JP5600329B2 - イミノ糖およびウイルス性疾患を治療する方法 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００９年２月２３日出願の米国特許仮出願第６１／２０２，３６７号および２００９年９月４日出願の米国特許仮出願第６１／２７２，２５５号に対する優先権を主張する。

本出願は、イミノ糖およびイミノ糖を用いてウイルス感染症を治療または予防する方法に関し、特に、イミノ糖およびデングウイルスに関連するウイルス感染症を治療または予防する方法に関する。

デングウイルス感染症を治療または予防する方法は、それを必要とする対象に、有効量の次式の化合物

または薬学的に許容されるその塩［式中、Ｒは置換もしくは非置換のオキサアルキル基であり、またはＲは、

（式中、
Ｒ_１は、オキサアルキル基であり、
Ｘ_１〜５は、Ｈ、ＮＯ_２、Ｎ_３、またはＮＨ_２から独立に選択され、
Ｙは、存在しない、またはカルボニル以外の置換もしくは非置換のＣ_１−アルキル基であり、
Ｚは、結合またはＮＨから選択され、ただし、Ｚが結合である場合Ｙは存在せず、ＺがＮＨである場合Ｙはカルボニル以外の置換もしくは非置換のＣ_１−アルキル基である）であり、
Ｗ_１〜４は、水素、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のハロアルキル基、置換もしくは非置換のアルカノイル基、置換もしくは非置換のアロイル基、または置換もしくは非置換のハロアルカノイル基から独立に選択される］を投与することを含む。

図１Ａ〜Ｅは、以下のイミノ糖の化学式を示す図である。すなわち、Ａ）Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪまたはＵＶ−１）、Ｂ）Ｎ−ノニルデオキシイノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪまたはＵＶ−２）、Ｃ）Ｎ−（７−オキサデシル）デオキシノジリマイシン（Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪまたはＮ７−ＤＮＪまたはＵＶ−３）、Ｄ）Ｎ−（９−メトキシノニル）デオキシノジリマイシン（Ｎ９−ＤＮＪまたはＵＶ−４）、Ｅ）Ｎ−（Ｎ−｛４’−アジド−２’−ニトロフェニル｝−６−アミノヘキシル）デオキシノジリマイシン（ＮＡＰ−ＤＮＪまたはＵＶ−５）である。 図２は、ＮＢ−ＤＮＪ、ＮＮ−ＤＮＪおよびＮ７−Ｏ−ＤＮＪによる細胞保護対デングウイルスを示すプロットである。 図３は、ＮＢ−ＤＮＪ、ＮＮ−ＤＮＪおよびＮ７−Ｏ−ＤＮＪの細胞傷害性のプロットである。 図４は、ＮＮ−ＤＮＪの合成スキームである。 図５Ａ〜Ｄは、Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪの合成を図示する。詳細には、図５Ａは、Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪに至る反応の順序を図示する。 図５Ａ〜Ｄは、Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪの合成を図示する。詳細には、図５Ｂは、６−プロピルオキシ−１−ヘキサノールの調製を図示し、図５Ｃは、６−プロピルオキシ−１−ヘキサナールの調製を図示し、図５Ｄは、Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪの合成を図示する。 図６Ａ〜Ｃは、Ｎ−（９−メトキシノニル）デオキシノジリマイシンの合成に関する。特に、図６Ａは、９−メトキシ−１−ノナノールの調製を図示し、図６Ｂは、９−メトキシ−１−ノナナールの調製を図示し、図６Ｄは、Ｎ−（９−メトキシノニル）デオキシノジリマイシンの合成を図示する。 図７は、Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪ、Ｎ９−ＤＮＪおよびＮＡＰ−ＤＮＪによるデングウイルス放出の阻害に関するデータを示す。 図８は、ＮＢ−ＤＮＪ（ＵＶ−１）、ＮＮ−ＤＮＪ（ＵＶ−２）、Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪ（ＵＶ−３）、Ｎ９−ＤＮＪ（ＵＶ−４）およびＮＡＰ−ＤＮＪ（ＵＶ−５）のデングウイルスに対するＩＣ５０値を示す表である。 図９は、以下のＵＶイミノ糖化合物：ＮＢ−ＤＮＪ（ＵＶ−１）、ＮＮ−ＤＮＪ（ＵＶ−２）、Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪ（ＵＶ−３）、Ｎ９−ＤＮＪ（ＵＶ−４）、ＮＡＰ−ＤＮＪ（ＵＶ−５）によるデングウイルス放出の阻害に関するデータを示す図である。 図１０は、ＵＶ−４（Ｎ９−ＤＮＪ）によるデングウイルスに対するマウスの保護を示す図である。 図１１Ａは、ＵＶ−４（Ｎ９−ＤＮＪ）によるデングウイルスに対するマウスの保護に関する図である。 図１１Ｂは、ＵＶ−４（Ｎ９−ＤＮＪ）によるデングウイルスに対するマウスの保護に関する図である。 図１１Ｃは、ＵＶ−４（Ｎ９−ＤＮＪ）によるデングウイルスに対するマウスの保護に関する図である。

用語の定義
別に規定する場合を除き、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、「１つまたは複数の」を意味する。

本明細書では、「ウイルス感染症」という用語は、病的な状態を表し、ウイルスは、健常な細胞に侵入し、細胞の複製機構を用いて増幅させるまたは増殖し、最終的に細胞を溶解し、細胞死、ウイルス粒子の放出、新たに産生された後世代ウイルスによる他の細胞の感染をもたらす。ある種のウイルスによる潜伏感染はまた、ウイルス感染症の起こり得る結果である。

本明細書では、「ウイルス感染を治療または予防する」という用語は、特定のウイルスの複製を阻害すること、ウイルスの伝染を阻害すること、またはウイルスがその宿主中でそれ自体を構築するのを妨げること、およびウイルス感染症によって引き起こされる疾患の症状を寛解させるまたは緩和することを意味する。治療は、ウイルス負荷の低減、死亡率および／または罹患率の低下がある場合、治療的であるとみなされる。

ＩＣ５０またはＩＣ９０（阻害濃度５０または９０）は、ウイルス感染をそれぞれ、５０％または９０％低減させるために用いられる、イミノ糖などの治療薬の濃度である。

関連出願
本出願は、２００９年２月２３日出願の米国特許仮出願第６１／２０２，３６７号を全体として参照により組み込む。

開示
本発明者らは、デオキシノジリマイシン誘導体など、ある種のイミノ糖が、デング１〜４ウイルスに対して有効で有り得ることを発見した。

特に、イミノ糖は、デング１〜４ウイルスによって引き起こされるもしくはそれに関連する疾患もしくは状態を治療または予防するために有用であり得る。いくつかの実施形態では、イミノ糖は、デングウイルスに感染した対象の生存率または生存の可能性を高めることができる。

デングウイルス
デングウイルスは、Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ科のフラビウイルス属に属し、デング出血熱（ＤＨＦ）を引き起こす。デングウイルスには、密接に関連した４つの血清型が含まれ、通常、デング１、デング２、デング３およびデング４と称される。１種による感染からの回復は、その血清型に対する生涯性免疫をもたらすが、他の３種による感染に対して部分的および一時的な防御を与えるに過ぎない。経時的な感染は、より重篤な疾患のリスクを高め、その結果ＤＨＦになるという良い証拠が存在する。新興のＤＨＦの流行は、４つのすべてのデングウイルスが固有である南北アメリカおよびアジアにおいて関心を高まらせている。ＤＨＦは、いくつかの国々において子供の入院および死亡の主要な原因になっている。２００７年に、南北アメリカにおいて報告されたデングの症例は８９０，０００人を超え、その２６，０００症例はＤＨＦであった。

デングは、主にネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）という蚊により伝染され、ヒトの最も一般的な蚊媒介性ウイルス性疾患である。世界的にみると、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）が一般的でありデングが伝染し得る温暖な地域に、２５億人（すなわち世界の人口の４０％）が住んでいる。熱帯の都市およびそこのヒトおよび蚊の母集団の急速な成長により、さらに多くの人々がこのベクターと接触するようになっている。蚊ベクターおよびウイルス両方の地理上の拡散は、流行性デング熱の世界的な復活およびデング出血熱（ＤＨＦ）の発生をもたらしている。

イミノ糖
多くの実施形態では、イミノ糖は、Ｎ−置換デオキシノジリマイシンであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｎ−置換デオキシノジリマイシンは、次式の化合物であってもよい

（式中、Ｗ_１〜４は、水素、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のハロアルキル基、置換もしくは非置換のアルカノイル基、置換もしくは非置換のアロイル基、または置換もしくは非置換のハロアルカノイル基から独立に選択される）。

いくつかの実施形態では、Ｒは、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のシクロアルキル基、置換もしくは非置換のアリール基、または置換もしくは非置換のオキサアルキル基から選択することができる。

いくつかの実施形態では、Ｒは、置換もしくは非置換のアルキル基であってもよく、かつ／または置換もしくは非置換のオキサアルキル基は、１〜１６個の炭素原子、４〜１２個の炭素原子または８〜１０個の炭素原子を含む。「オキサアルキル」という用語は、アルキル誘導体を意味し、これは、１〜５個または１〜３個または１〜２個の酸素原子を含むことができる。「オキサアルキル」という用語には、ヒドロキシ末端アルキル誘導体およびメトキシ末端アルキル誘導体が含まれる。

いくつかの実施形態では、Ｒは、それだけには限らないが、−（ＣＨ_２）_６ＯＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_６ＯＣＨ_２ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_６Ｏ（ＣＨ_２）_２ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_６Ｏ（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_５ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_６ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_２Ｏ（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_９−ＯＨ、−（ＣＨ_２）_９ＯＣＨ_３から選択することができる。

いくつかの実施形態では、Ｒは、分枝または非分枝の、置換または非置換のアルキル基であってもよい。いくつかの実施形態では、アルキル基は、長鎖アルキル基であってもよく、Ｃ６〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ８〜Ｃ１６アルキル基、またはＣ８〜Ｃ１０アルキル基であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｒは、長鎖オキサアルキル基、すなわち、１〜５個または１〜３個または１〜２個の酸素原子を含み得る長鎖アルキル基であってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｒは、次式を有し得る

（式中、Ｒ_１は、置換もしくは非置換のアルキル基であり；
Ｘ_１〜５は、Ｈ、ＮＯ_２、Ｎ_３、またはＮＨ_２から独立に選択され；
Ｙは、存在しないか、またはカルボニル以外の置換もしくは非置換のＣ_１−アルキル基であり；
Ｚは、結合またはＮＨから選択され、ただし、Ｚが結合である場合Ｙは存在せず、ＺがＮＨである場合Ｙはカルボニル以外の置換もしくは非置換のＣ_１−アルキル基である）。

いくつかの実施形態では、ＺはＮＨであり、Ｒ_１−Ｙは、Ｃ２〜Ｃ２０アルキル基またはＣ４〜Ｃ１２アルキル基またはＣ４〜Ｃ１０アルキル基などの置換もしくは非置換のアルキル基である。

いくつかの実施形態では、Ｘ_１は、ＮＯ_２であり、Ｘ_３はＮ_３である。いくつかの実施形態では、Ｘ_２、Ｘ_４およびＸ_５のそれぞれは水素である。

いくつかの実施形態では、イミノ糖は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／０２７５９９８号に開示される、ＤＮＪ誘導体であってもよい。

いくつかの実施形態では、イミノ糖は、図１に示される化合物の１つであってもよい。

デオキシノジリマイシン誘導体などのイミノ糖は、例えば、米国特許第５，６２２，９７２号、第５，２００，５２３号、第５，０４３，２７３号、第４，９９４，５７２号、第４，２４６，３４５号、第４，２６６，０２５号、第４，４０５，７１４号および第４，８０６，６５０号および米国特許出願公開第２００７／０２７５９９８号（これらはすべて、その全体が本明細書に組み込まれる）に開示される通り合成することができる。

いくつかの実施形態では、イミノ糖は、無機酸または有機酸に由来する塩の形態であってもよい。薬学的に許容される塩および塩の形態を調製するための方法は、例えば、Ｂｅｒｇｅら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６巻：１〜１８頁、１９７７年）に開示される。適当な塩の例としては、それだけには限らないが、以下の塩が挙げられる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、ショウノウ塩（camphorate）、ショウノウスルホン酸塩、二グルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩（glucoheptanoate）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パルモアート（palmoate）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバラート、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラート、メシル酸塩およびウンデカン酸塩。

いくつかの実施形態では、イミノ糖は、プロドラッグの形態で用いることもできる。６−リン酸化ＤＮＪ誘導体などのＤＮＪ誘導体のプロドラッグは、米国特許第５，０４３，２７３号および第５，１０３，００８号に開示される。

いくつかの実施形態では、イミノ糖は、組成物の一部として用いることができ、これは、さらに、薬学的に許容される担体および／または組成物を動物に送達するために有用な成分をさらに含む。組成物をヒトに送達するために有用な多数の薬学的に許容される担体およびウシなどの他の動物に組成物を送達するために有用な成分は、当技術分野で公知である。かかる担体および構成物の本発明の組成物への添加は、十分に当該分野の通常の技量レベル内である。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、イミノ糖から本質的になってもよく、これは、イミノ糖が組成物中で唯一の有効成分であることを意味し得る。

さらにいくつかの実施形態では、イミノ糖は、１種または複数の追加の抗ウイルス化合物と共に投与することができる。

いくつかの実施形態では、イミノ糖は、米国特許出願公開第２００８／０１３８３５１号；２００９年３月２５日出願の米国特許出願第１２／４１０，７５０号および２００９年３月２７日出願の米国仮出願第６１／２０２，６９９号に開示されたものなどのリポソーム組成物に用いることができる。

イミノ糖は、ウイルスにより影響を受けた細胞または個体に投与することができる。イミノ糖は、ウイルスの形態形成を阻害することができる、またはイミノ糖は、個体を治療することができる。治療は、動物におけるウイルス感染を低減、除去または減弱することができる。

デングウイルスに感染し得る動物には、げっ歯類を含めた哺乳動物およびヒトを含めた霊長類などの脊椎動物が挙げられる。

本発明の方法のために動物または動物細胞に投与されるイミノ糖の量は、細胞からのデングウイルスの形態形成を阻害するために有効な量とすることができる。本明細書では、「阻害する」という用語は、イミノ糖が存在しない場合に示される生物活性の検出可能な低下および／または除去を意味し得る。「有効量」という用語は、指示された効果を達成するために必要なイミノ糖の量を意味し得る。本明細書では、「治療」という用語は、対象において症状を軽減するもしくは緩和すること、症状が悪化もしくは進行を妨げること、原因因子の阻害もしくは除去、または感染がない対象においてデングウイルスに関する感染もしくは障害の予防を意味し得る。

したがって、例えば、デングウイルスによって引き起こされる感染またはそれに関連する感染の治療には、感染性因子の破壊、その増殖もしくは成熟への阻害または干渉、およびその病的な影響の中和を含むことができる。細胞または動物に投与することができるイミノ糖の量は、好ましくは、その投与に付随する利点を上回るいずれの毒性作用も誘発しない量である。

医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、ある特定の患者についての所望の治療効果を達成するのに有効である１種（または複数）の活性化合物の量を投与するように変更できる。

選択された用量レベルは、イミノ糖の活性、投与経路、治療対象となる状態の重症度、および治療対象となる患者の状態および以前の病歴に依存し得る。しかし、所望の治療効果を達成するために必要なものよりも低いレベルで１種（または複数）の化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を次第に増加させていくことは当技術分野の技量の範囲内である。望ましい場合、有効な１日投与量は、投与の目的のために複数回の用量、例えば、１日２回から４回投与に分けることができる。しかし、体重、全体的な健康、食事制限、投与の時間および経路ならびに他の治療薬との組み合わせおよび治療対象となる状態または疾患の重症度などの様々な因子に、任意の特定の患者のための特定の投与量レベルが依存し得ることを理解されたい。ヒト成人の１日投与量は、体重１０キログラム当たりイミノ糖約１マイクログラム〜約１グラム、または約１０ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であってもよい。もちろん、細胞または動物に投与するべきであるイミノ糖の量は、イミノ糖の分子量および投与経路など、当業者によって十分に理解される多数の要因に依存し得る。

本発明の方法に有用である医薬組成物は、経口固形配合物、点眼剤、坐剤、エアゾール、局所もしくは他の類似の配合物の形態で全身投与することができる。例えば、散剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、ゲル剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの物理的形態であってもよい。かかる医薬組成物は、イミノ糖に加えて、薬学的に許容される担体および薬物投与を促進し容易にするために公知の他の成分を含むことができる。ナノ粒子、リポソームによって再シール形成された赤血球、および免疫学的に基づいた系など、他の可能性ある配合物もまた、イミノ糖を投与するために用いることができる。かかる医薬組成物は、いくつかの経路によって投与することができる。本明細書で用いられる「非経口」という用語には、それだけには限らないが、皮下、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、ならびに注射および注入技法が含まれる。例として、医薬組成物は、経口的に、局所的に、非経口的に、全身的に、または肺経路によって投与することができる。

これらの組成物は、単一用量または異なる時点で投与される複数回の用量で投与することができる。組成物のデングウイルスに対する阻害効果は持続可能であるため、投与レジメンは、宿主細胞が最小限に影響を受けつつウイルス増殖が遅延されるように調整することができる。例として、動物は、本発明の組成物の用量を１週間に１回投与することができ、それによって、ウイルス増殖はまる１週間遅延され、宿主細胞機能は週に１回ほんの短期間阻害される。

本明細書に記載した実施形態は、まったく制限されるものではないが、以下の実施例によってさらに例示される。

１．Ｎ−ノニルＤＮＪの合成

手順：マグネチックスターラーを備えた５０ｍＬの１つ口丸底フラスコに、ＤＮＪ（５００ｍｇ）、エタノール（１００ｍＬ）、ノナナール（５３０ｍｇ）、および酢酸（０．５ｍＬ）を室温で入れた。反応混合物を４０〜４５℃に加熱し、窒素中で３０〜４０分間撹拌した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、Ｐｄ／Ｃを加えた。反応フラスコを排気し、バルーン中の水素ガスで置換した。この過程を３回繰り返した。最後に、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（注記１）によってモニターした。反応混合物をセライトのパッドでろ過し、エタノールで洗浄した。ろ液を真空中で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２３０〜４００メッシュシリカゲル）によって精製した。ジクロロメタン中のメタノールの溶媒勾配（１０〜２５％）を用いてカラムから生成物を溶出させた。所望の生成物を含むすべての画分を合わせ、真空中で濃縮して純粋な生成物（４２０ｍｇ）を得た。反応の終了を、薄層シリカゲルプレート；溶離液；メタノール：ジクロロメタン＝１：２を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってモニターした。

２．Ｎ−７−オキサデシルＤＮＪの合成
２ａ．６−プロピルオキシ−１−ヘキサノールの合成

手順：マグネチックスターラーを備えた５００ｍＬの１つ口丸底フラスコに、１，６−ヘキサンジオール（６．００ｇ）、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５．４１３ｇ）を室温で入れた。反応混合物を１時間撹拌し、次いで、１−ヨードプロパン（８．６３ｇ）を加えた。反応混合物を７０〜８０℃まで加熱し、終夜撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（注記１）によってモニターした。反応の終了後、水を反応混合物に加え、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を真空中で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をジクロロメタンに溶解し、水で洗浄し、次いでブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を真空中で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物を２３０〜４００メッシュシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製した。ヘキサン中の酢酸エチルの溶媒勾配（１０〜４５％）を用いてカラムから生成物を溶出させた。所望の純粋な生成物を含むすべての画分を合わせ、真空中で濃縮して純粋な６−プロピルオキシ−１−ヘキサノール（ｌｏｔ Ｄ−１０２９−０４８、１．９ｇ、２５％）を得た。反応の終了を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；（溶離液：ヘキサン中の６０％酢酸エチル）によってモニターした。

２ｂ．６−プロピルオキシ−１−ヘキサナールの調製

手順：マグネチックスターラーを備えた５０ｍＬの１つ口丸底フラスコに、６−プロピルオキシ−１−ヘキサノール（１．０ｇ）、ＰＤＣ（４．７ｇ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、セライト（１．０ｇ）、および酢酸ナトリウム（１００ｍｇ）を入れた。反応混合物を室温で窒素中で５分間撹拌した。ＰＤＣ（４．７０ｇ）を反応混合物に加え、終夜撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（注記１）によってモニターした。反応の終了後、反応混合物をカラム（２３０〜４００メッシュシリカゲル）に直接添加した。酢酸エチル中のジクロロメタンの溶媒勾配（１０〜２０％）を用いてカラムから生成物を溶出させた。所望の純粋な生成物を含むすべての画分を合わせ、真空中で濃縮して、純粋な６−プロピルオキシ−１−ヘキサナール（ｌｏｔ Ｄ−１０２９−０５０、７１０ｍｇ、７１％）を得た。反応の終了を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；（溶離液：ヘキサン中の６０％酢酸エチル）によってモニターした。

２ｃ Ｎ−７−オキサデシル−ＤＮＪの合成

手順：マグネチックスターラーを備えた５０ｍＬの１つ口丸底フラスコに、ＤＮＪ（５００ｍｇ）、エタノール（１５ｍＬ）、６−プロピルオキシ−１−ヘキサナール（５８５ｍｇ）、および酢酸（０．１ｍＬ）を室温で入れた。反応混合物を４０〜４５℃に加熱し、３０〜４０分間窒素中で撹拌した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、Ｐｄ／Ｃを加えた。反応フラスコを排気し、バルーン中の水素ガスで置換した。この過程を３回繰り返した。最後に、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（注記１）によってモニターした。反応混合物を、セライトのパッドでろ過し、エタノールで洗浄した。ろ液を真空中で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、カラムクロマトグラフィー（２３０〜４００メッシュシリカゲル）によって精製した。ジクロロメタン中のメタノールの溶媒勾配（１０〜４０％）を用いてカラムから生成物を溶出させた。所望の生成物を含むすべての画分を合わせ、真空中で濃縮して純粋な生成物を得た。（Ｌｏｔ：Ｄ−１０２９−０５２（８４０ｍｇ）。反応の終了を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；（溶離液：ジクロロメタン中の５０％メタノール）によってモニターした。

３．Ｎ−（９−メトキシ）−ノニルＤＮＪの合成
３ａ ９−メトキシ−１−ノナノールの調製

手順：マグネチックスターラーおよび撹拌子を備えた５００ｍＬの１つ口丸底フラスコに、ジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（１００ｍＬ）中の１，９−ノナンジオール（１０．００ｇ、６２．３ｍｍｏｌ）を入れた。これに水酸化ナトリウム（５．０ｇ、１２５．０ｍｍｏｌ）のＨ_２Ｏ（１０ｍＬ）溶液をゆっくりと室温で加えた。水酸化ナトリウムを加える間、生成された反応混合物を加熱し、温度を約４０℃まで上昇させた。混合物を１時間撹拌し、次いで、反応混合物の温度を約４０℃に保ちながら、硫酸ジメチル（１６．５２ｇ、１３１ｍｍｏｌ）を、４等分して加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（注記１）によってモニターした。ＴＬＣモニタリングは、反応が２５％の転化率であったことを示した。この段階で、追加の硫酸ジメチル（２４．７８ｇ、１９６．４４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物をさらに２４時間室温で撹拌した。反応の終了後、水酸化ナトリウム（水中の１０％溶液）を反応混合物に加えて溶液のｐＨを１１〜１３に調整した。混合物を室温で２時間撹拌し、ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、Ｈ_２Ｏ（２００ｍＬ）、食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム（２０ｇ）で乾燥し、ろ過し真空中で濃縮して粗生成物（１４ｇ）を得た。粗生成物を、２５０〜４００メッシュシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製した。ヘキサン中の酢酸エチルの溶媒勾配（１０〜５０％）を用いてカラムから生成物を溶出させた。所望の純粋な生成物を含むすべての画分を合わせ、真空中で濃縮して純粋な９−メトキシ−１−ノナノール（ｌｏｔ Ｄ−１０２７−１５５、２．３８ｇ、２１．９％）を得た。反応の終了を、薄層シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；溶離液：ヘキサン中の６０％酢酸エチルによってモニターした。

３ｂ ９−メトキシ−１−ノナナールの調製

手順：マグネチックスターラーおよび撹拌子を備えた５０ｍＬの１つ口丸底フラスコに、９−メトキシ−ノナノール（１．０ｇ、５．９ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、モレキュラーシーブ（１．０ｇ、３Ａ）、酢酸ナトリウム（０．１ｇ）を室温で入れた。反応混合物を室温で窒素中で５分間撹拌した。反応混合物に重クロム酸ピリジニウム（４．７ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を入れ、終夜撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（注記１）によってモニターした。反応の終了後、反応混合物をシリカゲル層（約１５ｇ）でろ過した。ろ液を真空中で蒸発させて粗化合物を得た。これを、シリカゲルカラム（２５０〜４００メッシュ、４０ｇ）を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製した。ヘキサン中の酢酸エチルの溶媒勾配（１０〜５０％）を用いてカラムから生成物を溶出させた。所望の純粋な生成物を含むすべての画分を合わせ、真空中で濃縮して純粋な９−メトキシ−ノナナール（ｌｏｔ Ｄ−１０２７−１５６、５５３ｍｇ、５４．４％）を得た。反応の終了を薄層シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；溶離液：ヘキサン中の６０％酢酸エチルによってモニターした。

３ｃ Ｎ−（９−メトキシ）−ノニルＤＮＪの合成

手順：マグネチックスターラーおよび撹拌子を備えた５０ｍＬの２つ口丸底フラスコに、ＤＮＪ（３００ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）、エタノール（２０ｍＬ）、９−メトキシ−１−ノナナール（４７６ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）を室温で入れた。反応混合物を窒素中で５〜１０分間撹拌し、Ｐｄ／Ｃを室温で加えた。反応混合物を排気し、バルーンを用いた水素ガスによって置換した。この過程を３回繰り返し、次いで、反応混合物を大気中の水素下で室温で撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（注記１）によってモニターした。反応混合物をセライト層でろ過し、エタノール（２０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を真空中で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を２５０〜４００メッシュシリカゲル（２０ｇ）を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製した。酢酸エチル中のメタノールの溶媒勾配（５〜２５％）を用いてカラムから生成物を溶出させた。所望の純粋な生成物を含むすべての画分を合わせ、真空中で濃縮してオフホワイト固形物を得た。固形物を酢酸エチル（２０ｍＬ）中ですりつぶし、ろ過し高真空で乾燥して白色固形物［ｌｏｔ：Ｄ−１０２７−１５８（１６５．３ｍｇ、２８．１％）を得た。反応の終了を薄層シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；溶離液：ジクロロメタン中の５０％メタノールによってモニターした。

４．イミノ糖のデングウイルスに対する効果。
図２は、ＮＢ−ＤＮＪ、ＮＮ−ＤＮＪ、およびＮ７−Ｏ−ＤＮＪによるデングウイルスに対する細胞保護を示す。

手順。ウイルス誘発細胞変性効果（ＣＰＥ）−阻害アッセイを０．１２２から５００ｕＭの濃度でＵＶ化合物で実施した。

化合物を、デングウイルス２型（ＤＥＮＶ２）ニューギニアＣ株に対する阻害についてスクリーニングした。ウイルス原液を２％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン，１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充し、標準のプラークアッセイを用いて力価測定した１×改変イーグル培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）を用いたベロ細胞における増殖によって作製した。ウイルス原液を使用するまで−８０℃で貯蔵した。

アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手したベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞系統）を、アッセイ２４時間前にＣＯ_２５％のインキュベーター中で３７℃で細胞培養処理した９６穴平底プレート中に播種した。試験を、２％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した改変イーグル培地中で、５００μＭ化合物で開始し、０．１２２ｕＭまで減らしながら行った。アッセイ当日に、培地を吸引し、細胞を様々な濃度の化合物で処理した。３７℃で薬物前処理の１時間後、感染多重度（ＭＯＩ）が低い細胞にデングウイルスを加えた。感染後１時間で、細胞を洗浄し、化合物を含む培地を加えた。アッセイをＣＯ_２５％のインキュベーター中で３７℃で６日間進行させた。その間に、未処理のウイルス感染した対照ウェルがＣＰＥを示した。感染後の期間の後、培養上清をプレートから除去し、ウイルス誘発細胞の損傷（細胞質酵素乳酸デヒドロゲナーゼの放出）についての製造業者の推奨に従ってＬＤＨアッセイ（ＣｙｔｏＴｏｘ９６、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）により検定した。ＯＤ読み取りを使用して化合物で処理した細胞または対照の細胞変性影響率を算出し比較した。実験により、ＵＶ化合物が、用量依存方式で細胞がデングウイルスによって死滅するのを防ぐのに有効であることが実証される。

図３は、ＮＢ−ＤＮＪ、ＮＮ−ＤＮＪ、およびＮ７−Ｏ−ＤＮＪについての細胞傷害性データを示す。

手順．０．１２２から５００ｕＭの濃度におけるＮＢ−ＤＮＪ、ＮＮ−ＤＮＪおよびＮ７−Ｏ−ＤＮＪを、ベロ細胞に対する細胞傷害性について試験した。アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手したベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞系）を、アッセイ２４時間前に細胞培養処理した９６穴平底プレートに播種した。

試験を、２％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した改変イーグル培地中で、５００μＭ化合物で開始し、０．１２２ｕＭまで減らしながら行った。細胞を３７℃で、ＣＯ_２５％のインキュベーターで培養し、プレートを、誘発された細胞の損傷（細胞質酵素乳酸デヒドロゲナーゼの放出）についての製造業者の推奨に従ってＬＤＨアッセイ（ＣｙｔｏＴｏｘ９６、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）により検定した。ＯＤ読み取りを使用して化合物で処理した細胞または対照の細胞変性影響率を算出し比較した。実験により、Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪはベロ細胞に対して非毒性であることが実証される。ＮＮ−ＤＮＪは、約２０ｕＭを超える濃度で細胞に対する毒性を示し始める。

図７は、Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪ；Ｎ９−ＤＮＪおよびＮＡＰ−ＤＮＪによるデングウイルス放出の阻害に関するデータを示す。

手順．対照ベロ細胞培養物および１００ｕＭ化合物で処理されたベロ細胞培養物を、ウイルスに感染させ、ＣＯ_２５％のインキュベーター中で３７℃で７日間培養した。化合物で処理したウイルス感染細胞培養物から得られた感染性ウイルス粒子の産生の阻害をプラークアッセイによって決定した。

ウイルスプラークアッセイを、２％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した１×改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、６穴プレートにウェル当たり５×１０５細胞で播種したベロ細胞において行った。化合物で処理した感染細胞培養物から収集した上清から得られた力価測定しようとするウイルスを、細胞培養培地で希釈し、細胞上に１００μｌ体積で接種し、３７℃で１時間吸着させた。細胞を２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した１×改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）中で０．６％アガロースで覆った。細胞を感染させるおよび死滅させる個別の感染性ウイルス粒子を示す死細胞のプラークを、ＣＯ_２５％のインキュベーター中で３７℃で発現させ、細胞単層をニュートラルレッドで生細胞染色（live-staining）することにより可視化した。実験により、感染性デングウイルスの放出がＵＶイミノ糖化合物で処理後、有意に減少したことが実証される。

図９は、以下のＵＶイミノ糖化合物：ＮＢ−ＤＮＪ（ＵＶ−１）；ＮＮ−ＤＮＪ（ＵＶ−２）；Ｎ７−Ｏ−ＤＮＪ（ＵＶ−３）；Ｎ９−ＤＮＪ（ＵＶ−４）；ＮＡＰ−ＤＮＪ（ＵＶ−５）によるデングウイルス放出の阻害に関するデータを示す。対照ベロ細胞培養物および示された濃度のＵＶ化合物で処理したベロ細胞培養物をウイルスに感染させ、ＣＯ_２５％のインキュベーターにおいて３７℃で７日間培養した。化合物で処理したウイルス感染細胞培養物から得られた感染性ウイルス粒子の産生の阻害をプラークアッセイによって決定した。ウイルスプラークアッセイを、２％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した１×改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、６穴プレートにウェル当たり５×１０５細胞で播種したベロ細胞において行った。化合物で処理された感染細胞培養物から収集した上清から得られた力価測定しようとするウイルスを、細胞培養培地で希釈し、細胞上に１００μｌ容量で接種し、３７℃で１時間吸着させた。細胞を２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した１×改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）中０．６％アガロースで覆った。

細胞に感染してそれを死滅させる個別の感染性ウイルス粒子を示す死細胞のプラークを、ＣＯ_２５％のインキュベーター中で３７℃で進行させ、細胞単層をニュートラルレッドで生細胞染色することにより可視化した。実験により、感染性デングウイルスの放出がＵＶイミノ糖化合物で処理後、有意に減少したことが実証される。

図１０および１１Ａ〜Ｃは、ＵＶ−４（Ｎ９−ＤＮＪ）によるデングウイルスに対するマウスの保護を示す。本モデルにおいて、α／βインターフェロンおよびＩＦＮ−γの受容体を欠如している１２９／ＳｖマウスであるＡＧ１２９マウスに、静脈内注射でデング２株Ｓ２２１を感染させる。マウスは、感染４〜５日後、ＴＮＦ−ａ媒介急性／早期死亡で死亡する。Ｓｈｒｅｓｔａ，Ｓ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００６年 ８０巻（２０号）：１０２０８〜１７頁を参照のこと。各実験群は、性別が一致した５〜６週齢のマウス５匹を含んだ。マウスに、最初のＮ９−ＤＮＪ用量を経口投与してから３０分後、ＤＥＮＶ２株Ｓ２２１の１０^１１ゲノム当量を用いて尾静脈により静脈内に注射した。Ｎ９−ＤＮＪを２００、１００、５０および１０ｍｇ／ｋｇで１日２回経口投与した。抗ウイルス化合物リバビリン１００ｍｇ／ｋｇを１日１回皮下に投与し、ＰＢＳのみの群と共に陽性対照として含んだ。実験中重篤な疾患（２０％体重減少、極端な嗜眠、ラッフルドコート（ruffled coat）、または麻痺によって決定される）を示す動物を安楽死させた。マウスは、すべての薬物濃度：１００ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．００２ 対ＰＢＳ）および１０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０３４ 対ＰＢＳ）の場合の生存率において統計的に有意な改善を示した。

前述したものは、具体的な好ましい実施形態を意味するが、本発明が必ずしもそのように限定されるものではないことを理解されたい。開示された実施形態に様々な修正がなされ、かかる修正が本発明の範囲内にあることが意図されることは当業者には明らかであろう。

本明細書で引用されたすべての刊行物、特許出願および特許は、全体として参照により
本明細書に組み込まれる。

以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ デングウイルス感染症を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の次式の化合物

または薬学的に許容されるその塩［式中、Ｒは、置換もしくは非置換のオキサアルキル基であり、またはＲは、

（式中、
Ｒ _１ は、オキサアルキル基であり、
Ｘ _１〜５ は、Ｈ、ＮＯ _２ 、Ｎ _３ 、またはＮＨ _２ から独立して選択され、
Ｙは、存在しないか、またはカルボニル以外の置換もしくは非置換のＣ _１ −アルキル基であり、
Ｚは、結合またはＮＨから選択され、ただし、Ｚが結合である場合Ｙは存在せず、ＺがＮＨである場合Ｙはカルボニル以外の置換もしくは非置換のＣ _１ −アルキル基である）であり、
Ｗ _１〜４ は、水素、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のハロアルキル基、置換もしくは非置換のアルカノイル基、置換もしくは非置換のアロイル基、または置換もしくは非置換のハロアルカノイル基から独立して選択される］を投与することを含む方法。
［２］ Ｗ _１ 、Ｗ _２ 、Ｗ _３ およびＷ _４ のそれぞれが水素である、［１］に記載の方法。
［３］ Ｒが、オキサアルキル基である、［１］に記載の方法。
［４］ Ｒが、１〜３個の酸素原子を含むＣ２〜Ｃ１６オキサアルキル基である、［１］に記載の方法。
［５］ Ｒが、１から２個の酸素原子を含むＣ６〜Ｃ１２オキサアルキル基である、［１］に記載の方法。
［６］ 化合物がＮ−（７−オキサデシル）デオキシノジリマイシンまたは薬学的に許容されるその塩である、［１］に記載の方法。
［７］ 化合物がＮ−（９−メトキシノニル）デオキシノジリマイシンまたは薬学的に許容されるその塩である、［１］に記載の方法。
［８］ Ｒが

である、［１］に記載の方法。
［９］ Ｘ _１ がＮＯ _２ であり、Ｘ _３ がＮ _３ である、［８］に記載の方法。
［１０］ Ｘ _２ 、Ｘ _４ およびＸ _５ のそれぞれが水素である、［８］に記載の方法。
［１１］ 化合物がＮ−（Ｎ−｛４’−アジド−２’−ニトロフェニル｝−６−アミノヘキシル）デオキシノジリマイシンまたは薬学的に許容されるその塩である、［１］に記載の方法。
［１２］ ウイルス感染症が、デング２ウイルスによって引き起こされるかまたはそれに関連する、［１］に記載の方法。
［１３］ 対象が哺乳動物である、［１］に記載の方法。
［１４］ 対象がヒトである、［１］に記載の方法。
［１５］ 前記投与が対象におけるデング感染症を予防する、［１］に記載の方法。
［１６］ Ｒがオキサアルキル基である、［１５］に記載の方法。
［１７］ １〜３個の酸素原子を含むＣ２〜Ｃ１６オキサアルキル基である、［１５］に記載の方法。
［１８］ Ｒが、１〜２個の酸素原子を含むＣ６〜Ｃ１２オキサアルキル基である、［１５］に記載の方法。
［１９］ 化合物がＮ−（９−メトキシノニル）デオキシノジリマイシンまたは薬学的に許容されるその塩である、［１５］に記載の方法。

Claims (4)

1. Ｎ−（９−メトキシノニル）デオキシノジリマイシンまたは薬学的に許容されるその塩を含む、対象においてデングウイルス感染症を治療するための医薬組成物。
2. 前記ウイルス感染症が、デング２ウイルスによって引き起こされる、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記対象が哺乳動物である、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記対象がヒトである、請求項１に記載の医薬組成物。
   
   

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