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JP5420566B2 - 微生物系及び流体試料分析の方法 - Google Patents

微生物系及び流体試料分析の方法 Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願第６１／０１６，２６５号（２００７年１２月２１出願）の利益を請求するものである。
大腸菌又は他の指示菌の存在は、食料及び水質の重要証拠である。飲料水又は特定の食料、例えば乳製品において見出される大腸菌の許容される量は、多くの国及び／又は自治体において規制されている。大腸菌群は、土壌に見られるもの等の自然界から生じる細菌を含む。大腸菌群は、エシェリキアコリ等の糞便性大腸菌も含む。試料内の糞便性大腸菌の存在は、食料又は水の最近の糞便汚染、及び可能性のある病原菌の存在の主な指標である。
水試料内の微生物を数えるための方法は、例えば、アメリカ公衆保健協会、米国水道協会、及び水環境連盟の共同出版である、抄録「Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ」（ＳＭＥＷＷ）、２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎにおいて見ることができる。ＳＭＥＷＷは、水中の微生物を直接数えるための膜濾過技法を記載する。膜濾過技法は、飲料水を生成することを意図したプロセスからの試料、加えて様々な天然の未処理水源からの試料の微生物学的品質を観察するのに有用である。
食料試料内の微生物を数えるための方法は、食料の特性、及び試料内に見られる傾向のある有機体の種類によって異なることが多い。食料試料を試験するための方法のいくつかの抄録には、アメリカ公衆保健協会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．によって出版された「Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、２７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、及び米国食品医薬品局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．によって出版されたＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（「ＢＡＭ」）が挙げられる。固形食料は、定量的微生物分析の方法において使用することができる、食品材料の液体ホモジネートを得るために、通常、水媒体中で懸濁され、混合及び／又は粉砕される。
前述の方法のそれぞれは、典型的には、試験結果を観察し、解釈するために非常に熟練した技術者を必要とする。液体試料内の微生物の数を決定するための簡単かつ正確な方法の必要性が存在する。
一実施形態では、本発明は、試料内の標的微生物の存在を検出する方法を含む。該方法は、標的微生物を含有する疑いがある試料、表面フィルタ、及び培地を含む培養デバイスを提供する工程を含むことができる。該方法は、フィルタ上に標的微生物を収集する工程と、表面フィルタを培地と接触させる工程と、培養デバイスを一定期間培養する工程と、標的微生物の存在を検出する工程と、を更に含むことができる。標的微生物は、任意に、自動検出システムにより検出することができる。
別の実施形態では、本発明は、液体試料内の標的微生物の存在を検出する方法を含む。該方法は、標的微生物を含有する疑いがある液体試料、培地を含む培養デバイス、及び培養デバイス内の水和培地と接触する時に実質的に透明であるフィルタを提供する工程を含むことができる。該方法は、フィルタ上に標的微生物を収集する工程と、フィルタを培地と接触させる工程と、培養デバイスを一定期間培養する工程と、標的微生物の存在を検出する工程と、を更に含むことができる。標的微生物は、任意に、自動検出システムにより検出することができる。
別の実施形態では、本発明は、ガス産生微生物を検出するための方法を含む。該方法は、ガス産生微生物を含有する疑いがある試料、表面フィルタ、及び発酵性栄養素を含む培地を含有する平坦フィルム培養デバイスを提供する工程を含むことができる。該方法は、試料からのガス産生微生物を表面フィルタ上に収集する工程と、表面フィルタを培地と接触させる工程と、培地と接触している表面フィルタを一定期間培養する工程と、ガス産生微生物の存在を検出する工程と、を更に含むことができる。標的微生物は、任意に、自動検出システムにより検出することができる。
別の実施形態では、本発明は、ガス産生微生物を検出するための方法を含む。該方法は、ガス産生微生物を含有する疑いがある試料、発酵性栄養素を含有する培地を含む培養デバイス、培養デバイス内の水和培地と接触する時に実質的に透明であるフィルタ、及び自動検出システムを提供する工程を含むことができる。該方法は、試料からのガス産生微生物をフィルタ上に収集する工程と、フィルタを培地と接触させる工程と、培地と接触している表面フィルタを一定期間培養する工程と、ガス産生微生物の存在を検出する工程と、を更に含むことができる。標的微生物は、任意に、自動検出システムにより検出することができる。
「培養デバイス」という用語は、少なくとも１つの細胞分裂が生じることを可能にする条件下で微生物を繁殖するために使用されるデバイスを指す。培養デバイスは、偶発的な汚染の可能性を最小化するためのハウジング（例えば、カバー付きペトリ皿）、及び微生物の成長を支持するための栄養素源を含む。
「フィルタ」という用語は、上下の主表面からなる、比較的に平面的な膜フィルタを指す。膜フィルタは、上下の主表面、並びに流体及び微粒子がフィルタの上面から下面へ通過することができる、孔、流路、又は通路からなる。本明細書において使用される時、「上主表面」は、液状試料（例えば、浮遊粒子を伴う液体又はガス）が通ってフィルタに入る、フィルタの主表面を指す。「下主表面」という用語は、濾液が通ってフィルタから出る、フィルタの主表面を指す。
本明細書において使用される時、「表面フィルタ」又は「表面型フィルタ」は、フィルタの一種を指し、フィルタの表面における個々の通路の開口部の断面積が、概して、フィルタ内の任意の他の点におけるその通路の断面積とほぼ同じ大きさである。表面フィルタは、個々の通路の開口部より大きい粒子がフィルタを通って入ること、又は通過することを排除するため、粒子は、典型的には、フィルタの表面上に残る。
用語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で、特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は他の状況下において、他の実施形態もまた好ましい可能性がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の詳細説明は、他の実施形態が有用でないことを示すものではなく、本発明の範囲内から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
用語「含む」及びこの変形は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲中に現れる場合、制限する意味を有さない。
本明細書で使用する時、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」は、同じ意味で使用される。そのため、例えば、「１つの（ａ）」標的微生物を含有する疑いがある液体試料は、液体試料が「１つ以上の」標的微生物を含み得ることを意味すると解釈することができる。
用語「及び／又は」は、列記されている要素の１つ若しくは全て、又は列記されている要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
また本明細書において、端点による数の範囲の列挙には、その範囲内に包含される全ての数（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等）が包含される。
本発明の上記の「課題を解決するための手段」は、本発明が開示する各実施形態又はあらゆる実施例を説明することを意図したものではない。以下の説明により、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本明細書にわたっていくつかの箇所で、実施例の一覧を通して指導を提供するが、実施例は様々な組み合わせにおいて使用できる。それぞれの事例において、列挙された一覧は、代表的な群としてのみ役目を果たすのであって、排他的な一覧として解釈されるべきではない。
本発明は、以下に列挙される図面を参照して更に説明され、類似構造は、いくつかの図にわたって、類似番号によって参照される。
本発明の一実施形態による、その中にフィルタ膜が挿入された開口を伴うスペーサを含む、開いた平坦フィルム培養デバイスの斜視図。 本発明の一実施形態による、その中にフィルタ膜が挿入された開いた平坦フィルム培養デバイスの斜視図。 本発明の実施形態による、その上にフィルタ膜が配置された半固体培地が入ったペトリ皿の斜視図。 本発明の実施形態による、その上にフィルタ膜が配置された多孔性支持体が入ったペトリ皿の斜視図。
本発明は、液体試料内の微生物の検出及び／又は計数のための方法に関する。本発明は、更に、液体試料内の微生物を検出し、及び／又は数えるための、培養デバイスと併せた膜フィルタの使用に関する。３Ｍ ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレート（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）等の培養デバイスは、微生物の繁殖及び検出のために使用することができる、試料が準備されたデバイスである。更に、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートは、特定の標的微生物の検出及び計数を容易にするインジケータを含む。
図１は、本発明に従って使用され得る平坦フィルム培養デバイス１０を示す。培養デバイス１０は、上面１４及び下面１６を有する自己支持基材１２を含む本体部材１１を含む。基材１２は、その上面１４上を、接着剤組成物１８の層でコーティングされる。１つ以上のゲル化剤及び１つ以上の栄養素からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含有する、冷水で再構成可能な乾燥培地２０は、薄い、比較的均一な層で接着剤組成物１８に付着される。スペーサ２３は、基材１２、及び乾燥培地２０の表面を部分的に覆い、乾燥培地２０の一部を曝露する開口２４を含む。カバーシート２２は、スペーサ２３及び開口２４を覆う。カバーシート２２を持ち上げて乾燥培地２０を曝露すると、液体試料が通過した膜フィルタ２６を、開口２４内の曝露された乾燥培地２０上に設置することができる。膜フィルタ２６は、いずれの配向（即ち、膜フィルタ２６の上主表面が乾燥培地２０を向いた状態、又は膜フィルタ２６の上主表面がカバーシート２２を向いた状態）で乾燥培地２０上に設置することもできる。膜フィルタ２６を乾燥培地２０上に設置した後、好適な体積の水性溶媒（例えば、滅菌水）を開口２４の中へ堆積させることができ、カバーシート２２を膜フィルタ２６及び／又はスペーサ２３上に下げることができる。カバーシート２２は、米国特許第５，０８９，４１３号の図２に示されるように、接着層及び乾燥培地層を更に含んでもよい。溶質を含み得る水性溶媒（図示せず）で水和されると、冷水で再構成可能な乾燥培地２０の層は、再構成培地（図示せず）を迅速に形成し、それは次に、膜フィルタ２６の表面上に存在する微生物を成長させることが可能である。代替の実施形態では、乾燥培地２０は、膜フィルタ２６を培養デバイスの中へ挿入する前に、水性溶媒で水和して再構成培地を形成することができる。
図２は、本発明に従って使用され得る平坦フィルム培養デバイス１１０を示す。培養デバイス１１０は、上面１１４及び下面１１６を有する自己支持基材１１２を含む本体部材１１１を含む。基材１１２は、その上面１１４上を、接着剤組成物１１８の層でコーティングされる。１つ以上のゲル化剤及び１つ以上の栄養素からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含有する、冷水で再構成可能な乾燥粉末１２１は、薄い、比較的均一な層で接着剤組成物１１８に付着される。カバーシート１２２は、乾燥粉末１２１を覆う。カバーシート１２２を持ち上げると、液体試料が通過した膜フィルタ１２６を、乾燥粉末１２１上に設置することができる。膜フィルタ１２６は、いずれの配向（即ち、膜フィルタ１２６の上主表面が乾燥粉末１２１を向いた状態、又は膜フィルタ１２６の上主表面がカバーシート１２２を向いた状態）で乾燥粉末１２１上に設置することもできる。膜フィルタ１２６を乾燥粉末１２１上に設置した後、好適な体積の水性溶媒（例えば、滅菌水）を膜フィルタ１２６上に堆積させることができ、カバーシート１２２を膜フィルタ１２６上に下げることができる。水性溶媒（図示せず）で水和されると、冷水で再構成可能な乾燥粉末１２１の層は、再構成培地（図示せず）を迅速に形成し、それは次に、膜フィルタ１２６の表面上に存在する微生物を成長させることが可能である。代替の実施形態では、乾燥粉末１２１は、膜フィルタ１２６を培養デバイスの中へ挿入する前に、水性溶媒で水和して再構成培地を形成することができる。
図３は、本発明に従って使用することができる代替の培養デバイス２１０を示す。培養デバイス２１０は、半固体培地２３０が入った器２６０からなる。当該技術分野において既知である多数の好適な器２６０が存在する。好適な器２６０としては、ペトリ皿、フラスコ、瓶、管、ビーカー等が挙げられる。好ましくは、器は、試料又は培地２３０の汚染を防止するために、無菌であるか、又は滅菌することができる。器２６０は、汚染を防止し、及び／又は試料若しくは培地２３０の乾燥を防止するために、蓋、キャップ等で覆われてもよい（図示せず）。液体試料が通過した膜フィルタ２２６は、培地２３０上に設置することができる。膜フィルタ２２６は、いずれの配向（即ち、膜フィルタ２２６の上主表面が培地２３０を向いた状態、又は膜フィルタ２２６の下主表面が培地２３０を向いた状態）で培地２３０上に設置することもできる。図３は、好適な条件下での培養後に膜フィルタ２２６上で観察することができる微生物コロニー２５０を示す。
図４は、本発明に従って使用することができる培養デバイス３１０を示す。培養デバイス３１０は、器３６０及びフィルタ支持体３４０からなる。当該技術分野において既知である多数の好適な器３６０が存在する。好適な器３６０としては、ペトリ皿、フラスコ、瓶、管、ビーカー等が挙げられる。好ましくは、器は、試料又は多孔性支持体３４０の汚染を防止するために、無菌であるか、又は滅菌することができる。好ましくは、器３６０は、汚染を防止し、及び／又は試料若しくは多孔性支持体３４０の乾燥を防止するために、蓋、キャップ等で覆うことができる（図示せず）。多孔性支持体３４０は、多孔性支持体３４０が水性溶媒で飽和される時に、多孔性支持体３４０が膜フィルタ３２６の下面の少なくとも一部と水性溶媒との間の接触を提供するように、膜フィルタ３２６を支持することが可能である材料から作製することができる。いくつかの実施形態では、多孔性支持体３４０は、膜フィルタ３２６の下面全体と水性溶媒との間の接触を提供する。水性溶媒は、標的微生物の成長を支持するための栄養素を含有する溶液を含んでもよく、及び／又は標的微生物を検出するための試薬を含有する溶液を含んでもよい。あるいは、多孔性支持体は、標的微生物の成長を支持するための栄養素を含有する粉末、及び／又は標的微生物の存在を検出するための試薬を含有する粉末を含んでもよい。当業者は、標的微生物を成長させ、及び／又は検出するための適切な栄養素及び試薬に精通している。多孔性支持体３４０のための好適な材料の非限定的な例としては、セルロース系材料、例えば濾紙、発泡体、例えばポリウレタン発泡体、ヒドロゲル、焼結ガラス等が挙げられる。液体試料が膜フィルタ３２６を通過した後、膜フィルタ３２６は、いずれかの配向で多孔性支持体３４０上に設置することができる。好ましくは、膜フィルタ３２６は、膜フィルタ３２６の上主表面が多孔性支持体を向いた状態で多孔性支持体３４０上に設置される。
試料及び標的微生物
本発明の方法において使用される試料は、液体培地内に懸濁される液体試料又は固体試料であり得る。好ましくは、固体試料は、物理的に（例えば、均質化）及び／又は化学的に（例えば、界面活性剤と混合することによって）のいずれかで処理して、液体培地内に標的微生物を懸濁することができる。液体試料は、浮遊固体の濃度又は大きさが、試料が表面型膜フィルタを通って濾過されるのを防止しないという条件で、浮遊固体を含有してもよい。液体又は浮遊固体試料は、濾過の前に好適な溶媒（例えば、滅菌水又は緩衝液）中で希釈されてもよい。
水性試料は、水性試料が膜フィルタを分解しないか、又は標的微生物の検出に干渉する（例えば、微生物の成長を阻害する）残基をフィルタ上に残さないという条件で、本発明の方法における使用に好適であり得る。非水性試料も、非水性試料が、膜フィルタが培養デバイスと接触するように設置された時に透明になることを妨げないか、膜フィルタを分解しないか、又は標的微生物の検出に干渉する残基をフィルタ上に残さない（例えば、残基が微生物の成長に干渉しないか、又は微生物を検出するために使用することができる酵素活性に干渉しない）という条件で、使用されてよい。本発明の方法における使用に好適であり得る液体試料の非限定的な例としては、地表水、飲用又は飼料用の水、生物薬剤学的製剤用の水、水性溶媒中に懸濁される食料又は乳製品、飲料、果汁、プロセス水、冷却水、循環水、ボイラー水、ボイラー給水、地下水、レクリエーション水、処理済み水、及び廃水が挙げられる。
本発明の方法は、様々な標的微生物を検出するか、又は特定するのに好適である。該方法は、培養デバイス内で成長し、及び／又は繁殖することができる標的微生物に好適である。標的微生物は、細菌、酵母、かび、又はウイルスであり得る。該方法は、好気性又は嫌気性細菌を検出するのに使用されてもよい。例示的な標的微生物としては、エンテロバクター、シトロバクター、セラシア、エルシニア、エシェリキア、ハフニア、サルモネラ、カンピロバクター、リステリア、スタヒロコッカス、エンテロコッカス、及びチオスピリルムの属からの種、腸内細菌科の族からの種、大腸菌群、糞便性大腸菌、糞便性連鎖球菌種、エシェリキアコリ、ハフニアアルベイ、エンテロバクターアムニゲナス、シクロスポラ、又はクリプトスポリジウム種、ロタウイルス、及びＡ型肝炎ウイルスが挙げられる。
膜フィルタ及び濾過ユニット
標的微生物は、液体若しくは固体試料をフィルタの表面上に移動させることによって、又は膜フィルタを通して液体試料を濾過することによって、膜フィルタ上に収集することができる。試料を膜フィルタ上に収集した後、フィルタは、培養デバイスに移動させることができる。膜フィルタは、標的微生物の成長又は代謝活性に対して抑制的ではない、表面型微多孔性膜フィルタであり得る。膜フィルタは、例えば、セラミック酸化アルミニウム、トラックエッチポリカーボネート、又はトラックエッチポリエステルから作製されてよい。好適な膜フィルタは、培養デバイス内の水和培地等の水和培地と接触している時に実質的に透明であるフィルタをも含む。本明細書において使用される時、「実質的に透明な」膜フィルタは、培養デバイス内の微生物成長の観測結果又は兆候の画像化（例えば、コロニー、ｐＨインジケータ、気泡、酵素反応の生成物又は中間体）を顕著に歪ませないか、又は損なわない膜フィルタを指す。好適な膜フィルタの非限定的な例としては、約６０μｍの厚さ、約２５〜５０％の多孔性、及び約１．６の屈折率を有する、商標名ＡＮＯＰＯＲＥでＷｈａｔｍａｎ Ｉｎｃ．（Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ、ＮＪ）によって販売されるセラミック膜フィルタ、並びに約１０〜２０μｍの厚さ、約１５％の多孔性、及び約１．６の屈折率を有する、商標名ＮＵＣＬＥＯＰＯＲＥでＷｈａｔｍａｎ Ｉｎｃ．によって販売されるトラックエッチポリカーボネートフィルタが挙げられる。
膜フィルタの孔径は、概して、標的微生物が孔を通過せず、それによって試料内の実質的に全ての標的微生物がフィルタ上に収集されることが確実になるように選択される。典型的な細菌は、長さ約０．５〜５．０μｍである。マイコプラズマ等の特定のより小さい細菌は、直径およそ０．３μｍである。酵母細胞は、概して、細菌より大きい。典型的な酵母細胞は、直径およそ３〜４μｍであるが、直径約４０μｍもの大きさのものもある。かびは、単一細胞、胞子、又は糸状菌糸として存在し得る。典型的には細菌より大きいが、かび細胞の平均の大きさは、種によって異なる。ウイルスは、典型的には細菌より小さい。例えば、ロタウイルスは、直径約０．０７μｍであり、Ａ型肝炎ウイルスは、直径約０．０２７μｍであり、カリシウイルス（例えば、ノロウイルス）は、直径約０．０２７〜０．０４０μｍであり、ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス）は、直径約０．０３μｍであり、腸管アデノウイルスは、直径約０．０７μｍである。したがって、好適な孔径を有する膜フィルタの選択は、標的微生物に依存し得る。例えば、１．０μｍ以下、０．８μｍ以下、０．６μｍ以下、０．４μｍ以下、０．２μｍ以下、０．１μｍ以下、０．０５μｍ以下、０．０３μｍ以下、０．０２μｍ以下、又は０．０１μｍ以下の孔径を有する膜フィルタは、標的細菌を捕獲し検出するのに好適であり得る。標的酵母又はかびの捕獲及び検出のためには、１２μｍ以下、８μｍ以下、５μｍ以下、３μｍ以下、２μｍ以下、１μｍ以下、０．８μｍ以下、０．６μｍ以下、０．４μｍ以下、０．２μｍ以下、又は０．１μｍ以下の孔径を有する膜フィルタが好適であり得る。標的ウイルスの捕獲及び検出のためには、０．０５μｍ以下、０．０３μｍ以下、０．０２μｍ以下、又は０．０１μｍ以下の孔径を有する膜フィルタが好適であり得る。
膜フィルタは、好適な濾過培地より手で調製されてもよいし、又は代替として、事前にカットされた大きさ及び形状で購入されてもよい。膜フィルタの大きさ及び形状は、試料体積、及び試料内の微粒子材料の予期される負荷に基づいて選択することができる。一般的に、より大きい表面積を有する膜フィルタは、より小さい表面積を有する膜フィルタより高い濾過率を可能にする。１３ｍｍ、２５ｍｍ、又は４７ｍｍの直径を有する円形膜フィルタは、多数の商業的供給源から容易に入手可能であり、対応する濾過デバイスとの併用に特に好適である。膜フィルタは、他の濾過培地（例えば、試料内のより大きいくずを捕捉するための前置フィルタ）又は他の膜フィルタと組み合わせて使用されてもよい。例えば、膜フィルタは、より小さい微生物（例えば、細菌又はウイルス）からより大きい微生物（例えば、酵母及びかび）を分離するために、孔径が減少する順に積み重ねてもよく、膜フィルタが別々に分析されて、異なる微生物を検出することを可能にする。
膜フィルタは、濾過ユニットと併せて使用することができる。濾過ユニットは、液体試料が膜フィルタを通過している間に、膜フィルタを保持するために使用することができる。液体試料が膜フィルタを通過した後、膜フィルタは、濾過ユニットから取り外し、培養デバイスに移動させることができる。好ましい濾過ユニットには、膜フィルタの容易な取り外し及び培養デバイスの中への膜フィルタの設置のために構成されるものが挙げられる。
濾過デバイスは、商標名ＳＷＩＮＮＥＸでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって販売されるフィルタホルダ等、注射器への取り付け、及びそれとの併用のために設計することができる。あるいは、より大きい体積に対して、濾過デバイスは、フラスコへの取り付け用に設計することができる。好ましくは、膜フィルタ及び濾過デバイスは、試料をフィルタに通過させる前に滅菌されてもよい。
本明細書において開示される膜フィルタ及び方法が組み込まれ得る、例示的なシステムとしては、２００７年５月３１日出願、名称「Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ」の米国特許出願第６０／９４１，１４５号、２００７年１１月２０日出願、名称「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅｓ」の米国特許出願第６０／９８９，１８０号、２００７年１１月２０日出願、名称「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅｓ」の米国特許出願第６０／９８９，１７５号、２００７年１１月２０日出願、名称「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅｓ」の米国特許出願第６０／９８９，１７０号、及び２００７年１１月２０日出願、名称「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓａｍｐｌｉｎｇ」の米国特許出願第６０／９８９，１８０号に記載されるものが挙げられる。
培養デバイス
様々な培養デバイスが、本発明の方法において使用できる。いくつかの実施形態では、培養デバイスは、細菌の存在を検出することができる。代替の実施形態では、培養デバイスは、酵母及び／又はかびの存在を検出することができる。ある実施形態では、培養デバイスは、ウイルスの存在を検出することができる。
細菌、酵母、又はかびを検出するために使用されるいくつかの実施形態では、培養デバイスは、標的微生物の成長を支持する栄養素を含む事前形成されたヒドロゲルマトリックス（例えば、寒天、アガロース、ペクチン酸カルシウム）、及び任意に、標的微生物の検出を容易にする少なくとも１つのインジケータを含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、試料に存在する可能性がある非標的微生物よりも標的微生物の成長又は検出を好む環境を提供する少なくとも１つの選択剤（塩、界面活性剤、又は抗生物質等）を更に含む。事前形成されたヒドロゲルマトリックスは、ペトリ皿、ビーカー、又はフラスコ等の任意の好適な容器の中に設置することができる。好ましくは、ヒドロゲル及び容器は、膜フィルタがヒドロゲルと接触するように設置される前に滅菌することができる。
他の実施形態では、培養デバイスは、標的微生物の成長を支持する栄養素を含む乾燥した再水和可能な培養デバイス、及び任意に、標的微生物の検出を容易にする少なくとも１つのインジケータを含むことができる。そのようなデバイスの非限定的な例は、米国特許第４，４７６，２２６号、同第５，０８９，４１３号、同第５，２３２，８３８号、同第６，３３１，４２９号、及び同第６，６３８，７５５号に記載される。乾燥した再水和可能な培養デバイスは、ゲル化剤を含むことができる。好適なゲル化剤は、冷水溶性の天然及び合成ゲル化剤を含む。そのようなゲル化剤の非限定的な例としては、グアーガム、キサンタンガム、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、イナゴマメゴム、アルギン、及び前述の２つ又はそれ以上の組み合わせが挙げられる。そのようなデバイスは、微生物の成長又は代謝を支持する栄養素も含むことができる。様々な微生物の成長を支持する栄養素の非限定的な例としては、ペプトン、酵母抽出物、ブドウ糖等が挙げられる。特定の有機体又は有機体の群を成長させ、及び／又は特定するために必要な特定の栄養素又は栄養素の組み合わせは、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、乾燥した再水和可能な培養デバイスは、試料に存在する可能性がある非標的微生物よりも標的微生物の成長又は検出を好む環境を提供する少なくとも１つの選択剤（塩、界面活性剤、又は抗生物質等）を更に含む。
他の実施形態では、培養デバイスは、標的微生物の成長を支持する栄養素を含む水性混合物と流体連結している多孔性支持体、及び任意に、標的微生物の検出を容易にする少なくとも１つのインジケータを含むことができる。いくつかの実施形態では、水性混合物は、試料に存在する可能性がある非標的微生物よりも標的微生物の成長又は検出を好む環境を提供する少なくとも１つの選択剤（塩、界面活性剤、又は抗生物質等）を更に含む。
多孔性支持体は、水性溶媒を通って運搬されることができ標的微生物の検出を妨げる材料を含有しないことが好ましい。多孔性支持体は、例えば、布地、不織布、ゲル、発泡体、メッシュ、スクリム、ガラス原料、マイクロ複写膜等の様々な物理的形態のうちの１つであり得る。ある多孔性支持体は、濾紙又はガラス繊維フィルタ等の親水性材料から構築される。あるいは、支持体は、材料を親水性にするように処理された疎水性材料から構築されてもよいし、又は疎水性材料は、例えば、毛管現象によって、水性溶媒又は溶液を運搬することが可能であってもよい。
多孔性支持体は、ペトリ皿、ビーカー、又はフラスコ等の任意の好適な容器の中に設置することができる。好ましくは、多孔性支持体及び容器は、膜フィルタが多孔性支持体と接触するように設置される前に滅菌することができる。
ある実施形態では、培養デバイスは、中に宿主細胞株の入ったハウジングを含む。特定のウイルスは、ウイルス粒子が培養細胞株（組織培養）を感染させる時に、それらが引き起こす細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察することによって、培養デバイス内で検出することができる。組織培養技法及びそれらの対応する培養デバイスは、当該技術分野において既知である。これらの実施形態では、液体試料が通過した膜フィルタは、細胞株の入った培養デバイスの中へ移動されてもよい。あるいは、ウイルスは、フィルタから少量の滅菌水、緩衝剤、又は組織培地の中へ洗浄されてもよく、得られた懸濁液は、培養デバイスに添加することができる。好適な期間の培養後、組織培養は、例えば、プラーク形成等のＣＰＥの表示に対して観察することができる。プラークは、視覚的に、あるいは顕微鏡及び／又は撮像装置の援助を伴ってのいずれかで観察することができる。プラークの視覚的検出は、クリスタルバイオレット等の染色、又は例えば、蛍光標識抗体等の免疫試薬を使用して改善されてもよい。
試料調製システム
表面フィルタ、濾過ユニット、及び培養デバイスは、梱包材料と組み合わせ、試料内の微生物を検出するための試料調製システム（キット）として販売することができる。例えば、試料調製システムは、併せてパッケージ化された、２つ以上の構成要素（例えば、表面フィルタ及び培養デバイス）、又は３つ以上の構成要素（例えば、表面フィルタ、濾過ユニット、及び培養デバイス）を含んでもよい。ある実施形態では、濾過ユニットは、表面フィルタの取り外し用に構成されることができる。
試料調製システムは、試料懸濁培地（例えば、水、緩衝剤、成長培地）、試薬（例えば、染料、インジケータ、酵素、酵素基質、溶解剤、溶出を容易にするための試薬）、ピペット、ラベル、ピンセット、試料キャリア、及び／又は手袋等の、サンプル用及び試験付属品を更に含んでもよい。ある実施形態では、試料調製システムの個々の構成要素は、滅菌することができる。ある実施形態では、試料調製システムの構成要素は、個別包装された一次包装であり得る。
自動検出システム
培養デバイス内の微生物コロニーを数えるための自動システムは、当該技術分野において既知である。そのような自動システムは、概して、撮像システム、コロニー数を決定する画像分析アルゴリズム、並びにコロニー数データ及び画像を表示し、任意に、格納し、操作するためのデータ管理システムを含む。寒天平板上のコロニーを数えるための例示的なシステムは、商標名ＰＲＯＴＯＣＯＬで、Ｓｙｎｂｉｏｓｉｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によって販売され、米国特許第６，００２，７８９号に見られる。ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレート上のコロニーを数えるためのシステムは、米国特許第５，４０３，７２２号、同第７，２９８，８８５号、及び同第７，２９８，８８６号に記載される。
典型的には、微生物コロニーを数えるための自動システムは、光を吸収するか、反射するか、放出するか、又は散乱するかのいずれかのコロニー又はそれに由来する代謝産物の能力によって、標的微生物の存在を検出する。そのため、コロニーは、例えば、比色分析により、蛍光定量的に、又は発光定量的に（lumimetrically）（例えば、化学発光又は生物発光）等の手段によって光学的に検出することができる。
大腸菌群のための試験等の特定の試験において、微生物が乳糖からガス（即ち、二酸化炭素）を産生するかどうかを判断することが望ましい。３Ｍ ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ大腸菌群カウントプレート及びＥ．ｃｏｌｉカウントプレートは、栄養素を含む成長培地に乳糖を組み込む。これらの試験において、大腸菌コロニーは、成長培地におけるｐＨインジケータの変色によって暫定的に特定されることができる。ｐＨ変化は、コロニーが乳糖から酸性最終生成物を産生した可能性があることを示し、コロニーが大腸菌コロニーであることが推定される。推定された大腸菌コロニーは、コロニーに隣接した１つ以上の気泡の存在を観察することによって、大腸菌微生物として確認されることができる。気泡は、可視的手段によって、又は米国特許第７，２９８，８８６号に記載される自動コロニー計測システム等の自動システムによってのいずれかで、光学的に観察され得る。水和され閉じた時に、成長培地の片側上の自己支持基材と連続的に接触する半固体成長培地、及び成長培地の他側上にカバーシートを含む（図１及び２を参照）、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群カウントプレート等の平坦フィルム培養デバイスは、乳糖発酵性大腸菌微生物によって産生される気泡を捕捉するために特に好適である。
確証特定試験
本開示のいくつかの培養デバイスは、培養デバイス内に存在する微生物を明確に特定するための、選択的及び／又は分化試薬等の手段を提供する。他の培養デバイスは、培養デバイス内に存在する微生物の暫定的特定を提供することができる。そのような暫定的特定が行われる時、時折、付加的な試験を行うことによって、微生物の同一性を確認することが望ましい。本開示の方法は、確証試験を提供する。
培養デバイスが培養され、有機体の存在が観察されると（視覚的に、又は自動検出システムによってのいずれかで）、標的有機体は、更なる分析のために培養デバイスから取り外されてもよいし、又は特定の遺伝学的若しくは免疫学的試験の場合においては、分析は、培養デバイス内で（即ち、その場で）行われてもよい。更なる分析には、化学分析（例えば、クロマトグラフィ、分光法、分光分析）、遺伝分析（例えば、ハイブリダイゼーション、核酸増幅）、及び免疫学的分析（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫クロマトグラフィ、凝集、放射免疫測定法）を挙げることができる。
分析方法は、例えば、膜フィルタ及び培地全体から微生物又はその構成要素を除去するか又は抽出することによって、培養デバイス内の試料全体を使用して行うことができる。あるいは、培養デバイスのより小さい領域又は個々のコロニーは、分析方法を行うために単離及び／又は抽出されてもよい。いくつかの実施形態では、ニトロセルロース又はナイロン膜を使用して、微生物又はその構成要素を「持ち上げ」、続いて遺伝学的、生化学的、又は免疫学的試験を行ってもよい。具体的な分析方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に見ることができ、この内容は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
（実施例１）
Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群カウントプレート内の大腸菌群の視覚的検出。
Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群カウント（ＥＣ）プレートは、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）から得た。混合セルロースエステル（ＭＣＥ）膜フィルタ（直径４７ｍｍ、公称孔径０．４５μｍ）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）から得た。アルミナマトリックスセラミック膜フィルタ（直径４７ｍｍ、公称孔径０．２μｍ）は、Ｗｈａｔｍａｎ（Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ、ＮＪ）から得た。エンテロバクターアムニゲナスＡＴＣＣ ５１８１８は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。
一夜細菌培養物は、３５℃でトリプチケースソイブロス内で成長させた。一夜培養物は、１ミリリットル当たりおよそ０．５〜１．０コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の最終濃度まで、１．５リットルの未処理の（例えば、水は、塩素化、フッ素化、又は軟化されなかった）井戸水で希釈した。１００ミリリットルの体積の希釈培養物は、無菌濾過装置（Ｍｉｃｒｏｆｉｌ Ｖ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）内の膜フィルタを通して濾過した。無菌ピンセットを使用して、膜を濾過装置から無菌で取り外し、Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ ＥＣプレート内の乾燥円形培地上に設置した。１ミリリットルの無菌Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄリン酸希釈剤を膜上に分注し、Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍプレートを閉じ、メーカーの使用説明書に従って希釈剤をプレート全体に均一に分配した。この工程は、植菌の間、プレートの中への気泡の導入を回避するように注意して行われた。プレートは、３５℃で２４±２時間培養した。プレートは、メーカーの使用説明書に従って手動で数えた。結果を表１に示す。
Figure 0005420566
（実施例２）
Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群カウントプレート内の大腸菌群の自動検出。
エンテロバクターアムニゲナスの一夜培養物を、実施例１に記載されるように成長させ、希釈し、濾過した。フィルタは、Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ ＥＣプレートの中に設置し、実施例１に記載されるように培養した。培養されたプレートは、Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）の中に設置し、大腸菌コロニーの数を、メーカーの使用説明書に従ってリーダによって決定した。結果を表２に示す。
Figure 0005420566
プレートリーダは、ＭＣＥフィルタ膜上に１つのコロニーのみを検出した。そのコロニーは、気泡に関連したため、大腸菌として数えた。プレートの可視的調査は、プレートリーダによって検出されなかった少なくとも数十の小さい拡散した赤色のコロニーが存在したことを示した。対照的に、プレートリーダは、セラミックフィルタ膜上に５１のコロニーを検出した。これらのコロニーのうち、リーダは、気泡に関連した４つを検出した。
ここで、本発明は、記述を可能にすることができる、発明者によって予測される、いくつかの特定の実施形態を参照して記載されている。現在予測されていない修正を含む、本発明の実体のない修正は、それでもなお、それらと同等であると定めることができる。したがって、本発明の範囲は、本明細書において説明した詳細及び構造に限定されるべきではなく、むしろ、以下の特許請求の範囲、及びそれらと同等のものによってのみ限定されるべきである。
（実施例３）
Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群カウントプレートを使用した、細菌の混合懸濁液の自動検出及び特定。
細菌培養物は、実施例１に記載されるように調製した。本実施例において使用された細菌は、ハフニアアルベイＡＴＣＣ ５１８１５（大腸菌群の種）及びエシェリキアコリＡＴＣＣ １１２２９であり、両方とも、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。培養物は、実施例１に記載されるように希釈し、１００ミリリットルの水に対しておよそ５０〜１００ＣＦＵの各有機体の懸濁液を得るように混合した。実施例１に記載されるように、１００ｍＬの懸濁液を濾過し、Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ Ｅ．ｃｏｌｉ／大腸菌群カウントプレートの中に設置した。プレートは、３５℃で２４時間培養した。培養されたプレートをＰｅｔｒｉｆｉｌｍ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒに通過させ、各プレート内のコロニーの存在及び種類に関して画像を分析した。データを表３に示す。大腸菌及びＥ．ｃｏｌｉコロニーは、セラミック膜フィルタを使用した実験において未修正プレートリーダスキャナ及びソフトウェアシステムによって検出された。ＭＣＥ膜フィルタ上で成長していた、いくつかの青色のコロニーは、自動リーダによって認識されず数えられなかった。
Figure 0005420566
ここで、本発明は、記述を可能にすることができる、発明者によって予測される、いくつかの特定の実施形態を参照して記載されている。現在予測されていない修正を含む、本発明の実体のない修正は、それでもなお、それらと同等であると定めることができる。したがって、本発明の範囲は、本明細書において説明した詳細及び構造に限定されるべきではなく、むしろ、以下の特許請求の範囲、及びそれらと同等のものによってのみ限定されるべきである。

Claims (1)

  1. ガス産生微生物を検出するための方法であって、
    ガス産生微生物を含有する疑いがある試料、表面フィルタ、及び発酵性栄養素を含む培地を含有する平坦フィルム培養デバイスを提供する工程と、
    前記試料からのガス産生微生物を前記表面フィルタ上に収集する工程と、
    前記表面フィルタを前記培地と接触させる工程と、
    前記培地と接触している前記表面フィルタを一定期間培養する工程と、
    ガス産生微生物の存在を検出する工程と、
    を含み、
    前記表面フィルタが、セラミック酸化アルミニウムを含み、
    前記ガス産生微生物の存在を検出する工程が、コロニーを検出する工程を含み、
    前記コロニーが、光学的に検出され、
    前記ガス産生微生物の存在を検出する工程が、前記コロニーに隣接した気泡を検出する工程を更に含む、方法。
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