JP5567551B2 - ヘパラナーゼ欠損非ヒト哺乳動物 - Google Patents

Description

本発明は、少なくとも１つの破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子を有する、細胞及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。本発明はさらに、ヘパラナーゼ欠損非ヒト哺乳動物を利用する治療剤候補のスクリーニング方法に関する。

ヘパラナーゼは、細胞表面及び細胞外マトリックスに偏在的に存在するヘパラン硫酸（ＨＳ）プロテオグリカンを特異的に分解する哺乳動物エンド−β−Ｄ−グルクロニダーゼである。ヘパラナーゼ活性は、腫瘍由来細胞の転移能と相互に関連及び原因として関連しており、これは、ＨＳ切断及びＥＣＭ障壁リモデリングの結果として細胞播種が増大することに起因する。同様に、ヘパラナーゼ活性は、血管内皮細胞及び免疫系活性化細胞の移動を伴う新血管形成、炎症及び自己免疫に関与している。さらに、ヘパラナーゼのアップレギュレーションは、癌患者の腫瘍血管増生の増加及び低い術後生存率と相関している。

幾つかの哺乳動物ヘパリン／ＨＳ分解エンドグリコシダーゼの存在に関する初期の報告にもかかわらず、幾つかのグループによる同遺伝子のクローニングは、哺乳動物細胞が主に単一の優性機能ヘパラナーゼを発現することを示している（Ｈｕｌｅｔｔら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９９年、５：８０３〜８０９頁；Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９９年、５：７９３〜８０２頁）。

ヘパラナーゼは、形態形成、発達及び恒常性から炎症、血管新成及び癌転移まで、基本的な生物学的現象に重要な役割を果たすことから、インビボでのヘパラナーゼ研究を可能にする動物モデルが当技術分野で必要とされている。米国特許公報ＵＳ２００２／０１９４６２５は、ヒトヘパラナーゼを過剰発現するトランスジェニックマウス、及び腫瘍発生などの病理学的過程の研究におけるこの使用を開示する。国際特許公報ＷＯ２００４／００６９４９は、発毛のさまざまな側面におけるヘパラナーゼの役割をテストするためのモデル系としての、ヘパラナーゼ過剰発現トランスジェニックマウスの使用を開示する。

ヘパラナーゼの重要及び多面的な役割を考慮すると、ヘパラナーゼ活性を欠く動物は、ヘパラナーゼの役割を綿密に考察するための貴重なツールを提供するであろう。ヘパラナーゼノックアウト動物を作製する、当技術分野で認識されている必要性及び幾つかの試みにもかかわらず、こうした動物は現在入手不可能である。国際特許公報ＷＯ２００５／１１８８０８は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）法による細胞におけるヘパラナーゼ活性のサイレンシングを開示する。あいにく、ｓｉＲＮＡ法は、安定なノックアウト哺乳動物系の作製にも、ヘパラナーゼ活性の完全なサイレンシングにも適さない。

故に、ヘパラナーゼ活性を欠く動物が依然として必要とされている。

本発明は、少なくとも１つの破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。１つの実施形態では、破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子は、プロモーター及びエクソン１を欠く。より具体的には、破壊されたヘパラナーゼ遺伝子は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｘｂａｌフラグメントを欠くことができる。前記哺乳動物は、破壊に対してヘテロ接合又はホモ接合であってよい。

本発明はまた、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物由来の単離細胞も提供する。

さらに、本発明は、少なくとも１つの破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法であって、非ヒト哺乳動物胚性幹細胞での相同組換えによりヘパラナーゼ遺伝子の部分を欠失させるステップと、得られた組換え細胞を単離された胚盤胞に導入するステップと、前記胚盤胞を偽妊娠した非ヒト哺乳動物に移植するステップと、前記移植された胚盤胞がトランスジェニック非ヒト哺乳動物に発達することを可能にするステップと、前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物を飼育して子孫を産生するステップと、前記子孫をスクリーニングして、少なくとも１つの破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を同定するステップとを含む方法を提供する。１つの具体的な実施形態では、ヘパラナーゼ遺伝子の欠失された部分が、配列番号１に示されたヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、ヘパラナーゼコーディング配列の１つのエクソンの少なくとも一部分が、選択可能なマーカー配列に置換されている、ヘパラナーゼノックアウト構築物をコードする核酸配列を含むベクターも提供する。１つの具体的な実施形態では、前記選択可能なマーカー配列はネオマイシン耐性遺伝子を含む。

さらに、本発明は、少なくとも１つの破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップと、前記哺乳動物を疾患刺激に曝露するステップと、前記哺乳動物に前記薬剤候補を投与するステップと、前記疾患刺激により誘導された疾患の発症について前記哺乳動物を分析するステップとを含む、治療剤候補のスクリーニング方法を提供する。具体的な実施形態では、疾患刺激は接種された腫瘍細胞及び炎症刺激から選択され、前記分析は、それぞれ、任意の腫瘍転移の形成を決定又は任意の炎症反応のレベルを決定することを含む。他の実施形態では、前記疾患刺激は実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導する。さらに他の実施形態では、前記疾患刺激はアレルギー反応を誘導する。方法は、野生型非ヒト哺乳動物において得られた対応する結果と、得られた結果を比較することを含むことができる。

以下では本発明が、添付図を参照して好ましい実施形態により、より詳細に記載される。

ヘパラナーゼ（Ｈｐｓｅ）遺伝子（正常な対立遺伝子として表されている）、及びＨｐｓｅ遺伝子の標的妨害用に設計（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）された標的構築物（Ｋ／Ｏ対立遺伝子として表されている）の５’末端の構造を示す図である。相同組換えは、第１エクソン及びプロモーターの除去並びに新遺伝子による置換をもたらす。Ｓｃａ Ｉ又はＥＲｖの制限酵素で処理された遺伝子産物のサイズが示されている。１〜４の番号の付いた黒い線は、サザンブロットスクリーニングに使用することができるプローブを表す。新カセットの方向が示されている。 ＥＲｖによる消化後にＨｐｓｅ＋／−ヘテロ接合マウスの交雑受精胚から抽出されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示す図である。試料は、図１Ａに示されたようなプローブ３とハイブリダイズされた。野生型（ｗｔ）胚は正常な対立遺伝子のみを示し、ヘテロ接合胚は正常及び変異対立遺伝子の両方を示し、Ｈｐｓｅ−ＫＯマウスはより短いＫＯ対立遺伝子のみを示した。 ヘパラナーゼｍＲＮＡ発現のＰＣＲ分析を示す図である。ＲＮＡは、ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯマウスの肺及び脾臓から抽出され、示されたようなＨｐｓｅ遺伝子の異なる領域を増幅するように設計された３つの異なるＰＣＲプライマー対を用いてＰＣＲ増幅に供された。ヘパラナーゼ発現は、ｗｔ由来であるがＨｐｓｅ−ＫＯ由来ではない試料において同定された。Ｌ−１９は、異なる試料間のｍＲＮＡレベルを標準化するためハウスキーピング遺伝子として使用されたリボソーム遺伝子を表す。 ヘパラナーゼ活性アッセイを示す図である。４匹のｗｔマウス及び４匹のＨｐｓｅ−ＫＯマウス由来の血液試料が、硫酸標識ＥＣＭと共にインキュベートされた（１６時間、３７℃、ｐＨ６．２）。インキュベーション培地に放出された標識分解産物は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂでのゲル濾過分析に供された。高ヘパラナーゼ活性はｗｔマウス由来の試料でのみ認められた。ヘパラナーゼ活性がＨｐｓｅ−ＫＯ試料で検出されることはなかった。 ＨＳ分解アッセイを示す図である。ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯマウス由来の肝臓、腎臓及び脾臓組織抽出物がホモジナイズされ、^３Ｈ−アセチル標識ＨＳと共にインキュベートされた（１８時間、３７℃、ｐＨ５．８）。反応混合物は、次いでＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２でのゲルクロマトグラフィーに供された。上のパネルは、ブランク（ピークＩ）及び陽性対照（組換えヘパラナーゼ；ピークＩＩ）インキュベーションを示す。Ｈｐｓｅ−ＫＯ組織抽出物のインキュベーション（線）は、ブランクインキュベーション（上のパネル）と同じ溶出プロファイルをもたらし、検出可能なヘパラナーゼ活性がないことを示した。一方、ｗｔ組織抽出物とのインキュベーションは、組換えヘパラナーゼとのインキュベーションの場合（上のパネル）のようにＨＳ基質の実質的な切断をもたらした（点線）。 ｗｔマウス（点線）対Ｈｐｓｅ−ＫＯマウス（連続線）由来のＨＳの分子構造を示す図である。肝臓（パネルＡ及びＢ）及び腎臓（パネルＣ及びＤ）由来の全ての代謝的に^３５Ｓ標識されたＨＳ鎖が、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムで分析された。パネルＡ及びＣがＨＳＰＧの分子構造を示すのに対し、パネルＢ及びＤは遊離ＨＳ鎖の分子構造を示す。 ｗｔ対Ｈｐｓｅ−ＫＯマウス由来の乳腺の形態的外観を示す図である。３カ月齢の処女マウス由来の乳腺の全載標本はヘマトキシリンで染色された。Ｈｐｓｅ−ＫＯ由来乳腺（下のパネル）は、年齢をマッチさせたｗｔ動物由来の腺（上のパネル）と比べて豊富な分枝及び胞巣状構造を示した。 大動脈輪モデルでの増殖因子誘導性の内皮の発芽を示す図である。Ｈｐｓｅ−ＫＯ及びｗｔマウス由来の大動脈輪が、６日間、ＦＧＦ−２誘導性の血管の発芽に供された。輪は次いで固定され、０．０２％クリスタルバイオレット溶液で染色され、血管の発芽について評価された。より広範な内皮の発芽は、ｗｔ由来の輪（上のパネル）に比べてＨｐｓｅ−ＫＯ由来の輪（下のパネル）で認められた。 マトリゲルプラグアッセイにおける血管新生を示す図である。Ｈｐｓｅ−ＫＯ（下のパネル）及びｗｔ（上のパネル）マウスは、ＦＧＦ−２（８０ｎｇ／ｍｌ）を追加した増殖因子枯渇マトリゲル２００μｌを皮下注射された。７日後、マトリゲルプラグは切除及び撮影され、ホモジナイズされ、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬を用いてヘモグロビン含量について評価された。顕著な血管新生反応が、ｗｔと比べてＨｐｓｅ−ＫＯマウスで認められた（それぞれ、２６±４．８ｍｇ／ｄｌ対５５．５７±７．１８ｍｇ／ｄｌ；ｐ＝０．０００２）。 リアルタイムＰＣＲにより評価されたＨｐｓｅ−ＫＯマウスにおけるＭＭＰ発現を示す図である。ＲＮＡは、ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯマウスの腎臓、肝臓及び乳腺から抽出され、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４及びＭＭＰ−２５の発現を評価するため定量的リアルタイムＰＣＲ分析に供された。ｗｔ組織（白いバー）で各ＭＭＰについて決定された発現レベルは１００％と見なされ、Ｈｐｓｅ−ＫＯ組織（黒いバー）マウスで決定された対応する発現が、これと比較したパーセンテージで表されている。各反応は６回繰り返され、平均±ＳＤが示されている。 ウェスタンブロット分析により決定されたＨｐｓｅ−ＫＯマウスでのＭＭＰ発現を示す図である。肝臓、腎臓及び乳腺組織抽出物が、抗マウスＭＭＰ−２モノクロナール抗体（ｍＡ８０１Ｂ；上のパネル）、抗マウスβ−カテニン（ｍＡｂ６１０１５４；真ん中のパネル）、又は抗マウスａ−チューブリン（Ｂ−５−１−２；下のパネル）を用いたウェスタンブロット分析に供された。 β−カテニン免疫染色を示す図である。パラフィン包埋腎臓試料がβ−カテニンに対する抗体を用いた免疫染色に供された。染色の増加は、ｗｔ由来の腎臓切片と比べてＨｐｓｅ−ＫＯ由来の腎臓切片で観察された。 ヘパラナーゼトランスフェクトＭＤＡ−２３１ヒト乳癌細胞でのＭＭＰ発現を示す図である。ＭＤＡ−２３１細胞は、偽（空ベクター）又は活性若しくは変異不活性ヘパラナーゼ遺伝子をトランスフェクトされた。ｍＲＮＡ発現レベルはリアルタイムＰＣＲにより決定された。偽トランスフェクト細胞で決定された発現レベルは１００％と見なされ、Ｈｐｓｅ及びｍｕｔ−Ｈｐｓｅトランスフェクト細胞でのレベルが、偽トランスフェクト細胞と比較したパーセンテージで表された。図６Ａはヘパラナーゼ発現を示すのに対し、図６ＢはＭＭＰ発現を示す。ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４ ｍＲＮＡのレベルの低下は、ヘパラナーゼ活性型を過剰発現する細胞で認められたが、酵素の２通りの変異、不活性型では認められなかった。 リポ多糖（ＬＰＳ）刺激でのＨｐｓｅ−ＫＯマウスにおける好中球動員の増加を示す図である。成体動物（各群に５匹）は、１００ｍｌのＰＢＳに溶解された１０μｇのＬＰＳを腹腔内注射された。１６時間後、動物は屠殺され、腹膜腔が１０ｍｌのＰＢＳで洗い流され回収された。細胞が計数され、腹膜腔内に見出された合計細胞数で表された。 全皮膚切開後の血管新生反応をまとめた図である。ｈｐａ−ｔｇマウスと共にｗｔ、ｈｓｐｅ−ＫＯマウスは麻酔され、剪毛され、マウスの背中の皮膚に１ｃｍ長の全層切開が行われた。切開口はシアノクリレート接着剤により塞がれ、創傷後１、３、及び７日目にＭＲＩ分析により調べられた。

本発明の目的は、破壊されたヘパラナーゼ遺伝子を有するトランスジェニックノックアウト又はノックダウン細胞系及び動物を提供することである。破壊は、例えば遺伝子発現又は機能性タンパク質の産生に不可欠な位置でヘパラナーゼ遺伝子に変異を導入することにより、ヘパラナーゼ遺伝子の部分的又は完全な機能的不活性化をもたらす。

ヘパラナーゼ遺伝子の破壊は、相同組換え、突然変異誘発、ｃｒｅ／ｌｏｘ技術、アンチセンス技術、及びトランスポゾンレトロトランスポゾン技術などの当技術分野で公知の種々の方法により達成することができる。

相同組換えでは、ノックアウトされる遺伝子は、典型的には、抗生物質耐性（例えばネオマイシン耐性）などの選択可能なマーカーにより妨害される。標的遺伝子の転写ユニットへのマーカーの組み込みは、遺伝子を破壊し、相同組換えを起こした細胞の選択を可能にする。相同組換えに使用するため当技術分野で利用可能な多くの適切なベクターの一例は、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ社から入手可能なＮｅｏｍｙｃｉｎ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ｌｏｘＰ）である。

１つの特定の実施形態では、相同組換えはＨｐｓｅ遺伝子をノックアウトするのに使用された。この目的のために、標的Ｈｐｓｅ遺伝子座と同一の配列を有するＤＮＡに隣接されたネオマイシン耐性カセットを含有するＤＮＡ構築物が、設計及び操作された。非ヒト哺乳動物胚性幹細胞は、次いで線状化構築物をトランスフェクトされ、相同組換えを起こした細胞が、成長培地に抗生物質を添加して選択された。相同組換え幹細胞は、次いで単離胚盤胞に注入され、偽妊娠した非ヒト哺乳動物に移植された。相同組換えによる１つのＨｐｓｅ対立遺伝子の不活性化に続いて、破壊されたＨｐｓｅ遺伝子の両方の対立遺伝子を有する均一なＨｐｓｅノックアウト非ヒト哺乳動物を提供するために、２世代以上の選抜飼育が行われた。

したがって、本発明は、ヘパラナーゼをコードする遺伝子が破壊された、例えば、ラット、モルモット、及び特にマウスなどのげっ歯類を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。結果として、こうした動物は、機能性ヘパラナーゼタンパク質を部分的に又は、好ましくは、完全に欠く。

マウスヘパラナーゼ遺伝子は、ヘパラナーゼを不活性化するために欠失され得る１２個のエクソンから成る。しかし、エクソンの幾つかは該活性にとってあまり必須ではない可能性があり、これらの欠失は、ヘパラナーゼ機能の部分的不活化をもたらすのみである。ヘパラナーゼのこうした不完全な不活化をもたらす欠失は、ノックダウン欠失（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）と呼ぶことができる。単一の構築物で１つを超えるエクソンを欠失させることは、Ｈｐｓｅノックアウト又はノックダウン動物を提供するうえで１つの選択肢である。しかし、この手法の難しさは、欠失される配列の長さの増加に伴い指数関数的に増加する。Ｈｐｓｅノックアウト又はノックダウンマウスの提供に使用するための好ましい構築物は、エクソン２及び３の欠失、エクソン４の欠失、エクソン５から９の欠失、エクソン１０の欠失、エクソン１１の欠失又はエクソン１２の欠失を含むものである。最も好ましい構築物は、プロモーター及びエクソン１の欠失を含む。

１つの特定の実施形態は、プロモーター領域が部分的に欠失、エクソン１が完全に欠失された変異Ｈｐｓｅ遺伝子を有する、トランスジェニックＨｐｓｅノックアウトマウスを提供する。より具体的な実施形態では、Ｈｐｓｅ遺伝子は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｘｂａ Ｉ制限フラグメントを欠き、さらにより具体的な実施形態におけるこのフラグメントは、配列番号１に示されたヌクレオチド配列を有する。こうしたマウスは、機能性ヘパラナーゼが欠損している。

本発明の実施形態は、破壊されたＨｐｓｅ遺伝子を有するトランスジェニックラット及びこの調製方法を提供する。Ｈｐｓｅノックアウト又はノックダウンラットを得る戦略は、マウスでの標的遺伝子破壊に使用されたものと基本的に同じである。簡単には、ヘパラナーゼをコードする遺伝子は、ラットゲノムから特徴付けられる。遺伝子構造に基づき、遺伝子の所望部分を欠失させるために設計された構築物が、適切なプラスミドを用いて確立される。好ましい構築物では、プロモーター領域の部分及びエクソン１が欠失される。１つの特定の実施形態では、２〜３ｋｂの上流隣接配列及び４〜６ｋｂの（エクソン１の）下流配列が、相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）組み込みのためｌｏｘｐ−ｎｅｏ−ｌｏｘｐプラスミドに含められる。ラットｈｐｓｅ遺伝子は５つのエクソンのみを含有し、他の好ましい構築物にはエクソン２の欠失、エクソン３の欠失、エクソン２及び３の欠失、エクソン４の欠失又はエクソン５の欠失を含むものが含まれる。構築物は、遺伝子マッピング及び部分配列決定により確認することができる。構築物は、次いでラットＥＳ細胞に注入され、陽性クローンが、選択された選択可能なマーカーに基づき選択される。陽性クローンは、例えばサザンブロット分析及び／又はＰＣＲによる相同組み込みについてスクリーニングされる。相同組み込みを有するＥＳクローンは、偽妊娠ラットに移植された単離ラット胚盤胞に注入される。最後に、キメラ子孫が生殖細胞系選択のため飼育される。ヘテロ接合動物はホモ接合子孫を得るために同系交配することができる。

別の実施形態では、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）などのトランスポゾンレトロトランスポゾン技術が、トランスジェニック非ヒトＨｐｓｅノックアウト哺乳動物、特にラットを提供するのに使用され得る。

本発明によるトランスジェニックノックアウト又はノックダウン哺乳動物は、さらなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するために、他のトランスジェニック（過剰発現又はノックアウト）非ヒト哺乳動物と交配することができる。

本発明によるトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ヘパラナーゼ欠損哺乳動物細胞系を確立するのに使用することができる。こうした細胞系の確立方法は、当技術分野では容易に利用可能である。好ましい細胞系には、胚性幹細胞及び線維芽細胞系が含まれる。不死化線維芽細胞系は、ヘパラナーゼヌル細胞系として使用しやすい。

Ｈｐｓｅ遺伝子の標的破壊の成功は、当技術分野で公知の方法により分析することができる。例えば、ノーザンブロッティングは、ヘパラナーゼｍＲＮＡ発現のダウンレギュレーションを確認するのに使用することができる。他の方法は、ヘパラナーゼ酵素活性の排除を検証するのに容易に利用可能である。

本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、さまざまな薬剤候補をスクリーニングするのに使用することができる。スクリーニング方法は、疾患刺激への前記哺乳動物の曝露、及び前記哺乳動物への薬剤候補の投与を含み得る。哺乳動物は、次いで疾患刺激により誘導された疾患の発症について分析される。

幾つかの実施形態では、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、例えば、抗ヘパラナーゼ及び／又は抗癌剤候補をスクリーニングするのに使用することができる。典型的なスクリーニングアッセイは、疾患刺激として働く、黒色腫、癌腫又は肝細胞腫細胞などの腫瘍細胞を、Ｈｐｓｅノックアウト動物に接種することを含む。接種後、動物は、異なる用量及び時間間隔で、通常は腹腔内注射、尾静脈注射、経口摂取又は経鼻摂取により、テスト剤で治療される。腫瘍転移（例えば肺又は骨への）形成に対する投与されたテスト剤の影響が次いで評価され、並びに年齢及び性別をマッチさせた野生型及び／又はヘパラナーゼ過剰発現動物で得られた対応する結果と比較され得る。該アッセイは、例えば、テスト剤の有効用量を決定するのに使用することができる。

本発明のトランスジェニック動物では、ヘパラナーゼの欠如は、幾つかのＭＭＰ、特にＭＭＰ２及びＭＭＰ１４のアップレギュレートされた発現により代償される。故に、１つの特定の実施形態は、抗転移候補化合物の特別なクラスである、抗ＭＭＰ剤の治療可能性を評価するための該動物の使用に関する。

ＭＭＰは、多発性硬化症及び炎症を起こした又は損傷した中枢神経系における重要なプレーヤーであることから、本発明の１つの実施形態は、多発性硬化症の治療をテストするためのＨｐｓｅノックアウト動物の使用に関する。この目的のために、多発性硬化症に関する公知の疾患モデル、すなわち実験的自己免疫性脳脊髄炎が、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物をミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）_{３５−５５}ペプチド及び百日咳毒に曝露して使用され得る（Ｓｈａｏら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２００４年、４５：４０６０〜４０６５頁。投与された候補化合物の影響が次いで評価され、麻痺のレベルの低下は治療可能性を示す。

本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、野生型哺乳動物と比較して炎症刺激に対するより強い反応を示し（図７）、したがって、抗炎症剤候補をスクリーニングするのに使用され得る。この目的のために、Ｈｐｓｅノックアウト哺乳動物は、カラゲナン足浮腫（ＣＰＥ）、アジュバント誘発関節炎（ＡＩＡ）、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、マウス耳浮腫、リポ多糖（ＬＰＳ）の腹腔内注射及び空気嚢ラット又はマウスにおける細胞反応分析を含む当技術分野で公知の十分に確立されたインビボ炎症モデルの１つ又は複数を用いて、疾患刺激に曝露することができる。投与された抗炎症剤候補の影響が次いで評価され、炎症反応の低下は抗炎症の可能性を示す。

本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物はまた、創傷治癒剤又は薬剤候補をスクリーニングするのに使用することもできる。１つの実施形態では、スクリーニングアッセイは、ｗｔ及びＨｐｓｅノックアウト動物を麻酔及び剪毛した後、動物の背中の皮膚を切開すること、並びに典型的には１ｃｍ長の全層創傷である切開口を、例えばシアノクリレート接着剤による接着により塞ぐことを含む。創傷治癒は、例えば創傷後１、３、及び７日目に上皮端間の距離を測定して調べることができる。或いは又はさらに、約５ｍｍ^３のポリビニルスポンジなどの適切なスポンジを創傷に挿入し、及び１日など所望の期間の後にスポンジを除去して、創傷液が回収されてよい。創傷液は、次いで遠心分離により抽出され得、液中の炎症因子の量が、例えばウェスタンブロッティングにより分析され得る。創傷組織も、組織切片の調製後、組織学的分析に供することができる。こうした切片は、切開された創傷組織を例えばＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで固定し、固定された組織をパラフィンに包埋し、及び約５μｍのパラフィン切片をカットして調製することができる。パラフィン切片の脱パラフィン及び再水和は、組織学的分析の前に当技術分野で十分に公知の方法により行うことができる。スクリーニングアッセイでテストされる創傷治癒剤候補は、０日目若しくはこれ以降など、任意の所望の時間に創傷に適用されてよく、又はこれらは皮下注射されてよい。

さらに、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、マスト特異的プロテアーゼ（ｍａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の貯蔵の増加を示す。例えば、カルボキシルペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ａ（マウスマスト細胞プロテアーゼ−５及び−６）の貯蔵は、ウェスタンブロット分析により示されたようにＨｐｓｅノックアウトマウスで増加する。この所見は、マスト細胞機能の制御、特にアレルギー反応の調節におけるヘパラナーゼの役割を指し示している。故に、本トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、アレルギー反応を調節するための薬剤候補をスクリーニングするのに使用することができる。ノックアウト哺乳動物は、慢性アレルギーモデルの役割を果たすために曝露され得る。投与された薬剤候補のアレルギー反応に対する影響が次いで評価され、年齢及び性別をマッチさせた野生型及び／又はヘパラナーゼ過剰発現動物で得られた対応する結果と比較され得る。

本発明によるトランスジェニックマウスは、繁殖性であり、正常な寿命を示し、軽度の変化（すなわち、乳腺の過剰分岐、血管新生反応の増大）を別にして顕著な病理学的表現型を示さなかった。脳、心臓、肝臓、肺、腎臓及び脾臓などのさまざまな臓器の組織学的分析は、病理学的変化を示さなかった。故に、ヘパラナーゼをノックアウトすることは、罹患動物をもたらすことはないが、さまざまな生理学的及び病理学的状態におけるヘパラナーゼの役割の綿密な考察、並びに治療剤候補のスクリーニングに対する貴重なツールを提供する。

（例１）
ヘパラナーゼ欠損マウスの作製
ヘパラナーゼ欠損マウスは、ＥＳ細胞における該遺伝子の標的妨害により作製した。最小プロモーター領域（転写開始点の約５００ｂｐ上流）及び第１エクソン全体を欠失させて機能的変異を生成するために、標的ベクターを構築した（図１Ａ）。欠失部分のヌクレオチド配列は配列番号１に示されている。この目的のために、ヘパラナーゼ遺伝子（Ｈｐｓｅ）の５’末端を含有する１５−ｋｂゲノムクローンを、バクテリオファージマウス（株１２９／Ｓｖ）ゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、シダークリーク、ＴＸ）から単離した。エクソン１の上流の２．５−ｋｂフラグメントを、短い相同性アームとして、ネオマイシン耐性遺伝子（新カセット）の下流のｐＮＴ−Ｌｏｘ２プラスミド（Ｐｅｔｅｒ Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ博士、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｃａｔｈｏｌｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ルーベン、ベルギーにより提供）にクローニングした。エクソン１の下流の４．８−ｋｂフラグメントは、内在性遺伝子の長い相同性アームとして新カセットの上流にクローニングした。標的ベクター構築物は、約１４．５−ｋｂの合計サイズを有した。

標的ベクターを制限酵素Ｎｏｔ Ｉにより線状化し、Ｕｐｐｓａｌａ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＵＵＴＦ）社により提供された胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションした。他のＥＳ細胞は容易に入手可能である。該新耐性遺伝子を発現するクローンを、Ｇ４１８（３５０μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、ＣＡ）を細胞培養培地に含めて選択し、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により標的遺伝子相同組換えについて分析した。簡単には、ＥＳ細胞から抽出したゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲ Ｖ又はＳｃａ１のいずれかにより消化した。得られたフラグメントは、０．８％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜にブロットした後、図１Ａに示した^３２Ｐ標識プローブ＃３とハイブリダイズした。

得られた４００個の新耐性ＥＳクローンのスクリーニングでは、Ｈｐｓｅ遺伝子における２つの相同組換えのみが同定された。さらなる組み込み部位は、これらの陽性クローンでは検出されなかった。両方の陽性クローンをＣ５７ＢＬ／６胚盤胞にマイクロインジェクションし、キメラ動物を産する偽妊娠マウスに移植し、このうち１匹が生殖細胞系伝達を示した。キメラオス初代マウスはＣ５７ＢＬ／６メスと交配させた。ヘテロ接合マウスを交雑受精してＨｐｓｅ変異マウスを作製した。表現型試験は混合遺伝的背景を有するマウス（１２９／ＳｖＪ／Ｓｖ／Ｃ５７ＢＬ／６）で行った。動物は、スウェーデン及びイスラエルの国立実験動物委員会により策定されたガイドラインに従って維持した。

ヘテロ接合同腹子間の交雑受精からの子孫の遺伝子型分析は、上記の通りサザンブロッティングにより行い（図１Ｂ）、基本的にメンデル遺伝を示し、初期の胚死がないことを示した。Ｈｐｓｅ遺伝子の完全な妨害を確認するために、ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯマウスの異なる組織由来のヘパラナーゼｍＲＮＡの発現を、特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲにより調べた。この目的のために、全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、ＣＡ）を用いてメーカーの指示に従い、約１００ｍｇ脾臓又は肺組織から単離し、分光測定により定量化した。５００ｎｇの全ＲＮＡのオリゴ（ｄＴ）プライムされた逆転写の後、得られた一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲプライマーを用いて増幅した。ヘパラナーゼに関するＰＣＲ条件は、９４℃で２分間の変性の後、９４℃で１５秒間の変性、５８℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長の２５サイクルであった。増幅産物のアリコート（１０μｌ）を１．５％アガロースゲルで電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色（Ｈｙ Ｌａｂｓ社、レホヴォト、イスラエル）により視覚化した。ＰＣＲに使用したプライマーは表１にまとめられている。プライマーは、ヘパラナーゼ遺伝子の５’、中間、及び３’領域を増幅するように設計された。図１Ｃに示した通り、ヘパラナーゼｍＲＮＡは、ｗｔマウス由来の試料でのみ検出されたが、Ｈｐｓｅ−ＫＯマウス由来の試料では検出されなかった。

ヘパラナーゼ酵素活性の排除を検証するために、ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯマウス由来の４つの血液血清試料及び３つの組織（肝臓、腎臓及び脾臓）を、それぞれ基質として、硫酸標識したインタクトなＥＣＭ（図１Ｄ）又は可溶性ＨＳ側鎖（図１Ｅ）を用いて分析した。血清試料は、反応緩衝液（１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＣａＣｌ２及び５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液 ｐＨ６．２）で１：１に希釈し、^３５Ｓ標識ＥＣＭでコートしたディッシュでインキュベートした（１６時間、３７℃）。インキュベーション培地を遠心分離し（２０，０００×ｇ、４℃、１分）、３５Ｓ標識ＨＳ分解フラグメントを含有する上清を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラムでゲル濾過により分析した。画分（０．２ｍＬ）を回収し、各画分における放射能量をベータシンチレーションカウンターで計数した。ほぼインタクトなＨＳプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）が空隙容量（ピークＩ、Ｋａｖ＜０．２）直後にＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂから溶出されるのに対し、ＨＳ分解フラグメントはカラムのＶｔ（ピークＩＩ、０．５＜Ｋａｖ＜０．８）の少し前に溶出される。アッセイに使用したＥＣＭコートディッシュは次のように調製した。ウシ角膜内皮細胞を、播種後１日目及び５日目に添加（２５μＣｉ／ｍＬ）したＮａ_２［^３５Ｓ］Ｏ_４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ウプサラ、スウェーデン）の存在下で培養した。７日から１０日後、細胞単層を溶解し、ＥＣＭは０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び２０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ含有ＰＢＳで細胞培養ディッシュを処理して曝露させた後、ＰＢＳで４回洗浄した。ＥＣＭは、インタクトなままであり、細胞残屑がなく、組織培養ディッシュの全域にしっかり付着していた。

組織試料分析については、４カ月齢のｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯマウスを屠殺し、臓器を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ＭＯ）含有２ｍｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４で直ちにホモジナイズした。ホモジネートを氷上で３０分間インキュベートした後、２０分間、４℃、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清は、ホモジナイゼーション緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）カラムに充填した。１０ｍｌ ＰＢＳで洗浄後、結合物質は１Ｍ ＮａＣｌ含有ＰＢＳで溶出した。総タンパク質量はＢｒａｄｆｏｒｄ方法により決定した。溶出からの５０μｇタンパク質の試料を、２０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．８）中５，０００ｃｐｍ［^３Ｈ］アセチル標識ＨＳ、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、及び５０ｍＭ ＮａＣｌと共にインキュベートした（３７℃、一晩）。得られた産物は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でゲルクロマトグラフィーにより分析した。

アッセイ系に関係なく、Ｈｐｓｅ−ＫＯマウス由来の試料がいずれもヘパラナーゼ活性を示さなかったのに対し、ｗｔ試料はヘパラナーゼ活性の正常レベルを示した（図１Ｄ及びＥ）。特に重要なのは、極めて高レベルの該酵素を発現することが知られている活性化血小板及び白血球細胞を含有する血清試料におけるヘパラナーゼ活性の欠如である。図１Ｄに示した通り、ｗｔマウス由来の血液試料は、画分２０〜４０で溶出された大量の低分子量物質（図１Ｄ、ピークＩＩ）により検出されたように、高レベルのヘパラナーゼ活性を示した。ピークＩＩで溶出された標識フラグメントは、これらがＨＳＰＧのインタクトなＨＳ鎖より５〜６倍小さく、パパイン及びコンドロイチナーゼＡＢＣによるさらなる消化に耐性があり、亜硝酸により脱アミノ化されやすかったことから、ＨＳの分解産物であることが示された。一方、Ｈｐｓｅ−ＫＯマウス由来の血液試料は、ＨＳ分解フラグメントの欠如（ピークＩＩ）及び画分５〜１０で溶出された高分子量物質の生成（ピークＩ、図１Ｄ）により明らかになったように、ヘパラナーゼ活性を示さなかった。ほぼインタクトなＨＳＰＧを表すこの物質は、ＥＣＭ及び細胞溶解物中に存在するプロテアーゼによるプロテオグリカンコアタンパク質のタンパク質分解により生成される。同様に、対応するｗｔ組織抽出物とのインキュベーションでのＨＳの有意な分解（ピークＩＩ、図１Ｅ）と比べて、Ｈｐｓｅ−ＫＯマウス由来の肝臓、腎臓及び脾臓抽出物とのインキュベーションでの^３Ｈ標識ＨＳの切断はなかった（ピークＩ）。まとめると、これらのデータは、Ｈｐｓｅ−ＫＯマウスにおけるヘパラナーゼ酵素活性の完全な排除を明らかに示している。

（例２）
ヘパラナーゼ欠損マウスの表現型分析
ホモ接合変異動物は、明らかに異常な表現型を示さず、繁殖性であり、正常な寿命を示した。いずれかの可能性のある年齢に関連した表現型を調べるために、６、１２及び１８カ月齢マウスを屠殺し、臓器を切開し、９６％エタノール、１％氷酢酸及び３％蒸留水含有溶液で固定した。パラフィン包埋組織切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。脳、心臓、肝臓、肺、腎臓及び脾臓由来の切片の組織学的検査は、Ｈｐｓｅ−ＫＯマウスにおける重大な構造的又は病理学的異常性を明らかにしなかった。

乳腺形態形成を試験するため、３カ月齢処女ホモ接合Ｈｐｓｅ−ＫＯ又はｗｔマウス由来の全載乳腺を、当技術分野で公知の通りに調製し、Ｔｅｌｌｙｓ固定液（１００ｍｌ ＥｔＯＨ ７０％、５ｍｌホルマリン、５ｍｌ氷酢酸）で固定し、再水和し、ヘマトキシリンで３時間染色した。染色後、腺を水道水で洗浄し（１時間）、再水和し、サリチル酸メチル中で貯蔵した。驚くべきことに、処女Ｈｐｓｅ−ＫＯマウスは、妊娠マウスに特有の、乳腺における管の異常な、豊富な分岐及び早熟な胞巣状構造を示した（図３、下のパネル）のに対し、処女ｗｔ処女マウスは発達の乏しい乳腺を示した（図３、上のパネル）。以前に、ヒトヘパラナーゼ遺伝子を過剰発現するトランスジェニック処女マウス（ｈｐａ−ｔｇマウス）は、処女ホモ接合Ｈｐｓｅ−ＫＯマウスに似た乳腺形態を示すことが報告されている。しかし、ｈｐａ−ｔｇ対対照マウスとは異なり、ｗｔとＨｐｓｅ−ＫＯマウスとの間では主な管の幅に有意差はなかった。

ヘパラナーゼの役割、並びに肝臓及び腎臓機能に対するＨＳ構造変化の影響を調べるために、血液試料を、７２時間の絶食の前後に１５匹のｗｔ及び１５匹のＨｐｓｅ−ＫＯマウスから採取した。試料は、総タンパク質量並びにクレアチニン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）含量について分析した。この目的のために、尿試料（２５μｌ）は、自動化Ｋｏｄａｋ ２５０系を用いて、総タンパク質量及びクレアチニン含量について分析した。血液試料（２５μｌ）は、自動化Ｋｏｄａｋ ９５０系を用いて、クレアチニン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）含量について調べた。絶食の前後のいずれにおいても、ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯマウスの間に有意差は検出されなかった。さらに、血小板が大量のヘパラナーゼを含有することから、血液試料は凝固特性（すなわち、ＡＰＴＴ）についても調べた。この場合もやはり、Ｈｐｓｅ−ＫＯとｗｔマウスとの間に有意差はなかった。

以前に、ヘパラナーゼは、成熟した健康な肝臓と比べて肝臓発生及び再生中により容易に発現されることが報告されている。さらに、本発明者は、組換え活性ヘパラナーゼによる治療が肝臓再生を促進することを見出している（未発表結果）。故にＨｐｓｅ−ＫＯマウスの肝臓は、部分的肝切除に反応してより緩慢な再生速度を示す可能性があることが想定された。ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯマウス（各群に４匹）を、部分的肝切除に供し、インビボで肝臓サイズを評価するためＭＲＩを適用して、肝臓再生について１日おきに調べた。意外にも、肝切除後８日間では２群間に有意差は観察されなかった。

（例３）
ヘパラナーゼ欠損マウスにおけるヘパラン硫酸構造の生化学分析
ヘパリン硫酸（ＨＳ）の分解がヘパラナーゼの１つの主要な機能であることから、選択された臓器由来のＨＳを分析した。この目的のために、野生型及びＨｐｓｅ−ＫＯマウスに０．５ ｍＣｉ Ｎａ_２ ^３５ＳＯ_４（特異的活性１，５００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、ワルトハム、ＭＡ）を腹腔内注射し、水及び食べ物を自由に摂取させて４５分間維持した。動物を次いで頸椎脱臼により屠殺し、臓器を切開した。組織は、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有する、６容量の氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、４Ｍ尿素、０．２５Ｍ ＮａＣｌにおいてＤｏｕｎｃｅホモジナイザーによりホモジナイズした後、４℃で一晩インキュベートした。遠心分離後、上清を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．３Ｍ ＮａＣｌで平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに適用した。カラムは同緩衝液で大規模洗浄し、次いで１．５Ｍ ＮａＣｌ含有同緩衝液で溶出した。溶出液を脱塩し、凍結乾燥し、コンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ社、東京、日本）及びベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ社、サンディエゴ、ＣＡ）で消化した。消化物は、次いでＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌに再適用して、分解されたコンドロイチン硫酸及びオリゴヌクレオチドを除去した。１．５Ｍ ＮａＣｌで溶出したＨＳＰＧ画分は、さらなる分析のためプールした。

ＨＳ分子構造の分析については、ＨＳＰＧ及びＨＳ遊離鎖のゲルクロマトグラフィーを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で溶出したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムで行った。ドメイン構成を分析するために、ＨＳ試料は、ｐＨ１．５での亜硝酸による処理により、Ｎ−硫酸化ＧｌｃＮ残基での切断に供した後、ＮａＢ［^３Ｈ］_４により還元した。還元産物は、０．５Ｍ ＮａＣｌ中、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ハーキュリーズ、ＣＡ）のカラム（１×２００ｃｍ）でゲルクロマトグラフィーにより分離した。亜硝酸分解産物の部分は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラムに適用し、二糖類を回収した。脱塩及び濃縮後、Ｎ−硫酸化ドメイン由来の^３Ｈ又は^３５Ｓ標識二糖類は、当技術分野で公知の通り、Ｐａｒｔｉｓｉｌ−１０ ＳＡＸカラムで陰イオン交換ＨＰＬＣによりさらに分析した。

予想通り、Ｈｐｓｅ−ＫＯ組織由来のＨＳ鎖は、ｗｔ組織から抽出したＨＳと比べてより高い分子量であった（図２）。さらに、Ｈｐｓｅ−ＫＯ組織から単離した遊離ＨＳ鎖の溶出ピークは、ｗｔ組織から単離したＨＳ側鎖の溶出プロファイルと比べてより狭くより対称的であるように見え、サイズ分布の不均一性がより小さいことを示した（全体的に幅広いサイズのピークは、ＨＳ生合成の状態を反映している）。ＨＳ硫酸化及び二糖組成の構造分析は、ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯ組織由来の試料間の検出可能な差を示さなかった。

（例４）
ヘパラナーゼ欠損マウスにおける内皮発芽及び血管新生の分析
ヘパラナーゼの細胞移動及び血管新生への関与は、十分に文献化されている。したがって、内皮細胞移動及び発芽に対するヘパラナーゼノックアウトの影響が評価された。先ず、エクスビボ大動脈輪アッセイが適用された。簡単には、８匹のｗｔ及び８匹のＨｐｓｅ−ＫＯマウスを屠殺し、この大動脈を浄化、及び１〜２ｍｍの厚さの輪にカットした。輪を３次元増殖因子枯渇マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンホセ、ＣＡ）に包埋し、添加ＦＧＦ−２（５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で０．５ｍｌ Ｂｉｏ−ＭＰＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、ベスハエメク、イスラエル）でインキュベートした。輪を６日間維持し（３７℃、８％ＣＯ_２、加湿雰囲気）、培地及びＦＧＦ−２の両方を２日ごとに交換した。血管発芽を毎日、６日間評価し、次いで４％ホルマリンで２４時間固定し、エタノール中０．０２％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で染色し、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ １００フェーズコントラスト顕微鏡を用いて撮影した。予想通り、ＦＧＦ−２の非存在下ではｗｔ又はＨｐｓｅ−ＫＯ輪のいずれにおいても発芽はほとんど又は全くなかった（不図示）。ＦＧＦ−２による刺激では、ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯ輪のいずれも内皮発芽を示した（図４Ａ）。特に、Ｈｐｓｅ−ＫＯ由来の輪は、ｗｔ大動脈輪（図４Ａ、上のパネル）と比べてより顕著な管形成を示し（図４Ａ、下のパネル）、ＦＧＦ−２刺激に対する反応の増加を示唆した。

エクスビボでの結果を検証するため、本発明者はインビボ血管新生アッセイを行った。このモデルでは、マウスにＦＧＦ−２（８０ｎｇ／ｍＬ）が有る又は無い場合の増殖因子枯渇マトリゲル２００μＬを皮下注射した。７日後、マトリゲルプラグを切除し、撮影し、低張溶解緩衝液（２５０μｌの０．１％Ｂｒｉｊ−３５／プラグ）でホモジナイズし、５，０００ｇで５分間遠心分離した。Ｄｒａｂｋｉｎ試薬によるヘモグロビン含量の測定により新血管形成を評価するために、上清は２通りに使用した。顕著な血管新生反応は、ｗｔマウスと比べてＨｐｓｅ−ＫＯマウスにおいてマトリゲル包埋ＦＧＦ−２により誘導され（図４Ｂ）、エクスビボでの結果を裏付けた。ヘモグロビンの測定は、ｗｔマウスと比べてＨｐｓｅ−ＫＯに包埋したマトリゲルプラグのヘモグロビン含量の約２倍の増加を明らかにした（それぞれ、２６±４．８ｍｇ／ｄｌ対５５．５±７．１８ｍｇ／ｄｌ；ｐ＝０．０００２）。

（例５）
ヘパラナーゼ欠損マウスにおける代償反応の分析
Ｈｐｓｅ−ＫＯマウスでの異常な乳腺形態及び新血管形成の増加という予想外の結果は、この表現型の背後にあるメカニズムの調査につながった。１つの疑問は、他のＥＣＭ分解酵素（単数又は複数）が、ヘパラナーゼ発現の欠如を代償しているかどうかであった。ヘパラナーゼ遺伝子と顕著な相同（約３８％）を示す（ＷＯ０１／７７３４１に開示）が、いかなる検出可能なヘパラナーゼ酵素活性も欠く遺伝子であるＨｐａ２が、調査の第１候補であった。Ｈｐａ２発現の分析は、ｗｔとＨｐｓｅ−ＫＯマウスとの間のいかなる差を明らかにしなかった。さらに、Ｈｐｓｅ−ＫＯマウスで見出されるＨＳ長の増加は、別のヘパラナーゼ様酵素を指し示さない。

マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が、ＥＣＭ構造の再編成及びこれによる組織リモデリング、形態形成及び新血管形成において重要な役割を果たすことを考慮して、ＭＭＰ発現をリアルタイムＰＣＲにより調査した。この目的のために、Ｈｐｓｅ−ＫＯ及びｗｔマウスの腎臓、肝臓及び乳腺から抽出した全ＲＮＡを、ＭＭＰ−２、−３、−９、−１４及び−２５に対応する特異的プライマーを用いて分析した（表２）。リアルタイム定量的ＰＣＲ分析は、自動化回転遺伝子系ＲＧ−３０００Ａ（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ社、シドニー、オーストラリア）により行った。ＰＣＲ反応ミックス（２０μｌ）は、１０μｌ ＱＰＣＲ ＳＹＢＲグリーンミックス（ＡＢｇｅｎｅ社、エプソム、ＵＫ）、５μｌの希釈ｃＤＮＡ（各試料６通り）及び最終濃度０．３μＭの各プライマーから成った。ＰＣＲ条件は次の通りであった：最初の変性ステップ、９５℃で１５分間；９５℃で１５秒間の変性、５７℃で３０秒間のハイブリダイゼーション、及び７２℃で３０秒間の伸長の４０サイクル。アクチンプライマーを内部標準として使用した。

ｗｔ組織における異なるＭＭＰの発現レベルを１００％と見なし、Ｈｐｓｅ−ＫＯマウスのＭＭＰレベルをこの値と比較して計算した。結果（図５Ａ）は、ヘパラナーゼ発現の欠如がＭＭＰファミリーの幾つかの膜の発現レベルにおける著しい変化と関連があることを示した。ＭＭＰ−２は、ｗｔマウスと比べてＨｐｓｅ−ＫＯマウスから抽出した全ての試料で過剰発現した（２〜３．５倍）。ＭＭＰ−１４は肝臓及び腎臓で過剰発現した（４〜７倍）が、ｗｔマウスと比べてＨｐｓｅ−ＫＯマウス由来の乳腺でダウンレギュレートされた（約４倍）。ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２５発現レベルも、組織により変化した（図５Ａ）。

これらの結果は、ｗｔマウスと比べてＨｐｓｅ−ＫＯマウスの肝臓、腎臓及び乳腺から抽出したホモジナイズした組織でのＭＭＰ−２タンパク質レベルの増加を明らかにするウェスタンブロット分析により、さらに裏付けられた（図５Ｂ 上のパネル）。組織抽出物のアリコート（５０μｇ）を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）での電気泳動により分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、ＭＡ）に移した。ＭＭＰ２を抗マウスＭＭＰ２モノクロナール抗体８０１Ｂ（１：１５０、Ｒａｆａｅｌ Ｆｒｉｄｍａｎ博士、Ｗａｙｎｅ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、デトロイト、ＭＩにより提供）により検出した。β−カテニンは、抗マウスモノクロナール抗体（１：１５０、ＢＤ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、サンホセ、ＣＡ）、及び抗マウスａ−チューブリンクローンＢ−５−１−２（１：５０００；ｓｉｇｍａ社）により検出した。膜は一次抗体と共に２時間、室温でインキュベートし、ＴＴＢＳで洗浄し、ＨＲＰ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーハーバー、ＭＥ）でプローブした。ＴＴＢＳで数回洗浄後、二次抗体の検出をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ系（Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード、ＩＬ）を用いて行った。化学発光シグナルは、ＦｕｊｉメディカルＸ線フィルム（Ｓｕｐｅｒ ＲＸ）に露光した。

ＭＭＰ−２発現の増加がＭＭＰ−２酵素活性の上昇により現れるかどうかも、さらに調査した。この目的のために、ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯ血液由来の血漿試料をザイモグラフィーに供し、ＭＭＰ−２活性を評価した。ＭＭＰ−２活性は、ｗｔマウスと比べてＨｐｓｅ−ＫＯマウス由来の血漿試料で２倍高かった。

次に、ヘパラナーゼとＭＭＰとの間の相互作用に関与する可能性のある分子経路を綿密に考察した。β−カテニンは、以前にＭＭＰ制御に関与したことから、この活性化を、細胞質におけるβ−カテニン蓄積を調べて評価した。組織抽出物のウェスタンブロット分析は、ｗｔマウスと比べてＨｐｓｅ−ＫＯマウス由来の肝臓、腎臓及び乳腺におけるβ−カテニン蓄積を明らかにした（図５Ｂ、真ん中のパネル）。同様に、ｗｔ及びＨｐｓｅ−ＫＯマウス由来の腎臓組織切片の免疫染色（図５Ｃ）は、ウェスタンブロットの結果と対応する、Ｈｐｓｅ−ＫＯ腎臓におけるβ−カテニン染色の増加を明らかにした。

さらに、ヘパラナーゼとＭＭＰとの相互関係は、中程度のヘパラナーゼレベルを正常に発現しているヒト乳癌ＭＤＡ−２３１細胞に、活性ヘパラナーゼ又は酵素活性を欠く変異ヘパラナーゼ（Ａｌａにより置換された活性部位Ｇｌｎ２２５及びＧｌｎ３４３）のいずれかをトランスフェクトして調査した。ｍＲＮＡ発現レベルは、表３に示したプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲにより決定した。

活性及び不活性変異ヘパラナーゼはいずれも、偽トランスフェクト細胞と比べてＨｐｓｅ−トランスフェクト細胞で３０倍過剰発現した（図６Ａ）。図６Ｂに示した通り、活性ヘパラナーゼをトランスフェクトした細胞は、Ｈｐｓｅ−ＫＯマウスで見出された発現増加の鏡像である、ＭＭＰ−２（５．８倍）、ＭＭＰ−９（６．５倍）及びＭＭＰ−１４（３倍）発現の著しい減少を示した。一方、ＭＤＡ−２３９細胞に変異不活性ヘパラナーゼをトランスフェクトすることは、ＭＭＰ発現（図６Ｂ）に影響を与えず、ヘパラナーゼ酵素活性が、観察されたＭＭＰ発現の制御に関与することを示した。

（例６）
多発性硬化症を治療するための候補化合物の評価モデルとしてのヘパラナーゼ欠損マウス
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、次のスキームによりＣ５７／Ｂｌ遺伝的背景の最適には６〜８週齢のＨｐｓｅ−ＫＯメスマウスにおいて誘導される。

０日目：完全フロインドアジュバントを有する５０：５０エマルション中の３００μｇ ＭＯＧ_{３５−５５}ペプチドの皮下注射；２００μｌ注入量；

５００μｇ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｔｏｘｉｎの腹腔内注射；注入量１００ｍｌ；

２日目：５００μｇ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｔｏｘｉｎの腹腔内注射；注入量１００μｌ；

７日目：完全フロインドアジュバントを有する５０：５０エマルション中の３００μｇ ＭＯＧ_{３５−５５}の皮下注射；２００μｌ注入量；

０日目又はこれ以前に、盲検試験における後の同定のためマウスをマーク又はタグ付けする。さらに、試験開始前にマウスを秤量し、健康状態をチェックする。

マウスを毎日チェックし、７日目（又はこれ以前）以降（最大２８日目まで）マウスを秤量及びモニターして毎日臨床スコア（ｃ．ｓ．）を得る。

テスト化合物は、例えば０、７日目又はこれ以後に適用してよく、上の表に示したような臨床スコアを評価する。臨床スコアが低いほど、テスト化合物の治療可能性は高まる。

Claims (11)

1. 配列番号１で表される配列を欠く、破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子を有する、ホモ接合ヘパラナーゼノックアウト（ＫＯ）マウス。
2. 請求項１に記載のホモ接合ヘパラナーゼノックアウトマウス由来の単離細胞。
3. ａ）マウス胚性幹細胞での相同組換えにより配列番号１で表されるヘパラナーゼ遺伝子の部分を欠失させるステップと、
   ｂ）ステップａ）で得られた組換え細胞を単離された胚盤胞に導入するステップと、
   ｃ）前記胚盤胞を偽妊娠したマウスに移植するステップと、
   ｄ）前記移植された胚盤胞がトランスジェニックマウスに発達することを可能にするステップと、
   ｅ）前記トランスジェニックマウスを飼育して子孫を産生するステップと、
   ｆ）前記子孫をスクリーニングして、ホモ接合で破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子を有するトランスジェニックマウスを同定するステップと
   を含む、請求項１に記載のホモ接合ヘパラナーゼノックアウトマウスの作製方法。
4. 請求項１に記載のホモ接合ヘパラナーゼノックアウトマウスを作製するためのベクターであって、ヘパラナーゼコーディング配列の１つのエクソンの少なくとも一部分が、選択可能なマーカー配列に置換されている、ヘパラナーゼノックアウト構築物をコードする核酸配列を含む上記ベクター。
5. 前記選択可能なマーカー配列がネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求項４に記載のベクター。
6. ａ）請求項１に記載のホモ接合ヘパラナーゼノックアウトマウスを提供するステップと、
   ｂ）前記マウスを疾患刺激に曝露するステップと、
   ｃ）前記マウスに前記薬剤候補を投与するステップと、
   ｄ）前記疾患刺激により誘導された疾患の発症について前記マウスを分析するステップと
   を含む、治療剤候補のスクリーニング方法。
7. 前記疾患刺激が接種された腫瘍細胞を含み、前記ステップｄ）が任意の腫瘍転移形成を決定することを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記疾患刺激が炎症刺激であり、前記ステップｄ）が任意の炎症反応のレベルを決定することを含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記疾患刺激が実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導する、請求項６に記載の方法。
10. 前記疾患刺激がアレルギー反応を誘導する、請求項６に記載の方法。
11. 野生型マウスにおいて得られた対応する結果と、得られた結果を比較することをさらに含む、請求項６から１０までのいずれか一項に記載の方法。