JP5408604B2 - Genes involved in prolamin accumulation and use thereof - Google Patents
Genes involved in prolamin accumulation and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- JP5408604B2 JP5408604B2 JP2008290180A JP2008290180A JP5408604B2 JP 5408604 B2 JP5408604 B2 JP 5408604B2 JP 2008290180 A JP2008290180 A JP 2008290180A JP 2008290180 A JP2008290180 A JP 2008290180A JP 5408604 B2 JP5408604 B2 JP 5408604B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- prolamin
- gene
- seq
- plant
- polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 115
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 title claims description 104
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 title claims description 30
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 53
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 53
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 89
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 44
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 44
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 43
- 101150061655 TLE5 gene Proteins 0.000 description 40
- 101100353039 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ppe1 gene Proteins 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 21
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 102100030667 Eukaryotic peptide chain release factor subunit 1 Human genes 0.000 description 16
- 101710175705 Eukaryotic peptide chain release factor subunit 1 Proteins 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 8
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 4
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 4
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 4
- XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl n-dimethoxyphosphorylcarbamate Chemical compound COP(=O)(OC)NC(=O)OC(C)C XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 101100480515 Caenorhabditis elegans tag-76 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150073803 ERF1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091035242 Sequence-tagged site Proteins 0.000 description 3
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070443 Arabidopsis eukaryotic release factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000209763 Avena sativa Species 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 235000017261 Fritillaria camtschatcensis Nutrition 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 241000519695 Ilex integra Species 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005044 Oryza sativa Indica Group Nutrition 0.000 description 1
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 1
- 235000005043 Oryza sativa Japonica Group Nutrition 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- 240000000300 Zizania aquatica Species 0.000 description 1
- 235000002636 Zizania aquatica Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 108010086507 peptide-chain-release factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 235000013550 pizza Nutrition 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、植物の種子における、プロラミンの集積に関与する遺伝子、及びその利用に関する。本発明は、イネの形質転換又は品種育成に特に有用である。 The present invention relates to genes involved in the accumulation of prolamin in plant seeds and the use thereof. The present invention is particularly useful for rice transformation or breeding.
イネ種子貯蔵タンパク質プロラミンは、コメの食味や醸造等の加工特性に大きな影響を及ぼすことが知られている。良食味米や醸造好適米にはプロラミン含量が少ないコメが適しているため、プロラミン含量が低いコメが要求されている。しかし、プロラミン含量の低いイネ品種を選抜し、交雑によって低プロラミン性である品種を育成する試みがなされてきたが、いずれも成功には至っていない。イネゲノム中にはプロラミン構造遺伝子は20個以上存在するため、プロラミン構造遺伝子の機能を消失させることによりプロラミン含量を劇的に減少させることは困難である。 The rice seed storage protein prolamin is known to have a great influence on the processing characteristics such as rice taste and brewing. Rice having low prolamin content is suitable for good-tasting rice or brewing suitable rice, so rice with low prolamin content is required. However, attempts have been made to select rice cultivars with low prolamin content and to breed varieties that are low in prolamin by crossing, but none of them have been successful. Since there are 20 or more prolamin structural genes in the rice genome, it is difficult to dramatically reduce the prolamin content by eliminating the function of the prolamin structural gene.
イネにおいて、プロラミンを劇的に減少させる突然変異体esp1 (endosperm storage protein 1)が知られている(非特許文献１)。等電点電気泳動（IEF）による分析から、esp1変異体においては、複数のプロラミンが同時に減少していることが分かっている（非特許文献２、非特許文献３）。そして、Esp1遺伝子はプロラミンの構造遺伝子ではなく、その生合成の過程に関与する遺伝子であることが示唆されている（前掲非特許文献１、前掲非特許文献２）。 In rice, a mutant esp1 (endosperm storage protein 1) that dramatically reduces prolamin is known (Non-patent Document 1). From the analysis by isoelectric focusing (IEF), it is known that a plurality of prolamins are simultaneously decreased in the esp1 mutant (Non-patent Documents 2 and 3). It has been suggested that the Esp1 gene is not a prolamin structural gene but a gene involved in the biosynthesis process (Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
さらに、Esp1遺伝子は、第７染色体上に座乗することがトリソミック変異体との交雑後代の分析によって明らかとされ（非特許文献４）、e81.9-8.2（81.9cM）とR2677（83.3cM）の間に位置づけられた（非特許文献５、非特許文献６、前掲非特許文献３）。
本発明者らは、植物の中でも、種子成分を改変する簡便な方法の開発が望まれているイネに着目し、なかでも食味や日本酒の醸造適性に大きな影響を与える貯蔵タンパク質プロラミンの集積に関与する遺伝子を単離すべく鋭意研究を行ってきた。そして、その遺伝子を単離することに成功したとともに、当該遺伝子を利用して植物の貯蔵タンパク質の組成を改変させることが可能であることを見いだし、本発明を完成した。 Among the plants, the present inventors have focused on rice for which development of a simple method for modifying seed components is desired, and in particular, involved in the accumulation of prolamin, a storage protein that greatly affects the taste and sake brewing ability. We have conducted intensive research to isolate the genes to be used. The inventors have succeeded in isolating the gene and found that the composition of the plant storage protein can be altered using the gene, thereby completing the present invention.
本発明はすなわち、以下を提供する：
１）下記の（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）又は（g）のポリヌクレオチド：
（a）配列番号：15に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（b）配列番号：15に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号：15に記載のヌクレオチド配列において1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換、付加及び／又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号：15に記載のヌクレオチド配列と少なくとも90％の同一性を有し、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号：18に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（f）配列番号：18に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（g）配列番号：18に記載のアミノ酸配列と少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
２）下記の（e’）、（f’）又は（g’）のタンパク質：
（e’）配列番号：18に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（f’）配列番号：18に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質；
（g’）配列番号:18に記載のアミノ酸配列と少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質。
３）１）に記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子を利用することを特徴とする、種子におけるプロラミン集積が制御された植物の生産方法。
４）３）に記載の方法であって：
請求項１に記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子を利用することが、該遺伝子を機能可能に有することによりプロラミン蓄積性である植物において、該遺伝子の機能を低下若しくは喪失させることであるか、又は該遺伝子を機能可能に有さないことによりにプロラミン低集積性である植物において、該ポリヌクレオチドを機能可能に導入することである、方法。
５）４）に記載の方法であって：
該遺伝子を利用することが、該遺伝子を機能可能に有することによりプロラミン蓄積性である植物において、該遺伝子の機能を低下若しくは喪失させることであり；
このとき該遺伝子の機能を低下若しくは喪失させるための手段が、１）に記載のポリヌクレオチドにおいて、１又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、付加及び／又は挿入することである、方法。
６）５）に記載の方法であって：
１）に記載のポリヌクレオチドにおいて、一又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、付加及び／又は挿入することにより生じたヌクレオチドが、下記の（h）、（i）、（j）又は（k）である、方法：
（h）配列番号：16に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（i）配列番号：17に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（j）配列番号：19に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（k）配列番号：20に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
７）１）に記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子、又はその機能を低下若しくは喪失したその変異遺伝子を検出する工程を含む、プロラミン蓄積性に関する望ましい性質を有する植物の生産方法。
８）３）〜７）のいずれか１に記載の方法により得られた植物（好ましくはイネ）、又はその子孫。
９）プロラミン集積性である品種に由来する、esp1欠損植物であって、esp1が、請求項２に記載のタンパク質である、植物（好ましくは、イネ）。
１０）８）又は９）に記載の植物を利用することにより得られる、収穫物、繁殖材料又は加工品。
The present invention thus provides:
1) The following polynucleotide (a), (b), (c), (d), (e), (f) or (g):
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15;
(B) a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and has a function of accumulating prolamin in plant seeds The encoding polynucleotide;
(C) a protein comprising a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted, added and / or inserted in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and having a function of accumulating prolamin in plant seeds Polynucleotides to:
(D) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and having a function of accumulating prolamin in plant seeds;
(E) a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18;
(F) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 and encodes a protein having a function of accumulating prolamin in plant seeds A polynucleotide;
(G) A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having at least 97% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 and having a function of accumulating prolamin in plant seeds.
2) The following protein (e ′), (f ′) or (g ′):
(E ′) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18;
(F ′) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and having a function of accumulating prolamin in plant seeds;
(G ′) a protein comprising an amino acid sequence having at least 97% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and having a function of accumulating prolamin in plant seeds.
3) A method for producing a plant in which prolamin accumulation in seeds is controlled, which comprises using the gene comprising the polynucleotide according to 1).
4) The method according to 3):
Utilizing the gene comprising the polynucleotide according to claim 1 is reducing or losing the function of the gene in a plant capable of accumulating prolamin by having the gene functionally, or A method comprising operably introducing the polynucleotide into a plant that is low in prolamin accumulation by not having a gene functionally.
5) The method according to 4):
Utilizing the gene is reducing or losing the function of the gene in a plant that is prolamin accumulating by operably having the gene;
The method for reducing or losing the function of the gene at this time is deleting, substituting, adding and / or inserting one or more nucleotides in the polynucleotide according to 1).
6) The method according to 5):
In the polynucleotide according to 1), nucleotides generated by deleting, substituting, adding and / or inserting one or more nucleotides are the following (h), (i), (j) or (k): The method is:
(H) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 16 (i) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 (j) a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19;
(K) a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
7) A method for producing a plant having desirable properties relating to prolamin accumulation, comprising the step of detecting a gene comprising the polynucleotide according to 1) or a mutant gene whose function has been reduced or lost.
8) A plant (preferably rice) obtained by the method according to any one of 3) to 7), or a progeny thereof.
9) A plant (preferably rice) which is an esp1- deficient plant derived from a variety that is prolamin-accumulating, wherein esp1 is the protein according to claim 2.
10) A harvest, a propagation material or a processed product obtained by using the plant described in 8) or 9).
配列表には、配列番号:15として、イネ品種日本晴、金南風及び台中号65号から得られたEsp1遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号:16として、esp1変異体CM21から得られた変異Esp1遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号:17として、esp1変異体EM711から得られた変異Esp1遺伝子のヌクレオチド配列が記載されている。配列番号:18として、イネ品種日本晴、金南風及び台中号65号から得られたEsp1遺伝子の発現産物の推定アミノ酸配列が、配列番号:19として、esp1変異体CM21から得られた変異Esp1遺伝子の遺伝子産物の推定アミノ酸配列が、配列番号:20として、esp1変異体EM711から得られた変異Esp1遺伝子の発現産物の推定アミノ酸配列が、記載されている。 In the sequence listing, the nucleotide sequence of the Esp1 gene obtained from the rice varieties Nipponbare, Kinnankaze and Taichung No. 65 as SEQ ID NO: 15 is the mutant Esp1 obtained from the esp1 mutant CM21 as SEQ ID NO: 16. As the nucleotide sequence of the gene, SEQ ID NO: 17, the nucleotide sequence of the mutant Esp1 gene obtained from the esp1 mutant EM711 is described. As SEQ ID NO: 18, the deduced amino acid sequence of the expression product of the Esp1 gene obtained from rice varieties Nipponbare, Kinnankaze, and Taichung No. 65 is shown as SEQ ID NO: 19, the mutant Esp1 gene obtained from the esp1 mutant CM21. The deduced amino acid sequence of the gene product is described as SEQ ID NO: 20, and the deduced amino acid sequence of the expression product of the mutant Esp1 gene obtained from the esp1 mutant EM711 is described.
本発明でいう「ストリンジェントな条件」とは、特別な場合を除き、6M尿素、0.4％ SDS、0.5×SSCの条件又はこれと同等のハイブリダイゼーション条件を指し、さらに必要に応じ、本発明には、よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4％ SDS、0.1×SSC又はこれと同等のハイブリダイゼーション条件を適用してもよい。それぞれの条件において、温度は約40℃以上とすることができ、よりストリンジェンシーの高い条件が必要であれば、例えば約50℃、さらに約65℃としてもよい。 The “stringent conditions” as used in the present invention refers to the conditions of 6M urea, 0.4% SDS, 0.5 × SSC or a hybridization condition equivalent thereto, unless otherwise specified. May be applied under conditions of higher stringency, for example, 6M urea, 0.4% SDS, 0.1 × SSC or equivalent hybridization conditions. Under each condition, the temperature can be about 40 ° C. or higher, and if higher stringency conditions are required, for example, about 50 ° C. or about 65 ° C. may be used.
また、本発明でポリヌクレオチドに関し、「1若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換、付加及び／又は挿入された」というときの置換等されるヌクレオチド（塩基ということもある。）の個数は、そのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個又は1〜4個程度である。同一又は性質の似たアミノ酸配列をコードするような置換であれば、所望の機能を消失しないであろうから、より多くのヌクレオチドの置換が可能である場合がある。また、本発明でタンパク質又は発現産物に関し、「1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入された」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個又は1〜4個程度である。性質の似たアミノ酸への置換であれば、所望の機能を消失しないであろうから、より多くのアミノ酸の置換が可能である場合がある。ヌクレオチド又はアミノ酸が置換等されたポリヌクレオチド又はタンパク質を調製するための手段には、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer W & Fritz H-J: Methods Enzymol 154: 350、 1987）がある。 Further, regarding the polynucleotide in the present invention, the number of nucleotides (sometimes referred to as bases) to be substituted when "one or more nucleotides are deleted, substituted, added and / or inserted" Although it does not specifically limit as long as the polynucleotide which consists of a nucleotide sequence has a desired function, About 1-9 pieces or 1-4 pieces. Substitutions that encode the same or similar amino acid sequences may not lose the desired function and may allow more nucleotide substitutions. In addition, regarding the protein or expression product in the present invention, the number of amino acids to be substituted when "one or more amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted" is the number of amino acids substituted by the protein comprising the amino acid sequence. Although it does not specifically limit as long as it has a desired function, It is about 1-9 pieces or 1-4 pieces. Since substitution of amino acids with similar properties will not lose the desired function, substitution of more amino acids may be possible. As a means for preparing a polynucleotide or protein in which nucleotides or amino acids are substituted, for example, there is a site-directed mutagenesis method (Kramer W & Fritz HJ: Methods Enzymol 154: 350, 1987).
本発明で、ヌクレオチド配列に関し、同一性（相同性ということもある。）が高いというときは、特別な場合を除き、90％以上、好ましくは92％以上、より好ましくは94％以上、さらに好ましくは96％以上、最も好ましくは98％以上の配列の同一性を指す。本発明で、アミノ酸配列に関し、同一性（相同性ということもある。）が高いというときは、特別な場合を除き、97％以上、好ましくは98％以上、より好ましくは99％以上の配列の同一性を指す。ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268、 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873、 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF、 et al: J Mol Biol 215: 403、 1990）。BLASTNを用いてヌクレオチド配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は当業者にはよく知られている（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。 In the present invention, when the nucleotide sequence has high identity (sometimes referred to as homology), except for special cases, it is 90% or more, preferably 92% or more, more preferably 94% or more, and further preferably Refers to sequence identity of 96% or more, most preferably 98% or more. In the present invention, when amino acid sequences have high identity (sometimes referred to as homology), except for special cases, 97% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more. Refers to identity. Nucleotide or amino acid sequence identity is determined using the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) by Carlin and Arthur. it can. Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990). When a nucleotide sequence is analyzed using BLASTN, parameters are set to, for example, score = 100 and wordlength = 12. In addition, when an amino acid sequence is analyzed using BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific techniques for these analysis methods are well known to those skilled in the art (for example, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
本発明ではまた、ヌクレオチド配列についてはBLAST 2を用いて同一性を計算することができ、またアミノ酸配列についてはblastpで検索し、同一性を求めることができる。本発明でヌクレオチド配列又はアミノ酸配列について同一性をいうときは、特別な場合を除き、通常の設定でこれらの手段により得た値である。 In the present invention, the identity of nucleotide sequences can also be calculated using BLAST 2, and the identity of amino acid sequences can be determined by searching with blastp. In the present invention, when referring to identity with respect to a nucleotide sequence or amino acid sequence, it is a value obtained by these means under normal settings, except in special cases.
本発明者らは、eRF1のアミノ酸配列を用いてblastpで検索し、得られたタンパク質のヌクレオチド配列を取得した。これらのヌクレオチド配列とeRF1ヌクレオチド配列とをBLAST 2 SEQUENCE (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)で比較した結果を下表に示す。なお、実際にクローンが同定され機能解析等がされているものは、シロイヌナズナのeRF1-1、1-2及び1-3のみであり、他はゲノムの配列から予測されたものである。 The present inventors searched with blastp using the amino acid sequence of eRF1, and obtained the nucleotide sequence of the obtained protein. The results of comparing these nucleotide sequences with eRF1 nucleotide sequences by BLAST 2 SEQUENCE (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi) are shown in the table below. The only clones that have been identified and functionally analyzed are only Arabidopsis eRF1-1, 1-2, and 1-3, and others are predicted from the genomic sequence.
本発明のポリヌクレオチドは、天然の植物組織材料から調製することができる。本発明のポリヌクレオチドを調製するためには、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用することができる。例えば、Esp1遺伝子（配列番号：15）の一部をプローブ又はプライマーとして、イネや他の植物からEsp1遺伝子と高い同一性を有するDNAを単離することができる。本発明のポリヌクレオチドには、ゲノムDNA、cDNA及び化学合成DNAが含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖DNA及び二本鎖DNAであり得る。 The polynucleotide of the present invention can be prepared from natural plant tissue material. In order to prepare the polynucleotide of the present invention, a hybridization technique or a polymerase chain reaction (PCR) technique can be used. For example, DNA having high identity with the Esp1 gene can be isolated from rice or other plants using a part of the Esp1 gene (SEQ ID NO: 15) as a probe or primer. The polynucleotide of the present invention includes genomic DNA, cDNA and chemically synthesized DNA. The polynucleotide of the present invention can be single-stranded DNA and double-stranded DNA.
本発明において、ポリヌクレオチド又は遺伝子に関して「機能を有する」又は「機能可能」というときは、特別な場合をのぞき、そのポリヌクレオチドが転写され、転写産物が翻訳され、目的の機能を有するタンパク質が発現されることをいう。例えば、Esp1遺伝子の変異体が、比較的重要な部分における変異を有するために、転写若しくは翻訳が抑制され、又は得られる発現産物において、本来有すべき機能が低下又は喪失している場合、その変異ポリヌクレオチド（又は遺伝子）は、「機能を有する」「機能可能」とはいえない。 In the present invention, when it has “function” or “can function” with respect to a polynucleotide or gene, the polynucleotide is transcribed, the transcript is translated, and a protein having the desired function is expressed, except in special cases. To be done. For example, if a mutant of the Esp1 gene has a mutation in a relatively important part, transcription or translation is suppressed, or the function that should be inherent in the obtained expression product is reduced or lost, A mutated polynucleotide (or gene) is not “functional” or “functional”.
本明細書において、植物の形質に関し、「低プロラミン（性」」又は「プロラミン集積（性）」というときは、特別な場合を除き、貯蔵タンパク質プロラミンの種子における含量が、通常の場合に比較して減少していることをいう。例えば、本発明により、Esp1遺伝子を機能可能に有する品種に由来するイネついてEsp1遺伝子を変異させ、その機能を低下又は喪失させることにより得られるイネは、通常の品種のイネに比較して種子におけるプロラミン含量が低減され、「低プロラミン（性）」又は「プロラミン低集積（性）」であるということができる。 In this specification, with respect to plant traits, the term “low prolamin (sex)” or “prolamin accumulation (sex)” refers to the content of the storage protein prolamin in the seed compared to the usual case, except in special cases. means that the decrease Te. for example, the present invention, mutated Esp1 gene with rice from varieties with enabling function Esp1 gene, rice obtained by reducing or losing its function, normal The prolamin content in seeds is reduced compared to rice of the variety, and it can be said that it is “low prolamin (sex)” or “low prolamin accumulation (sex)”.
「低プロラミン（性）」又は「プロラミン低集積（性）」というとき、プロラミン集積の減少は、本発明の方法により原品種より減じられていれば、程度は問わないが、例えば、全プロラミンが、原品種に比較して、少なくとも約3％減じられている場合、好ましくは約5％減じられている場合、より好ましくは約10％減じられている場合、さらに好ましくは約15％減じられている場合に、「低プロラミン（性）」又は「プロラミン低集積（性）」ということができる。なお、イネ品種金南風において、プロラミンは全タンパク質のうちの20〜25％を占める(Ogawa et al 1987, Plant and Cell Physiol. 28: 1517-1527)。また、M201というインディカ品種において18〜20%である(Li and Okita 1993, Plant and Cell Physiol. 34: 385-390)。一方、esp1変異体CM21の全プロラミンは、原品種である金南風に比較して、約15%の減少が認められる。(Kumamaru et al 1988, Theor Appl Genet 76: 11-16、Ogawa et al 1989, Theor Appl Genet 78: 305-310)。EM711についても同等の減少率であると推定される。 When referring to “low prolamin (sex)” or “prolamin low accumulation (sex)”, the decrease in prolamin accumulation is not limited as long as it is reduced from the original variety by the method of the present invention. When reduced by at least about 3% compared to the original variety, preferably reduced by about 5%, more preferably reduced by about 10%, more preferably reduced by about 15% If so, it can be referred to as “low prolamin (sex)” or “prolamin low accumulation (sex)”. In the rice cultivar Kinnan-style, prolamin accounts for 20-25% of the total protein (Ogawa et al 1987, Plant and Cell Physiol. 28: 1517-1527). Moreover, it is 18-20% in the indica variety called M201 (Li and Okita 1993, Plant and Cell Physiol. 34: 385-390). On the other hand, the total prolamin of esp1 mutant CM21 shows a decrease of about 15% compared to the original cultivar Kinnan- style. (Kumamaru et al 1988, Theor Appl Genet 76: 11-16, Ogawa et al 1989, Theor Appl Genet 78: 305-310). EM711 is also estimated to have a similar reduction rate.
種子におけるプロラミンは、当業者であれば、従来技術を用いて分離・分画し、また定量することができる。アルコール可溶性のプロラミンは、60% n-プロパノールによって抽出されるシステイン含量が低いcysteine poor (CysP)プロラミン画分と、CysPプロラミン抽出後の残渣から5% 2-メルカプトエタノールを含む60% n-プロパノールによって抽出されるシステイン含量が高いcysteine rich (CysR)プロラミン画分に分類できる。通常、種子又はその可食部を必要に応じ粉状物したものから、5% 2-メルカプトエタノールを含む60% n-プロパノールによって抽出されるプロラミンを全プロラミン画分とすることができる。本発明により得られるプロラミン低集積性の植物においては、少なくとも、60% n-プロパノールのみで抽出されるCysPプロラミンが減少している（図１及び実施例参照）。なお、本発明においては、プロラミンの抽出及び定量は、Kumamaru et al (1988)及びOgawa et al (1989)の方法によって行なった。 Prolamins in seeds can be separated, fractionated and quantified by those skilled in the art using conventional techniques. Alcohol-soluble prolamin is extracted with 60% n-propanol containing 5% 2-mercaptoethanol from the cysteine poor (CysP) prolamin fraction with low cysteine content extracted with 60% n-propanol and the residue after CysP prolamin extraction. It can be classified into cysteine rich (CysR) prolamin fraction with high cysteine content. Usually, prolamin extracted from 60% n-propanol containing 5% 2-mercaptoethanol from seeds or edible portions thereof as necessary can be used as the total prolamin fraction. In plants with low prolamin accumulation obtained by the present invention, CysP prolamin extracted with at least 60% n-propanol is reduced (see FIG. 1 and Examples). In the present invention, prolamin was extracted and quantified by the methods of Kumamaru et al (1988) and Ogawa et al (1989).
本明細書においてプロラミンの集積に関し、「制御（する）」というときは、特別な場合を除き、種子におけるプロラミンの集積量を調節することを指し、これには集積量が増すように調節することと集積量が低減するように調節することとが含まれる。プロラミン集積量を調節する際に、他の種子に関する尺度も同時に調節することがある。プロラミン集積を増すように調節することには、プロラミン含量を低減するように調節することには、プロラミン集積に関与する遺伝子（例えば、本発明のEsp1遺伝子）の機能を低下又は喪失させることにより、プロラミン集積を低減することが含まれる。プロラミン集積に関与する遺伝子（例えば、本発明のEsp1遺伝子）を、植物に導入してその機能を発揮させることにより、プロラミン含量を増すことが含まれる。 In the present specification, with regard to the accumulation of prolamin, the term “control” refers to adjusting the amount of prolamin accumulation in the seed, except in special cases, and this is to adjust the accumulation amount to increase. And adjusting the accumulation amount to be reduced. When adjusting the amount of prolamin accumulation, the scale for other seeds may be adjusted simultaneously. To adjust to increase prolamin accumulation, to adjust to decrease prolamin content, to reduce or lose the function of a gene involved in prolamin accumulation (for example, the Esp1 gene of the present invention). , Reducing prolamin accumulation. It includes increasing the prolamin content by introducing a gene involved in prolamin accumulation (for example, the Esp1 gene of the present invention) into a plant to exert its function.
本発明で「植物」というときは、特別な場合を除き、植物個体又はその一部の意味で用いており、また「その一部」というときは、特別な場合を除き、種子（発芽種子、未熟種子を含む。）、器官又はその部分（葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む）、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。植物には、遺伝子操作植物及び形質転換植物が含まれる。植物には、「収穫物」及び「繁殖材料」がふくまれる。本発明でいう「繁殖材料」とは、特別な場合を除き、植物体の全部又は一部で繁殖の用に供されるもの（「種苗」ということもある。）をいい、例えば、種子、苗、細胞、カルス、幼芽がある。本発明でいう「収穫物」とは、特別な場合を除き、通常の意味で用いており、植物体の全部又は一部で繁殖の用に供されないもの、例えば、植物がイネ属に属するものである場合、収穫物には、刈り取った稲、もみが含まれる。 In the present invention, the term “plant” is used in the meaning of a plant individual or a part thereof except for special cases, and the term “part” refers to a seed (a germinated seed, Including immature seeds), organs or parts thereof (including leaves, roots, stems, flowers, stamens, pistils, fragments thereof), plant culture cells, callus, protoplasts. Plants include genetically engineered plants and transformed plants. Plants include “harvested products” and “breeding materials”. The “reproduction material” as used in the present invention means a material (or a “seed seedling”) that is used for propagation in all or a part of a plant body, except for special cases, for example, seeds, There are seedlings, cells, callus, shoots. The term “harvested product” as used in the present invention is used in a normal sense except in special cases, and all or part of the plant body is not used for breeding, for example, the plant belongs to the genus Rice. The harvest includes harvested rice and fir.
本発明の植物には、本発明の方法により組換え植物細胞を得て、該植物細胞を植物体に再生させることにより得た形質転換植物（T0）が含まれる。本発明で、植物に関し、「その子孫」というときは、特別な場合を除き、当該植物を、少なくとも一方の遺伝的な親及び／又は祖先とする植物をいう。子孫には、目的とする形質に関与する遺伝子を有する限り、親である形質転換植物より得られた後代（T1等）又はその子孫、T0又はT1を一方の親とする交雑後代（例えばF1）及びその子孫が含まれる。 The plant of the present invention includes a transformed plant (T 0 ) obtained by obtaining a recombinant plant cell by the method of the present invention and regenerating the plant cell into a plant body. In the present invention, regarding a plant, the term “its offspring” refers to a plant having the plant as at least one genetic parent and / or ancestor unless otherwise specified. As long as the progeny has a gene involved in the target trait, the progeny obtained from the transformed plant that is the parent (T 1 etc.) or its progeny, a progeny of the cross that has T 0 or T 1 as one parent ( For example, F 1 ) and its descendants.
本発明で「加工品」というときは、特別な場合を除き、収穫物から直接的に又は間接的に生産される加工品をいう。本発明の範囲は、少なくとも、本発明の収穫物における特徴を反映した加工品が含まれる。例えば、植物がイネである場合、収穫物である米を原料とし、プロラミン集積性が制御されたことに起因して加工性、食味、食感、匂い等において従来とは異なることとなった、精米した米、米飯、米粉、米粉を使用したパン類、菓子類、饅頭類、ピザ、酒は、本発明の範囲に含まれる。 In the present invention, “processed product” refers to a processed product produced directly or indirectly from a harvested product, unless otherwise specified. The scope of the present invention includes at least processed products that reflect the characteristics of the harvest of the present invention. For example, when the plant is rice, the rice that is the harvest is used as a raw material, and the prolamin accumulation property is controlled, so that the processability, taste, texture, smell, etc. are different from conventional ones. Polished rice, cooked rice, rice flour, breads using rice flour, confectionery, buns, pizza, and sake are included in the scope of the present invention.
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、そのようなベクターにより形質転換された形質転換植物を提供する。
本発明のDNAが挿入されるベクターは、植物細胞内で挿入物の機能を発揮させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、種子、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
The present invention also provides a recombinant vector comprising the polynucleotide of the present invention, and a transformed plant transformed with such a vector.
The vector into which the DNA of the present invention is inserted is not particularly limited as long as it can exert the function of the insert in plant cells. For example, using a vector having a promoter (eg, cauliflower mosaic virus 35S promoter) for constitutive expression of the gene in plant cells, or a vector having a promoter inducibly activated by an external stimulus. You can also. As used herein, “plant cells” include various forms of plant cells such as seeds, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, callus and the like.
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。アグロバクテリウム（例えば、EHA101）を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法（特許第3141084号）を用いることが可能である。また、パーティクルガン法においては、例えば、バイオラッド社のものを用いることが可能である。 For introduction of a vector into a plant cell, various methods known to those skilled in the art such as polyethylene glycol method, electroporation method (electroporation method), Agrobacterium-mediated method, particle gun method and the like can be used. In the method using Agrobacterium (for example, EHA101), for example, an ultra-rapid monocotyl transformation method (Japanese Patent No. 314084) can be used. Further, in the particle gun method, for example, a product from Bio-Rad can be used.
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta SK: In Gene Transfer To Plants （Potrykus I and Spangenberg、 Eds） pp.66-74、 1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki S、 et al: Plant Physiol 100: 1503、 1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P、 et al: Biotechnology 9: 957、 1991）、及びアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y、 et al: Plant J 6: 271、 1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。 Regeneration of plant bodies from transformed plant cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells. For example, as a method for producing a transformed plant body in rice, a method of regenerating a plant body (suitable for Indian rice varieties) by introducing a gene into protoplasts using polyethylene glycol (Datta SK: In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg, Eds) pp.66-74, 1995), a method of regenerating plants (Japanese rice varieties are suitable) by introducing genes into protoplasts by electric pulses (Toki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1992), a method of introducing a gene directly into a cell by the particle gun method and regenerating a plant body (Christou P, et al: Biotechnology 9: 957, 1991), and a gene via Agrobacterium Several techniques have already been established and widely used in the technical field of the present invention, such as a method for introducing plant and regenerating plant bodies (Hiei Y, et al: Plant J 6: 271, 1994). In the present invention, these methods can be suitably used.
ゲノム内に所望の遺伝子が導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に植物体を量産することも可能である。 Once a transformed plant having a desired gene introduced into the genome is obtained, offspring can be obtained from the plant by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain propagation materials (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) from the plant and its descendants or clones, and mass-produce plants based on them. It is.
本発明の形質転換の対象となる植物は、本発明のポリヌクレオチドからなる遺伝子の作用により、プロラミン集積性を制御することができるものであれば特に限定されないが、好ましくは被子植物であり、より好ましくは単子葉植物網に属する植物であり、さらに好ましくはツユクサ亜網に属する植物であり、最も好ましくはイネ科（Poaceae（Gramineae））に属する植物、例えばイネ（Oryza）、オオムギ、ライムギ、パンコムギ、イヌムギ、ハトムギ、サトウキビ、トウモロコシ、モロコシ、アワ、キビ、ヒエいずれかの属に属する植物である。イネ科に属する植物のうちでは、好ましくはイネ属に属する植物であり、より好ましくはイネ（Oryza sativa L.）である。本発明は、種子にプロラミンを集積する単子葉植物であるという観点からは、特に、トウモロコシ、ライムギ、エンバク、コムギ、オオムギ、ソルガム、イネに対して用いるのに適している。 The plant to be transformed according to the present invention is not particularly limited as long as it can control prolamin accumulation by the action of the gene comprising the polynucleotide of the present invention, but is preferably an angiosperm, more Preferably, it is a plant belonging to the monocotyledonous network, more preferably a plant belonging to the Cyprus subnet, most preferably a plant belonging to the family Gramineae (Poaceae (Gramineae)), for example, rice (Oryza), barley, rye, bread wheat. It is a plant belonging to any of the genera, barley, pearl barley, sugar cane, corn, sorghum, millet, millet and millet. Among the plants belonging to the family Gramineae, the plant is preferably a plant belonging to the genus Graminea, and more preferably rice (Oryza sativa L.). The present invention is particularly suitable for use on corn, rye, oat, wheat, barley, sorghum and rice from the viewpoint of being a monocotyledon that accumulates prolamin in seeds.
イネの品種の中では、本発明は、特に「コシヒカリ」及びその近縁種に適していると考えられる。コシヒカリ近縁種とは、その育成系譜に「コシヒカリ」を交配母本としているもので、「ひのひかり」や「キヌヒカリ」等を指す。さらにコシヒカリ近縁種以外の「ササニシキ」等の良食味品種、及び「滋賀羽二重もち」等のモチ品種、多収性品種である「ハバタキ」、「おおちから」等にも、本発明は適していると考えられる。 Among rice varieties, the present invention is considered to be particularly suitable for “Koshihikari” and its related species. Koshihikari relatives are those that use “Koshihikari” as the breeding parent in their breeding lineage, such as “Hinohikari” and “Kinuhikari”. Furthermore, the present invention is also applicable to good-tasting varieties such as “Sasanishiki” other than Koshihikari-related species, Mochi varieties such as “Shigaha Du Mochi”, “Habataki”, “Ochikara”, etc. It is considered suitable.
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドからなる遺伝子を利用することを特徴とする、植物のプロラミン集積性の制御方法を提供する。ここでいう「（遺伝子を）利用すること」には、遺伝子を機能可能に有する植物でこと、及び該遺伝子が機能していない植物に該遺伝子を機能可能に導入することが含まれる。 The present invention also provides a method for controlling prolamin accumulation in plants, which comprises using a gene comprising the polynucleotide of the present invention. “Utilizing (gene)” as used herein includes a plant having a gene operably, and operably introducing the gene into a plant in which the gene does not function.
該遺伝子の機能を低下又は喪失させるようにする表現型を生じるには、例えば本発明のポリヌクレオチドからなる遺伝子の発現を抑制することによる。ここでいう「発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制、転写物のスプライシングの抑制、及びタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、遺伝子の発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。また、翻訳されたタンパク質が植物細胞内で本来の機能を発揮することの抑制も含まれる。 In order to generate a phenotype that reduces or eliminates the function of the gene, for example, by suppressing the expression of the gene comprising the polynucleotide of the present invention. As used herein, “suppression of expression” includes suppression of gene transcription, suppression of transcript splicing, and suppression of protein translation. Also included is a decrease in expression as well as complete cessation of gene expression. Moreover, suppression of the translated protein exerting its original function in plant cells is also included.
本発明により、「esp1欠損変異（体）」（本発明のポリヌクレオチドからなる遺伝子の機能を低下又は喪失させ、プロラミン低集積性である表現型を生じたもの」）が提供されるが、この欠損変異体を作製する方法としては、本発明の遺伝子の発現又はタンパク質の機能が低下又は喪失した変異体を作製できれば特に制限されないが、例えば、植物体に、化学変異原処理又は放射線処理による変異誘発、ウイルス感染、トランスポゾン転移、自然突然変異がある。また、ＤＮＡ断片導入による遺伝子の破壊、アンチセンス核酸等による遺伝子の発現抑制などがある。 According to the present invention, there is provided an “esp1-deficient mutation (body)” (reducing or losing the function of a gene comprising the polynucleotide of the present invention, resulting in a phenotype with low prolamin accumulation). The method for producing a deletion mutant is not particularly limited as long as a mutant in which the expression of the gene of the present invention or the function of the protein is reduced or lost can be produced. For example, a plant body may be mutated by chemical mutagen treatment or radiation treatment. There are induction, viral infection, transposon transfer, spontaneous mutation. In addition, there are gene disruption by introduction of DNA fragments, gene expression suppression by antisense nucleic acid and the like.
遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするポリヌクレオチドを利用して行うことも可能である。RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能である。また、遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA interferance（RNAi）によっても行いうる。RNAiは植物においても効果を奏することが知られている（Chuang CF & Meyerowitz EM: Proc Natl Acad Sci USA 97: 4985、 2000）。さらに、遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAによる形質転換によって起こる共抑制によっても達成しうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子及び標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、少なくともその機構の一部はRNAiの機構と重複していると考えられている。共抑制は植物においても観察される（Smyth DR: Curr Biol 7: R793、 1997、Martienssen R: Curr Biol 6: 810、 1996）。 Suppression of gene expression can also be performed using a polynucleotide encoding a ribozyme. It is possible to design ribozymes that cleave RNA in a site-specific manner. In addition, gene expression can also be suppressed by RNA interferance (RNAi) using double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence. RNAi is known to have an effect in plants (Chuang CF & Meyerowitz EM: Proc Natl Acad Sci USA 97: 4985, 2000). Furthermore, suppression of gene expression can also be achieved by co-suppression caused by transformation with DNA having the same or similar sequence as the target gene sequence. “Co-suppression” is a phenomenon in which the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene is both suppressed when a gene having the same or similar sequence as the target endogenous gene is introduced into a plant by transformation. Point to. The details of the mechanism of co-suppression are not clear, but at least part of the mechanism is thought to overlap with that of RNAi. Co-suppression is also observed in plants (Smyth DR: Curr Biol 7: R793, 1997, Martienssen R: Curr Biol 6: 810, 1996).
イネにおいて種子で発現するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)1-1の発現が、MNU突然変異により抑制されている（特願2008-058057「パン類の製造に適した米粉組成物およびその利用」、川越靖ら（2008）イネ種子貯蔵タンパク質突然変異体esp2における米粉の製パン特性. 日本育種学会第113回講演会））。同様の手法が、本願にも適用できる可能性がある。 Expression of protein disulfide isomerase (PDI) 1-1 expressed in seeds in rice is suppressed by MNU mutation (Japanese Patent Application 2008-058057 “Rice flour composition suitable for bread production and its use”, Kawagoe (2008) Bread characteristics of rice flour in rice seed storage protein mutant esp2 (113th Lecture Meeting of Japanese Society of Breeding)). Similar techniques may be applicable to the present application.
本発明の遺伝子の発現又はタンパク質の機能が低下又は喪失した変異体を作製するためには、以下で述べることを考慮してもよい。すなわち、eRF1遺伝子は3つのドメインから構成され、ドメイン1にはSTOPコドンを認識するNIKSモチーフが存在する(Bertram et al. RNA 6: 1236-1247, 2000)。また、eRF1はこれまでにUAA、UGA、UAGのすべてのSTOPコドンを認識することが明らかとなっているが、繊毛虫(ciliates)の一部でいずれかのSTOPコドンを認識しないことが明らかとなっている。これらの繊毛虫ではドメイン1のNIKS以外の配列も多種とは大きく異なっている(Inagaki et al. Nucleic Acids Research 30: 532-544, 2002)。このことから、ドメイン1のアミノ酸配列の改変によっても機能低下や喪失が生じると考えられる。また、ドメイン2はGGQモチーフをもち、ペプチドの解離を行い(Song et al. Cell 100: 311-321, 2000)、ドメイン3はclassIIの翻訳終了因子であるeRF3との結合に寄与する(Ito et al. RNA 4: 958-972, 1998, Eurwilaichitr et al. Mol. Microbiol. 32: 485-496, 1999)。これらの領域はeRF1の機能の維持において特に重要であると考えられる。しかしながら、本発明におけるesp1変異は、これまでに機能を有することが明らかなモチーフ以外での変異でeRF1の機能の低下が生じたと考えられることから、種々の位置における変異によって、本発明が目的とする、機能の低下又は喪失の可能性が残されている。 In order to produce a mutant in which the expression of the gene of the present invention or the function of the protein is reduced or lost, the following may be considered. That is, the eRF1 gene is composed of three domains, and domain 1 has a NIKS motif that recognizes the STOP codon (Bertram et al. RNA 6: 1236-1247, 2000). In addition, eRF1 has been shown to recognize all STOP codons of UAA, UGA, and UAG so far, but it is clear that some STOP codons are not recognized by some ciliates. It has become. In these ciliates, sequences other than domain 1 NIKS are also very different (Inagaki et al. Nucleic Acids Research 30: 532-544, 2002). From this, it is considered that functional alteration and loss also occur by modification of the amino acid sequence of domain 1. Domain 2 has a GGQ motif and dissociates the peptide (Song et al. Cell 100: 311-321, 2000), and domain 3 contributes to binding to eRF3, a class II translation termination factor (Ito et al. al. RNA 4: 958-972, 1998, Eurwilaichitr et al. Mol. Microbiol. 32: 485-496, 1999). These regions are thought to be particularly important in maintaining the function of eRF1. However, the esp1 mutation in the present invention is considered to have caused a decrease in the function of eRF1 due to mutations other than motifs that have been known to have a function so far. However, there is still a possibility of functional deterioration or loss.
［発明の効果］
従来、イネの品種改良は（1）交雑による有望系統の選抜、（2）放射線や化学物質による突然変異誘起などによって行われてきた。これらの作業は長期間を要することや変異の程度や方向性を制御できないことなどの問題があった。本発明の遺伝子はプロラミンの量が減少したイネの品種育成に有用である。また、本発明の遺伝子を用いるイネの品種育成は、短期間で高い確実性をもって目的の植物体を得ることができる点で、従来の方法より有利である。
[Effect of the invention]
Traditionally, rice varieties have been improved by (1) selecting promising lines by crossing, and (2) mutagenesis by radiation or chemicals. These operations have problems such as requiring a long time and inability to control the degree and direction of mutation. The gene of the present invention is useful for breeding rice varieties with a reduced amount of prolamin. In addition, rice cultivar breeding using the gene of the present invention is more advantageous than conventional methods in that a target plant can be obtained with high certainty in a short period of time.
なお、プロラミンが集積するPB Iはペプシンに対して難消化性を示すので、ペプシン易消化性のグルテリンが相対的に減少するプロラミン集積が増した植物種子は、腎臓病患者等のアミノ酸摂取量に制限がある場合の食事に使用できる可能性がある。また、特定のプロラミン分子種を増加させることにより、食味、香り、加工特性を改変できる可能性もあると考えられる。トウモロコシのプロラミンであるゼインはフィルムの合成の材料として考えられている(Gillgren and Standing 2008, Food Biophys 3: 287-294)ことから、プロラミン集積の増した植物は、このような用途のために有用でありうる。 Since PBI I, which accumulates prolamin, is resistant to pepsin, plant seeds with increased prolamin accumulation, in which pepsin-digestible glutelin is relatively reduced, contribute to the intake of amino acids in patients with kidney disease, etc. May be used for meals with restrictions. It is also considered that there is a possibility that the taste, aroma, and processing characteristics can be modified by increasing the specific prolamin molecular species. Zein, a corn prolamin, is considered a material for film synthesis (Gillgren and Standing 2008, Food Biophys 3: 287-294), so plants with increased prolamin accumulation are useful for such applications. It can be.
本発明により、品種の選抜、検査が容易・迅速にできるようになった。esp1変異体を交配母本に用い、その交雑後代からesp1型を選抜する際に、変異部位の塩基配列から作製したDNA多型マーカーを用いて、幼苗期にesp1型を効率的に選抜することが可能となった。さらに、Esp1遺伝子が特定されたことにより、eRF1に関する他のアミノ酸置換変異体やアミノ酸欠損変異体をTilling法を用いて選抜することが可能となった。 According to the present invention, selection and inspection of varieties can be performed easily and quickly. esp1 using mutants mating mother this, when selecting a esp1 type from their Offspring, using DNA polymorphism markers prepared from the nucleotide sequence of the mutation site, effectively selected to the esp1 type in seedling stage Became possible. Furthermore, since the Esp1 gene was identified, it was possible to select other amino acid substitution mutants and amino acid deletion mutants related to eRF1 using the Tilling method.
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
［事前の検討］
１．Esp1遺伝子の機能の推定
材料には水稲品種「金南風」及び「金南風」からMNU受精卵処理によって誘発したesp1変異体「CM21」を用いた。esp1劣勢変異はSDS-PAGEで分離する13kDの種子貯蔵タンパク質を減少することによって見い出され（図１：SDS-PAGE）（Kumamaru et al. TAG 76: 11-16, 1988）、PB Iに存在する複数の分子種を減少することが2次元電気泳動によって示された（Ogawa et al. TAG 78: 305-310, 1989）。アルコール可溶性のプロラミンは、米粉から60% n-プロパノールによって抽出されるシステイン含量が低いcysteine poor (CysP)プロラミン画分と、CysPプロラミン抽出後の残渣から5% 2-メルカプトエタノールを含む60% n-プロパノールによって抽出されるシステイン含量が高いcysteine rich (CysR)プロラミン画分に分類できる。米粉から5% 2-メルカプトエタノールを含む60% n-プロパノールによって抽出されるプロラミンを全プロラミン画分とした。抽出した各プロラミン画分を遠心エバポレーターによって乾燥し、試料用緩衝液(Laemmli 1970)を加えて実験に供試した。esp1劣勢変異はプロラミンをそれぞれの画分に分けてSDS-PAGEで分析した結果、60% n-プロパノールのみで抽出されるCysPプロラミンが減少していることが見い出された（図１：SDS-PAGE）。SDS-PAGEは分子サイズで分離するため同様の分子サイズを有する複数の分子から構成されるプロラミンを詳細に分析するには不向きである。
[Preliminary examination]
1. Esp1 gene function estimation The material used was Esp1 mutant “CM21” induced by MNU fertilized egg treatment from rice cultivars “ Kinnankaze ” and “ Kinankaze ”. The esp1 recessive mutation was found by reducing the 13 kD seed storage protein separated by SDS-PAGE (Figure 1: SDS-PAGE) (Kumamaru et al. TAG 76: 11-16, 1988) and is present in PBI Reduction of multiple molecular species has been shown by two-dimensional electrophoresis (Ogawa et al. TAG 78: 305-310, 1989). Alcohol-soluble prolamin is a cysteine poor (CysP) prolamin fraction with low cysteine content extracted from rice flour by 60% n-propanol, and 60% n- containing 5% 2-mercaptoethanol from the residue after CysP prolamin extraction. It can be classified into a cysteine rich (CysR) prolamin fraction with high cysteine content extracted by propanol. Prolamin extracted from rice flour with 60% n-propanol containing 5% 2-mercaptoethanol was used as the total prolamin fraction. Each extracted prolamin fraction was dried by a centrifugal evaporator, and a sample buffer solution (Laemmli 1970) was added for use in the experiment. As for the esp1 recessive mutation, prolamin was divided into each fraction and analyzed by SDS-PAGE. As a result, it was found that CysP prolamin extracted only with 60% n-propanol decreased (FIG. 1: SDS-PAGE). ). SDS-PAGE is not suitable for detailed analysis of prolamins composed of a plurality of molecules having the same molecular size because they are separated by molecular size.
IEFはアンフォライトを含むポリアクリルアミドゲルが通電時に形成するpHの勾配を利用してポリペプチドをその等電点に集束させ分離する方法である。IEFは複数の分子から構成されるプロラミンを分離、解析する本発明において有用な方法である。具体的には、ゲルの組成が4%(w/v)アクリルアミド、0.2%(w/v)メチレンビスアクリルアミド、6M尿素、2%(w/v) Nonidet P-40、5%(v/v)アンフォライン(2.5% 3.5-10アンフォライン、2.5% 6.0-8.0アンフォライン)、0.0005%(w/v)リボフラビン、0.01%(w/v)過硫酸アンモニウム、0.05625%(v/v) TEMED、試料用緩衝液の組成が8.5M尿素、0.8%(w/v) Nonidet P-40、5.0%(v/v) 2-メルカプトエタノール、0.1%(w/v) SDSで、泳動は150V 30分間、400V 60分間、700V 70分間、1000V 40分間行う。泳動後、15% TCAで10分間の固定処理、脱色液（25%(v/v)エタノール、10%(v/v)酢酸）に換え、16時間の処理でアンフォラインを除去したのち、染色液（0.1%(w/v)Coomasie brilliant blue R-250、50%(v/v)エタノール、10%(v/v)酢酸）に換え、任意に染色、その後、脱色液で任意に脱色を行う。 IEF is a method of focusing and separating polypeptides at their isoelectric points using a pH gradient formed by polyacrylamide gel containing ampholite when energized. IEF is a useful method in the present invention for separating and analyzing prolamins composed of a plurality of molecules. Specifically, the gel composition is 4% (w / v) acrylamide, 0.2% (w / v) methylenebisacrylamide, 6M urea, 2% (w / v) Nonidet P-40, 5% (v / v ) Ampholine (2.5% 3.5-10 ampholine, 2.5% 6.0-8.0 ampholine), 0.0005% (w / v) riboflavin, 0.01% (w / v) ammonium persulfate, 0.05625% (v / v) TEMED, sample The composition of the buffer solution is 8.5M urea, 0.8% (w / v) Nonidet P-40, 5.0% (v / v) 2-mercaptoethanol, 0.1% (w / v) SDS, 150V for 30 minutes, 400V 60 minutes, 700V 70 minutes, 1000V 40 minutes. After electrophoresis, fixation with 15% TCA for 10 minutes, change to decolorization solution (25% (v / v) ethanol, 10% (v / v) acetic acid), remove ampholine by 16 hours treatment, and then stain (0.1% (w / v) Coomasie brilliant blue R-250, 50% (v / v) ethanol, 10% (v / v) acetic acid) Do.
esp1劣勢変異で減少する分子は等電点がpI6.65、6.95、7.10、7.35であることがIEFによって明らかとなった（図１：IEF）（牛島ら 育種学研究 第5巻 （別１） p68 (2003) 第103回日本育種学会講演会要旨集）。これらのプロラミン分子はそれぞれ異なる構造遺伝子の翻訳産物であると考えられる。 IEF revealed that the molecules that decrease due to esp1 recessive mutations have isoelectric points of pI6.65, 6.95, 7.10, and 7.35 (Figure 1: IEF) (Ushijima et al., Breeding Studies Vol. 5 (Another 1) p68 (2003) The 103th Annual Meeting of the Breeding Society of Japan). These prolamin molecules are thought to be translation products of different structural genes.
以上のことからEsp1遺伝子はプロラミンの構造遺伝子ではなく、その生合成の過程に関与する遺伝子であることが示唆される（Kumamaru et al. TAG 76: 11-16, 1988；牛島ら 育種学研究 第４巻 （別１） p66 (2002) 第101回日本育種学会講演会要旨集）。 This suggests that the Esp1 gene is not a prolamin structural gene but a gene involved in its biosynthesis process (Kumamaru et al. TAG 76: 11-16, 1988; Ushijima et al. Volume 4 (Attachment 1) p66 (2002) Abstracts of the 101st Annual Meeting of the Japanese Society of Breeding).
２．連鎖解析
Esp1遺伝子は第７染色体上に座乗することがトリソミック変異体との交雑後代の分析によって明らかとなっていた（Kumamaru et al. Jpn. J. Genet. 62: 16-22, 1987）。そこでまず、esp1変異体「CM21」とインド型品種「Kasalath」の交雑F2種子からSDS-PAGEで選抜したesp1変異型109個体を用いて連鎖解析を行った。Esp1遺伝子はRFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)マーカー、R2394（短腕末端からの距離80.5cM）、R1422(81.1cM)、R2677(83.3cM)及びSTS(sequence tagged site)マーカー、C53905(81.9cM)、ゲノム塩基配列から新規に作成したCAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)マーカーe81.9-8.2(81.9cM)(プライマー5’-GCTGCTCAGAGAGGGAGTCA-3’（配列番号:1） / 5’-GACACTGCTCGCCAAAGAAG-3’（配列番号:2）、制限酵素HaeIII)、e83.3-13(83.5cM)（プライマー5’-CGTGAAAAAGCAAACCTCCA-3’（配列番号:3） / 5’-TGGTATACGCAGGGAGCATC-3’（配列番号:4）、制限酵素ClaI又はHhaI ）、PCRマーカー、e84.1-15(84.1cM)( プライマー5’-GACGACTGCTGCTGGTTTTC-3’（配列番号:5）/ 5’-GTTGTTGCCACGTTTGCTTT-3’（配列番号:6）)を用いた分析によりe81.9-8.2（81.9cM）とR2677（83.3cM）の間に位置づけられた（図２A）（熊丸ら 育種学雑誌 第47巻 （別2） p176(1997) 第92回日本育種学会講演会要旨、Ushijima et al. RGP 19: 64, 2002、牛島ら 育種学研究 第5巻 （別１） p68 (2003) 第103回日本育種学会講演会要旨集）。しかしながら、この連鎖解析の精度ではマップベースクローニングによる遺伝子の単離・同定は困難である。
2. Linkage analysis
It was revealed by analysis of the progeny of a hybrid with a trisomic mutant that the Esp1 gene sits on chromosome 7 (Kumamaru et al. Jpn. J. Genet. 62: 16-22, 1987). Therefore, linkage analysis was first performed using 109 esp1 mutants selected by SDS-PAGE from hybrid F2 seeds of esp1 mutant “CM21” and Indian variety “Kasalath”. Esp1 gene is RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) marker, R2394 (distance 80.5 cM from short arm end), R1422 (81.1 cM), R2677 (83.3 cM) and STS (sequence tagged site) marker, C53905 (81.9 cM), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) marker newly created from genomic base sequence e81.9-8.2 (81.9cM) (primer 5'-GCTGCTCAGAGAGGGAGTCA-3 '(SEQ ID NO: 1) / 5'-GACACTGCTCGCCAAAGAAG-3' (sequence Number: 2), restriction enzyme HaeIII), e83.3-13 (83.5cM) (primer 5'-CGTGAAAAAGCAAACCTCCA-3 '(SEQ ID NO: 3) / 5'-TGGTATACGCAGGGAGCATC-3' (SEQ ID NO: 4), restriction Enzyme ClaI or HhaI), PCR marker, e84.1-15 (84.1cM) (Primer 5'-GACGACTGCTGCTGGTTTTC-3 '(SEQ ID NO: 5) / 5'-GTTGTTGCCACGTTTGCTTT-3' (SEQ ID NO: 6)) Was positioned between e81.9-8.2 (81.9cM) and R2677 (83.3cM) (Fig. 2A) (Kumamaru et al., Breeding Science Journal Vol. 47 (Attachment 2) p176 (1997) 92nd Japan Abstract of Breeding Society Lecture, U shijima et al. RGP 19: 64, 2002, Ushijima et al. Breeding Studies Vol. 5 (Another 1) p68 (2003) The 103rd Annual Meeting of the Breeding Society of Japan). However, the accuracy of this linkage analysis makes it difficult to isolate and identify genes by map-based cloning.
［高密度連鎖地図の作成］
マップベースクローニングに不可欠な大規模分離集団によるEsp1遺伝子領域の詳細な連鎖解析を行った。連鎖解析は小規模連鎖解析時と同様にesp1変異体「CM21」と「Kasalath」の交雑F2種子を用いて行った。SDS-PAGEによりesp1変異型を示す種子を910個体得た。連鎖分析用のCAPSマーカーは候補領域のゲノム塩基配列を元に新たに作成した。マーカーがヘテロ型を示し、Esp1遺伝子候補領域がホモ型を示す組換え型個体がCAPSマーカーe11f2（プライマー5’-GGATCCAACAATCCATCGAA3’（配列番号:7） / 5’- TTTGGTTGGCTTTGCTAACG-3’（配列番号:8）、制限酵素ClaI又はDraI）で9個体、同マーカーe11b6（プライマー5’-CAACATCCTGAGGCTCGAAG-3’（配列番号:9）/ 5’-AAATGACGCTACCGAGCTGA-3’（配列番号:10）、制限酵素PstI）で7個体同定できた（図2B）。CAPSマーカーe11f2とe11b6はBACクローンOJ1047-C01の両端に位置する。このことからEsp1遺伝子はBACクローンOJ1047-C01に含まれることが明らかになり、当該クローンのゲノム塩基配列を元に新規なCAPSマーカーを作成し、候補ゲノム領域をさらに限定した。その結果、Esp1遺伝子の候補領域はCAPSマーカーe11-18（プライマー5’-AAGCAGTTTGCTGGCTCAAA-3’（配列番号:11） / 5’-CAGCGTGTCAGCAAAAACAA-3’（配列番号:12）、制限酵素DraI又はMvaI）と同マーカーe11-27（プライマー5’-TTCCCCAGGTGCTACTGCTA-3’（配列番号:13） / 5’-ACGGGCAGATTTACAACACG-3’（配列番号:14）、制限酵素MvaI）に挟み込まれる約20kbであることが明らかとなった（図 2C）。この候補領域の塩基配列に対してRiceGAAS (Rice Genome Annotation Database; http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp/rgadb/)による遺伝子予測ならびに類似性検索を行ったところ、5個の遺伝子が予測され、そのうち2個はeRF(Eucaryotic Release Factor) 1又はβ-cateninと高い類似性を示した。
[Create high-density linkage map]
Detailed linkage analysis of the Esp1 gene region was performed by a large-scale segregation population essential for map-based cloning. Linkage analysis was performed using hybrid F 2 seeds of esp1 mutants “CM21” and “Kasalath” as in the small-scale linkage analysis. By SDS-PAGE, 910 seeds showing the esp1 mutant were obtained. A CAPS marker for linkage analysis was newly created based on the genomic sequence of the candidate region. Recombinant individuals whose marker is heterozygous and whose Esp1 gene candidate region is homozygous are CAPS marker e11f2 (primer 5'-GGATCCAACAATCCATCGAA3 '(SEQ ID NO: 7) / 5'- TTTGGTTGGCTTTGCTAACG-3' (SEQ ID NO: 8 ), 9 with restriction enzyme ClaI or DraI), with the same marker e11b6 (primer 5'-CAACATCCTGAGGCTCGAAG-3 '(SEQ ID NO: 9) / 5'-AAATGACGCTACCGAGCTGA-3' (SEQ ID NO: 10), restriction enzyme PstI) Seven individuals could be identified (Fig. 2B). CAPS markers e11f2 and e11b6 are located at both ends of BAC clone OJ1047-C01. This revealed that the Esp1 gene is contained in the BAC clone OJ1047-C01, and a new CAPS marker was created based on the genomic base sequence of the clone to further limit the candidate genomic region. As a result, the candidate region of Esp1 gene is CAPS marker e11-18 (primer 5'-AAGCAGTTTGCTGGCTCAAA-3 '(SEQ ID NO: 11) / 5'-CAGCGTGTCAGCAAAAACAA-3' (SEQ ID NO: 12), restriction enzyme DraI or MvaI) And the same marker e11-27 (primer 5'-TTCCCCAGGTGCTACTGCTA-3 '(SEQ ID NO: 13) / 5'-ACGGGCAGATTTACAACACG-3' (SEQ ID NO: 14), restriction enzyme MvaI) is about 20kb (Figure 2C). When the gene prediction and similarity search by RiceGAAS (Rice Genome Annotation Database; http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp/rgadb/) were performed on the base sequence of this candidate region, 5 genes were found. Two of them were highly similar to eRF (Eucaryotic Release Factor) 1 or β-catenin.
［候補遺伝子の塩基配列解析によるEsp1候補遺伝子の特定］
esp1変異系統「CM21」及び「EM711」、及びそれぞれの原品種「金南風」と「台中65号」のEsp1遺伝子候補領域のゲノム塩基配列を解析した（図3、配列番号：15〜17）。その結果、予測遺伝子の一つについて、esp1変異系統「CM21」と「EM711」において、この遺伝子内における塩基がG1217がAに、G779がAにそれぞれ置換していた（図3）。候補領域における他の塩基に置換は認められなかった。この遺伝子は、タンパク質合成過程において終止コドン認識に関与している翻訳集結因子eRF1とアミノ酸配列において高い相同性が認められる。この結果は、Esp1候補遺伝子はeRF1をコードしていることを示唆している。「金南風」、「台中65号」及び「日本晴」における当該遺伝子のゲノム配列に差異は認められなかった。「日本晴」において当該遺伝子のcDNAの全長の配列をKOME(Knowledge-based Oryza Molecular biological Encyclopedia；http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)による検索を行い、ゲノム塩基配列と比較したところ、Esp1候補遺伝子は1個のエクソンからなり、コード領域の全長は1314bp、437アミノ酸からなるタンパク質をコードしていることが予測された（図4、配列番号18〜20）。アミノ酸配列では、「CM21」と「EM711」においてEsp1候補遺伝子内の塩基置換によってそれぞれグリシン406がアスパラギン酸、グリシン260がグルタミン酸に置換していた（図4）。
[ Identification of Esp1 candidate genes by nucleotide sequence analysis of candidate genes]
The genome base sequences of the Esp1 mutant lines “CM21” and “EM711” and the Esp1 gene candidate regions of the original varieties “Kinanfu” and “Tainaka 65” were analyzed (FIG. 3, SEQ ID NOs: 15 to 17). . As a result, for one of the predicted genes, in the esp1 mutant lines “CM21” and “EM711”, the bases in this gene were substituted with G1217 for A and G779 for A (FIG. 3). No substitution was found for other bases in the candidate region. This gene has a high homology in amino acid sequence with the translation aggregation factor eRF1, which is involved in stop codon recognition in the protein synthesis process. This result suggests that the Esp1 candidate gene encodes eRF1. There was no difference in the genome sequence of the gene in “Kinnankaze”, “Taichung 65” and “Nippon Hare”. Search for the full-length cDNA sequence of the gene in “Nipponbare” using KOME (Knowledge-based Oryza Molecular biological Encyclopedia; http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/) and compare it with the genome sequence As a result, it was predicted that the Esp1 candidate gene consists of one exon and the coding region has a total length of 1314 bp and encodes a protein consisting of 437 amino acids (FIG. 4, SEQ ID NOs: 18 to 20). As for the amino acid sequences, in “CM21” and “EM711”, glycine 406 was replaced with aspartic acid and glycine 260 was replaced with glutamic acid by base substitution in the Esp1 candidate gene, respectively (FIG. 4).
［発現解析］
eRF1の登熟におけるmRNAの発現は「金南風」、「CM21」についてRT-PCR( Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)で解析した（図6）。RT-PCRは開花後2、4、6、8、10、12日目の種子からTotal RNAをRNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて抽出後、Ready To Go You prime First Strand Beads(GE)を用いて逆転写を行い、その後プライマー5’- GCCGGATCACGGAAATTACT -3’（配列番号：21） / 5’- AGGCCTAATCCTCGCTGGTT -3’（配列番号：22）を用いて、94℃ 4分間 1サイクル / （94℃ 30秒間、60℃ 30秒間、72℃ 2分間） 25サイクル / 72℃ 7分間 1サイクル / 4℃の条件で行った。「金南風」において開花後2日目からすでに当該遺伝子のmRNAの発現が認められた。この傾向はesp1変異体「CM21」でも同様であった。esp1変異体でmRNAの発現が認められたことから、アミノ酸の置換によってeRF1の機能が大幅な減少もしくは喪失したと推察される。
[Expression analysis]
mRNA expression during ripening of eRF1 was analyzed by RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) for “Kinnankaze” and “CM21” (FIG. 6). RT-PCR extracts total RNA from seeds 2, 4, 6, 8, 10 and 12 days after flowering using RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN), and then Ready To Go You prime First Strand Beads (GE). Reverse transcription using primer 5′-GCCGGATCACGGAAATTACT -3 ′ (SEQ ID NO: 21) / 5′-AGGCCTAATCCTCGCTGGTT -3 ′ (SEQ ID NO: 22) 1 cycle / 94 ° C. for 4 minutes 30 seconds, 60 ° C., 30 seconds, 72 ° C., 2 minutes) 25 cycles / 72 ° C., 7 minutes 1 cycle / 4 ° C. In the “Kinnankaze”, mRNA expression of the gene was already observed from the second day after flowering. This tendency was the same for the esp1 mutant “CM21”. Since the expression of mRNA was observed in the esp1 mutant, it is presumed that the amino acid substitution significantly reduced or lost the function of eRF1.
［Esp1遺伝子の機能証明］
Esp1遺伝子がプロラミンの集積における機能を有していることを確認するために、esp1変異体「EM711」の植物体に「金南風」由来のEsp1候補遺伝子を導入する形質転換実験を行った。Esp1候補遺伝子であるeRF1のORFはプライマー5’-CTCTGTCAAGATGTCTGACA-3’（配列番号：23） / 5’- ATATCTAGACCCGGGCTCGAGTGGCTGATTGCTAATCAGAG-3’（配列番号：24）を用いてゲノムDNAをテンプレートにPCRで単離した。また、10kDプロラミンのプロモーターはAY427572をテンプレートとして、プライマー5’-ATATGTACAGTCGACACTGGATAATTATAATATCA-3’（配列番号：25） / 5’-TGTCAGACATCTTGACAGAGTGCTGATTCTACAATACT-3’（配列番号：26）を用いて単離した。その後、PCRで単離したeRF1のORF及び10kDプロラミンのプロモーターを1:1で混合し、プライマー5’-ATATGTACAGTCGACACTGGATAATTATAATATCA-3’（前掲配列番号：25） / 5’- ATATCTAGACCCGGGCTCGAGTGGCTGATTGCTAATCAGAG-3’（前掲配列番号：24）でPCRを行うことにより10kDプロラミンプライマー / eRF1 ORFのPCR産物を得た。このPCR産物を制限酵素Sal I、Xho IでpBluescript SKプラスミドにクローニングした。バイナリーベクターpGPTV(Becker et al. Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197, 1992)に入れた。アグロバクテリウム（EHA105菌株）(Hood et al. Transgenic Res. 2: 208-218, 1993)を介して「EM711」に導入した（図5）。SDS-PAGEの結果、作出された形質転換体T1の種子は、プロラミン含量が原品種とほぼ同等まで増加しているものが分離した（図5）。同サンプルのDsRedの発現をanti-RFP(anti-Red Fluorescent Protein)を用いてウエスタンブロット分析により調べた結果、プロラミン含量が増加した個体と一致した。DsRed遺伝子が発現している個体では同一ベクター内にあるEsp1候補遺伝子も発現していると考えられる。以上の結果から、eRF1が複数のプロラミン分子を集積させる機能を有し、Esp1遺伝子であることが確認された。
[ Proof of Esp1 gene function]
In order to confirm that the Esp1 gene has a function in accumulating prolamin, a transformation experiment was conducted in which an Esp1 candidate gene derived from “Golden style” was introduced into the plant of the esp1 mutant “EM711”. ORF of eRF1 which is a candidate gene of Esp1 was isolated by PCR using genomic DNA as a template using primer 5'-CTCTGTCAAGATGTCTGACA-3 '(SEQ ID NO: 23) / 5'-ATATCTAGACCCGGGCTCGAGTGGCTGATTGCTAATCAGAG-3' (SEQ ID NO: 24) . The 10 kD prolamin promoter was isolated using AY427572 as a template and primer 5'-ATATGTACAGTCGACACTGGATAATTATAATATCA-3 '(SEQ ID NO: 25) / 5'-TGTCAGACATCTTGACAGAGTGCTGATTCTACAATACT-3' (SEQ ID NO: 26). Then, the ORF of eRF1 and 10kD prolamin promoter isolated by PCR were mixed 1: 1, and the primer 5'-ATATGTACAGTCGACACTGGATAATTATAATATCA-3 '(supra SEQ ID NO: 25) / 5'-ATATCTAGACCCGGGCTCGAGTGGCTGATTGCTAATCAGAG-3' (previously SEQ ID NO. : A PCR product of 10 kD prolamin primer / eRF1 ORF was obtained by PCR in 24). This PCR product was cloned into pBluescript SK plasmid with restriction enzymes Sal I and Xho I. It was put into the binary vector pGPTV (Becker et al. Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197, 1992). It was introduced into “EM711” via Agrobacterium (EHA105 strain) (Hood et al. Transgenic Res. 2: 208-218, 1993) (FIG. 5). As a result of SDS-PAGE, the seeds of the produced transformant T 1 were isolated with prolamin content increased to almost the same as that of the original variety (FIG. 5). The expression of DsRed in the sample was examined by Western blot analysis using anti-RFP (anti-Red Fluorescent Protein). As a result, it was consistent with an individual having an increased prolamin content. It is considered that an Esp1 candidate gene in the same vector is also expressed in an individual in which the DsRed gene is expressed. From the above results, it was confirmed that eRF1 has a function of accumulating a plurality of prolamin molecules and is an Esp1 gene.
Claims (7)
（a）配列番号：15に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（c）配列番号：15に記載のヌクレオチド配列において1〜9個のヌクレオチドが欠失、置換、付加及び／又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号：15に記載のヌクレオチド配列と少なくとも90％の同一性を有し、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号：18に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（f）配列番号：18に記載のアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（g）配列番号：18に記載のアミノ酸配列と少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 The following polynucleotide (a), (c), (d), (e), (f) or (g):
(A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15;
(C) a protein comprising a nucleotide sequence in which 1 to 9 nucleotides are deleted, substituted, added and / or inserted in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and having a function of accumulating prolamin in plant seeds The encoding polynucleotide;
(D) a polynucleotide encoding a protein having at least 90% identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and having a function of accumulating prolamin in plant seeds;
(E) a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18;
(F) A protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 and having a function of accumulating prolamin in plant seeds Polynucleotides to:
(G) A polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence having at least 97% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 and having a function of accumulating prolamin in plant seeds.
（e’）配列番号：18に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（f’）配列番号：18に記載のアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質；
（g’）配列番号:18に記載のアミノ酸配列と少なくとも97％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ植物種子においてプロラミンを集積させる機能を有するタンパク質。 The following protein (e ′), (f ′) or (g ′):
(E ′) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18;
(F ′) a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 9 amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and having a function of accumulating prolamin in plant seeds;
(G ′) a protein comprising an amino acid sequence having at least 97% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and having a function of accumulating prolamin in plant seeds.
請求項1に記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子を利用することが、該遺伝子を機能可能に有することによりプロラミン蓄積性である植物において、該遺伝子の機能を低下若しくは喪失させることであるか、又は該遺伝子を機能可能に有さないことによりにプロラミン低集積性である植物において、該ポリヌクレオチドを機能可能に導入することである、方法。 The method of claim 3, wherein:
Use of the gene comprising the polynucleotide according to claim 1 is to reduce or lose the function of the gene in a plant that is prolamin accumulating by operably having the gene, or A method comprising operably introducing the polynucleotide into a plant that is low in prolamin accumulation by not having a gene functionally.
該遺伝子を利用することが、該遺伝子を機能可能に有することによりプロラミン蓄積性である植物において、該遺伝子の機能を低下若しくは喪失させることであり；
このとき該遺伝子の機能を低下若しくは喪失させるための手段が、請求項1に記載のポリヌクレオチドにおいて、1〜9個のヌクレオチドを欠失、置換、付加及び／又は挿入することである、方法。 The method according to claim 4, wherein:
Utilizing the gene is reducing or losing the function of the gene in a plant that is prolamin accumulating by operably having the gene;
The method for reducing or losing the function of the gene at this time is deleting, substituting, adding and / or inserting 1 to 9 nucleotides in the polynucleotide of claim 1.
請求項1に記載のポリヌクレオチドにおいて、1〜9個のヌクレオチドを欠失、置換、付加及び／又は挿入することにより生じたヌクレオチドが、下記の（h）、（i）、（j）又は（k）である、方法：
（h）配列番号：16に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（i）配列番号：17に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（j）配列番号：19に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（k）配列番号：20に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。 The method of claim 5, wherein:
The polynucleotide according to claim 1, wherein nucleotides generated by deleting, substituting, adding and / or inserting 1 to 9 nucleotides are the following (h), (i), (j) or ( k) the method is:
(H) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 16 (i) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 (j) a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19;
(K) a polynucleotide encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008290180A JP5408604B2 (en) | 2008-11-12 | 2008-11-12 | Genes involved in prolamin accumulation and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008290180A JP5408604B2 (en) | 2008-11-12 | 2008-11-12 | Genes involved in prolamin accumulation and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010115141A JP2010115141A (en) | 2010-05-27 |
| JP5408604B2 true JP5408604B2 (en) | 2014-02-05 |
Family
ID=42303223
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008290180A Expired - Fee Related JP5408604B2 (en) | 2008-11-12 | 2008-11-12 | Genes involved in prolamin accumulation and use thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5408604B2 (en) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005185101A (en) * | 2002-05-30 | 2005-07-14 | National Institute Of Agrobiological Sciences | VEGETABLE FULL-LENGTH cDNA AND UTILIZATION THEREOF |
-
2008
- 2008-11-12 JP JP2008290180A patent/JP5408604B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2010115141A (en) | 2010-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109321582B (en) | Application of aegilops tauschii Yr4DS gene in stripe rust resistant breeding of wheat plants | |
| CN111511920A (en) | Novel resistance genes associated with disease resistance in soybean | |
| US20200354735A1 (en) | Plants with increased seed size | |
| WO2019038417A1 (en) | Methods for increasing grain yield | |
| WO2012054468A2 (en) | Potyvirus resistance in potato | |
| US20200255846A1 (en) | Methods for increasing grain yield | |
| WO2002042475A1 (en) | Gene hd3a inducing flowering of plant and utilization thereof | |
| MX2008012443A (en) | Maize genes for controlling plant growth and organ size and their use in improving crop plants. | |
| US7754945B2 (en) | Generation of plants with improved drought tolerance | |
| US7968768B2 (en) | Generation of plants with improved drought tolerance | |
| JP3051874B2 (en) | How to make plants dwarf | |
| WO2011046202A1 (en) | Gene controlling flowering habit/cleistogamy in plants, and use thereof | |
| JP5408604B2 (en) | Genes involved in prolamin accumulation and use thereof | |
| WO2019027871A1 (en) | Peanut with reduced allergen levels | |
| NL2025344B1 (en) | Methods for induction of endogenous tandem duplication events | |
| US20230165205A1 (en) | Methods for induction of endogenous tandem duplication events | |
| CA2572305C (en) | Cell number polynucleotides and polypeptides and methods of use thereof | |
| JP4997508B2 (en) | Lk3 gene controlling rice grain length and use thereof | |
| US10442841B2 (en) | Bread quality protein and methods of use | |
| KR100432534B1 (en) | Asexually producible plant for shortening internode of inflorescence by introducing gene for petunia transcription factor PetSPL2 | |
| KR101630837B1 (en) | Antibiotic marker-free transgenic rice with TaGlu-Dy10 gene from Triticum asetivum | |
| EP4408860A1 (en) | Wheat plants with an increased yield | |
| AU2021264887A1 (en) | Methof for obtaining wheat with increased resistance to powdery mildew | |
| CN114644698A (en) | Application of rice gene OsREM20 in regulation of grain number per ear and yield | |
| US20030226167A1 (en) | No-apical meristem proteins, polynucleotides and methods of use for same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20111007 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20111007 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130710 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130906 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130930 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131029 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5408604 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |