JP5527654B2

JP5527654B2 - 植物の油脂を増産させる遺伝子及びその利用方法

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Publication number: JP5527654B2
Application number: JP2009544739A
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Inventors: 大志茶谷; 徳大音; 幸治岡村; 典宏光川; 伸彦村本; 知嗣小山; 恭子松井; 優高木
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Description

バイオマス（biomass）とは、一般的には一定面積あたりに生息または存在する生物の総量を指し、特に植物を対象とした場合は、単位面積あたりの乾重量を意味する。バイオマスの単位は、質量又はエネルギー量で数値化する。バイオマスという表現は、「生物体量」、「生物量」も同義語であり、植物バイオマスの場合には「現存量（Standing crop）」の語が使われることもある。植物バイオマスは、大気中の二酸化炭素を太陽エネルギーを用いて固定して生成されるため、いわゆるカーボンニュートラルなエネルギーとして捕らえることができる。したがって、植物のバイオマスを増加させることは、地球環境保全、地球温暖化防止、温室効果ガス排出低減の効果がある。従って、植物バイオマスを増産させる技術は産業上の重要性が高い。

一方、植物は、その一部の組織自体（種子、根、葉茎など）を目的として栽培されたり、油脂などの種々の物質生産を目的として栽培される。例えば、植物が生産する油脂としては、大豆油、ごま油、オリーブ油、椰子油、米油、綿実油、ひまわり油、コーン油、べに花油及び菜種油等が古来より知られており、家庭用途や工業用途に広く利用されている。また、植物が生産する油脂は、バイオディーゼル燃料としても使用され、石油代替エネルギーとして適用性が広がっている。

このような状況において、植物を用いた油脂生産を工業的に成功させるには、単位耕地面積あたりの生産性の向上が必要となる。ここで単位耕地面積あたりの栽培個体数が一定であると仮定すると、個体あたりの油脂生産量の向上が必要であることが判る。植物体から採取した種子から油脂を抽出する場合には、個体あたりの種子収量を向上させる、及び種子中の油脂含有量を向上させるといった技術により、個体あたりの油脂生産量の向上が達成できるものと期待される。

植物種子の油脂生産量を増加させる技術には大別して栽培法の改良によるもの、油脂増産品種の開発がある。品種開発方法は、交配等の従来育種法と遺伝子組換による分子育種法とに大別される。遺伝子組換えによる油脂増産技術としては、A)植物油脂の主成分である種子のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の合成系の改変する技術、及びB)植物の形態形成や代謝を制御する制御遺伝子の改変する技術が知られている。

上記A)の方法としては、光合成により生産される糖を原料として合成されるＴＡＧの合成量を増加させる方法として（１）ＴＡＧの構成成分である脂肪酸、あるいはグリセロールの糖からの合成活性を高める方法、（２）グリセロールと脂肪酸からＴＡＧが合成される反応を強化する方法が考えられる。これらについて、遺伝子工学的な方法を用いた技術としては以下の技術が報告されている。（１）の例としては、シロイヌナズナの細胞質型Acetyl-Coenzyme A Carboxylase (ACCase)をナタネのプラスチド中で過剰発現させることにより、種子の油脂含量を５％向上させた報告（非特許文献１）が挙げられる。また、（２）の例としては、ジアシルグリセロールのsn-3位にアシル基を転移するDGAT（diacylglycerol acyltransferase）の過剰発現による油脂増産技術に関する報告（非特許文献２）が挙げられる。非特許文献２の方法では、DGATの発現量が増加するに従って油脂含量と種子重が増加し、個体あたりの種子数が増加する場合があることも報告されている。本方法を適用したシロイヌナズナの種子油脂含量は46%増、個体あたりの油脂量は最高で約125%増であった。

一方、上記B)の方法としては、生合成系酵素遺伝子の発現制御に関与する転写因子遺伝子の発現を制御する方法が考えられる。この例としては、特許文献１が挙げられる。本特許文献１では、転写因子を網羅的に過剰発現またはノックアウトした組換え植物を作製したのちに種子の油脂含量を高める遺伝子を選抜するといった手法が採用されている。特許文献１によれば、ERF subfamily B-4転写因子遺伝子の過剰発現によって種子の油脂含量が23％増加したと記載されている。しかし、特許文献１において、個体あたりの油脂含量の増減については記載されていない。また、非特許文献３には、AP2/EREBドメインを持つ転写因子であるWRINKLED1を過剰発現させることにより、種子の油脂含量が向上することが記載されている。

しかしながら、種々の形質の改良を目的とした上述した分子育種法が開発されているにもかかわらず、植物の重量増産、特定の組織増産、或いは目的物質の生産性向上を伴う、収量向上技術は実用の域に達していない。

さらに、遺伝子組換えによる目的物質、特に油脂の増産技術の対象は、シロイヌナズナやナタネが属する双子葉植物であるアブラナ科であり、イネやトウモロコシが属する単子葉植物を対象とした技術は知られていない。

この理由として、真に優れた遺伝子が未発見であること、試験段階で効果のある組換え新品種が実用段階では多様な自然環境下で期待通りの効果を発揮できないことにあると考えられる。これらの問題を解決するためには、効果が劇的に高い新たな遺伝子を見出すこと、効果レベルは同等であっても実用環境条件で効果を発揮する遺伝子を開発することが課題である。
Plant Physiology (1997) Vol. 113, pp. 75-81 Plant Physiology (2001), Vol. 126, pp. 861-874 Plant J. (2004) 40, 575-585 WO01/35727

そこで、上述したような実情に鑑み、植物体個体あたりの植物体重量を増加させるか、植物体個体あたりの特定の組織重量を増加させるか、植物体個体あたりの特定の物質生産性を向上させるか、植物体の特定の組織中の特定の物質の含量を増加させることができる新規な機能を有する転写因子を探索し、植物体におけるこれらの特性を向上できる技術を提供することを目的とする。

上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、転写促進活性を抑制するように改変した転写因子を発現させることによって、植物体個体あたりの植物体重量を増加させるか、植物体個体あたりの特定の組織重量を増加させるか、植物体個体あたりの特定の物質生産性を向上させるか、植物体の特定の組織中の特定の物質の含量を増加させることができることを見いだし、本発明を完成するに至った。

本発明に係る植物体は、転写促進活性が抑制された転写因子を発現させることで、植物体個体あたりの植物体重量が増加するか、植物体個体あたりの特定の組織重量が増加するか、植物体個体あたりの特定の物質生産性が向上するか、植物体の特定の組織中の特定の物質の含量が増加したものである。

本発明において上記転写因子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む転写因子及び配列番号４に示すアミノ酸配列を含む転写因子を含む転写因子ファミリーに属する転写因子を使用することができる。

上記転写因子としては、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質であることが好ましい。

（a）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、転写促進活性を有するタンパク質
（c）配列番号１又は３に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ転写促進活性を有するタンパク質
特に、本発明に係る植物体は、対象とする転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体内で発現させることで、当該対象とする転写因子の転写促進活性を抑制することができる。ここで上記機能性ペプチドとしては、次に示す式（１）〜（８）を挙げることができる。

（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式（５）〜（８）中、α1はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2はＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
本発明に係る植物体によれば、上記特定の組織重量として種子重量の増加を達成することができる。また、本発明に係る植物体によれば、上記特定の物質生産性として油脂生産性の向上を達成することができる。

また、本発明によれば、転写促進活性が抑制された転写因子を発現させることで、植物体個体あたりの植物体重量を増加させるか、植物体個体あたりの特定の組織重量を増加させるか、植物体個体あたりの特定の物質生産性を向上させるか、植物体の特定の組織中の特定の物質の含量を増加させた植物体の製造方法を提供できる。

さらに、本発明によれば、転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質であって、上記転写因子の転写促進活性が抑制されることにより植物体個体あたりの植物体重量を増加させるか、植物体個体あたりの特定の組織重量を増加させるか、植物体個体あたりの特定の物質生産性を向上させるか、植物体の特定の組織中の特定の物質の含量を増加させるキメラタンパク質、当該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドとプロモーターとを含む組換え発現ベクター及び当該発現ベクターを含むことを特徴とする植物体の植物体重量、特定の組織重量、特定の物質生産性、又は物質含量向上キットを提供することができる。

本発明に係る植物体は、野生型の植物体と比較して、植物体個体あたりの植物体重量が増加するか、植物体個体あたりの特定の組織重量が増加するか、植物体個体あたりの特定の物質生産性が向上するか、植物体の特定の組織中の特定の物質の含量が増加したものとなる。したがって、本発明に係る植物体を用いることによって、目的とするバイオマスの増産、目的とする組織の収量増加、目的物質の生産性の向上、目的とする組織中の目的物質の含量の向上を達成することができ、バイオマス、植物組織又は目的物質を低コストで製造することができる。

また、本発明に係るキメラタンパク質は、植物体に対して野生型と比較して植物体個体あたりの植物体重量の増加、植物体個体あたりの特定の組織重量の増加、植物体個体あたりの特定の物質生産性の向上、植物体の特定の組織中の特定の物質の含量の増加といった形質を付与することができる。これにより、本発明に係るキメラタンパク質によれば、バイオマスの増産、目的とする組織の収量増加、目的物質の生産性の向上、又は目的物質の含量の向上を可能とする植物体を製造することができる。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2007-315272号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

発現促進活性を抑制した転写因子At3g25890を導入した植物体のT2植物-T3種子（CR029）における、植物体個体あたりの油脂生産量を測定した結果を示す特性図である。発現促進活性を抑制した転写因子At1g56650を導入した植物体のT2植物-T3種子（TP107）における、植物体個体あたりの油脂生産量を測定した結果を示す特性図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明に係る植物体は、転写促進活性が抑制された転写因子を発現させることで、野生型の植物体と比較して、植物体個体あたりの植物体重量が増加するか、植物体個体あたりの特定の組織重量が増加するか、植物体個体あたりの特定の物質生産性が向上するか、特定の組織中の特定の物質の含量が増加したものである。すなわち、本発明に係る植物体は、所望の植物を対象として、当該植物における植物体重量、特定の組織重量、特定の物質生産性或いは物質含量を有意に向上させるように、転写促進活性が抑制された転写因子を発現させた植物体である。

ここで、植物における植物体重量を向上させるとは、いわゆるバイオマスの増産、すなわち一定面積あたりのバイオマスの増加と同義である。一定面積あたりのバイオマスを増加させるためには、密植度（一定面積あたりの植物個体数）を増加させる技術と、植物体個体あたりの重量またはエネルギー量を増加させる技術の二つが寄与する。つまり、植物バイオマスとしては、一定面積あたりの乾重量だけでなく、植物体個体あたりの乾重量で評価することもできる。

よって本発明で定義するバイオマスとしては、個体あたりの植物体乾重量でも良く、個体あたりの地上部植物体乾重量でも良く、個体あたりの目的生産物を蓄積している特定の組織重量でも良く、個体あたりの目的生産物でも良く、特定の組織あたりの目的物質含量としても良い。

ここで、植物体個体あたりの特定の組織重量は、植物体を構成する種子、根、葉、茎、花、花粉等の組織のうち少なくとも１種以上の組織重量を意味する。特に、本発明に係る植物体は、種子重量の増加を目的とすることが好ましい。

ここで、植物体個体あたり特定の物質生産性とは、植物が生成する各種の物質についての個体あたりの含有量を意味する。物質としては、特に限定されず、植物体が本来的に生成する物質であっても良いし、植物体が本来的には生成しないが遺伝子操作技術等によって生成できるようになった物質であっても良い。特に、組織あたりの目的生産物の含量が高くなれば、精製コストや運搬コストを低減できるため産業上有用性が高い。特に、目的生産物としては、植物のほとんどの重量を占めるリグノセルロースでも良く、種子油として産業上利用されている植物油脂、特に植物油でも良い。植物油は、脂肪酸とアルコールのエステルである単純脂質でも良く、リンや糖や窒素などを含んだ複合脂質でも良く、脂肪酸そのものでも良い。単純脂質のアルコールとしては分子量の高い高級アルコールでも良く、グリセロール（グリセリン）などの多価アルコールでも良い。単純脂質の脂肪酸としては、飽和脂肪酸でも良く、不飽和脂肪酸でも良く、また、水酸基やエポキシ基を含んだ特殊脂肪酸でも良い。グリセロールと脂肪酸のエステルである単純脂質としては、モノアシルグリセロールでも良く、ジアシルグリセロールでも良く、トリアシルグリセロールでも良い。

以下の説明において、生産性を向上させる物質として油脂を例示して説明するが、本発明の技術的範囲がこれに限定されるものではない。本発明は、植物が生成する物質として油脂以外の物質についても同様に適用される。

ここで、植物体としては、特に限定されず、如何なる植物をも対象とすることができる。特に、植物体としては、被子植物が好ましく、単子葉植物及び双子葉植物のいずれでも良い。特に、従来より油脂の生産に使用される植物を対象とすることが好ましい。対象とする植物としては、例えば、大豆、ごま、オリーブ油、椰子、イネ、綿花、ひまわり、トウモロコシ、べに花及びナタネ等を挙げることができる。また、植物の遺伝子解析におけるモデル生物として広く利用されており、遺伝子発現解析の方法が確立しているシロイヌナズナを対象の植物とすることもできる。

また、転写促進活性が抑制された転写因子とは、当該転写因子が本来的に有している転写促進活性が有意に低減した転写因子であることを意味する。転写促進活性を低減させる手法としては、特に限定されず遺伝子サイレンシング技術を広く適用することができるが、なかでもリプレッサードメイン配列を付加した融合タンパク質を構築する方法を適用することが最も好ましい。

この手法においてリプレッサードメイン配列とは、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを構成するアミノ酸配列であり本発明者らによって種々見出された配列である。

リプレッサードメイン配列を使用した方法については、例えば、特開２００１−２６９１７７公報、特開２００１−２６９１７８公報、特開２００１−２９２７７６公報、特開２００１−２９２７７７公報、特開２００１−２６９１７６公報、特開２００１−２６９１７９公報、国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット、Ohta, M., Matsui, K., Hiratsu, K., Shinshi, H. and Ohme-Takagi, M., The Plant Cell, Vol.13,1959-1968,August,2001及びHiratsu, K., Ohta, M., Matsui, K., Ohme-Takagi, M., FEBS Letters 514(2002)351-354を参照することができる。リプレッサードメイン配列は、Class II ERF（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナSUPERMANタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。

転写促進活性を抑制する対象となる転写因子としては、シロイヌナズナにおけるAt3g25890で特定される転写因子（以下、単に『転写因子At3g25890』と称す）及びAt1g56650で特定される転写因子（以下、単に『転写因子At1g56650』と称す）を挙げることができる。転写因子At3g25890は、エチレン応答性因子（ERF：ethylene response factor）/AP2転写因子ファミリーにおけるERFサブファミリーB-6に属し、１つのAP2ドメインを有することが知られている。転写因子At3g25890のアミノ酸配列を配列番号２に示す。転写因子At3g25890をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。また、転写因子At1g56650は、アントシアニン代謝及びラジカル消去能に関与する転写因子を含む推定上のMYBドメインをコードすることが知られており、ジヒドロフラボノール還元酵素遺伝子の発現に必須であることが知られている。転写因子At1g56650のアミノ酸配列を配列番号４に示す。転写因子At1g56650をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。

また、転写促進活性を抑制する対象となるAt3g25890及び転写因子At1g56650は、それぞれ配列番号２及び４に示すアミノ酸配列からなるものに限定されず、当該アミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、且つ、転写促進活性を有するものであっても良い。ここで、複数個のアミノ酸としては、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。なお、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記転写因子をコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA社製）を用いて変異が導入される。

さらに、転写促進活性を抑制する対象となる転写因子には、シロイヌナズナにおける転写因子At3g25890及び転写因子At1g56650に限定されず、シロイヌナズナ以外の植物（例えば上述した植物）において同機能を有する転写因子（以下、相同転写因子と称す）が含まれる。転写因子At3g25890或いは転写因子At1g56650に対する相同転写因子は、植物ゲノム情報が明らかになっていれば、転写因子At3g25890或いは転写因子At1g56650のアミノ酸配列或いは各遺伝子の塩基配列に基づいて、検索対象の植物ゲノム情報から検索することができる。このとき、相同転写因子としては、転写因子At3g25890或いは転写因子At1g56650のアミノ酸配列に対して、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列として検索される。ここで、相同性の値は、blastアルゴリズムを実装したコンピュータプログラム及び遺伝子配列情報を格納したデータベースを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。

また、植物ゲノム情報が明らかとなっていない場合には、対象となる植物からゲノムを抽出するか或いは対象となる植物のcDNAライブラリーを構築し、転写因子At3g25890遺伝子或いは転写因子At1g56650遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノム領域或いはcDNAを単離することで相同遺伝子を同定することができる。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。

本発明に係る植物体は、上述したような転写因子における転写促進活性を抑制した状態で発現させることで、油脂生産量が有意に向上するといった特徴を示す。このとき、上記植物体においては、内因性の転写因子を改変してその転写促進活性を抑制してもよいが、転写促進活性が抑制された転写因子の改変体をコードする遺伝子を導入し、当該遺伝子を発現させても良い。また、対象となる転写因子をコードする遺伝子について、所謂、遺伝子サイレンシング技術を応用して転写促進活性を抑制することもできる。

一例としては、上述したような転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させた融合タンパク質をコードする遺伝子を対象の植物に導入し、当該融合タンパク質を植物内で発現させる手法が好ましい。

本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（転写抑制転換ペプチドと称す）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチドであればよい。この転写抑制転換ペプチドについては、特開２００５−２０４６５７号公報に詳述されており、当該公報に開示されたものを全て使用することができる。

転写抑制転換ペプチドは、例えば次に示す式（１）〜（８）のいずれかで表されるアミノ酸配列を挙げることができる。

（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式（５）〜（８）中、α1はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2はＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
式（１）の転写抑制転換ペプチド
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的にＸ１で表されるアミノ酸残基は、５個以下であることが好ましい。

同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。

式（２）の転写抑制転換ペプチド
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。具体的にＹ１で表されるアミノ酸残基は、５個以下であることが好ましい。

同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。

式（３）の転写抑制転換ペプチド
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。

一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。具体的にＺ３で表されるアミノ酸残基は、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。

また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときの容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。

式（４）の転写抑制転換ペプチド
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）である。なお、上記式（４）の転写抑制転換ペプチドにおいてＺ４で表されるアミノ酸残基がＧｌｕの場合のアミノ酸配列は、シロイヌナズナSUPERMANタンパク質（SUPタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当している。

以上で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上述した転写因子と融合して融合タンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードする遺伝子との融合遺伝子を得れば、融合タンパク質を生産させることができる。

具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（転写抑制転換ポリヌクレオチドと称す）と上記転写因子をコードする遺伝子とを連結することにより融合遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これにより融合タンパク質を生産させることができる。上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。さらにまた、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のように融合タンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記融合タンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。

本発明に係る植物体を製造する方法は、転写促進活性が抑制された転写因子を植物体で生産させ、油脂生産性を向上させる過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む製造法方法として挙げることができる。以下、各工程について具体的に説明する。

発現ベクター構築工程
発現ベクター構築工程は、上述した転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐBluescript、ｐBluescriptＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。

プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、アクチンプロモーター又はユビキチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した融合遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。

なお、組換え発現ベクターは、プロモーター及び上記融合遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。

ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。上記組換えベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止することができる。

選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。

翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記融合遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。

組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードする遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結して融合遺伝子を構築し、次に、この融合遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。

融合遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記キメラ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。

また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。

形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上述した融合遺伝子を発現させるように、上述した組換え発現ベクターを植物細胞に導入する工程である。組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Bechtold, E., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993) In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C.R. Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199. あるいは、Zyprian E, Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256.に記載された方法を用いることができる。

組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。

上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明に係る植物体の製造方法においては、上述した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。

その他の工程、その他の方法
本発明に係る植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。

選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのもの、または任意の器官や組織に含まれる油脂含有量から選抜してもよい。例えば、油脂含有量から選抜する例としては、形質転換体の種子から定法に従って油脂成分を定量し、形質転換していない植物体の種子に含まれる油脂含有量と比較する方法を挙げることができる（後述の実施例参照）。

本発明に係る植物体の製造方法では、上記融合遺伝子を植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖または無性生殖により油脂含有量が有意に向上した子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明に係る植物体の製造方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。

なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体とみなす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明に係る植物体の製造方法では、植物細胞等から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。

また、本発明に係る植物体の生産方法は、組換え発現ベクターで形質転換する方法に限定されるものではなく、他の方法を用いてもよい。具体的には、例えば、上記融合タンパク質そのものを植物体に投与してもよい。この場合、最終的に利用する植物体の部位において油脂含有量を向上できるように、若年期の植物体に融合タンパク質を投与すればよい。また融合タンパク質の投与方法も特に限定されるものではなく、公知の各種方法を用いればよい。

以上説明したように、本発明によれば、転写促進活性が抑制された転写因子を導入した植物体であって、油脂含有量が有意に向上した植物体を提供することができる。本発明に係る植物体においては、転写促進活性を有する転写因子も同様に発現しているものの、転写促進活性が抑制された転写因子がドミナントネガティブに遺伝子発現を抑制することができる。これにより、本発明に係る植物体においては、油脂生産に関連する遺伝子群及び/又は生産された油脂の分解に関連する遺伝子群の発現レベルが変化し、その結果、油脂含有量が有意に向上すると考えられる。

ここで油脂含有量が有意に向上するとは、野生型と比較して一粒あたりの種子質量に変化はないが油脂量が向上した場合と、野生型と比較して一粒あたりの種子質量が有意に大となり油脂量が向上した場合のいずれかを意味する。いずれの場合であっても、植物一個体が生産する油脂量が向上したこととなる。本発明に係る植物体は、植物由来の油性の製造方法に利用することができる。例えば、本発明に係る植物体を成長させて種子を採取し、採取した種子から油脂成分を抽出することで油脂を製造することができる。

特に本発明に係る植物体を利用した油脂の製造方法は、植物一個体における油脂含有量が高いため生産性に優れた方法であるといえる。換言すると、単位耕地面積あたりの栽培個体数が一定であると仮定すると、本発明に係る植物体を利用することによって単位耕地面積あたりから製造する油脂量が大幅に向上することとなる。したがって、本発明に係る植物体を利用することによって油脂生産に要する製造コストを大幅に削減することができる。

なお、本発明に係る植物体を利用した油脂の製造方法において、製造対象の油脂としては、特に限定されず、例えば、大豆油、ごま油、オリーブ油、椰子油、米油、綿実油、ひまわり油、コーン油、べに花油及び菜種油等の植物由来の油脂を例示することができる。また、製造した油脂は、家庭用途や工業用途に広く利用することができ、更にはバイオディーゼル燃料の原料としても使用することができる。すなわち、本発明に係る植物体を利用することによって、上述した家庭用途又は工業用途の油脂や、バイオディーゼル燃料等を低コストに製造することができる。植物体個体当たりの種子収量が向上すると、油脂生産性だけでなく、飼料、食料の生産性向上が望め、生産コストの低減が可能になる。また、植物体個体当たりのバイオマス量が向上すると、種子収穫後のバイオマスもしくは全バイオマスの生産性が向上する。バイオマスは適切な処理を行うことにより、糖に分解することが可能である。糖は微生物を利用した発酵法によりエタノールをはじめとする様々な化学物質に変換可能である。また、バイオマスは直接燃焼することにより熱エネルギー若しくはそこから電気エネルギーを得ることができる。本発明が提供する植物体を利用することにより、以上に示した化学物質や熱・電気エネルギーを安価に生産することが可能となる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
本実施例では、シロイヌナズナにおける転写因子At3g25890及び転写因子At1g56650について、それぞれリプレッサードメイン配列を付加した融合タンパク質を植物体において発現させ、当該植物体から採取した種子における油脂含有量を測定した。

転写因子遺伝子の増幅
シロイヌナズナのcDNAライブラリーより、以下に記載するプライマーを用いて転写因子At3g25890をコードする遺伝子及び転写因子At1g56650をコードする遺伝子の終止コドンを除く領域をPCRによって増幅した。PCR条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして２５サイクル行った。PCR終了後、増幅されたDNA断片をアガローズゲル電気泳動により分離、回収した。

・At3g25890増幅用フォワードプライマー
ATGGCTGAACGAAAGAAACGC（配列番号５）
・At3g25890増幅用リバースプライマー
TGGGCACGCGATATTAAGAGG（配列番号６）
・At1g56650増幅用フォワードプライマー
GATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGC（配列番号７）
・At1g56650増幅用リバースプライマー
ATCAAATTTCACAGTCTCTCCATCG（配列番号８）
融合遺伝子の作製
転写因子At3g25890のC末端側及び転写因子At1g56650のC末端側にリプレッサードメイン配列を付加した融合タンパク質をコードする融合遺伝子を作製した。先ず、上記PCRで増幅された各DNA断片の３’末端にリプレッサードメイン配列をコードするポリヌクレオチドを付加するために、CaMV35Sプロモーターの下流にSmaIサイトとリプレッサードメイン配列（GLDLDLELRLGFA）をコードするポリヌクレオチドを有しているベクターp35SSXGを準備した。このp35SSXGをSmaIで切断し、上記PCRで増幅された各DNA断片を挿入した。得られた発現ベクターをそれぞれp35SSXG(At3g25890)及びp35SSXG(At1g56650)と命名した。

バイナリーベクターの構築
アグロバクテリウム法を用いて、植物の形質転換を行うためバイナリーベクターpBCKHを用いた。本ベクターはpBIG(Hygr)(Nucleic Acids Res. 18, 203(1990))のHindIIIサイトにGatewayベクターコンバージョンシステム（Invitrogen）のカセットを組み込んだものである。このベクターに上記融合遺伝子を組み込むために、本ベクターとp35SSXG(At3g25890)又はp35SSXG(At1g56650)を混合し、GATEWAY LR clonase (Invitrogen)を用いて組換え反応を行った。その結果、pBCKH- p35SSXG(At3g25890)及びpBCKH -p35SSXG(At1g56650)を構築することができた。

バイナリーベクターの植物への導入
本実施例では、植物として双子葉植物アブラナ科に属するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana, Columbia ）を用いた。遺伝子導入法は、Bechtold, E., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993) In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C.R. Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199.及びZyprian E, Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256.に記載された方法に従った。ただし、感染させるのに減圧処理は行なわず、アグロバクテリウム菌液に浸すだけにした。具体的には、バイナリーベクターpBCKH- p35SSXG(At3g25890)及びpBCKH -p35SSXG(At1g56650)を、それぞれ土壌細菌Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (C58C1Rifr) pMP90 (Gmr)(koncz and Schell 1986)株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Km）50μg/ml、ゲンタマイシン（Gm）25μg/ml、リファンピシリン（Rif）50μg/ml）を含むYEP培地でOD600が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Infiltration medium、1リッターあたり、2.2 ｇ MS salt, 1X B5 vitamins, 50 g sucrose, 0.5 g MES, 0.044 μM benzylaminopurine, 400μｌ Silwetを含む。ｐH 5.7)に懸濁した。

この溶液に、１４日間生育したシロイヌナズナを１分間浸し、感染させた後、再び栽培を継続し結実させた。採種した種子（T1種子）を50％ブリーチ、0.02％Triton X-100溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（4.3g/l MS salts, 0.5 % sucrose, 0.5 g/l MES, pH 5.7, 0.8 % agar, 30mg/l hygromycin, 250 mg/l Vancomycin）に播種した。上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体（T1植物）を各改良型転写遺伝子につき１０系統を選抜し、バーミキュライト混合土を入れた直径50mmのポットに移植した。これを22℃、１６時間明期8時間暗期、光強度約60〜80μE/cm²で栽培し種子（T2種子）を得た。

＜T2種子の分析＞
得られたT2種子に含まれる油脂成分の定量分析は、MARAN-23 (Resonance Insturuments Ltd., UK) ^H-NMRと、解析ソフト RI-NMR Ver. 2.0を用いた。これら装置を用いて、2〜10mgのT2種子を測定した。油脂の標準物質としてオリーブオイルを用いて検量線を作製し、種子中の油脂含量（重量％）を求めた。

一粒種子重の測定は、T2種子約1mgを秤量後、ガラスシャーレに広げ、種子の画像をピクトロスタット（FUJIFILM）を使用いてスキャンし、画像編集ソフトPhotoshopでグレースケールに加工したものを画像解析ソフトScion Imageで解析し、種子数をカウントした。全種子重量を種子数で除し、一粒あたりの種子重量を求めた。野生型シロイヌナズナについても同様に油脂成分を定量し、これらの結果をまとめて表１に示す。

表１から判るように、発現促進活性を抑制した転写因子At1g56650を導入した植物体においては、油脂含量が野生型と比較して非常に高い値を示し、一粒あたりの油脂量の増加率が106.3%といった優れた値を示した。また、発現促進活性を抑制した転写因子At3g25890を導入した植物体においては、油脂含量が野生型と比較すると3.6%程度の上昇であったが、一粒の種子重量が野生型と比較して非常に高い値を示したため、その結果、一粒あたりの油脂量の増加率が74.4%といった優れた値を示した。

＜T3種子の分析＞
T3種子を分析するために、上記で作製されたT2植物を栽培した。T2種子を50％ブリーチ、0.02％Triton X-100溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌した播種培地（4.3g/l MS salts, 0.5 % sucrose, pH 5.7, 0.8 % agar, 10mg/l hygromycin）に播種した。播種3週間後に、生育した遺伝子導入個体を形質転換植物体（T1植物）を各改良型転写遺伝子につき6個体を、バーミキュライト混合土を入れた直径50mmのポットに移植した。対象には非組換えシロイヌナズナ4個体を移植した。これを22℃、１６時間明期8時間暗期、光強度約30〜45μE/cm²で栽培し4週間後に、組換え体4個体、非組換え体3個体を残し間引きした。さらに7週間、移植後合計１1週間まで栽培した。発現促進活性を抑制した転写因子At1g56650を導入した植物体のT3植物をTP107と命名し、発現促進活性を抑制した転写因子At3g25890を導入した植物体のT3植物をCR029と命名した。

地上部の植物体を紙袋に入れ、22℃、湿度60%の条件で2週間乾燥させた後に、全バイオマス量と種子収量を電子天秤で秤量した。また、油脂の定量分析は前述の方法を用いた。その結果を図１及び２並びに表２及び表３に示した。なお、表２中、「＊」は分析値が最も高い個体の値を意味する。

図１及び図２並びに表２から判るように、発現促進活性を抑制した転写因子At3g25890を導入した植物体（植物体T2世代、種子T3世代）においては、植物体個体あたりの油脂含量の増加率が野生型と比較して273％といった優れた値を示す個体が得られ、平均値としても95%の増加率を示した。また、発現促進活性を抑制した転写因子At1g56650を導入した植物体（植物体T2世代、種子T3世代）においては、植物体個体あたりの油脂含量の増加率が野生型と比較して180％といった優れた値を示す個体が得られ、平均値としても98%の増加率を示した。

表３から判るように、発現促進活性を抑制した転写因子At3g25890を導入した植物体（植物体T2世代、種子T3世代）及び発現促進活性を抑制した転写因子At1g56650を導入した植物体（植物体T2世代、種子T3世代）のいずれにおいても、バイオマス量及び種子収量が野生型と比較して有意に向上していた。また、両植物体とも、種子への分配率である収穫指数も野生型と比較して有意に向上していることが明らかとなった。

以上の結果から、発現促進活性を抑制した転写因子At3g25890を導入した植物体（植物体T2世代、種子T3世代）及び発現促進活性を抑制した転写因子At1g56650を導入した植物体（植物体T2世代、種子T3世代）は、一粒あたりの油脂含有量が優れるとともに単位耕地面積あたりの収穫指数の優れるため、油脂生産において非常に有効な植物体であることが判明した。

なお、以上の結果においてT2世代とT3世代を比較したときに、植物体個体あたりの油脂含量、種子収量、油脂含量及びバイオマス量が異なる傾向を示している場合がある。しかし、T2世代とT3世代の間ではメンデルの法則が成立しているため、必ずしも同じ遺伝子型を有しているとは限らず、またRNAi技術で知られるようにmRNAが原因となって遺伝子発現が抑制される場合もあるため、T2世代とT3世代における傾向の相違は生じる現象である。いずれにしても、発現促進活性を抑制した転写因子At3g25890を導入した植物体及び発現促進活性を抑制した転写因子At1g56650を導入した植物体については、バイオマス量の増加、種種収量の増加、油脂収量の増加といった優れた効果を奏するものとして評価できる。

〔実施例２〕
本実施例では、実施例１と同様にシロイヌナズナにおける転写因子At1g56650について、リプレッサードメイン配列を付加した融合タンパク質を植物体において発現させ、単子葉植物イネ科に属するイネ（日本晴）（Olyza sative Nipponbare）から採取した種子における油脂含有量を測定した。

転写因子遺伝子の増幅、融合遺伝子の作製、バイナリーベクターの構築
実施例１と同様に行った。

バイナリーベクターの植物への導入
特許第3141084号記載の方法に従って、バイナリーベクターを保持したアグロバクテリウムを用いて当該ベクターをイネ（日本晴）に導入し、カルスを得た。

遺伝子を導入したカルスは、一ヶ月間、50ppmのハイグロマイシンによる選抜を行い、薬剤耐性を示すカルスを得た。得られたカルスから定法に従ってDNAを調製した。調製したDNAを鋳型とするPCRによってAt1g56650融合遺伝子を確認できた。薬剤耐性の表現型を有し、At1g56650融合遺伝子の存在が確認できたカルスを、再分化培地（特許第3141084号記載）に移動して再分化を誘導した後、ホルモンを含まないMS培地（特許第3141084号記載）に移動し、形質転換植物を得た。

形質転換植物は、16時間明条件（光量子量：135μE/cm²、温度：30℃）−8時間暗条件（温度：25℃）で100日間生育させた後、12時間明条件（光量子量：135μE/cm²、温度：30℃）−12時間暗条件（温度：25℃）で生育させ、結実した種子（T1種子）を回収した。

T1種子の分析
実施例１＜T2種子の分析＞と同じ方法で、得られたイネT1種子中の油脂の定量分析を行った。ただし、イネ種子の重量は玄米一粒が約20mgであるため、一粒中の油脂含量を再現性良く定量することができた。結果を表４に示す。なお玄米は、果皮、種皮、胚乳及び糊粉層を含む種子であり、頴果（caryopsis）はいわゆる籾殻である。

表４から判るように、発現促進活性を抑制した転写因子At1g56650を導入した単子葉植物であるイネにおいては、油脂含量が野生型と比較して非常に高い値を示し、一粒あたりの油脂量の増加率が玄米で91.9％、頴果で45.2％といった優れた値を示した。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

転写促進活性が抑制された、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質からなる転写因子を発現させることで、植物体個体あたりの植物体重量が増加するか、植物体個体あたりの種子重量が増加するか、植物体個体あたりの油脂生産性が向上するか、種子の油脂含量が増加した植物体の製造方法。
（a）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、転写促進活性を有するタンパク質
（c）配列番号１又は３に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ転写促進活性を有するタンパク質
上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体内で発現させることで、上記転写因子の転写促進活性を抑制することを特徴とする請求項１記載の植物体の製造方法。
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（８）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式（５）〜（８）中、α1はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2はＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項２記載の植物体の製造方法。
転写促進活性が抑制された、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質からなる転写因子を発現させることで、植物体個体あたりの植物体重量が増加するか、植物体個体あたりの種子重量が増加するか、植物体個体あたりの油脂生産性が向上するか、種子の油脂含量が増加した植物体から、生産性が向上した油脂を分離及び回収する工程を含む、植物体を用いた油脂の製造方法。
（a）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、転写促進活性を有するタンパク質
（c）配列番号１又は３に示す塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ転写促進活性を有するタンパク質
上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体内で発現させることで、上記転写因子の転写促進活性を抑制することを特徴とする請求項４記載の植物体を用いた油脂の製造方法。
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（８）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式（５）〜（８）中、α1はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2はＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1はＡｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項５記載の植物体を用いた油脂の製造方法。