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JP5697881B2 - Method for detecting Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus - Google Patents

Method for detecting Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus Download PDF

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JP5697881B2 JP2010064252A JP2010064252A JP5697881B2 JP 5697881 B2 JP5697881 B2 JP 5697881B2 JP 2010064252 A JP2010064252 A JP 2010064252A JP 2010064252 A JP2010064252 A JP 2010064252A JP 5697881 B2 JP5697881 B2 JP 5697881B2
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Description

本発明は、パエシロマイセス サトゥラタス(Paecilomyces saturatus)及びパエシロマイセス ディバリカタス(Paecilomyces divaricatus)の検出方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus .

パエシロマイセス サトゥラタス(Paecilomyces saturatus)及びパエシロマイセス ディバリカタス(Paecilomyces divaricatus)は自然界に広く分布する不完全真菌である。パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスは食品の重大な危害菌であるパエシロマイセス バリオッティ(Paecilomyces variotii)に形態学的に極めて類似しており、長年パエシロマイセス バリオッティであると考えられてきた。しかしながら、近年の遺伝学的な解析により、パエシロマイセス サトゥラタスとパエシロマイセス ディバリカタスはパエシロマイセス バリオッティと別種であることが明らかとなった。これら3種のパエシロマイセスは、生活環の中で厚膜胞子と呼ばれる二重の細胞壁からなる無性胞子を形成する。パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの厚膜胞子はストレス耐性が極めて高いことが知られており、一般的な真菌菌糸の熱及び薬剤での殺菌条件でも生存・増殖することが知られている。従って、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスは食品業界やトイレタリー業界において危害菌として重要視されている。このため、防腐・防黴体制の確立において、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの検出・同定が極めて重要であると認識されている。 Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus are imperfect fungi widely distributed in nature. Paecilomyces Saturatasu and Paecilomyces Dibarikatasu are very similar morphologically to a serious harm bacteria food Paecilomyces burr Matteotti (Paecilomyces variotii), it has been considered as a long Paecilomyces burr Matteotti. However, recent genetic analyzes revealed that Paecilomyces saturatas and Paecilomyces divaricatas are distinct from Paecilomyces varioti. These three types of Paecilomyces form asexual spores consisting of double cell walls called thick film spores in the life cycle. Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus thick film spores are known to be extremely resistant to stress, and are known to survive and proliferate even under heat and chemical bactericidal conditions. Therefore, Paecilomyces saturatas and Paecilomyces divaricatus are regarded as important germs in the food and toiletries industries. For this reason, it is recognized that the detection and identification of Paecilomyces saturatas and Paecilomyces divaricatus is extremely important in establishing antiseptic and antifungal systems.

パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの検出及び同定法は、培養による形態学的な種分類が主である。この方法は形態学的な特徴が発生するまで培養を続ける必要があるため、最短でも14日以上の長期間を必要とする。また、形態学的な同定には極めて高い専門性を必要とするため、判定者によって同定結果が異なる危険性が否定できない。さらには、損傷菌などの菌体の状態によっては培養を続けても種特異的な形態が形成されないことがあるため、従来の同定法による解析結果の信頼性に問題が指摘されてきた。従って、迅速性及び信頼性の問題を解決した検出・同定方法の確立が求められている。   Paecilomyces saturatas and Paecilomyces divaricatus detection and identification methods are mainly morphological species classification by culture. This method requires a long period of at least 14 days since culture must be continued until morphological characteristics occur. In addition, since morphological identification requires extremely high expertise, it is impossible to deny the risk that identification results differ depending on the judge. Furthermore, depending on the state of cells such as damaged bacteria, a species-specific form may not be formed even if the culture is continued, and problems have been pointed out in the reliability of the analysis results obtained by the conventional identification method. Therefore, establishment of a detection / identification method that solves the problems of rapidity and reliability is required.

菌類の迅速かつ信頼性の高い検出方法としては、遺伝子の特定の塩基配列を標的とした増幅法(たとえばPCR法やLAMP法)が知られている(例えば、特許文献1〜4参照)。しかし、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスに特異的な遺伝子領域が解明されていない。従って、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的かつ迅速に検出することが困難であるという問題を有している。   As a rapid and reliable detection method of fungi, an amplification method (for example, a PCR method or a LAMP method) targeting a specific base sequence of a gene is known (for example, see Patent Documents 1 to 4). However, the gene regions specific to Paecilomyces saturatas and Paecilomyces divaricatus have not been elucidated. Therefore, there is a problem that it is difficult to specifically and rapidly detect Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus.

特表平11−505728号公報Japanese National Patent Publication No. 11-505728 特開2006−61152号公報JP 2006-61152 A 特開2006−304763号公報JP 2006-304763 A 特開2007−174903号公報JP 2007-174903 A

本発明は、食品業界やトイレタリー業界などにおいて危害菌とされているパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的、簡便かつ迅速に検出できる方法を提供することを課題とする。また、本発明の課題は、この方法に適用可能なオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットを提供することにある。   An object of the present invention is to provide a method capable of specifically, simply and rapidly detecting Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus, which are considered harmful bacteria in the food industry and the toiletry industry. Another object of the present invention is to provide an oligonucleotide, an oligonucleotide pair and a detection kit applicable to this method.

上述のようにパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの検出を困難にしている一因として、従来の公知のプライマーを用いたPCR法では擬陽性や擬陰性の結果が出る点である。そしてこれは、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの遺伝子のデータベースが現在のところ貧弱であり、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスの種レベルで保存されている遺伝子領域が正確にわかっていないために、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的かつ迅速に検出・識別するための高感度のプライマーの設計等が困難となっていることが原因であると考えた。   As mentioned above, one of the reasons that makes it difficult to detect Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus is that PCR methods using conventional known primers give false positive or false negative results. And this is because Paecilomyces saturatas and Paecilomyces divaricatus genetic databases are currently poor, and the genetic region conserved at the species level of Paecilomyces saturatas and Paecilomyces divaricatus is not known accurately, so Paecilomyces saturatas and Paecilomyces divaricatus This was thought to be due to the difficulty in designing highly sensitive primers for specific and rapid detection and identification.

このような課題に鑑み、本発明者等は、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的に検出・識別しうる新たなDNA領域を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する領域(以下、「可変領域」ともいう)が存在することを見出した。また、この可変領域をターゲットとすることでパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的かつ迅速に検出できることを見出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。   In view of such a problem, the present inventors have intensively studied to search for a new DNA region capable of specifically detecting and identifying Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus. As a result, there is a region in the β-tubulin gene of Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatas that has a specific base sequence that can be clearly distinguished from those of other fungi (hereinafter also referred to as “variable regions”). I found out. It was also found that Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus can be specifically and rapidly detected by targeting this variable region. The present invention has been completed based on this finding.

本発明は、下記(a)〜(d)からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチドを用いてパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスの同定を行う工程を含むことを特徴とするパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出方法に関する。
(a)配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号1に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号2に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号3に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号4に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
The present invention includes a step of identifying Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus using at least one oligonucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (d): Or, it relates to a method for detecting Paecilomyces divaricatus.
(A) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and of Paecilomyces saturatus Oligonucleotide that can be used for detection (b) Oligonucleotide represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, or one or several bases in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is deleted, substituted, inserted or added And an oligonucleotide that can be used to detect Paecilomyces saturatus (c) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, or one or several bases deleted in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, Used to detect Paecilomyces divaricatus that has been replaced, inserted, or added. (D) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or one or several bases deleted, substituted, inserted or added in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and Oligonucleotides that can be used to detect Paecilomyces divaricatus

また、本発明は、前記(a)〜(d)からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチドを用いて、下記(e)〜(h)のいずれかの塩基配列で表される核酸の全部又は一部が含まれるかを確認することを特徴とするパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出方法に関する。
(e)配列番号5に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(f)配列番号5に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
(g)配列番号6に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(h)配列番号6に記載の塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
The present invention also provides a nucleic acid represented by any one of the following base sequences (e) to (h) using at least one oligonucleotide selected from the group consisting of (a) to (d): The present invention relates to a method for detecting Paecilomyces saturatas and / or Paecilomyces divaricatus, which is characterized by confirming whether all or a part is included.
(E) a partial base sequence of the β-tubulin gene described in SEQ ID NO: 5 or its complementary sequence (f) one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence described in SEQ ID NO: 5 And a base sequence that can be used to detect Paecilomyces saturatus, or a complementary sequence thereof (g) a partial base sequence of the β-tubulin gene described in SEQ ID NO: 6 or a complementary sequence thereof (h) a base sequence described in SEQ ID NO: 6 In which one or several bases are deleted, substituted, inserted or added and can be used for detection of Paecilomyces divaricatus, or a complementary sequence thereof

また、本発明は、前記(a)〜(d)のいずれかのオリゴヌクレオチドであって、パエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる、パエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用オリゴヌクレオチドに関する。   The present invention also relates to the oligonucleotide for detecting Paecilomyces saturatus or Paecilomyces divaricatus, which is the oligonucleotide of any one of (a) to (d) and can be used as an oligonucleotide for detecting Paecilomyces saturatus or Paecilomyces divaricatus.

また、本発明は、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチド対又は下記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチド対で示されたパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用オリゴヌクレオチド対に関する。   The present invention also relates to a pair of oligonucleotides for detecting Paecilomyces saturatus or Paecilomyces divaricatas shown by the oligonucleotide pairs (a) and (b) or the oligonucleotide pairs (c) and (d) below.

また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド対を含むパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出キットに関する。   The present invention also relates to a Paecilomyces saturatus or Paecilomyces divaricatus detection kit comprising the oligonucleotide pair.

本発明の検出方法は、食品業界やトイレタリー業界などにおいて危害菌とされているパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的、簡便かつ迅速に検出することができる。また、本発明オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットは、前記方法に好適に適用することができる。   The detection method of the present invention can specifically, easily and quickly detect Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus, which are regarded as harmful bacteria in the food industry, the toiletry industry and the like. Moreover, the oligonucleotide, oligonucleotide pair and detection kit of the present invention can be suitably applied to the above method.

実施例1における、本発明の(a)及び(b)のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したPCR産物の電気泳動図である。FIG. 2 is an electrophoretogram of a PCR product amplified using the oligonucleotides (a) and (b) of the present invention in Example 1. 実施例1における、本発明の(a)及び(b)のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したPCR産物の電気泳動図である。FIG. 2 is an electrophoretogram of a PCR product amplified using the oligonucleotides (a) and (b) of the present invention in Example 1. 実施例2における、本発明の(c)及び(d)のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したPCR産物の電気泳動図である。FIG. 3 is an electrophoretogram of PCR products amplified using the oligonucleotides (c) and (d) of the present invention in Example 2.

本発明は、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の特定の部分塩基配列、すなわちパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子配列中に存在するパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスにそれぞれ特異的な領域(可変領域)にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを用いてパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスの同定を行い、パエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスを特異的に識別・検出する方法である。ここで、「可変領域」とは、β−チューブリン遺伝子中で塩基変異が蓄積しやすい領域であり、この領域の塩基配列は他の真菌との間で大きく異なる。本発明における「パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタス」及び「パエシロマイセス ディバリカタス」は、ぞれぞれ糸状不完全菌類のパエシロマイセス(Paecilomyces)に属する。また、「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。 The present invention relates to a specific partial base sequence of the β-tubulin gene of Paecilomyces saturatas and Paecilomyces divaricatus, that is, specific regions respectively for Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus present in the β-tubulin gene sequence of Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus. Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus are identified using oligonucleotides that can hybridize under stringent conditions to the (variable region), and Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus is specifically identified and detected. Here, the “variable region” is a region in which base mutations tend to accumulate in the β-tubulin gene, and the base sequence of this region is greatly different from other fungi. “Paecilomyces saturatas and Paecilomyces divaricatas” and “Paecilomyces divaricatas” in the present invention belong to Paecilomyces, a filamentous imperfect fungus. Further, “β-tubulin” is a protein constituting a microtubule, and “β-tubulin gene” is a gene encoding β-tubulin.

パエシロマイセス サトゥラタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域を配列番号5に基づき説明する。なお、配列番号5で示された塩基配列は、パエシロマイセス サトゥラタスIFM50295株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。配列番号5で示された塩基配列のうち、70位〜100位までの領域、及び310位〜350位までの領域は真菌間で塩基配列の保存性が特に低く、種間によって固有の塩基配列を有する可変領域であることを本発明者らが見出した。本発明は、これらのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を対象としたものである。   The variable region of the β-tubulin gene of Paecilomyces saturatus will be described based on SEQ ID NO: 5. The base sequence represented by SEQ ID NO: 5 shows a partial base sequence of the β-tubulin gene of Paecilomyces saturatus IFM50295 strain. Of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, the region from position 70 to position 100 and the region from position 310 to position 350 are particularly low in conservation of the base sequence among fungi, and the base sequence unique among species The present inventors have found that this is a variable region having. The present invention is directed to the partial base sequences of these β-tubulin genes.

前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号5で示された塩基配列のうち80位〜97位までの領域及び324位〜343位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。したがって、前記(a)及び/又は(b)のオリゴヌクレオチドを用いて、パエシロマイセス サトゥラタスを特異的に識別・同定することができる。   The oligonucleotides (a) and (b) are hybridized under stringent conditions to the region from position 80 to position 97 and the region from position 324 to position 343, respectively, of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. It is an oligonucleotide capable of soybean. Therefore, Paecilomyces saturatus can be specifically identified and identified using the oligonucleotide (a) and / or (b).

本発明において、前記(a)及び/又は(b)のオリゴヌクレオチドを用いて、下記(e)又は(f)の塩基配列で表される核酸の全部又は一部(好ましくは、前記可変領域)が含まれるかを確認することが好ましい。
(e)配列番号5に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(f)配列番号5に記載の塩基配列において1又は数個(好ましくは1〜7個、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは1〜2個、最も好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
In the present invention, using the oligonucleotide (a) and / or (b), all or part of the nucleic acid represented by the nucleotide sequence (e) or (f) below (preferably the variable region): It is preferable to confirm whether or not is contained.
(E) a partial base sequence of the β-tubulin gene described in SEQ ID NO: 5 or a complementary sequence thereof (f) one or several (preferably 1-7, more preferably 1) in the base sequence described in SEQ ID NO: 5 -5, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 to 2, most preferably 1) base sequence which is deleted, substituted, inserted or added and can be used for detection of Paecilomyces saturatus Or its complementary sequence

パエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域を配列番号6に基づき説明する。なお、配列番号6で示された塩基配列は、パエシロマイセス ディバリカタスIFM50291株のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を示す。配列番号6で示された塩基配列のうち、50位〜90位までの領域、及び180位〜220位までの領域は真菌間で塩基配列の保存性が特に低く、種間によって固有の塩基配列を有する可変領域であることを本発明者らが見出した。本発明は、これらのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を対象としたものである。   The variable region of the β-tubulin gene of Paecilomyces divaricatus will be described based on SEQ ID NO: 6. The base sequence represented by SEQ ID NO: 6 represents a partial base sequence of the β-tubulin gene of Paecilomyces divaricatus IFM50291 strain. Of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, the region from the 50th position to the 90th position and the region from the 180th position to the 220th position are particularly low in conservation of the base sequence among fungi, and the base sequence unique among species The present inventors have found that this is a variable region having. The present invention is directed to the partial base sequences of these β-tubulin genes.

前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号6で示された塩基配列のうち59位〜78位までの領域及び192位〜211位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。したがって、前記(c)及び/又は(d)のオリゴヌクレオチドを用いて、パエシロマイセス ディバリカタスを特異的に識別・同定することができる。   The oligonucleotides (c) and (d) are hybridized under stringent conditions to the region from the 59th position to the 78th position and the region from the 192nd position to the 211th position of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, respectively. It is an oligonucleotide capable of soybean. Therefore, Paecilomyces divaricatus can be specifically identified and identified using the oligonucleotides (c) and / or (d).

本発明において、前記(c)及び/又は(d)のオリゴヌクレオチドを用いて、下記(g)又は(h)の塩基配列で表される核酸の全部又は一部(好ましくは、前記可変領域)が含まれるかを確認することが好ましい。
(g)配列番号6に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(h)配列番号6に記載の塩基配列において1又は数個(好ましくは1〜7個、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは1〜2個、最も好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されておりかつパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
In the present invention, using the oligonucleotide (c) and / or (d), all or part of the nucleic acid represented by the nucleotide sequence (g) or (h) below (preferably the variable region): It is preferable to confirm whether or not is contained.
(G) a partial base sequence of the β-tubulin gene described in SEQ ID NO: 6 or a complementary sequence thereof (h) one or several (preferably 1-7, more preferably 1) in the base sequence described in SEQ ID NO: 6 -5, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1 to 2, most preferably 1) base sequence which is deleted, substituted, inserted or added and can be used for detection of Paecilomyces divaricatus Or its complementary sequence

前記(a)〜(d)の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを用いてパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスを同定する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、PCR法、LAMP法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。   The method for identifying Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus using at least one oligonucleotide of (a) to (d) is not particularly limited, and is usually a sequencing method, a hybridization method, a PCR method, a LAMP method, etc. It can be performed by the genetic engineering technique used.

本発明の検出方法において、パエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスを同定し検出を行うために、パエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつ核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いる。
本発明のパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用オリゴヌクレオチドとしては、パエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件でエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]記載の方法が挙げられ、例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5%SDS、5×デンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
In the detection method of the present invention, in order to identify and detect Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus, hybridization to a nucleic acid represented by the base sequence of the variable region of the β-tubulin gene of Paecilomyces saturatus or Paecilomyces divaricatus And a detection oligonucleotide that can function as a nucleic acid probe or nucleic acid primer.
The oligonucleotide for detecting Paecilomyces saturatas or Paecilomyces divaricatus of the present invention can be used as a nucleic acid primer or nucleic acid probe for detection of Paecilomyces saturatus or Paecilomyces divaricatus, or β-tube of Ecylomyces saturatus or Paecilomyces divaricatus under stringent conditions. Any oligonucleotide that can hybridize to the variable region of the phosphorus gene may be used. Here, “stringent conditions” include, for example, the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press], for example, 6 × SSC (1 × SSC composition: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA together with the probe at 65 ° C. And the conditions of constant temperature for 8 to 16 hours and hybridization.

本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号1〜4のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである。また、本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号1〜4のいずれかに記載の塩基配列に対して70%以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が80%以上であることがさらに好ましく、相同性が85%以上であることがさらに好ましく、相同性が90%以上であることがさらに好ましく、相同性が95%以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるオリゴヌクレオチドには、配列番号1〜4のいずれかに記載の塩基配列において1つの塩基配列中、1又は数個、好ましくは1から5個、より好ましくは1から4個、さらに好ましくは1から3個、よりさらに好ましくは1から2個、特に好ましくは1個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加されており、かつパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号1〜4のいずれかに記載の塩基配列又はその相補配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman−Pearson法(Science,227,1435,1985)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx−Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。
The oligonucleotide used in the detection method of the present invention is an oligonucleotide represented by the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4. The oligonucleotide used in the detection method of the present invention is an oligonucleotide represented by a base sequence having 70% or more homology to the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 4 or a complementary sequence thereof. The homology is more preferably 80% or more, the homology is more preferably 85% or more, the homology is more preferably 90% or more, and the homology is 95% or more. It is particularly preferred that In addition, the oligonucleotide that can be used in the present invention includes one or several, preferably 1 to 5, more preferably 1 in one base sequence in the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4. For detecting Paecilomyces saturatus or Paecilomyces divaricatus, wherein 1 to 3, more preferably 1 to 3, even more preferably 1 to 2, particularly preferably 1 base has been deleted, substituted, inserted or added. Also included are oligonucleotides that can be used. Moreover, you may add an appropriate base sequence to the base sequence in any one of sequence number 1-4, or its complementary sequence.
The base sequence homology is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985) or the like. Specifically, using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (manufactured by software development), the calculation is performed by performing an analysis with the parameter unit size to compare (ktup) as 2. Can do.

上記検出用オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。   The binding mode of the detection oligonucleotide may be not only a phosphodiester bond existing in a natural nucleic acid but also a phosphoramidate bond, a phosphorothioate bond, or the like.

本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、核酸プライマー及び核酸プローブとして用いることができる。核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やCCDカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標的核酸を標識して捕捉することもできる。
The oligonucleotide for detection of the present invention can be used as a nucleic acid primer and a nucleic acid probe. The nucleic acid probe can be prepared by labeling the oligonucleotide with a label. The label is not particularly limited, and usual labels such as radioactive substances, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, antigens, haptens, enzyme substrates, insoluble carriers and the like can be used. The labeling method may be end labeling, labeling in the middle of the sequence, or labeling on a sugar, phosphate group, or base moiety. As a means for detecting such a label, for example, when the nucleic acid probe is labeled with a radioisotope, it is labeled with a chemiluminescent substance such as autoradiography, and when it is labeled with a fluorescent substance, such as a fluorescence microscope. In some cases, analysis using a photosensitive film, digital analysis using a CCD camera, and the like can be given.
The oligonucleotide can also be used as a capture probe by binding to a solid support. In this case, a sandwich assay can be performed with a combination of a capture probe and a labeled nucleic acid probe, or the target nucleic acid can be labeled and captured.

本発明の検出法において、パエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスを同定、検出するために、配列番号1〜4のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションを行うことが好ましく、配列番号1〜4のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いるのがさらに好ましい。パエシロマイセス サトゥラタスを同定、検出するためには、前記(a)及び/又は(b)のオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いるのが好ましい。パエシロマイセス ディバリカタスを同定、検出するためには、前記(c)及び/又は(d)のオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして用いるのが好ましい。   In the detection method of the present invention, in order to identify and detect Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus, the oligonucleotide represented by the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, or 1 to the nucleotide sequence Alternatively, it is preferable to perform hybridization using an oligonucleotide having several bases deleted, substituted, inserted or added and usable for detection of Paecilomyces saturatus or Paecilomyces divaricatas as a nucleic acid probe. It is more preferable to use an oligonucleotide represented by any one of the base sequences as a nucleic acid probe. In order to identify and detect Paecilomyces saturatus, it is preferable to use the oligonucleotide (a) and / or (b) as a nucleic acid probe. In order to identify and detect Paecilomyces divaricatus, it is preferable to use the oligonucleotide (c) and / or (d) as a nucleic acid probe.

被検体中のパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスを検出するためには、前記(a)〜(d)の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをDNA又はRNAとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出法により検出すればよい。上記核酸プローブはパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の可変領域の一部と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスを迅速かつ簡便に検出することができる。DNA又はRNAとハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法(FISH法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等)を用いることができる。   In order to detect Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus in a subject, at least one of the oligonucleotides (a) to (d) is labeled as a nucleic acid probe, and the obtained nucleic acid probe is used as DNA or RNA. Hybridization is performed, and the label of the hybridized probe may be detected by an appropriate detection method. Since the above nucleic acid probe specifically hybridizes with a part of the variable region of the β-tubulin gene of Paecilomyces saturatus or Paecilomyces devaricatus, it is possible to quickly and easily detect Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus in a subject. it can. As a method for measuring the label of the nucleic acid probe hybridized with DNA or RNA, a usual method (FISH method, dot blot method, Southern blot method, Northern blot method, etc.) can be used.

本発明の検出方法において、パエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスの同定を行うため、前記(a)〜(d)の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを用いて、前記(e)〜(h)のいずれかの塩基配列の全部又は一部を増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。当該領域を含むDNA断片を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法、LCR(Ligase Chain Reaction)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amplification)法、RCA(Rolling-circle amplification)法、LAMP(Loop mediated isothermal amplification)法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、PCR法を用いるのが好ましい。
本発明において、PCR法により増幅反応を行いパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出を行う場合について説明する。
In the detection method of the present invention, in order to identify Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus, any one of (e) to (h) above is used using at least one oligonucleotide of (a) to (d). It is preferable to amplify all or part of the base sequence and confirm the presence or absence of the amplified product. A method for amplifying a DNA fragment containing the region is not particularly limited, and is a polymerase chain reaction (PCR) method, an LCR (Ligase Chain Reaction) method, an SDA (Strand Displacement Amplification) method, an NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification) method. Ordinary methods such as RCA (Rolling-circle amplification) method and LAMP (Loop mediated isothermal amplification) method can be used. In the present invention, the PCR method is preferably used.
In the present invention, the case of detecting Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus by carrying out an amplification reaction by PCR will be described.

本発明において、PCR法により増幅反応を行い、パエシロマイセス サトゥラタスを検出するためには、前記(a)及び(b)の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのが好ましく、前記(a)及び(b)オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがより好ましく、前記配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。
また、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチド対をパエシロマイセス サトゥラタス検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
In the present invention, in order to perform an amplification reaction by PCR and detect Paecilomyces saturatus, it is preferable to use at least one oligonucleotide of (a) and (b) as a nucleic acid primer. b) It is more preferable to use an oligonucleotide as a nucleic acid primer, and an oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 2 are used as a nucleic acid primer. Is more preferable.
Further, the oligonucleotide pair (a) and (b) can be used as an oligonucleotide pair for detecting Paecilomyces saturatus.

配列番号1及び配列番号2で示されるオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス サトゥラタスのβ−チューブリン遺伝子領域に存在し、可変領域の一部分の塩基配列又はその相補配列と同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス サトゥラタスのDNAの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
前記(a)及び(b)で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号5に記載の塩基配列のうち、それぞれ80位〜97位まで、324位〜343位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをパエシロマイセス サトゥラタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、パエシロマイセス サトゥラタスを特異的に検出することができる。
The oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are oligonucleotides that are present in the β-tubulin gene region of Paecilomyces saturatus and have the same base sequence as the base sequence of a part of the variable region or its complementary sequence. These oligonucleotides can specifically hybridize to a portion of Paecilomyces saturatus DNA.
The oligonucleotides represented by the above (a) and (b) correspond to regions from the 80th to 97th positions and from the 324th to 343th positions, respectively, of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5. Therefore, Paecilomyces saturatus can be specifically detected by hybridizing the oligonucleotide to the β-tubulin gene of Paecilomyces saturatus.

本発明において、PCR法により増幅反応を行い、パエシロマイセス ディバリカタスを検出するためには、前記(c)及び(d)の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのが好ましく、前記(c)及び(d)オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがより好ましく、前記配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号4に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのがさらに好ましい。
また、前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチド対をパエシロマイセス サトゥラタス検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
In the present invention, it is preferable to use at least one oligonucleotide of (c) and (d) as a nucleic acid primer in order to perform an amplification reaction by PCR and detect Paecilomyces divaricatus. d) It is more preferable to use the oligonucleotide as a nucleic acid primer, and the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 4 are used as the nucleic acid primer. Is more preferable.
The oligonucleotide pairs (c) and (d) can be used as Paecilomyces saturatus detection oligonucleotide pairs.

配列番号3及び配列番号4で示されるオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子領域に存在し、可変領域の一部分の塩基配列又はその相補配列と同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、パエシロマイセス ディバリカタスのDNAの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
前記(c)及び(d)で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号6に記載の塩基配列のうち、それぞれ59位〜78位まで、192位〜211位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、パエシロマイセス ディバリカタスを特異的に検出することができる。
The oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are oligonucleotides that are present in the β-tubulin gene region of Paecilomyces devaricatus and have the same base sequence as the base sequence of a part of the variable region or its complementary sequence. These oligonucleotides can specifically hybridize to a portion of the DNA of Paecilomyces divaricatus.
The oligonucleotides represented by (c) and (d) correspond to the regions from position 59 to position 78 and position 192 to position 211, respectively, in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6. Therefore, Paecilomyces divaricatus can be specifically detected by hybridizing the oligonucleotide to the β-tubulin gene of Paecilomyces divaricatus.

本発明におけるPCR反応の条件は、目的のDNA断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。例えば、前記(a)及び(b)オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いてPCR法を行う場合、2本鎖DNAを1本鎖にする熱変性反応を95〜98℃で10〜60秒間行い、プライマー対を1本鎖DNAにハイブリダイズさせるアニーリング反応を50〜60℃で約60秒間行い、DNAポリメラーゼを作用させる伸長反応を約72℃で約60秒間行い、これらを1サイクルとしたものを約30〜35サイクル行う。また、前記(c)及び(d)オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いてPCR法を行う場合、2本鎖DNAを1本鎖にする熱変性反応を95〜98℃で10〜60秒間行い、プライマー対を1本鎖DNAにハイブリダイズさせるアニーリング反応を50〜63℃で約60秒間行い、DNAポリメラーゼを作用させる伸長反応を約72℃で約60秒間行い、これらを1サイクルとしたものを約30〜35サイクル行う。   The PCR reaction conditions in the present invention are not particularly limited as long as the target DNA fragment can be amplified to a detectable level. For example, when performing the PCR method using the oligonucleotides (a) and (b) as a nucleic acid primer, a heat denaturation reaction in which a double-stranded DNA is made into a single strand is carried out at 95 to 98 ° C. for 10 to 60 seconds. An annealing reaction for hybridizing the pair to single-stranded DNA is carried out at 50 to 60 ° C. for about 60 seconds, an extension reaction for allowing DNA polymerase to act is carried out at about 72 ° C. for about 60 seconds, and these are defined as one cycle for about 30 Perform ~ 35 cycles. In addition, when performing the PCR method using the oligonucleotides (c) and (d) as nucleic acid primers, a heat denaturation reaction in which a double-stranded DNA is made into a single strand is carried out at 95 to 98 ° C. for 10 to 60 seconds. An annealing reaction for hybridizing the pair to single-stranded DNA is carried out at 50 to 63 ° C. for about 60 seconds, an extension reaction for allowing DNA polymerase to act is carried out at about 72 ° C. for about 60 seconds, and these are defined as about 30 cycles. Perform ~ 35 cycles.

本発明において、PCR法により増幅した遺伝子断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、PCR反応産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、PCR反応産物の塩基配列を解読する方法、増幅したDNA2本鎖の間に蛍光物質を入り込ませ発光させる方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。
検体にパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスが含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してPCR反応を行い、得られたPCR反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的なDNA断片の増幅が認められる。具体的には、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いた場合は約250bpのDNA断片の増幅が認められ、前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いた場合は約150bpのDNA断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、検体にパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスが含まれているかを確認することができる。
In the present invention, gene fragments amplified by the PCR method can be confirmed by ordinary methods. For example, a method of incorporating nucleotides labeled with radioactive substances during amplification reaction, a method of confirming the presence or absence of a band corresponding to the size of the amplified gene by electrophoresis on the PCR reaction product, and decoding the base sequence of the PCR reaction product And a method of allowing a fluorescent substance to enter between the amplified DNA double strands to emit light, but the present invention is not limited to these methods. In the present invention, a method of performing electrophoresis after gene amplification treatment and confirming the presence or absence of a band corresponding to the size of the amplified gene is preferable.
When the sample contains Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus, PCR is performed using the oligonucleotide pair of the present invention as a primer set, and the obtained PCR reaction product is electrophoresed. Amplification of a typical DNA fragment is observed. Specifically, when the oligonucleotides (a) and (b) were used as nucleic acid primers, amplification of a DNA fragment of about 250 bp was observed, and the oligonucleotides (c) and (d) were used as nucleic acid primers. When used, amplification of a DNA fragment of about 150 bp is observed. By performing this operation, it can be confirmed whether the specimen contains Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus.

本発明において、標的領域を含むDNA断片の増幅のために用いられるプライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、1ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、公知の方法を使用して合成できる。   In the present invention, a primer used for amplification of a DNA fragment containing a target region can be chemically synthesized based on the designed sequence or purchased from a reagent manufacturer. Specifically, it can be synthesized using an oligonucleotide synthesizer or the like. Moreover, what was refine | purified using the adsorption column, the high performance liquid chromatography, and the electrophoresis method after a synthesis | combination can also be used. An oligonucleotide having a base sequence in which one to several bases are substituted, deleted, inserted or added can also be synthesized using a known method.

本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
検体からDNAを調製する方法としては、パエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスの検出を行うのに十分な精製度及び量のDNAが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のRNAを逆転写して得られるDNAを用いることもできる。
There is no restriction | limiting in particular as a test substance used in this invention, Food-drinks itself, the raw material of food-drinks, an isolated microbial cell, a cultured microbial cell, etc. can be used.
The method for preparing DNA from a specimen is not particularly limited as long as DNA having sufficient purity and quantity to detect Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatus can be obtained, and can be used even in an unpurified state. Further, it can be used after pretreatment such as separation, extraction, concentration and purification. For example, it can be purified by extraction with phenol and chloroform, or purified using a commercially available extraction kit to increase the purity of the nucleic acid. In addition, DNA obtained by reverse transcription of RNA in a subject can also be used.

本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてパエシロマイセス サトゥラタス及び/又はパエシロマイセス ディバリカタスのβ−チューブリン遺伝子の標的領域を含むDNA断片の増幅を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。
例えば、本発明のパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタス検出用キットは、前記(a)及び(b)のオリゴヌクレオチド対又は前記(c)及び(d)のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして含有するものである。このキットは、PCR法によりパエシロマイセス サトゥラタス又はパエシロマイセス ディバリカタスを検出する方法に好ましく用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素(DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素等)、酵素基質(dNTP,rNTP等)等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のプライマーによってPCR反応が正常に進行することを確認するための陽性対照(ポジティブコントロール)を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだDNAが挙げられる。
Various reagents necessary for amplifying a DNA fragment containing the target region of the β-tubulin gene of Paecilomyces saturatus and / or Paecilomyces divaricatas using the oligonucleotide pair of the present invention as primers are packaged in advance. It can be made into a kit.
For example, the Paecilomyces saturatus or Paecilomyces divaricatus detection kit of the present invention contains the oligonucleotide pair (a) and (b) or the oligonucleotide pair (c) and (d) as a nucleic acid primer. This kit can be preferably used in a method for detecting Paecilomyces saturatus or Paecilomyces divaricatus by PCR. In addition to the nucleic acid primer, the kit of the present invention may be a label detection substance, a buffer, a nucleic acid synthase (DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, etc.), an enzyme substrate (dNTP, rNTP, etc.), etc. Contains substances commonly used for fungal detection. The kit of the present invention may contain a positive control (positive control) for confirming that the PCR reaction proceeds normally with the primer of the present invention. Examples of the positive control include DNA containing a region amplified by the method of the present invention.

本発明の方法によれば、検体の調製工程から菌類の検出工程までを約60〜120分という短時間で行うことが可能である。   According to the method of the present invention, the process from the specimen preparation process to the fungus detection process can be performed in a short time of about 60 to 120 minutes.

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail based on an Example, this invention is not limited to this.

実施例1 パエシロマイセス サトゥラタスの検出
(1)プライマーの調製
PDA(ポテトデキストロース寒天)斜面培地にて25℃、7日間暗所培養した各種菌体から、Genとるくん(商品名、タカラバイオ社)を使用し、DNAを抽出した。抽出したDNAを鋳型とし、PuRe Taq(商品名)Ready−To−Go PCR Beads(GE Health Care UK LTD)、並びにプライマーとして、Bt2aプライマー(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’:配列番号7)及びBt2bプライマー(5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’:配列番号8)を用いて、Glass and Donaldson,1995を参考にPCR法により遺伝子断片の増幅を行った。PCR反応条件は、変性温度95℃で1分、アニーリング温度59℃で1分及び伸長温度72℃で1分行い、これらを1サイクルとしたものを35サイクル行った。PCR産物は、Auto Seg(商品名)G−50(Amersham Pharmacia Biotech)により精製し、ラベル化は、BigDye(商品名)terminator Ver.1.1(Applied Biosystems)を使用して行い、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer(商品名、Applied Biosystems)でPCR産物の解析を実施した。塩基配列の決定には、ソフトウエア‘ATGC Ver.4’(Genetyx社)を使用した。
上記のように決定した各種菌類(パエシロマイセス サトゥラタス、パエシロマイセス バリオッティー(Paecilomyces variotii)、パエシロマイセス フォーモサス(Paecilomyces formosus)、パエシロマイセス ディバリカタス、ビソクラミス ニベア(Byssochlamys nivea))のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、DNA解析ソフトウエア(商品名:DNAsis pro、日立ソフトウエア社製)を用いてアライメント解析を行い、パエシロマイセス サトゥラタスに特異的な塩基配列部位を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号1及び2に記載の塩基配列でそれぞれ表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、シグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し(脱塩精製品、0.02μmolスケール)、購入した。
Example 1 Detection of Paecilomyces saturatus (1) Primer preparation Gen Toru-kun (trade name, Takara Bio Inc.) was used from various cells cultured in a PDA (potato dextrose agar) slant medium at 25 ° C for 7 days in the dark. DNA was extracted. Using the extracted DNA as a template, PuRe Taq (trade name) Ready-To-Go PCR Beads (GE Health Care UK LTD), and as primers, Bt2a primer (5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3 ': SEQ ID NO: 7) and Bt2b primer Using (5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3 ′: SEQ ID NO: 8), gene fragments were amplified by the PCR method with reference to Glass and Donaldson, 1995. PCR reaction conditions were performed at a denaturation temperature of 95 ° C. for 1 minute, an annealing temperature of 59 ° C. for 1 minute, and an extension temperature of 72 ° C. for 1 minute, and these were defined as one cycle for 35 cycles. The PCR product was purified by Auto Seg (trade name) G-50 (Amersham Pharmacia Biotech), and labeling was performed using BigDye (trade name) terminator Ver. 1.1 (Applied Biosystems) was used, and PCR products were analyzed with ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (trade name, Applied Biosystems). For determination of the base sequence, software 'ATGC Ver. 4 '(Geneticx) was used.
It determined various fungi as described above is also a (Paecilomyces Saturatasu, Paecilomyces burr Matteotti chromatography (Paecilomyces variotii), Paecilomyces Fomosasu (Paecilomyces formosus), Paecilomyces Dibarikatasu, Byssochlamys nivea (Byssochlamys nivea)) partial base sequence information of the β- tubulin gene In addition, alignment analysis was performed using DNA analysis software (trade name: DNAsis pro, manufactured by Hitachi Software Co., Ltd.), and a base sequence site specific to Paecilomyces saturatus was identified. Based on the specified nucleotide sequence, primers composed of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 are designed, and the synthesis is requested to Sigma Aldrich Japan (desalted product, 0.02 μmol scale) ), Purchased.

(2)検体の調製
パエシロマイセス属及びパエシロマイセス属に類縁のビソクラミス属に属する耐熱性菌としては表1に記載した菌株を使用した。その他飲食品の製造環境に分布するカビとしては表2に記載した菌株を使用した。これらの菌類に関しては、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、The Centraalbureau voor Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターが管理しJCMナンバーで管理された株、財団法人発行研究所が管理しIFOナンバーで管理されている株、及び化学品原料から単離された株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。菌株の培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いての各菌の最適温度で7日間培養した。
(2) Preparation of specimens The strains listed in Table 1 were used as the thermostable bacteria belonging to the genus Paecilomyces and the genus Bisoclamis, which are related to the genus Paecilomyces. Other strains listed in Table 2 were used as molds distributed in the production environment for food and drink. Regarding these fungi, strains stored by the National Institute of Technology and Evaluation managed by the National Institute of Technology and Evaluation by the NBRC number, strains stored by the Center for Fungal Medicine, Chiba University School of Medicine and managed by the IFM number, The Centraalbureau voor Schimmelcultures Stocks stored and managed by CBS numbers, stocks managed by RIKEN BioResource Center and managed by JCM numbers, stocks managed by the Issuing Research Institute and managed by IFO numbers, and chemicals Strains isolated from the raw material were obtained and used.
Each strain was cultured under optimal conditions. With respect to the culture conditions of the strains, culturing was carried out for 7 days at the optimum temperature of each bacterium using a potato dextrose medium (trade name: Pearl Core potato dextrose agar medium, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.).

(3)ゲノムDNAの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収し、ポテトデキストロース寒天培地(組成:培地1000L当り馬鈴薯抽出液200g、ブドウ糖20g及び寒天15g、栄研化学株式会社)に播種した。25℃の培養条件下で2〜5日間培養し、1白金耳量の菌糸を回収した。
ゲノムDNA調製用キット(アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra(商品名))を用いて、回収した菌体からゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は5ng/μLに調製した。
(3) Preparation of genomic DNA Each bacterial cell was collected from an agar medium using a platinum loop and placed on a potato dextrose agar medium (composition: potato extract 200 g, glucose 20 g and agar 15 g, Eiken Chemical Co., Ltd. per 1000 L of medium). Sowing. After culturing for 2 to 5 days at 25 ° C., 1 platinum loop of mycelium was collected.
A genomic DNA solution was prepared from the collected cells using a genomic DNA preparation kit (PrepMan ultra (trade name) manufactured by Applied Biosystems). The concentration of the DNA solution was adjusted to 5 ng / μL.

(4)PCR反応
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μL、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μL、無菌蒸留水10μLを混合し、配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(PaeB1Fプライマー、20pmol/μL)0.5μL及び配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(PaeB1Rプライマー、20pmol/μL)0.5μLを加え、25μLのPCR反応液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)98℃、1分秒間の熱変性反応、(ii)59℃、1分間のアニーリング反応、および(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを35サイクル行った。
(4) PCR reaction As a DNA template, 1 μL of the genomic DNA solution prepared above, Pre Mix Taq (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.) 13 μL, and 10 μL of sterile distilled water were mixed and represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. 0.5 μL of a primer (PaeB1F primer, 20 pmol / μL) consisting of an oligonucleotide and 0.5 μL of a primer (PaeB1R primer, 20 pmol / μL) represented by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 25 μL of a PCR reaction solution was prepared.
The PCR reaction solution was subjected to gene amplification using an automatic gene amplification apparatus thermal cycler DICE (Takara Bio). PCR reaction conditions were as follows: (i) heat denaturation reaction at 98 ° C. for 1 minute, (ii) annealing reaction at 59 ° C. for 1 minute, and (iii) extension reaction at 72 ° C. for 1 minute in one cycle. 35 cycles were performed.

(5)増幅した遺伝子断片の確認
PCR反応後、PCR反応液から2μLを分取してローディングバッファーと十分に混和し、2%アガロースゲルを用いて電気泳動(135V、20分間)を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、増幅されたDNA断片の有無を確認した。その結果を図1及び図2に示す。なお、図1は表1に示す菌類の試料についての電気泳動図を示し、図2は表2に示す菌類の試料についての電気泳動図を示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したDNAを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図中の記号Mは、分子量マーカー(商品名:EZ Load TM 100bp、BIO RAD社)のレーンを示す。
(5) Confirmation of amplified gene fragment After the PCR reaction, 2 μL of the PCR reaction solution was separated and mixed well with a loading buffer, and electrophoresis (135 V, 20 minutes) was performed using a 2% agarose gel. After completion of electrophoresis, the agarose gel was stained with SYBR Safe DNA gel stain in 1 × TAE (Invitrogen), and the presence or absence of the amplified DNA fragment was confirmed. The results are shown in FIGS. 1 shows an electrophoretic diagram for the fungal sample shown in Table 1, and FIG. 2 shows an electrophoretic diagram for the fungal sample shown in Table 2. The numbers in the figure indicate that the samples were reacted using DNA extracted from the samples with corresponding sample numbers in the table. In addition, the symbol M in a figure shows the lane of a molecular weight marker (Brand name: EZ LoadTM100bp, BIO RAD).

その結果、パエシロマイセス サトゥラタスのゲノムDNAを含む試料では、250bp程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、パエシロマイセス サトゥラタス以外のパエシロマイセス属、及びその他食品の製造環境に広く分布する真菌類のゲノムDNAを含む試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、パエシロマイセス サトゥラタスを特異的に検出し、種レベルで同定することができる。   As a result, amplification of a gene fragment of about 250 bp was confirmed in the sample containing genomic DNA of Paecilomyces saturatus. On the other hand, amplification of gene fragments was not confirmed in samples containing the genome DNA of fungi widely distributed in the production environment of foods other than Paecilomyces saturatas and other foods. Therefore, by using the oligonucleotide of the present invention, Paecilomyces saturatus can be specifically detected and identified at the species level.

実施例2 パエシロマイセス ディバリカタスの検出
(1)プライマーの調製
実施例1で決定した各種菌類(パエシロマイセス ディバリカタス、パエシロマイセス バリオッティー、パエシロマイセス フォーモサス、パエシロマイセス サトゥラタス、ビソクラミス ニベア)のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、DNA解析ソフトウエア(商品名:DNAsis pro、日立ソフトウエア社製)を用いてアライメント解析を行い、パエシロマイセス ディバリカタスに特異的な塩基配列部位を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号3および4に記載の塩基配列でそれぞれ表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、シグマ アルドリッチ ジャパン社に合成依頼し(脱塩精製品、0.02μmolスケール)、購入した。
Example 2 Detection of Paecilomyces divaricatus (1) Preparation of primer Partial base sequence information of β-tubulin gene of various fungi determined in Example 1 (Paecilomyces divaricatus, Paecilomyces varioti, Paecilomyces formosas, Paecilomyces saturatus, Bisocramis nivea) First, alignment analysis was performed using DNA analysis software (trade name: DNAsis pro, manufactured by Hitachi Software Co., Ltd.), and a base sequence site specific to Paecilomyces divaricatus was identified. Based on the identified base sequence, primers composed of oligonucleotides represented by the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 are designed, and a synthesis request is made to Sigma Aldrich Japan (desalted product, 0.02 μmol scale) ), Purchased.

(2)検体の調製
パエシロマイセス ディバリカタスとその他飲食品の製造環境に分布する耐熱性菌としては表3に記載した菌株を使用した。これらの菌類に関しては、独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株、千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、及びThe Centraalbureau voor Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。菌株の培養条件についてはポテトデキストロース培地(商品名:パールコア ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製)を用いての各菌の最適温度で7日間培養した。
(2) Preparation of specimen The strains listed in Table 3 were used as heat-resistant bacteria distributed in the manufacturing environment of Paecilomyces divaricatus and other food and drink. Regarding these fungi, strains stored by the National Institute of Technology and Evaluation managed by the NBRC number, strains stored by the Chiba University School of Medicine, Center for Fungal Medicine and controlled by the IFM number, and The Centraalbureau voor Schimmelcultures Obtained and used stocks managed by CBS numbers.
Each strain was cultured under optimal conditions. With respect to the culture conditions of the strains, culturing was carried out for 7 days at the optimum temperature of each bacterium using a potato dextrose medium (trade name: Pearl Core potato dextrose agar medium, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.).

(3)ゲノムDNAの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収し、ポテトデキストロース寒天培地(組成:培地1000L当り馬鈴薯抽出液200g、ブドウ糖20g及び寒天15g、栄研化学株式会社)に播種した。25℃の培養条件下で2〜7日間培養し、1白金耳量の菌糸を回収した。
ゲノムDNA調製用キット(アプライドバイオシステムズ社製PrepMan ultra(商品名))を用いて、回収した菌体からゲノムDNA溶液を調製した。DNA溶液の濃度は5ng/μLに調製した。
(3) Preparation of genomic DNA Each bacterial cell was collected from an agar medium using a platinum loop and placed on a potato dextrose agar medium (composition: potato extract 200 g, glucose 20 g and agar 15 g, Eiken Chemical Co., Ltd. per 1000 L of medium). Sowing. The cells were cultured for 2 to 7 days under 25 ° C. culture conditions, and 1 platinum loop of mycelium was collected.
A genomic DNA solution was prepared from the collected cells using a genomic DNA preparation kit (PrepMan ultra (trade name) manufactured by Applied Biosystems). The concentration of the DNA solution was adjusted to 5 ng / μL.

(4)PCR反応
DNAテンプレートとして、上記で調製したゲノムDNA溶液1μL、Pre Mix Taq(商品名、タカラバイオ社製)13μL、無菌蒸留水10μLを混合し、配列番号3に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(Pae5Fプライマー、20pmol/μL)0.5μL及び配列番号4記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(Pae5Rプライマー、20pmol/μL)0.5μLを加え、25μLのPCR反応液を調製した。
PCR反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーDICE(タカラバイオ)を用いて遺伝子増幅処理を行った。PCR反応条件は、(i)95℃、1分間の熱変性反応、(ii)59℃、1分間のアニーリング反応、および(iii)72℃、1分間の伸長反応を1サイクルとしたものを35サイクル行った。
(4) PCR reaction As a DNA template, 1 μL of the genomic DNA solution prepared above, Pre Mix Taq (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.) 13 μL, and 10 μL of sterile distilled water were mixed and represented by the base sequence described in SEQ ID NO: 3. 0.5 μL of a primer composed of oligonucleotide (Pae5F primer, 20 pmol / μL) and 0.5 μL of a primer composed of an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (Pae5R primer, 20 pmol / μL) were added, and 25 μL was added. PCR reaction solution was prepared.
The PCR reaction solution was subjected to gene amplification using an automatic gene amplification apparatus thermal cycler DICE (Takara Bio). PCR reaction conditions include 35 cycles of (i) heat denaturation reaction at 95 ° C for 1 minute, (ii) annealing reaction at 59 ° C for 1 minute, and (iii) extension reaction at 72 ° C for 1 minute. Cycled.

(5)増幅した遺伝子断片の確認
PCR反応後、PCR反応液から2μLを分取してローディングバッファーと十分に混和し、2%アガロースゲルを用いて電気泳動(135V、20分間)を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR Safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン)でDNAを染色後、増幅されたDNA断片の有無を確認した。その結果を図3に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したDNAを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、電気泳動において、分子量マーカーとしてBIO RAD社製のEZ LoadTM 100bp(商品名)を用いた。
(5) Confirmation of amplified gene fragment After the PCR reaction, 2 μL of the PCR reaction solution was separated and mixed well with a loading buffer, and electrophoresis (135 V, 20 minutes) was performed using a 2% agarose gel. After completion of electrophoresis, the agarose gel was stained with SYBR Safe DNA gel stain in 1 × TAE (Invitrogen), and the presence or absence of the amplified DNA fragment was confirmed. The result is shown in FIG. The numbers in the figure indicate that the samples were reacted using DNA extracted from the samples with corresponding sample numbers in the table. In electrophoresis, EZ Load ™ 100 bp (trade name) manufactured by BIO RAD was used as a molecular weight marker.

その結果、パエシロマイセス ディバリカタスのゲノムDNAを含む試料では、150bp程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、パエシロマイセス ディバリカタス以外の飲食品の製造環境に広く分布する耐熱性菌のゲノムDNAを含む試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、パエシロマイセス ディバリカタスを特異的に検出し、種レベルで同定することができる。   As a result, amplification of a gene fragment of about 150 bp was confirmed in the sample containing genomic DNA of Paecilomyces divaricatus. On the other hand, amplification of gene fragments was not confirmed in samples containing genomic DNA of heat-resistant bacteria widely distributed in the food and drink manufacturing environment other than Paecilomyces divaricatas. Therefore, by using the oligonucleotide of the present invention, Paecilomyces divaricatus can be specifically detected and identified at the species level.

実施例1〜2の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、パエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを特異的に検出できることがわかる。したがって、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にパエシロマイセス サトゥラタス及びパエシロマイセス ディバリカタスを検出することが可能である。   From the results of Examples 1 and 2, it can be seen that Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus can be specifically detected by using the oligonucleotide of the present invention. Therefore, according to the method of the present invention, Paecilomyces saturatus and Paecilomyces divaricatus can be detected simply, rapidly and specifically.

Claims (5)

下記オリゴヌクレオチド(a)及び)からなるオリゴヌクレオチド核酸プライマーとして用いてβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅し、増幅産物の有無を確認して同定を行い、パエシロマイセス・サトゥラタス(Paecilomyces saturatus)を検出するパエシロマイセスサトゥラタスの検出方法。
(a)配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号1に記載の塩基配列において1個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセスサトゥラタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号2に記載の塩基配列において1個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセスサトゥラタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチ
The following oligonucleotides (a) and (b) Tona Luo Rigo nucleotide pair amplifies a nucleic acid represented by partial nucleotide sequence of the β- tubulin gene using a nucleic acid primer, identified to confirm the presence or absence of an amplification product the stomach line, to detect Paecilomyces Saturatasu (Paecilomyces saturatus), Paecilomyces Saturata vinegar detection method.
(A) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 1 nucleotides are deleted in the nucleotide sequence set forth in 1, substituted, inserted or added in and and Paecilomyces Saturatasu detection (B) an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or one base in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 has been deleted, substituted, inserted or added; oligonucleotide soil can be used to detect Paecilomyces Saturatasu
記オリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法によりβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を増幅する、請求項1に記載の検出方法。 Amplifying a nucleic acid represented by partial nucleotide sequence of the β- tubulin gene by polymerase chain reaction using a pre Kio oligo nucleotide pairs as a nucleic acid primer, the detection method of claim 1. 記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)からなる、パエシロマイセスサトゥラタス(Paecilomyces saturatus)検出用オリゴヌクレオチド対。
(a)配列番号1に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号1に記載の塩基配列において1個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセスサトゥラタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号2に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号2に記載の塩基配列において1個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセスサトゥラタスの検出に使用できるオリゴヌクレオチ
Consisting lower Kio Rigo nucleotide (a) and (b), Paecilomyces Saturatasu (Paecilomyces saturatus) detector oligonucleotide pair.
(A) an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 1 nucleotides are deleted in the nucleotide sequence set forth in 1, substituted, inserted or added in and and Paecilomyces Saturatasu detection (B) an oligonucleotide represented by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or one base in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 has been deleted, substituted, inserted or added; oligonucleotide soil can be used to detect Paecilomyces Saturatasu
下記(e)及び)のいずれかの塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、パエシロマイセスサトゥラタスを特異的に検出するための核酸プライマーとして機能し得る請求項3に記載の検出用オリゴヌクレオチド
(e)配列番号5に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列又はその相補配列
(f)配列番号5に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつパエシロマイセスサトゥラタスの検出に使用できる塩基配列、又はその相補配
Below (e) and any can hybridize to a nucleic acid represented by the nucleotide sequence of (f), can function as a nucleic acid primer for specifically detecting Paecilomyces Saturata scan, claim 3 detector oligonucleotide pair described.
(E) a partial base sequence of the β-tubulin gene described in SEQ ID NO: 5 or a complementary sequence thereof (f) one or several bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and which and nucleotide sequences can be used to detect Paecilomyces Saturatasu, or the complement sequence
請求項3又は4に記載のオリゴヌクレオチド対を含むパエシロマイセスサトゥラタス(Paecilomyces saturatus)検出キット。 To claim 3 or 4 comprising a pair of oligonucleotides according, Paecilomyces Saturatasu (Paecilomyces saturatus) detection kit.
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