JP5548357B2

JP5548357B2 - アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の検出方法

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Publication number: JP5548357B2
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Inventors: 幸一細谷; 素一中山; 一徳田; 貴志矢口; 佑介弘
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Filing date: 2008-11-11
Publication date: 2014-07-16
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Description

本発明は、アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の検出方法に関する。

アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属は自然界に広く見られる真菌であり、１５０菌種以上が知られている。土壌中や堆肥中にも存在し、また空気中にも浮遊しているため、食品およびその原材料からも頻繁に検出される。
アスペルギルス属に属する菌類の中には、ヒトや動物に対する病原性を持っている菌種がある。これらの病原性菌類は、主に呼吸によって空気中に浮遊する胞子を吸い込むことで体内に侵入し、肺、外耳道、鼻腔等に感染し、アスペルギルス症と呼ばれる感染症を引き起こす。アスペルギルス症は、原因菌が病原性の低い二次病原体（日和見病原体）であるため健常者には比較的感染しにくいが、疾患等によって感染抵抗力が低下している場合に感染する、いわゆる日和見感染症の一種である。近年の高齢化に伴って、治療に免疫抑制剤や抗がん剤を使用している移植患者、抗がん剤治療患者等が増加しており、それとともにアスペルギルス症の発症件数も増加傾向にある。さらにこれらのアスペルギルス症による死亡率も高いことから早急な治療法の改善が望まれている。

アスペルギルス症の原因となるアスペルギルス属に属する菌類として、従来からアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスフラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）等が知られている。これらの中でもアスペルギルスフミガタスを原因として発症するケースが特に多い。

近年、遺伝学的な系統解析方法の進歩とともに、従来の形態学的分類方法では識別できなかった新種の菌類が発見されている。アスペルギルスフミガタスについても、その形態学的特徴がよく似ており従来はアスペルギルスフミガタスと同一種とみなされていたが、遺伝子解析等を行った結果アスペルギルスフミガタスとは別種と同定された新種の菌類が複数発見されている。これらの新種のアスペルギルス属の菌類は、外見上の特徴はもとより、遺伝学的特徴もアスペルギルスフミガタスに似ているため、アスペルギルスフミガタス類縁菌と呼ばれている。
これらアスペルギルスフミガタス類縁菌のうちのいくつかの菌種は、アスペルギルスフミガタス同様、アスペルギルス症を引き起こすことが報告されている。しかも、菌種によっては、特定の抗真菌薬に対して感受性が低いものがある。一般にアスペルギルス症の治療には抗真菌薬が用いられ、アンフォテリシンＢ、ボリコナゾール、カスポファンジン等が使用されているが、例えば、病原性が指摘されている類縁菌のうち、アスペルギルスレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｌｕｓ）はアンフォテリシンＢ、ボリコナゾール、カスポファンジンに対して薬剤耐性を持っており、またアスペルギルスウダガワエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｕｄａｇａｗａｅ）はアンフォテリシンＢに対する薬剤耐性を持つことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。アスペルギルスフミガタスとその類縁菌は形態学的特徴がよく似ているため、このような薬剤耐性の菌種をアスペルギルスフミガタスと誤認し治療を行った場合、適切な抗真菌薬を選択できずに治療効果が著しく劣ることにもなりかねない。したがって、アスペルギルス症の治療効果を上げるためには、病気を引き起こしている菌の種類を特定し、その菌種に有効な抗真菌薬を適切に選択することが非常に重要である。そのためには、アスペルギルス症を引き起こしている原因菌の菌種を適切かつ迅速に同定することが求められている。

また、アスペルギルスフミガタスおよびその類縁菌の中には、カビ毒（fumitoremorgin類）を産生する菌種がある。前述のとおり、アスペルギルス属の菌類は食品やその材料からも頻繁に検出されるため、これら食品等へのカビ毒の混入も懸念される。

現在のところ、アスペルギルスフミガタスおよびその類縁菌の検出及び同定法は、培養による発育温度と形態学的な菌種分類が主である。この方法は形態学的な特徴が発生するまで培養を続ける必要があるため、最短でも１４日以上の長期間を必要とする。また、アスペルギルスフミガタスおよびその類縁菌は形態学的な特徴がよく似ているため、形態学的特徴だけから正確に菌種を同定することは非常に困難である。そのため、アスペルギルス症の治療や食品衛生対策上の観点から、菌種レベルでの迅速かつ正確な検出・同定方法の確立が求められている。

菌類の迅速かつ信頼性の高い検出方法としては、遺伝子の特定の塩基配列を標的とした増幅法（たとえばPCR法やLAMP法）が知られている（例えば、特許文献１〜４参照）。しかし、アスペルギルスフミガタス及びその類縁菌に特異的な遺伝子領域が解明されていない。従って、アスペルギルスフミガタス及びその類縁菌を特異的かつ迅速に検出することが困難であるという問題を有している。

ukaryotic Cell, 5(10): 1705-1712, 2006Balajee SA et al. Molecular Studies Reveal Frequent Misidentification of Aspergillus fumigatus by Morphotyping. 特表平１１−５０５７２８号公報特開２００６−６１１５２号公報特開２００６−３０４７６３号公報特開２００７−１７４９０３号公報

本発明は、ヒトや動物に対して病原性を有するアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌を特異的、簡便かつ迅速に検出できる方法を提供することを目的とする。また、本発明は、この検出方法に使用するためのアスペルギルスフミガタス類縁菌に特異的な塩基配列で表されるＤＮＡ、該塩基配列で表される核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドを用いたプライマーセット及び検出キットを提供することを目的とする。

上記課題に鑑み、本発明者等は、アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌のうちヒトや動物に対し病原性を持つ菌種を特異的に識別する方法について鋭意検討を行った。その結果、アスペルギルスフミガタス類縁菌のβ−チューブリン遺伝子配列中に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する領域（以下、「可変領域」ともいう）が存在することを見い出した。また、この可変領域をターゲットとすることで、上記病原性を有するアスペルギルスフミガタス類縁菌を特異的かつ迅速に検出できることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。

本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列で表される核酸を用いてアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の同定を行うことを特徴とするアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の検出方法に関する。
（ａ）配列番号１若しくは２に記載のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列、又はその相補配列
（ｂ）配列番号１若しくは２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列、又はその相補配列

また本発明は、アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の検出に用いるための、前記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列で表されるＤＮＡに関する。

また本発明は、前記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得るアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌検出用オリゴヌクレオチドに関する。

また本発明は、下記の（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるアスペルギルスレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｌｕｓ）及び／又はアスペルギルスフミシネマタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｓｙｎｎｅｍａｔｕｓ）検出用オリゴヌクレオチド対、下記の（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるアスペルギルスウダガワエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｕｄａｇａｗａｅ）検出用オリゴヌクレオチド対、並びにそれらのオリゴヌクレオチド対を含むアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌検出用キットに関する。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ検出用オリゴヌクレオチドとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド

また、本発明は、下記の（ｇ）〜（ｊ）のプライマー若しくは下記（ｇ）〜（ｌ）のプライマーからなるアスペルギルスレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｌｕｓ）及び／又はアスペルギルスフミシネマタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｓｙｎｎｅｍａｔｕｓ）検出用プライマーセット、下記の（ｍ）〜（ｐ）のプライマー若しくは下記の（ｍ）〜（ｒ）のプライマーからなるアスペルギルスウダガワエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｕｄａｇａｗａｅ）検出用プライマーセット、並びにそれらのプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰとを含むアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌検出キットに関する。
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｍ）配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｎ）配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｏ）配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｐ）配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｑ）配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｒ）配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー

さらに、本発明は、アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列から選択される標的領域の配列の５’側から順に、塩基配列領域としてＦ３、Ｆ２及びＦ１を選択し、
前記標的領域の３’側から順に、塩基配列領域としてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃを選択し、
前記Ｆ３、Ｆ２及びＦ１の相補的塩基配列を、それぞれＦ３ｃ、Ｆ２ｃ及びＦ１ｃとし、
前記Ｂ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃに相補的な塩基配列を、それぞれＢ３、Ｂ２及びＢ１としたとき、
以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに該当する塩基配列で表されるアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌検出用オリゴヌクレオチド、並びにそれらの検出用オリゴヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰとを含むアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌検出キットに関する。
（ａ）前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列
（ｂ）前記Ｂ３領域を有する塩基配列
（ｃ）前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列
（ｄ）前記Ｆ３領域を有する塩基配列
（ｅ）前記Ｂ１領域と前記Ｂ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
（ｆ）前記Ｆ１領域と前記Ｆ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列

本発明によれば、ヒトや動物に対して病原性を有するアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌を特異的、簡便かつ迅速に検出できる方法を提供することができる。また、本発明によれば、この検出方法に使用するためのアスペルギルスフミガタス類縁菌に特異的なβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表されるＤＮＡ、該塩基配列で表される核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドを用いたプライマーセット及び検出キットを提供することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、アスペルギルスフミガタス類縁菌のβ−チューブリン遺伝子の特定の部分塩基配列、すなわちアスペルギルスフミガタス類縁菌のβ−チューブリン遺伝子配列中の種特異的領域（可変領域）の塩基配列で表される核酸を用いてアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の同定を行い、アスペルギルスフミガタス類縁菌を特異的に識別・検出する方法である。
アスペルギルスフミガタスは、不完全菌のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する菌類であり、ヒトおよび動物に対する病原性を有しアスペルギルス症の原因となる。
また、本発明において「アスペルギルスフミガタス類縁菌」とは、アスペルギルス属に属する菌類であって、特にアスペルギルスフミガタスに形態学的特徴及び遺伝学的特徴が似ている一群の菌類をいう。具体的には、アスペルギルスレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｌｕｓ）、アスペルギルスフミシネマタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｓｙｎｎｅｍａｔｕｓ）、アスペルギルスウダガワエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｕｄａｇａｗａｅ）、アスペルギルスフミガチアフィニス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｉａｆｆｉｎｉｓ）、アスペルギルスノボフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｏｖｏｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスビリジニュータンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｖｉｒｉｄｉｎｕｔａｎｓ）、アスペルギルスブレビプス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｐｅｓ）、アスペルギルスデュリカリス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｄｕｒｉｃａｕｌｉｓ）、アスペルギルスユニラテラリス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｕｎｉｌａｔｅｒａｌｉｓ）等が知られている。これら類縁菌の中でも、アスペルギルスレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｌｕｓ）、アスペルギルスフミシネマタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｓｙｎｎｅｍａｔｕｓ）及びアスペルギルスウダガワエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｕｄａｇａｗａｅ）はアスペルギルス症の患者からの分離頻度が比較的高く、病原性を有するとの報告がある。また、これらの種はアンポテリシンＢなどの抗真菌剤に対して感受性が低く臨床上問題となっている。さらに、アスペルギルスフミガタス及びアスペルギルスウダガワエは抗神経性のカビ毒を産出することが知られている。

「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。また、本発明において「β−チューブリン遺伝子の可変領域」とは、β−チューブリン遺伝子中で塩基の変異が蓄積しやすい特定の領域をいう。本発明の検出方法において「β−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸を用いて同定を行う」とは、当該部分塩基配列の全部またはその一部の配列で表される核酸を用いて同定を行うことをいう。

本発明の検出方法は、アスペルギルスフミガタス類縁菌のβ−チューブリン遺伝子中の特定（可変）領域の塩基配列で表される核酸を用いることを特徴とする。
発明者らは、アスペルギルス属に属する菌類から種々のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を同定し、アスペルギルス属内での遺伝的距離の解析を行った。さらに、決定した各種のβチューブリン配列の相同性解析をおこなった。その結果、アスペルギルスフミガタス類縁菌は５つのグループに分類されることを明らかとした。そして、この５グループの中でも医真菌分野において特に重要視されるアスペルギルスレンタスのグループ（アスペルギルスレンタスおよびアスペルギルスフミシネマタスが含まれる）及びアスペルギルスウダガワエのグループにおいて、グループに属する菌類に固有の塩基配列を有する可変領域を見出した。この可変領域において、アスペルギルスフミガタスおよびその類縁菌は菌種によって固有の塩基配列を有しているため、アスペルギルスフミガタスおよびその類縁菌を菌種レベルで識別・同定することが可能となる。本発明は、この可変領域及び可変領域に由来するオリゴヌクレオチドをターゲットとしたものである。

本発明の検出方法に用いるアスペルギルスフミガタス類縁菌のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列（可変領域の塩基配列）で表される核酸は、配列番号１若しくは配列番号２に記載の塩基配列又はその相補配列で表される核酸である。

配列番号１に記載の塩基配列及びその相補配列は、アスペルギルスレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｌｕｓ）から単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。この配列はアスペルギルスレンタスグループに特異的、すなわちアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスレンタスに系統的に非常に近い種であるアスペルギルスフミシネマタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｓｙｎｎｅｍａｔｕｓ）に特異的な配列であるため、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、アスペルギルスフミガタスおよびその類縁菌の中からアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのみを特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基か欠失、置換若しくは付加された塩基配列又はその相補配列で表される核酸を用いても、同様にアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのみを特異的に識別・同定することが可能である。
配列番号２に記載の塩基配列及びその相補配列は、アスペルギルスウダガワエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｕｄａｇａｗａｅ）から単離、同定されたβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列である。この配列はアスペルギルスウダガワエに特異的な配列であるため、被検体がこの塩基配列を有しているか否かを確認することで、アスペルギルスフミガタスおよびその類縁菌の中からアスペルギルスウダガワエのみを特異的に識別・同定することが可能である。また、配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基か欠失、置換若しくは付加された塩基配列又はその相補配列で表される核酸を用いても、同様にアスペルギルスウダガワエのみを特異的に識別・同定することが可能である。
（以下、配列番号１若しくは２に記載の塩基配列またはその相補配列、配列番号１若しくは２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基か欠失、置換若しくは付加された塩基配列またはその相補配列をまとめて「本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列」ともいう。）

上記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてアスペルギルスフミガタス類縁菌を同定する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。

本発明の検出方法において、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてアスペルギルスフミガタス類縁菌の同定を行うには、被検体のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、該遺伝子の塩基配列中に前記（ａ）または（ｂ）に記載の核酸の塩基配列が含まれるか否かを確認することが好ましい。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列とを比較し、その一致または相違に基づいてゲオスミチア属に属する菌類の同定を行うものである。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡまたはＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。

本発明においては、上記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌の同定を行うために、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、かつアスペルギルスフミガタス類縁菌を特異的に検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る検出用オリゴヌクレオチドを用いることができる。
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、アスペルギルスフミガタス類縁菌の検出に使用できるものであればよい。すなわち、アスペルギルスフミガタス類縁菌の検出のための核酸プライマーや核酸プローブとして使用できるものや、ストリンジェントな条件でアスペルギルスフミガタス類縁菌のβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであれば良い。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。

本発明の検出用オリゴヌクレオチドの塩基数は特に限定されないが、１３塩基〜３０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２３塩基であることがより好ましい。また、ハイブリダイズ時のＴｍ値が５５℃〜６５℃の範囲内であることが好ましく、５９℃〜６２℃の範囲内であることがより好ましい。ＧＣ含量は、３０％〜８０％が好ましく、４５％〜６５％がより好ましく、５５％前後であることが最も好ましい。

本発明の上記検出用オリゴヌクレオチドとしては、配列番号３〜１８のいずれかに記載の塩基配列若しくはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドがより好ましい。また、本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、配列番号３から１８のいずれかに記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列またはその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがより好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができる検出用オリゴヌクレオチドには、配列番号３から１８のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列において１または数個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号３から１８のいずれかに記載の塩基配列またはその相補配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。塩基配列の相同性については、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔｓｉｚｅｔｏｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出することができる。

本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、核酸プライマー及び核酸プローブとして用いることができる。核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標的核酸を標識して捕捉することもできる。

被検体中のアスペルギルスフミガタス類縁菌を検出するためには、本発明の検出用オリゴヌクレオチドを標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出法により検出すればよい。上記核酸プローブはアスペルギルスフミガタス類縁菌のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の一部と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のアスペルギルスフミガタス類縁菌を迅速かつ簡便に検出することができる。ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。

本発明の検出方法において、前記本発明のβ−チューブリン遺伝子の可変領域の塩基配列で表される核酸を用いてアスペルギルスフミガタス類縁菌の同定を行うためには、該塩基配列の全部または一部の領域のＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。当該領域を含むＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-based Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop mediated isothermal amplification）法など通常の方法を用いることができる。しかし、本発明においては、ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法を用いるのが迅速性及び簡便性の観点から好ましい。

本発明において、ＰＣＲ法を用いてアスペルギルスフミガタス類縁菌の検出を行う場合について説明する。

アスペルギルスレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｌｕｓ）及び／又はアスペルギルスフミシネマタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｓｙｎｎｅｍａｔｕｓ）を検出する場合、下記の（ｃ）または（ｄ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのが好ましく、配列番号３および配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いるのがさらに好ましい。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明のアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタス検出用オリゴヌクレオチド対は、前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対である。

配列番号３および配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、可変領域の一部分の塩基配列またはその相補配列と同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのＤＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
前記（ｃ）及び（ｄ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列のうち、それぞれ９７位〜１１８位まで、３６１位〜３８３位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスを特異的に検出することができる。

本発明において、ＰＣＲ法を用いてアスペルギルスウダガワエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｕｄａｇａｗａｅ）を検出する場合、下記の（ｅ）または（ｆ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いるのが好ましく、配列番号５および配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド対を用いるのがさらに好ましい。
（ｅ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して７０％以上の相同性を有しかつ核酸プライマーとして使用できる塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
また、本発明のアスペルギルスウダガワエ検出用オリゴヌクレオチド対は、前記（ｅ）のオリゴヌクレオチドと前記（ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対である。

配列番号５および配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子領域に存在し、可変領域の一部分の塩基配列またはその相補配列と同じ塩基配列を持つオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、アスペルギルスウダガワエのＤＮＡの一部分に特異的にハイブリダイズすることができる。
前記（ｅ）及び（ｆ）で示されるオリゴヌクレオチドは、配列番号２に記載の塩基配列のうち、それぞれ９３位〜１１４位まで、３３８位〜３５７位までの領域に対応する。したがって、前記オリゴヌクレオチドをアスペルギルスウダガワエのβ−チューブリン遺伝子にハイブリダイズさせることによって、アスペルギルスウダガワエを特異的に検出することができる。

本発明におけるＰＣＲ反応の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を約５９℃で約６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で約６０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを約３０〜３５サイクル行う。

本発明において、ＰＣＲ法により増幅した遺伝子断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、ＰＣＲ反応産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、ＰＣＲ反応産物の塩基配列を解読する方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間に蛍光物質を入り込ませ発光させる方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。
検体にアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌に属する菌類が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ反応産物について電気泳動を行うと、これらの菌類に特異的な約２５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められる。この操作を行うことにより、検体にアスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）類縁菌に属する菌類が含まれているかを確認することができる。

次に、本発明において、ＬＡＭＰ法を用いてアスペルギルスフミガタス類縁菌の検出を行う場合について説明する。
本発明において目的領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法によって増幅させる場合、周期的な温度変化制御が不要となるため、等温での相補鎖合成反応が可能である。このため、検体中に含まれる特定の菌類を簡便かつ迅速に検出できる。

ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法で不可欠とされる周期的な温度変化制御が不要なループ媒介等温増幅法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）であって、鋳型となるヌクレオチドにプライマーの３’側をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能にする。このＬＡＭＰ法では、鋳型となる核酸の６つの塩基配列領域を認識する少なくとも４つのプライマーが必要とされる。これらのプライマーは、３’側が常に鋳型となるヌクレオチドにアニールするように設計されるため、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能することになり、高感度でかつ特異性の高い核酸の増幅反応が可能となる。

ＬＡＭＰ法に用いられるプライマーが認識する６つの塩基配列領域は、鋳型となるヌクレオチドの５’側から順にＦ３、Ｆ２、Ｆ１と呼び、３’側から順にＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃと呼び、さらに、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３の相補的な塩基配列をそれぞれＦ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃと呼び、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃの相補的な塩基配列をそれぞれＢ１、Ｂ２、Ｂ３と呼ぶ。
上記６つの塩基配列領域は、以下のように選定することができるが、本発明はこれに限定されるものではない。
対象となる菌種遺伝子の塩基配列のアライメントを行い、Primer Explorer V4（栄研化学ホームページ）等のソフトウエアを用いて、複数のプライマーを設計する。それらを合成し、実際にLAMP反応を行い、アスペルギルスフミガタス類縁菌を特異的に検出することができるプライマーを採用した。
詳細には、
１． Clustal Xなどのアラインメントソフトを用いて対象となる菌種の標的領域の塩基配列情報のアライメントファイルを作成する。
２．アライメントファイル中の情報をもとにPrimer Explorer V4（栄研化学ホームページ）を用いてプライマーを設計する。
３．設計されたプライマーセットの候補の中からより安定（dimer構造をとりにくい）で、伸長方向の先端に変異（種特異的な変異）を多く含むプライマーセットを選択する。特にインナープライマーの伸長方向に多くの変異を含んでいると近縁な種とも区別ができる可能性が高まる。プライマーセットの候補ができない場合には、Tm値やプライマーの塩基数についての設定をゆるく幅を持たせるようにし設計する。
４．実際に選択したプライマーセットを用いて試験を行い、有効性を確認する。有効性が確認された後、ループプライマーを設計し、より反応時間が短くなるようにする。

ＬＡＭＰ法に用いられるプライマーの設計は、まず、標的領域の塩基配列から上記の６つの塩基配列領域を決定し、その後、後述するインナープライマーＦ及びＢ並びにアウタープライマーＦ及びＢを設計する。

ＬＡＭＰ法に用いられる「インナープライマー」とは、標的塩基配列上のある特定のヌクレオチド配列領域を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’側に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’側に有するオリゴヌクレオチドのことをいう。このうち、前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下、ＦＩＰ）と呼び、前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列を含むプライマーをインナープライマーＢ（以下、ＢＩＰ）と呼ぶ。このインナープライマーは、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域の間、またはＢ２領域とＢ１ｃ領域の間に、塩基数０〜５０のいずれかの長さの任意の塩基配列を有していてもよい。
一方、「アウタープライマー」とは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」（例えば前記Ｆ２領域またはＢ２領域）の５'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｆ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーおよびＢ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーが挙げられる。ここで、Ｆ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下、Ｆ３プライマー）、Ｂ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーＢ（以下、Ｂ３プライマー）と呼ぶ。
ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供することを意味するプライマー表示であり、各プライマーにおけるＢとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供することを意味するプライマー表示である。

ＬＡＭＰ法における核酸の増幅では、インナープライマー及びアウタープライマーに加え、さらにループプライマー（以下、ＬＦ、ＬＢ）を好ましく用いることができる。ループプライマーは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、このループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’側に含むプライマー（二本鎖を構成する各々について１つずつ）のことをいう。すなわち、ダンベル構造の５’側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いれば、核酸合成の起点が増加するため、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。
ループプライマーの塩基配列は、上記ダンベル構造の５’側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的領域の塩基配列又はその相補鎖から選択されてもよく、他の塩基配列でもよい。また、ループプライマーは１種類であっても、２種類であってもよい。

上記の少なくとも４種以上のプライマーを用いて標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅すれば、当該ＤＮＡ断片を特異的かつ効率的に検出可能な量まで増幅することが可能である。このため、増幅産物の有無を確認することによって、特定の菌類を検出することができる。

ＬＡＭＰ法に用いることができるプライマーは、１５塩基以上であることが好ましく、２０塩基以上であることがさらに好ましい。また、各プライマーは、単一の塩基配列のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数の塩基配列のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。

また、ＬＡＭＰ法に用いることができるアウタープライマーは、標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅するためにＰＣＲ法にも使用できる。ＰＣＲ法では、上記プライマーを用いて、検体中のβ−チューブリン遺伝子を鋳型に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲを行えば、目的とするＤＮＡ断片を増幅させることが可能である。

アスペルギルスフミガタス類縁菌をＬＡＭＰ法により検出する場合に好ましく用いられるプライマーセットについて説明する。
アスペルギルスレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｌｕｓ）及びアスペルギルスフミシネマタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｓｙｎｎｅｍａｔｕｓ）を特異的に検出するために、下記（ｇ）〜（ｊ）のプライマーからなるプライマーセットを用いるのがより好ましい。

アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタス検出用プライマーセット
（ｇ）配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｈ）配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｉ）配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー

アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、下記（ｋ）及び／又は（ｌ）のプライマーを用いるのが好ましい。

アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタス検出用ループプライマー
（ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー

図１に、アスペルギルスレンタスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。

本発明のアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタス検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号１１及び／又は配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。このプライマーセットを用いることにより、アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのβ−チューブリン遺伝子の標的領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスが存在すると判断できる。

アスペルギルスウダガワエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｕｄａｇａｗａｅ）を特異的に検出するために、下記（ｍ）〜（ｐ）のプライマーからなるプライマーセットを用いるのがより好ましい。

アスペルギルスウダガワエ検出用プライマーセット
（ｍ）配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｎ）配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｏ）配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｐ）配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー

アスペルギルスウダガワエを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、下記（ｑ）及び／又は（ｒ）のプライマープライマーを用いるのが好ましい。

アスペルギルスウダガワエ検出用ループプライマー
（ｑ）配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
（ｒ）配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー

図２に、アスペルギルスウダガワエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。

本発明のアスペルギルスウダガワエ検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号１７及び／又は配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。このプライマーセットを用いることにより、アスペルギルスウダガワエのβ−チューブリン遺伝子の標的領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にアスペルギルスウダガワエが存在すると判断できる。

また、本発明のアスペルギルスフミガタス類縁菌検出用オリゴヌクレオチドは、β−チューブリン遺伝子の塩基配列から選択される標的領域の５’側から、塩基配列領域としてＦ３、Ｆ２及びＦ１を選択し、前記標的領域の３’側から、塩基配列領域としてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃを選択し、前記Ｂ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃの相補的塩基配列を、それぞれＢ３、Ｂ２及びＢ１とし、前記Ｆ３、Ｆ２及びＦ１に相補的な塩基配列を、それぞれＦ３ｃ、Ｆ２ｃ及びＦ１ｃとしたとき、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに該当する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
（ａ）前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列
（ｂ）前記Ｂ３領域を有する塩基配列
（ｃ）前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列
（ｄ）前記Ｆ３領域を有する塩基配列
（ｅ）前記Ｂ１領域と前記Ｂ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
（ｆ）前記Ｆ１領域と前記Ｆ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＬＡＭＰ法で用いられるプライマーとしてだけではなく、ＰＣＲ法等のプライマー、核酸検出用プローブなどとしても用いることができる。

標的領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により増幅させる場合に用いられる酵素は、通常用いられるものであれば特に制限はないが、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素が好ましい。このような酵素としては、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。本発明に用いることができる酵素は、ウイルスや細菌等から精製されたものでもよく、遺伝子組換え技術によって作製されたものでもよい。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換等の改変をされたものでもよい。

標的領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により増幅させるときの温度に特に制限はないが、６０〜６５℃であることが好ましい。

標的領域を含むＤＮＡ断片の増幅は通常の方法により確認することができる。前記標的領域を含むＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法によって増幅させる場合には、例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドをプローブに用いてハイブリダイゼーションを行ったり、蛍光性インターカレーター法（特開２００１−２４２１６９号公報）で検出したり、あるいは、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲルで電気泳動してバンドとして検出することもできる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ法増幅産物は塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。
また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸イオンが、共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムが算出される。ピロリン酸マグネシウムが算出されると、反応液が肉眼で確認できる程度にまで白濁する。この白濁を指標として、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器を用いて核酸の増幅反応を検出できる。例えば、分光光度計を用いて４００ｎｍにおける吸光度の変化を確認することによって、核酸の増幅反応を検出することができる（国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。

本発明に用いられる前記検出用オリゴヌクレオチド、核酸プライマーおよび核酸プローブは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、公知の方法を使用して合成できる。

上記検出用オリゴヌクレオチド、核酸プライマーおよび核酸プローブの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。

本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
検体からＤＮＡを調製する方法としては、アスペルギルスフミガタス類縁菌の検出を行うのに十分な精製度および量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。

本発明の前記検出用オリゴヌクレオチド、核酸プローブまたは核酸プライマーは、アスペルギルスフミガタス類縁菌の検出を行う際に必要な各種の試薬類とともに予めパッケージングして、アスペルギルスフミガタス類縁菌検出用キットとすることができる。
例えば、本発明のキットには、ＬＡＭＰ法に用いることができる上記（ｇ）〜（ｊ）のプライマーセット及び／又は上記（ｍ）〜（ｐ）のプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰとを含有する。好ましくは、上記（ｇ）〜（ｌ）のプライマーセット及び／又は上記（ｍ）〜（ｒ）のプライマーセット、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素などのＤＮＡポリメラーゼと、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩又はマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして含有される。本発明のキットには、本発明のプライマーによってＬＡＭＰ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。

また、本発明の検出用キットは、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド対及び／または前記（ｅ）及び（ｆ）のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして含有するものである。このキットは、ＰＣＲ法によりアスペルギルスフミガタス類縁菌を検出する方法に好ましく用いることができる。本発明のキットは、前記核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、菌類の検出に通常用いられる物質を含有する。

本発明の方法によれば、検体の調製工程から菌類の検出工程までを約６０〜１２０分という短時間で行うことが可能である。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１アスペルギルスフミガタス類縁菌に特異的な塩基配列の解析
下記の方法によりアスペルギルス属に属する各菌類のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定した。ポテトデキストロース寒天斜面培地にて２５℃、７日間、暗所培養したアスペルギルスフミガタス類縁菌体からＧｅｎとるくんＴＭ（タカラバイオ（株）社製）を使用し、ＤＮＡを抽出した。目的とする部位のＰＣＲ増幅は、PuRe TaqTM Ready-To-Go PCR Beads（GE Health Care UK LTD製）を用いて、プライマーとして、Bt2a（5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'、配列番号１９）、Bt2b（5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'、配列番号２０）（Glass and Donaldson，Appl Environ Microbiol 61：1323−1330，1995）を使用した。増幅条件は、変性温度９５℃、アニリング温度５９℃、伸長温度７２℃、３５サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、Auto SegTM G-50（Amersham Pharmacia Biotech社製）を使用し精製した。PCR産物は、BigDye terminator Ver. 1.1（商品名、Applied Biosystems社製）を使用してラベル化し、ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウエアー‘ATGC Ver. 4’（Genetyx社製）を使用した。
シークエンシング法により決定した各種菌類（アスペルギルスフミガタス（特願2008-139999参照）、アスペルギルスレンタス、アスペルギルスウダガワエ、アスペルギルスニガー（アクセッションナンバー：AY585535）、ハミゲラアベラネラ（特願2008-139999参照）、ビソクラミスニベア（特願2008-139999参照））のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスに特異的な塩基配列（配列番号１）、及びアスペルギルスウダガワエに特異的な塩基配列（配列番号２）を特定した。

実施例２ＰＣＲ法によるアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスの検出
（１）プライマーの調製
実施例１で得られたアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスに特異的な塩基配列領域（配列番号１）のうち、３´末端側でアスペルギルスレンタスグループの特異性が特に高い領域から、１）グループ固有の塩基配列が１０塩基前後連続している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部位の検討を行った。この部分領域の塩基配列を基にして１組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲ反応によるアスペルギルスレンタスグループ検出の有効性、すなわち、アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのＤＮＡを鋳型とした反応では約３００ｂｐＤＮＡ増幅反応が認められ、その他の菌類のゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、設計したプライマー対の有効性を確認した。配列番号３及び４記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドが、このプライマー対である。なお、使用したプライマーはシグマアルドリッチジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入したものである。

（２）検体の調製
アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスとしては、表１に記載の菌株を使用した。アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのβ−チューブリン遺伝子に対する配列番号３及び４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー特異性を示すために、表１に示す他のアスペルギルスフミガタス類縁菌および他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコアポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。

（３）ゲノムＤＮＡの調製
各菌体を寒天培地から白金耳を用いて回収した。
ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製ＰｒｅｐＭａｎｕｌｔｒａ（商品名））を用いて、回収した菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ／μｌに調製した。

（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、ＰｒｅＭｉｘＴａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Al1Fプライマー：GTGTTCAGCTTCGCTGCCATGA、２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Al1Rプライマー：GTCAGACCGTGGGATGTTGTCA、２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９８℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)６３℃、１分間のアニーリング反応、および(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。

（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲＳａｆｅＤＮＡｇｅｌｓｔａｉｎｉｎ１×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、紫外線下で蛍光を検出することにより増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図３に示す。図中の番号は表１記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのゲノムＤＮＡを含む試料（試料番号１〜６）では、約２５０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスを特異的に検出することができる。

実施例３ＰＣＲ法によるアスペルギルスウダガワエの検出
（１）プライマーの調製
実施例１で得られたアスペルギルスウダガワエグループに特異的な塩基配列領域（配列番号２）のうち、３´末端側でアスペルギルスウダガワエグループの特異性が特に高い領域から、１）グループ固有の塩基配列が１０塩基前後連続している、２）ＧＣ含量が概ね３０％〜８０％となる、３）自己アニールの可能性が低い、４）Ｔｍ値が概ね５５〜６５℃程度となる、の４つの条件を満たす部位の検討を行った。この部分領域の塩基配列を基にして１組のプライマー対を設計し、各種菌体から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲ反応によるアスペルギルスウダガワエグループ検出の有効性、すなわち、アスペルギルスウダガワエのＤＮＡを鋳型とした反応では約２５０ｂｐＤＮＡ増幅反応が認められ、その他の菌類のゲノムＤＮＡを鋳型とした反応では増幅産物が認められないことの検討を行った。その結果、設計したプライマー対の有効性を確認した。配列番号５及び６記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドげ、このプライマー対である。なお、使用したプライマー対はシグマアルドリッチジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、0.02μmolスケール）、購入したものである。

（２）検体の調製
アスペルギルスウダガワエとしては、表２に記載の菌株を使用した。アスペルギルスウダガワエのβ−チューブリン遺伝子に対する配列番号５及び６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー特異性を示すために、表２に示す他のアスペルギルスフミガタス類縁菌および他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコアポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。

（４）ＰＣＲ反応
ＤＮＡテンプレートとして、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液１μｌ、ＰｒｅＭｉｘＴａｑ（商品名、タカラバイオ社製）１３μｌ、無菌蒸留水１０μｌを混合し、配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Ａｓｐ１Ｆプライマー：CCATGGTTTCAGCGTCGCTTTG、２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌ及び配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（Ａｓｐ１Ｒプライマー：GTAGTGTAGAGTCGAGTTTC、２０ｐｍｏｌ／μｌ）０．５μｌを加え、２５μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
ＰＣＲ反応液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ反応条件は、(i)９８℃、１０秒間の熱変性反応、(ii)６３℃、１分間のアニーリング反応、および(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行った。

（５）増幅した遺伝子断片の確認
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ反応液から１０μｌを分取し、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＳＹＢＲＳａｆｅＤＮＡｇｅｌｓｔａｉｎｉｎ１×ＴＡＥ（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、紫外線下で蛍光を検出することにより増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。アガロースゲルの電気泳動図を図４に示す。図中の番号は表２記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。
その結果アスペルギルスウダガワエのゲノムＤＮＡを含む試料（試料番号１〜４）では、約２５０ｂｐ程度の遺伝子断片の増幅が確認された。一方、アスペルギルスウダガワエのゲノムＤＮＡを含まない試料では、遺伝子断片の増幅は確認されなかった。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、アスペルギルスウダガワエを特異的に検出することができる。

実施例４ＬＡＭＰ法によるアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスの検出
（１）プライマーの設計及び合成
実施例１で得られたアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスに特異的な塩基配列領域（配列番号１）をもとに、ＬＡＭＰ法プライマー設計支援ソフトウェアＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒＶ４を用いて、４セットのＬＡＭＰプライマー対を設計した。各種菌体から抽出したＤＮＡを用いて、これら4セットのプライマー対についてそれぞれ、ＬＡＭＰ法によるアスペルギルスレンタスグループ検出の有効性を検討したところ、そのうちの１つのプライマー対で有効性を確認した。配列番号７〜１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドはそのプライマー対である。なお、使用したプライマーはE Genome order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号７，８；５ｐmolスケール、配列番号９，１０；４０ｐmolスケール、配列番号１１，１２：２０ｐmolスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入したものである。

（２）検体の調製
アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスとしては、表３に記載の菌株を使用した。アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのβ−チューブリン遺伝子に対する配列番号７〜１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの特異性を確かめるために、表３に示す他のアスペルギルスフミガタス類縁菌および他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコアポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。

（３）ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名ＰｒｅｐＭａｎｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度は５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、以下のＬＡＭＰ反応に用いた。

（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）４０ｍＭ、ＫＣｌ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ_４１６ｍＭ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ１．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社；ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｌ３Ｆ３プライマー：TCTCCACCTCAATGCTAGGA、５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｌ３Ｂ３プライマー：ACGCGTCCTCTTCTTCCTT、５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｌ３ＦＩＰプライマー：CTCATGGCAGCGAAGCTGAACAGGAGACTGGGACCTGTCATC、４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｌ３ＢＩＰプライマー：TTGACGGCTCTGGCCAGTAAGGCCTTACGTGTTTCCGCC、４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｌ３ＬＦループプライマー：CATGGAGGACAGCCTGCT、２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｌ３ＬＢループプライマー：TCGACCTATATCCTCCCAATTGA、２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、ＢｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、および上記で調製した鋳型ＤＮＡ１μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。

（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置ＬｏｏｐａｍｐＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。

（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図５および図６に示す。
その結果、アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスのゲノムＤＮＡを鋳型とした系（試料番号１〜４）のみで、反応開始２０分前後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、その他の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系、すなわち他のアスペルギルス属（試料番号５アスペルギルスブレビペス、試料番号６アスペルギルスドリキャリス、試料番号７アスペルギルスフミガタフィニス、試料番号８アスペルギルスフミガタス、試料番号９アスペルギルスノボフミガタス、試料番号１０アスペルギルスウダガワエ、試料番号１１アスペルギルスウニラテラリス、試料番号１２アスペルギルスビリデヌタンス）やネオサルトリア属（資料番号１３ネオサルトリアフィシェリ、試料番号１４ネオサルトリアスピノサ、試料番号１５ネオサルトリアグラブラ、試料番号１６ネオサルトリアヒラツカエ）では、反応開始後１００分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始１００分前後から、アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタス以外のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これは経時的にプラマー同士の非特異的な反応が発生したため、あるいは反応時間が長いと、ターゲット以外の部分にも少数のプライマーが反応してしまったためと考えられる。
以上の結果から、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスを検出することが可能である。

実施例５ＬＡＭＰ法によるアスペルギルスウダガワエの検出
（１）プライマーの設計及び合成
実施例１で得られたアスペルギルスウダガワエグループに特異的な塩基配列領域（配列番号２）をもとに、ＬＡＭＰ法プライマー設計支援ソフトウェアＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒＶ４を用いて３セットのＬＡＭＰプライマーを設計した。各種菌体から抽出したＤＮＡを用いて、これら３セットのプライマー対についてそれぞれ、ＬＡＭＰ法によるアスペルギルスウダガワエグループ検出の有効性を検討したところ、そのうち１セットのプライマー対で有効性を確認した。配列番号１３〜１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドはそのプライマー対である。なお、使用したプライマーはE Genome order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号１３，１４；５ｐmolスケール、配列番号１５，１６；４０ｐmolスケール、配列番号１７，１８：２０ｐmolスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入したものである。

（２）検体の調製
アスペルギルスウダガワエとしては、表４に記載の菌株を使用した。アスペルギルスウダガワエのβ−チューブリン遺伝子に対する配列番号１３〜１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの特異性を確かめるために、表４に示す他のアスペルギルスフミガタス類縁菌および他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコアポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。

（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）４０ｍＭ、ＫＣｌ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ_４１６ｍＭ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ１．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社；ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｓｐ３Ｆ３プライマー：AGGACCTGTCATCCTAGCA、５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｓｐ３Ｂ３プライマー：ATCCTCATCAGACACGCGC、５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｓｐ３ＦＩＰプライマー：TCACCAGAGATGGTCTGCCTGTTTTCCTCCATGGTTTCAGCG、４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｓｐ３ＢＩＰプライマー：CTTGACGGCTCTGGCCAGTATTCCTGCTTGCCTTTCGC、４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｓｐ３ＬＦループプライマー：TTTGTTAGCTGATACCCATCAAAGC、２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｓｐ３ＬＢループプライマー：TCCTCCCAATTGAGAAAGCGGG、２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、ＢｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、および上記で調製した鋳型ＤＮＡ１μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。

（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図７および図８に示す。
その結果、アスペルギルスウダガワエのゲノムＤＮＡを鋳型とした系（試料番号１〜３）のみで、反応開始２０分前後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、その他の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系、すなわちその他のアスペルギルス属（試料番号４アスペルギルスブレビペス、試料番号５アスペルギルスドリキャリス、試料番号６、アスペルギルスフミガタフィニス、試料番号７アスペルギルスフミガタス、試料番号８アスペルギルスフミシネマタス、試料番号９アスペルギルスレンタス、試料番号１０アスペルギルスノボフミガタス、試料番号１１アスペルギルスウニラテラリス）やネオサルトリア属（資料番号１３ネオサルトリアフィシェリ、試料番号１４ネオサルトリアスピノサ、試料番号１５ネオサルトリアグラブラ、試料番号１６ネオサルトリアヒラツカエ）では、反応開始後７０分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始７０分前後から、アスペルギルスウダガワエ以外のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これは経時的にプラマー同士の非特異的な反応が発生したため、あるいは反応時間が長いと、ターゲット以外の部分にも少数のプライマーが反応してしまったためと考えられる。
以上の結果から、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にアスペルギルスウダガワエを検出することが可能である。

アスペルギルスレンタスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、アスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタス検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。アスペルギルスウダガワエのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、アスペルギルスウダガワエ検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。実施例２における、ＰＣＲ産物の電気泳動図である。実施例３における、ＰＣＲ産物の電気泳動図である。実施例４における、リアルタイム濁度法によるアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスの検出感度を示す図である。１はAspergillus lentulus A170株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はAspergillus lentulus AS10株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、３はAspergillus fumisynnematus A234株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、４はAspergillus fumisynnematus A240株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、８はAspergillus fumigatus A215株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。実施例４における、リアルタイム濁度法によるアスペルギルスレンタス及びアスペルギルスフミシネマタスの検出感度を示す図である。１０はAspergillus udagawae A221株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１６はNeosartorya hiratsukae IFM47036株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。実施例５における、リアルタイム濁度法によるアスペルギルスウダガワエの検出感度を示す図である。１はAspergillus udagawae A221株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はAspergillus udagawae N73株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、３はAspergillus udagawae A19株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。実施例５における、リアルタイム濁度法によるアスペルギルスウダガワエの検出感度を示す図である。９はAspergillus lentulus A170株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１１はAspergillus unilateralis A131株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１２はAspergillus viridinutans A132株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１３はNeosartorya ficheri A213株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１４はNeosartorya spinosa IFM46945株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。

Claims

アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）類縁菌の検出方法であって、
前記アスペルギルス・フミガタス類縁菌がアスペルギルス・レンタス（Aspergillus lentulus）及びアスペルギルス・フミシネマタス（Aspergillus fumisynnematus）からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いてβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅し、増幅産物の有無を確認して同定を行い、アスペルギルス・フミガタス類縁菌を検出する、アスペルギルス・フミガタス類縁菌の検出方法。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）類縁菌検出用オリゴヌクレオチド対であって、
前記オリゴヌクレオチド対が核酸プライマー対であり、
前記アスペルギルス・フミガタス類縁菌がアスペルギルス・レンタス（Aspergillus lentulus）及びアスペルギルス・フミシネマタス（Aspergillus fumisynnematus）からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
下記の（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなり、
前記アスペルギルス・フミガタス類縁菌のβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列で表される核酸にハイブリダイズすることができ、アスペルギルス・フミガタス類縁菌を特異的に検出するための核酸プライマーとして機能し得る、アスペルギルス・フミガタス類縁菌検出用オリゴヌクレオチド対。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド
核酸プライマー対として請求項２記載のオリゴヌクレオチド対を含む、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）類縁菌検出用キット。