して、本発明は、特定の固体表面に限定されず、固体表面は多孔質であってもよいし、非多孔質であってもよく、特定の方法および適用に適した任意の組成、大きさまたは形状であり得る。例えば、固体表面は、磁性を有するビーズ、コーティングされたビーズ、スライド、マイクロタイタープレートの壁、チューブ、ならびにガラス、プラスチック（例えばラテックスまたはポリスチレン）、シリカ、テフロン（登録商標）または他の適切な材料からなるディップスティックからなる群より選択され得る。親和性に基づき結合する物質によってコーティングされた固体表面の目的は、親和性分子に化学的に連結された、アクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡのプライマーまたは第二鎖ｃＤＮＡのプライマーの、操作（例えば、反応混合物中の他の分子から除去するために洗浄したり、捕捉したりすること）、単離および捕捉を可能にすること、あるいは得られた５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡ、第二鎖ｃＤＮＡまたは二本鎖ｃＤＮＡのそれぞれの、操作、単離および捕捉を可能にすることである。非特異的な結合を防止するために、いくつかの実施形態において、固体支持体は、ＤＮＡを含まないｔＲＮＡ、タンパク質（例えばＢＳＡ）、多糖類（例えば、グリコーゲン、デキストラン硫酸、またはヘパリン）からなる群より選択される物質を大過剰用いて処理される。また、本発明は、親和性分子と親和性に基づき結合する物質とが特異的に結合し、特異的な結合のペアを形成できるのであれば、特定の親和性分子または親和性に基づき結合する物質に限定されない。
本発明の方法２５は、方法２４の好ましい実施形態を含んでおり、合成されたそれぞれの５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡまたは第二鎖ｃＤＮＡが親和性分子を含んでおり、親和性分子を含んでいる５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡまたは第二鎖ｃＤＮＡが、固体表面に結合されることによって捕捉、単離または精製される。この方法は、親和性分子を含んでいる、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡまたは第二鎖ｃＤＮＡを固体表面と、親和性分子と固体表面に付着した親和性に基づき結合する物質との結合が促進される試薬の存在下およびこの結合が促進される条件において接触させて、親和性分子を含んでいる、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡまたは第二鎖ｃＤＮＡをこの表面に結合させ、これによって、親和性分子を含んでいる、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡまたは第二鎖ｃＤＮＡを捕捉、単離または精製する工程を包含している。
方法２６は、方法２４または２５の実施形態を含んでおり、親和性分子がビオチンであり、親和性に基づき結合する物質がアビジンまたはストレプトアビジンであるか、親和性分子がジゴキシゲニンであり、親和性に基づき結合する物質が、ジゴキシゲニンに対して特異的に結合する抗体である。
方法１〜２６のいずれかのいくつかの実施形態において、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡは、真核生物の一次ＲＮＡ、原核生物の一次ＲＮＡ（例えば、細菌のｍＲＮＡ）、ｎｃＲＮＡ、およびＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロの転写反応にて合成されたＲＮＡの中から選択される、５’三リン酸基を有するＲＮＡを含んでいるか、またはこの５’三リン酸基を有するＲＮＡからなる。
方法１〜２６のいずれかのいくつかの実施形態において、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡは、キャッピング酵素のシステム（例えば、ポックスウイルスのキャッピング酵素、ワクシニアのキャッピング酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素、またはＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）のキャッピング酵素のキット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））のＲＮＡトリホスファターゼによって、ＲＮＡの一次転写産物を消化した産物である、５’二リン酸基を有するＲＮＡを含んでいるか、またはこの５’二リン酸基を有するＲＮＡからなる。
一般に、方法１〜２６のいずれかの工程（Ａ）において提供されたサンプルは、１つの真核生物または１つの原核生物に由来するものであってもよいし、１つ以上の真核生物および／あるいは１つ以上の原核生物に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態において、サンプル中のＲＮＡは、インビトロでの転写またはＲＮＡの増幅を用いて増幅される。しかし、このような実施形態において、ＲＮＡは、インビトロでの転写またはＲＮＡの増幅の前に、５’ライゲーションによってタグを付加されることが好ましい。このようにすれば、サンプル中の５’ライゲーションによりタグを付加されるＲＮＡの５’末端の基を、生物学的な原料（source）にて存在するものとすることができる。
本発明の方法の何れかに関し、サンプル中に存在する場合、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡは、５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡを有するＲＮＡからなり得る。本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、サンプル中に存在する場合、５’三リン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡは、原核生物の一次ＲＮＡ、真核生物の一次ＲＮＡ、およびＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロのＤＮＡの転写によって合成されたＲＮＡからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡのテンプレートをインビトロにて転写することによって合成されたＲＮＡは、ＲＮＡの増幅反応に由来する。ＲＮＡの増幅反応としては、本発明の１つ以上の方法を用いてセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを合成する、ＲＮＡの増幅反応が挙げられる。本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、サンプル中に存在する場合、５’三リン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡは、真核生物のｍＲＮＡ、真核生物の非翻訳ＲＮＡ、原核生物のｍＲＮＡ、および／または原核生物の非翻訳ＲＮＡを含んでいる。本方法のいずれかのいくつかの実施形態において、５’二リン酸基を有するＲＮＡは、サンプル中に存在する場合、ＲＮＡトリホスファターゼによってキャッピングされていない一次ＲＮＡを消化した産物であってもよい。ＲＮＡトリホスファターゼは、例えば、キャッピング酵素のシステム（例えば、ポックスウイルスのキャッピング酵素、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素、またはSaccharomyces cerevisiaeのＲＮＡトリホスファターゼ）を含んでいるＲＮＡトリホスファターゼ活性を有するポリペプチドである。あるいは、５’二リン酸基を有するＲＮＡは、サンプル中に存在する場合、Ｄｃｐ２のサブユニットを含んでいるデキャッピング酵素によって５’キャッピングされたＲＮＡを消化した産物であってもよい。デキャッピング酵素は、例えば、真核生物のｍＲＮＡのデキャッピング酵素（Coller, J and Parker, R, Ann. Rev. Biochem. 73: 861-890, 2004）、酵母のデキャッピング酵素（Steiger, M et al., RNA 9: 231-238, 2003）、哺乳動物のデキャッピング酵素（Piccirillo, C et al., RNA 9: 1138-1147, 2003）、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素（Gunawardana, D et al., Nucleic Acids Res. 36: 203-216, 2008およびIwasaki S, et al., FEBS Lett. 581: 2455-2459, 2007）、およびワクシニアウイルスのデキャッピング酵素（例えば、ワクシニアウイルスのＤ９またはＤ１０のデキャッピング酵素;（Parrish, S and Moss, B, J Virol. 81: 12973-12978, 2007; Parrish, S et al., Proc Natl Acad Sci USA 104: 2139-2144, 2007））である。
一般に、５’ライゲーションによりタグを付加することを望まれる目的のＲＮＡ分子が、サンプル中にて５’−ヒドロキシル基を有するＲＮＡを含んでいる場合、方法１〜２６のいずれかは、サンプル中の５’−ヒドロキシル基を有するＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、ＲＮＡをアクセプタのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡリガーゼとインキュベートすることを含んでいる工程の前に、サンプルをポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４ＰＮＫ）およびＡＴＰによって処理する工程をさらに含んでいる。
一般に、アクセプタのオリゴヌクレオチドが提供され、用いられるという本発明の全ての方法に提供され、用いられるアクセプタのオリゴヌクレオチドとしては、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドが好ましい。このため、方法１〜２６のいずれかのいくつかの好ましい実施形態において、アクセプタのオリゴヌクレオチドは、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド（「ＲＮＡのアクセプタオリゴ」、「ＲＮＡアクセプタ」「アクセプタＲＮＡ」「ＲＮＡアクセプタ分子」、または「ＲＮＡオリゴアクセプタ」などとも称する。）である。しかし、いくつかの実施形態では、アクセプタであるＤＮＡのオリゴヌクレオチドを用いる。アクセプタのオリゴヌクレオチドは長さに関して限定されないが、一般に、最小のサイズのアクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドは、トリヌクレオシドジホスフェートからなる。いくつかの好ましい実施形態において、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３個のリボヌクレオチド〜約２５個のリボヌクレオチドからなる。このように小さいサイズの範囲のアクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドは、より大きいものよりも好ましい。というのも、（例えば、ドナーであるＲＮＡ分子の５’ライゲーションによりタグを付加する効率を増加させるために）ＲＮＡリガーゼの工程のためにより高いモル濃度のアクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用することができるからである。また、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドが自身に対してアニールしたり、ドナーであるＲＮＡ分子によって示される１つ以上のＲＮＡの配列に対してアニールしたりすることがあり、これによって、ライゲーションの効率が低下することや、アーチファクトがもたらされることがあるが、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドがより短ければ、自身に対するアニールおよび上記ＲＮＡの配列に対するアニールの可能性がより低くなるからである。このように、いくつかの好ましい実施形態において、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドは、（例えば、分子内配列の相補性に起因して）自身に対してアニールしそうになく、（例えば、分子間配列の相補性に起因して）サンプル中のドナーであるＲＮＡ分子または他の核酸にアニールしそうにない配列を示す。
いくつかの好ましい実施形態において、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端は、ライゲーションのためのドナーであるＲＮＡとしての役割を果たすことができないように、５’ヒドロキシル基を有する。いくつかの好ましい実施形態において、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端は、５’キャップヌクレオチドを有している。５’−キャッピングされたアクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ライゲーションのためのドナーであるＲＮＡとしての役割を果たすことができない。
ヌクレオシドの組成に関し、Ｔ４ＲＮＡリガーゼがリガーゼとして用いられるいくつかの好ましい実施形態において、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドはアデノシンからなる。いくつかの好ましい実施形態において、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、ウリジンからなるものでない。いくつかの好ましい実施形態において、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端における最後の２個のヌクレオチドは、アデノシンからなる。いくつかの好ましい実施形態において、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端における最後の３個のヌクレオチドはアデノシンからなる。いくつかの好ましい実施形態において、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドはウリジンからなるものでない。アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計し、使用するためのさらなる情報、ならびに本発明の方法を用いて５’ライゲーションによりタグを付加されるドナーであるＲＮＡの特性および使用に関するさらなる情報は、従来技術にて開示されている（例えば、 Gumport RI and Uhlenbeck OC, Gene Amplif Anal. 2: 313-345, 1981; Romaniuk E, McLaughlin LW, Neilson T, and Romaniuk PJ. Eur J Biochem. 125: 639-43, 1982; Romaniuk PJ and Uhlenbeck OC. Methods Enzymol.;100: 52-59, 1983; and Uhlenbeck OC and Gumport RI (1982) In: The Enzymes Vol. XV, pp. 31-58, (Boyer, P.D., ed.) Academic Press, New York）。一般に、ドナーである分子のリン酸化された５’末端の特定のヌクレオチドの組成は、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドのヒドロキシル化された３’末端のヌクレオチドの組成ほど、５’ライゲーションによりタグを付加する効率に対する影響をほとんど有していない。
いくつかの好ましい他の実施形態において、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ以外の別のＲＮＡリガーゼ（例えば、バクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）が、リガーゼとして用いられ、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、アデノシン以外の１つ以上のヌクレオシドからなり得る。可能であれば、ドナーである５’一リン酸化ＲＮＡ分子と特定のＲＮＡリガーゼによってライゲーションするために最適なアクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドは、実験的に決定される。
種々の異なる酵素が本発明の方法に使用される。ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（ＲＰＰ）を用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＲＰＰは、アルミニウム誘導性のＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、E. coliのＲＰＰ、E. coliのＲＰＰＩ、ShigellaのＲＰＰ、およびShigellaのＲＰＰＩの中から選択される。ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）を用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＲＭＰがＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）である。アルカリホスファターゼを用いる本発明の方法のいくつかの実施形態において、アルカリホスファターゼは、ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、シュリンプのアルカリホスファターゼ（USB, Cleveland, OH）、およびアークティックのアルカリホスファターゼ（New England Biolabs, MA）の中から選択される。核酸に対するピロホスファターゼを用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ピロホスファターゼは、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）である。デキャッピング酵素を用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、デキャッピング酵素は、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、およびワクシニアウイルスのデキャッピング酵素Ｄ９またはＤ１０の中から選択される。キャッピング酵素を用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、キャッピング酵素は、ポックスウイルスのキャッピング酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素、およびＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）キャッピング酵素（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）の中から選択される。ＲＮＡリガーゼを用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、バクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼの中から選択される。ポリＡポリメラーゼを用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ポリＡポリメラーゼは、E. coliのポリＡポリメラーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、およびSaccharomyces cerevisiaeのポリＡポリメラーゼの中から選択される。ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼは、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＲＴ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、ＡＭＶ ＲＴ、およびＭＭＬＶ ＲＴ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）の中から選択される。ＲＮａｓｅＨを用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＲＮａｓｅＨは、E. coliのＲＮａｓｅＨ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、Ｔｔｈ ＲＮａｓｅＨ、Ｔｆｌ ＲＮａｓｅＨ、およびＨＹＢＲＩＤＡＳＥ（登録商標）ＲＮａｓｅＨ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）の中から選択される。ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）を用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７型のＲＮＡＰ、Ｔ７ＲＮＡＰ、Ｔ３ＲＮＡＰ、およびＳＰ６ＲＮＡＰ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）の中から選択される。エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）を用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、エキソリボヌクレアーゼは、Saccharomyces cerevisaeのＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ（ＸｒｎＩ）およびＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）の中から選択される。ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドキナーゼはＴ４ＰＮＫ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）である。
当業者は、本発明の種々の方法のある工程を実施する順番が重要であることを理解する。また、サンプル中に存在し得る種々のクラスのＲＮＡ分子の５’末端における基に対する各酵素の効果が意図されるゴールに悪影響を与えないように注意深く考慮された場合、工程の順番が変更され得ることを理解する。
特定の酵素が提供され、用いられる本発明の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、この方法は、本発明にこの特定の酵素を使用した後に、特定の酵素を不活性化または除去する工程をさらに包含している。特定の実施形態に関して可能であれば、特定の酵素の不活性化は、加熱によって実施されるか、または反応後の反応混合物の条件を、特定の酵素が不活性になるが、本方法の次の工程に用いる酵素が活性である新しい条件に変更することによって実施される。例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１）は、反応混合物を６５℃で約１５分間加熱することによって不活性化され得る。E. coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ（ＲＰＰＩ）は、マグネシウムを約１〜１０ｍＭの終濃度になるように添加することによって、および／または無機リン酸イオンを約０．１ｍＭの終濃度になるように添加することによって、ＲＰＰＩの反応混合物柱にて不活性化され得る。タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）は、リン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）をＴＡＰの反応混合物へ約１０ｍＭの終濃度になるように添加してｐＨを６．０から約ｐＨ７．５へ調整することによって不活性化され得る。もちろん、本方法の次の工程に用いる酵素が、特定の酵素を不活性する工程から得られた反応条件下において活性であることを確認することが重要である。
本発明の１実施形態はキットである。このキットは、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼまたはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ（これらは、全てＥＰＩＣＥＮＴＲＥから入手される。）、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、アルミニウム誘導性のＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、Escherichia coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ（E. coliのＲＰＰＩ、すなわち、ＲＰＰＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））またはShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ）を備えている。いくつかの実施形態において、キットは、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）をさらに備えている。ＲＮＡ５’モノホスファターゼをさらに備えているキットのいくつかの実施形態において、このキットは、核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはデキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはワクシニアウイルスのデキャッピング酵素のＤ９もしくはＤ１０）をさらに備えている。
本発明の別の実施形態は、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、および核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を備えているキットである。
本発明の別の実施形態は、核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ）、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド、およびバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼを備えているキットである。
本発明の別の実施形態は、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、アルミニウム誘導性のＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、Escherichia coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ（E. coliのＲＰＰＩ、すなわちＲＰＰＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））またはShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ）、ならびに少なくとも１つの他の成分を備えている。少なくとも１つの他の成分は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）および核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、およびデキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはワクシニアウイルスのデキャッピング酵素のＤ９またはＤ１０）からなる群より選択される。
本発明の別の実施形態は、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド、キャッピング酵素（例えば、ポックスウイルスのキャッピング酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素、またはＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）キャッピング酵素のキット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））、および少なくとも１つの他の成分を備えている。少なくとも１つの他の成分は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）またはアルカリホスファターゼ（例えば、ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、シュリンプのアルカリホスファターゼ（USB, Cleveland, OH）、またはアークティックのアルカリホスファターゼ（New England Biolabs, MA）；および核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）またはデキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはワクシニアウイルスのデキャッピング酵素のＤ９もしくはＤ１０）からなる群より選択される。
本発明の別の実施形態は、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド、デキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはワクシニアウイルスのデキャッピング酵素のＤ９もしくはＤ１０）、および少なくとも１つの他の成分を備えている。少なくとも１つの他の成分は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）；およびアルカリホスファターゼ（例えば、ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、シュリンプのアルカリホスファターゼ（USB, Cleveland, OH）またはアークティックのアルカリホスファターゼ（New England Biolabs, MA）からなる群より選択される。
本発明の別の実施形態は、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド、およびデキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはワクシニアウイルスのデキャッピング酵素のＤ９もしくはＤ１０）を備えているキットである。
上述したキットのいずれかのいくつかの実施形態において、キットは、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４ＰＮＫ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）（例えば、Ｔ７型のＲＮＡＰ、例えば、Ｔ７ＲＮＡＰ、Ｔ３ＲＮＡＰ、またはＳＰ６ＲＮＡＰ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）からなる群より選択される少なくとも１つの他の成分をさらに備えている。
本発明のキットの別の実施形態は、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、アルミニウム誘導性のＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、Escherichia coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ（E. coliのＲＰＰＩ、すなわちＲＰＰＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））またはShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ）を、少なくとも１つの他の成分と組み合わせて備えているキットである。このキットにおける少なくとも１つの他の成分は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、アルカリホスファターゼ（例えば、ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、シュリンプのアルカリホスファターゼ（USB, Cleveland, OH）またはアークティックのアルカリホスファターゼ（New England Biolabs, MA）、核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、デキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはワクシニアウイルスのデキャッピング酵素のＤ９もしくはＤ１０）、キャッピング酵素（例えば、ポックスウイルスのキャッピング酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素、またはＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）キャッピング酵素のキット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド、ポリＡポリメラーゼ（例えば、E. coliのポリＡポリメラーゼ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）またはポリＵポリメラーゼ、ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）（例えば、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＲＴ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、ＡＭＶ ＲＴ、ＭＭＬＶ ＲＴ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー、ＲＮａｓｅＨ（例えば、E. coliのＲＮａｓｅＨまたはＨＹＢＲＩＤＡＳＥ（登録商標）ＲＮａｓｅＨ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）（例えば、Ｔ７型のＲＮＡＰ、例えば、Ｔ７ＲＮＡＰ、Ｔ３ＲＮＡＰ、またはＳＰ６ＲＮＡＰ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ） （例えば、Saccharomyces cerevisaeのＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ（ＸｒｎＩ）、またはＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４ＰＮＫ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、および５’三リン酸基または５’二リン酸基を有し、これらの基のβまたはγのリン酸が標識されているＲＮＡ分子、からなる群より選択される。
本発明の別の実施形態は、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を、少なくとも１つの他の成分と組み合わせて備えているキットである。このキットにおける少なくとも１つの他の成分は、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（例えば、アルミニウム誘導性のＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、例えば、Escherichia coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ（E. coliのＲＰＰＩ、すなわちＲＰＰＩ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））またはShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ）、アルカリホスファターゼ（例えば、ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、シュリンプのアルカリホスファターゼ（USB, Cleveland, OH）またはアークティックのアルカリホスファターゼ（New England Biolabs, MA）、核酸に対するピロホスファターゼ（例えば、タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、デキャッピング酵素（例えば、酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、Arabidopsis thalianaのデキャッピング酵素、またはワクシニアウイルスのデキャッピング酵素のＤ９もしくはＤ１０）、キャッピング酵素（例えば、ポックスウイルスのキャッピング酵素、Saccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素、またはＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）キャッピング酵素のキット、（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド、ポリＡポリメラーゼ（例えば、E. coliのポリＡポリメラーゼ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）（例えば、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＲＴ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、ＡＭＶ ＲＴ、ＭＭＬＶ ＲＴ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ））、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー、ＲＮａｓｅＨ （例えば、E. coliのＲＮａｓｅＨまたはＨＹＢＲＩＤＡＳＥ（登録商標）ＲＮａｓｅＨ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）（例えば、Ｔ７型のＲＮＡＰ、例えば、Ｔ７ＲＮＡＰ、Ｔ３ＲＮＡＰ、またはＳＰ６ＲＮＡＰ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）（例えば、ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、またはSaccharomyces cerevisaeのＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ（ＸｒｎＩ））、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）（例えば、Ｔ４ＰＮＫ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、および５’三リン酸基または５’二リン酸基を有し、これらの基のβまたはγのリン酸が標識されているＲＮＡ分子からなる群より選択される。
本発明の方法、キットおよび組成物は広範囲の応用性を有している。例えば、本発明の方法、キットおよび組成物を用いて生成した核酸分子を、任意の所望の完全長のＲＮＡ（例えば、完全長のキャッピングされた真核生物のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、完全長のキャッピングされていない真核生物の一次ＲＮＡ（非翻訳ＲＮＡを含む。）、または完全長の原核生物の一次ｍＲＮＡ）からｃＤＮＡを合成したり、このｃＤＮＡをクローン化したり、この所望のＲＮＡのＲＮＡ増幅を行ったり、（シーケンシングによって、あるいはｃＤＮＡ末端のランダムな増幅（random amplification of cDNA ends（ＲＡＣＥ））、エキソンのアレイ、または他のマイクロアレイなどの方法を用いることによって）所望のＲＮＡの正確な５’末端の捕捉および特定をしたりするために、使用することができる。
一般に、本明細書に開示した方法１〜２６のいずれか、キットおよび組成物のいずれかは、国際公開第２００７／１１７０３９号明細書Ａ１に記載されるような目的および応用と同一のものを改善し、これらの目的および応用に使用することができる。
本明細書に開示した方法１〜１６のいずれか、またはキットおよび組成物のいずれかは、２つの異なるサンプルのそれぞれから核酸分子を生成するために、別々にまたは組み合わせて使用される。この核酸分子は、標識されたまたは標識されていない、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、第一鎖ｃＤＮＡ、第二鎖ｃＤＮＡ、二本鎖ｃＤＮＡ、または二本鎖ｃＤＮＡのインビトロでの転写によって合成されたＲＮＡ、からなる。この核酸分子は、核酸分子を分析したり、核酸分子を同定（例えば、配列決定）したり、（（例えば、マイクロアレイまたはリアルタイムＰＣＲを用いて）例えば、あるサンプルからのまたはあるサンプルに由来する１つ以上核酸分子の存在量を測定し、別のサンプル中のこの核酸分子の存在量と比較することによって）核酸分子の相対的な存在量を定量または決定したり、注釈付けを行ったり、核酸分子が生成されたサンプル中のＲＮＡ分子の生物学的な機能を発見したりするために用いられる。いくつかの実施形態において、研究のために、核酸分子は分析され、同定され、定量され、配列決定され、注釈付けされるか、生物学的機能が発見される。一方、他の実施形態において、
この成果は、商業的な目的のために実施される。このような商業的な目的は、例えば、工業的、農業的、または他の商業的な応用のために遺伝子を発見し、発現すること、またはヒトまたは動物への医学的、治療的、または診断的な応用のための情報を用いることである。
〔定義〕
本発明は、以下に規定するような用語の定義に基づいて理解され、解釈される。用語「例えば」、「など」、「挙げられる」またはそれらのバリエーションが本明細書にて用いられる場合、これらの用語は、限定の用語であるとみなされず、「限定されないが」または「限定することなく」ということを意味すると解釈される。
本明細書にて用いられる場合、「アクセプタのオリゴヌクレオチド」は、５’リン酸基を有するＲＮＡの５’末端にＲＮＡリガーゼの作用によって連結されることができる、３’ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを意味する。５’リン酸基を有するＲＮＡを「ドナー」と称する。リボヌクレオチドからなるアクセプタのオリゴヌクレオチドを、本明細書では、「アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド」または「ＲＮＡアクセプタ」と称する。
本明細書における「親和性に基づき結合する分子」または「特異的な結合のペア」は、特定の条件（「結合条件」という。）下において互いに親和性を有し、結合する分子を意味する。ビオチンおよびストレプトアビジンまたはアビジンが、「特異的な結合のペア」または「親和性に基づき結合する分子」の例であるが、本発明は、この特定の「特異的な結合のペア」を使用することに限定されない。
本明細書にて規定される「親和性分子」は、本明細書にて「親和性に基づき結合する物質」と称される別の物質に特異的に結合することができる分子を意味する。「親和性分子」および「親和性に基づき結合する物質」は、「親和性に基づき結合する分子」または「特異的な結合のペア」を構成するか、または含んでいる。親和性分子（例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン）は他の分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）に抱合され得る。親和性に基づき結合する物質（例えば、ビオチンに結合するストレプトアビジンまたはアビジン、あるいはジゴキシゲニンに結合する特異的な抗体）は、従来技術において公知の方法を用いて固体表面へ共有結合的に抱合され得るか、非共有結合的に結合され得る。従来技術において公知の方法は、例えば、Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, by D. Savage et al., Pierce Chemical Company, 1992、Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Ninth Edition, by R.P. Hoagland, Molecular Probes, Inc.、およびBIOCONJUGATE Techniques, by Greg T. Hermanson, Published by Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996に記載の試薬および方法である。また、ＤＮＡまたはＲＮＡに抱合される親和性分子も、従来技術において公知の試薬および方法を用いてオリゴヌクレオチド合成機を使用して合成され得る。
本発明によれば、用語「結合」は、非共有結合の結果としての、親和性分子と親和性に基づき結合する物質との間の相互作用を意味する。非共有結合は、水素結合、疎水的相互作用、ファンデルワールス結合、およびイオン結合などである。理論によって縛られること無く、これらの種類の非共有結合は、特異的な結合のペアに関与する分子の相補的な形状または構造に部分的に起因する結合をもたらすことを従来技術において考えられている。「結合」の定義および多種多様な親和性に基づき結合する分子または特異的な結合のペアに基づけば、結合条件が、異なる特異的な結合のペアについて変更されることが明白である。当業者は、親和性に基づき結合する分子の間にサンプル中にて結合が生じる条件を容易に発見するか、または決定することができる。特に、当業者は、「特異的な結合」であると従来技術において考えられる、親和性に基づき結合する分子間の結合が生じ得る条件を容易に決定することができる。従来技術において理解されるように、このような特異性は、大抵、親和性に基づき結合する分子間の親和性がサンプルにおける他の物質および成分（例えば、容器の壁、固体支持体）よりも高いことに起因している。ある場合において、特異性は、親和性に基づき結合する分子の会合が、サンプル中の他の物質および成分との会合よりも顕著に迅速であることに関係していることもあるか、このことに起因していることもある。
「キャップ」または「キャップヌクレオチド」は、ＲＮＡの一次転写産物の５’末端に連結した修飾されたグアニンヌクレオチドである。５’末端にキャップヌクレオチドが連結したＲＮＡを、「キャッピングされたＲＮＡ」、「キャッピングされたＲＮＡの転写産物」または「キャッピングされた転写産物」と称する。一般的なキャップヌクレオシドは、７−メチルグアノシンまたはＮ７−メチルグアノシン（「標準的なキャップ」と称することもある。）である。７−メチルグアノシンまたはＮ７−メチルグアノシンは、「ｍ7Ｇ」として名付けられる構造を有している。この場合、キャッピングされたＲＮＡまたは「ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡ」は、ｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ1（ｐＮ）x−ＯＨ（３’）、またはより単純にｍ7ＧｐｐｐＮ1（ｐＮ）xまたはｍ7Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎとして名付けられる構造を有している。ｍ7Ｇは、７−メチルグアノシンのキャップヌクレオシドを表す。ｐｐｐは、キャップヌクレオシドの５’炭素とＲＮＡの一次転写産物の第１のヌクレオチドとの間の三リン酸の架橋を表す。Ｎ1（ｐＮ）x−ＯＨ（３’）は、ＲＮＡの一次転写産物を表す。Ｎ1は最も５’側のヌクレオチドである。「ｐ」はリン酸基を表す。「Ｇ」はグアノシンヌクレオシドを表す。「ｍ7」はグアニンの７位のメチル基を表す。（５’）は、「ｐ」がキャップヌクレオチドのリボース、およびｍＲＮＡの転写産物の第１のヌクレオシド（「Ｎ」）のリボースに連結する位置を示す。この「標準的なキャップ」に加えて、種々の他の天然に生じるキャップの類似体および合成のキャップ類似体が従来技術において公知である。任意のキャップヌクレオチドを有するＲＮＡを「キャッピングされたＲＮＡ」と称する。キャッピングされたＲＮＡは、生物学的なサンプルから天然に生じるものであってもよいし、５’三リン酸基を有するＲＮＡまたは５’二リン酸基を有するＲＮＡをキャッピング酵素のシステムによってインビトロにてキャッピングすることによって取得されたものであってもよい。キャッピング酵素のシステムとしては、例えば、ワクシニアのキャッピング酵素のシステムまたはSaccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素のシステムが挙げられる。また、キャッピングされたＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含んでいるＤＮＡテンプレートのインビトロでの転写（ＩＶＴ）によって取得されたものであってもよい。ＧＴＰに加えて、ＩＶＴの反応は、従来技術において公知の方法を用いた（例えば、ＡＭＰＬＩＣＡＰ（登録商標）Ｔ７キャッピングキット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を用いた）ジヌクレオチドのキャップの類似体を含んでいてもよい。ジヌクレオチドのキャップの類似体は、例えば、ｍ7ＧｐｐｐＧのキャップの類似体、またはＮ7−メチル、２’−Ｏ−メチル−ＧｐｐｐＧ ＡＲＣＡのキャップの類似体、またはＮ7−メチル、３’−Ｏ−メチル−ＧｐｐｐＧ ＡＲＣＡのキャップの類似体である。
インビボでの、５’三リン酸化されたｍＲＮＡの一次転写産物のキャッピングは、酵素が関与するいくつかの工程を経て生じる（例えば、Martin, S A et al., J. Biol. Chem. 250: 9322, 1975; Myette, J R and Niles, E G, J. Biol. Chem. 271: 11936, 1996; M A Higman, et al., J. Biol. Chem. 267: 16430, 1992参照）。
以下の酵素反応が、真核生物のｍＲＮＡのキャッピングに関与している。
（１）ＲＮＡトリホスファターゼがｍＲＮＡの５’三リン酸を二リン酸に切断する、
pppN1(p)Nx-OH(3') → ppN1(pN)x-OH(3') + Pi、
次いで、
（２）ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼが、ｍＲＮＡの最も５’側のヌクレオチド（Ｎ1）の５’二リン酸へのＧＴＰの連結を触媒する、
ppN1(pN)x-OH(3') + GTP → G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + PPi、
最後に、
（３）グアニン−７−メチルトランスフェラーゼが、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）を補助因子として用いて、キャップヌクレオチドにおけるグアニンの７−窒素のメチル化を触媒する、
G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoMet → m7G(5')ppp(5)N1(pN)x-OH(3') + AdoHyc。
ＲＮＡトリホスファターゼおよびＲＮＡグアニルトランスフェラーゼの酵素活性の作用から生じるＲＮＡ、ならびにグアニン−７−メチルトランスフェラーゼの酵素活性によってさらにメチル化されるＲＮＡを、本明細書において「５’キャッピングされたＲＮＡ」または「キャッピングされたＲＮＡ」と称する。本明細書において「キャッピング酵素のシステム」またはより単純に「キャッピング酵素」は、「キャッピングされたＲＮＡ」をもたらす酵素活性を有するポリペプチドの１つ以上の任意の組合せを意味する。キャッピング酵素のシステム（クローン化された形態の酵素が挙げられる。）は、多くの原料から同定および精製されており、従来技術において周知である（例えば、Shuman, S, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66: 1-40, 2001; Shuman, S, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 50: 101-129, 1995; Shuman, S et al., J. Biol. Chem. 255: 11588, 1980; Banerjee, A K, Microbiol. Rev. 44: 175-205, 1980; Wang, S P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9573, 1997; Higman M.A. et al., J. Biol. Chem. 267: 16430, 1992; Higman, MA et al., J. Biol. Chem. 269: 14974-14981, 1994; Myette, JR and Niles, EG, J. Biol. Chem. 271: 11936-11944, 1996参照）。５’ポリリン酸を有するキャッピングされていないＲＮＡをキャッピングされたＲＮＡへ変換し得る任意のキャッピング酵素のシステムを、キャッピング酵素のシステムを提供するか、用いる本発明の実施形態のいずれかに用いることができる。いくつかの実施形態において、キャッピング酵素のシステムはポックスウイルスのキャッピング酵素のシステムである。いくつかの好ましい実施形態において、キャッピング酵素のシステムはワクシニアウイルスのキャッピング酵素である。いくつかの実施形態において、キャッピング酵素のシステムはSaccharomyces cerevisiaeのキャッピング酵素である。また、ある原料からのＲＮＡトリホスファターゼをコードする遺伝子、ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子およびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、別の原料からのこれらの遺伝子の１つまたは全ての欠損を補完することができるという事実を考慮すると、キャッピング酵素のシステムが１つの原料に由来するものであってもよいし、ＲＮＡトリホスファターゼの活性、ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼの活性および／またはグアニン−７−メチルトランスフェラーゼの活性、の１つ以上が、異なる原料に由来するポリペプチドを含んでいてもよい。
本明細書にて規定される「デキャッピング酵素」は、デキャッピング酵素が５’ポリリン酸基を有するＲＮＡを５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換しない条件下において、キャッピングされたＲＮＡを５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する酵素を意味する。真核生物では、長いキャッピングされたＲＮＡが、典型的に、Ｄｃｐ１／Ｄｃｐ２の複合体からなるデキャッピング酵素によって、５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される。Ｄｃｐ１／Ｄｃｐ２の複合体のうちＤｃｐ２が酵素サブユニットであり、このデキャピング酵素を本明細書において「Ｄｃｐ２型のデキャッピング酵素」と称する。よって、デキャッピング酵素を用いる本発明の好ましい実施形態において、デキャッピング酵素がＤｃｐ２型のデキャッピング酵素である。Ｄｃｐ２型のデキャッピング酵素は、ヌーディックス（Ｎｕｄｉｘ）スーパーファミリーの酵素のメンバーである。ヌーディックススーパーファミリーの酵素は、配列ＧＸ5ＥＸ7ＲＥＵＸＥＥＸＧＵを示すヌーディックス（またはＭｕｔＴ）モチーフまたはヌーディックスボックスと呼ばれる、保存されたアミノ酸配列を共有する（（Dunckley, T and Parker, R. EMBO J 18: 5411-5422, 1999; van Dijk, E et al., EMBO J. 21: 6915-6924, 2002; Steiger, M et al., RNA 9: 231-238, 2003; Xu, W et al. J. Biol. Chem. 279: 24861-24865, 2004; Gunawardana, D et al., Nucleic Acids Res. 36: 203-216, 2008）。短いキャッピングされたＲＮＡ（ジヌクレオチドが挙げられる。）を５’二リン酸基を有するＲＮＡへ消化するＤｃｐＳ型の酵素は、本明細書にて規定されるデキャッピング酵素ではない。
本明細書にて用いられる場合、用語「酵素」は、化学的および生物学的な反応の触媒を司るタンパク質分子またはタンパク質分子の集合体をいう。一般に、本発明の方法、組成物またはキットは、特定の原料からの特定の酵素を使用することに限定されない。むしろ、本発明の方法、組成物またはキットは、特定の方法、組成物またはキットに関して本明細書に開示した特定の酵素と同等の酵素活性を有する、任意の原料からの任意の酵素を含んでいる。例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、Escherichia coliまたはShigellaのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩであってもよいし、適切な反応条件下において５’ポリリン酸基を有するＲＮＡを５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する別のＲＮＡ５’ポリホスファターゼ酵素であってもよい。ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼは、ＡＭＶ逆転写酵素；ＭＭＬＶ逆転写酵素；ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩ、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩＩ、またはＡＭＶ ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴの逆転写酵素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）；またはＭＯＮＳＴＥＲＳＣＲＩＰＴの逆転写酵素（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）であってもよいし、テンプレートとしてのＲＮＡおよびこのＲＮＡ内の相補的な配列にアニールするオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡを適切な反応条件下において合成することができる別の酵素であってもよい。ポリヌクレオチドキナーゼはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼであってもよいし、ＡＴＰまたは別のヌクレオシド−５’−三リン酸から、一リン酸基を、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡの５’末端へ適切な反応条件下において移動させることができる別の酵素であってもよい。ポリＡポリメラーゼは、ｐｃｎＢ遺伝子にコードされたEscherichia coliのポリＡポリメラーゼであってもよいし、ＡＴＰが存在し、核酸のテンプレートが存在しないときに、適切な反応条件下において、３’ヒドロキシル基を有するＲＮＡの３’末端にてポリ（Ａ）テールを合成することができる別の酵素であってもよい。リボヌクレアーゼＨは、Escherichia coliのＲＮａｓｅＨまたはＨＹＢＲＩＤＡＳＥ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＲＮａｓｅＨ（EPICENTRE, Madison, WI）であってもよいし、適切な反応条件下において、ＤＮＡにアニールしたＲＮＡを消化するが、一本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡにアニールしたＲＮＡを消化しない別の酵素であってもよい。核酸に対するピロホスファターゼは、タバコ酸性ピロホスファターゼであってもよいし、ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡの三リン酸の架橋を切断することによって５’一リン酸基を有するＲＮＡを適切な反応条件下において生成する別の酵素であってもよい。アルカリホスファターゼは、ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ（EPICENTRE, Madison, WI）、あるいはシュリンプのアルカリホスファターゼまたはアークティックのアルカリホスファターゼ（New England Biolabs, MA）であってもよいし、５’ポリリン酸基を有するＲＮＡまたは５’一リン酸基を有するＲＮＡを５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ適切な反応条件下において変換する別の酵素であってもよい。さらに、本発明の方法は、この方法の工程に提供され使用される任意の特定の酵素の１つが、２つ以上の酵素の組合せと置換された実施形態を含んでいる。２つ以上の酵素を組み合わせて使用する場合、段階的な方法で別々に用いようが、同時に一緒の反応混合物として用いようが、特定の酵素を１つ用いて合成したＲＮＡと同一のＲＮＡが合成されることになる。本明細書に提示された方法、バッファおよび反応条件（実施例に記載されたものを含む。）は、本発明の方法、組成物およびキットの実施形態にとって現時点にて好ましいものである。しかし、本発明のいくつかの酵素を使用するための他の酵素保存バッファ、反応バッファ、および反応条件が従来技術において公知であり、本発明にて使用するに適切であり得、本明細書にて挙げられる。
本発明の方法、組成物またはキットに使用される任意の酵素は、ネイティブなタンパク質であってもよいし、組換えタンパク質であってもよい。用語「ネイティブなタンパク質」は、天然に生じる（すなわち、組み換えでない）原料から単離されたタンパク質を示すために本明細書にて用いる。本明細書にて使用される場合、用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ分子から発現されたタンパク質分子をいう。ネイティブな型のタンパク質と比較したときに同一または類似の性質を有する組換え型のタンパク質が、分子生物学的な技術を用いて製造され得る。また、ポリペプチドの発現、精製または他の所望の性質を改善するためにネイティブな配列の変異体を作製してもよい。組換えタンパク質は融合タンパク質であってもよい。本明細書にて用いる場合、用語「融合タンパク質」は、外因性のタンパク質断片に連結された目的のタンパク質を含んでいるキメラタンパク質をいう。目的のタンパク質が、例えば、E. coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼＩ（ＲＰＰＩ）またはその断片であり、外因性のタンパク質断片が、例えば、ＲＰＰＩでないタンパク質を含んでいる融合パートナーである。融合パートナーは、宿主細胞にて発現したときの、所望の酵素活性を有するタンパク質の溶解度を向上し得る。また、融合パートナーは、宿主細胞または培養上清あるいはそれらの両方からの、組換え融合タンパク質の精製を可能にする親和性タグを提供し得る。必要に応じて、融合タンパク質を、従来技術にて公知の種々の酵素的または化学的な手段によって目的のタンパク質から除去してもよい。
本発明の好ましい実施形態において、方法、組成物またはキットに使用する酵素組成物は、精製されたタンパク質を含んでいる。本明細書において用いる場合、用語「精製された」または「精製すること」は、目的の成分（タンパク質など）から夾雑物のいくつかを除去する任意のプロセスの結果を意味する。例えば、特定の所望のタンパク質（例えばＲＰＰＩまたはＲＭＰ１）は、混入する他の望まれないタンパク質、核酸、炭水化物、脂質および／または生化学的な小分子を除去することによって精製される。夾雑物を除去した結果、組成物中の所望のタンパク質の割合が増加する。例えば、好ましい実施形態において、ＲＰＰＩまたはＲＭＰ１の組成物は、混入する核酸および核酸に対する活性を有する他の酵素を含まないように、精製される。
いくつかの実施形態において、所望のタンパク質（例えばＲＰＰＩまたはＲＭＰ１）は、Escherichia coliの細胞にて複製され、発現するプラスミドまたは他のベクター内の遺伝子（および／または遺伝子の機能的なバリアントおよびホモログ）を発現させることによって取得されることが好ましい。あるいは、この所望のタンパク質は、ＴＲＡＮＳＰＯＳＯＭＥ（登録商標）システム（例えば、ＥＺ−Ｔｎ５（登録商標）ＴＲＡＮＳＰＯＳＯＭＥ（登録商標）システム（EPICENTRE, Madison, WI）を用いて、Escherichia coli細胞内の染色体に挿入された遺伝子（および／または遺伝子の機能的なバリアントおよびホモログ）を発現させることによって取得されることが好ましい。なぜなら、このような組換え体の原料から取得された酵素は、組換え体でない原料から取得される酵素と比べて、純度がより高く、混入する酵素の活性を含んでおらず、一般に酵素の濃度が高いからである。
本明細書において用いる場合、用語「遺伝子」は、コードされたポリペプチドまたはタンパク質の前駆体の産生に必要な、制御配列およびコード配列を含んでいるＤＮＡ配列をいう。ポリペプチドは、完全長のコード配列によってコードされていてもよいし、所望のタンパク質の活性が保持されている限り、このコード配列の任意の部分によってコードされていてもよい。
本発明の好ましい実施形態において、酵素は「安定化」される。「酵素が安定化される」とは、酵素が、分解および酵素活性の喪失の原因となるプロテアーゼおよび他の夾雑物によって十分に汚染されておらず、酵素が、所定の配合の酵素の保存バッファ中に提供されており、このバッファ中では、マイナス２０℃にて６ヶ月間保存する間に活性の顕著な喪失がないことが意図される。安定化された多くの酵素（例えば、E. coliの５’ＲＰＰＩ、Ｔ４ＰＮＫ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ）の組成物を提供するための適切な酵素の保存バッファの１つは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１％の非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を含有している５０％グリセロールの溶液、を含んでいる。
さらに、本発明のタンパク質（例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼまたはＲＮＡ５’モノホスファターゼ）のバリアントの形態は、本明細書にてより詳細に説明されたペプチドおよびＤＮＡ分子と均等であるとみなされる。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単離された置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単離された置換、トレオニンのセリンとの単離された置換、またはあるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との同様の置換（すなわち、保存的変異）は、生じた分子の生物学的な活性に対して重大な影響を有していない。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に開示した酵素のバリアントを提供する。このバリアントは保存的な置換を含んでいる。保存的な置換は、アミノ酸の側鎖について関連するアミノ酸のファミリー内にて行われる。遺伝的にコードされたアミノ酸は、（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（２）塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および（４）無電荷の極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）、の４つのファミリーに分けられ得る。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類されることもある。同様に、アミノ酸のレパートリーは、（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（２）塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン）（なお、セリンおよびトレオニンは必要に応じて、脂肪族のヒドロキシル基を有するアミノ酸として別にグループ化される）、（４）芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、（５）アミドアミノ酸（アスパラギン、グルタミン）、および（６）含硫アミノ酸（システインおよびメチオニン）としてグループ化され得る（例えば、Stryer ed., Biochemistry, pg. 17-21, 2nd ed, WH Freeman and Co., 1981）。ペプチドのアミノ酸配列内の電荷が機能的なポリペプチドの原因になるか否かは、バリアントのペプチドが野生型タンパク質と同様に機能できることを評価することによって、容易に決定することができる。１個よりも多い置換を有するペプチドを、同じようにして容易に試験することができる。
より稀であるが、本発明の方法、組成物またはキットに用いる酵素のバリアントには、「保存的でない」変更を含んでいる（例えば、グリシンのトリプトファンとの置換）。類似する少数のバリエーションとしては、アミノ酸の欠失または挿入あるいはそれらの両方を挙げることができる。生物学的な活性を消失することなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失できるのかを決定するガイダンスは、コンピュータープログラム（例えば、LASERGENE software, DNASTAR Inc., Madison, WI）を用いて見出すことができる。
バリアントは、定方向進化、または以下にて詳細に説明するバリアントのコンビナトリアルライブラリーを製造するための他の技術などの方法によって製造し得る。本発明のさらに他の実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、本発明の方法、組成物またはキットの酵素のコード配列を（例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼまたはＲＮＡ５’モノホスファターゼの配列を操作することによって）変更するために、操作され得る。このような変更としては、遺伝子産物のクローン化、プロセシング、局在、分泌および／または発現を修飾する変更が挙げられる。例えば、従来技術において周知の技術（例えば、新たな制限酵素部位を挿入したり、グリコシル化のパターンを変更したり、またはコドンの選択を変更したりするための部位特異的変異誘発法）を用いて、変異を導入してもよい。
本発明のさらに他の実施形態は、変異体またはバリアントの形態の本発明の酵素を提供する。（例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼの）活性を有するペプチドの構造を、活性または安定性（例えばエキソビボでの有効期間および／またはインビボでのタンパク質分解に対する耐性）を増強するために修飾することができる。このような修飾されたペプチドは、本明細書にて規定される対象のタンパク質の活性を有するペプチドと機能的に均等であるとみなされる。アミノ酸配列が（例えば、アミノ酸の置換、欠失または付加によって）変更された修飾されたペプチドが、製造され得る。
さらに、上述したバリアント（例えば変異体）の形態の対象のタンパク質も、より詳細に説明されたペプチドおよびＤＮＡ分子と均等であるとみなされる。例えば、上述したように、本発明は、アミノ酸の保存的な置換またはアミノ酸の保存的でない置換を含んでいる、変異体およびバリアントのタンパク質を包含している。
本発明は、本タンパク質（例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼまたはＲＮＡ５’モノホスファターゼ）のコンビナトリアル変異体のセット、および（例えば、ＥＺ−Ｔｎ５（登録商標）Protein Truncation Kit（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を用いて）切断された変異体のセットを生成する方法をさらに意図している。本発明は、機能的な（例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼまたはＲＮＡ５’モノホスファターゼの活性を示す）バリアントの配列（すなわち、変異体）であると見込まれる配列を同定するために特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、酵素活性が改善または変更された新規な酵素のバリアントを生成することである。
それ故、本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質のバリアント（例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼまたはＲＮＡ５’モノホスファターゼのバリアントは、変更された（例えば、増加または低減された）酵素活性を提供するように本発明の方法によって操作される。他の実施形態において、タンパク質のバリアントは、特定の応用のために、熱安定性（すなわち、「耐熱性」）、または熱不安定性の活性を提供するように操作される。本発明の他の実施形態において、コンビナトリアルケミストリーに（combinatorially）から得られたバリアントを生成する。このバリアントは、天然に生じるタンパク質の基質多様性（substrate variability）と異なる基質多様性を有している。このようなタンパク質は、組換えＤＮＡコンストラクトから発現された場合、本明細書に記載した方法に使用されると分かる。
本発明のさらに他の実施形態は、対応する野生型タンパク質と細胞内の半減期が劇的に異なる、タンパク質のバリアント（例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼまたはＲＮＡ５’モノホスファターゼのバリアント）を提供する。例えば、変更されたタンパク質は、タンパク質を分解または破壊することになるか、そうでなければタンパク質を不活性化する他の細胞のプロセスに対して、より安定な状態またはより不安定な状態であり得る。このようなバリアントおよびこれらのバリアントをコードする遺伝子を、タンパク質の半減期を調節することによって発現の部位を変更することに利用することができる。例えば、半減期が短ければ、より一時的な生物学的効果を発揮することができ、誘導可能な発現系の一部である場合、細胞内のタンパク質のレベルをより厳密に制御することができる。
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質のバリアント（例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼまたはＲＮＡ５’モノホスファターゼのバリアント）は、アンタゴニストとして作用するように、コンビナトリアルの手法によって生成される。アンタゴニストとして作用するバリアントは、対応する野生型タンパク質の、細胞機能を調節する能力を妨害することができる。本発明のコンビナトリアル変異の手法のいくつかの実施形態において、タンパク質のホモログ、バリアント、または他の関連するタンパク質の集団に関するアミノ酸配列が整列される。この場合、これらの配列は、ホモロジーが可能な限り最も高くなるように整列されることが好ましい。このようなバリアントの集団としては、１つ以上の種または亜種に由来するタンパク質のホモログ（例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼまたはＲＮＡ５’モノホスファターゼのホモログ）、または、同一の種または亜種に由来するが、変異または多型が原因で異なるタンパク質のバリアントが挙げられる。整列された配列の各位置に見られるアミノ酸は、コンビナトリアル配列（combinatorial sequence）の縮重の組（degenerate set）を作製するために選択される。
本発明の好ましい実施形態において、タンパク質のコンビナトリアルライブラリーは、ポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって製造される。上記ポリペプチドのライブラリーのポリペプチドは、それぞれ、タンパク質の配列であると見込まれる配列を少なくとも一部含んでいる。例えば、所定の配列であると見込まれる配列（例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼまたはＲＮＡ５’モノホスファターゼの配列であると見込まれる配列）の縮重の組が、個々のポリペプチドとして発現可能なように、または所定の配列の組を含んでいる（例えば、ファージディスプレイのための）より大きい融合タンパク質の組として発現可能なように、合成のオリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することができる。
タンパク質のホモログおよびバリアントであると見込まれるもののライブラリーを、オリゴヌクレオチドの縮重配列から生成することができる多くの方法が存在する。いくつかの実施形態において、遺伝子の縮重配列の化学的な合成を自動ＤＮＡ合成機にて実施し、合成遺伝子を、発現用の適切な遺伝子に連結する。遺伝子の縮重の組は、タンパク質配列であると見込まれる配列の所望の組をコードする全ての配列を１つの混合物にて提供するために用いる。縮重のオリゴヌクレオチドの合成は従来技術において周知である（例えば、Narang, Tetrahedron Lett., 39: 39, 1983; Itakura et al., Recombinant DNA, in Walton (ed.), Proceedings of the 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, Elsevier, Amsterdam, pp 273-289, 1981; Itakura et al., Annu. Rev. Biochem., 53: 323, 1984; Itakura et al., Science 198: 1056, 1984; Ike et al., Nucl. Acid Res., 11: 477, 1983参照）。このような技術は、他のタンパク質の定方向進化に採用されている（例えば、Scott et al., Science 249: 386, 1980; Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2429, 1992; Devlin et al., Science 249: 404, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378, 1990;および米国特許第５２２３４０９号明細書; 米国特許第５１９８３４６号明細書; 米国特許第５０９６８１５号明細書）。
タンパク質をコードする核酸を定方向進化のための出発物質の核酸として利用できることが意図される。これらの技術を利用して、所望の性質を有する（例えば、酵素活性が増加、低減または変更された）酵素のバリアントを開発することができる。
いくつかの実施形態において、ランダム変異誘発によって人工的な進化を実施する。人工的な進化を、例えば、エラープローンＲＣＲ（error-prone PCR）を利用して、ランダムな変異を所定のコード配列に導入することによって実施する。この方法は、変異の頻度を精密に調整することを必要とする。一般に、有益な変異は稀であり、有害な変異が一般的である。これは、有害な変異と有益な変異とが組み合せられると、多くの場合、不活性な酵素が得られるからである。標的化される遺伝子に対する塩基の置換の理想的な数は、通常、１．５個〜５個である（Moore and Arnold, Nat. Biotech., 14, 458, 1996; Eckert and Kunkel, PCR Methods Appl., 1: 17-24, 1991; Caldwell and Joyce, PCR Methods Appl., 2: 28, 1992; and Zhao and Arnold, Nuc. Acids Res. 25: 1307, 1997）。突然変異の後に、生じたクローンを所望の活性について選抜する。多くの場合、所望の性質を有する酵素を開発するには、突然変異および選抜を連続的に何度も行うことが必要になる。留意するべきことは、有用な変異のみが、次回の突然変異に持ち越されることである。
本発明の他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子シャッフリング（gene shuffling）法またはセクシャルＰＣＲ法に用いられる（例えば、Smith, Nature, 370: 324, 1994; U.S. Pat. Nos. 5837458; 5830721; 5811238; 5733731）。遺伝子シャッフリングは、いくつかの変異ＤＮＡをランダムに断片化し、その後、断片化されたＤＮＡをＰＣＲによって完全長の分子へ再構築することを含んでいる。種々の遺伝子シャッフリングの手法の例は、ＤＮａｓｅを用いて処理すること、互い違いに伸長するプロセス、およびランダムにプライミングしてインビトロにて組み換えること、これらの後に構築することを含んでいる。ＤＮａｓｅに媒介される方法では、陽性の変異のプールから単離されたＤＮＡの部分をＤＮａｓｅ Ｉを用いてランダムな断片へと切断し、プライマーを添加せずに複数回のＰＣＲに供する。ランダムな断片の長さは、ＰＣＲのサイクルが進むと、切断されていない上記部分の長さに達する。その結果として、変異が、混合された種々のクローン内に存在し、そして生じた配列のいくつかに蓄積する。複数のサイクルの選抜およびシャッフリングを行うことによって、いくつかの酵素の機能が向上されている（Stemmer, Nature, 370:398, 1994; Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10747, 1994; Crameri et al., Nat. Biotech., 14: 315, 1996; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4504, 1997;およびCrameri et al., Nat. Biotech., 15: 436, 1997）。
ある性質を有する遺伝子産物について、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたり、点変異によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングしたりするための、広範な技術が従来技術において公知である。このような技術は、コンビナトリアル変異によって、またはタンパク質もしくはバリアントの組換えによって生成された遺伝子ライブラリーを迅速にスクリーニングするために、一般的に適合される。巨大な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられる技術は、複製可能な発現ベクターへ遺伝子のライブラリーをクローン化することと、生じたベクターのライブラリーによって適切な細胞を形質転換することと、産物を検出される遺伝子をコードするベクターが、所望の活性を検出されることによって比較的容易に単離される条件でコンビナトリアルな遺伝子を発現させることと、を典型的に包含している。
また、本発明の核酸およびタンパク質の断片は、これらの断片が所望の酵素活性をコードしているか、有しているのであれば、用いられてもよい。
本明細書において用いる場合、「５’エキソリボヌクレアーゼ」（「ＸＲＮ」）は、５’一リン酸化された末端を有する一本鎖ＲＮＡの基質に対する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が、５’三リン酸化された末端または５’キャッピングされた末端を有する同一のＲＮＡの基質に対する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性よりも２０倍を超える５’エキソヌクレアーゼを意味する。本発明の５’エキソリボヌクレアーゼの酵素活性を多種多様な方法を用いて測定することができる。５’三リン酸を有するＲＮＡ基質、５’キャップを有するＲＮＡ基質、または５’一リン酸を有するＲＮＡ基質を用いた、活性の評価および相対的な活性の決定をするための適切な方法が、StevensおよびPooleによって記載されている（J. Biol. Chem., 270: 16063, 1995）。５’エキソリボヌクレアーゼの好ましい組成物は、Saccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ１ｐ（５’エキソリボヌクレアーゼ１）（または「ＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ」または「ＸｒｎＩ５’エキソリボヌクレアーゼ」または「５’Ｘｒｎ１ｐエキソリボヌクレアーゼ」）である。Saccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ１ｐを従来技術において公知の方法を用いて調製することができる。いくつかの実施形態において、５’エキソリボヌクレアーゼを、Saccharomyces cerevisiaeのＸＲＮ１遺伝子を発現させることによって取得する。このＸＲＮ１遺伝子の発現は、このＸＲＮ１遺伝子をプラスミド内にクローン化し、次いで、Escherichia coli細胞にて複製し、この細胞内にて発現させることによって実施する。
「オリゴキャップ」または「オリゴヌクレオチドのキャップ」は、「オリゴキャッピング」法の一部として、５’一リン酸化ＲＮＡ分子の５’末端にＲＮＡリガーゼの作用によって連結された、アクセプタのオリゴヌクレオチドである。従来技術におけるオリゴキャッピング法のほとんどの実施形態において、オリゴキャップはアクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドである。「オリゴキャップ」は、真核生物のｍＲＮＡ分子にて典型的に見出される「ｍ7Ｇキャップ」と異なる。真核生物のｍＲＮＡおよび真核生物のいくつかの他のＲＮＡ分子の、キャップ（例えばｍ7Ｇキャップ）を、本明細書において「ｍ7Ｇ−キャップ」または「キャップヌクレオチド」または「ヌクレオチドのキャップ」とも称することがあり、「オリゴヌクレオチドのキャップ」または「オリゴキャップ」と区別する。我々は、キャップヌクレオチドがグアニン塩基のＮ７のメチル基に加えて他の修飾を有しているかもしれないとしても、このキャップヌクレオチドを有するＲＮＡ（例えば真核生物のｍＲＮＡ）を本明細書において「ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡ」と称することがある。
本明細書において用いる場合、「核酸に対するピロホスファターゼ」または「ピロホスファターゼ」（「ＰＰａｓｅ」）は、ｍ7ＧによってキャッピングされたＲＮＡの三リン酸の架橋のピロホスフェート結合、または５’三リン酸を有する一次ＲＮＡ内の５’三リン酸の三リン酸の架橋のピロホスフェート結合を切断し、５’一リン酸を有するＲＮＡを生成する酵素を意味する。核酸に対するピロホスファターゼは、タバコ酸性ピロホスファターゼ（「ＴＡＰ」）であってもよいし、本方法において同様の活性を有する任意の他の酵素であってもよい。例えば、バキュロウイルスのホスファターゼ（ＢＶＰ）（Takagi, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9808-9812, 1998; Gross, C.H. and Shuman, S., J. Virology 72: 7057-7063, 1998）、ヒトのＰＩＲ１のタンパク質（Deshpande, T. et al., J. Biol. Chem. 274: 16590-16594, 1999）、およびE. coliのＲｐｐＨのタンパク質（Deana, A et al., Nature 451: 355-358, 2008）が、５’三リン酸化ＲＮＡを５’一リン酸化ＲＮＡへ変換することが報告されている。これらの酵素のキャッピングされたＲＮＡに対する活性は報告されていないが、この活性はテストされると考えられる。そして、ＢＶＰ、ＰＩＲ１およびＲｐｐＨのタンパク質の中から選択されるタンパク質のいずれかが、キャッピングされたＲＮＡを５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する活性を有しており、この活性を有するタンパク質のいずれかが、本発明の方法のいずれかにおいて核酸に対するピロホスファターゼとして使用され得ることが考られる。
「ポリＡポリメラーゼ」（「ＰＡＰ」）は、ＡＴＰを選択的に用いて、ＡＭＰ残基をＲＮＡのヒドロキシル化された３’末端に組み込む、テンプレートに依存しないＲＮＡポリメラーゼを意味する。このＲＮＡポリメラーゼは、ほとんどの真核生物、原核生物、および真核生物のウイルスにて発見される。植物、動物、細菌およびウイルスから研究されたＰＡＰ酵素は全て、同一の総括反応を触媒するので（例えば、Edmonds, M, Methods Enzymol., 181; 161-180, 1990参照）、これらのＰＡＰ酵素は構造的に高度に保存されており（例えば、Gershon, P, Nature Structural Biol. 7: 819-821, 2000参照）、特定の配列または大きさのＲＮＡ分子に対する固有の特異性を欠いている。ＰＡＰが、ポリアデニル化シグナルＡＡＵＡＡＡ（Wilusz, J and Shenk, T, Cell 52: 221, 1988）を認識するタンパク質から分離された場合、種々の原料のいずれかから精製された野生型ＰＡＰ酵素および組換えＰＡＰ酵素を、本発明のキットおよび方法に使用することができる。
「一次ＲＮＡ」または「ＲＮＡの一次転写産物」は、ＲＮＡポリメラーゼによってインビボまたはインビトロにて合成され、最も５’側のヌクレオチドの５’炭素に三リン酸を有するＲＮＡ分子を意味する。
「複製」は、ＲＮＡ分子をテンプレートとして、ＲＮＡ依存的なＲＮＡポリメラーゼ（すなわち、「レプリカーゼ」）によってＲＮＡ分子を形成または合成することを意味する。
本発明によれば、「ＲＮＡの増幅」は、ＲＮＡ産物を合成することになる方法である。ＲＮＡの増幅では、ＲＮＡ配列またはその相補的な配列のコピー数が、サンプル中に存在する配列のコピー数と比較して増加する。例えば、オリゴｄＴのプロモータープライマー（promoter primer）を第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーとして用いる方法を、Van Gelder, R.N., et al.によってProc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1663, 1990に記載されたようなアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を合成するために用いることができる。この目的のためのキットは市販されており、用いることができる。このようなキットとしては、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（Madison, WI）から入手可能な種々のキット（１ラウンド（1-round）TARGETAMP（登録商標）アミノアリル（Aminoallyl）aRNA増幅キット（Amplification Kit）、２ラウンド（2-round）TARGETAMP（登録商標）アミノアリルaRNA増幅キット、１ラウンドTARGETAMP（登録商標）aRNA増幅キット、２ラウンドTARGETAMP（登録商標）aRNA増幅キットなど）のような１ラウンド増幅キットおよび２ラウンド増幅キットが挙げられる。また、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー（またはＰＣＲプライマー）を、（例えば本明細書に記載の方法を用いて）センスＲＮＡを合成するためのＲＮＡを増幅する方法に用いることができる。この第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーは、５’部分にて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータの一鎖に関する配列を示し、３’部分にて、第一鎖ｃＤＮＡの３’末端のタグによって示される配列に対して相補的な配列を示す。したがって、これらの実施形態において、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドは、５’一リン酸基を有するＲＮＡを含んでいる目的のＲＮＡの５’末端に連結される。これにより、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが得られる。次いで、この５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡをテンプレートとして用い、ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを使用して第一鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、ＤＮＡポリメラーゼと第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー（またはＰＣＲプライマー）を用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含んでいる二本鎖ｃＤＮＡを合成する。最後に、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータに結合し、このプロモータから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて、二本鎖ｃＤＮＡからインビトロにて転写することによって、増幅されたセンスＲＮＡを合成する。サンプル中の目的のＲＮＡが５’一リン酸基を予め有していない場合、このＲＮＡを５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する。例えば、キャッピングされたＲＮＡおよび５’ポリリン酸基を有するＲＮＡの両方を含んでいる目的のＲＮＡを５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換するためには、タバコ酸性ピロホスファターゼを用い、５’ポリリン酸基を有するＲＮＡのみを５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換するためには、ＲＮＡポリホスファターゼを用いる。
また、本発明は、二本鎖ｃＤＮＡの合成を必要とするＲＮＡを増幅する方法に限定されない。例えば、本発明は、米国特許出願公開第２００４／０１７１０４１号明細書に記載されたような、ＲＮＡを増幅する方法および組成物を含んでいる。米国特許出願公開第２００４／０１７１０４１号明細書に記載されたような、ＲＮＡを増幅する方法および組成物は、一本鎖のプロモータに機能的に連結された一本鎖のテンプレートを用いてＲＮＡを合成することができるＲＮＡポリメラーゼを用いるものであり、例えば、ＭＩＮＩ−ＶのＲＮＡポリメラーゼを用いる方法である。ＭＩＮＩ−ＶのＲＮＡポリメラーゼは、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥから入手可能なＭＩＮＩ−Ｖ（登録商標）のインビトロ転写キット（In Vitro Transcription Kit）に備えられている。これらの実施形態において、一本鎖のプロモータがｃＤＮＡの５’末端または３’末端のどちらか一方に連結されており、後に一本鎖ＤＮＡテンプレートを（例えば、ＭＩＮＩＶ ＲＮＡポリメラーゼを用いて）インビトロにて転写することによって、増幅されたアンチセンスＲＮＡまたは増幅されたセンスＲＮＡをそれぞれ生じる。なお、このｃＤＮＡは、ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーを伸長するｍＲＮＡの逆転写によって作製されたものである。
本明細書において規定される場合、「ＲＮＡリガーゼ」は、アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド（ヒドロキシル基を３’末端に有している。）とＲＮＡのドナー（５’末端に５’リン酸基を有している。）との連結またはライゲーションを触媒することができる酵素または酵素組成物を意味する。本発明はＲＮＡリガーゼに関して限定されず、任意の原料からの任意のＲＮＡリガーゼを、本発明の方法およびキットの実施形態に用いることができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＮＡリガーゼは、バクテリオファージＴ４の遺伝子６３によってコードされたポリペプチド（ｇｐ６３）である。この酵素は、普通、単純に「Ｔ４ＲＮＡリガーゼ」と称されるが、Ho, CKおよびShuman, Sが第２のＲＮＡリガーゼ（ｇｐ２４．１）をProc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 12709-12714, 2002に記載してから、今ではより正確に「Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１」と呼ばれる。第２のＲＮＡリガーゼ（ｇｐ２４．１）は、バクテリオファージＴ４の遺伝子２４．１によってコードされており、今では「Ｔ４ＲＮＡリガーゼ ２」と呼ばれる。特に断りの無い限り、本明細書において「Ｔ４ＲＮＡリガーゼ」を用いた場合、「Ｔ４ＲＮＡリガーゼ１」が意図される。例えば、いくつかの他の実施形態において、ＲＮＡリガーゼは、米国特許第７３０３９０１号明細書に開示されたような、Thermus scotoductusに感染するバクテリオファージＴＳ２１２６からのＲＮＡリガーゼ遺伝子に由来するか、またはこの遺伝子にコードされるポリペプチド（すなわち、バクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）である。
本明細書にて規定する場合、「ＲＮＡ５’モノホスファターゼ」または「ＲＮＡ５’モノホスファターゼ酵素」または「ＲＮＡ５’モノホスファターゼの組成物」または「ＲＭＰ」は、このＲＮＡ５’モノホスファターゼが、キャッピングされていない一次ＲＮＡ（５’三リン酸基を有するＲＮＡを意味する。）を５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ実質的に消化しない条件で、５’一リン酸基を有するＲＮＡを５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換することができる酵素または酵素組成物を意味する。異なる実施形態において、ＲＮＡ５’モノホスファターゼを使用する本発明の方法に用いるための適切なＲＮＡ５’モノホスファターゼは、用いた条件下において、反応物中の５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える、または９０％を超える５’一リン酸化ＲＮＡを５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換するが、この反応混合物における５’三リン酸化ＲＮＡ（例えば、原核生物のｍＲＮＡ）を実質的に消化しない酵素である。例えば、いくつかの実施形態において、これは、従来公知の方法（５’一リン酸化ＲＮＡおよび５’三リン酸化ＲＮＡを増幅するための適切なプライマーの対を用いる、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＴ）を用いて評価することができる。ＲＮＡ５’モノホスファターゼを、ＲＮＡの５’一リン酸基を５’ヒドロキシル基へ消化する能力に関して本明細書にて規定したが、ＲＮＡ５’モノホスファターゼは他の酵素活性を有することもできる。例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼは、３’一リン酸基を有するＲＮＡから３’一リン酸基を除去するという酵素活性を有していてもよい（この酵素活性を有している必要はない）ことが本明細書において理解される。さらに、ＲＮＡ５’モノホスファターゼは、ＤＮＡの末端、リボヌクレオチドの末端、もしくはデオキシリボヌクレオチドの末端から、または核酸でない基質の末端からでさえも一リン酸基を切断することが可能であってもよい（可能である必要はない）。ＲＮＡ５’モノホスファターゼを使用する本方法の何れかに用いることができる適切なＲＮＡ５’モノホスファターゼの１つは、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１、EPICENTRE, Madison, WI， USA）。である。本発明はＲＭＰ１を含んでいる実施形態に限定されず、５’一リン酸基を有するＲＮＡを５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ特異的に変換し、同じ反応混合物中に存在する５’三リン酸基を有するＲＮＡを５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換しないという、意図された目的のために機能するのであれば、任意のＲＮＡ５’モノホスファターゼを用いることができる。
ＲＮＡ５’モノホスファターゼの酵素活性は、種々の基質（例えば、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩、または、５’一リン酸基を有する核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ））、条件、およびアッセイを用いる様々な方法によって規定され得る。例えば、１ユニットの規定としては、以下のような規定を用いることが可能である。ＲＮＡ５’モノホスファターゼの１ユニットは、「１５ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸塩および５ｍＭの塩化カルシウムを含む、ｐＨ９．６の１Ｍのジエタノールアミン中で、２５℃にて１分間あたり、１マイクロモルのｐ−ニトロフェニルリン酸塩を脱リン酸化させる酵素の量」と規定し得る。ユニットの規定の別の例としては、以下のような規定を用いることができる。ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（例えば、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）の１モレキュラーバイオロジーユニット（１ molecular biology unit（MBU））は、「適切な反応バッファ中で、３０℃にて６０分間あたり、５’一リン酸基を有する核酸の基質の規定された調製物の１マイクログラムから、５’一リン酸基を除去する酵素の量」と規定し得る。例えば、ＲＭＰ１にとって適した上記反応バッファは、ｐＨ７．５の３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、６６ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５ｍＭの塩化カルシウム、および０．５ｍＭのＤＴＴを含んでいる。例えば、ＲＭＰ１にとっての上記基質は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、バクテリアの１６Ｓおよび／または２３ＳリボソームＲＮＡの規定された調製物、または、５’一リン酸基を有する規定されたＤＮＡ）である。
本明細書にて規定する場合、「ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ」または「ＲＮＡポリホスファターゼ」は、５’三リン酸基を有するＲＮＡ（例えば、真核生物または原核生物のキャップされていない初期のＲＮＡ）または５’二リン酸基を有するＲＮＡを、５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する酵素または酵素組成物であって、キャップされたＲＮＡ（例えば、ｍ7ＧによってキャップされたＲＮＡを５'一リン酸基を有するＲＮＡへ変換しない酵素または酵素組成物、を意図する。しかしながら、本明細書中に規定する酵素活性を有することに加えて、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、別の酵素活性をも備え得る。例えば、本明細書中において、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、ＲＮＡ分子の５’末端に連結した２つ以上のリン酸塩を含む、あらゆる直鎖型のポリリン酸塩からリン酸塩を除去し得る。加えて、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または、非核酸であるポリリン酸塩基質の５’末端に連結した２つ以上のリン酸を含む、直鎖型のポリリン酸をも分解し得る。本発明のいくつかの実施形態は、アルミニウム誘導性のバクテリア遺伝子（例えば、Escherichia coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼ１、または、E. coliの５’ＲＰＰ１、または、E. coliのＲＰＰ１、または、場合によっては単にＲＰＰ１）によってコードされたＲＮＡ５'ポリホスファターゼを用いる、組成物、キットおよび方法を包含している。精製されたＥ. coliのＲＮＡ５'ポリホスファターゼ１酵素は、おおよそ１９ｋＤａのタンパク質であった。ＲＮＡ５'ポリホスファターゼ１の核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）が決定された（図４）。明細書中に用いられる用語「ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ」は、特に指定されない限り、タンパク質または遺伝子を意図し得る。
E. coliのＲＮＡ５'ポリホスファターゼ１（Ｅ. coliの５'ＲＰＰ１）の安定した酵素組成物を提供するために適した酵素保存用のバッファとしては、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴおよび０．１%の非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んでいる５０%グリセロール溶液を挙げることができる。
ＲＮＡ５’ポリホスファターゼの酵素活性は、種々の基質（例えば、ＮＴＰ、初期のＲＮＡ、６，８−ジフルオロ−4-メチルウンベリフェリルホスフェート（methylumbelliferyl phosphate））、条件、およびアッセイを用いる様々な方法によって規定され得る。例えば、１ユニットの規定としては、以下のような規定を用いることが可能である。ＲＮＡ５’ポリホスファターゼの１ユニットは、「標準的な反応アッセイの条件下で、３７℃にて６０分間あたり、ＡＴＰから１ナノモルの無機リン酸塩を放出する酵素の量」と規定し得る。例えば、E. coliのＲＮＡ５'ポリホスファターゼ１の場合、標準的な反応アッセイの条件としては、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１%のＢＭＥおよび０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００からなる反応バッファ中に１ｍＭ ＡＴＰを添加したものを用いる。
本発明の方法は、E. coliの５’ＲＰＰ１を使用することに限定されない。上記方法における反応条件下でE. coliの５’ＲＰＰ１と同等の酵素活性を有する、あらゆるＲＮＡ５'ポリホスファターゼが用いられ得る。本明細書中で規定するように、「ＲＮＡ５'ポリホスファターゼ」または「ＲＮＡポリホスファターゼ」は、上記ＲＮＡポリホスファターゼが、キャップされたＲＮＡの５'末端を５'一リン酸塩へ分解しない条件下において、初期のＲＮＡの５'三リン酸基を５'一リン酸へ分解することができる酵素組成物を意図する。例えば、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは、Escherichia coliのＲＮＡ５'ポリホスファターゼ１（E. coliのＲＰＰ１）およびShigellaのＲＮＡ５'ポリホスファターゼ１（ShigellaのＲＰＰ１）の中から選択され得る。しかしながら、本発明の方法については、上記酵素は、ＲＮＡ５'ポリホスファターゼ活性を有する、あらゆる材料に由来するあらゆる酵素であり得る。例えば、バキュロウイルスのホスファターゼ（ＢＶＰ）（Takagi, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9808-9812, 1998; Gross, C.H. and Shuman, S., J. Virology 72: 7057-7063, 1998）、ヒトＰＩＲ１タンパク質（Deshpande, T. et al., J. Biol. Chem. 274: 16590-16594, 1999）およびE. coli ＲｐｐＨタンパク質（Deana, A et al., Nature 451: 355-358, 2008）は、５'が三リン酸化ＲＮＡを5'が一リン酸化ＲＮＡへ変換することが報告されているが、これらの活性が、キャップされたＲＮＡへ作用することは報告されていない。この活性を試験するとともに、キャップされたＲＮＡを、５’に一リン酸基を有するＲＮＡへ変換する活性を有していないＢＶＰ、ＰＩＲ１およびＲｐｐＨタンパク質の中から選択された何れかのタンパク質を、ＲＮＡポリホスファターゼを用いる本発明の何れかの方法におけるＲＮＡポリホスファターゼとして用いられ得ることが予期される。
本明細書中で規定するように、「ＲＮａｓｅＨ」は、同じ反応混合物中に存在するＤＮＡまたはハイブリダイズしていないＤＮＡを分解することなく、ＲＮＡとＤＮＡとの複合体中のＲＮＡを特異的に分解する酵素または酵素組成物を意図する。典型的なＲＮａｓｅＨとしては、E. coliのＲＮａｓｅＨ、ＨＹＢＲＩＤＡＳＥＴＭ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＲＮａｓｅＨ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ＲＮａｓｅＨ（例えば、ＴｔｈまたはＴｆｌ ＲＮａｓｅＨ）が挙げられる。しかしながら、本発明は、ＲＮＡとＤＮＡとの複合体中のＤＮＡにアニーリングしたＲＮＡを特異的に分解するという目的のために機能する限り、ＲＮａｓｅＨについて限定されない。
本明細書中で規定するように、「ＲＮａｓｅＩ」は、同じ反応混合物中に存在する二本鎖のＲＮＡ、一本鎖のＤＮＡまたは二本鎖のＤＮＡを分解することなく、全てのジヌクレオチド中の１本鎖ＲＮＡをヌクレオシド−３’−一リン酸へ特異的に分解する酵素または酵素組成物を意図ずる。典型的なＲＮａｓｅＩとしては、E. coliのＲＮａｓｅＩが挙げられる。しかしながら、本発明は、同じ反応混合物中に存在する二本鎖のＲＮＡ、一本鎖のＤＮＡまたは二本鎖のＤＮＡを分解することなく、一本鎖のＲＮＡを特異的に分解するという目的のために機能する酵素である限り、ＲＮａｓｅＩに限定されない。
本明細書中で用いるように、「ヌクレオシド」は、ペントース糖へ共有結合したプリン（グアニン（Ｇ）またはアデニン（Ａ））、またはペントース糖へ共有結合したピリミジン（チミン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）またはシチジン（Ｃ））からなる化合物を意図するが、「ヌクレオチド」は、ペントース糖のヒドロキシル基の１つがリン酸化されたヌクレオシドを意図する。
本明細書中で用いるように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドが共有結合した配列（sequence）である。当該配列において、１つのヌクレオチド内の糖の３’の位置は、隣のヌクレオチド内の糖の５’の位置へ、ホスホジエステル基によって結合している。上記配列において、ヌクレオチド残基（ベース（bases））は、特定の配列（例えば、ヌクレオチドの直線状の順序）にて連結している。本明細書中で用いるように、「オリゴヌクレオチド」は、短いポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの一部分を意図する。典型的なオリゴヌクレオチドは、略２〜略１００ベースの配列を含んでいる。用語「オリゴ」は、時には、用語「オリゴヌクレオチド」の代わりに用いられる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、アクセプタのオリゴヌクレオチド（「アクセプタオリゴ」、「オリゴヌクレオチドアクセプタ」、「オリゴアクセプタ」、「アクセプタ」または「アクセプタ分子」などとも呼ぶ）である。アクセプタのオリゴヌクレオチドは、自身の３’末端にヒドロキシル基を有している。このヒドロキシル基は、アクセプタのオリゴヌクレオチドを、５’一リン酸を有するＲＮＡ分子（ドナー）へ連結させることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）からなるか、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を含んでいる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）からなるか、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含んでいる。オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチド（ＲＮＡ）からなるいくつかの好ましい実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、「アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド」、「ＲＮＡのアクセプタオリゴ」、「ＲＮＡアクセプタ」または「ＲＮＡオリゴヌクレオチドアクセプタ」などである。これらは、自身の３’末端にヒドロキシル基を有しており、ＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）またはバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼ）によって、５'末端に一リン酸基を有するＲＮＡ分子（例えば、「ＲＮＡドナー」または「ＲＮＡドナー分子」など）に連結され得る。
直鎖の核酸分子は、「５’末端（５’エンド）」および「３’末端（３’エンド）」を有していると考えられている。その理由は、置換モノヌクレオチド内の糖の５’炭素および３’炭素において、核酸のホスホジエステル結合が生じるからである。５’炭素に対して新たな結合を生じるポリヌクレオチドの末端は、５’末端ヌクレオチドである。３’炭素に対して新たな結合を生じるポリヌクレオチドの末端は、３’末端ヌクレオチドである。本明細書で用いるように、「末端ヌクレオチド」とは、３’または５’末端に存在するヌクレオチドを意図する。
核酸分子は、「５’エンド」および「３’エンド」を有していると考えられている。その理由は、キャップを除けば（本明細書の他の箇所に記載したように）、モノヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を介して、一方向へ連結されてオリゴヌクレオチドを形成する。このとき、１つのモノヌクレオチド内の糖の５’炭素に結合したリン酸が、隣接するモノヌクレオチド内の糖の３’炭素に結合した酸素へ結合される。それ故に、５’リン酸が、モノヌクレオチド内の糖の３’炭素の酸素へ結合しない場合には、オリゴヌクレオチドの末端は、５’エンドと呼ばれる。３’酸素が、後に続くモノヌクレオチド内の糖の５’リン酸塩へ結合しない場合には、オリゴヌクレオチドの末端は、３’エンドと呼ばれる。
本明細書中で用いるように、用語「５’（5'-of）」および「３'（3'-of）」は、一本鎖の核酸中に存在する別の化学基、核酸または核酸配列に対する、特定の化学基、核酸または核酸配列の位置または方向を意図する。例えば、ＲＮＡのアクセプタオリゴの３'エンドにある３'ヌクレオチドの３'位置に存在するヒドロキシル基には、ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡドナー分子の５'エンドが連結され得るが、当該ヒドロキシル基は、ＲＮＡアクセプタのオリゴヌクレオチド内のあらゆる他の化学基または核酸の３'である。全ての他の化学基、ヌクレオチドまたはヌクレオチド配列は、ＲＮＡアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’エンドの５’である。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ プロモーター配列は、ＲＮＡアクセプタのオリゴヌクレオチドの３’エンドに存在するヌクレオチドの５’であり得る。当業者は、これらの用語を、核酸化学および核酸構造、特に、標準的な核酸ヌクレオチド内の３’および５’の位置の糖に関連付けて理解するであろう。第１の核酸配列が、１つの鎖の第２の配列の３'である場合には、第１の配列の相補鎖は、相補鎖の第２の配列の相補鎖の５’である。
ポリペプチド分子は、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有すると考えられている。その理由は、ペプチド結合は、第１のアミノ酸のバックボーンのアミノ基と、第２のアミノ酸のバックボーンのカルボキシル基との間で生じるからである。
「ＲＮＡトリホスファターゼ」は、キャップヌクレオチド（例えば、ｍ7Ｇ）を真核生物のｍＲＮＡの５'末端へ加えるキャッピング酵素のシステムの酵素または酵素のサブユニットを意図する。ＲＮＡトリホスファターゼは、初期のｍＲＮＡ転写物の５'三リン酸を５'二リン酸へ分解する触媒作用を有している。いくつかのキャッピング酵素のシステムでは、ＲＮＡトリホスファターゼは、グアニルトランスフェラーゼ活性をも有するタンパク質の一活性である（例えば、ワクシニアのキャッピンング酵素に関して）。一方、別のキャッピング酵素のシステムでは、ＲＮＡトリホスファターゼとグアニルトランスフェラーゼ活性とが別々のタンパク質である（例えば、Saccharomyces cerevisiae）。初期のｍＲＮＡ転写物の５’三リン酸を５’二リン酸へ分解する活性を有する、あらゆるＲＮＡトリホスファターゼが、本発明の方法に用いられ得る。
用語「サンプル」または「生物学的サンプル」は、非常に広い意味で用いられ、生物学的原料および環境に起因する原料（environmental sources）を含むあらゆる原料から得られる、サンプルまたは標本を包含する。本明細書中で用いるように、生物から得られる生物学的サンプルを指して用いられる用語「サンプル」は、液体、固体、組織および気体を含んでいる。本発明の好ましい実施形態では、生物学的サンプルとして、体液、分離された細胞、固定化された細胞、および細胞溶解物などが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、上記サンプルは、ホルマリンで固定化されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片であり、当該サンプル中に含まれるＲＮＡには、分解されたＲＮＡ分子が含まれる。当該分解されたＲＮＡには、分解されたキャッピングされたＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有する分解されたＲＮＡ、５’一リン酸基を有する分解されたＲＮＡ、および／または、５’ヒドロキシル基を有する分解されたＲＮＡが含まれる。それ故に、サンプル中の１つ以上のＲＮＡ分子に５’ライゲーションによりタグを付加するための方法におけるいくつかの実施形態では、上記サンプルは、分解されたＲＮＡを含んでいる。上記方法は、サンプル中の１つ以上の個々の分解されたＲＮＡ分子（例えば、分解された、キャッピングされたＲＮＡ、または分解された、５’三リン酸化ＲＮＡ）に、５’ライゲーションによりタグを付加するために用いられる。これらの実施形態のいくつかでは、取得され、分離され、精製され、または、解析された上記１つ以上のＲＮＡ分子は、天然に生じた分解されていないＲＮＡに由来する、ＲＮＡ分子の５’末端部分のみを、または、主として５’末端部分を含む（例えば、キャッピングされたＲＮＡまたは５’三リン酸化ＲＮＡの５’末端部分のみ）。しかしながら、これらの例は、本発明に用いられるサンプルのタイプを限定するものではない。
「タグ」は、「タグ配列」と呼ばれる配列を示すＤＮＡを意図し、この「タグ配列」は、タグが連結または付加されたＤＮＡの同定、認識、および／または、分子学的もしくは生化学的な操作を可能にする。（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長するための、プライマーがアニーリングする部位（換言すれば、プライミング部位）を提供することによって、例えば、ＤＮＡの配列の解析または核酸の増幅のための、または、例えば、ライゲーション反応のためのオリゴヌクレオチドがアニーリングするための部位を提供することによって（例えば、テンプレート依存的なＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションのための「ライゲーションのテンプレート」、例えば、シークエンシング−バイ−ライゲーション（sequencing-by-ligation）のため）、または、オリゴデオキシリボヌクレオチドがアニーリングするための部位を提供するために、例えば、ハイブリダイゼーションによって配列を解析するために（Drmanac et al in U.S. Patent Application Nos. 20090011943; 20090005252; 20080318796; 20080234136; 20080213771; 20070099208; and 20070072208参照））。ＤＮＡ分子にタグを結合させる工程は、本明細書中で、しばしは「タグの付加（タグ化（tagging））」と呼び、タグを付加されたＤＮＡを「タグ化された」（例えば、「タグ化されたＤＮＡ」）と呼ぶ。上記タグは、１つ以上の「タグ部」または「タグドメイン」を有し得、本明細書において、これらは、所望の意図された目的または適用のための配列を提示するタグの、部分またはドメインを意図する。異なるタグドメインの名称および記載は、便宜上、異なる実施形態において、タグの異なる部分またはドメインの意図された目的および適用を、理解および議論することを容易にするようになっている。しかしながら、これらの名称および記載は、タグ、または当該タグのあらゆるタグドメインの使用または適用を何ら制限することはない。それ故に、あらゆる特定のタグまたはタグドメインは、意図された目的または適用、および最初の目的または適用に加えて（または代えて）、あらゆる目的に使用され得る。例えば、「捕捉用のタグドメイン（capture tag domain）」または「捕捉用のタグ（capture tag）」は、タグドメインが結合されたｓｓＤＮＡ断片の捕捉を容易にすることを目的にした配列を提示するためのタグドメインを意図する（例えば、ビーズ上または他の表面上に存在するタグ化されたＲＮＡまたはＤＮＡを捕捉するためのアニーリング部位または親和性タグを提供するために、例えば、タグドメイン配列のアニーリング部位は、表面上の特異的な配列（例えば、ビーズ上、マイクロチップ上、マイクロアレイ上、配列決定用のビーズ（sequencing bead）上のプローブなど）にアニーリングすることによって、捕捉を可能にする。）。本発明の方法のいくつかの実施形態では、表面上の相補的なプローブにアニーリングすることによって、タグ化されたＲＮＡまたはＤＮＡが捕捉された後で、捕捉タグドメインは、上記タグ化されたＲＮＡまたはＤＮＡ（または、上記タグ化されたＲＮＡまたはＤＮＡの相補体）をテンプレートとして用いて、ＤＮＡ合成を準備するための部位を提供する。別のいくつかの実施形態では、上記捕捉タグドメインは、親和性に基づき結合する分子を含むまたは親和性に基づき結合する分子からなる、化学基または構成成分へ結合される（例えば、タグ化されたＲＮＡまたはＤＮＡの５’部分が、第１の親和性に基づき結合する分子（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、抗原または当該抗原に結合する抗体など）へ結合され、第１の親和性に基づき結合する分子と特異的な結合対を形成する第２の親和性に基づき結合する分子が結合された表面上に、タグ化されたＲＮＡまたはＤＮＡを捕捉することを可能にする。）。「配列決定用タグドメイン（sequencing tag domain）」または「シークエンシングタグ（sequencing tag）」は、タグが結合したＲＮＡまたはＤＮＡの配列決定（sequencing）を容易にする配列を提示するためのタグドメインを意図する（例えば、合成によって、配列決定のためのプライミング部位を提供するため、または、ライゲーションによって、配列決定のためのアニーリング部位を提供するため、または、ハイブリダイゼーションによって、配列決定のためのアニーリング部位を提供するため）。例えば、いくつかの実施形態では、上記配列決定用タグドメインは、タグ化されたＤＮＡまたは当該タグ化されたＤＮＡの相補鎖のプライミングＤＮＡ合成（priming DNA synthesis）のための部位を提供する。「検出用タグドメイン（detection tag domain）」または「検出タグ（detection tag）」は、本発明の方法を用いて作製されたタグ化されたＲＮＡまたはＤＮＡの検出を容易にするための、配列または検出可能な化学的な構造体もしくは生化学的な構造体を提示するタグドメインを意図する（例えば、上記配列または化学的な構造体は、検出可能な分子を含むか、または、検出可能な分子に結合される。上記検出可能な分子は、可視的な色素、蛍光性の色素、化学発光性の色素、他の検出可能な色素；基質の存在下で検出可能な酵素（例えば、ＮＢＴおよびＢＣＩＰ存在下のアルカリホスファターゼ、または、適切な基質存在下のペルオキシダーゼ）；検出可能なタンパク質（例えば、ＧＦＰ（green fluorescent protein））；および、検出可能な構造体へ結合する親和性に基づき結合する分子、または、別の検出可能な親和性に基づき結合する分子と親和性のペアまたは特異的な結合のペアを形成し得る親和性に基づき結合する分子；または、当該分野で公知の他の多くの検出可能な分子またはシステム、から選択される。）。「アドレスタグドメイン（address tag domain）」または「アドレスタグ（address tag）」は、特定のサンプルを同定することができる配列を提示するタグドメインを意図する（例えば、タグ化されたＲＮＡまたはＤＮＡは、各サンプルに対して異なる配列を提示するための、異なるアドレスタグドメインを有する。）。「制限酵素部位ドメイン（restriction site domain）」は、エンドヌクレアーゼ（restriction endonuclease）による分解を容易にする配列を提示するためのタグドメインを意図する。例えば、いくつかの実施形態では、制限酵素部位ドメインは、ジタグ化ＲＮＡまたはＤＮＡ（di-tagged RNA or DNA）を作製するために用いられる。いくつかの実施形態では、上記制限酵素部位ドメインは、タグドメイン内に、相補的な２本鎖の５'末端を作製するために用いられる。当該末端は、テンプレート依存的なＤＮＡリガーゼを用いて、別のＤＮＡ分子へ連結され得る。いくつかの好ましい実施形態では、タグ内の制限酵素部位ドメインは、たとえ標的のＤＮＡ内に存在したとしても稀にしか存在しない制限酵素認識部位の配列を提示する（例えば、ＮｏｔＩまたはＡｓｃＩのような、稀にしか切断しないエンドヌクレアーゼ（rare-cutting restriction endonuclease）の制限酵素認識部位）。いくつかの好ましい実施形態では、制限酵素部位ドメイン内の制限酵素認識部位は、タイプＩＩのエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ エンドヌクレアーゼなど）のものである。１つのタグドメインは、２つ以上の異なるタグドメインの機能、目的または適用を、包含または提供し得る（例えば、配列決定用タグドメインは、捕捉タグドメインと、アドレスタグドメインまたは検出用タグドメインとの両方を含み得る。）。上記タグは、特定の目的、適用または機能の何れかに用いられるために、１つ以上の異なるドメインに関して更に記載される必要はない。
「転写」は、ＤＮＡ分子をテンプレートとして用いる、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の形成または合成を意図する。本発明では、転写に用いられるＲＮＡポリメラーゼは限定されない。例えば、Ｔ７型のＲＮＡポリメラーゼが用いられ得る。
本明細書において「Ｔ７型のＲＮＡポリメラーゼ」は、Ｔ７型のバクテリオファージに由来するＲＮＡポリメラーゼの野生型または変異型を意図する。「Ｔ７型のＲＮＡポリメラーゼ」は、ファージにコードされた酵素、および、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をＤＮＡベクター内へクローン化して、バクテリアまたは他の細胞内で発現させることによって得られる酵素、の両方を包含している。このことは、試験されてきた全てのＴ７型のバクテリオファージの遺伝的構成（genetic organization）が、Ｔ７の遺伝的構成と本質的に同じであるという事実に基づいている。本発明におけるＴ７型のバクテリオファージの例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ファージ Ｔ３、ｐｈｉＩ、ｐｈｉＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ、Ａ１、１２２、ｃｒｏ、Ｃ２１、Ｃ２２、およびＣ２３；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ファージ ｇｈ−１； Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ファージ ＳＰ６；Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ファージ ＩＶ；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ファージ ＶｉＩＩＩ；およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ファージ Ｎｏ．１１ （Hausmann, Current Topics in Microbiology and Immunology 75: 77-109, 1976; Korsten et al., J. Gen. Virol. 43: 57-73, 1975; Dunn, et al., Nature New Biology 230: 94-96, 1971; Towle, et al., J. Biol. Chem. 250: 1723-1733, 1975; Butler and Chamberlin, J. Biol. Chem. 257:5772-5778, 1982）が挙げられる。変異ＲＮＡＰ（Sousa et al., U.S. Patent No. 5,849,546; Padilla, R and Sousa, R, Nucleic Acids Res., 15: e138, 2002; Sousa, R and Mukherjee, S, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol., 73: 1-41, 2003）の例としては、Ｔ７ ＲＮＡＰ Ｙ６３９Ｆ変異酵素、Ｔ３ ＲＮＡＰ Ｙ６４０Ｆ変異酵素、ＳＰ６ ＲＮＡＰ Ｙ６３１Ｆ変異酵素、６３９および７８４の両位置のアミノ酸が変化しているＴ７ ＲＮＡＰ、６４０および７８５の両位置のアミノ酸が変化しているＴ３ ＲＮＡＰ、または、６３１および７７９の両位置のアミノ酸が変化しているＳＰ６ ＲＮＡＰが挙げられる。上記変異ＲＮＡＰは、本発明の方法またはアッセイのいくつかの実施形態にも用いられ得る。特に、このような変異酵素は、ｄｄＮＴＰおよび他の特定の基質に加えて、ｄＮＴＰおよび２'−Ｆ−ｄＮＴＰを用い（corporate）得る。上記ｄＮＴＰおよび２'−Ｆ−ｄＮＴＰは、特定の特性および用途を有するＲＮＡ分子を合成するために、利点を有している。いくつかの実施形態では、ファージ Ｎ４ ｍｉｎｉ−ｖＲＮＡＰ（当該Ｎ４ ｍｉｎｉ−ｖＲＮＡＰは、）は、Ｔ７型のＲＮＡＰである。なお、当該ファージ Ｎ４ ｍｉｎｉ−ｖＲＮＡＰは、Ｎ４ ｖＲＮＡＰの９９８−２１０３のアミノ酸に対応する、転写活性のあるＮ４ ｖＲＮＡＰの１１０６アミノ酸からなるドメインであって、Ｔ７ ＲＮＡＰと共通した特定のドメインを有している（Kazmierczak, K.M., et al., EMBO J 21: 5815-5823, 2002; 米国特許第7,452,705号明細書）。別のいくつかの実施形態では、非標準的な核酸（例えば、２'−Ｆ−ｄＮＴＰなど）が組み込まれ得るＮ４ ｍｉｎｉ−ｖＲＮＡＰ Ｙ６７８Ｆ変異酵素（米国特許第7,452,705号明細書）は、Ｔ７型のＲＮＡＰである。転写を行うために、ＲＮＡポリメラーゼは、「ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター」、「転写プロモーター」または単に「プロモーター」と呼ばれる、凡そ２５ヌクレオチドの長さのＤＮＡ配列を認識して当該配列に結合し、そこからの転写を開始する。ほとんどの場合、プロモーター配列は、２本鎖である。本明細書中では、ＲＮＡ合成のテンプレートになる配列へ共有結合する、２本鎖プロモーター中の配列は、「センス鎖」または「センスプロモーター配列」と規定され、当該配列の相補鎖は、「アンチセンス鎖」または「アンチセンスプロモーター配列」と規定される。
本明細書において、用語「バッファ」または「バッファ試薬」は、溶液へ加えられたときに、当該溶液のｐＨの変化を抑制する物質が意図される。本明細書において、用語「反応バッファ」は、その中で酵素反応が行われるバッファ溶液を意図する。本明細書において「保存バッファ」は、その中で酵素が保存されるバッファ溶液を意図する。
本明細書において、用語「キレート剤（chelator）」または「キレート試薬（chelating agent）」は、金属カチオンへの結合に利用できる孤立電子対（a lone pair of electrons）を有する１つ以上の原子を備えた、あらゆる材料を意図する。本明細書において、「二価塩（divalent salt）」または「二価金属カチオン（"divalent metal cation）」は、溶液中で２＋の電化（net 2+ charge）を有する金属（例えば、Ｍｇ、 Ｍｎ、 ＣａまたはＳｒなど）を備えた、あらゆる塩を意図する。
本明細書において、用語「相補的（complementary）」または「相補性（complementarity）」は、塩基対合則にしたがったヌクレオチド配列に関連して用いられる。例えば、配列「５'−Ａ−Ｇ−Ｔ−３'」は、配列「３'−Ｔ−Ｃ−Ａ−５'」に対して相補的である。相補性は、「部分的」であり得、この場合には、塩基対合則にしたがって、核酸のいくつかのみが対合する。または、核酸間が、「完全（complete）」相補性または「全体（total）」相補性であってもよい。核酸配列間の相補性の程度は、核酸配列間のハイブリダイゼーションの効率および強さに対して、重大な影響を及ぼす。これは、核酸のハイブリダイゼーションに依存した検出方法と同様に、増幅反応において極めて重要である。
用語「ホモロジー」は、ある核酸配列の別の核酸配列に対する相補性の程度をいう。部分的なホモロジーであってもよいし、完全なホモロジー（すなわち、相補性）であってもよい。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列が標的の核酸にハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する配列であり、「実質的に相同である」という機能的な用語を用いるために称される。完全に相補的な配列の、標的の配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、ストリンジェンシーが低い条件下においてハイブリダイゼーションのアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、および溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて試験され得る。実質的に相同な配列またはプローブは、ストリンジェンシーが低い条件下において完全に相同な配列が標的に結合する（すなわち、ハイブリダイズする）ことを競合し、阻害する。ストリンジェンシーが低い条件では非特異的な結合が許されることを言っているのではない。ストリンジェンシーが低い条件は、２つの配列が互いに結合することが特異的な（すなわち、選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的な結合がないことは、相補性を欠いているか、相補性の程度が極低い（例えば、相補性が約３０％未満である）第２の標的を用いることによって試験され得る。特異的な結合が少ないか、存在しない場合、プローブは標的の核酸にハイブリダイズしない。
二本鎖の核酸配列（ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなど）に関して用いる場合、用語「実質的に相同な」は、本明細書に記載したストリンジェンシーが低い条件下において二本鎖の核酸配列の１つまたは両方にハイブリダイズし得る任意のプローブをいう。
本明細書において用いる場合、用語「ハイブリダイゼーション」または「アニーニング」は、相補的な核酸の鎖の対合に関して用いる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸の鎖の間の会合の強度）は、従来技術において周知の多くの要因によって影響を受ける。このような要因としては、核酸間の相補性の程度や、塩濃度、形成されたハイブリッドのＴm（融解温度）、他の成分の存在（例えば、ポリエチレングリコールまたはベタインの存在または非存在）、ハイブリダイズする鎖のモル濃度および核酸の鎖のＧ：Ｃ含有量のような条件によって影響を受ける関連する条件のストリンジェンシーが挙げられる。
用語「単離された」または「精製された」を、「単離されたポリヌクレオチド」、「単離されたオリゴヌクレオチド」、「精製されたＲＮＡ」、「精製されたキャッピングされたＲＮＡ」のように核酸に関して用いる場合、この用語は、核酸の原料に一般的に関連する夾雑物の少なくとも１つから分離され、同定された核酸をいう。したがって、単離または精製された核酸（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）は、天然に発見される形態または設定と異なる形態または設定で存在するか、あるいは、天然に発見される核酸を処置方法または精製方法に供する前に存在する形態または設定と異なる形態または設定で存在する。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は、他の遺伝子と一緒に宿主細胞の染色体にて発見される。そして、特定のＲＮＡ（例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ）は、多くのタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に発見される。単離または精製された、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。単離または精製されたポリヌクレオチドまたは核酸をタンパク質の発現に利用する場合、このポリヌクレオチドは、センス鎖またはコーディング鎖を最小限に含んでいる（すなわち、このようなポリヌクレオチドは一本鎖であり得る。）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含んでいてもよい（すなわち、このようなポリヌクレオチドは二本鎖であってもよい。）。
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および局面を例証するために記載され、その範囲に限定されるように解釈されるべきではない。
〔ＲＮＡポリホスファターゼの発見および精製〕
本発明者らがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中にてインサイチュでEscherichia coliタンパク質を復元させたときに、ＲＮＡポリホスファターゼ（ＲＰＰ）を見出した。γ−32Ｐで末端標識されたＲＮＡポリメラーゼの存在下でポリアクリルアミドを重合させることによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）分離ゲルを調製した。このＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７反応緩衝液、γ−32Ｐで標識されたＧＴＰ、ならびに未標識のＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰを用いて、線状ＤＮＡのインビトロ転写によって合成した。電気泳動の後に、ＳＤＳを含まない緩衝液中でゲルをインキュベートすることによってＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動用緩衝液を交換して、ＳＤＳを除去し、インサイチュにてタンパク質の復元を可能にした。ゲルを緩衝液中で一晩インキュベートし、ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Invitrogen, Carlsbad, CA）で染色した。染色されなかったバンドは、約３０，０００の分子量を有して移動したことの証拠である。しかし、ゲルを７．５％酢酸で固定し、次いで乾燥し、そしてオートラジオグラフィに供したときに、放射活性を欠いた２つのバンドが観察された。これらは、分子量が約３０，０００（３０ｋＤａ）および約１９，０００（１９ｋＤａ）を有して移動した。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色は、この１９ｋＤａバンドにおけるＲＮＡの存在を示し、１９ｋＤａタンパク質によって32Ｐで末端標識されたＲＮＡ脱リン酸化と一致したが、分解はなかった。３０ｋＤａバンドにおけるＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色がなかったことは、バンド中のタンパク質がＲＮａｓｅ（おそらくＲＮａｓｅＩ）であることを一致した。
酵素活性についてのアッセイを単純化し、酵素の精製を容易にするために、本発明者らは代替的な酵素基質を探索した。本発明者らは、蛍光性のホスファターゼ基質である６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ）が、１９ｋＤａタンパク質の基質であることを見出した。加水分解の際に、この基質は蛍光産物である６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（ＤｉＦＭＵ）に変換された。これは、３５８ｎｍでの吸収ピークおよび４５５ｎｍでの励起ピークを有している。驚いたことに、Ｒｐｐ酵素は、ＤｉＦＭＵＰを基質として用いた場合に４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４ＭＵＰ）を基質として用いた場合よりも、５０倍よりも高い活性を示した。よって、標準的な紫外蛍光照射器を用いて、ＤｉＦＭＵＰを使用して、ポリアクリルアミドゲル上でインサイチュでのタンパク質の復元の後に、Escherichia coliの総抽出物中の単一の１９ｋＤａの蛍光バンドを検出した。このバンドをまた、クーマシーブルータンパク質色素によって染色した。単純なＤｉＦＭＵＰアッセイを用いて、本発明者らは、ＲＮＡポリホスファターゼタンパク質の精製をスケールアップし得、そしてその物理的特性および酵素学的特性をさらに特徴付けた。例えば、いくつかの実施形態において、以下の方法の１つ以上をもちいてＲＮＡポリホスファターゼ活性を精製した：ポリチレンイミン分画；硫酸アンモニウム分画；Ｂｉｏ−Ｅｒｘ７０陽イオン交換カラムクロマトグラフィ（例えば、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ７０クロマトグラフィ）；ゲルろ過カラムクロマトグラフィ（例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００）；および陰イオン交換カラムクロマトグラフィ（例えば、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）。ＲＮＡポリホスファターゼ活性は、イオン交換カラムおよびゲルろ過カラムの両方において単一のピークとしてクロマトグラフされ、このことは１９ｋＤａタンパク質が、この活性を示す唯一の酵素であることを示唆する。
〔ＲＮＡポリホスファターゼをコードする遺伝子の同定〕
ＲＮＡポリホスファターゼ酵素タンパク質を同定し、このタンパク質をコードする遺伝子座を決定するために、ＲＮＡポリホスファターゼをゲル中にてトリプシンで消化し、生じたトリプシン消化物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF MS）を用いて分析した。ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを用いてＮＣＢＩデータベースにてタンパク質配列と比較した場合、ＲＮＡポリホスファターゼに由来するトリプシン消化したペプチドの配列はEscherichia coli 53638からのタンパク質と一致した。実際に上位１２のマッチ（タンパク質スコアの範囲が４３９〜２２９、ｐ＜０．０５）は、異なる系統のEscherichia coliからのデータベースにおける同一のタンパク質であった。異なる系統のEscherichia coliからの１２個のタンパク質のアラインメントは、これらが実質的に同一であることを示した。Escherichia coli K12（ＭＧ１６５５）において、このタンパク質（ローカスタグｂ２２５２）は、機能が未知のアルミニウム誘導性タンパク質として記載されている。対応するアルミニウム誘導性（ａｉｓ）遺伝子は、５０．０４分にマップし、約２００アミノ酸のタンパク質をコードする。これは、必須でない遺伝子として分類され、無機リン酸を含まない、規定の培地中で増殖される培養物に０．２ｍＭ ＺｎＳＯ4が添加された後にそのｍＲＮＡレベルが１６倍誘導される。この遺伝子のタンパク質産物に対する情報は利用可能でない。なぜなら、このタンパク質はこれまでに検出されていないからである。理論に縛られることなく、このタンパク質のＯＲＦにおける保存されたドメインの検索は、このタンパク質がホスホグリセリン酸ムターゼ様のスーパーファミリーの万バーであり得ることを示す。このファミリーに置ける酵素の触媒活性は、ヒスチジンのリン酸化を含む。
〔ａｉｓ遺伝子のクローニングおよび過剰発現〕
本発明者らは、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの制限酵素部位を含む特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いた、Escherichia coli K12（MG1655）から単離したゲノムＤＮＡを用いたポリメラーゼ鎖反応によってａｉｓ遺伝子（ｂ２２５２ローカス）を増幅した。ＮｄｅＩ制限配列を含むフォワードプライマーを操作して第１コドンをＧＴＧからＡＴＧに変更した。増幅された産物を、Ｔ７ベースの誘導性のｐＥＴプラスミド発現ベクターの対応する部位へクローニングし、次いでEscherichia coli EC100コンピテント細胞の形質転換、およびリコンビナントの選択を行い、挿入ＤＮＡの配列がａｉｓ遺伝子であることを確認した。リコンビナントクローンからのタンパク質のＲＮＡポリホスファターゼ活性を、以前と同様にインサイチュゲルアッセイを用いて蛍光によって検出し、誘導の差異のタンパク質の過剰発現をクーマシーブルー染色によってモニタリングした。これらの実験において、精製したネイティブＲＮＡポリホスファターゼをコントロールとして用いた。誘導されなかった細胞に存在する内因性のＲＮＡポリホスファターゼの検出を最小化するために、リコンビナントクローンからのタンパク質のほぼ全量をゲルアッセイに用いた。
誘導されたリコンビナント細胞から調製したタンパク質抽出物において、蛍光およびクーマシーブルー染色のバンドが２つ見られた。誘導されたリコンビナント細胞からのこれらのバンドの１つは、ＲＮＡポリホスファターゼ活性を有する可溶性タンパク質であった。これは、サイズおよび特性において１９ｋＤａのネイティブなＲＮＡポリホスファターゼ酵素と同一であった。さらに、ＲＮＡポリホスファターゼ活性を有する第２の２４ｋＤａタンパク質もまた、誘導されたリコンビナント細胞において過剰発現されていた。このタンパク質は封入体に優勢に存在した。精製したネイティブな酵素、ならびにリコンビナントの２４ｋＤａおよび１９ｋＤａのＲＮＡポリホスファターゼ酵素のアミノ末端を、エドマン分解によって決定した。精製したネイティブな酵素およびリコンビナントの１９ｋＤａタンパク質のアミノ末端の配列（Ｓ−Ｎ−Ｇ−Ｌ−Ｐ）は同一であった。２４ｋＤａリコンビナントタンパク質のアミノ末端の配列（Ｍ−Ｌ−Ａ−Ｆ）はクローニングしたａｉｓ遺伝子のアミノ末端に対応した。ネイティブな酵素のアミノ末端配列Ｓ−Ｎ−Ｇ−Ｌ−Ｐは、このタンパク質がシグナルペプチダーゼによってプロセッシングされ、このネイティブな酵素がペリプラズム空間に存在することを、示唆する。ネイティブな酵素の亜細胞分布を決定するために、Escherichia coli Ｂ細胞を、スフェロプラストに変換し、上清（ペリプラズム画分）に放出されたＲＮＡポリホスファターゼ活性と、スフェロプラスト（細胞質画分）に残存したＲＮＡポリホスファターゼ活性とを、インサイチュでのゲルアッセイの蛍光によって測定した。ＲＮＡポリホスファターゼを、ペリプラズム画分において検出した。この活性は、１９ｋＤａサイズの精製されたネイティブな酵素と同時に移動した。細胞質画分もまたＲＮＡポリホスファターゼ活性を含み、これは、１９ｋＤａタンパク質として移動したが、２４ｋＤａのＲＮＡポリホスファターゼを検出しなかった。理論に縛られることなく、このデータは、リコンビナントの１９ｋＤａのＲＮＡポリホスファターゼが、２４ｋＤａタンパク質がそのアミノ末端をプロセッシングされることによってもたらされるペリプラズムタンパク質であることを示唆する。非リコンビナント細胞の細胞質画分において観察される１９ｋＤａのＲＮＡポリホスファターゼ活性の存在は、細胞からスフェロプラストへの変換が不完全であったことに起因し、リコンビナント細胞における２４ｋＤａの活性なタンパク質の存在は、おそらく、リコンビナント細胞内の封入体に存在するプロセッシングされていないタンパク質に起因する。ａｉｓ遺伝子は、Zalucki, YM, et al. (Nucleic Acids Res. 35: 5748-5754, 2007) によって、分泌タンパク質に分類されるが、推定の切断部位と同定されたアミノ末端とが異なるということは、興味深いことである。
〔精製されたＲＮＡポリホスファターゼの酵素学的特性〕
精製したＲＮＡポリホスファターゼ酵素は広い範囲のｐＨにわたって活性である（例えば、ｐＨ５．０〜ｐＨ８．０の間の範囲において最適な活性を有している。）。驚くことに、そして他のいくつかのリン酸除去酵素とは異なって、ＲＮＡポリホスファターゼ酵素は二価カチオン（例えばＭｇ2+）を必要とせず、ＥＤＴＡの存在下で活性である。実際に、１ｍＭのＭｇ2+カチオンの存在下で、この酵素は阻害された。
核酸（例えば、一次ＲＮＡ）または５’二リン酸化ＲＮＡ（例えば、キャッピング酵素ＲＮＡトリホスファターゼ反応）からのβリン酸およびγリン酸の除去に加え、精製した約１９ｋＤａの単一サブユニットのＲＮＡポリホスファターゼは、広範な他の基質からリン酸基を除去する。この基質としては、ヌクレオシド５’−二リン酸およびヌクレオシド５’−三リン酸（例えば、ＮＴＰｓ、ＮＤＰｓ、ｄＮＴＰｓ、ｄＮＤＰｓ）が挙げられる。加水分解の産物は、ヌクレオシド５’一リン酸および無機オルソリン酸である。ヌクレオシド５’一リン酸は基質ではない。ＡＤＰは、ＡＴＰと比較して５０％の効率で加水分解される。この酵素は、段階的な様式でヌクレオシド三リン酸を加水分解し、無機オルソリン酸をピロリン酸の代りに放出する。薄層クロマトグラフィによる、ＡＴＰ加水分解産物の経時的な分析は、最初にＡＤＰの蓄積を示し、次いで、ＡＭＰが出現する。興味深いことに、ポリホスフェートは、ＡＴＰと同様に、ＲＮＡポリホスファターゼのよい基質であるが、無機ピロリン酸は基質ではないようだ。シンメトリカルな二ヌクレオシド三リン酸であるＧ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇおよびそのメチル化誘導体ｍ7Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇは極わずかしか加水分解されない。例え、加水分解されたとしても、この酵素はエキソポリホスファターゼであることが示唆される。また、ＤｉＦＭＵＰ（この酵素の最初のスクリーニングおよび同定において使用された基質）はよい基質であり、４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートおよびｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）はこの酵素にとってよい基質ではない。そして、ビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェートは極わずかしか加水分解されない。理論に縛られることなく、６位または８位のフッ素が、単一のリン酸を有するとはいえ、おそらくこの酵素の基質であるＤｉＦＭＵＰを生成する役割を担う。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートおよびホスホアミノ酸であるアミノセリンは、本質的には、基質として認識されなかった。
本発明者らは、三リン酸基または二リン酸基を一リン酸の５’末端に有しているＲＮＡを切断し得るが、キャッピングされたＲＮＡを一リン酸に切断し得ないＲＮＡポリホスファターゼは、当該分野においてこれまでに記載されていない。この活性は、種々の方法に有用であり、本明細書中に記載されている広範な方法に有用である。しかし、理論に縛られることなく、本発明者らは、ＲＮＡポリホスファターゼを供給する細菌が、天然には類似の機能のための酵素を使用するということを信じることができない。また、本発明者らは、原核生物においてＲＮＡポリホスファターゼがペリフェラズム性の酵素であるという知見が、この酵素の天然の機能が必須栄養素（例えばリン酸）をその環境内にて捕捉することであり得るということを示している。よって、本明細書中に記載されている方法は、例え本発明の目的に好都合であるとはいえ、人為的であり得る。にもかかわらず、これらのホスファターゼおよび他のいくつかのホスファターゼは多機能性であり広範なリン酸化化合物（例えば、ヌクレオチド、糖リン酸、リン脂質、およびポリホスフェート）に対して活性であるので、天然においてＲＮＡポリホスファターゼが担う役割は未知のままである。
〔５’ライゲーションによるタグの付加における使用のための、サンプルからの総ＲＮＡの単離〕
いくつかの実施形態において、（例えば、MASTERPURETM ＲＮＡ精製キット（EPICENTRE, Madison, WI）を、製造業者のプロトコルに従って用いて、あるいは当該分野における別の好適な方法を用いて）総ＲＮＡをサンプルから単離した。いくつかの実施形態において、総ＲＮＡを細菌の培養物から単離した。いくつかの実施形態において、総ＲＮＡを培養したヒトＨｅｌａ細胞から、MASTERPURETM ＲＮＡ精製キット（EPICENTRE, Madison, WI）を用いて単離した。いくつかの実施形態において、総ＲＮＡを（例えば、Frias-Lopez, J et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3805-3810, 2008に記載されているような）周囲の供給原料から単離した。いくつかの実施形態において、総ＲＮＡを、リゾビウムまたは他の窒素固定共生細菌を含む、マメ科植物の根粒から単離した。いくつかの実施形態において、総ＲＮＡを、細菌性の病原体またはマイコプラズマ性の病原体に感染した組織の、動物またはヒトの臨床サンプルから単離した。いくつかの実施形態において、総ＲＮＡを、ヒトまたは動物のサンプルから（例えば、癌標本または同一タイプの正常細胞から）単離した。
〔５’ポリホスフェート基を有するＲＮＡを、５’一リン酸基を有するＲＮＡに変換するＲＮＡ５’ポリホスファターゼを用いた、ＲＮＡの処理〕
いくつかの実施形態において、１μｇのサンプルＲＮＡ（未処理または別の酵素で処理済）を、２０μＬの反応混合液中で３７℃で３０分間インキュベートする。反応混合液には、１×ＲＮＡ ５’ポリホスファターゼ反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ ７．５），０．１Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ ＢＭＥ、および０．０１％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００を含む。）にE. coli ＲＮＡ ５’ポリホスファターゼＩ（ＲＰＰ Ｉ，ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）が含まれている。２０ユニットのＲＰＰ Ｉを標準的な２０μＬの反応において使用したが、いくつかの実験においては異なる量の酵素を使用した。いくつかの実施形態において、ＲＰＰ Ｉ処理したサンプルＲＮＡ、および／またはTERMINATOR処理したサンプルＲＮＡを、Zymo Research RNA cleanup column (Orange, CA)を用いて精製し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。アガロースゲル分析によって示されたように、ＲＰＰ Ｉ酵素は、AMPLISCRIBETM T7 Kit (EPICENTRE)からの１．４ｋｂの５’三リン酸化されたコントロール転写物を、TERMINATOR感受性の５’一リン酸化された形態に変換した。同一の条件下でのコントロール実験において、TERMINATOR酵素はＲＰＰ Ｉ処理した５’キャッピングされた９１５ベースの転写物を消化しなかった。これは、５’ポリリン酸化されたＲＮＡ（５’キャッピングされたＲＮＡではない）を５’一リン酸化された形態へ変換する際のＲＰＰ Ｉ酵素の特異性を示す。
いくつかの実施形態において、ＲＰＰ Ｉ処理したＲＮＡを、フェノール：クロロホルム、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって清浄化した。サンプルをＲＰＰ Ｉで処理する前にＲＭＰ１で処理した場合（以下の実施例を参照のこと）のいくつかの実施形態において、ＲＭＰ１酵素活性は、ＥＤＴＡの添加によって阻害され、ＲＭＰ１処理したＲＮＡからの反応混合物全体を、２×濃度のＲＰＰ Ｉ反応混合物１０μＬに添加した。
いくつかの実施形態において、酵素でのＲＮＡの処理からの反応混合物を、フェノール：クロロホルム（１：１混合）で一度、クロロホルムで一度抽出し、そして、エタノール沈殿によって、ＲＮＡを水相から変換し、１０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解する。
ＲＮＡをポリアデニル化することが所望される場合のいくつかの実施形態において、ＲＰＰ Ｉ反応からの反応混合物の容量全体を、ポリ（Ａ）テール化反応に使用する。
〔５’一リン酸基を有するＲＮＡを、５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡに変換するための、ＲＮＡ５’一ホスファターゼでのＲＮＡの処理〕
サンプルＲＮＡが５’ライゲーションによるタグの付加のための本発明の方法において使用される場合のいくつかの実施形態において、約１μｇのサンプルＲＮＡを、約１〜約１００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔｓ（ＭＢＵ）のＲＮＡ５’一ホスファターゼ１（ＲＭＰ１、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）と、反応緩衝液中にて３０℃で６０分間インキュベートする。反応緩衝液は、以下からなる：（ｉ）３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸，ｐＨ ７．５，６６ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，５ｍＭ 塩化カルシウム，および０．５ｍＭ ＤＴＴ；あるいは（ｉｉ）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ８．０，２ｍＭ 塩化マグネシウム，１００ｍＭ 塩化ナトリウム，および５ｍＭ 塩化カルシウム。好ましい実施形態において、ｒＲＮＡ（例えば、真核生物の１８Ｓ ｒＲＮＡおよび２６Ｓ ｒＲＮＡまたは２８Ｓ ｒＲＮＡ、あるいは原核生物の１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ）を、本発明の方法において使用する前にサンプルから除去する。これは、他の方法（例えば、RIBOMINUSTMキット）がほとんどのサンプル中に存在する高レベルのｒＲＮＡ（例えば総ＲＮＡの約９８％）を除去するためにＲＭＰ１よりも効率的であることを出願人らが見出したからである。ｒＲＮＡがサンプルから除去される場合、５’ライゲーションによるタグの付加のため、および普遍的でない他の５’一リン酸化ＲＮＡ分子（例えばｍｉＲＮＡ）の下流の分析のために、本発明の方法を用いることがより容易である。
にもかかわらず、出願人は、種々のクラスのＲＮＡ分子を含むサンプルを用いて、ｍＲＭＰ１の活性および特異性を研究するために多くの実験を行った。例えば、いくつかの実験において、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかからなるサンプルＲＮＡを、約１０〜６０ ＭＢＵのＲＭＰ１（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）とともに、上述した反応緩衝液中にてインキュベートした：（ｉ）Ｈｅｌａ細胞からの総ＲＮＡ；（ｉｉ）参照用ヒト総ＲＮＡ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）；（ｉｉｉ）AMPLISCRIBETM T7 High Yield Transcription Kit (EPICENTRE)からの、１．４Ｋｂの５’三リン酸化されたコントロール転写物。いくつかの実施形態において、ＲＭＰ１処理したサンプルＲＮＡを、次いで、製造業者の指示に従って、TERMINATORTM 5'-Phosphate-dependent Exonuclease (EPICENTRE, Madison, WI)で処理した。コントロール反応物を、同一条件下にて、ＲＭＰ１なしまたはTERMINATORTM酵素なしでインキュベートした。次いで、いくつかの他の実施形態において、ＲＭＰ１処理したサンプルおよびTERMINATORTM処理したサンプルを、Zymo Research RNA cleanup column (Orange, CA)を用いて精製し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。２０μＬの反応物あたり約１０ＭＢＵ以上のＲＭＰ１は、TERMINATORTM酵素によるＨｅｌａの１８Ｓ ｒＲＮＡまたは２８Ｓ ｒＲＮＡの消化物を減少させ、２０μＬの反応物あたり２０ＭＢＵ以上のＲＭＰ１は、TERMINATORTM酵素によるＨｅｌａの１８Ｓ ｒＲＮＡまたは２８Ｓ ｒＲＮＡの消化物を、顕著に（しかし完全ではなく）減少させた。STRATAGENEの参照ヒトＲＮＡを用いた同様の反応において、２０μＬの反応物あたり約１０ＭＢＵ以上によって、TERMINATORTM酵素による１８Ｓ ｒＲＮＡまたは２８Ｓ ｒＲＮＡの消化物を検出可能に減少させ、２０μＬの反応物あたり２０ＭＢＵのＲＭＰ１は、TERMINATORTM酵素による１８Ｓ ｒＲＮＡまたは２８Ｓ ｒＲＮＡの消化物を顕著に減少させ、２０μＬの反応物あたり約４０ＭＢＵのＲＭＰ１は、TERMINATORTM酵素による消化から１８Ｓ ｒＲＮＡまたは２８Ｓ ｒＲＮＡを、２０μＬの反応物あたり２０ＭＢＵのＲＭＰ１よりも約２倍保護した。このことは、ＲＭＰ１が５’一リン酸化された１８Ｓ ｒＲＮＡまたは２８Ｓ ｒＲＮＡを脱リン酸化して、TERMINATOR ５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼによる消化から保護したようである。約１０ＭＢＵのＲＭＰ１を用いたAMPLISCRIBETM T7キットからの１．４Ｋｂの５’三リン酸化されたコントロール転写物の前処理は、１．４Ｋｂの転写物をTERMINATOR酵素による消化に感受性にしなかったが、ＲＭＰ１での処理の後の、ＲＭＰ１処理した１．４Ｋｂの転写物のＲＰＰＩでの処理は、１．４Ｋｂの転写物のTERMINATOR酵素による消化を生じさせた。よって、試験した条件下で、ＲＭＰ１は、１．４Ｋｂの５’三リン酸化された転写物を、TERMINATOR感受性の５’一リン酸化形態またはTERMINATOR耐性の５’ヒドロキシル化形態へ変換しなかった。このことは、ＲＭＰ１酵素およびＲＰＰ Ｉ酵素のそれぞれの特異性を示している。他の反応において、５’キャッピングされたＲＮＡ転写物が未処理であろうと、ＲＭＰ１酵素で最初に処理されてようと、５’キャッピングされた９１５ベースのＲＮＡ転写物は、TERMINATOR酵素によって消化されなかった。この５’キャッピングされたＲＮＡ転写物は、AMPLISCRIBETM T7-Flash Transcription Kit (EPICENTRE)を用いるインビトロ転写、引き続くSCRIPTGUARDTM Capping Enzyme (EPICENTRE)によって調製され、これらの両者は、製造業者の指示に従った。（いくつかの実施形態において、反応混合物を、フェノール：クロロホルム（１：１混合）で一度、クロロホルムで一度抽出し、ＲＮＡをエタノール沈殿によって回収し、ＲＭＰ１および／またはTERMINATORの処理の後に、１０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解する。いくつかの実施形態において、反応混合物を抽出せずに、次の工程に進める前（例えば、TERMINATOR反応またはＲＮＡ ５’ポリホスファターゼ反応の前）に１０〜２０ｍＭ ＥＤＴＡを添加する。）
５’三リン酸化ＲＮＡと比較した、５’一リン酸化ＲＮＡに対するＲＭＰ１、ＲＰＰ Ｉおよび他の酵素の特異性を分析するために、さらなる実験を行った。これらの実験について、γ32Ｐ標識した５１マーの５’三リン酸化ＲＮＡを、AMPLISCRIBETM T7 transcription kit (EPICENTRE)およびγ32Ｐ−ＧＴＰを用いて、インビトロ転写によって調製し、そして、同一の配列の、α32Ｐ標識した５１マーの５’三リン酸化ＲＮＡを、先ず、APexTM thermolabile alkaline phosphatase (EPICENTRE)とともにAMPLISCRIBETM T7 transcription kit (EPICENTRE)を用いて作製した未標識の５１マーのＲＮＡを処理して５’ヒドロキシル化された５１マーのＲＮＡを調製し、次いで、γ32Ｐ標識したＡＴＰおよびT4 polynucleotide kinase (EPICENTRE)を用いて５’末端を標識することによって調製した。γ32Ｐおよびα32Ｐで標識した５１マーのＲＮＡの各々を、ＲＭＰ１ (EPICENTRE)、ＲＰＰ Ｉ (EPICENTRE) 、ApexTM thermolabile alkaline phosphatase、SCRIPTCAPTM capping enzyme (EPICENTRE) 、tobacco acid pyrophosphatase (ＴＡＰ, EPICENTRE) 、およびTERMINATORTM 5'-phosphatase dependent exonuclease (EPICENTRE)とともに、それぞれインキュベートした。ＲＭＰ１（２ＭＢＵ ＠〜１ＭＢＵ／ｐｍｏｌ）は、約０．１３ｐｍｏｌのα32Ｐ−一リン酸標識された５１マーのＲＮＡを５’ヒドロキシル化形態に、ApexTM alkaline phosphataseを用いた場合と同程度に脱リン酸化した。また、α32Ｐ一リン酸標識された５１マーのＲＮＡは消化され、32Ｐ標識されたＲＮＡは、TERMINATORエンドヌクレアーゼとのインキュベートの後に検出されなかった。しかし、ＲＰＰ Ｉ、ＴＡＰまたはSCRIPTCAPTM キャッピング酵素によって、32Ｐ標識は、α32Ｐ一リン酸で標識された５１マーのＲＮＡから除去されなかった。ＲＭＰ１（２ＭＢＵ ＠〜１ＭＢＵ／ｐｍｏｌ）もTERMINATORエンドヌクレアーゼも、γ32Ｐ一リン酸で標識された５１マーのＲＮＡから32Ｐ標識を除去しなかったが、APex alkaline phosphatase、ＲＰＰ Ｉ、ＴＡＰ、およびSCRIPTCAPTM キャッピング酵素のそれぞれによって、32Ｐ標識は、γ32Ｐ一リン酸で標識された５１マーのＲＮＡから除去された。
〔総ＲＮＡのポリアデニル化〕
以下の成分を、ＲＮＡのポリ（Ａ）テール化について上述した工程からの２０μＬの各反応混合物に室温で添加した。
Figure 0005774474
１０×ポリＡポリメラーゼＲｘｎ緩衝液：０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），２．５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＤＴＴ、および１００ｍＭ ＭｇＣｌ2．
反応混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。
いくつかの実施形態において、反応混合物を、フェノール：クロロホルム（１：１混合）で一度、クロロホルムで一度抽出し、エタノール沈殿によってＲＮＡを水相から回収し、１０μＬの１０ｍＭ ＴＥ溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に溶解する。
〔２’−Ｏ−メチル化された３’末端ヌクレオチドを有するＲＮＡのポリアデニル化〕
２’−Ｏ−メチル基を３’末端ヌクレオチドに有するＲＮＡ分子（２’ＯＭｅ−ＲＮＡ）（例えば、植物ｍｉＲＮＡｓ、生殖細胞特異的ｐｉｗｉＲＮＡｓ、内因性ｓｉＲＮＡｓ）は、E. coliまたはSaccharomycesのポリＡポリメラーゼによってほとんどまたはまったくポリアデニル化されない。しかし、添加したＡＴＰの非存在下でＴ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２によって、ライゲーションアクセプタとして用いた２’ＯＭｅ−ＲＮＡの３’末端に、ライゲーションドナーとして用いた、アデニル化された５’−ＡＭＰ（Ａ５’ｐｐ５’Ａ）に、１または２個のＡＭＰ残基をライゲーションした後に、１または２個のＡＭＰ残基を有した２’ＯＭｅ−ＲＮＡが、ポリＡポリメラーゼ（EPICENTRE）によってポリアデニル化され得ることを、出願人は見出した。また、ライゲーションアクセプタとして用いた２’ＯＭｅ−ＲＮＡまたは２’ＯＭｅ基を欠いた同一配列のＲＮＡよりも２０００倍モル過剰のＡ５’ｐｐ５’Ａの、延長されたインキュベーション（例えば４時間以上）は、多数のＡＭＰヌクレオチドが各ＲＮＡ分子の３’末端に連続的に連結されたことに起因して、約１５〜２０ヌクレオチドのポリ（Ａ）テールの付加を生じさせた。両方の方法によって得られたポリアデニル化された２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子は、相補的なオリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）のプライマー、またはオリゴ（ｄＴ）またはオリゴ（ｄＵ）を含むアンカーされたプライマーを用いる逆転写によるｃＤＮＡ合成のテンプレートである。このようなプライマーはタグを５’部位に示す（上記タグは、例えば、例えば、Ｒｏｃｈｅ４５４配列決定用プラットホーム、あるいは他の次世代の配列決定用プラットホームまたはより古い配列決定用プラットホームを用いて配列決定するための、配列決定用テンプレートを生成するための、配列決定用タグドメイン（例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４Ａまたは４５４Ｂの配列決定用タグドメイン）を含む、または、配列決定用タグドメインからなる。）。
Ａが伸長した２’ＯＭｅ−ＲＮＡは、３’末端にさらなるＡヌクレオチドのない２２ヌクレオチドＲＮＡではなく、以前に記載したようにポリＡポリメラーゼを用いて定量的にテール化された。次いで、このポリ（Ａ）テール化された分子は、製造業者EPICENTREのプロトコルに従う、ＡＴＰ依存的なＴ４ ＲＮＡリガーゼ１媒介性の標準的なライゲーション反応において、５’ライゲーションによるタグを付加され得る。
よって、いくつかの実施形態において、ライゲーションドナーとしての精製されたＡ５’ｐｐ５’Ａ（１ｍＭ）を、０．５μＭの２’ＯＭｅ−ＲＮＡアクセプタ（ＩＤＴより得た。）とともに２２℃で種々の時間にわたってインキュベートした。この２’ＯＭｅ−ＲＮＡアクセプタは、Arabidopsis thaliana miRNA （ｍｉＲ１７３［２’ＯＭｅ］）として同定され、以下の配列を示す：ｒＵｒＵｒＣｒＧｒＣｒＵｒＵｒＧｒＣｒＡｒＧｒＡｒＧｒＡｒＧｒＡｒＡｒＡｒＵｒＣｒＡｍＣ（配列番号３）。インキュベーションを行った反応液（１０μＬ）は、以下を含む：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２０％ ＤＭＳＯ、２０ユニットのScriptGuardTM RNase inhibitor、０．５μＬのAPexTM heat-labile alkaline phosphatase（これは、Ａ５’ｐｐ５’Ａドナーと２’ＯＭｅ−ＲＮＡアクセプタとの間のライゲーション反応から放出された５’−ＡＭＰを脱リン酸化するために含められた。）、および、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１またはＴ４ ＲＮＡリガーゼ２の、種々の量の異なる調製物（全ての酵素をEPICENTREから得た。）。各反応からの２．５μＬのアリコートを、引き続く電気泳動（１６％尿素−ポリアクリルアミドゲル）およびＳＹＢＲゴールドでの染色によって分析した。
ＡＭＰ残基を、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１およびＴ４ ＲＮＡリガーゼ２の両方によって２’ＯＭｅ−ＲＮＡに連結した。これらの実験において、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２が、特に、アデニル化されるリガーゼ酵素分子の割合が低い場合に、２’ＯＭｅ−ＲＮＡへのドナーの連結により効果的であった。１〜約４時間のインキュベーションの後に、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２（５μＭ）は１個以上のＡＭＰ残基を約５０％〜約８０％の２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子に付加した。１２時間のインキュベーションの後に、９０％を超える２’ＯＭｅ−ＲＮＡ分子が、３’末端に連結された１個以上のＡＭＰ残基を有した。１２時間よりも長くインキュベーション時間を延長した場合、および／または、ＲＮＡリガーゼのいずれかの濃度をより高くした（例えば、５〜約５０μＭ）場合、ライゲーション効率が上昇した。
いくつかの実験において、生じた５’ライゲーションによってタグ化されかつポリ（Ａ）テール化されたＲＮＡを、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いた逆転写によってｃＤＮＡに変換し、ＰＣＲによって増幅した（例えば、第一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートを得るために４０μＬの反応物に１０μＬのライゲーション反応混合物を３７℃で１０分間添加し、次いで、酵素を８５℃で１０分間インキュベートすることによって不活性化し、１μＬのＲＮＡｓｅ混合物（EPICENTRE）を用いて５５℃で５分間消化することによる。４０μＬの反応物は、各５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、０．５μＭのアンカーされたオリゴ（ｄＴ）アダプタープライマー：（ＣＴＡＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ）（配列番号４）、および４０ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素（EPICENTRE）を含む。）。
１μＬの、５０倍希釈した第一鎖ｃＤＮＡ合成混合物を、１００μＬの反応混合物中でＰＣＲによって、９４℃で３０秒間、６０℃で１０秒間、および７２℃での１０秒間のサイクルで増幅した。１００μＬの反応混合物は、１×MasterAmpTM PCR PreMix E（EPICENTRE）、２０ｐＭのフォワードＰＣＲプライマー（ＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧ（配列番号５））、２０ｐＭのリバースＰＣＲプライマー（ＴＡＴＡＧＧＴＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＴＧ（配列番号６））、および１μＬのFailSafeTM PCR Enzyme mix（EPICENTRE）を含む。１５サイクルおよび１８サイクルの後に、５μＬのＰＣＲ反応物を、８％ポリアクリルアミドゲル上で分析し、ＳＹＢＲゴールド染色によって可視化した。
次いで、ＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩの制限酵素で消化し、pCDC1-KTM cloning-ready vector（EPICENTRE）に連結し、これを、TransforMaxTM EC100TM cells （EPICENTRE）の形質転換に用いた。無作為に拾い上げた２１個の形質転換体コロニーを配列決定し、予想したｍｉＲ１７３配列に対応することを確認した。
〔タバコの酸性ピロホスファターゼの反応〕
いくつかの実施形態において、ＲＲＰ Ｉ反応工程、またはＲＭＰ１およびＲＲＰ Ｉの反応工程の両方が省略され、タバコの酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）の反応工程によって置き換えられる。例えば、いくつかの実施形態において、１μｇの総ＲＮＡ（これはアルカリホスファターゼで処理されていない。）を、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ６．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ β−メルカプトエタノールおよび０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００の中で、１０ユニットのTobacco Acid Pyrophosphatase（EPICENTRE）とともに、１０μＬの容量にて３７℃で３０分間インキュベートした。コントロール反応を、ＴＡＰ酵素なしで、同一緩衝液中でインキュベートした。
〔５’一リン酸基を有するＲＮＡの、５’ライゲーションによるタグ付加の反応〕
５’ライゲーションによるタグ付加によってタグ化されることが所望される、５’一リン酸化ＲＮＡを含む各サンプルをＲＰＰ ＩまたはＴＡＰで処理し（ポリ（Ａ）テール化反応工程を、その前後に含むかまたは含まない。）、次いで、５’ライゲーションによるタグ付加の反応に供した。上記工程からの反応混合物に以下の成分を室温にて連続的に添加した：
Figure 0005774474
１０×ＲＬＲＴ緩衝液：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、７５０ｍＭ ＫＣｌおよび３０ｍＭ ＭｇＣｌ2．
アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドの例示的な配列：ｒＧｒＡｒＧｒＣｒＧｒＧｒＣｒＣｒＧｒＣｒＣｒＵｒＧｒＣｒＡｒＧｒＧｒＡｒＡｒＡ（配列番号７）．
反応混合物を、３７℃で３０分間インキュベートし、５’一リン酸化ＲＮＡの５’ライゲーションによるタグ付加を生じた。
〔第一鎖ｃＤＮＡ合成反応〕
５’ライゲーションによるタグ付加の後に、５’ライゲーションによってタグ付加したＲＮＡサンプルを、それぞれ第一鎖ｃＤＮＡの合成のための単プレートとして使用する。所望するならば、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーは、第一鎖ｃＤＮＡの合成のためのテンプレートとして用いられる、５’ライゲーションによってタグ付加したＲＮＡの３’末端に相補的でないタグをその５’部位に有する；いくつかの実施形態において、第一鎖ｃＤＮＡ合成ブライマーの５’部位におけるタグは、配列決定用タグドメインを含むか、配列決定用タグドメインからなる。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、先の５’ライゲーションによるタグ付加反応からの反応混合物に以下の成分を添加することによって達成される：
Figure 0005774474
第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの例示的な配列：ＴＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＴＧｄ（Ｔ）18（配列番号８）．
反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、５’および３’にタグ化された第一鎖ｃＤＮＡが生じた。
〔第一鎖ｃＤＮＡの合成の後のＲＮＡの回収〕
第一鎖ｃＤＮＡ合成反応に続いて、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッド中におけるＲＮＡおよび用いられなかったＲＮＡアクセプタオリゴを、ＲＮａｓｅＩおよびＲＮａｓｅＨで消化して、第一鎖ｃＤＮＡのみを得る。これは、ＲＮＡｓｅ混合物（０．５ユニットのRNase Iおよび０．５ユニットのHYBRIDASE TM Thermostable RNase H （EPICENTRE）を含む。）を第一鎖ｃＤＮＡが合成される反応混合物に添加して、次いで５５℃で５分間インキュベートすることによって達成される。
〔第二鎖ｃＤＮＡ合成〕
上述したように合成された第一鎖ｃＤＮＡを、第二鎖ｃＤＮＡの合成のためのテンプレートとして使用する：
Figure 0005774474
第二鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの例示的な配列：ＴＣＡＴＡＣＡＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡ（配列番号９）．
反応混合物を７２℃で１０分間インキュベートし、ｃＤＮＡの各鎖の両端にタグを有する二本鎖ｃＤＮＡが生じる。
次いで、反応混合物を、フェノール：クロロホルム（１：１混合）で一度、クロロホルムで一度抽出し、そして１００μＬのDNA Fragment 2X Precipitation Solution（EPICENTRE）を添加して、１０分間氷上にて冷やす。遠心分離によってＤＮＡを回収し、ペレットを７０％エタノールで一度洗浄し、２５μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解する。
〔ＰＣＲ増幅〕
いくつかの実施形態において、第一鎖ｃＤＮＡを、第二鎖ｃＤＮＡの合成について上述したものと同一の成分を添加することによって（例えば、クローニングのために）ＰＣＲによって増幅する。タグ化された第一鎖ｃＤＮＡを増幅するために、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー（ＰＣＲプライマー１として作用する。）を添加することを除いて、１μＬの以下のプライマー（ＰＣＲプライマー２）もまた、１μＬの水の代りにＰＣＲ反応物に添加する：
ＰＣＲプライマー２の例示的な配列：５’ ＴＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＧ（配列番号１０）．
ＰＣＲ反応混合物を以下の温度でサイクリングする：
工程Ｉ：９５℃で３０秒間
工程ＩＩ：「９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で４分間」を１５サイクル。
次いで、反応混合物をフェノール：クロロホルム（１：１混合）で一度、クロロホルムで一度抽出し、そして１００μＬのDNA Fragment 2X Precipitation Solution（EPICENTRE）を添加して、１０分間氷上にて冷やす。遠心分離によってＤＮＡを回収し、ペレットを７０％エタノールで一度洗浄し、２５μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解する。
〔ＲＮＡ合成反応〕
いくつかの実施形態において、二本鎖ｃＤＮＡまたはＰＣＲ増幅したｃＤＮＡを、ＲＮＡのインビトロ転写のためのテンプレートとして使用する。例えば、先の実施例における第二鎖ｃＤＮＡ合成プライマーは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモータのための配列を示す。このプロモータを含む二本鎖ｃＤＮＡは、センスＲＮＡの合成のためのテンプレートである。ＲＮＡ合成反応は、（例えば、AMPLISCRIBETM SP6 transcription kit，EPICENTREを用いて）、このキットとともに提供される製造業者のプロトコルに従って達成され得る。他の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼプロモータのための配列をその５’部位に示す第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが、第一鎖ｃＤＮＡ合成反応のために使用され得る。例えば、上述した実施例における、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータのための配列を示す第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー、または、TARGETAMPTM ＲＮＡ増幅キットにて提供されるオリゴ（ｄＴ）Ｔ７プロモータを使用して、ポリ（Ａ）テールを有するＲＮＡの第一鎖ｃＤＮＡを合成し得る。次いで、二本鎖ｃＤＮＡまたはＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡの合成に続いて、生じた二本鎖ｃＤＮＡを、（例えば、AMPLISCRIBE TM T7 transcription kit, EPICENTRE、またはTARGETAMPTM ＲＮＡ増幅キット中のインビトロ転写試薬を、各キットとともに提供されるプロトコルに従って用いる）アンチセンスＲＮＡの合成のためのテンプレートとして使用し得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡを、インビトロ転写の間またはその後に標識して、マイクロアレイ分析のための標識として用いる。
〔５’ライゲーションタグ化ＲＮＡの５’末端の分析〕
いくつかの他の実施形態において、タグ化された第一鎖ｃＤＮＡの３’末端（これは、５’ライゲーションによってタグ化された対応するＲＮＡの５’末端に対応する。）をＰＣＲによって増幅する。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）には、ＰＣＲプライマー１および異なる標的に特異的なプライマーを用いる。この目的のために、第一鎖ｃＤＮＡの３’末端に付加されたタグの配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＣＲプライマー１）、および、第一鎖ｃＤＮＡの公知の配列に相補的である第２のＰＣＲプライマーとしての標的特異的なプライマーを、以下に図示されたようなＰＣＲに使用する。第２のＰＣＲプライマーは、分析されることが所望される種々のＲＮＡｓの各々についてのコード配列の５’末端に相補的である：
Figure 0005774474
〔５’タグ化および３’タグ化された第一鎖ｃＤＮＡの、配列決定用テンプレートとしての使用〕
いくつかの他の実施形態において、配列決定用タグドメインを含むか、配列決定用タグドメインからなる５’タグおよび／または３’タグを、（上述したような）第一鎖ｃＤＮＡ合成反応の間に、５’タグ化および３’タグ化された第一鎖ｃＤＮＡに，（ｉ）第一鎖を合成するためのプライマーおよび／または（ｉｉ）アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いることによって導入する：（ｉ）第一鎖を合成するためのプライマーは、その５’部位に第一の配列決定用タグドメインを示し、第一の配列決定用タグドメインは、第一鎖ｃＤＮＡの３’末端に組み込まれる；（ｉｉ）アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドは、第二の配列決定用タグドメインを含むか、第二の配列決定用タグドメインからなり、第二の配列決定用タグドメインは、第一鎖ｃＤＮＡの３’末端にコピーされる（例えば、ここで、配列決定用タグドメインは個々の配列決定用プラットホーム（例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４、Illumina Solexa、Intelligent Biosystems、または他の配列決定用プラットホーム）についての配列決定用アダプタの配列を示す。）。これらの実施形態において、５’タグ化および３’タグ化された第一鎖ｃＤＮＡ分子は、配列決定用のテンプレートとして使用される。いくつかの実施形態において、５’タグ化および３’タグ化された第一鎖ｃＤＮＡ分子は、（一般的には上述されるような）二本鎖の二タグ化されたｃＤＮＡに変換され、そして、この二本鎖の二タグ化されたｃＤＮＡは配列決定用のテンプレートとして使用される。
〔要約〕
タグ化されたＲＮＡ、ならびに第一鎖ｃＤＮＡまたは二本鎖ｃＤＮＡが、５’一リン酸化ＲＮＡの合成について上述されたような方法を用いてキャッピングされていない一次ＲＮＡから、ＲＮＡポリホスファターゼを用いて一次ＲＮＡから、あるいは、ＴＡＰまたはデキャッピング酵素を用いて一次ＲＮＡまたはキャッピングされたＲＮＡから、ＲＮＡのポリアデニル化、ＲＮＡリガーゼを用いるアクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチドへのライゲーションによる５’一リン酸化ＲＮＡの５’ライゲーションタグ化によって調製され得、ＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、および付加されたポリ（Ａ）テールにアニーリングする第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーを用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅＩおよびＲＮａｓｅＨを用いてＲＮＡを除去し、そして、ＤＮＡポリメラーゼ、および第一鎖ｃＤＮＡの一部の配列（ＲＮＡ分子の５’末端に付加された５’ライゲーション化タグに相補的である。）にアニーリングする第二鎖ｃＤＮＡ合成プライマーを用いて第二鎖ｃＤＮＡ（すなわち二本鎖ｃＤＮＡ）を合成する。所望される場合、上述したように合成された二本鎖ｃＤＮＡ分子を、サンプル中の一次ＲＮＡ分子の全長に対応するｃＤＮＡライブラリーを調製するためにプラスミドまたは他のベクターにクローニングし得る。よって、５’ライゲーションによるタグ化方法は、５’キャッピングを有していないために、当該分野においてすでに知られているオリゴキャッピングｃＤＮＡ合成法によって補足し得ない転写物から、生物学的に関連するｃＤＮＡを捕捉し得る。
本願において言及された刊行物および特許文献の全てが、本明細書中において参照として援用される。本明細書中に記載された本発明の方法および組成物の種々の改変および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明が特定の好ましい実施形態と組み合わせて記載されているが、特許請求の範囲に記載された本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが、理解されなければならない。さらに、当業者に自明である、本発明を実施するための記載された様式の種々の改変が、添付の特許請求の範囲の範囲内であるということが意図される。
図１は、ＲＮＡ５’ポリホスファターゼによって触媒される反応の例を示す図である。 図２は、種々の５’末端の基を有するＲＮＡの基質に対する酵素の活性を示す図である。 図３は、図２に示した酵素によるＲＮＡ基質の反応を示す図である。 図４は、E. coliのＲＮＡ５’ポリホスファターゼの、ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

Claims (16)

  1. サンプル中の５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
    （ｉ）５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡを含有しているサンプルであって、５’一リン酸基を有するＲＮＡおよび／またはキャッピングされたＲＮＡおよび／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有していることを含んでいるサンプル、
    （ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、
    （ｉｉｉ）タグを示すアクセプタのオリゴヌクレオチド、および
    （ｉｖ）ＲＮＡリガーゼ
    を提供する工程（Ａ）、
    該５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、ならびに
    該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、キャッピングされたＲＮＡではなく、該５’一リン酸基を有するＲＮＡに連結されて、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｃ）
    を包含しており、
    該ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、
    前記工程（Ａ）にて提供されたサンプルが５’一リン酸基を有するＲＮＡをさらに含有しているが、前記アクセプタのオリゴヌクレオチドは、前記工程（Ｂ）にて前記５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡにのみ連結され、工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する該５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されない、方法であり、
    ＲＮＡ５’モノホスファターゼを提供するサブ工程、
    該サンプル中の該５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’モノホスファターゼと工程（Ｂ）の前に接触させるサブ工程、ならびに
    該ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去するサブ工程
    をさらに包含している、方法。
  3. 請求項１または２に記載の方法であって、
    前記サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加する工程をさらに包含しており、
    核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素を提供するサブ工程、ならびに
    該サンプル中の該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換され、これによって、前記工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に含有されているキャッピングされたＲＮＡにも前記工程（Ｃ）にて５’ライゲーションによりタグが付加される条件で十分な時間にわたって、前記工程（Ｂ）からのサンプルを該核酸に対するピロホスファターゼまたは該デキャッピング酵素と工程（Ｃ）の前に接触させるサブ工程
    をさらに包含している、方法。
  4. サンプル中のキャッピングされたＲＮＡに５’ライゲーションによりタグを付加するための方法であって、
    （ｉ）キャッピングされたＲＮＡを含有しているサンプル、
    （ｉｉ）ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ、
    （ｉｉｉ）ＲＮＡ５’モノホスファターゼ、
    （ｉｖ）核酸に対するピロホスファターゼまたはデキャッピング酵素、
    （ｖ）アクセプタのオリゴヌクレオチド、および
    （ｖｉ）ＲＮＡリガーゼ
    を提供する工程（Ａ）、
    該５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ＲＮＡ５’ポリホスファターゼと接触させる工程（Ｂ）、
    該５’一リン酸基を有するＲＮＡが５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｂ）からのサンプルを該ＲＮＡ５’モノホスファターゼと接触させる工程（Ｃ）、
    該ＲＮＡ５’モノホスファターゼを不活性化または除去する工程（Ｄ）、
    工程（Ｄ）の後のサンプル中の該キャッピングされたＲＮＡが５’一リン酸基を有するＲＮＡへ変換される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｄ）の後のサンプルを該核酸に対するピロホスファターゼまたは該デキャッピング酵素と接触させる工程（Ｅ）、ならびに
    該アクセプタのオリゴヌクレオチドの３’末端が、工程（Ｅ）にて生成された５’一リン酸基を有するＲＮＡの５’末端に連結され、工程（Ｂ）にて５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡから変換された５’一リン酸基を有するＲＮＡまたは工程（Ａ）にて提供されたサンプル中に既に存在する５’一リン酸基を有するＲＮＡには連結されずに、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡがキャッピングされたＲＮＡから生成される条件で十分な時間にわたって、工程（Ｅ）からのサンプルを該アクセプタのオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡリガーゼと接触させる工程（Ｆ）
    を包含しており、
    該ＲＮＡ５’ポリホスファターゼは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる、方法。
  5. 前記サンプルが、５’ポリリン酸基を有するキャッピングされていないＲＮＡおよび／または５’一リン酸基を有するＲＮＡ、および／または５’ヒドロキシル基を有するＲＮＡをさらに含有していることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  6. ポリＡポリメラーゼおよびＡＴＰを提供する工程、ならびに
    ポリ（Ａ）テールが前記サンプル中のＲＮＡ分子の３’末端に付加されて、ポリ（Ａ）テールを有するＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、該サンプルを該ポリＡポリメラーゼおよび該ＡＴＰと接触させる工程
    をさらに包含している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記サンプルが、第１のタイプの細胞、第１の状態の細胞、または第１の環境からの細胞に由来するＲＮＡを含有している第１のサンプルを含んでおり、
    該第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡから、第２のタイプの細胞、第２の状態の細胞、または第２の環境からの細胞に由来する第２のサンプル中にも存在するＲＮＡを除き、これにより、第１のサンプル中のみに存在するが、第２のサンプル中には存在しないＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ分子の集団を生成することをさらに包含している、方法であり、
    第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、および第２のタイプの細胞、第２の条件の細胞、または第２の環境からの細胞に由来するＲＮＡを含有している第２のサンプルを提供する工程（ｉ）、
    第２のサンプル中のＲＮＡを逆転写することによって第一鎖ｃＤＮＡを調製する工程（ｉｉ）、
    第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡと第２のサンプルからのＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡとの間に、ハイブリダイズした複合体が形成される条件で十分な時間にわたって、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを第２のサンプルからのＲＮＡから調製された第一鎖ｃＤＮＡとアニールさせる工程（ｉｉｉ）、ならびに、
    該ｃＤＮＡがアニールしたＲＮＡが消化され、第１のサンプル中にのみ存在するが、第２のサンプル中には存在しないＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡからなる、除かれた５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが生成される条件で十分な時間にわたって、ハイブリダイズした複合体をＲＮａｓｅＨによって処理する工程（ｉｖ）
    を包含している方法。
  8. 請求項７に記載の方法であって、
    前記第１のサンプル中のＲＮＡから前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを生成するために前記工程（Ａ）にて提供された前記アクセプタのオリゴヌクレオチドが、親和性分子を含んでおり、
    該親和性分子に結合可能な親和性に基づき結合する物質が付着している固体表面を提供する工程、ならびに
    該第１のサンプルからの該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが、該親和性に基づき結合する物質が付着している固体表面に結合されて、第１のサンプル中のＲＮＡに由来する５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡが該固体表面に捕捉される条件で十分な時間にわたって、第１のサンプルから生成された５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを該固体表面と、前記工程（ｉｖ）の前または後のどちらか一方において接触させる工程
    をさらに包含している、方法。
  9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成する工程をさらに包含している、方法であり、
    ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、および
    ５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的な第一鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡをＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程
    をさらに包含しており、
    ５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的な、第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーを提供する工程、ならびに
    ５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡを第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程をさらに包含していることを含んでいる、方法。
  10. 請求項９に記載の方法であって、
    前記第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが配列を含んでおり、該配列の少なくとも３’末端は、
    （１）インビボにおける細胞またはインビトロのどちらかにおいて、前記サンプル中のＲＮＡの３’末端または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡの３’末端に転写後に付加されたホモポリマーの配列に対して相補的な配列、
    （２）１つ以上のＲＮＡ分子の３’末端における公知の配列に対して相補的な配列、
    （３）１つ以上のＲＮＡ分子の１つ以上の内部配列に対して相補的な配列、
    （４）全ての可能な配列の集合であって、各配列がランダムである集合、
    （５）ポリ（Ａ）テールに対して相補的な配列であって、オリゴ（ｄＴ）ｎの配列、オリゴ（ｄＵ）ｎの配列、オリゴ（Ｕ）ｎの配列、オリゴ（ｄＴ）ｎＸのアンカー配列、オリゴ（ｄＵ）ｎＸのアンカー配列、およびオリゴ（Ｕ）ｎＸのアンカー配列の中から選択される、配列、ならびに、
    （６）前記サンプル中のＲＮＡの３’末端または５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡの３’末端に付加されたオリゴヌクレオチドのタグに対して相補的な配列、からなる群より選択される配列を示し、ならびに／あるいは
    前記第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーが、特定の５’配列をさらに示し、
    該特定の５’配列は、前記第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの３’末端に示される配列の５’であり、該特定の５’配列に対して相補的な特定の３’配列を示す第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとして機能することができ、該第二鎖ｃＤＮＡの特異的なプライミングのための部位を提供する、方法。
  11. ＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩを提供する工程、ならびに
    ＲＮＡが消化される条件で十分な時間にわたって、前記第一鎖ｃＤＮＡを含有しているサンプルをＲＮａｓｅＨおよびＲＮａｓｅＩと接触させる工程
    をさらに包含している、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、
    ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、および
    二本鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、前記第一鎖ｃＤＮＡをＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと接触させる工程
    をさらに包含している、方法であり、
    前記工程（Ａ）にて提供された前記アクセプタのオリゴヌクレオチドに対して相補的な該第一鎖ｃＤＮＡの一部に対して相補的な第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよび該ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを提供する工程、ならびに、
    二本鎖ｃＤＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーおよびＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼを第一鎖ｃＤＮＡと接触させる工程をさらに包含していることを含んでおり、
    ＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼが、第一鎖ｃＤＮＡを合成するために提供されたＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと同一であるか、またはＤＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼが、第一鎖ｃＤＮＡを合成するために提供されたＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼと異なる、方法。
  13. 請求項１２に記載の方法であって、
    前記アクセプタのオリゴヌクレオチドの５’部分、前記第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分または前記第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーの５’部分が、ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータの一鎖に関する配列を示し、
    該ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータを用いてＲＮＡを合成し得るＲＮＡポリメラーゼを提供する工程、および
    ＲＮＡが合成される条件で十分な時間にわたって、前記二本鎖ｃＤＮＡを該ＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程
    をさらに包含しており、
    該ＲＮＡポリメラーゼ用の二本鎖プロモータの一鎖に関する配列が、該アクセプタのオリゴヌクレオチド、該第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーまたは該第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマーにおいて示される、方法。
  14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、
    前記アクセプタのオリゴヌクレオチド、第一鎖ｃＤＮＡのプライマー、または第二鎖ｃＤＮＡのプライマーが、親和性分子を含んでいるか、または該親和性分子に連結されており、
    該親和性分子に特異的に結合可能な親和性に基づき結合する物質によって共有結合的または非共有結合的にコーティングされた固体表面を提供する工程、ならびに、
    該親和性分子が、該固体表面に連結された親和性に基づき結合する物質と結合される条件で十分な時間にわたって、該親和性分子に化学的に連結された、該アクセプタのオリゴヌクレオチド、該第一鎖ｃＤＮＡのプライマーまたは該第二鎖ｃＤＮＡのプライマーを、該アクセプタのオリゴヌクレオチド、該第一鎖ｃＤＮＡのプライマーまたは該第二鎖ｃＤＮＡのプライマーが関与する工程の前または後のどちらか一方において、接触させる工程をさらに包含している、方法。
  15. 請求項１４に記載の方法であって、
    合成された、前記５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、前記第一鎖ｃＤＮＡまたは前記第二鎖ｃＤＮＡのそれぞれが前記親和性分子を含んでおり、
    該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡが、該親和性分子を前記固定表面に結合されることによって捕捉、単離または精製される、方法であり、
    該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡを該固体表面と、該親和性分子と該固体表面に付着した前記親和性に基づき結合する物質との結合が促進される試薬の存在下および該結合が促進される条件において接触させて、該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡを該表面に結合させ、これによって、該親和性分子を含んでいる、該５’ライゲーションによりタグを付加されたＲＮＡ、該第一鎖ｃＤＮＡまたは該第二鎖ｃＤＮＡを捕捉、単離または精製する工程を包含しており、
    該親和性分子がビオチンであり、該親和性に基づき結合する物質がアビジンまたはストレプトアビジンであるか、該親和性分子がジゴキシゲニンであり、親和性に基づき結合する物質がジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体であることを含んでいる、方法。
  16. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    ＲＮＡ５’ポリホスファターゼ（ＲＰＰ）と、
    ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；核酸に対するピロホスファターゼ；デキャッピング酵素；キャッピング酵素；リガーゼ；アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド；ポリＡポリメラーゼ；ポリＵポリメラーゼ；ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）；第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮａｓｅＨ；第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）；５’エキソリボヌクレアーゼ（Ｘｒｎ）；ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）；および５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡ分子であって、これらの基のβまたはγのリン酸が標識されているもの、からなる群より選択される少なくとも１つの他の成分と
    を備えているか、あるいは
    ＲＮＡ５’モノホスファターゼ（ＲＭＰ）と、
    ＲＮＡ５’ポリホスファターゼと、
    アルカリホスファターゼ、シュリンプのアルカリホスファターゼ、またはアークティックのアルカリホスファターゼ；核酸に対するピロホスファターゼ；デキャッピング酵素；キャッピング酵素；ＲＮＡリガーゼ；アクセプタのＲＮＡオリゴヌクレオチド；ポリＡポリメラーゼ；ＲＮＡ依存的なＤＮＡポリメラーゼ（ＲＴ）；第一鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮａｓｅＨ；第二鎖ｃＤＮＡを合成するためのプライマー；ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）；５’エキソリボヌクレアーゼ；ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）；および５’三リン酸基または５’二リン酸基を有するＲＮＡ分子であって、これらの基のβまたはγのリン酸が標識されているもの、からなる群より選択される少なくとも１つの他の成分とを備えており、
    該ＲＰＰが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、少なくとも１つの他の成分は、キットに備えられている場合、ＲＮＡ５’モノホスファターゼ１（ＲＭＰ１）であるＲＭＰ；ＡＰＥＸ（登録商標）アルカリホスファターゼ、シュリンプのアルカリホスファターゼおよびアークティックのアルカリホスファターゼの中から選択されるＡＰ；タバコ酸性ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）である核酸に対するピロホスファターゼ；酵母のデキャッピング酵素、哺乳動物のデキャッピング酵素、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）のデキャッピング酵素、ポックスウイルスのデキャッピング酵素およびワクシニアウイルスのデキャッピング酵素の中から選択されるデキャッピング酵素；ポックスウイルスのキャッピング酵素、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のキャッピング酵素およびＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（登録商標）キャッピング酵素の中から選択されるキャッピング酵素；Ｔ４ＲＮＡリガーゼおよびバクテリオファージＴＳ２１２６のＲＮＡリガーゼの中から選択されるＲＮＡリガーゼ；エシェリヒア・コリ（E. coli）のポリＡポリメラーゼおよびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のポリＡポリメラーゼの中から選択されるポリＡポリメラーゼ；ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴ、ＡＭＶ ＲＴおよびＭＭＬＶ ＲＴの中から選択されるＲＴ；エシェリヒア・コリ（E. coli）のＲＮａｓｅＨおよびＨＹＢＲＩＤＡＳＥ（登録商標）ＲＮａｓｅＨの中から選択されるＲＮａｓｅＨ；Ｔ７型のＲＮＡＰ、Ｔ７ＲＮＡＰ、Ｔ３ＲＮＡＰおよびＳＰ６ＲＮＡＰの中から選択されるＲＮＡＰ；ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（登録商標）５’−ホスフェート依存的エキソヌクレアーゼおよびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae）のＸｒｎＩエキソリボヌクレアーゼ（ＸｒｎＩ）の中から選択される５’エキソリボヌクレアーゼ；またはＴ４ＰＮＫであるＰＮＫ、からなる群より選択される、ことを含んでいる、
    キット。
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