JP5512536B2 - トウゴマ植物由来種子優先遺伝子プロモーター - Google Patents
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Description
優先権の主張
本出願は、２００７年１２月４日に出願の米国特許仮出願第６０／９９２，２７３号「Ｓｅｅｄ−Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃａｓｔｏｒ Ｐｌａｎｔ．」の出願日の利益を主張する。
本出願は、２００７年１２月４日に出願の米国特許仮出願第６０／９９２，２７３号「Ｓｅｅｄ−Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃａｓｔｏｒ Ｐｌａｎｔ．」の出願日の利益を主張する。
連邦支援研究または開発に関する陳述
本明細書に記載する研究は、一部にエネルギー省からの賞金に支援を受けた；賞金番号ＤＥ−ＦＣ０７−０１ＩＤ１４２１３。合衆国政府は本発明にある種の権利を有する可能性がある。
本明細書に記載する研究は、一部にエネルギー省からの賞金に支援を受けた；賞金番号ＤＥ−ＦＣ０７−０１ＩＤ１４２１３。合衆国政府は本発明にある種の権利を有する可能性がある。
本発明は、他のヌクレオチド配列の発現を推進することができるヌクレオチド配列に関する。
組換え植物を作製するために重要な考慮すべき事柄は、導入遺伝子発現を推進するのに適切な活性を示す遺伝子プロモーターの使用である。プロモーターは、遺伝子発現のレベルだけではなく、発現の時機および組織特異性も制御することができる。
特定の産業上の有用性を有する脂肪酸を生産するために使用することができる産業的油料種子作物の開発に関心がもたれている。トウゴマ植物（リキヌスコンムニス（Ricinus communis））は、その長い歴史を持つヒマシ油を得るための栽培のためにこの点に関して特に興味深い。したがって、トウゴマおよび他の植物の遺伝子導入亜種の作製に使用するためのトウゴマ由来のプロモーターがあれば、当技術分野の前進になると考えられる。
本発明の例となる実施形態には、配列番号：９もしくは配列番号：１０の配列に少なくとも約９０％相同性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、ベクター、細胞、植物、および／または種子が含まれる。
本発明の追加の例となる実施形態には、配列番号：９もしくは配列番号：１０の配列に少なくとも約９０％相同性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたヌクレオチド配列に作動可能（operably linked）に連結された、目的のヌクレオチド配列（nucleotide sequence of interest）を含むヌクレオチド配列、ベクター、細胞、植物、および／または種子が含まれる。
本発明の追加の例となる実施形態は、目的のヌクレオチド配列によりコードされた分子の発現を促進する方法であって、請求項１に記載の単離されたヌクレオチド配列を目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結することを含む方法を含む。
本発明の追加の例となる実施形態は、細胞中で目的のヌクレオチド配列にコードされた分子を産生する方法であって、請求項１に記載の単離されたヌクレオチド配列を目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結すること、作動可能に連結されたヌクレオチド配列を細胞に供給する（providing）こと、および目的のヌクレオチド配列を発現させることを含む方法を含む。
本発明の追加の例となる実施形態は、細胞中で標的（target）の発現を調節する方法であって、ヌクレオチド配列が細胞中で標的の発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡをコードする目的のヌクレオチド配列を提供すること、請求項１に記載の単離されたヌクレオチド配列を目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結すること、作動可能に連結されたヌクレオチド配列を細胞に供給すること、および目的のヌクレオチド配列を発現させることを含む方法を含む。
本発明は、他のヌクレオチド配列の発現を促進することができるヌクレオチド配列に関する。本発明の一態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたヌクレオチド配列を提供する。本発明の追加の態様では、そのような配列はプロモーターとして作用することができる。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを含む細胞を提供する。当業者に明らかであるように、細胞は、ヌクレオチド配列および／またはベクターの宿主となり得る（capable of harboring）どんな種類の細胞でも可能である。本発明に従って有用な細胞の例には、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、生殖系細胞、種子細胞、シロイヌナズナ細胞、ヒマワリ細胞、ワタ細胞、ナタネ細胞、トウモロコシ細胞、ヤシ細胞、タバコ細胞、ピーナッツ細胞、ダイズ細胞、およびトウゴマ細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列を含む植物を提供する。本発明に従って有用な植物の例には、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、ダイズ、シロイヌナズナ属（Arabidopsis sp.）およびトウゴマ属（Ricinus sp.）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列を含む種子を提供する。本発明に従って有用な種子の例には、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、ダイズ、シロイヌナズナ属およびトウゴマ属由来の種子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列に作動可能に連結された、目的のヌクレオチド配列（a nucleotide sequence of interest）を提供する。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列に作動可能に連結された、目的のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列に作動可能に連結された、目的のヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列に作動可能に連結された、目的のヌクレオチド配列を含むベクターを含む細胞を提供する。当業者に明らかであるように、細胞は、ヌクレオチド配列の宿主となり得るどんな種類の細胞でも可能である。本発明に従って有用な細胞の例には、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、生殖系細胞、種子細胞、ヒマワリ細胞、ワタ細胞、ナタネ細胞、トウモロコシ細胞、ヤシ細胞、タバコ細胞、ピーナッツ細胞、ダイズ細胞、シロイヌナズナ属細胞、およびトウゴマ属細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列に作動可能に連結された、目的のヌクレオチド配列を含む植物を提供する。本発明に従って有用な植物の例には、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、ダイズ、シロイヌナズナ属およびトウゴマ属が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の追加の態様は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列に作動可能に連結された、目的のヌクレオチド配列を含む種子を提供する。本発明に従って有用な種子の例には、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、ダイズ、シロイヌナズナ属およびトウゴマ属由来の種子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
当業者には明らかであるように、目的のヌクレオチド配列は、発現させたいと思うどんなヌクレオチド配列でもよい。目的のヌクレオチド配列の例には、タンパク質、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、マーカー、レポーター、酵素、シグナル伝達分子、脂肪酸合成、分解、貯蔵、および／または調節に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、脂肪酸合成、分解、貯蔵、および／または調節に関与するタンパク質をコードするＲＮＡに標的されたアンチセンスＲＮＡ、ならびに脂肪酸合成、分解、貯蔵、および／または調節に関与するタンパク質をコードするＲＮＡに標的されたｓｉＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の追加の態様は、目的のヌクレオチド配列を発現する方法を提供する。そのような方法の一例は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列に目的のヌクレオチド配列を作動可能に連結すること、ならびに目的のヌクレオチド配列を発現させることを含む。
当業者には明らかであるように、目的のヌクレオチド配列を発現させることは、一般に、作動可能に連結されたヌクレオチド配列に目的のヌクレオチド配列の発現を可能にする環境を提供する、または、作動可能に連結されたヌクレオチド配列を目的のヌクレオチド配列の発現を可能にする環境に供給することに関係する。目的のヌクレオチド配列の発現を可能にする環境の例は、当技術分野では一般に知られており、インビトロ転写キット、ＰＣＲ反応、細胞、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、生殖系細胞、種子細胞、ヒマワリ細胞、ワタ細胞、ナタネ細胞、トウモロコシ細胞、ヤシ細胞、タバコ細胞、ピーナッツ細胞、ダイズ細胞、シロイヌナズナ属細胞、およびトウゴマ属細胞などの、しかしこれらに限定されることはない、少なくとも１つのｄＮＴＰおよびポリメラーゼを有するどんな環境でも挙げられるが、これらに限定されるものではない。
当業者により認識されるように、作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、当技術分野で既知のどんな手順でも使用して発現させる環境に供給してよい。そのような方法の例には、たとえば、リポフェクチンもしくはリポフェクタミン、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介導入を使用するトランスフェクション（たとえば、Ｃｈｉｓｔｏｕ（１９９６）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、１：４２３〜４３２頁；およびＨｏｏｙｋａａｓとＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ（１９９２）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、１９：１５〜３８頁参照）、フローラルディップ（たとえば、ＣｌｏｕｇｈとＢｅｎｔ（１９９８）、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１６（６）７３５〜７４３頁参照）、エレクトロポレーション（たとえば、ＳｈｉｇｅｋａｗａとＤｏｗｅｒ（１９８８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：７４２頁；Ｍｉｌｌｅｒ、ら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：８５６〜８６０頁；およびＰｏｗｅｌｌ、ら（１９８８）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５４：６５５〜６６０頁参照）、直接ＤＮＡ取込み機構（たとえば、ＭａｎｄｅｌとＨｉｇａ（１９７２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５３：１５９〜１６２頁；Ｄｉｔｙａｔｋｉｎ、ら（１９７２）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２８１：３１９〜３２３頁；Ｗｉｇｌｅｒ、ら（１９７９）、Ｃｅｌｌ、１６：７７頁；およびＵｃｈｉｍｉｙａ、ら（１９８２）、Ｉｎ：Ｐｒｏｃ．５ｔｈ Ｉｎｔｌ．Ｃｏｎｇ．Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ａ．Ｆｕｊｉｗａｒａ（編）、Ｊａｐ．Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｔｏｋｙｏ、５０７〜５０８頁参照）、融合機構（たとえば、Ｕｃｈｉｄａｚ、ら（１９８０）、Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｉｎｔｏ Ｖｉａｂｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｂａｓｅｒｇａら（編）Ｗｉｓｔａｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、１：１６９〜１８５頁参照）；感染病原体（Ｆｒａｌｅｙ、ら（１９８６）、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、４：１〜４６頁；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２６：４０１〜４０９頁参照）；マイクロインジェクション機構（たとえば、Ｃｒｏｓｓｗａｙ、ら（１９８６）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２０２：１７９〜１８５頁参照）；ならびに高速噴出性機構（たとえば、ＥＰＯ ０４０５６９６ ｔｏ Ｍｉｌｌｅｒ、Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔ、ＳｋｏｋｕｔとＧｏｕｌｄ、（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）参照）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の特定の実施形態は、種子優先（seed preferred）の形で目的のヌクレオチド配列を発現する方法を提供する。そのような方法の一例は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列に目的のヌクレオチド配列を作動可能に連結すること、作動可能に連結されたヌクレオチド配列を直接的にまたは間接的に種子細胞に供給すること、ならびに目的のヌクレオチド配列の発現を可能にすることを含む。
本発明の他の実施形態は、標的タンパク質のレベルを低下させる方法を提供する。そのような方法の一例は、標的タンパク質をコードするＲＮＡに結合することができるアンチセンスＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を提供すること、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列にアンチセンスＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結すること、ならびにアンチセンスＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含む。
本発明の他の態様は、種子優先の形で標的タンパク質のレベルを低下させる方法を提供する。そのような方法の一例は、標的タンパク質をコードするＲＮＡに結合することができるアンチセンスＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を提供すること、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列にアンチセンスＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結すること、作動可能に連結されたヌクレオチド配列を直接的にまたは間接的に種子細胞に供給すること、ならびにアンチセンスＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含む。
本発明の追加の態様は、種子の脂肪酸含有量を変化させる方法を提供する。そのような方法の一例は、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列に脂肪酸合成、分解、貯蔵、および／または調節に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結すること、作動可能に連結されたヌクレオチド配列を直接的にまたは間接的に種子細胞に供給すること、ならびに目的のヌクレオチド配列の発現を可能にすることを含む。脂肪酸合成、分解、貯蔵、および／または調節に関与するタンパク質の例には、ＡＣＣアーゼ、ＦＡＳ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、ＫＡＳＩＩＩ、Ｆａｄ２、およびＦａｄ３が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
種子の脂肪酸含有量を変化させる方法の追加の例は、脂肪酸合成、分解、貯蔵、および／または調節に関与するタンパク質をコードするＲＮＡに結合することができるアンチセンスＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を提供すること、配列番号：９および配列番号：１０から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％同一性、少なくとも約７０％同一性、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約９０％同一性、または少なくとも約９５％同一性を有する単離されたヌクレオチド配列にアンチセンスＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結すること、作動可能に連結されたヌクレオチド配列を直接的にまたは間接的に種子細胞に供給すること、ならびにアンチセンスＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含む。
本明細書で使用するように、「プロモーター」とは、一般に転写開始部位の上流にある、転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与するＤＮＡの領域のことである。プロモーターはエンハンサーおよびリプレッサーを含んでいてよい。
本明細書で使用するように、「作動可能に連結された」とは、意図する形で機能するようにヌクレオチド配列が結合されることである。「作動可能に連結された」配列は、直接隣接していてもしていなくてもよい。たとえば、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーターは、それが目的のヌクレオチド配列の発現を推進することができる形で結合され配置されることが可能である。
本発明は以下の実施例においてさらに説明されるが、この実施例は説明のために提供されるものであり、いかなる形でも本発明を限定するためのものではない。
［実施例１］
プロモーター単離
レグミン様（「５４−ＳＳＰ」）およびオレオシンタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子アノテーションが既知遺伝子への配列に基づく相同性を使用して実現された無作為ｃＤＮＡ塩基配列決定プロジェクトを通して同定された。これらの選択された遺伝子のためのプロモーターは、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ．）を製造元の指示書に従って使用して、ＰＣＲベースの「ゲノムウォーキング」を介して単離された。この技法では、配列が既知の短いオリゴヌクレオチドアダプター分子が、いくつかの異なる平滑末端切断制限酵素ですでに消化されたトウゴマゲノムＤＮＡの末端に先ずライゲートされた。一次ＰＣＲ反応は、アダプター分子にアニールする順方向ＰＣＲプライマーおよび５４−ＳＳＰまたはオレオシン遺伝子のコード領域内のＤＮＡに特異的にアニールする逆方向ＰＣＲプライマーを使用して実施された。次に、ネステッドプライマーを使用する第２順目のＰＣＲは、これも既知のアダプターおよび遺伝子特異的配列に基づいて、実施された。この戦略を使用して、選択されたコード配列から上流のＤＮＡ配列が単離され、クローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）に挿入され、塩基配列決定された。この過程で使用されるプライマーを以下に示す。
５４−ＳＳＰプライマー
一次ＰＣＲ反応プライマー
アダプタープライマー１（順方向プライマー）：5’GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3’（配列番号：１）
５４−ＳＳＰプライマーＢ（逆方向プライマー）：5’GAG AGC AGC GAA GAA GGC TGA ACC ATA G 3’（配列番号：２）
ネステッドＰＣＲ反応プライマー
ネステッドアダプタープライマー２（順方向プライマー）：5’ACT ATA GGG CAC GCG TGG T 3’（配列番号：３）
５４−ＳＳＰプライマーＡ（逆方向プライマー）：5’GAG AGC CAT GGA AGA GAA CAA GTA GGA A 3’（配列番号：４）
オレオシンプライマー
一次ＰＣＲ反応プライマー
アダプタープライマー１（順方向プライマー）：5’GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3’（配列番号：５）
オレオシンプライマーＢ（逆方向プライマー）：5’ATA GGC TTG CAG AAT CAG AGC TTC TGG TTA 3’（配列番号：６）
ネステッドＰＣＲ反応プライマー
ネステッドアダプタープライマー２（順方向プライマー）：5’ACT ATA GGG CAC GCG TGG T 3’（配列番号：７）
オレオシンプライマーＡ（逆方向プライマー）：5’GGT GAC TAA CAA CCG GTG ATT GTT GAT GCT 3’（配列番号：８）
プロモーター単離
レグミン様（「５４−ＳＳＰ」）およびオレオシンタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子アノテーションが既知遺伝子への配列に基づく相同性を使用して実現された無作為ｃＤＮＡ塩基配列決定プロジェクトを通して同定された。これらの選択された遺伝子のためのプロモーターは、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ．）を製造元の指示書に従って使用して、ＰＣＲベースの「ゲノムウォーキング」を介して単離された。この技法では、配列が既知の短いオリゴヌクレオチドアダプター分子が、いくつかの異なる平滑末端切断制限酵素ですでに消化されたトウゴマゲノムＤＮＡの末端に先ずライゲートされた。一次ＰＣＲ反応は、アダプター分子にアニールする順方向ＰＣＲプライマーおよび５４−ＳＳＰまたはオレオシン遺伝子のコード領域内のＤＮＡに特異的にアニールする逆方向ＰＣＲプライマーを使用して実施された。次に、ネステッドプライマーを使用する第２順目のＰＣＲは、これも既知のアダプターおよび遺伝子特異的配列に基づいて、実施された。この戦略を使用して、選択されたコード配列から上流のＤＮＡ配列が単離され、クローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）に挿入され、塩基配列決定された。この過程で使用されるプライマーを以下に示す。
５４−ＳＳＰプライマー
一次ＰＣＲ反応プライマー
アダプタープライマー１（順方向プライマー）：5’GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3’（配列番号：１）
５４−ＳＳＰプライマーＢ（逆方向プライマー）：5’GAG AGC AGC GAA GAA GGC TGA ACC ATA G 3’（配列番号：２）
ネステッドＰＣＲ反応プライマー
ネステッドアダプタープライマー２（順方向プライマー）：5’ACT ATA GGG CAC GCG TGG T 3’（配列番号：３）
５４−ＳＳＰプライマーＡ（逆方向プライマー）：5’GAG AGC CAT GGA AGA GAA CAA GTA GGA A 3’（配列番号：４）
オレオシンプライマー
一次ＰＣＲ反応プライマー
アダプタープライマー１（順方向プライマー）：5’GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3’（配列番号：５）
オレオシンプライマーＢ（逆方向プライマー）：5’ATA GGC TTG CAG AAT CAG AGC TTC TGG TTA 3’（配列番号：６）
ネステッドＰＣＲ反応プライマー
ネステッドアダプタープライマー２（順方向プライマー）：5’ACT ATA GGG CAC GCG TGG T 3’（配列番号：７）
オレオシンプライマーＡ（逆方向プライマー）：5’GGT GAC TAA CAA CCG GTG ATT GTT GAT GCT 3’（配列番号：８）
この様な形で得られるプロモーターフラグメントの配列が決定されると、特定のクローニング部位がプライマー配列に組み込まれている追加のＰＣＲ産物を作製して発現ベクター構築を促進することが可能であった。
５４−ＳＳＰプロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列（５４−ＳＳＰ開始コドンの直前を先行する１１２４塩基対）は配列番号：９に見出される。
オレオシンプロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列（オレオシン開始コドンの直前を先行する５２８塩基対）は配列番号：１０に見出される。オレオシンプロモーターの試験のために使用されるクローンは、位置２３４のＴがＡで置き換えられているＰＣＲ作製配列エラーを有していたことは注意すべきである。
［実施例２］
プロモーターの試験
オレオシンおよび５４−ＳＳＰ遺伝子プロモーターの活性を、レポーター遺伝子緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用して、植物全体（シロイヌナズナ）において試験した。ＣｏｐＧＦＰ遺伝子の上流にオレオシンまたは５４−ＳＳＰプロモーターのある発現カセット（Ｅｖｒｏｇｅｎ）を有し、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター領域が続くシロイヌナズナ形質転換のためのバイナリーベクターを構築した。以下のベクター、すなわちＣｏｐＧＦＰレポーター遺伝子に作動可能に連結されたｐＤＯＷ２７７１−５４−ＳＳＰプロモーターおよびＣｏｐＧＦＰレポーター遺伝子に作動可能に連結されたｐＤＯＷ２７７２−オレオシンプロモーターのマップは図１に示されている。
プロモーターの試験
オレオシンおよび５４−ＳＳＰ遺伝子プロモーターの活性を、レポーター遺伝子緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用して、植物全体（シロイヌナズナ）において試験した。ＣｏｐＧＦＰ遺伝子の上流にオレオシンまたは５４−ＳＳＰプロモーターのある発現カセット（Ｅｖｒｏｇｅｎ）を有し、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター領域が続くシロイヌナズナ形質転換のためのバイナリーベクターを構築した。以下のベクター、すなわちＣｏｐＧＦＰレポーター遺伝子に作動可能に連結されたｐＤＯＷ２７７１−５４−ＳＳＰプロモーターおよびＣｏｐＧＦＰレポーター遺伝子に作動可能に連結されたｐＤＯＷ２７７２−オレオシンプロモーターのマップは図１に示されている。
シロイヌナズナ植物はフローラルディップ法により形質転換された（ＣｌｏｕｇｈとＢｅｎｔ（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、１６：７３５〜７４３頁）。バイナリーベクターは、除草剤グルホシネート上での形質転換体の選択を可能にするホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinothricin acetyltransferase）（ＰＡＴ）遺伝子を含有していた。プロモーターが主として種子中で活性であるかどうかを判定するために、葉、発生中の長角果（siliques）、および成熟種子を含む第１世代（Ｔ１）形質転換体からある種の組織を収穫した。これらの組織は下に記載されるＣｏｐＧＦＰ蛍光について試験された。Ｔ１植物由来の種子を植え付けてＴ２植物を作製し、このＴ２植物からも葉、発生中の長角果、および成熟種子試料が採取され分析された。組織試料は、以下のＣｏｐＧＦＰアッセイ法により分析された。
ＣｏｐＧＦＰアッセイ：組織試料は、組織ホモジナイザーにおいて１分間、１ＸＣＣＬＲ緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）と、Ｈ３ＰＯ４、１０ｍＭ ＣＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロールおよび５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とを含有するＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ５Ｘ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｒｏｐ．、カタログ番号Ｅ１５３Ａ））中で粉砕した。試料は、さらに使用するまでドライアイス上に置いた。抽出物は４℃で１５分間１４Ｋ×ｇで遠心分離した。上澄み液を別のチューブに移してさらなる分析のために使用した。各上澄み２００μｌをＣｏｓｔａｒ９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、カタログ番号３９１５）上に置き、蛍光はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。ＣｏｐＧＦＰを発現している大腸菌（E.coli）系統を含有する培養物を標準として使用した。組織抽出物のタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．；カタログ番号２３２２５）を使用して決定した。蛍光はｍｇのタンパク質あたりの蛍光として表した。実験はすべて重複して実施した。
これらの実験結果は図２および図３に示されている。５４−ＳＳＰプロモーターでもオレオシンプロモーターでも、植物葉材料中よりも種子中のほうにはるかに多くの活性が存在していた。発生中の長角果は栄養組織と発生中の種子の両方を含有しており、これらの組織中のプロモーターの活性は、葉組織と成熟種子中のプロモーターの活性の間であった。
オレオシンプロモーターの追加試験は、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用して、シロイヌナズナ植物中で実施した。これらの実験結果も、種子中のほうがオレオシンプロモーターのより高い活性を示していた。
［実施例３］
脂肪酸合成遺伝子の調節のためのベクター
脂肪酸合成タンパク質の調節のためのベクターは、実施例２において概説した通りに作製される。５４−ＳＳＰプロモーターの制御下にある脂肪酸合成タンパク質をコードする以下のベクター、すなわち
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ２− Ｆａｄ２遺伝子に作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ３− Ｆａｄ３遺伝子に作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター；および
ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ− ＫＡＳＩＩ遺伝子に作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター
が作製される。
脂肪酸合成遺伝子の調節のためのベクター
脂肪酸合成タンパク質の調節のためのベクターは、実施例２において概説した通りに作製される。５４−ＳＳＰプロモーターの制御下にある脂肪酸合成タンパク質をコードする以下のベクター、すなわち
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ２− Ｆａｄ２遺伝子に作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ３− Ｆａｄ３遺伝子に作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター；および
ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ− ＫＡＳＩＩ遺伝子に作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター
が作製される。
オレオシンプロモーターの制御下にある脂肪酸合成タンパク質をコードする以下のベクター、すなわち
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ２− Ｆａｄ２遺伝子に作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ３− Ｆａｄ３遺伝子に作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；および
ｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ− ＫＡＳＩＩ遺伝子に作動可能に連結されたオレオシンプロモーター
が作製される。
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ２− Ｆａｄ２遺伝子に作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ３− Ｆａｄ３遺伝子に作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；および
ｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ− ＫＡＳＩＩ遺伝子に作動可能に連結されたオレオシンプロモーター
が作製される。
５４−ＳＳＰプロモーターの制御下にある脂肪酸合成タンパク質に対するアンチセンス分子をコードする以下のベクター、すなわち
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ２：ＡＳ− Ｆａｄ２ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター；
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ３：ＡＳ− Ｆａｄ３ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター；および
ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ：ＡＳ− ＫＡＳＩＩ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター
が作製される。
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ２：ＡＳ− Ｆａｄ２ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター；
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ３：ＡＳ− Ｆａｄ３ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター；および
ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ：ＡＳ− ＫＡＳＩＩ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター
が作製される。
オレオシンプロモーターの制御下にある脂肪酸合成タンパク質に対するアンチセンス分子をコードする以下のベクター、すなわち
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ２：ＡＳ− Ｆａｄ２ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ３：ＡＳ− Ｆａｄ３ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；および
ｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ：ＡＳ− ＫＡＳＩＩ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター
が作製される。
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ２：ＡＳ− Ｆａｄ２ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ３：ＡＳ− Ｆａｄ３ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；および
ｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ：ＡＳ− ＫＡＳＩＩ ＲＮＡに対するアンチセンスに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター
が作製される。
脂肪酸合成タンパク質に対するｓｉＲＮＡ分子をコードするベクターが作製される。ｓｉＲＮＡ分子は、自己とハイブリダイズして、一本鎖ループ領域および塩基対合ステムを含むヘアピン構造を形成するＲＮＡ分子を発現するように設計され得る。塩基対合ステム領域は、その発現が阻害されることになる遺伝子をコードする内在性メッセンジャーＲＮＡのすべてまたは一部分に対応するセンス配列、およびセンス配列に完全にまたは部分的に相補的なアンチセンス配列を含む。したがって、分子の塩基対合ステム領域が一般にＲＮＡ干渉の特異性を決定する。これらのヘアピンＲＮＡ分子は、内在性遺伝子の発現を阻害するのに高度に効率的であり、これらの分子が誘導するＲＮＡ干渉は次世代に受け継がれる。たとえば、ＣｈｕａｎｇとＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５９８５〜５９９０頁；Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋら（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７２３〜１７３１頁；およびＷａｔｅｒｈｏｕｓｅとＨｅｌｌｉｗｅｌｌ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：２９〜３８頁を参照されたい。ｈｐＲＮＡ干渉を使用して遺伝子の発現を阻害するまたは発現停止させるための方法は、たとえば、ＣｈｕａｎｇとＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５９８５〜５９９０頁；Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋら（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７２３〜１７３１頁；ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅとＨｅｌｌｉｗｅｌｌ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５：２９〜３８頁；Ｐａｎｄｏｌｆｉｎｉら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：７頁、および米国特許出願公開第２００３０１７５９６５号に記載されている。インビボで遺伝子発現を発現停止にするヘアピンＲＮＡ構築物の効率についての過渡的アッセイは、Ｐａｎｓｔｒｕｇａら（２００３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３０：１３５〜１５０頁により記載されている。
５４−ＳＳＰプロモーターの制御下にある脂肪酸合成タンパク質に対するｓｉＲＮＡ分子をコードする以下のベクター、すなわち
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ２：ｓｉ− Ｆａｄ２ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター；
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ３：ｓｉ− Ｆａｄ３ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター；および
ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ：ｓｉ− ＫＡＳＩＩ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター
が作製される。
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ２：ｓｉ− Ｆａｄ２ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター；
ｐＳＳＰ：Ｆａｄ３：ｓｉ− Ｆａｄ３ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター；および
ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ：ｓｉ− ＫＡＳＩＩ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結された５４−ＳＳＰプロモーター
が作製される。
オレオシンプロモーターの制御下にある脂肪酸合成タンパク質に対するアンチセンス分子をコードする以下のベクター、すなわち
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ２：ｓｉ− Ｆａｄ２ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ３：ｓｉ− Ｆａｄ３ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；および
ｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ：ｓｉ− ＫＡＳＩＩ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター
が作製される。
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ２：ｓｉ− Ｆａｄ２ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；
ｐＯｌｅｏ：Ｆａｄ３：ｓｉ− Ｆａｄ３ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター；および
ｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ：ｓｉ− ＫＡＳＩＩ ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに作動可能に連結されたオレオシンプロモーター
が作製される。
［実施例４］
シロイヌナズナおよびトウゴマ栽培および形質転換
シロイヌナズナおよびトウゴマは通常の条件下で栽培される。ベクターは、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウムツメファシエンス系統ＧＶ３１０１ ｐＭＰ９０に導入され、フローラルディップ法によりシロイヌナズナおよびトウゴマを形質転換するのに使用される（Ｎ．Ｂｅｃｈｔｏｌｄ、Ｊ．Ｅｌｌｉｓ、とＧ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ（１９９３）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ ３１６、１１９４〜１１９８頁）。ベクターは、高速粒子および感染病原体も使用して導入される。形質転換は、最初の開花の約５日後に実施される。
シロイヌナズナおよびトウゴマ栽培および形質転換
シロイヌナズナおよびトウゴマは通常の条件下で栽培される。ベクターは、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウムツメファシエンス系統ＧＶ３１０１ ｐＭＰ９０に導入され、フローラルディップ法によりシロイヌナズナおよびトウゴマを形質転換するのに使用される（Ｎ．Ｂｅｃｈｔｏｌｄ、Ｊ．Ｅｌｌｉｓ、とＧ．Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ（１９９３）Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ ３１６、１１９４〜１１９８頁）。ベクターは、高速粒子および感染病原体も使用して導入される。形質転換は、最初の開花の約５日後に実施される。
［実施例５］
シロイヌナズナおよびトウゴマの種子中の脂肪酸含有量の決定
脂肪酸分析：種子はメチル化され（１ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ、メタノール、Ｓｕｐｅｌｃｏ、８０℃で１時間）、ヘキサンで抽出され、トリメチルシリル化される（１００μｌのＢＳＴＦＡ−ＴＭＣＳ（ビス（トレイメチルシリル）トリフルオロアセトアミドトリメチルシラン）、Ｓｕｐｅｌｃｏ、９０℃で４５分間）。ＢＳＴＦＡ−ＴＭＣＳはエバポレーションにより取り除かれ、試料はヘキサン中に再懸濁される。試料は、５９７３質量選択検出器を装備したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ６８９０ガスクロマトグラフ（ＧＣ／ＭＳ）およびＳｕｐｅｌｃｏＳＰ−２３４０シアノキャピラリーカラム（６０ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍ）上で分析される。注射器は２２５℃に保持され、オーブン温度は変化させ（１５℃／分で１００〜２４０℃に続いて２４０℃で５分間）、およびヘリウム流量は１．１ｍｌ／分である。ピークアイデンティティーの指定は、溶出時間対真正基準に基づいて実施され、その質量スペクトルに基づいて確認される。定量化はＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄケムステーションソフトウェアを使用して実施される。
シロイヌナズナおよびトウゴマの種子中の脂肪酸含有量の決定
脂肪酸分析：種子はメチル化され（１ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ、メタノール、Ｓｕｐｅｌｃｏ、８０℃で１時間）、ヘキサンで抽出され、トリメチルシリル化される（１００μｌのＢＳＴＦＡ−ＴＭＣＳ（ビス（トレイメチルシリル）トリフルオロアセトアミドトリメチルシラン）、Ｓｕｐｅｌｃｏ、９０℃で４５分間）。ＢＳＴＦＡ−ＴＭＣＳはエバポレーションにより取り除かれ、試料はヘキサン中に再懸濁される。試料は、５９７３質量選択検出器を装備したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ６８９０ガスクロマトグラフ（ＧＣ／ＭＳ）およびＳｕｐｅｌｃｏＳＰ−２３４０シアノキャピラリーカラム（６０ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍ）上で分析される。注射器は２２５℃に保持され、オーブン温度は変化させ（１５℃／分で１００〜２４０℃に続いて２４０℃で５分間）、およびヘリウム流量は１．１ｍｌ／分である。ピークアイデンティティーの指定は、溶出時間対真正基準に基づいて実施され、その質量スペクトルに基づいて確認される。定量化はＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄケムステーションソフトウェアを使用して実施される。
［実施例６］
シロイヌナズナおよびトウゴマにおける脂肪酸合成の調節
Ｆａｄ２を介して脂肪酸合成を調節する３種の方法が比較される（遺伝子発現、アンチセンス発現、ｓｉＲＮＡ発現）。遺伝子抑制の３種の方法を比較するために３種の遺伝子（簡単にスコア化されるので１２−不飽和化酵素ＦＡＤ２および１５−不飽和化酵素ＦＡＤ３、ならびに遺伝子発現における低下の評価のために以前使用されたことがあるのでＦＡＤ２）、他にもβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）ＩＩが選ばれる。これらの酵素と脂肪酸合成間の関係は図４に描かれている。
シロイヌナズナおよびトウゴマにおける脂肪酸合成の調節
Ｆａｄ２を介して脂肪酸合成を調節する３種の方法が比較される（遺伝子発現、アンチセンス発現、ｓｉＲＮＡ発現）。遺伝子抑制の３種の方法を比較するために３種の遺伝子（簡単にスコア化されるので１２−不飽和化酵素ＦＡＤ２および１５−不飽和化酵素ＦＡＤ３、ならびに遺伝子発現における低下の評価のために以前使用されたことがあるのでＦＡＤ２）、他にもβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＡＳ）ＩＩが選ばれる。これらの酵素と脂肪酸合成間の関係は図４に描かれている。
種子はガスクロマトグラフィーによるその組成の再現性のある定量分析を可能にするので、およびピークの指定を特定の脂肪酸として定性的に確証するためのピークの質量分光分析を可能にするので、分析のために種子が選ばれる。スチューデントｔ検定を使用して平均値（平均値あたり１０以上の試料に基づいて）間の差について有意性を特定する。
［実施例７］
ＫＡＳＩＩ発現の調節
色素体中でＫＡＳＩＩは１６Ｃを１８Ｃ脂肪酸へ伸長する。ＫＡＳＩＩでは、１６：０プラス１６：１脂肪酸（ＫＡＳＩＩの基質）のレベルが産物１８：０および１８：１プラス代謝物１８：２および１８：３のレベルと比較される。
ＫＡＳＩＩ発現の調節
色素体中でＫＡＳＩＩは１６Ｃを１８Ｃ脂肪酸へ伸長する。ＫＡＳＩＩでは、１６：０プラス１６：１脂肪酸（ＫＡＳＩＩの基質）のレベルが産物１８：０および１８：１プラス代謝物１８：２および１８：３のレベルと比較される。
野生型シロイヌナズナおよびトウゴマは、ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ、ｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ、ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ：ＡＳ、ｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ：ＡＳ、ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ：ｓｉ、またはｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ：ｓｉで形質転換された系統と比較される。ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩおよびｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩベクターを宿す植物は、Ｃ１８および高級脂肪酸における対応する増加とともに１６：０脂肪酸に有意な減少を示す。ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ：ＡＳ、ｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ：ＡＳ、ｐＳＳＰ：ＫＡＳＩＩ：ｓｉ、およびｐＯｌｅｏ：ＫＡＳＩＩ：ｓｉベクターを宿す植物は、Ｃ１８および高級脂肪酸における対応する減少とともに１６：０脂肪酸に有意な増加を示す。
［実施例８］
ＦＡＤ２発現の調節
ＦＡＤ２では、１８：１脂肪酸（ＦＡＤ２の基質）のレベルがその産物１８：２および代謝物１８：３のレベルと比較される。分析では、１８：２は１８：３と合わされて、ＦＡＤ２により不飽和化されている全脂肪酸割合を得る。
ＦＡＤ２発現の調節
ＦＡＤ２では、１８：１脂肪酸（ＦＡＤ２の基質）のレベルがその産物１８：２および代謝物１８：３のレベルと比較される。分析では、１８：２は１８：３と合わされて、ＦＡＤ２により不飽和化されている全脂肪酸割合を得る。
野生型シロイヌナズナおよびトウゴマは、ｐＳＳＰ：ＦＡＤ２、ｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ２、ｐＳＳＰ：ＦＡＤ２：ＡＳ、ｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ２：ＡＳ、ｐＳＳＰ：ＦＡＤ２：ｓｉ、またはｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ２：ｓｉで形質転換された系統と比較される。ｐＳＳＰ：ＦＡＤ２およびｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ２ベクターを宿す植物は、１８：２および１８：３脂肪酸に有意な増加を示す。ｐＳＳＰ：ＦＡＤ２：ＡＳ、ｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ２：ＡＳ、ｐＳＳＰ：ＦＡＤ２：ｓｉ、およびｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ２：ｓｉベクターを宿す植物は、低次脂肪酸における対応する増加とともに１８：２および１８：３脂肪酸に有意な減少を示す。
［実施例９］
ＦＡＤ３発現の調節
ＦＡＤ３では、１８：１プラス１８：２脂肪酸（１８：２はＦＡＤ３の基質である）のレベルがその産物１８：３のレベルと比較される。
ＦＡＤ３発現の調節
ＦＡＤ３では、１８：１プラス１８：２脂肪酸（１８：２はＦＡＤ３の基質である）のレベルがその産物１８：３のレベルと比較される。
野生型シロイヌナズナおよびトウゴマは、ｐＳＳＰ：ＦＡＤ３、ｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ３、ｐＳＳＰ：ＦＡＤ３：ＡＳ、ｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ３：ＡＳ、ｐＳＳＰ：ＦＡＤ３：ｓｉ、またはｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ３：ｓｉで形質転換された系統と比較される。ｐＳＳＰ：ＦＡＤ３およびｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ３ベクターを宿す植物は、１８：３脂肪酸に有意な増加を示す。ｐＳＳＰ：ＦＡＤ３：ＡＳ、ｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ３：ＡＳ、ｐＳＳＰ：ＦＡＤ３：ｓｉ、およびｐＯｌｅｏ：ＦＡＤ３：ｓｉベクターを宿す植物は、低次脂肪酸における対応する増加とともに１８：３脂肪酸に有意な減少を示す。
本発明はある種の例となる実施形態において記載されたが、本発明は本開示の精神と範囲内においてさらに改変してよい。したがって、本出願は、その一般原則を使用した本発明のどんな異形、使用または改作も含めることを意図している。さらに、本出願は、本発明が関連するおよび添付の特許請求の範囲の限度内に収まる当技術分野の既知のまたは慣行内に入るような本開示からの逸脱を含むことを意図している。
Claims (29)
- 配列番号：９または配列番号：１０の配列に少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
- 配列番号：９または配列番号：１０の配列に少なくとも９０％相同性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸。
- 目的のヌクレオチド配列がタンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡからなるグループから選択される分子をコードする、請求項２に記載の単離された核酸。
- 請求項１に記載の単離された核酸を含むベクター。
- 配列番号：９または配列番号：１０の配列に少なくとも９０％相同性を有するヌクレオチド配列に作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４に記載のベクター。
- 目的のヌクレオチド配列がタンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡからなるグループから選択される分子をコードする、請求項４に記載のベクター。
- 選択可能なマーカーをさらに含む、請求項５に記載のベクター。
- 選択可能なマーカーがホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項７に記載のベクター。
- 請求項１に記載の単離された核酸を導入遺伝子として含む植物種子細胞。
- 請求項１に記載の単離された核酸が細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項９に記載の植物種子細胞。
- 細胞が、シロイヌナズナ属、ヒマワリ、ワタ細胞、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、ダイズ、およびトウゴマ属細胞からなるグループから選択される、請求項９に記載の植物種子細胞。
- 細胞が請求項４に記載のベクターを含む、請求項９に記載の植物種子細胞。
- 請求項１に記載の単離された核酸を導入遺伝子として含む植物。
- 植物がシロイヌナズナ属、ヒマワリ、ワタ細胞、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、ダイズ、およびトウゴマ属からなるグループから選択される、請求項１３に記載の植物。
- 植物が請求項４に記載のベクターを含む、請求項１３に記載の植物。
- 植物が請求項９に記載の細胞を含む、請求項１３に記載の植物。
- 請求項１に記載の単離された核酸を含む種子。
- 種子がシロイヌナズナ属、ヒマワリ、ワタ細胞、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツ、ダイズ、およびトウゴマ属種子からなるグループから選択される、請求項１７に記載の種子。
- 請求項１７に記載の種子であって、該種子から育った植物が請求項４に記載のベクターを含む、種子。
- 請求項１７に記載の種子であって、該種子から育った植物が請求項９に記載の細胞を含む、種子。
- 目的のヌクレオチド配列によりコードされる分子の発現を、種子優先（seed preferred）の形で促進する方法であって、請求項１に記載の単離された核酸を目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結することを含み、種子の細胞中の目的のヌクレオチド配列を発現させる方法。
- 目的のヌクレオチド配列によりコードされる分子が、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡからなるグループから選択される、請求項２１に記載の方法。
- 種子の細胞中で目的のヌクレオチド配列によりコードされる分子を産生する方法であって、および請求項２に記載の核酸を種子細胞に供給すること、および、目的のヌクレオチド配列を発現させること、
を含む方法。 - 目的のヌクレオチド配列によりコードされる分子が、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡからなるグループから選択される、請求項２３に記載の方法。
- 植物種子の細胞中で標的の発現を調節する方法であって、
請求項２に記載の核酸を種子細胞に供給すること、であって、前記目的のヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド又は前記細胞中の標的の発現を調整する事が可能なｓｉＲＮＡをコードし、および種子細胞中の目的のヌクレオチド配列を発現させること、を含む方法。 - 植物細胞が、トウゴマ、シロイヌナズナ、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、トウモロコシ、ヤシ、タバコ、ピーナッツまたはダイズの細胞からなるグループから選択される、請求項２５に記載の方法。
- 標的が遺伝子、オリゴヌクレオチド配列、および／またはタンパク質である、請求項２５に記載の方法。
- 標的が、脂肪酸合成、分解、貯蔵、および／または調節に関与するタンパク質から選択される、請求項２５に記載の方法。
- 標的が、ＡＣＣアーゼ、ＦＡＳ、ＫＡＳＩ、ＫＡＳＩＩ、ＫＡＳＩＩＩ、Ｆａｄ２、およびＦａｄ３からなるグループから選択される、請求項２５に記載の方法。
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