JP5681548B2 - 培地溶液のｐＨ計測方法及びｐＨ計測装置 - Google Patents

Description

本発明は細胞培養液のｐＨ計測方法に関し、培地に含まれる未知の濃度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの細胞増殖因子といった所定の成分の影響を補正した高精度なｐＨ計測方法及びｐＨ計測装置に関する。

細胞が生育、増殖を行うためには、その細胞培養液のｐＨが増殖適合範囲にある必要がある。しかしながら、その細胞培養液の調製または保存中に細胞培養液中に含まれる二酸化炭素が放出され、ｐＨが増大することによって増殖適合範囲から外れることが多い。
このため、通常細胞培養液に含まれるフェノールレッドの色変化を目視にて判断したり、或いはｐＨ電極を細胞培養液中に浸漬して測定するなどの方法により、ｐＨの計測を行っているが、次のような問題点があった。
細胞培養液に含まれたフェノールレッドの色変化を目視にて判断する場合、誤認が起こる。これは、目視では誤りが多発しやすく、また細胞培養液中に含まれる牛胎児などの血清が黄色を呈しているためこの呈色にまどわされることもあるからである。
一方、ｐＨ電極を細胞培養液に浸漬する場合、ｐＨ電極が十分滅菌されていない場合には、雑菌等のコンタミネーションが起こる。

上記、目視に伴う誤認や、ｐＨ電極を使用する場合のコンタミネーションのような問題の起こらない細胞培養液のｐＨ計測方法として以下のものが知られている。（特許文献１参照）

特公平０６−３４７５４号公報

図１は、培地溶液のｐＨを計測可能なｐＨ計測装置の基本的なブロック図である。
本例のｐＨ計測装置において、発光素子１は、電池４より供給される電力によって、発光するように駆動回路３により駆動される。
発光素子１は、図１では１個の素子として示されているが、実際には異なる波長の光を発光する複数の素子で構成される。より具体的には、発光素子１は、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に対応した吸光度のピークである４１１ｎｍ帯を発光する素子、フェノールレッド（ｐＨ指示薬）の吸光度のピークを示す４３０ｎｍ帯や５６０ｎｍ帯を発光する素子、ｐＨの変化に依らず吸光度が変化せずに収束した値を示す３６７ｎｍ帯や４７９ｎｍ帯を発光する素子、および、例えばウシ胎児血清やフェノールレッドが吸光度を示さない７００ｎｍ帯を発光する素子など、少なくとも４つ以上の素子で構成をされる。これらの素子には、例えばＬＥＤが好ましく用いられる。

これらの発光素子１から発光した光はｐＨの測定溶液５を透過して受光素子６で受光されて電気信号に変換される。受光素子６は、図１では１個の素子として示されているが、発光素子１を構成する各素子に対応した複数の素子で構成される。これらの各素子には、フォトダイオードが好ましく用いられる。すなわち、発光素子１が４個のＬＥＤで構成されている場合は、受光素子６は、４個のフォトダイオードで構成されてもよい。また、受光素子６は、測定溶液５を透過した光を受光する形態に替えて、測定溶液５の反射光を受光するように設けられてもよい。
受光素子６で変換された信号は、増幅器６で増幅され、マルチプレクサ８によりそれぞれの光波長に対応したフィルター９に振り分けられる。
各フィルター９に振り分けられた信号はフィルター９によりフィルタリングされてノイズ成分が低減され、図示しないＡ／Ｄ変換器によりデジタル化されて処理部１０に入力される。この処理部１０は、例えばＣＰＵなどの演算処理素子および記憶素子などで構成される。

特許文献１には従来の細胞培養液のｐＨ計測方法として以下の記載がなされている。
細胞培養培地、血清および可視光の波長領域で２種以上の吸収ピークを有する指示薬からなる細胞培養液の可視光の吸収からｐＨを測定する細胞培養液のｐＨ測定方法であって、ｐＨが既知である細胞培養液に可視光を透過して得られた吸収ピークの２つの波長における吸光度の対数とｐＨとの直線関係に基づいて、ｐＨが未知である細胞培養液試料で測定された各吸収ピークの吸光度の比の対数の値によりｐＨの値を求めることを特徴とする。

上記細胞培養液中には通常細胞に害を与えないような希薄な濃度にてフェノールレッドがｐＨ変化の検出のため含まれているが、このような希薄な濃度においてはフェノールレッドは可視光の範囲において４３０〜４４０ｎｍ付近と５６０ｎｍ付近に吸収ピークをもち、また４８０ｎｍに等吸収点をもっている。細胞の生育可能なｐＨ領域であるｐＨ６．８〜７．６の範囲では、ｐＨが下がるにつれて４３０〜４４４ｎｍ付近の吸収ピークは増大し、５６０ｎｍ付近の吸収ピークは減少していく。フェノールレッドのみの吸収が得られれば、この４３０〜４４０ｎｍ付近の吸収と５６０ｎｍ付近の吸収の比をとると、プロットは１本の曲線上にのり、この２つのピークの比から培養液のｐＨを算出することが可能である。

また、従来のｐＨの光学的測定では、試料を測定する前に、試料を空にした状態でゼロレベル測定を行い、空の吸光レベルを、試料の読み取り値から減算すると、試料の正味吸光度が得られる。第３の波長として指示薬による吸光性を殆ど示さない波長(７００ｎｍ)付近を選定して、ゼロレベルの変化を追跡する手段として利用されている。この波長チャネルの吸光レベルに変化があれば、ゼロレベルに変化があったことを示すので、測定に使用される他の２つの波長を、この第３の波長で測定された変化に基づいてゼロ補正を行っていた。

特許文献１に記載の従来の細胞培養液のｐＨ計測方法は、細胞培養液にフェノールレッドのみが含まれている場合であるが、細胞培養液には、フェノールレッドのみでなく、細胞を増殖させるための増殖因子として、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含ませる場合がある。
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の光吸度特性は、フェノールレッドとは大きく異なっているので、特許文献１に記載のｐＨ計測方法で得られた計測値をそのまま使用することはできない。特に特許文献１に記載のｐＨ計測方法は、測定前に予め培地に含まれる血清の濃度が分からないと吸光度の対数とｐＨとの直線関係が決定できない為、濃度が分からない血清などが含まれた培地において、正確なｐＨ計測ができなかった。

本発明の課題（目的）は、細胞培養液中に含まれるウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の増殖因子などの濃度に依存せずに、正確な細胞培養液のｐＨ値の計測が可能なｐＨ計測方法及び細胞培養液のｐＨ計測装置を提供することにある。

本発明は、
３００ｎｍ〜８００ｎｍの波長領域で第一の吸収ピークを有する第一の物質と、
３００ｎｍ〜８００ｎｍの波長領域で第二の吸収ピーク又はｐＨによらず吸光度が収束する第二の収束点と第三の吸収ピーク又はｐＨによらず吸光度が収束する第三の収束点とを有する第二の物質と
を含む培地溶液に、
第一の吸収ピークに対応した波長λ１の光と、
第二の吸収ピーク又は第二の収束点に対応した波長λ２の光と、
第三の吸収ピーク又は第三の収束点に対応した波長λ３の光と、
前記第一の物質と前記第二の物質の少なくともいずれかの吸光度がｐＨによらずに収束する波長λ４の光とを含む複数の光を培地溶液に照射する照射ステップと、
前記照射された複数の光の透過光及び/又は反射光を受光する受光ステップと、
受光ステップで得られた各波長λ１〜λ４における吸光度を計測する計測ステップと、
計測された吸光度に基づき、第一の物質の影響を補正した培地溶液のｐＨを演算する演算ステップと、
を含むｐＨ計測方法を提供する。

また、上記ｐＨ計測方法において、
前記演算ステップは、
計測された吸光度から算出された吸光度比の対数を用いた重回帰分析を用いて補正するステップを含むことが好ましい。

また、上記ｐＨ計測方法において、
前記重回帰分析は、以下の［式１］にて表される回帰式で行われることが好ましい。なお、［式１］において、Ｂは定数、Φは吸光度比、Ａは吸光度をそれぞれ示す。
［式１］

また、上記ｐＨ計測方法において、
また、前記演算ステップは、
前記第一の物質の吸光度と前記第二の物質の吸光度の和とした行列式で演算するステップを含むことが好ましい。
また、この場合、前記行列式はｐＨと吸光係数のいずれかを変数とした関数を元に構成されることが好ましい。

また、上記ｐＨ計測方法において、
前記行列式がｐＨを変数とした関数から構成された場合、以下の［式２］にて表される行列式によりｐＨを計測することが好ましい。
［式２］

また、上記ｐＨ計測方法において、
前記行列式が吸光係数を変数とした関数から構成された場合、以下の［式３］にて表される行列式により得られた吸光係数に基づいてｐＨを計測することが好ましい。
［式３］

また、上記ｐＨ計測方法において、
前記第二の収束点λ２と第三の収束点λ３に対応した波長の光とは、それぞれ４８０ｎｍ帯と３７０ｎｍ帯の光とし、
前記吸光度が収束する波長の光λ４とは、第一の物質と第二の物質との両方がｐＨによらずに吸光度が収束する波長の光とした場合、以下の［式４］にて表される行列式によりｐＨを計測することが好ましい。
［式４］

また、上記ｐＨ計測方法において、
前記演算ステップでは、
前記行列式に基づき、さらに第一の物質と第二の物質の少なくともいずれかの濃度を演算することが好ましい。

また、上記ｐＨ計測方法において、
前記第一の物質は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又は仔ウシ血清であり、前記第二の物質はフェノールレッド（又は乳酸菌）であってもよい。

また、上記ｐＨ計測方法において、
第一の吸収ピークは４１０ｎｍおよびその近傍（４１０ｎｍ帯）であり、第二の吸収ピークは４３０ｎｍおよびその近傍（４３０ｎｍ帯）であり、第三の吸収ピークは５６０ｎｍおよびその近傍（５６０ｎｍ帯）であってもよい。

また、本発明は、
上記のいずれかの特徴を有するｐＨ計測方法によるｐＨの計測が可能なｐＨ計測装置を提供する。

また、本発明は、
発光波長の異なる４種の発光部と、前記４種の波長の吸光度を計測する受光部と、
前記４種の波長の吸光度の値からｐＨを演算する演算部とを備えるｐＨ計測装置であって、前記発光部は、第一の吸収ピークに対応した波長λ１の光と、第二の吸収ピーク又はｐＨによらず吸光度が収束する第二の収束点に対応した波長λ２の光と、第三の吸収ピーク又はｐＨによらず吸光度が収束する第三の収束点に対応した波長λ３の光と、第一の物質と第二の物質の少なくともいずれかの吸光度がｐＨによらずに収束する波長λ４の光とを発光するｐＨ計測装置を提供する。

本発明のｐＨ計測方法によれば、細胞培養液中に濃度が不明のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の増殖因子が含まれている場合にも正確な細胞培養液のｐＨ値の計測が可能である。さらに、ＦＢＳの濃度が時々刻々と変化してもそれに応じたｐＨ値を計測することができる。

溶液のｐＨ計測装置の基本的なブロックを示す図である。 フェノールレッド単独での吸光度と波長との関係を示す図である。 ウシ胎児血清（ＦＢＳ）単独での吸光度と波長との関係を示す図である。 図３のウシ胎児血清（ＦＢＳ）単独での吸光度と波長との関係を、図２のフェノールレッドと重ねて示す図である。 ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が１０％存在する場合（１０％ＦＢＳ）の培地における３００ｎｍ〜８００ｎｍにおけるフェノールレッドの吸光度をｐＨ６．２０〜ｐＨ８．２５毎の関係を示す図である。 ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が２０％存在する場合（２０％ＦＢＳ）の培地における３００ｎｍ〜８００ｎｍにおけるフェノールレッドの吸光度をｐＨ６．２０〜ｐＨ８．２５毎の関係を示す図である。 ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の濃度が違いによる吸光度の対数ΦとｐＨとの関係を示す図である。 図７の吸光度の対数ΦとｐＨとの関係の一部であるｐＨ７〜ｐＨ７．８範囲を拡大して示す図である。 重回帰分析による［式１］で示す回帰式によるｐＨ計算値と実際のｐＨ値との関係を示す図である。 重回帰分析による［式１］で示す回帰式によるｐＨ計算値と実際のｐＨ値との関係の一部であるｐＨが７〜７．６の範囲を拡大して示す図である。 フェノールレッドの吸光係数αPR-JとｐＨとの関係を示す図である。 ［式２］の行列式での計算結果（ＦＢＳ濃度と計算したＦＢＳ濃度との関係）を示す図である。 ［式２］の行列式での計算結果（フェノールレッド濃度と計算したフェノールレッド濃度との関係）を示す図である。 ［式２］の行列式での計算結果（ｐＨと計算したｐＨとの関係）を示す図である。 ［式１６］を用いて計算した結果を横軸ｐＨで、縦軸吸光度比で示す図である。 ［式１６］を用いて計算した結果（ｐＨと計算したｐＨとの関係）を示す図である。 吸光係数とｐＨとの関係を示す図である。

先ず、細胞培養液中にウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれている場合と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれていないフェノールレッド単独での光の波長と吸光度との関係を図２〜６に示す。

図２は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が存在しない通常の培地（ＤＭＥＭ）における波長３００〜８００ｎｍにおけるフェノールレッドの吸光度をｐＨ６．２０〜ｐＨ８．２５毎の関係を示す図であって、横軸は波長で３００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で、縦軸は吸光度（ＡＢＳ）であって、０〜２の範囲を示している。
図２では、波長４３０ｎｍ及び５６０ｎｍにピークが存在し、波長７００ｎｍでは吸光度がほぼゼロであり、波長３６７ｎｍ及び４７９ｎｍでは、全てのｐＨ値でそれぞれ吸光度は収束して同じ値を示している。

また、図３は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の吸光度と波長との関係を示す図である。
この図３は、１００％ＦＢＳの場合の吸光度を表す図であって、横軸は波長で３００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で、縦軸は吸光度（ＡＢＳ）であって、０〜２の範囲を示している。
図３では、波長４１１ｎｍ付近にピークが存在し、それ以外の波長では漸減している。

図４は、上記図３のウシ胎児血清（ＦＢＳ）の吸光度と波長との関係を、図２と重ねて示す図である。

次に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）がフェノールレッドの吸光度に与える影響について考察する。

ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が存在しない場合（０％ＦＢＳ）の培地における３００ｎｍ〜８００ｎｍにおけるフェノールレッドの吸光度をｐＨ６．２０〜ｐＨ８．２５毎の関係は
図２に示すとおりである。

また、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が１０％存在する場合（１０％ＦＢＳ）の培地における３００ｎｍ〜８００ｎｍにおけるフェノールレッドの吸光度をｐＨ６．２０〜ｐＨ８．２５毎の関係は図５に示すとおりであり、図２と比してＦＢＳが混合することで、フェノールレッドの吸光スペクトルに変化が生じている。

また、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が２０％存在する場合（２０％ＦＢＳ）の培地における３００ｎｍ〜８００ｎｍにおけるフェノールレッドの吸光度をｐＨ６．２０〜ｐＨ８．２５毎の関係は図６に示すとおりであり、図２と比してＦＢＳが更に混合することで、フェノールレッドの吸光スペクトルに更に変化が生じている。

図２，５，６に示す様に、ウシ胎児血清がある程度存在する場合には、図２では成立していた４３０ｎｍ付近の吸収と５６０ｎｍ付近の吸収の比をとると、プロットは１本の曲線上にのり、このフェノールレッドの２つのピークの比から培養液のｐＨを算出することが可能であるという前提が成立しなくなって、正確な細胞培養液のｐＨ値の測定ができないことが理解できる。

吸光度の対数ΦとｐＨとの関係を図７に示す。
図７では、吸光度の対数Φとして、
Φ＝ｌｏｇ（（A５６０−７００）／（A４３０−A７００））波長４３０ｎｍ及び５６０ｎｍの吸光度を波長７００ｎｍで補正した値を縦軸に、ｐＨ６．２０〜ｐＨ８．２５を横軸にとって、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が０％、１０％、２０％の培地の例を示したものである。

次に、吸光度の対数ΦとｐＨとの関係を示す図８の一部であるｐＨ７〜ｐＨ７．８範囲について図８に示す。
図８では、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の０％、１０％、２０％の場合に、以下の式で近似できる。
ｙ１＝０．９０１８ｘ−６．７１５４ Ｒ^２＝０．９９７５ （ＦＢＳ ０%）
ｙ２＝０．８６ｘ−６４４８９ Ｒ^２＝０．９９７２ （ＦＢＳ １０%）
ｙ３＝０．８１６５ｘ−６４４８９ Ｒ^２＝０．９９６５ （ＦＢＳ ２０%）

次に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の影響の補正について述べる。
本願では、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の影響の補正方法として、以下を検討している。

第１の補正方法として、重回帰分析について以下に述べる。
重回帰分析の基本式は、例えば、以下の［式５］にて表される。なお、この［式５］は、上記の［式１］と同じ式であり、Ｂは定数、Φは吸光度比、Ａは吸光度をそれぞれ示す。
［式５］

_{ここで、B：定数、Φ：吸光度比、A：吸光度}

上記回帰式は、ＦＢＳが０％〜２０％存在する範囲で収束して同じ値を示す４７７ｎｍ付近の吸光度と、ＦＢＳ単独で吸光度のピークを示す４１１ｎｍ，フェノールレッドの第１のピークである４３０ｎｍ及び第２のピーク５５８ｎｍの吸光度を用いて計算をしている。

重回帰分析による上記［式５］で示す回帰式によるｐＨ計算値と実際のｐＨ値との関係を図９に示す。
図９に示すように、回帰式によるｐＨ計算値と実際のｐＨ値との関係は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の濃度の変化による影響はｐＨが６．５以下では大きくなるが、ｐＨが７以上では少なくなることが理解できる。
ｐＨが７〜７．６の範囲の例を図１０に示す。

以上の結果から、重回帰分析により良好に計測が可能である。
特に、図１０に示すように、ｐＨが７〜７．６の範囲では直線に近似でき、より良好な計測が可能である。

上記説明は、通常の培地（ＤＭＥＭ）における例を示しているが、培地としては、通常の培地（ＤＭＥＭ）以外に、筋芽細胞の培養に特化した培地としてＳｋＢＭが存在する。
ＳｋＢＭは、フェノールレッドの濃度がＤＭＥＭの１／１０程度であるため、ウシ胎児血清の吸光度の影響を大きく受けるため、上記重回帰分析で使用した回帰式が当てはまらないため、培地がＳｋＢＭの場合は正確なｐＨの計測はできないという課題が残る。

第２の補正方法として、行列計算（連立方程式）について以下に述べる。
フェノールレッドにウシ胎児血清（ＦＢＳ）が存在する場合のＬＥＤから発光される光の波長をλ１〜λ４としたときのそれぞれの吸光度A_λ１〜A_λ４は、以下に［式６］で表されるように、ＦＢＳの吸光度とフェノールレッドの吸光度の和で示される。
［式６］

フェノールレッドの吸光係数αPR-λiとｐＨとの関係は、ｐＨが７〜８．０の範囲であれば図１１に示すように一次式で近似可能である。すなわち、本補正方法において、ｐＨを未知数とする関数として以下に［式７］で表す行列式を構成させる。
［式７］

したがって、吸光度A_λiは、以下の［式８］のように表すことができる。
［式８］

ここで、λ１〜λ４の各波長における吸光度は、以下の［式９］で表すことができる。
［式９］

上記［式５］の行列計算は、各波長（例えば、λ１を４１１ｎｍ、λ２を４３０ｎｍ、λ３を５５８ｎｍ、λ４を７００ｎｍとした場合）の吸光度を以下の［式１０］に代入して、ＦＢＳの濃度、フェノールレッド濃度、ｐＨが算出できる。
［式１０］

図１２、図１３及び図１４は、上記［式２］の行列式での計算結果をに示す。
図１２乃至図１４に示す計算結果から明らかなように、フェノールレッド濃度及びＦＢＳ濃度によらずにｐＨの算出が可能である。
しかし、図１４に示す計算結果から判るように培地のｐＨが７〜８の範囲内であれば、早期に演算ができ、連続的にモニタリングができる為、特に有効ではあるものの、培地の所定のｐＨの範囲外では誤差が大きいという課題が残る。
なお、本補正において、一次関数での近似を例としてあげたが、これに限られるものではない。二次関数で近似する場合には、さらに異なる波長を追加し、５行５列の行列式を用いて計算してもよい。

第３の補正方法として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の影響の除去について以下に述べる。
第２の補正方法で述べたように、フェノールレッドにウシ胎児血清（ＦＢＳ）が存在する場合のＬＥＤから発光される光の波長をλ１〜λ４としたときのそれぞれの吸光度A_λ１〜A_λ４は、以下の［式１１］のように、ＦＢＳの吸光度とフェノールレッドの吸光度の和で示される。
［式１１］

ここで、第２の補正方法とは異なり、吸光係数αPR-λ１を未知数とする関数として以下の［式１２］で表される行列式を構成させることもできる。なお、この［式１２］は、上記の［式７］と同じ式である。
［式１２］

したがって、吸光係数αPR-λ１は、以下の［式１３］で表すことができる。
［式１３］

ここで、λ１〜λ４の各波長における吸光度は、以下の［式１４］で表すことができる。
［式１４］

上記［式２］の行列式による計算は、各波長の吸光度を以下の［式１５］に代入すると、αPR-λ１が求まるため、ＦＢＳの濃度、フェノールレッド濃度、ｐＨが算出できる。
なお、吸光係数とｐＨとは図１７に示す関係にあり、吸光係数αPR-λ１が求まることで、ｐＨは一意に算出できる。
なお、本補正において、一次関数での近似を例としてあげたが、これに限られるものではない。二次関数で近似する場合には、さらに異なる波長を追加し、５行５列の行列式を用いて計算してもよい。
［式１５］

ここで、図２に示す如く、フェノールレッドの吸光度は、波長４３０ｎｍ及び５６０ｎｍにピークが存在し、波長７００ｎｍでは吸光度がほぼゼロであり、波長３６７ｎｍ及び４７９ｎｍでは、ｐＨ値が変化しても、それぞれ吸光度は収束して同じである収束点といえるような波長である。
この特性を利用して、補正方法３を適用した場合、数１５の行列計算において、各波長（例えば、λ１を４１１ｎｍ、λ２を４７８ｎｍ、λ３を３６７ｎｍ、λ４を７００ｎｍとした場合）の吸光度を以下の［式１６］に代入すると、行列の要素は０に置き換え可能となるため、行列が簡素化され、精度良くＦＢＳの濃度、フェノールレッド濃度、ｐＨが算出できる。
［式１６］

［式１６］で算出した結果を横軸ｐＨで、縦軸吸光度比で示すと図１５の如くなり、ほぼ直線に近似されていることが判る。

［式１６］の行列式での計算結果（ｐＨと計算したｐＨとの関係）を図１６に示す。
図１５，１６で明らかなように、フェノールレッド濃度及びＦＢＳ濃度によらずにｐＨの算出が可能であり、［式８］の行列式での計算結果であるｐＨとｐＨとは良く一致している。
培地のｐＨの範囲に依存せず、安定した関係（一次関数）を保つ点で特に有効といえる。

なお、本発明に係る実施例として挙げたフェノールレッドやウシ胎児血清（ＦＢＳ）はそれぞれｐＨ指示薬と細胞増殖因子の一例であり、これらに限られるものでない。培地にフェノールレッドやウシ胎児血清（ＦＢＳ）以外のｐＨ指示薬と細胞増殖因子が採用された場合、それらの吸光スペクトルに応じて発光素子に採用される波長の値は適宜変更可能である。

１：発光素子
３：駆動回路
４：電池
５：測定溶液
６：受光素子
７：増幅器（マルチプレクサ，フィルタ）
８：マルチプレクサ
９：フィルター
１０：処理部

Claims (12)

1. ３００ｎｍ〜８００ｎｍの波長領域で第一の吸収ピークを有する第一の物質と、
   ３００ｎｍ〜８００ｎｍの波長領域で第二の吸収ピーク又はｐＨによらず吸光度が収束する第二の収束点と第三の吸収ピーク又はｐＨによらず吸光度が収束する第三の収束点とを有する第二の物質と
   を含む培地溶液に、
   第一の吸収ピークに対応した波長λ１の光と、
   第二の吸収ピーク又は第二の収束点に対応した波長λ２の光と、
   第三の吸収ピーク又は第三の収束点に対応した波長λ３の光と、
   前記第一の物質と前記第二の物質の少なくともいずれかの吸光度がｐＨによらずに収束する波長λ４の光とを含む複数の光を培地溶液に照射する照射ステップと、
   前記照射された複数の光の透過光及び/又は反射光を受光する受光ステップと、
   受光ステップで得られた各波長λ１〜λ４における吸光度を計測する計測ステップと
   計測された吸光度に基づき、前記第一の物質の影響を補正した培地溶液のｐＨを演算する演算ステップと、
   から構成されるｐＨ計測方法。
2. 前記演算ステップには、
   波長λ４の吸光度に対する各波長λ１〜λ３の吸光度の比である吸光度比の対数を用いた重回帰分析を用いて補正するステップが含まれることを特徴とする請求項１に記載のｐＨ計測方法。
3. 前記重回帰分析は、以下の［式１］にて表される回帰式で行われることを特徴とする請求項２に記載のｐＨ計測方法。なお、以下の［式１］において、Ｂは定数、Φは吸光度比、Ａは吸光度をそれぞれ示す。
   ［式１］
   

   
4. 前記演算ステップは、
   前記第一の物質の吸光度と前記第二の物質の吸光度の和とした行列式で演算するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載のｐＨ計測方法。
5. 前記行列式は、ｐＨと吸光係数のいずれかを変数とした関数を元に構成されることを特徴とする請求項４に記載のｐＨ計測方法。
6. 前記行列式がｐＨを変数とした関数から構成された場合、以下の［式２］にて表される行列式によりｐＨを計測することを特徴とする請求項４又は５のいずれかに記載のｐＨ計測方法。
   ［式２］
   

   
7. 前記行列式が吸光係数を変数とした関数から構成された場合、以下の［式３］にて表される行列式により得られた吸光係数に基づいてｐＨを計測することを特徴とする請求項４又は５のいずれかに記載のｐＨ計測方法。
   ［式３］
   

   
8. 前記第二の収束点λ２と第三の収束点λ３に対応した波長の光とは、それぞれ４８０ｎｍ帯と３７０ｎｍ帯の光とし、
   前記吸光度が収束する波長の光λ４とは、前記第一の物質と前記第二の物質との両方がｐＨによらずに吸光度が収束する波長の光とした場合、以下の［式４］にて表される行列式によりｐＨを計測することを特徴とする請求項４又は５のいずれかに記載のｐＨ計測方法。
   ［式４］
   

   
9. 前記演算ステップでは、
   前記行列式に基づき、さらに前記第一の物質と前記第二の物質の少なくともいずれかの濃度を演算することを特徴とする請求項４乃至８のいずれか一項に記載のｐＨ計測方法。
10. 前記第一の物質はウシ胎児血清又は仔ウシ血清であり、前記第二の物質はフェノールレッドである請求項１乃至９のいずれかに記載のｐＨ計測法。
11. 第一の吸収ピークは４１０ｎｍおよびその近傍であり、第二の吸収ピークは４３０ｎｍおよびその近傍であり、第三の吸収ピークは５６０ｎｍおよびその近傍である請求項１乃至１０のいずれかに記載のｐＨ計測法。
12. 発光部と、受光部と、演算部と、を備えるｐＨ計測装置であって、
    前記発光部は、
    ３００ｎｍ〜８００ｎｍの波長領域で第一の吸収ピークを有する第一の物質と、
    ３００ｎｍ〜８００ｎｍの波長領域で第二の吸収ピーク又はｐＨによらず吸光度が収束する第二の収束点と第三の吸収ピーク又はｐＨによらず吸光度が収束する第三の収束点とを有する第二の物質と、
    を含む培地溶液に、
    第一の吸収ピークに対応した波長λ１の光と、
    第二の吸収ピーク又は第二の収束点に対応した波長λ２の光と、
    第三の吸収ピーク又は第三の収束点に対応した波長λ３の光と、
    前記第一の物質と前記第二の物質の少なくともいずれかの吸光度がｐＨによらずに収束する波長λ４の光とを含む複数の光を培地溶液に照射することが可能に構成され、
    前記受光部は、
    前記発光部にて照射された複数の光の透過光及び/又は反射光を受光することが可能に構成され、
    前記演算部は、
    前記受光部で得られた各波長λ１〜λ４における吸光度を計測し、計測された吸光度に基づき、前記第一の物質の影響を補正した培地溶液のｐＨを演算することが可能に構成されている、ｐＨ計測装置。
    

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