JP5311196B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、照明光を対物レンズを介して照射することで前記照明光の焦点を前記試料に結ばせるとともに、前記焦点からの戻り光を前記対物レンズを介して取得して検出器で検出する顕微鏡装置に関する。

顕微鏡観察において、生体の深部観察を行う際には、焦点面以外からの戻り光の影響により、画像のSNは劣化する。この現象はたとえ共焦点顕微鏡を用いたとしても充分取り除くことはできていない。

この、問題点を解消するための技術（USP5,973,828、USP5,969,854、USP6,423,956、DE4326473）が提案されている。

これらの技術では、二つの対物レンズを用いて、それぞれの焦点領域が交差するように配置することと共焦点顕微鏡技術を組み合わせるによって、それらの交差領域のみの情報が得られることにより、水平分解能は少々悪くなるが、主として深度方向の分解能を向上させるものである（USP5,973,828の図２参照）。

また、これらの構成を比較的低ＮＡのレンズで構成した場合には次の効果があることが非特許文献２に記載されている。
（１）光軸方向の分解能が向上する。
（２）ＮＡが小さいため、生体深部観察においても収差が発生しにくい。
（３）小さい径のものが製作しやすい。
（４）ＷＤを長くできて深部観察に適する。
（５）二つの光路が別々のため、深部観察を行っても観察面以外からの戻り光などのノイズ光の影響を受けにくい。

また、USP5,973,828の図７には、二つの対物レンズの位置関係を保ったまま焦点位置を走査する走査機構が開示されている。また、非特許文献１、非特許文献２には、対象物をステージ等で移動させて走査する方法が開示されている。

米国特許第5,973,828号明細書 米国特許第5,969,854号明細書 米国特許第6,423,956号明細書 独国特許第4326473号明細書 「Confocal microscope with large field and working distance」, Applied Optics, Vol.38, No.22, pp.4870 「Dual-axis confocal microscope for high-resolution in vivo imaging」,Optics Letters,Vol.28,No.6,pp414

しかしながら、角度のついた二つの対物レンズを通る光の焦点の位置関係を保ったまま焦点位置を走査する機構は複雑な上に、走査に時間がかかることが考えられる。また、ステージ等を移動させて走査する方法を適用する場合も、実際には極めて長時間の走査時間がかかると考えられる。

本発明の目的は、照明光を容易に走査でき、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を提供することにある。

本発明の顕微鏡装置は、照明光を対物レンズを介して照射することで前記照明光の焦点を前記試料に結ばせるとともに、前記焦点からの戻り光を前記対物レンズを介して取得して検出器で検出する顕微鏡装置において、前記対物レンズから前記焦点に至る前記照明光の光路と、前記戻り光のうち、前記検出器で検出される光の前記焦点から前記対物レンズに至る光路とが、光路全体に渡り分離され、前記戻り光が蛍光であり、前記照明光が前記対物レンズを通過する領域と、前記戻り光が前記対物レンズを通過する領域とが互いに分離されていることを特徴とする。
この顕微鏡装置によれば、対物レンズから焦点に至る照明光の光路と、戻り光のうち、検出器で検出される光の焦点から対物レンズに至る光路とが、光路全体に渡り分離されているので、照明光を容易に走査でき、生体深部の観察に適している。

前記対物レンズに入射する前記照明光の光軸の方向が、前記対物レンズの対称軸に対して傾けられていてもよい。

前記対物レンズに入射する前記戻り光の光軸の方向が、前記対物レンズの対称軸に対して傾けられていてもよい。

前記照明光の焦点を前記対物レンズの焦点面で走査するとともに、走査された各々の焦点からの戻り光を前記検出器で検出してもよい。

前記照明光の焦点は、前記照明光の光路中のミラーを駆動することにより走査されてもよい。

前記照明光の焦点は、前記照明光の光路中のマスクパターン部材を駆動することにより走査されてもよい。

前記対物レンズから前記焦点に至る前記照明光が前記対物レンズの瞳位置において通過する領域と、前記戻り光のうち前記検出器で検出される光が前記対物レンズの瞳位置において通過する領域とが、分離されてもよい。

前記対物レンズの瞳位置において、前記瞳位置を横断する少なくとも１本以上の直線または曲線で分離される区分のそれぞれ別の区分に、前記照明光の通過する領域と前記戻り光の通過する領域が存在してもよい。

前記対物レンズの瞳位置において、前記瞳位置を横断する少なくとも２本以上の互いに交差する直線または曲線で放射状に分離される区分のそれぞれ別の区分に、前記照明光の通過する領域と前記戻り光の通過する領域が存在してもよい。

前記対物レンズの瞳位置において、前記瞳位置の内部に存在する少なくとも１本以上の閉じた直線または曲線でその内部と外部に分離される区分のそれぞれ別の区分に、前記照明光の通過する領域と前記戻り光の通過する領域が存在してもよい。

前記対物レンズの瞳位置において、前記瞳位置の内部に存在する少なくとも１つの円の内部と外部に分離される区分のそれぞれ別の区分に、前記照明光の通過する領域と前記戻り光の通過する領域が存在してもよい。

前記戻り光の光路と、照明光の光路とを分離するための光路制限手段を設けてもよい。

前記戻り光は蛍光であり、前記光路制限手段として、波長特性を有するフィルタもしくはミラーを用い、前記検出器で検出される蛍光の光路を制限してもよい。

前記光路制限手段として、波長特性を有するフィルタもしくはミラーを用い、前記対物レンズに入る照明光の光路を制限してもよい。

前記照明光の光路または前記戻り光の光路の一部が、前記光路制限手段としての遮光マスクによって制限されてもよい。

前記光路制限手段を前記対物レンズの瞳位置近傍に設けてもよい。

前記光路制限手段を前記対物レンズの瞳位置がリレーされた位置の近傍に設けてもよい。

前記光路制限手段を前記照明光または前記戻り光が平行光をなす光路の部分に設けてもよい。

前記照明光の光路と、前記戻り光の光路とを別々の光学部品により構成してもよい。

前記照明光の焦点の集合がライン状であるとともに、前記検出器による検出される検出点の集合もまた、前記焦点の集合に一致したライン状であってもよい。

前記照明光が近赤外レーザ光であってもよい。

本発明の顕微鏡装置によれば、対物レンズから焦点に至る照明光の光路と、戻り光のうち、検出器で検出される光の焦点から対物レンズに至る光路とが、光路全体に渡り分離されているので、照明光を容易に走査でき、生体深部の観察に適している。

以下、本発明による顕微鏡装置の実施形態について説明する。

以下、図１〜図４を参照して、実施例１の顕微鏡装置について説明する。

図１は、実施例１の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。

図１に示すように、本実施例の顕微鏡装置１は、近赤外の波長のレーザ光を出力するレーザ光源２を備え、その前面には電動シャッタ３が配置されている。さらに、レーザ光の向きを変えるためのダイクロイックミラー４とレーザ光を走査するための走査光学ユニット５とを備えている。

ダイクロイックミラー４はレーザ光の波長を反射し、レーザ光により励起された蛍光を透過させる特性を有する。走査光学ユニット５は、一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー５ａと、可変ミラー５ａの軸にほぼ直交する軸の周りに回転可能な可変ミラー５ｂとを備える。

また、顕微鏡装置１は光を収束させる瞳投影レンズ６とレーザビームを偏向するミラー７及び結像レンズ８と対物レンズ１０を備える。対物レンズ１０の瞳位置の近傍には分離フィルタ９が設けられている。

図２は、分離フィルタ９の構造を示す図である。図２に示すように、分離フィルタ９はレーザ光のみを通過する領域９１と、上記の蛍光のみを通過する領域９２と、遮光領域９３とによって構成されている。

また、顕微鏡装置１は試料１２を載せるステージ１１を有する。また、ダイクロイックミラー４の近傍には試料１２から発生した蛍光を選択的に透過する蛍光フィルタ１３と、蛍光ビームを収束させるレンズ１４とピンホールが形成されたピンホール部材１５と、ピンホール部材１５のピンホールを通過した光を検出する検出器１６とが設けられている。
さらに顕微鏡装置１はコントローラ１７と表示モニタ１８を有し、コントローラ１７による制御に基づいて、電動シャッタ３の開閉、光学走査ユニット５によるレーザ光の走査、光検出器１６からの信号の取得、表示モニタ１８への情報出力が実行される。

次に、本実施例の顕微鏡装置の動作について説明する。

試料１２には、レーザ光源２からの光によって励起される蛍光指示薬が導入された状態で、ステージ１１上に配置される。

レーザ光源２からのレーザ光は、電動シャッタ３が開いている時には電動シャッタ３を通過し、ダイクロイックミラー４によって光走査ユニット５へと導かれ、光走査ユニット５によって任意の方向に走査される。レーザ光はさらに瞳投影レンズ６、反射ミラー７、結像レンズ８を通過し、対物レンズ１０の瞳位置近傍の分離フィルタ９に入射される。

図３は、分離フィルタ９の機能を示す図である。

分離フィルタ９はその一部（領域９１）のみをレーザ光が透過可能に構成されているので、レーザ光はこの部分に照射された光のみが通過して対物レンズ１０に入る。対物レンズ１０によってこのレーザ光は収束されるとともに、光走査ユニット５によってこの収束点は焦点面２０上を走査される。このレーザ光によって試料の蛍光指示薬が励起されて、蛍光が発する。この蛍光は対物レンズ１０によって捕らえられて、分離フィルタ９に向かうが、分離フィルタ９ではその一部（領域９２）のみで蛍光を通過させる。

図１に示すように、分離フィルタ９を通過した蛍光は、レーザ光とは逆向きに進み、結像レンズ８、反射ミラー９、瞳投影レンズ６、光走査ユニット５を介してダイクロイックミラー４へ導かれる。蛍光はダイクロイックミラー４を透過して、蛍光フィルタ１３によって特定の波長成分が選択的に透過されて、レンズ１４と、ピンホール１５によって焦点面２０からの蛍光のみが選択されて検出器１５へ入る。

光検出器１６からの出力信号は、コントロールユニット１７へ導かれ、走査光学ユニット５による走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応させて画像データを作成し、表示モニタ１８上に表示し、あるいは、作成されたデータを内部のメモリに記憶する。

図４は、対物レンズ１０の収束点近傍を示す図である。図４に示すように、右側からのレーザ光により蛍光物質を励起して、左側から蛍光を検出しており、対物レンズ１０の瞳を部分的にしか使用していないため、水平方向分解能はやや悪くなるが、図４のハッチング領域の蛍光が選択的に検出されるために、深さ方向分解能が優れている。

このとき、レーザ光の光軸と検出蛍光の光軸が概ね９０度となるように構成するときに図４に示すハッチング領域が最も小さくなるので最も良好な分解能が得られる。また、レーザ光の光路と検出蛍光の光路が分離されているので、レーザ光により励起される図４のハッチング領域以外の蛍光が、容易には検出されなくなっており、深部観察時にＳＮ良く画像が撮影できる。

また、ハッチング領域のみの蛍光が戻ってくるので、ピンホール１５を用いなくても共焦点効果は得られるが、ピンホール１５を挿入することで一層ＳＮが良くなる。

ここで分離フィルタ９の設置位置は対物レンズ１０の瞳位置の近傍が望ましいが、瞳位置が投影される光走査ユニット５内部かその近傍でも良く、また光走査ユニット５とダイクロイックミラー４の間の平行光路に挿入しても良い。分離フィルタは、対物レンズ１０の瞳位置がリレーされた位置の近傍に設置されればよい。

また、分離フィルタのパターンはこれに限らず、透過する光を選択する各領域が放射状に、あるいは、同心円状に設けられてもよく、同様の効果が得られる他のパターンでも良い。

このように、実施例１の顕微鏡装置によれば、レーザ光を投光する光学系と、検出する光学系を分離したので、光軸方向の分解能に優れている。また、投光系の光学系と検出系の光学系とを別々に構成したので、投光系の光学系の通る様々な場所からのノイズとなる蛍光が、検出系の光路に入り難い構成となっており、極めてＳＮ比が良く、組織の深部観察に適している。

以下、図５を参照して、実施例２の顕微鏡装置について説明する。

図５は、実施例２の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例１と同一構成要素には同一符合を付し、説明を省略する。

図２に示すように、実施例２の顕微鏡装置１Ａでは、レーザ光源２Ａからのレーザ光の光束を絞り、光軸中心を外した光路を通している。また、戻り光（蛍光）を選択する遮光マスク２１が設けられている。

図５において、太線はレーザ光の光束を示している。レーザ光の光路は太線で示す光路を通り、図５において対物レンズ１０の右側から光が入る。試料１１からの蛍光は図の実線で示すように瞳径を満たす太い光束で戻り、遮光マスク２１でその一部のみが取り出され、ピンホール１５を通った光が光検出器１６で検出される。

遮光マスク２１を通る光は対物レンズ１０の左側を通る光束なので、遮光マスク２１は、実施例１の分離フィルタ９と実質的に同様に作用する。また、遮光マスクはピンホール部材１５の近傍に設けても良い。

本実施例の顕微鏡装置では、実施例１の効果に加えて、レーザ光の大半を使用できるので効率が良いという利点がある。

以下、図６〜図８を参照して、実施例３の顕微鏡装置について説明する。実施例１と同一構成要素についての説明は省略する。実施例３の顕微鏡装置では、実施例１の顕微鏡装置に対し、分離フィルタの構造が異なっている。

図６は、本実施例の顕微鏡装置で使用される分離フィルタ９Ａの構造を示す図である。

図６に示すように、分離フィルタ９Ａはレーザ光のみを通過する領域９１Ａ、遮光領域９３Ａおよび蛍光のみを通過する領域９２Ａが順次、内側から外側に向けて同心円状に設けられている。

図７は、分離フィルタ９Ａの機能を示す図である。

図７に示すように、本実施例の顕微鏡装置では、レーザ光源からのレーザ光の光束を絞り、分離フィルタ９Ａの領域９１Ａに対応する光束としている。領域９１Ａを通ったレーザ光は対物レンズ１０で収束される。収束点からの蛍光は領域９２Ａを通ったものが同じ光路を通って戻っていく。

図８は、対物レンズ１０の収束点近傍を示す図である。図８に示すように、本実施例では、光軸に近い領域からのレーザ光により蛍光物質を励起して、外側から蛍光を検出している。これにより、図８のハッチング領域の蛍光が選択的に検出されるために、実施例１と同様、深さ方向分解能が優れている。

ここで分離フィルタ９Ａの設置位置は対物レンズ１０の瞳位置の近傍が望ましいが、瞳位置が投影される光走査ユニット５内部かその近傍でも良く、また光走査ユニット５とダイクロイックミラー４の間の平行光路に挿入しても良い。分離フィルタは、対物レンズ１０の瞳位置がリレーされた位置の近傍に設置されればよい。

本実施例の顕微鏡装置では、実施例１の効果に加えて、レーザ光の大半を使用できるので効率が良いという利点がある。

以下、図９を参照して、実施例４の顕微鏡装置について説明する。実施例４の顕微鏡装置では、実施例１と異なる走査方式を採用している。

図９は、実施例４の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例１と同一構成要素には同一符合を付し、説明を省略する。

図９に示すように、本実施例の顕微鏡装置では、レーザ光源からのレーザ光がスキャナユニット４０に入射される。

スキャナユニット４０は、レーザ光源に連結された光ファイバの先端からレーザ光を照射するレーザ光照射部４１と、コリメータレンズ４２とを備える。また、スキャナユニット４０は、アレイ状にマイクロレンズが配置されたマイクロレンズディスク４３と、同じパターンでピンホールが配置されたピンホールディスク４４とを有し、それらは連結ドラム４５で連結されるとともに、モータ４６で一体的に回転可能な構成になっている。マイクロレンズディスク４３とピンホールディスク４４の間にはダイクロイックミラー４７が配置されている。また、スキャナユニット４０には蛍光フィルタ４８、カメラレンズ４９、カメラ５０が配置されている。

スキャナユニット４０のピンホールディスク４４の下部には結像レンズ８と対物レンズ１０が配置されている。対物レンズ１０の瞳位置の近傍には実施例１と同様の分離フィルタ９が設けられている。この分離フィルタ９に代えて、実施例３の分離フィルタ９Ａを用いてもよい。カメラ５０とモータ４６はコントローラ１７に接続され、回転の同期と露光時間が調整されている。

次に、本実施例の顕微鏡装置の動作について説明する。

レーザ光照射部４１における光ファイバの先端からの光は、コリメートレンズ４２によって平行光へと変換される。この光はマイクロレンズディスク４３に照射され、個々のマイクロレンズの作用によってダイクロイックミラー４７を透過した後、ピンホールディスク４４のマイクロレンズに対応するピンホール上で焦点を結ぶようになっている。

ピンホールディスク４４を通過した光は、結像レンズ８において、通過したピンホールディスク４４のピンホールに対応する傾きを有する平行光に変換される。対物レンズ１０に平行光が入射されると、その傾きに応じて焦点面に焦点を結像するので、対物レンズ１０に入射された光はその傾きに対応した位置で焦点を結ぶ。

図９では光軸中心の光を実線で示し、光軸からずれた光線の例を破線で示す。焦点で発生した蛍光は、対物レンズ１０で集められて平行光となる。ここで分離フィルタ９の効果によって、入射光は図９において対物レンズ１０の右側から照射され、対物レンズ１０の左側を通る光がフィルタ９を通過して、戻っていく（図３参照）。この蛍光は同じ光路を通って再びピンホールディスク４４の同じピンホールを通過する。ここでピンホールを通過した光はダイクロイックミラー４７によって反射されて蛍光フィルタ４８で波長成分が選択され、カメラレンズ４９の作用によりカメラ５０で結像する。

ここでマイクロレンズディスク４３とピンホールディスク４４を一体的に回転させると、ピンホールを通過する光が、対応する焦点面上を走査し、さらに個々の蛍光は再び同じピンホールを通過した後に、カメラ５０の撮像素子上を走査する。この動作によって焦点面の蛍光がカメラ５０に投影されて観察が可能となる。また、この際に焦点面以外の光は、ピンホールをほとんど通過できないためにほとんどカメラ５０に到達することができない。これによって、カメラ５０は焦点面の光のみの共焦点画像を撮影することになる。

また、図３のように右側から励起して、左側から検出しており、対物レンズ１０の瞳を部分的にしか使用していないため、水平方向分解能はやや悪くなるが、図３のハッチング領域の蛍光が検出されるために、深さ方向分解能が優れている。

このとき、レーザ光の光軸と検出蛍光の光軸が概ね９０度となるように構成するときに図３のハッチング領域が最も小さくなるので分解能に優れる。また、本実施例においても、レーザ光の光路と検出蛍光の光路が分離されているので、レーザ光が励起した図３のハッチング領域以外の蛍光が、容易には検出されなくなっており、深部観察時にＳＮ良く画像が撮影できる。

なお、試料近傍で、隣り合ったピンホールを通る光学系の光路どうしが重なると、ＳＮの劣化を招くので、極力試料付近での光路が重ならないような間隔を有するピンホールパターンのピンホールディスク５４等を採用することが望ましい。

実施例４の顕微鏡装置では、ディスクの回転によりレーザ光を走査するスキャナユニット４０を使用するので、実施例１の効果に加えて、走査速度が速いという利点がある。

以下、図１０を参照して、実施例５の顕微鏡装置について説明する。

図１０は、実施例４の顕微鏡装置における対物レンズ周辺の構成を示すブロック図である。図１０は、実施例１と異なる部分を示しており、他の部分は実施例１と同様に構成されている。

本実施例の顕微鏡装置では、結像レンズ８から試料１２に至る光学的な構成が実施例１と異なっている。

図１０に示すように、本実施例ではダイクロイックミラー５１を用いて、結像レンズ８から試料１２に至る照明光の光路と検出系の光路を分離している。すなわち、結像レンズ８の先には、レーザ光の波長の光を反射しレーザ光の波長よりも長い波長の光を反射するダイクロイックミラー５１が配置されている。さらにその近傍には３枚の反射ミラー５２，５３，５４が配置されている。さらに対物レンズ１０Ａとして、比較的径の大きいものが選定されている。

このように構成された本実施例の顕微鏡装置では、結像レンズ８で平行光に変換された近赤外のレーザ光は、ダイクロイックミラー５１およびミラー５２で反射され、対物レンズ１０Ａに対して、その主軸に平行で主軸にオフセットした光として入射される。

図１０に示すように、光は試料１２で焦点を結び、試料１２からは蛍光が発せられる。この蛍光の一部は、図１０に示すように照明光と対物レンズ１０Ａの主軸に対して対称となる別の光路を通って対物レンズ１０Ａで再び平行光に変換され、ミラー５４およびミラー５３で反射される。この蛍光は、蛍光の波長に対して透過特性を有するダイクロイックミラー５１を透過して、照明光と同じ光路を戻る。以下は実施例１と同様に戻り、ダイクロイックミラー４を透過して検出器１６で検出される（図１）。

実施例４の顕微鏡装置によれば、実施例１と同様、レーザ光を投光する光学系と、検出する光学系を分離したので、光軸方向の分解能に優れている。また、投光系の光学系と検出系の光学系とを別々に構成したので、投光系の光学系の通る様々な場所からのノイズとなる蛍光が、検出系の光路に入り難い構成となっており、極めてＳＮ比が良く、組織の深部観察に適している。

以下、図１１を参照して、実施例６の顕微鏡装置について説明する。

図１１は、実施例６の顕微鏡装置１Ｂの構成を示すブロック図である。実施例１と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

実施例６の顕微鏡装置では、ライン状の光を投影する。本実施例の顕微鏡装置は、図示しないレーザ光からのレーザを照射するファイバ６１を有する。ファイバ６１の先には、コリメートレンズ６２、シリンドリカルレンズ６３、紙面に垂直方向に延びるスリットが開口したスリット部材６４、および結像レンズ６５がある。光走査ユニット５Ａは紙面に垂直な回転軸で回転するガルバノミラー５ａを有する。実施例１におけるガルバノミラー５ｂ（図１）に代えて、固定ミラー６８が配置されている。また、実施例１におけるピンホール部材１５（図１）に代えて、紙面に垂直方向に延びるスリットが開口したスリット部材６６が配置され、光検出器としてラインＣＣＤ６７が用いられている。

以下、本実施例の顕微鏡装置１Ｂの動作について説明する。

レーザ光源からの光は、光ファイバ６１によって点光源として伝えられ、コリメートレンズ６２で平行光に変換され、シリンドリカルレンズ６３によってライン状に集光される。この集光点に配置されたスリット６３を通過した光は、結像レンズ６４を通過する。

この後、この光は図１１に示すように、実施例１と同様の光路を介して対物レンズ１０によって焦点面に結像され、紙面に垂直なライン状となる。このラインからの蛍光は対物レンズ１０で回収されるが、ライン上の個々の点は、実施例１と同様、分離フィルタ９の効果で図３のハッチング領域のみの蛍光が回収される。この蛍光はレンズ系によってスリット部材６６のスリットに再び結像され、このスリットを通過した焦点面からの光のみがラインＣＣＤ６７で検出される。

さらに、ガルバノミラー５ａを操作することにより、ラインは焦点面上をラインに垂直な方向に走査され、この情報はラインＣＣＤ６７で検出されて、コントローラ２０で画像化される。

実施例６の顕微鏡装置１Ｂでは、照明光の焦点の集合がライン状であるとともに、前記検出される検出点の集合もまた、焦点の集合に一致したライン状としたので、実施例１の効果に加えて、ラインを１方向に走査する構成にしたので走査時間を短縮できるという利点がある。

以下、図１２を参照して、実施例７の顕微鏡装置について説明する。

図１２は、実施例７の顕微鏡装置１Ｃの構成を示すブロック図である。実施例１と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

本実施例の顕微鏡装置１Ｃは、投光光学系と検出光学系を完全に分離した構成をとる。

図１２に示すように、投光系の光学系は、実施例１における光路中のダイクロイックミラー４を用いていない。また、結像レンズ８の光は、対物レンズ１０にオフセットして入射するようになっており、実施例１の分離フィルタ９は除去されている。また対物レンズ１０で回収される蛍光は、投光系の光と対物レンズ１２の光軸に対して対称となり、結像レンズ７１、ミラー７２、瞳投影レンズ７３、２枚のガルバノミラー７４ａ、７４ｂを有する光走査ユニット７４を有する。蛍光フィルタ１３から光検出器１６に至る光路は、実施例１と同様に構成されている。

本実施形態の顕微鏡装置１Ｃでは、レーザ光源２の光は、電動シャッタ３、光走査ユニット５、瞳投影レンズ６、反射ミラー７、結像レンズ８を介して、対物レンズ１０に入射し、対物レンズ１０によって焦点を結ぶ。焦点からの蛍光は対物レンズ１０で回収される。このとき、結像レンズ８からの光が対物レンズ１０にオフセットして入射し、回収される蛍光もオフセットした方向に回収されることで、実施例１と同様の効果で図３のハッチング領域のみからの蛍光が回収される。

この蛍光は平行光に変えられて結像レンズ７１を通りミラー７２で反射し、瞳投影レンズ７３によって、再び平行光に変換され、光操作ユニット７４を通り、蛍光ファイル１３で波長成分を選択される。その後、レンズ１４の作用でピンホール１５に集光され、レンズ１４とピンホール１５によって焦点面からの光のみが選択されて検出器１６へ入る。

また、コントロールユニット１７は光走査ユニット５で焦点面上を走査させる時には、同期して光走査ユニット７４を駆動して、光走査ユニット７４に入る平行光の向きが変化しても、ピンホール１５に向かう光の向きが変化しないように制御を行う。

光検出器１６からの出力信号は、コントロールユニット１７へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応させて画像データを作成して表示モニタ１８上に表示し、あるいは、画像データを内部のメモリに記憶する。

このように、実施例７の顕微鏡装置１Ｃでは、照明光の光路と戻り光の光路とを別々の光学部品により構成し、光路を完全に分離したので、実施例１の効果に加えて、投光系の戻り光などの迷光を確実に除くことができるため、一層画像のＳＮが良くなるという効果がある。

以下、図１３および図１４を参照して、実施例８の顕微鏡装置について説明する。

図１３は、実施例８の顕微鏡装置１Ｄの構成を示すブロック図、図１４は、分離フィルタの機能を示す図である。実施例１と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。

本実施例の顕微鏡装置は、戻り光が蛍光ではなく反射、散乱光である顕微鏡装置に本発明を適用したものである。

図１３に示すように、顕微鏡装置１Ｄでは、実施例１におけるダイクロイックミラー４の代わりに偏光ビームスプリッタ８１が用いられ、蛍光フィルタ１３の代わりに偏光フィルタ８４が用いられる。また、分離フィルタ９の代わりに、偏光を用いた分離フィルタ８２が用いられている。図１４に示すように、分離フィルタ８２の右側領域８２ａと左側領域８２ｂは、それぞれ通過させる直線偏光の偏光方向が９０度異なった偏光フィルタにより構成され、右側領域８２ａと左側領域８２ｂの間には遮光領域８２ｃが設けられている。さらに対物レンズ１０の前には、１/４波長板８３が挿入されている。

このように構成された顕微鏡装置１Ｄでは、レーザ光は直線偏光を有し偏光ビームスプリッタ８１で反射した後、実施例１と同様の光路を通り、分離フィルタ８２に入る。ここでレーザ光の偏光を通すように構成された、分離フィルタ８２の右側領域８２ａのみを透過する。この光は１/４波長板８３で円偏光へと変換され、対物レンズ１０によって焦点を結ぶ。焦点からの反射、散乱光は対物レンズ１０で集められて、もう一度１/４波長板８３を通過することにより、入射レーザとは９０度偏光方向の異なる偏光となり、分離フィルタ８２の左側領域８２ｂを透過する。ここで戻り光は、右側領域８２ａとは偏光方向が９０度異なっているので右側領域８２ａは透過できない。左側領域８２ｂを透過した光は、レーザ光の光路を逆方向に戻り、今度は偏光ビームスプリッタ８１を透過した後に、偏光フィルタ８４でその偏光成分を選択され、ピンホール１８を介して検出器１９で検出される。

このように、実施例８の顕微鏡装置によれば、生体深部の反射、散乱光を検出できるようになる。また、レーザ光を投光する光学系と、検出する光学系を分離したので、光軸方向の分解能に優れている。また、投光系の光学系と検出系の光学系とを別々に構成したので、投光系の光学系の通る様々な場所からのノイズとなる光が、検出系の光路に入り難い構成となっており、極めてＳＮ比が良く、組織の深部観察に適している。

以下、図１５を参照して、実施例９の顕微鏡装置について説明する。

図１５は、実施例１の顕微鏡装置１に使用される分離フィルタ９に代えて使用される分離フィルタ９Ｂの構造を示す図である。他の要素は実施例１と同様である。

分離フィルタ９Ｂは、透過光を選択する領域を放射状に配置したものである。図１５に示すように、分離フィルタ９Ｂはレーザ光のみを通過する領域９１Ｂと、蛍光のみを通過する領域９２Ｂと、遮光領域９３Ｂとによって構成されている。領域９１Ｂおよび領域９２Ｂが、それぞれ光軸を対象点として対向した位置に配置されている。

分離フィルタ９Ｂでは、投光系と検出系が対物レンズ１０の瞳のそれぞれ向かいあう位置を使用するので、焦点が小さくなり、より分解能が向上する。

本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、照明光を対物レンズを介して照射することで照明光の焦点を試料に結ばせるとともに、焦点からの戻り光を対物レンズを介して取得して検出器で検出する顕微鏡装置に対し、広く適用することができる。

実施例１の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 分離フィルタの構造を示す図。 分離フィルタの機能を示す図。 対物レンズの収束点近傍を示す図。 実施例２の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 分離フィルタの構造を示す図。 分離フィルタの機能を示す図。 対物レンズの収束点近傍を示す図。 実施例４の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 対物レンズ周辺の構成を示すブロック図。 実施例６の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 実施例７の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 実施例８の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。 分離フィルタの機能を示す図。 分離フィルタの構造を示す図。

符号の説明

９，９Ａ，９Ｂ 分離フィルタ（光路制限手段）
１０ 対物レンズ
１０Ａ 対物レンズ
１６ 光検出器（検出器）
２１ 遮光マスク（光路制限手段）
４０ スキャナユニット（光路制限手段）
５１ ダイクロイックミラー（光路制限手段）
６７ ラインＣＣＤ（検出器）
８２ 分離フィルタ（光路制限手段）

Claims (21)

1. 照明光を対物レンズを介して照射することで前記照明光の焦点を前記試料に結ばせるとともに、前記焦点からの戻り光を前記対物レンズを介して取得して検出器で検出する顕微鏡装置において、
   前記対物レンズから前記焦点に至る前記照明光の光路と、前記戻り光のうち、前記検出器で検出される光の前記焦点から前記対物レンズに至る光路とが、光路全体に渡り分離され、
   前記戻り光が蛍光であり、
   前記照明光が前記対物レンズを通過する領域と、前記戻り光が前記対物レンズを通過する領域とが互いに分離されていることを特徴とする顕微鏡装置。
2. 前記対物レンズに入射する前記照明光の光軸の方向が、前記対物レンズの対称軸に対して傾けられていることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記対物レンズに入射する前記戻り光の光軸の方向が、前記対物レンズの対称軸に対して傾けられていることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記照明光の焦点を前記対物レンズの焦点面で走査するとともに、走査された各々の焦点からの戻り光を前記検出器で検出することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
5. 前記照明光の焦点は、前記照明光の光路中のミラーを駆動することにより走査されることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡装置。
6. 前記照明光の焦点は、前記照明光の光路中のマスクパターン部材を駆動することにより走査されることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡装置。
7. 前記対物レンズから前記焦点に至る前記照明光が前記対物レンズの瞳位置において通過する領域と、前記戻り光のうち前記検出器で検出される光が前記対物レンズの瞳位置において通過する領域とが、分離されていることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
8. 前記対物レンズの瞳位置において、前記瞳位置を横断する少なくとも１本以上の直線または曲線で分離される区分のそれぞれ別の区分に、前記照明光の通過する領域と前記戻り光の通過する領域が存在することを特徴とする請求項７記載の顕微鏡装置。
9. 前記対物レンズの瞳位置において、前記瞳位置を横断する少なくとも２本以上の互いに交差する直線または曲線で放射状に分離される区分のそれぞれ別の区分に、前記照明光の通過する領域と前記戻り光の通過する領域が存在することを特徴とする請求項８記載の顕微鏡装置。
10. 前記対物レンズの瞳位置において、前記瞳位置の内部に存在する少なくとも１本以上の閉じた直線または曲線でその内部と外部に分離される区分のそれぞれ別の区分に、前記照明光の通過する領域と前記戻り光の通過する領域が存在することを特徴とする請求項７記載の顕微鏡装置。
11. 前記対物レンズの瞳位置において、前記瞳位置の内部に存在する少なくとも１つの円の内部と外部に分離される区分のそれぞれ別の区分に、前記照明光の通過する領域と前記戻り光の通過する領域が存在することを特徴とする請求項１０記載の顕微鏡装置。
12. 前記戻り光の光路と、照明光の光路とを分離するための光路制限手段を設けたことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
13. 前記光路制限手段として、波長特性を有するフィルタもしくはミラーを用い、前記検出器で検出される蛍光の光路を制限することを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡装置。
14. 前記光路制限手段として、波長特性を有するフィルタもしくはミラーを用い、前記対物レンズに入る照明光の光路を制限することを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡装置。
15. 前記照明光の光路または前記戻り光の光路の一部が、前記光路制限手段としての遮光マスクによって制限されることを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡装置。
16. 前記光路制限手段を前記対物レンズの瞳位置近傍に設けたことを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡装置。
17. 前記光路制限手段を前記対物レンズの瞳位置がリレーされた位置の近傍に設けたことを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡装置。
18. 前記光路制限手段を前記照明光または前記戻り光が平行光をなす光路の部分に設けたことを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡装置。
19. 前記照明光の光路と、前記戻り光の光路とを別々の光学部品により構成したことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
20. 前記照明光の焦点の集合がライン状であるとともに、前記検出器による検出される検出点の集合もまた、前記焦点の集合に一致したライン状であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
21. 前記照明光が近赤外レーザ光であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。

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