JP5524824B2 - 改良されたバイオリアクタ表面 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照

本願は、２００７年４月６日に出願された米国仮特許出願第６０／９１０５０２号の利益を主張する。

発明の分野

幹細胞は臓器移植、組織再生、輸血、および骨髄移植を含む種々の治療的応用での可能性が示されている未分化の細胞カテゴリーである。治療的応用のために有用な量で幹細胞を増殖させるためには、幹細胞を増殖させるための効率的で且つ信頼性のあるメカニズムが重要である。経済的に有用であるために、かかるメカニズムは、幹細胞汚染の機会を最小限にする方法で、莫大な数の幹細胞が産生されることを保証すべきである。

哺乳類細胞は、生存するためのホメオスタシスを必要とする；従って、ヒト細胞をエクスビボで増殖させるときには、温度、酸素濃度、ｐＨ、浸透圧、栄養素濃度、およびイオン濃度を含む一定の環境的パラメータを注意深く調節しなければならない。更に、幹細胞増殖に関して、間葉幹細胞（ＭＳＣ）のような頻繁に増殖する多くの細胞は足場依存性である。このことは、ＭＳＣをエクスビボで増殖させるときに、それらの生存および増殖の能力は、該ＭＳＣが固定された表面に固着されるに至らない限り低下し得ることを意味している。

従って、細胞が固定された培養において、労力コストおよび汚染リスクを最小化しながら、効率的に増殖できるシステムについての必要性が生じている。最も初歩的なバイオリアクタシステムは、ポリスチレン組織培養フラスコの使用を含んでいるが、この方法は最小スケールでの適用を除き、全てについて実際的ではない：培養フラスコ内で細胞を培養するのは労働集約的であり、培養フラスコの頻繁な解放がフラスコ内の汚染の可能性を増大させるという事実により、高い汚染リスクを有している。組織培養フラスコに関連した問題に対応して開発された多くのバイオリアクタシステムは、「閉鎖」システムと称される；これらのシステムでは、自動化された流体の流れが細胞に栄養素を供給し、従って汚染のためのより少ない機会を可能にして、プロセス全体の改善された制御を与え、細胞の生理学的環境をより良く近似する。自動化された培養バイオリアクタは、平板型または中空ファイバ型であってよい。中空ファイバ型の使用は、所定容積のリアクタ内で増殖細胞のために利用可能な表面積を最大化する。

従って、細胞が付着するバイオリアクタ表面を発展させるための努力が傾注されてきた。現在の中空ファイバを作っている材料に対して細胞が容易には付着せず、または緊密には付着しないという事実によって、細胞付着のための適切な表面を開発する仕事は更に困難になっている。これらの問題に対する解決策は、細胞を、それらが自然には結合しない表面に付着させることができる細胞接着システムを開発し、また細胞に対する培地の流れにより生じる剪断ストレスに定常的に曝されても、細胞を結合したまま維持することが必要とされる。

既知の膜バイオリアクタの細胞増殖表面を構築する際に、基体として使用されるポリマーにはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンチレン、鹸化されたセルロースエステル、ポリメチルアクリレート、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、スチレン−アクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ＰＶＣ、オルガノシリコーン、セルロースエステル、およびポリアミドが含まれる。

幾つかのポリマー表面が、共有結合または静電的吸着を介して、ラミニン、コラーゲン、およびフィブロネクチンのような細胞付着因子で処理されてきた。他の表面は、米国特許第５，９１２，１７７号に示されるように、細胞を膜表面に生理学的に固定するために細胞付着因子を使用して処理される。しかし、米国特許第５，５１２，４７４号、第５，９１２，１７７号に記載されているように、また、例えばPrichard, H., Reichert, W. et al.が「Adult Adipose-Derived Stem Cell Attachment to Biomaterials」（Biomaterials 28(6) 936-946）に記載しているように、従来技術では、細胞付着因子それ自身の使用は、ポリマーマトリックスへの細胞の長期の付着を媒介するためには不十分なものとして認識されている。更に、フィブロネクチンおよび他の細胞付着因子は高価であり、ポリマー表面のフィブロネクチン被覆のための現在の吸着技術は極めて不経済である。

従って、フィブロネクチンをより効率的に使用する方法を見つけるか、またはフィブロネクチンの必要性を回避する方法を見つけることが望まし。

本発明は、バイオリアクタの膜表面への哺乳類細胞の付着を促進する方法に向けられている。該バイオリアクタは、少なくともハウジング、および該ハウジング内に少なくとも一つの表面を有するポリマー膜を有している。ポリマー膜表面は、該ポリマー膜表面に対する細胞付着を改善するために十分な量の、少なくとも一つの表面処理剤で処理される。

もう一つの実施形態は改善された細胞培養システムを含み；該細胞培養システムは、ハウジングおよび該ハウジング内のポリマー膜を備えたバイオリアクタを含んでなり；前記ポリマー膜は、該膜への細胞の結合および付着を刺激するのに十分な量の血小板溶解物または血漿で処理される。

本発明のもう一つの実施形態は、細胞培養システムにおいて使用するための細胞培養表面を含んでいる。この細胞培養表面は、ポリマー材料への細胞付着を促進するのに十分な量の血小板溶解物もしくは血漿、またはそれらの組み合わせで処理されたポリマー材料である。

図１は本発明において有用なバイオリアクタの概略図である。 図２は、本発明と共に使用し得る細胞増殖システムのフロー図である。 図３は、間葉幹細胞増殖に対する種々の表面処理の効果を比較するグラフである。 図４は、間葉幹細胞増殖に対する種々の表面処理の効果を比較するも一つのグラフである。

発明の詳細な説明

背景の項で述べたように、付着性の哺乳類細胞を増殖するためにバイオリアクタを構成するための複数の方法が存在する；本発明は、その何れか一つの構成に依存するものではない。ここで使用する「付着性哺乳類細胞」の語は、起源の種、起源の組織、細胞株、または培養時間の長さに関係なく、哺乳類核ゲノムおよび付着能力を有する何れかのタイプの真核細胞を意味する。

本発明の実施形態の一つの非限定的な例は、図１に示した中空ファイバ式バイオリアクタである。バイオリアクタ、または細胞増殖モジュール１０は、ハウジング１４内に封入された中空ファイバ形状の束ねられた組の生体適合性ポリマー膜１２から製造される。この説明の目的では、全ての中空ファイバの組、並びにそのキャピラリー内側（ＩＣ）およびキャピラリー外側（ＥＣ）の両者を膜と称する。「膜」、「細胞培養表面」、「培養表面」、「ポリマー膜」、および「ポリマー表面」の語は同義語である。ファイバ１２を含むハウジングまたはモジュール１４は、形状が円筒形であり、何れかの生体適合性ポリマー材料で製造されてよい。膜のキャピラリー内側は、この説明の目的では、中空ファイバに似た膜の内腔、および該膜に囲まれた、または実質的に囲まれた容積として定義される。該膜のキャピラリー外側は、この記述の目的にとっては、中空ファイバによって取り囲まれていないか、または中空ファイバの内腔側と接触していないバイオリアクタハウジング内の容積の何れかの成分として定義される。この記述の目的にとって、細胞は、ＩＣ空間内のみで播種、増殖および再播種されると仮定される：この仮定は特許請求の範囲を限定することを意図するものではなく、むしろ細胞はＥＣ空間内で増殖されてもよく、ここに記載する同じ原理が適用されるであろう。

モジュールまたはハウジングの各末端は、エンドキャップまたはヘッダ１６，１８で閉鎖される。これらのエンドキャップ１６，１８は、バイオリアクタ内で増殖される細胞に対して生体適合性である限り、ポリカーボネートのような何れか適切な材料で製造されてよい。

該モジュールは、モジュール内への流体の入口または出口のための少なくとも一つのポートを有している；非限定的な例としての一実施形態のモジュールは、四つのポートを有している。四つのポートのうちの二つは、キャピラリー外側空間に流体的に接続している。キャピラリー外側空間への流体および溶質の流入のために一つのポート３４が使用され、またキャピラリー外側空間からの流体および溶質の流出のためには他のポート４４が使用される。四つのポートのうちの他の二つは、キャピラリー内側空間と流体的に接続している；非限定的な例として、一つのポート２６は、キャピラリー内側空間への流体および溶質の流入のために使用され、他のポート４２は、キャピラリー内側空間からの流体および溶質の流出のために使用される。細胞、処理剤および培地がバイオリアクタ内に導入され得るのは、上記の入口ポート３４，２４によってであり、また細胞、処理剤および培地がバイオリアクタから時々除去され得るのは上、記の流出ポート４４，４２によってである。本発明の目的にとって、バイオリアクタへの物質の流入を可能にするバイオリアクタ１０の何れかの物理的な孔が入口ポートであり；該バイオリアクタからの物質の流出が生じる何れかのポートが流出ポートである。

ＩＣ空間は細胞増殖室として働くと仮定される；しかし、先に述べた通り、細胞はＥＣ空間の中にも流入してその中で増殖し得るので、この仮定は本発明に不可欠なものではない。新しい細胞増殖周期の開始時に、細胞はＩＣ空間内に流入されてよい。ＩＣ空間はシリンジを使用して、または細胞の調製物を含むバッグから細胞を充填されてよい。細胞は、細胞培養培地中で、または骨髄吸引物として直接にＩＣ空間の中に流入されてよい。

一実施形態において、ＩＣ培地バッグ２２（図２参照）は、可撓性配管の一部（ＩＣ入口ライン）２４を介して、バイオリアクタ１０のＩＣ入口ポート２６に接続されてよい。ＩＣ入口ライン２４は、新鮮なＩＣ培地をバイオリアクタのＩＣ側へと運ぶ。バイオリアクタ内で細胞を再播種または再分布させる等の特別な応用を可能にするために、必要に応じて、追加の配管ライン６２をシステムに追加することができる。

細胞入力バッグ３０は、バイオリアクタ１０内で増殖されるべき細胞を含んでいる。細胞入力バッグ３０は、ＩＣ入口ポート２６を介して中空ファイバの内腔に細胞を送給するＩＣ入口ライン２４に連結される。

細胞が回収できる状態になったとき、それらはバイオリアクタのＩＣ出口ポート４２から、細胞回収ライン３１を通して細胞回収バッグ３２へと流出される。

該細胞増殖システムはまた、ＩＣ再循環ループ３６として働くある長さの配管を含んでよい。ＩＣ培地は、ＩＣ出口ポート４２から配管ループ３６を通って流出し、ＩＣ入口ポート２６を通ってバイオリアクタの中に戻る。このループ３６は、中空ファイバを通してＩＣ培地を再循環させるために使用される。それはまた、細胞を中空ファイバから流出させ、以下で更に十分に説明するように、該細胞の更なる増殖のために、中空ファイバ全体に亘って該細胞を再播種／再分布させるために使用されてよい。

図１に見られるように、ファイバ１２自身の間の空間、即ちＥＣ空間は、キャピラリー内部空間中の細胞のための栄養素貯蔵庫および老廃物回収部位として働く。栄養素は、ポリマー膜を横切る拡散によってＥＣ空間からＩＣ空間に侵入する；更に、細胞老廃物はこのＥＣ空間を通ってＩＣ空間を出て行く。ＥＣ培地は、細胞代謝老廃物を除去するために時おり置換されてよく、または連続的に置換されてよい。ＥＣ培地は、必要に応じて酸素付加器（４、図２参照）を通して循環されてよい。ＥＣ培地は、ＥＣ培地バッグ（１６、図２参照）からバイオリアクタの中に導入されてよく、一実施形態において、該バッグはある長さの可撓性配管または導管２８を介して入口ポート３４に流体的に連結される。該ＥＣ培地は、何等かの細胞老廃物と共に、ＥＣ流出ポート４４を介してバイオリアクタから溢出されてよく、該流出ポート４４は、ある長さの配管または導管５８を介して廃液バッグ６０に流体的に連結される。

また、ＥＣ培地を再循環させるために、ライン４０および４１を含むＥＣ再循環ループが設けられてよい。ここでもまた、細胞がＥＣ空間内で増殖されるのなら、ＩＣ空間が細胞のための栄養素貯蔵庫および老廃物回収プールとして働くであろう。

この説明の目的のために行われる第二の仮定は、ＩＣ空間を通って流れる流体およびＥＣ空間を通って流れる流体は反対方向に流れるということである。本発明は、流体がＥＣ空間およびＩＣ空間の両方で同じ方向に流れるバイオリアクタ内で使用されてよいので、この仮定は本発明に不可欠ではない。

ここに記載する特定の実施形態での中空ファイバ１２は、本数が約９０００本であり、長さが約２９５ｍｍである。それらは、ポリウレタンポッティング（図示せず）によってハウジング内の適所に保持されてよい。該ファイバ１２は、ＩＣ空間を通して流体を流すために、横断面に沿って切断されてよよい。ファイバ１２の長さおよび数は変化してよく、ここに記載する実施形態は単なる例に過ぎないことが理解される。

中空ファイバ１２は、半透性で生体適合性のポリマー材料で製造されてよい。このような一つのポリマー材料は、ポリアミドおよびポリアリールエーテルスルホンの混合物である。該半透膜は、ＥＣ空間およびＩＣ空間の間の膜を通しての栄養素、老廃物およびガスの輸送を可能にする。該ファイバは一般に多孔質のコンシステンシーを有しており、これにより膜を通しての分子の拡散および対流が容易になるので、流体の交換が部分的に生じる。

膜１２の一つの実施形態は、６５〜９５重量％の少なくとも一つの疎水性ポリマー、および５〜３５重量％の少なくとも一つの親水性ポリマーを含んでなるものである。この疎水性ポリマーは、ポリアミド（ＰＡ）、ポリアラミド（ＰＡＡ）、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリアリールスルホン（ＰＡＳＵ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエーテル（ＰＥ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、ポリエーテルイミド、および上記何れかのポリマーのコポリマー混合物からなる群から選択されてよく、例えば、ポリエーテルスルホン、またはポリエーテルスルホンおよびポリアミドの混合物である。親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコールモノエステル、水溶性セルロース誘導体、ポリソルベート、およびポリエチレン−ポリプロピレンオキシドコポリマーからなる群から選択されてよい。

ポリマー中空ファイバ１２は、特に付着性細胞または足場依存性細胞をバイオリアクタ内で増殖させるときには、細胞の膜への付着を改善するための物質の処理、即ち「表面処理」を施されてよい。「処理」「処理された」または「処理する」の用語は、中空ファイバの細胞培養表面の実質的に全ての部分が、処理された分子を該膜に吸着させるのを可能にするために充分な時間だけ、表面処理を受けることを意味する。更に、共有結合、吸着および可能化の処理は、組合せまたは量に限定されることなく相互に関連して使用されてよい。

＜方法＞
膜または細胞培養表面を処理する工程は、以下のようにして行われてよい：膜処理工程の前に、細胞培養表面１２を、塩水溶液（一実施形態ではＰＢＳまたはリン酸緩衝塩水）で湿潤化させることによってプライミングする。沈殿の形成を回避するために、ＰＢＳは、Ｍｇ^＋＋またはＣａ^＋＋のような二価陽イオンを含まないものでなければならない。

プライミング手順に続いて、該膜は血小板溶解物（ＰＬ）、血漿、およびフィブロネクチン（ＦＮ）のような表面処理剤で処理される。

本発明の目的にとって、ヒト血小板溶解物は血漿および溶解したヒト血小板を含有する溶液である。該溶液は、当該技術において現在知られている方法を含めて、ヒト血小板を溶解させる何れかの方法によって調製されてよい。一実施形態では、血小板を溶解させるために、血漿中の１．５×１０^９／ｍＬの血小板を−８０℃で凍結させる；得られた生物学的に活性な溶液は、以下では血小板溶解溶液と称する。この血小板溶解物は解凍されて、１０００×ｇで１０分間遠心分離される。この得られた上清を用いて膜を処理する。

本発明の目的にとって、血漿は、当該技術で知られたものを含む何れかの方法により、そこから実質的に全ての白血球および赤血球が除去された何れかのヒト血漿製剤からなっている。該血漿の血小板含量は変化してよい。

本発明の目的にとって、この表面処理剤はまた、ＰＢＳ中に０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解されたフィブロネクチン（ＦＮ）であってよい。

この表面処理剤は、ＩＣ空間の中に該表面処理剤をポンピングまたは滴下することによって、膜１２に接触させられる。

該表面処理剤は、それ自身がバイオリアクタの中に導入されてよく、または細胞培養培地中に含められてもよい。別の実施形態において、一つの表面処理剤は、第一の表面処理剤とは異なるもう一つの表面処理剤と共にバイオリアクタの中に導入されてよい。

バイオリアクタの膜と接触したら、表面処理剤は、高い細胞付着を促進するのに充分な量で表面処理剤の吸着を可能にするために充分な時間だけ、該膜と共にインキュベートされる。本発明の一実施形態において、フィブロネクチン処理溶液は、少なくとも一時間、細胞培養表面と共にインキュベートされる。

細胞の装填は、水に懸濁した細胞サンプルを、ＩＣ入口ポート２６を介してバイオリアクタ１０の中に送給することによって達成されてよい。上記で述べたように、血小板溶解物または血漿は、増殖されるべき細胞と共に含められてよい。

実施例１
この実施例では、三つのポリフラックス中空ファイバのリアクタを使用した。一つのバイオリアクタは全く処理されなかった（図３ではＦＮなしと称する）。一つのバイオリアクタはフィブロネクチン（ＦＮ）で処理され、一つは上記で述べた方法に従って血小板溶解物（ＦＮなし＋ＰＬ）で処理された。第０日に、約３×１０^６個の間葉幹細胞を各バイオリアクタの中に装填した。細胞を７日間増殖させた。第３日および第五日に、ＥＣおよびＩＣ培地を取り替え、第７日に細胞を回収して計数した。

図３から分かるように、フィブロネクチン（ＦＮ）または血小板溶解物（ＰＬ）で処理されたバイオリアクタは、未処理のバイオリアクタよりも遙かに良好な細胞増殖を生じた。処理されたファイバを供えたバイオリアクタにより生じた増大した細胞数は、該細胞が膜に付着でき、増殖されたことを示している。

実施例２
個の実施例では、四つのポリフラックス中空ファイバのバイオリアクタを使用した。一つのバイオリアクタはある量のフィブロネクチン（１×ＦＮ）で処理し、一つのバイオリアクタはある量のフィブロネクチンで２回処理し（２×ＦＮ）、一つのバイオリアクタは血小板溶解物で処理し、また一つのバイオリアクタは上記で述べた方法に従って血漿で処理した。第０日に、約３×１０^６の間葉幹細胞を各バイオリアクタに装填した。該細胞を７日間増殖させた。第３日および第５日にＥＣ培地およびＩＣ培地を交換し、第７日に細胞を回収して計数した。

図４から分かるように、１×フィブロネクチンまたは２×フィブロネクチンで処理されたバイオリアクタは最も高い細胞増殖を生じた。しかし、血小板用怪物および血漿で処理された膜上で増殖された細胞もまた、培養において良好な増殖を示した。

上記に提示された実施例は、本発明の原理に従って利用できるであろう幾つかの応用であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲を限定することを意味するものではない。

Claims (5)

1. バイオリアクタ（１０）における膜表面への間葉幹細胞（ＭＳＣ）の付着を促進する方法であって：
   下記を含んでなるバイオリアクタ（１０）を準備することと；
   ・ハウジング（１４）；および
   ・キャピラリー内側空間表面およびキャピラリー外側空間表面を有する中空糸半透膜ポリマー膜（１２）であって、該ポリマー膜（１２）は少なくとも一つの疎水性ポリマーおよび少なくとも一つの親水性ポリマーを含んでなるポリマー膜
   前記ポリマー膜のキャピラリー内側空間表面を、該ポリマー膜表面への細胞付着を改善するために充分な量の、血小板溶解物を含む第一の表面処理剤で処理すること
   を含んでなる方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記ポリマー膜のキャピラリー内側空間表面を処理する工程が、更に、前記第一の表面処理剤とは異なる第二の表面処理剤で前記膜表面を処理することを含んでなる方法。
3. 細胞をエクスビボで培養するための細胞培養システムであって：
   ハウジング（１４）；および
   該ハウジング（１４）の内側のポリマー膜（１２）
   を備えてなるバイオリアクタを含んでなり、
   前記ポリマー膜は、該膜への細胞付着を改善するために十分な量の血小板溶解物で処理されている
   システム。
4. 請求項３に記載のシステムであって、前記ポリマー膜が中空ファイバ膜であるシステム。
5. 請求項３に記載のシステムであって、前記ポリマー材料は少なくとも一つの疎水性ポリマーおよび少なくとも一つの親水性ポリマーを含んでなるシステム。
   

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