JP5394718B2 - 顕微観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、焦点検出装置を備えた顕微観察装置に関し、特に、マイクロプレートやスライドガラスなどの透明基板の所望の表面に焦点合わせを自動的に行うための焦点検出装置を備えた顕微観察装置に関する。

バイオテクノロジーの分野においては、様々な条件下での種々の生細胞の反応を明らかにするため、多数の細胞を対象とした統計解析結果を用いることが頻繁に行われている。このような目的のため、従来、フローサイトメーターと呼ばれる装置が使用されてきたが、近年、顕微観察装置によって多数の細胞の画像を取得し、取得した画像を解析することにより統計解析結果を得るという手法が用いられるようになってきている。

ところで、実際に様々な条件下での生細胞の反応を試験するためには、マイクロプレートなどの容器の中で培養された非常に多くの生細胞を解析対象とする必要がある。
このため、細胞画像を取得する顕微観察装置としては、マイクロプレートなどの容器の下方より観察する倒立顕微鏡型の光学配置を採用し、さらに視野位置変更、焦点合わせ、撮像などの画像取得に係わる一連の動作を自動化したものが望まれる。

顕微観察装置を自動化する場合には、特に、焦点合わせの自動化方式が重要である。一般的に、焦点合わせの自動化方式には、大別して対象物（被写体）に赤外線等の照明光を照射し、その反射光の光量等を検出することにより焦点を検出するアクティブ方式と、レンズで捉えた画像を利用して焦点を検出するパッシブ方式の２つの方式が存在する。

しかるに、様々な条件下での種々の生細胞の反応を明らかにすることを目的として細胞画像を取得する顕微観察装置においては、多数の画像を取得する必要があるため、迅速な動作速度を有するアクティブ方式の焦点合わせ方式が採用されることが多い。このようなアクティブ方式を採用した焦点検出装置としては、例えば、次の特許文献１に記載のものがある。

ところで、このようなアクティブ方式の焦点検出装置においては、特許文献１に記載されているように光源としてレーザを使用することが一般的に行われているが、高い焦点合わせ精度を実現するために、レーザ光束径を対物レンズの瞳径に一致させるのが一般的である。しかしながら、レーザ光束径を瞳径の大きな低倍率の対物レンズに合わせて最適化すると、瞳径の小さな高倍率の対物レンズに切り換えた場合にレーザ光束が対物レンズの瞳によってケラレるため、光量不足となって焦点検出を行うことが困難になり易い。
一方、レーザ光束の径を瞳径の小さな高倍率の対物レンズに合わせて最適化すると、瞳径の大きな低倍率の対物レンズに切り換えた場合に焦点検出の精度が悪化する。

特許文献１には、従来の焦点検出用光源のレーザパワーの制御に関し、レーザ光束径を瞳径の大きな対物レンズに合わせるとともに、制御回路を介して焦点検出用光源のレーザパワーを倍率の異なる対物レンズごとに変化させて、充分な受光量を得ることによって焦点検出を行うことが記載されている。
しかし、制御回路を介して焦点検出用光源のパワーを変化させる方法では、瞳径の小さい対物レンズを用いたときに、レーザ光のパワーが大きくなり過ぎ、対物レンズを外したときに、高出力のレーザ光が外部に出力されるなどの安全上の問題が生じるおそれがある。

しかるに、特許文献１には、レーザ光源と対物レンズとの間に、ＮＤフィルタと径の異なる開口絞りを組み合わせた絞りフィルタ組立体を備え、レーザ光源のパワーを一定にしたままで、ＮＤフィルタを介してレーザ光量を調節するとともに、開口絞りを選択してレーザ光束の径を対物レンズの瞳径に合わせるようにした構成が開示されている。
特開２００７−１６３７３８号公報

また、アクティブ方式を採用した焦点検出装置においては、透明基板の一方の面に焦点を合わせるために、その一方の面からの反射光を光検出器で検出するような場合に、他方の面からの反射光も光検出器で検出されてノイズとなって焦点の検出に悪影響を及ぼすという問題がある。

しかしながら、特許文献１に記載の焦点検出装置のように、開口絞りを介してレーザ光束の径を対物レンズの瞳径に合わせる構成では、他方の面からの反射光も光検出器で検出されてノイズとなって焦点の検出に悪影響を及ぼすという問題を解決することができない。

本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、瞳径の異なる対物レンズに切り換えても、レーザ光を調光することなく、レーザ光束の径を対物レンズの瞳径に合わせて最適化でき、しかも、瞳径の大きな対物レンズに切り換えたときでも、透明基板における焦点合わせの対象となっていない側の表面からの反射光による悪影響を排除しながら、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面からの反射光量を高い検出感度で検出して、この焦点合わせの対象となっている側の表面に焦点合わせを行うことが可能な焦点検出装置を備えた顕微鏡観察装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明による顕微観察装置は、瞳径の異なる複数の対物レンズを切り換え可能に有する倒立型顕微鏡と、前記倒立型顕微鏡の焦点を検出する焦点検出装置と、を備えた顕微観察装置において、前記倒立型顕微鏡は、前記対物レンズを介して底面部が透明基板からなる容器を含む被検物を照明する観察用照明光を発する光源と、前記被検物からの光が導かれるＣＣＤカメラと、を備え、前記焦点検出装置は、前記対物レンズを介して被検物の目的表面に対して合焦信号を生成するための合焦信号生成用照明光を発する焦点検出用光源と、前記合焦信号を検出するための光検出器と、前記瞳径の異なる複数の対物レンズの各々の瞳径に合わせて、調光がされていない前記合焦信号生成用照明光の光束の前記対物レンズの瞳位置における入射位置を、前記透明基板の内側表面と外側表面のうちの一方の表面近傍に前記対物レンズの焦点が位置するときに、該一方の表面からの反射光が前記光検出器の受光部に入射するとともに他方の表面からの反射光が該受光部を外れた領域を通るような該対物レンズの瞳内の所定位置に、調節可能な光学部材からなる光束変更手段と、を備えたことを特徴とする。

また、本発明の顕微観察装置においては、前記目的表面は、前記透明基板の内側表面であることが好ましい。

本発明によれば、瞳径の異なる対物レンズに切り換えても、レーザ光を調光することなく、レーザ光束の径を対物レンズの瞳径に合わせて最適化でき、しかも、瞳径の大きな対物レンズに切り換えたときに、透明基板における焦点合わせの対象となっていない側の表面からの反射光による悪影響を排除しながら、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面からの反射光量を高い検出感度で検出して、この焦点合わせの対象となっている側の表面に焦点合わせを行うことが可能な焦点検出装置を備えた顕微観察装置が得られる。

実施形態に先立ち、本発明を導出するに至った経緯について説明する。
本件出願人は、本発明に先立ち、透明基板における焦点合わせの対象となっていない側の表面からの反射光による悪影響を排除しながら、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面からの反射光量を高い検出感度で検出して、この焦点合わせの対象となっている側の表面に焦点合わせを行うことを目的として、特願２００７−３１６８５７号に記載の発明の焦点検出装置を想出した。
そこで、特願２００７−３１６８５７号に記載の発明の焦点検出装置について説明する。

図９は特願２００７−３１６８５７号に記載の発明の一実施形態にかかる焦点検出装置を備えた顕微観察装置の概略構成を示す説明図、図１０は図９の顕微観察装置に備わる焦点検出装置におけるマスク手段を構成する第１及び第２の遮光部の形状、及び（焦点検出用）照明光束における第１及び第２の遮光部で遮光されない領域と遮光される領域を示す説明図、図１１は図１０に示す第１及び第２の遮光部で遮光されない領域の（焦点検出用）照明光について、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面で反射された光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光の、２つの受光部との位置関係を示す説明図である。図１２は図９の焦点検出装置において、焦点を透明基板の被検物側の面に合わせた場合における、焦点合わせの対象となっている側の表面で反射する光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射する光の経路を概念的に示す説明図である。図１３は図１２に示す状態の焦点検出装置において、透明基板における焦点検出対象となっている側と焦点検出対象となっていない側の夫々の表面で反射する光の２つの受光部近傍での入射状態を示す説明図である。図１４は図９の焦点検出装置において、焦点を透明基板の被検物側とは反対側の面に合わせた場合における、焦点合わせの対象となっている側の表面で反射する光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射する光の経路を概念的に示す説明図である。図１５は図１４に示す状態の焦点検出装置において、透明基板における焦点検出対象となっている側と焦点検出対象となっていない側の夫々の表面で反射する光の２つの受光部近傍での入射状態を示す説明図である。なお、図１２及び図１４では説明の便宜上、本発明における点光源及びマスク手段と、光検出器の位置を入れ替えた状態で示してある。また、後述する外乱光遮光部材も省略して示してある。

図９の焦点検出装置を備えた顕微観察装置は、顕微鏡本体５１と、落射照明装置５２と、焦点検出装置５３とからなる。
顕微鏡本体５１は、被検物５４を載置するＸＹステージ５５を備えている。ＸＹステージ５５の下方には、対物レンズ５６と、ハーフミラー５７，７０と、結像レンズ５８と、ＣＣＤカメラ５９とを備えている。ＸＹステージ５５は、水平面内（紙面に対して垂直な平面内）を移動可能に構成されている。対物レンズ５６は、駆動部６０を介して光軸方向に移動可能に構成されている。
被検物５４は、公知の複数ウェルを有するポリスチレン等の光透過性部材で製作されたマイクロプレート５４ａを容器として使用し、培養液５４ｂ中で培養された細胞をマイクロプレート５４ａの底面部５４ａ１の表面５４ａ１１に公知の技術によって固定化したものである。マイクロプレート５４ａの底面部５４ａ１は、本発明における透明基板に相当する。なお、被検物５４に用いる細胞は、さらに解析する項目に応じて適切な方法によって染色された細胞でもかまわない。また、使用する容器として、ここではプラスチック製のものを例示したが、底面にガラスを貼り付けたガラスボトムプレートでもかまわない。

落射照明装置５２は、ＸＹステージ５５の下方に備えられ、光源６１と、レンズ６２からなる。光源６１は、白色ＬＥＤで構成されている。
焦点検出装置５３は、対物レンズ５６と、ハーフミラー５７と、焦点検出ユニット５３’とからなり、焦点検出ユニット５３’は、顕微鏡本体５１におけるハーフミラー５７の反射光路上に配置され、λ／４板６５と、レンズ６３と、偏光ビームスプリッタ６４と、マスク手段６６と、偏光ビームスプリッタ６４の透過光路上に配置された、焦点合わせ用の点光源６７と、偏光ビームスプリッタ６４の反射光路上に配置された、外乱光遮光部材６８と、光検出器６９とを備えている。焦点合わせ用の点光源６７は、レーザダイオードで構成されていて、被検物５４の透明基板（マイクロプレート５４ａの底面部５４ａ１）に対して合焦信号を生成するための照明光を発するようになっている。外乱光遮光部材６８は、後述するマスク手段６６を通過し対物レンズ５６を介して被検物５４を照射し被検物５４で反射されて光検出器６９側へ向かう光のうち、所定の光路を外れた外乱光を遮光するように、光軸Ｘ２に沿う第２の仮想平面（図９では光軸Ｘ２を含む紙面に垂直な平面）で分割したときの一方の領域に設けられている。なお、外乱光遮光部材６８は、所定の光路を外れた外乱光が殆ど発生しない場合には、その配置を省略してもよい。
光検出器６９は、２分割フォトダイオードで構成されている。２分割フォトダイオードは、２つの受光部６９ａ，６９ｂを有している。２つの受光部６９ａ，６９ｂは、光軸Ｘ２に沿う仮想平面（図９では光軸Ｘ２を含む紙面に垂直な平面）を挟んで対称に配置されている。

マスク手段６６は、図１０に示すように、第１の遮光部６６ａと、第２の遮光部６６ｂを有している。
第１の遮光部６６ａは、点光源６７から発せられた照明光の光束のうち光軸Ｘ１に沿う第１の仮想平面（図９では光軸Ｘ１を含む紙面に垂直な平面）で分割したときの一方の領域を通る光束を遮光する形状及び大きさに形成されている。なお、本実施形態では、第１の遮光部６６ａは、矩形形状をしているが、この一方の片側部分の光束を遮光することができる形状であればどのような形状でもよい。
第２の遮光部６６ｂは、光検出器６９における一方の受光部と相似形状（ここでは矩形）に形成され、且つ、透明基板（マイクロプレート５４ａの底面部５４ａ１）における第１又は第２の表面（底面部５４ａ１の表面５４ａ１１又は表面５４ａ１２）のうち、一方の表面近傍に対物レンズ５６の焦点が位置するときに、一方の表面からの反射光が２つの受光部６９ａ，６９ｂに入射するとともに他方の表面からの反射光が、例えば図１１に示すように、第２の仮想平面で分割したときの一方の領域におけるその一方の領域に配置された受光部（図１１の例では受光部６９ａ）を外れた領域を通るように、点光源６７から発せられた照明光の光束のうち光軸Ｘ１に沿う第１の仮想平面で分割したときの他方の領域を通る一部の光束を遮光するように構成されている。

このように構成された本実施形態の焦点検出装置を備えた顕微観察装置では、まず、落射照明装置５２の光源６１である白色ＬＥＤから射出された光が、レンズ６２、ハーフミラー７０、ハーフミラー５７、対物レンズ５６を介してＸＹステージ５５に載置された被検物５４を照明する。このときの被検物５４からの光は、対物レンズ５６、ハーフミラー５７、ハーフミラー７０、レンズ５８を経由してＣＣＤカメラ５９へ導かれる。これにより、ＣＣＤカメラ５９を介して被検物５４を撮像することができる。

また、焦点検出装置５３では、レーザダイオード６７から射出された光の一部が、遮光部材６６を介して遮光される。一方、遮光部材６６によって遮光されることなく通り抜けた光は、偏光ビームスプリッタ６４、レンズ６３、λ／４板６５、ハーフミラー５７、対物レンズ５８を経由して、被検物５４へ導かれる。このときの被検物５４からの反射光は、対物レンズ５８、ハーフミラー５７、λ／４板６５、レンズ６３、偏光ビームスプリッタ６４を経由して、受光素子６９側に導かれる。

ここで、焦点検出装置５３において、マイクロプレート５４ａの底面部５４ａ１からの反射光が受光素子６９へ入射する状態は、底面部５４ａ１の２つの表面位置と対物レンズ５８の焦点位置との関係において次のように変化する。

まず、底面部５４ａ１における培養液５４ｂ及び細胞と接する側の表面５４ａ１１に対物レンズ５８の焦点位置を合わせる場合（以下、対物レンズ５８の焦点を合わせる表面を目的表面と称す。）において、目的表面５４ａ１１近傍に対物レンズ５８の焦点が位置するときは、図１２に示すように、焦点検出装置５３の光路を辿る。
すなわち、レーザダイオード６７から発してマイクロプレート５４ａの底面部５４ａ１で反射された光のうち、目的表面５４ａ１１で反射された光は、対物レンズ５８を透過した後、受光素子６９である２分割フォトディテクター上の結像点７１に結像する。一方、目的表面５４ａ１１に対向する表面５４ａ１２で反射された光は、結像点７１よりも遠い結像点７３で結像する。

したがって、図１３に示すように、目的表面５４ａ１１で反射された光は、ほぼ点に近い状態に集光して２分割フォトディテクターに入射し、２分割フォトディテクターの双方の受光部６９ａ，６９ｂで均等な光量が検出される。一方、表面５４ａ１２で反射された光は、結像しない状態で２分割フォトディテクター側に向かうが、点光源６７から発せられて表面５４ａ１２で反射しうる光のうち２分割フォトディテクターに入射しうる領域の光は、マスク手段６６の第２の遮光部６６ｂによって遮光され、表面５４ａ１２で反射されない。このため、表面５４ａ１２で反射された光は、そのすべてが、２分割フォトディテクターから外れた位置を通る。

一方、底面部５４ａ１における培養液５４ｂ及び細胞と接する側とは反対側の表面５４ａ１２に対物レンズ５８の焦点位置を合わせる場合において、目的表面５４ａ１２近傍に対物レンズ５８の焦点が位置するときは、図１４に示すように、焦点検出装置５３の光路を辿る。
すなわち、レーザダイオード６７から発してマイクロプレート５４ａの底面部５４ａ１で反射された光のうち、目的表面５４ａ１２で反射された光は、対物レンズ５８を透過した後、受光素子６９である２分割フォトディテクター上の結像点７３’に結像する。一方、目的表面５４ａ１２に対向する表面５４ａ１１で反射された光は、結像点７３’よりも近い結像点７１’で結像する。

したがって、図１５に示すように、目的表面５４ａ１２で反射された光は、ほぼ点に近い状態に集光して２分割フォトディテクターに入射し、２分割フォトディテクターの双方の受光部６９ａ，６９ｂで均等な光量が検出される。一方、表面５４ａ１１で反射された光は、２分割フォトディテクター側に向かうが、点光源６７から発せられて表面５４ａ１１で反射しうる光のうち２分割フォトディテクターに入射しうる領域の光は、マスク手段６６の第２の遮光部６６ｂによって遮光され、表面５４ａ１１で反射されない。このため、表面５４ａ１１で反射された光は、そのすべてが、２分割フォトディテクターから外れた位置を通る。

このようにして被検物５４の目的表面からの反射光だけを受光した２分割フォトディテクター６９は、前記反射光の光量情報を捉え、焦点合わせ信号として不図示の制御部へ出力する。そして、この制御部はこの焦点合わせ信号に基づき、（Ａ−Ｂ）／（Ａ十Ｂ）なる評価関数を計算する。焦点検出装置における２分割フォトディテクターによって検出される光量変化の一例を図１６のグラフに示す。また、図１７に図１６のデータに基づいて行った評価関数計算値の一例をグラフに示す。図１７のグラフにおいて、横軸が被検物５４と対物レンズの相対距離、縦軸が焦点合わせ評価値である。焦点合わせは、この評価関数計算値が０となるように駆動部６０を介して対物レンズ５８を上下させる。評価関数計算値が０となる位置に対物レンズ５８が移動したときに対物レンズ５８の焦点が被検物５４の目的表面に位置し合焦が達成される。

このように図９の焦点検出装置によれば、焦点合わせ用光源６７から発した光は、マスク手段６６を介してサンプル容器底面部に照射され、目的としない側の表面からの反射光が排除されるので、点光源６７から発されて目的表面からの反射する光だけを、受光素子で検出することができる。このため、目的としない側の表面からの反射光が外乱光として、焦点合わせ信号に悪影響を及ぼすことなく、高精度な焦点合わせを行うことができるようになる。

ここで、本件出願人は、図９の焦点検出装置において、点光源６７から発せられて目的としない側の表面からの反射光のうち２分割フォトディテクターに入射しうる領域の光が、マスク手段６６における第２の遮光部６６ｂによって遮光される点について着目した。
即ち、図９の発明においては第２の遮光部６６ｂによって遮光される分、第２の遮光部６６ｂを設けない場合に比べて、マスク手段６６を透過したときの光量が少なくなる。ところで、第２の遮光部６６ｂで遮光される領域を通る光は、第２の遮光部６６ｂを設けない場合には外乱光として焦点合わせに影響を与える光である。ここで、この第２の遮光部６６ｂで遮光される領域を通る光を目的表面からの反射光となるべき光として用いることができるようにすれば、目的としない側の表面からの反射光を減らすことができるとともに、目的表面からの反射光が２分割フォトディテクターに入射する強度を強くすることができるので、より高精度な焦点合わせを行うことができるようになる。

しかるに、本件出願人は、点光源６７からの光束が図９の焦点検出装置におけるマスク手段６６を介して遮光される領域から外れた位置を通るように、点光源６７からの光束の位置を調節すれば、マスク手段６６において第２の遮光部６６ｂを設けた場合と同様に、焦点合わせ信号に外乱光の悪影響を及ぼすことをなくす効果が得られ、点光源６７からの光束を有効利用でき、しかも２分割フォトディテクターに入射する強度が強くなり、より高精度な焦点合わせを行うことができるようになることに気がついた。
また、対物レンズの瞳径は、一般に低倍率になるほど大きく、高倍率になるにしたがって小さくなるので、照明用光源からの光束の位置を調整できるようにすることにより、本件出願人は、瞳径の小さい高倍率の対物レンズから瞳径の大きい低倍率の対物レンズに切り換えたときに、点光源からの光束を図８の焦点検出装置におけるマスク手段６６を介して遮光される領域に入らない位置を通るように位置調整可能な本発明を導出するに至った。

第一実施形態
図１は本発明の第一実施形態にかかる顕微観察装置に備わる焦点検出装置の概略構成を示す説明図である。図２は図１の焦点検出装置におけるマスク手段で遮光されない照明光束が、光束入射位置調節手段を介して、対物レンズの瞳位置における入射位置を対物レンズの瞳径に応じた瞳内の所定位置に調節される状態を示す説明図で、(a)は上方から見た図、(b)は側方から見た図である。図３は図１の焦点検出装置に用いられている光束入射位置調節手段の構成を示す分解斜視図である。図４は光束入射位置調節手段による光束入射位置調節の原理説明図である。図５は光束入射位置調節手段による光束入射位置調節の一数値例を示す説明図である。図６は光束入射位置調節手段を構成するプリズムの屈折率ｎ＝１．５１として径が２ｍｍの光束のマージナル光線が対物レンズの瞳位置において光軸から４ｍｍの位置に入射するようにする場合における、光束入射位置調節手段を構成するプリズムの傾斜面間の間隔と、光軸とプリズムの傾斜面とのなす角度との関係を示すグラフである。なお、説明の便宜上、図１では光束入射位置調節手段を光軸周りに９０度回転させた状態で示してある。

第一実施形態の焦点検出装置は、焦点検出用光源１と、コリメートレンズ２と、マスク手段３と、光束入射位置調節手段４と、偏光ビームスプリッタ５と、λ／４板６と、対物レンズ７と、偏光ビームスプリッタ５の反射光路上に配置された結像レンズ８と、光検出器９を有している。なお、図１中、１０は対物レンズの入射瞳であり、Ｓは被検出表面を有する透明基板である。
焦点検出用光源１は、例えば、レーザダイオードなどの点光源で構成されていて、被検物としての透明基板（例えば、マイクロプレートの表面部又は底面部）Ｓの目的表面Ｓ１に対して合焦信号を生成するための照明光を発するようになっている。
コリメートレンズ２は、焦点検出用光源１からの光を平行光束に変換する。
マスク手段３は、点光源１から発せられた照明光の光束のうち光軸Ｘ１に沿う仮想平面（図１では光軸Ｘ１を含む紙面に垂直な平面）で分割したときの一方の領域を通る光束を遮光することが可能な形状及び大きさに形成されている。本実施形態では、マスク手段３は矩形形状に形成されている。なお、この一方の領域の光束を遮光することができる形状であればどのような形状でもよい。
偏光ビームスプリッタ５は、入射光のうちＳ偏光又はＰ偏光のいずれか一方の直線偏光成分を透過し、他方の直線偏光成分を反射する。
λ／４板６は、偏光ビームスプリッタ５の透過光路上に配置されており、偏光ビームスプリッタ５からの一方の直線偏光を円偏光に変換し、また、対物レンズ７からの円偏光を直線偏光を他方の直線偏光に変換する。
光検出器９は、２分割フォトダイオードで構成されている。２分割フォトダイオードは、２つの受光部９ａ，９ｂを有している。２つの受光部は、光軸Ｘ２に沿う仮想平面（図１では光軸Ｘ２を含む紙面に垂直な平面）を挟んで対称に配置されている。

光束位置調整手段４は、第１のプリズム４ａと、第２のプリズム４ｂとで構成されている。第１のプリズム４ａは、入射側が平面４ａ１、出射側が光軸Ｘ１に対称なＶ字形状に凹んだ傾斜面４ａ２で構成されている。第２のプリズム４ｂは、入射側が第１のプリズム４ａの傾斜面４ａ２のＶ字形状に一致する光軸Ｘ１に対称なＶ字形状に突出した傾斜面４ｂ１、出射側が平面４ｂ２で構成されている。
第１のプリズム４ａと第２のプリズム４ｂは、傾斜面４ａ２と傾斜面４ｂ１とが互いに対向した状態で配置され、傾斜面４ａ２，４ｂ１の間隔を調節可能に構成されている。
また、第１のプリズム４ａと第２のプリズム４ｂは、焦点検出用光束を光軸Ｘ１に対称に分離するとともに、傾斜面４ａ２，４ｂ１の間隔を調節することによって、分離した２つの光束の間隔を調節するように構成されている。

そして、光束入射位置調節手段４は、第１のプリズム４ａと第２のプリズム４ｂの間隔を調整することにより、対物レンズ７の瞳１０の位置における焦点検出用光束の入射位置を対物レンズ７の瞳１０の径に応じた瞳１０内の所定位置に調節することができるようになっている。
なお、ここでは、光束入射位置調節手段４は、瞳径の大きい対物レンズに切り換えたとき、被検物としての透明基板（例えば、マイクロプレートの底面部）Ｓにおける２つの表面のうち目的表面Ｓ１近傍に対物レンズ７の焦点が位置するとき、目的表面Ｓ１からの反射光が２分割フォトダイオードの２つの受光部に入射するとともに他方の表面からの反射光が第２の仮想平面で分割したときの一方の領域における当該領域に配置された受光部を外れた領域を通るような対物レンズ７の瞳１０内の所定位置に、対物レンズ７の瞳１０の位置における焦点検出用光束の入射位置を調節可能に構成されている（図２(a)）。

ここで、光束入射位置調節手段４による光束入射位置調節の原理を、図４に示す第１のプリズム４ａと第２のプリズム４ｂとの距離による分離された光束のシフト量との関係から説明する。なお、説明の便宜上、図２(a)に示した光束のうちの光軸Ｘ１から上側の部分について説明することとする。

図４に示すように、第１のプリズム４ａと第２のプリズム４ｂとの面間隔をｄ、第１のプリズム４ａに入射する光束の光軸Ｘ１からのマージナル光線の光線高をｈ₁、第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２と光軸Ｘ１とのなす角度をθ、第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２に垂直な直線と光軸とのなす角度をα、第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２及び第２のプリズム４ｂの入射面（傾斜面）４ｂ１に垂直な直線と第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２で屈折して出射するマージナル光線とのなす角度をβ、第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２で屈折して出射するマージナル光線と光軸Ｘ１とのなす角度をγ、第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２及び第２のプリズム４ｂの入射面（傾斜面）４ｂ１に垂直な線と、第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２と第２のプリズム４ｂの入射面（傾斜面）４ｂ１との交点間の長さをｌ、第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２で屈折して出射するマージナル光線の第２のプリズムの入射面（傾斜面）４ｂ１までの長さをｌ₁、第１のプリズム４ａ及び第２のプリズム４ｂの屈折率をｎとすると、
α＝π／２−θ
β＝ｓｉｎ^-1[ｎｓｉｎ（π／２−θ）]
ｌ＝ｄｓｉｎθ
ｌ／ｌ₁＝ｃｏｓβ よってｌ₁＝ｌ／ｃｏｓβ
γ＝β−α
＝β−（π／２−θ）
＝β＋θ−（π／２）
と表すことができる。

また、第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２で屈折して出射するマージナル光線の第２のプリズムの入射面（傾斜面）４ｂ１との交点に第１のプリズム４ａに入射する光束の光軸Ｘ１からマージナル光線（の延長線）までの垂直な距離をｈ₂とすると、
ｈ₂＝ｌ₁ｓｉｎγ
＝ｌ₁ｓｉｎ[β＋θ−（π／２）]
＝（ｌ／ｃｏｓβ）ｓｉｎ[β＋θ−（π／２）]
＝（ｄｓｉｎθ／ｃｏｓβ）ｓｉｎ[β＋θ−（π／２）]
よって、
ｄ＝ｈ₂（ｃｏｓβ／ｓｉｎθ）ｓｉｎ[β＋θ−（π／２）]
となる。

図５に光束入射位置調節手段４による光束入射位置調節の一数値例を示す。
図５の例では、第１のプリズム４ａ、第２のプリズム４ｂの屈折率ｎ＝１．５１、傾斜第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２と光軸Ｘ１とのなす角度が６０度である。第１のプリズム４ａの出射面（傾斜面）４ａ２と第２のプリズム４ｂの入射面４ｂ１との間隔を０．７４ｍｍあけると、径が２ｍｍの光束のマージナル光線が対物レンズ７の瞳１０の位置において光軸から４ｍｍの位置に入射することができるようになっている。
そこで、対物レンズ７の瞳１０の径が１０ｍｍであるような場合、図５に示すように構成された光束入力位置調節手段４のプリズム４ａ，４ｂの傾斜面４ｂ２，４ｂ１の間隔を調節することで、入射光束をノイズとはならない好適な位置に調節できる。

なお、光束入射位置調整手段４を構成するプリズム４ａ，４ｂに形成する傾斜面４ｂ２，４ｂ１の光軸Ｘ１に対する角度は、図５の例に限定されるものではない。例えば、図６に示すように、光軸Ｘ１に対するプリズム４ａ，４ｂの傾斜面４ａ２，４ｂ１の角度に応じて、プリズム４ａ，４ｂの傾斜面間の距離を調節することで、対物レンズ７における瞳１０内の所定位置に光束の位置を調節することが可能である。

このように構成された第一実施形態の焦点検出装置では、まず、焦点検出用光源１から射出された光が、コリメートレンズ２で平行光束に変換される。変換された光束のうちの光軸Ｘ１に沿う第１の仮想平面で分割したときの一方の領域を通る光束がマスク手段３を介して遮光される。一方、マスク手段３によって遮光されることなく通り抜けた光束は、図２(a)、図２(b)に示すように、光束入射位置調節手段４を介して、対物レンズ７の瞳１０の位置における焦点検出用光束が対物レンズ７の瞳１０の径に応じた瞳１０内の所定位置に入射するように調節される。位置を調節された光は、偏光ビームスプリッタ５に入射する。偏光ビームスプリッタ５を透過した一方の直線偏光がλ／４板６で円偏光に変換され、対物レンズ７を介して被検物を照明する。そして、被検物で反射した光束は、対物レンズ７を通り、λ／４板６で他方の直線偏光に変換され、偏光ビームスプリッタ５で反射され、結像レンズ８を経て光検出器９に導かれる。

ここで、第一実施形態の焦点検出装置では、光束入射調節手段４が、互いに対向した状態で配置された傾斜面４ａ２，４ｂ１を有し、且つ、傾斜面４ａ２，４ｂ１の間隔を調節可能な第１のプリズム４ａ、第２のプリズム４ｂで構成されており、第１のプリズム４ａ、第２のプリズム４ｂの傾斜面４ａ２，４ｂ１の間隔を調節することにより、対物レンズ７の瞳１０の位置における焦点検出用光束の入射位置を対物レンズ７の瞳１０の径に応じた瞳１０内の所定位置に調節可能に構成されている。

したがって、第１のプリズム４ａ、第２のプリズム４ｂの傾斜面４ａ２，４ｂ１の間隔を調節することにより、例えば、被検物である透明基板の第１又は第２の表面のうち一方の表面近傍に対物レンズ７の焦点が位置するときに、一方の表面からの反射光が光検出器９における２つの受光部に入射するとともに他方の表面からの反射光が第２の仮想平面で分割したときの一方の領域における当該領域に配置された受光部を外れた領域を通るような対物レンズ７の瞳１０内の所定位置に、対物レンズ７の瞳１０位置における瞳１０内の焦点検出用光束の入射位置を調節することができる。

このため、第一実施形態の焦点検出装置によれば、瞳径が異なる対物レンズに切り換えても、レーザ光を調光することなく、レーザ光束の径を対物レンズの瞳径に合わせて最適化でき、しかも、瞳径の大きな対物レンズに切り換えたときに、透明基板における焦点合わせの対象となっていない側の表面からの反射光による影響を極力排除しながら、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面からの反射光量を高い検出感度で検出して、この焦点合わせの対象となっている側の表面に焦点合わせを行うことができる。

第二実施形態
図７は本発明の第二実施形態にかかる顕微観察装置に備わる焦点検出装置の概略構成を側方からみた説明図で、(a)は瞳径の大きな対物レンズを用いた場合における、光束入射位置調節手段による光束入射位置の調節状態を示す図、(b)は透明基板の焦点合わせの対象になっている側の表面で反射された光と焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光に関し、(a)の状態での２分割フォトディテクターとの位置関係を示す図であり、(c)は瞳径の小さな対物レンズを用いた場合における、光束入射位置調節手段による光束入射位置の調節状態を示す図である。
第二実施形態の焦点検出装置では、光束入射位置調節手段４は、互いの上下を逆向きにして配置された、頂角の等しい２つのプリズム４ａ’，４ｂ’で構成されている。
第１のプリズム４ａ’は、入射側が平面４ａ１’、出射側が傾斜面４ａ２’で構成されている。
第２のプリズム４ｂ’は、入射側が傾斜面４ａ２’に平行な傾斜面４ｂ１’、出射側が平面４ｂ２’で構成されている。
また、第１のプリズム４ａ’と第２のプリズム４ｂ’は、傾斜面４ａ２’，４ｂ１’の間隔を調節することによって、焦点検出用光束を光軸Ｘ１と垂直な方向にシフトするように構成されている。
そして、光束入射位置調節手段４は、第１のプリズム４ａと第２のプリズム４ｂの間隔を調整することにより、対物レンズ７の瞳１０の位置における焦点検出用光束の入射位置を対物レンズ７の瞳１０の径に応じた瞳１０内の所定位置に調節することができるようになっている。
その他の構成は、第一実施形態の焦点検出装置と略同じである。

このように構成された第二実施形態の焦点検出装置では、プリズム４ａ’とプリズム４ｂ’との間隔が広がるにしたがって、プリズム４ａ’に入射した焦点検出用光束が光軸Ｘ１から離れる方向にシフトし、プリズム４ａ’とプリズム４ｂ’との間隔が狭まるにしたがって、プリズム４ａ’に入射した焦点検出用光束が光軸Ｘ１に近づく方向にシフトする。
そこで、瞳径の大きい対物レンズを用いた場合には、図７(a)に示すように、プリズム４ａ’とプリズム４ｂ’との間隔を広げて、焦点検出用光束の対物レンズ７の瞳１０位置での入射位置を、瞳１０内における光軸Ｘ１から離れた所定位置（ノイズとはならない好適な位置）に調節する。
このとき、図７(b)に示すように、透明基板の焦点合わせの対象になっている側の表面で反射された光は、ほぼ点に近い状態に集光して２分割フォトディテクターに入射し、２分割フォトディテクターの双方の受光部で均等な光量が検出される。一方、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光は、結像しない状態で２分割フォトディテクター側に向かうが、この光のうち２分割フォトディテクターに入射しうる領域の光は、そのすべてが、２分割フォトディテクターから外れた位置を通る。
一方、瞳径の小さい対物レンズを用いた場合には、図７(c)に示すように、プリズム４ａ’とプリズム４ｂ’との間隔を狭めて、焦点検出用光束の対物レンズ７の瞳１０位置での入射位置を、瞳１０内に入るように調節する。

このため、第二実施形態の焦点検出装置によれば、第一実施形態の焦点検出装置と同様に、瞳径の異なる対物レンズに切り換えても、レーザ光を調光することなく、レーザ光束径を対物レンズの瞳径に合わせて最適化でき、しかも、瞳径の大きな対物レンズに切り換えたときでも、焦点合わせの対象となっている側の表面からの反射光量を高い検出感度で検出して、この焦点合わせの対象となっている側の表面に焦点合わせを行うことができる。
しかも、第二実施形態の焦点検出装置によれば、入射光束位置調節手段を構成するプリズムが一種類で済みしかも形状が単純であるため、その分、構成を簡単化できコスト低減に寄与できる。

第三実施形態
図８(a)は本発明の第三実施形態にかかる顕微観察装置に備わる焦点検出装置の概略構成を示す説明図、(b)は透明基板の焦点合わせの対象になっている側の表面で反射された光と焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光に関し、焦点検出装置内の光検出器である２分割フォトディテクターとの位置関係を示す図である。
第三実施形態の焦点検出装置では、光束入射位置調節手段４が、入射側が平面４ａ１”、出射側が光軸Ｘ１に対称な円錐形状に凹んだ傾斜面４ａ２”で構成された第１の円錐レンズ４ａ”と、入射側が第１の円錐レンズ４ａ”の傾斜面４ａ２”の凹んだ円錐形状に一致する、光軸Ｘ１１に対称な円錐形状に突出した傾斜面４ｂ１”、出射側が平面４ｂ２”で構成された第２の円錐レンズ４ｂ”とで構成されている。
そして、光束入射位置調節手段４は、焦点検出用光束を光軸を中心とした同心円状に変形し、円錐レンズ４ａ”，４ｂ”の傾斜面４ａ２”，４ｂ１”の間隔を大きくすることによって、変形した光束を光軸Ｘ１から離れる方向にシフトするようになっている。
その他の構成は、第一実施形態の焦点検出装置と略同じである。
したがって、図８(b)に示すように、透明基板の焦点合わせの対象になっている側の表面で反射された光は、ほぼ点に近い状態に集光して２分割フォトディテクターに入射し、２分割フォトディテクターの双方の受光部で均等な光量が検出される。一方、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光は、結像しない状態で２分割フォトディテクター側に向かうが、この光のうち２分割フォトディテクターに入射しうる領域の光は、そのすべてが、２分割フォトディテクターから外れた位置を通る。

第三実施形態の焦点検出装置によれば、図８に示すように、対物レンズ７の瞳１０内における外周部全域を検出用照明光が通る光路として使用できるので、自動焦点検出の感度が良くなる。
その他の作用効果は、第一実施形態の焦点検出装置と略同じである。

なお、上記各実施形態の焦点検出装置において、瞳径の極端に小さい対物レンズを用いた場合、焦点検出用光束は、瞳１０位置において略瞳１０の全範囲を含む位置に入射し、ノイズとなる光軸近傍の領域にも入射することになる。
そこで、上記各実施形態の焦点検出装置においても、マスク手段３とともに、図９の焦点検出装置において示したマスク手段６６（図１０）をマスク手段３と切り換え可能に備えておき、瞳径の小さい対物レンズを用いた場合には、マスク手段３からマスク手段６６に切り換えるようにするのが好ましい。そのようにすれば、瞳径の小さい対物レンズを用いたときに、焦点合わせ信号に悪影響を及ぼすことなく、高精度な焦点合わせを行うことができるようになる。

その他、上記各実施形態の焦点検出装置では、光束入射位置調節手段４を構成する２つの光学部材としてプリズムを用いたが、プリズムの代わりにＤＯＥを用いても良い。
そのようにすれば、光束入射位置調節手段４を構成する光学部材を小さくすることができ、光束入射位置調節手段４の配置スペースを小さくすることができる。

本発明は、例えば、自動化した顕微観察装置を用いて多数の細胞の画像を取得し、取得した画像を解析することにより統計解析結果を得ることが求められる分野に有用である。

本発明の第一実施形態にかかる顕微観察装置に備わる焦点検出装置の概略構成を示す説明図である。 図１の焦点検出装置におけるマスク手段で遮光されない照明光束が、光束入射位置調節手段を介して、対物レンズの瞳位置における入射位置を対物レンズの瞳径に応じた所定位置に調節される状態を示す説明図で、(a)は上方から見た図、(b)は側方から見た図である。 図１の焦点検出装置に用いられている光束入射位置調節手段の構成を示す分解斜視図である。 光束入射位置調節手段による光束入射位置調節の原理説明図である。 光束入射位置調節手段による光束調節の一例を示す説明図である。 光束入射位置調節手段を構成するプリズムの屈折率ｎ＝１．５１として径が２ｍｍの光束のマージナル光線が対物レンズの瞳位置において光軸から４ｍｍの位置に入射するようにする場合における、光束入射位置調節手段を構成するプリズムの傾斜面間の間隔と、光軸とプリズムの傾斜面とのなす角度との関係を示すグラフである。 本発明の第二実施形態にかかる顕微観察装置に備わる焦点検出装置の概略構成を側方からみた説明図で、(a)は光束入射位置調節手段を介して入射光束の位置を平行にシフトした状態を示す図、(b)は透明基板の焦点合わせの対象になっている側の表面で反射された光と焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光に関し、(a)の状態での２分割フォトディテクターとの位置関係を示す図、(c)は光束入射位置調節手段を介して入射光束の位置をシフトしない状態を示す図である。 (a)は本発明の第三実施形態にかかる顕微観察装置に備わる焦点検出装置の概略構成を示す説明図、(b)は透明基板の焦点合わせの対象になっている側の表面で反射された光と焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光に関し、焦点検出装置内の光検出器である２分割フォトディテクターとの位置関係を示す図である。 特願２００７−３１６８５７号に記載の発明の一実施形態にかかる焦点検出装置を備えた顕微観察装置の概略構成を示す説明図である。 図９の顕微観察装置に備わる焦点検出装置におけるマスク手段を構成する第１及び第２の遮光部の形状、及び（焦点検出用）照明光束における第１及び第２の遮光部で遮光されない領域と遮光される領域を示す説明図である。 図１０に示す第１及び第２の遮光部で遮光されない領域の（焦点検出用）照明光について、透明基板における焦点合わせの対象となっている側の表面で反射された光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射された光の、２つの受光部との位置関係を示す説明図である。 図９の焦点検出装置において、焦点を透明基板の被検物側の面に合わせた場合における、焦点合わせの対象となっている側の表面で反射する光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射する光の経路を概念的に示す説明図である。 図１２に示す状態の焦点検出装置において、透明基板における焦点検出対象となっている側と焦点検出対象となっていない側の夫々の表面で反射する光の２つの受光部近傍での入射状態を示す説明図である。 図９の焦点検出装置において、焦点を透明基板の被検物側とは反対側の面に合わせた場合における、焦点合わせの対象となっている側の表面で反射する光と、焦点合わせの対象となっていない側の表面で反射する光の経路を概念的に示す説明図である。 図１４に示す状態の焦点検出装置において、透明基板における焦点検出対象となっている側と焦点検出対象となっていない側の夫々の表面で反射する光の２つの受光部近傍での入射状態を示す説明図である。 図９の焦点検出装置における２つの受光部で検出される、合焦状態に応じた受光量の変化の一例を示すグラフである。 図１６に示した２つの受光部で検出された受光量に基づき計算された評価関数計算値の一例を示すグラフである。

符号の説明

１ 焦点検出用光源
２ コリメートレンズ
３ マスク手段
４ 光束入射位置調節手段
４ａ，４ａ’ 第１のプリズム
４ａ１，４ａ１’，４ａ１” 平面
４ａ２ 光軸に対称なＶ字形状に凹んだ傾斜面
４ａ２’ 傾斜面
４ａ２” 光軸に対称な円錐形状に凹んだ傾斜面
４ｂ，４ｂ’ 第２のプリズム
４ｂ１ 第１のプリズム４ａの傾斜面４ａ２のＶ字形状に一致する光軸に対称なＶ字形状に突出した傾斜面
４ｂ１’ 傾斜面４ａ２’に平行な傾斜面
４ｂ２，４ｂ２’ 平面
５ 偏光ビームスプリッタ
６ λ／４板
７ 対物レンズ
８ 結像レンズ
９ 光検出器
９ａ，９ｂ 受光部
１０ 入射瞳
５１ 顕微鏡本体
５２ 落射照明装置
５３ 焦点検出装置
５３’ 自動焦点検出ユニット
５４ 被検物
５４ａ マイクロプレート
５４ａ１ 底面部
５４ａ１１，５４ａ１２ 底面部４ａ１の表面
５４ｂ 培養液
５５ ＸＹステージ
５６ 対物レンズ
５７，７０ ハーフミラー
５８ 結像レンズ
５９ ＣＣＤカメラ
６０ 駆動部
６１ 光源
６２，６３ レンズ
６４ 偏光ビームスプリッタ
６５ λ／４板
６６ マスク手段
６６ａ 第１の遮光部
６６ｂ 第２の遮光部
６７ 点光源
６８ 外乱光遮光部材
６９ 光検出器
６９ａ，６９ｂ 受光部
Ｓ 被検出表面を有する透明基板
Ｓ１ 目的表面

Claims (2)

1. 瞳径の異なる複数の対物レンズを切り換え可能に有する倒立型顕微鏡と、前記倒立型顕微鏡の焦点を検出する焦点検出装置と、を備えた顕微観察装置において、
   前記倒立型顕微鏡は、前記対物レンズを介して底面部が透明基板からなる容器を含む被検物を照明する観察用照明光を発する光源と、前記被検物からの光が導かれるＣＣＤカメラと、を備え、
   前記焦点検出装置は、前記対物レンズを介して被検物の目的表面に対して合焦信号を生成するための合焦信号生成用照明光を発する焦点検出用光源と、前記合焦信号を検出するための光検出器と、前記瞳径の異なる複数の対物レンズの各々の瞳径に合わせて、調光がされていない前記合焦信号生成用照明光の光束の前記対物レンズの瞳位置における入射位置を、前記透明基板の内側表面と外側表面のうちの一方の表面近傍に前記対物レンズの焦点が位置するときに、該一方の表面からの反射光が前記光検出器の受光部に入射するとともに他方の表面からの反射光が該受光部を外れた領域を通るような該対物レンズの瞳内の所定位置に、調節可能な光学部材からなる光束変更手段と、を備えたことを特徴とする顕微観察装置。
2. 前記目的表面は、前記透明基板の内側表面であることを特徴とする請求項１に記載の顕微観察装置。

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