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JP5392683B2 - Activating carrier for preparing immobilized protein - Google Patents

Activating carrier for preparing immobilized protein Download PDF

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JP5392683B2
JP5392683B2 JP2009291032A JP2009291032A JP5392683B2 JP 5392683 B2 JP5392683 B2 JP 5392683B2 JP 2009291032 A JP2009291032 A JP 2009291032A JP 2009291032 A JP2009291032 A JP 2009291032A JP 5392683 B2 JP5392683 B2 JP 5392683B2
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正寛 巌倉
潔憲 広田
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  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

本発明は、仲介タンパク質を介して目的とするタンパク質が担体に共有結合で固定化していることを特徴とするタンパク質に関するものであり、関係する技術分野としては、固定化タンパク質が関わる幅広い技術分野、例えば、タンパク質の配向制御固定化、アフィニティ分析、アフィニティ分離、クロマトグラフィー用担体、イムノアフィニティ担体、タンパク質センサー、タンパク質アレイ、タンパク質チップ、マイクロタス、抗体アレイ、タンパク質の除去方法、成分検査、臨床検査、などが含まれる。   The present invention relates to a protein characterized in that the target protein is covalently immobilized on a carrier via a mediator protein, and the related technical fields include a wide range of technical fields related to the immobilized protein, For example, protein orientation control immobilization, affinity analysis, affinity separation, chromatography carrier, immunoaffinity carrier, protein sensor, protein array, protein chip, microtus, antibody array, protein removal method, component test, clinical test, Etc. are included.

用途
タンパク質は、アミノ酸の連鎖により構成されるが、通常、特定の立体構造を形成することにより、その機能、例えば、特異的認識結合機能や触媒機能など他の高分子では到底できない機能を発現する。そのようなタンパク質の機能を幅広く活用する手段として、担体と呼ばれる不溶性の基板、ビーズ、繊維、膜又は可溶性のポリマーなどに結合させること(固定化すること)が行われている。固定化したタンパク質は、クロマトグラフィーなどの物質分離やバイオセンサー、リアクター、除去剤、ウイルス分離など幅広い分野での利用が進んでいる。
Applications Proteins are composed of a chain of amino acids, but usually form specific steric structures to express their functions, such as specific recognition and binding functions and catalytic functions that cannot be achieved with other macromolecules. . As means for utilizing such protein functions widely, binding (immobilization) to an insoluble substrate called a carrier, beads, fibers, membranes or soluble polymers is performed. Immobilized proteins are being used in a wide range of fields such as substance separation such as chromatography, biosensors, reactors, removal agents, and virus separation.

例えば、特定のタンパク質を精製あるいは除去する手段として、アフィニティークロマトグラフィーがよく利用される。アフィニティークロマトグラフィーでは、目的物質と親和性のあるタンパク質(これをリガンド、又はリガンドタンパク質と称する)を不溶性担体に固定しておき、目的物質をこのリガンドに特異的に結合させることで、目的物質を夾雑物から分離した後、適切な条件下にリガンドから遊離・溶出することで、精製を行うことが可能である。   For example, affinity chromatography is often used as a means for purifying or removing a specific protein. In affinity chromatography, a protein having affinity for a target substance (referred to as a ligand or a ligand protein) is immobilized on an insoluble carrier, and the target substance is specifically bound to the ligand to thereby bind the target substance. After separation from contaminants, purification can be performed by releasing and eluting from the ligand under appropriate conditions.

例えば、特定のウイルスに対する抗体をフィルター又はマスクに固定化することにより、特定のウイルスを抗体に結合させることができるため、ウイルス除去フィルター又はマスクとしての利用が考えられる。   For example, since a specific virus can be bound to an antibody by immobilizing an antibody against the specific virus on a filter or mask, it can be used as a virus removal filter or mask.

このように、目的に沿った機能を有するタンパク質を適切な担体と組み合わせ固定化することにより、幅広い用途が開けることは、自明であり、このことが、タンパク質を固定化することにより利用拡大を広げることの原動力となっている。   Thus, it is obvious that a wide range of uses can be opened by immobilizing a protein having a function according to the purpose in combination with an appropriate carrier, and this expands the use expansion by immobilizing the protein. It is the driving force of that.

固定化技術
当該技術分野の当業者にとって自明なこととして、目的タンパク質を担体に固定化する方法としては、固定化反応の形態に応じて、物理吸着と化学的結合の二つに大きく分けられること、また、化学結合の場合も、イオン結合など可逆的結合と共有結合などによる不可逆的結合に分けることができること、物理吸着や可逆的化学結合による固定化は、固定化方法としては、温和で且つ簡便であるが、固定化タンパク質が使用される環境条件として、溶液のpH、塩濃度、温度などの変化に対応できない場合が多く、その利用は非常に限定されること、従って、固定化タンパク質の幅広い用途を目指す場合、共有結合による固定化が望ましいことなどがあげられる。
Immobilization technology It is obvious to those skilled in the art that the method of immobilizing a target protein on a carrier can be broadly divided into physical adsorption and chemical bonding depending on the form of the immobilization reaction. In addition, chemical bonds can also be classified into reversible bonds such as ionic bonds and irreversible bonds such as covalent bonds. Immobilization by physical adsorption or reversible chemical bonds is a mild and Although it is simple, the environmental conditions under which the immobilized protein is used often cannot cope with changes in the pH, salt concentration, temperature, etc. of the solution, and its use is very limited. When aiming at a wide range of applications, it may be desirable to use covalent bonding.

共有結合によるタンパク質の固定化を実施する場合においては、担体基材の表面に固定化反応を行わせるための官能基を導入し、その官能基と反応できるタンパク質末端のアミノ基やカルボキシル基、又は、タンパク質側鎖のSH基、アミノ基、カルボキシル基などとの反応により固定化が通常行われる。時には、担体基材の官能基とタンパク質側鎖の官能基との間に架橋試薬(クロスリンカー)を用いて適当なスペーサーを介して共有結合を形成させることも行われている。   In the case of carrying out protein immobilization by covalent bond, an amino group or carboxyl group at the end of the protein capable of reacting with the functional group by introducing a functional group for immobilization reaction on the surface of the carrier substrate, or Immobilization is usually performed by reaction with SH groups, amino groups, carboxyl groups and the like of protein side chains. In some cases, a covalent bond is formed between a functional group of a carrier substrate and a functional group of a protein side chain through a suitable spacer using a crosslinking reagent (crosslinker).

共有結合によるタンパク質の固定化を実施する場合において、固定化されるタンパク質からみた固定化状況に応じて、固定化に利用される部位(アミノ酸残基番号など)が特定される場合(部位特異的固定化)と特定できない場合(ランダム固定化)のカテゴリーに分けることができる。このうち、タンパク質の末端側1か所で固定化された場合は、固定化されたタンパク質の配向がそろうことから、配向制御固定化と呼ばれる。   When performing protein immobilization by covalent bond, the site (amino acid residue number, etc.) used for immobilization is specified according to the immobilization status from the viewpoint of the protein to be immobilized (site specific) It can be divided into categories when it cannot be identified as (fixed) (random fixed). Among these, when the protein is immobilized at one position on the end side of the protein, it is called orientation controlled immobilization because the orientation of the immobilized protein is aligned.

このように、タンパク質の固定化技術は非常に多岐にわたるが、作製された固定化酵素の機能・性能・安定性など品質の観点で評価すると、理想的な固定化の形態としては、共有結合による配向が制御された形態での固定化タンパク質が望ましいことは、自明である。   In this way, protein immobilization techniques are extremely diverse, but when evaluated from the viewpoint of quality, such as the function, performance, and stability of the prepared immobilized enzyme, the ideal immobilization form is covalent bonding. It is obvious that an immobilized protein in a controlled orientation form is desirable.

しかしながら、タンパク質は、高々20種類のアミノ酸残基を構成要素とするアミノ酸残基の連鎖であることから、望ましい形態での固定化された固定化タンパク質を作製するためには、固定化対象タンパク質のアミノ酸配列に各種制限を加えることが必要となる。例えば、システイン残基のSH基を結合の官能基として利用して、タンパク質の末端側で配向制御固定化を行う場合は、目的とするタンパク質の機能を保持したままタンパク質中のシステイン残基をすべて他のアミノ酸残基に置換し、且つ、末端側に結合を担うシステイン残基を導入することが行われている。   However, since a protein is a chain of amino acid residues composed of at most 20 types of amino acid residues, in order to produce an immobilized immobilized protein in a desired form, Various restrictions must be added to the amino acid sequence. For example, when using the SH group of a cysteine residue as a functional group for binding and performing orientation control immobilization on the terminal side of the protein, all cysteine residues in the protein are retained while retaining the function of the target protein. Substitution with other amino acid residues and introduction of cysteine residues responsible for binding to the terminal side have been carried out.

配向を制御して固定化することにより、目的タンパク質の機能が最大限に発揮されることは、本発明者らがジヒドロ葉酸還元酵素を配向制御固定化することにより元の機能が完全に保たれることを示した結果(非特許文献1及び2を参照)、及び、各種固定化方法により抗体分子の固定化を行った結果より明らかである。ちなみに、抗体分子を共有結合で固定化した場合、担体の表面上での抗体分子の結合様式を整えることは原理的に不可能であり、極端な場合は、抗体分子の物質認識能に必須な部位が利用できない形での固定化が生じたり、物質認識能に大きく影響する形での結合が生じることが多くの文献で示されている。すなわち、共有結合による固定化された抗体の配向性は、分子としてまったく不均質な形での固定化抗体であり、このような不均質な固定化により抗体分子の機能、すなわち、抗原との結合能力が、抗体分子の変性、無秩序な配向や化学修飾などにより、低下することが報告されている(非特許文献3〜5を参照)。   By controlling the orientation and immobilizing, the function of the target protein is exerted to the maximum extent. The inventors have completely maintained the original function by immobilizing and controlling the dihydrofolate reductase. It is clear from the results (see Non-Patent Documents 1 and 2) and the results of immobilizing antibody molecules by various immobilization methods. By the way, when an antibody molecule is immobilized by covalent bond, it is impossible in principle to arrange the binding mode of the antibody molecule on the surface of the carrier. In extreme cases, it is indispensable for the substance recognition ability of the antibody molecule. Many documents indicate that immobilization occurs in a form where the site cannot be used, or that binding occurs in a form that greatly affects substance recognition ability. That is, the orientation of the immobilized antibody by covalent bond is an immobilized antibody in a completely heterogeneous form as a molecule, and the function of the antibody molecule, that is, the binding to the antigen by such heterogeneous immobilization. It has been reported that the ability decreases due to denaturation of antibody molecules, disordered orientation, chemical modification, and the like (see Non-Patent Documents 3 to 5).

さらに、固定化タンパク質の利用において、担体基材の表面に固定化反応を行わせるための導入した官能基を不活性化するために、いわゆる、マスク反応を施す必要があるが、そのために、固定化の対象となるタンパク質は、用いられるマスク反応に非感受性であることが求められる。   Furthermore, in using the immobilized protein, it is necessary to perform a so-called mask reaction in order to inactivate the introduced functional group for causing the surface of the carrier base material to perform the immobilization reaction. The protein to be converted is required to be insensitive to the mask reaction used.

本発明者らは、タンパク質配列の末端一か所での結合を確実なものにするために、シアノシステインを介したタンパク質の固定化反応を開発すると共に、その反応だけでなく官能基のマスク反応にも非感受性であるタンパク質の一般的形態を開発している(特許文献1〜6を参照)。配向を制御して共有結合で固定化するためには、固定化の対象となるタンパク質の配列又は構成するアミノ酸の種類が大きく制限されることになる。   The present inventors have developed a protein immobilization reaction via cyanocysteine in order to ensure the binding at one end of the protein sequence, and not only the reaction but also the mask reaction of the functional group Are developing general forms of proteins that are also insensitive (see Patent Documents 1-6). In order to control the orientation and immobilize with a covalent bond, the protein sequence to be immobilized or the type of amino acid constituting it is greatly limited.

前述したように、固定化タンパク質については、広範な用途が考えられることから、また、天然由来のタンパク質をこれまでの技術を用いて配向を制御して共有結合で固定化することは非常に困難であることから、新たに解決すべき課題が生じた。   As mentioned above, because immobilized proteins can be used in a wide range of applications, it is very difficult to covalently immobilize naturally-derived proteins by controlling the orientation using conventional techniques. Therefore, a new problem to be solved has arisen.

すなわち、天然由来のタンパク質の配列に手を加えることなく、配向を制御して共有結合で固定化するための方法の開発である。特に、抗体タンパク質は、固定化タンパク質としての活用が幅広く進んでいることから、抗体分子の機能を損なうことなく、配向を制御して共有結合で固定化するため技術開発が求められている。   That is, the development of a method for controlling the orientation and immobilizing with a covalent bond without modifying the sequence of the naturally derived protein. In particular, since antibody proteins are widely used as immobilized proteins, there is a need for technological development in order to control the orientation and immobilize them by covalent bonds without impairing the function of the antibody molecules.

抗体分子の配向制御固定化
抗体は、抗体医薬品としての利用に限らず、それぞれの分子種がそれぞれ、非常に特異的にある特定の物質を認識して結合することから、診断などを含む各種分析に幅広く利用されるだけでなく、抗体そのものをアフィニティリガンドとして利用することにより、分離精製用担体としても利用できる。各種分析や分離に抗体を利用する場合は、抗体分子を不溶性基板又は担体に固定化した形、すなわち、固定化抗体の形状とすることが便利である。たとえば、96穴イムノプレートに抗体分子をいわゆる物理吸着により固定化することにより、簡便なイムノアッセイ系を構築することができる。また、不溶性担体基材の表面に官能基を導入し、抗体のアミノ酸側鎖と化学的に結合させた形で固定化することが行われている。しかしながら、このような形態で抗体の固定化を行った場合、担体の表面上での抗体分子の結合様式を整えることは原理的に不可能であり、極端な場合は、抗体分子の物質認識能に必須な部位が利用できない形での固定化が生じ、物質認識能に大きく影響する可能性がある。このことを固定化された抗体の配向性という観点で考えると、分子としてまったく不均質な形での固定化抗体と言わざるを得ない。このような不均質な固定化により抗体分子の機能、すなわち、抗原との結合能力が、抗体分子の変性、無秩序な配向や化学修飾などにより、低下することが報告されている(非特許文献3〜5を参照)。従って、より均質な固定化抗体の製造が望まれている。
Antibody molecule orientation control immobilization Antibodies are not limited to use as antibody drugs, but each molecular species recognizes and binds to a specific substance in a very specific manner, so various analyzes including diagnosis It can be used as a carrier for separation and purification by using the antibody itself as an affinity ligand. When antibodies are used for various analyzes and separations, it is convenient to use a form in which antibody molecules are immobilized on an insoluble substrate or carrier, that is, a form of an immobilized antibody. For example, a simple immunoassay system can be constructed by immobilizing antibody molecules on a 96-well immunoplate by so-called physical adsorption. In addition, a functional group is introduced on the surface of an insoluble carrier substrate and is immobilized in a form in which it is chemically bonded to the amino acid side chain of the antibody. However, when the antibody is immobilized in such a form, it is impossible in principle to arrange the binding mode of the antibody molecule on the surface of the carrier. May cause immobilization in a form in which essential sites cannot be used, which may greatly affect substance recognition ability. Considering this from the viewpoint of the orientation of the immobilized antibody, it must be said that it is an immobilized antibody in a completely heterogeneous form as a molecule. It has been reported that the function of an antibody molecule, that is, the ability to bind to an antigen, decreases due to such heterogeneous immobilization due to denaturation, disordered orientation, chemical modification, etc. of the antibody molecule (Non-patent Document 3). ~ 5). Therefore, it is desired to produce a more homogeneous immobilized antibody.

この問題を解消するために、抗体分子の配向を制御して固定化することが行われるようになってきた。抗体分子の担体表面上における配向性を改善するために、プロテインAやプロテインGと呼ばれる抗体結合タンパク質を利用することが考案された。これらの抗体結合タンパク質は、抗原認識部位とは異なったFcドメインと呼ばれる部位と特異的に結合するタンパク質である。これらの抗体結合タンパク質を、担体表面上に配向を制御して固定化することができれば、固定化したこれら抗体結合タンパク質を介して、配向を制御して、抗体分子そのものを固定化することが可能となる。図1に示す模式図1は、このことをより一般的に示す概念図である。   In order to solve this problem, it has been carried out to control and fix the orientation of antibody molecules. In order to improve the orientation of antibody molecules on the carrier surface, it has been devised to use an antibody binding protein called protein A or protein G. These antibody-binding proteins are proteins that specifically bind to a site called an Fc domain that is different from the antigen recognition site. If these antibody-binding proteins can be immobilized on the carrier surface by controlling the orientation, the antibody molecules themselves can be immobilized by controlling the orientation via these immobilized antibody-binding proteins. It becomes. The schematic diagram 1 shown in FIG. 1 is a conceptual diagram showing this more generally.

このことを、より一般化して表現すると、配向制御固定化を目的とするタンパク質の固定化において、目的タンパク質と特異的に結合する小タンパク質(リガンドタンパク質)を介在タンパク質として、あらかじめ担体表面上に配向制御固定化しておき、介在タンパク質に目的タンパク質を結合させると、介在タンパク質自身は配向が制御されており、且つ、介在タンパク質と目的タンパク質の結合は、定まった構造で結合することから、配向が定まったタンパク質に定まった結合をすることで、目的タンパク質の配向が定まるという帰結になる。このとき、介在タンパク質が結合する部位が、固定化を目的とするタンパク質の機能発現を損なわない部位であれば、このような形での目的タンパク質の固定化は、目的タンパク質の配向が整った上で機能的にも均質な機能が保証できる形態での固定化が実現できることになる。   To express this in a more general way, in the immobilization of proteins for the purpose of orientation control immobilization, a small protein (ligand protein) that specifically binds to the target protein is used as an intervening protein in advance on the carrier surface. When the target protein is bound to the intervening protein by controlling and immobilizing, the orientation of the intervening protein itself is controlled, and the binding of the intervening protein and the target protein is bound by a fixed structure, so the orientation is fixed. The result is that the orientation of the target protein is determined by binding to the protein. At this time, if the site to which the intervening protein binds is a site that does not impair the functional expression of the protein intended for immobilization, immobilization of the target protein in such a form will ensure that the target protein is oriented. Thus, immobilization in a form that can guarantee a functionally uniform function can be realized.

配向を制御しない形での介在タンパク質を介した共有結合での固定化は、1978年ごろに提唱されている。D.M. Gersten and J.J. Marchalonisは、セファローズ4Bにランダム共有結合で固定化したプロテインAとイムノグロブリンGと混合し、結合させたのちに、二価性試薬であるジメチルスベルイミデートで処理することにより、プロテインAとイムノグロブリンGとの間に架橋反応を行わせ、共有結合で両者を結合させたことを示している(非特許文献6を参照)。   Covalent immobilization via intervening proteins in an uncontrolled manner has been proposed around 1978. DM Gersten and JJ Marchalonis mixed protein A and immunoglobulin G immobilized on Sepharose 4B with random covalent bonds, combined, and then treated with dimethyl suberimidate, a bivalent reagent. It shows that a cross-linking reaction was performed between protein A and immunoglobulin G, and both were bound by a covalent bond (see Non-Patent Document 6).

しかしながら、架橋反応で結合したイムノグロブリンGの機能が保持されたままであったという記載はなく、また、今日に至るまでに、このような架橋により作製された固定化抗体が実用的であるとの報告も見当たらない。このことは、架橋反応に用いられる試薬が、主にタンパク質のリジン残基の側鎖のアミノ基と反応すること、また、架橋は、プロテインAとイムノグロブリンGの側鎖間で反応が生じた場合にだけ成立し、分子内での架橋、又は、片方だけの反応(いわゆる、単なる化学修飾)が生じ、固定化した抗体そのものの機能が大きく失われ、プロテインAを介した抗体分子の固定化そのものに成功したとしても、固定化抗体として利用できる形態に反応を制御することが困難であることによるものであると考えられる(図2に示す模式図2)。   However, there is no description that the function of immunoglobulin G bound by the cross-linking reaction was maintained, and to date, the immobilized antibody produced by such cross-linking is practical. There are no reports. This means that the reagent used for the cross-linking reaction mainly reacts with the amino group on the side chain of the lysine residue of the protein, and the cross-linking occurs between the side chain of protein A and immunoglobulin G. Only in some cases, cross-linking within the molecule or reaction on one side (so-called mere chemical modification) occurs, the function of the immobilized antibody itself is greatly lost, and the antibody molecule is immobilized via protein A. Even if it succeeds in itself, it is considered that it is because it is difficult to control the reaction into a form that can be used as an immobilized antibody (schematic diagram 2 shown in FIG. 2).

配向を制御した形での介在タンパク質を介した固定化の優位性は、1996年ごろまでに提唱されている。例えばR. Polziusらは、プロテインGを、固定化基板に結合する際、物理吸着、各種化学的カップリング、ビオチン-アビジンを介した配向制御固定化などにより固定化し、固定化したプロテインGを介してイムノグロブリンを非共有結合的に固定化することにより、機能が保たれること、さらに、配向制御固定化したプロテインGを介してイムノグロブリンGを固定化した場合、抗体の機能を最大限発揮することを示し、配向制御固定化が望ましいことを明らかにしている(非特許文献7を参照)。   The superiority of immobilization via intervening proteins in a controlled orientation has been proposed by around 1996. For example, R. Polzius et al. Immobilized protein G by immobilizing protein G by immobilizing protein G by physical adsorption, various chemical couplings, orientation control immobilization via biotin-avidin, and the like. By immobilizing immunoglobulins non-covalently, the function is maintained, and when immunoglobulin G is immobilized through protein G with orientation-controlled immobilization, the antibody functions to its full potential. It is shown that the orientation control immobilization is desirable (see Non-Patent Document 7).

しかしながら、プロテインA又はプロテインGなどの介在タンパク質を共有結合により配向を制御して固定化したとしても、介在タンパク質と目的タンパク質との結合を非共有結合とした場合、類似タンパク質の存在や、溶液のpH変化、塩濃度変化などにより、目的タンパク質が、固定化基板から遊離するため、その利用が大幅に制限を受ける。例えば、プロテインAを配向制御した担体に蛍光ラベルしたイムノグロブリンGを中性条件で結合した固定化抗体においては、高濃度の蛍光非標識イムノグロブリンGを共存させることにより、徐々に蛍光ラベルしたイムノグロブリンGが遊離する。また、pHを3から2の酸性にするだけで、ほぼすべてのイムノグロブリンGが遊離する。   However, even if the intervening protein such as protein A or protein G is immobilized by controlling the orientation by covalent bond, when the intervening protein and the target protein are non-covalently bound, Since the target protein is released from the immobilized substrate due to changes in pH, salt concentration, etc., its use is greatly limited. For example, in an immobilized antibody in which a fluorescently labeled immunoglobulin G is bound to a carrier in which protein A is orientation-controlled under neutral conditions, by gradually coexisting with a high concentration of fluorescent unlabeled immunoglobulin G, the gradually labeled fluorescently labeled immunoglobulin G is used. Globulin G is released. Also, almost all immunoglobulin G is liberated only by adjusting the pH to 3 to 2.

特開2008-115151号公報JP 2008-115151 A 特開2008-115152号公報JP 2008-115152 A 特開2008-115153号公報JP 2008-115153 A 特開2008-266219号公報JP 2008-266219 A 特開2008-266221号公報JP 2008-266221 A 特開2008-280259号公報JP 2008-280259 A

M Iwakura et al., J. Biochem. 119, 414-420M Iwakura et al., J. Biochem. 119, 414-420 Masahiro Iwakura et al., Protein engineer., 14, 583-589.Masahiro Iwakura et al., Protein engineer., 14, 583-589. M.Nisnevitch et al., J.Biochem.Biophys.Methods, vol. 49, pp.467-480(2001)M. Nisnevitch et al., J. Biochem. Biophys. Methods, vol. 49, pp. 467-480 (2001) R.Danczyk et al. Biotechnol. Bioeng. Vol.84, pp.215-223(2003)R. Danczyk et al. Biotechnol. Bioeng. Vol.84, pp.215-223 (2003) Yongwong Jung et al., Analytical Biochemistry, vol. 374, pp99-105(2008)Yongwong Jung et al., Analytical Biochemistry, vol. 374, pp99-105 (2008) D.M. Gersten et al. J. Immunol. Methods 24 (1978), pp. 305-309.D.M.Gersten et al. J. Immunol.Methods 24 (1978), pp. 305-309. R. Polzius et al., Biosens. Bioelectron. 11 (1996), pp. 503-514.R. Polzius et al., Biosens. Bioelectron. 11 (1996), pp. 503-514.

固定化タンパク質の利用を考える場合、固定化対象のタンパク質の機能が固定化される以前の機能を全く失うことなく共有結合で担体に結合していることが最も望ましい形態である。この目的を達成するためには、上述のように、固定化対象のタンパク質を、機能を損なわない部位を介して配向をそろえて共有結合で固定化することが確実な方法である。しかしながら、上述のように、固定化を目的とするタンパク質の配列を改変することなく配向を制御して固定化することは、困難である。また、アレイなどの作製において、多数のタンパク質をそれぞれ固定化用に配列を転換することは、多大な労力と費用を要する。   When considering the use of an immobilized protein, it is the most desirable form that the function of the protein to be immobilized is bound to the carrier by a covalent bond without losing the previous function. In order to achieve this object, as described above, it is a reliable method to fix the protein to be immobilized by covalent bonding with the orientation aligned through a site that does not impair the function. However, as described above, it is difficult to immobilize by controlling the orientation without altering the sequence of the protein intended for immobilization. Further, in the production of an array or the like, it takes a lot of labor and cost to convert the sequence of many proteins for immobilization.

本発明は、目的とするタンパク質の配列を改変することなく、共有結合で配向を制御して固定化する技術を提供し、さらに該技術を利用した固定化タンパク質固定化用活性化担体の提供を目的とする。   The present invention provides a technique for controlling and immobilizing a covalent bond without modifying the target protein sequence, and further provides an activated carrier for immobilizing an immobilized protein using the technique. Objective.

本発明者らは、上記の課題の解決に向けて、すでに、本発明者らが発明している、リジン及びシステインを全く含まないタンパク質をアミノ又はカルボキシ末端側のいずれか一か所で共有結合により固定化基板に配向制御して固定化した固定化タンパク質(これを介在タンパク質と称する)(特開2008-115151号公報、特開2008-115152号公報、特開2008-115153号公報、特開2008-266219号公報、特開2008-266221号公報、特開2008-280259号公報)に着目し、この介在タンパク質が固定化の対象となるタンパク質が機能発現部位以外の部位で特異的にタンパク質−タンパク質相互作用により強く結合できる場合において、介在タンパク質中のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基をカルボジイミド法などによりアミノ基と特異的に縮合反応をするように活性化し、活性化した状態で目的タンパク質と結合させるとタンパク質構造の揺らぎとの兼ね合いで、両タンパク質の結合部位又はその近傍のリジン残基のアミノ基だけがアミド結合を優先的に結合できるという着想を得て、さらに、このことにより、目的タンパク質において、結合に関与したアミノ酸残基以外のアミノ酸は、全く変化しないことから、介在タンパク質と目的タンパク質との共有結合の形成において、目的タンパク質の機能を保持したまま共有結合(アミド結合)により結合できるという着想を得た。   In order to solve the above problems, the present inventors have already covalently bound a protein containing no lysine and cysteine, which has been invented by the present inventors, at either the amino- or carboxy-terminal side. Immobilized protein (this is referred to as an intervening protein) immobilized on an immobilization substrate by the above-mentioned method (referred to as JP 2008-115151, JP 2008-115152, JP 2008-115153, JP 2008-266219, 2008-266221, 2008-280259), and the interstitial protein is a protein that is specifically immobilized at a site other than the functional expression site. When it can be strongly bound by protein interaction, the carboxyl group on the side chain of the aspartic acid or glutamic acid residue in the intervening protein is specifically condensed with the amino group by the carbodiimide method. When activated and bound to the target protein, the protein structure fluctuates, and only the amino group of the lysine residue at or near the binding site of both proteins binds preferentially In addition, since the amino acid other than the amino acid residue involved in the binding does not change at all in the target protein, the target protein can be formed in the formation of a covalent bond between the intervening protein and the target protein. The idea of being able to bind by a covalent bond (amide bond) while maintaining the function of was obtained.

さらに、この着想が正しいことを、すでに本発明者らが発明しているイムノグロブリンGタンパク質のFcドメインに特異的に結合するプロテインA又はプロテインGタンパク質のアミノ酸配列を改変し、リジン及びシステイン残基を全く含まない形で、共有結合で且つ配向制御固定化した固定化タンパク質を、介在タンパク質として利用することにより、イムノグロブリンGタンパク質を配向制御固定化できること、すなわち、本発明の目的が達成できることを見出した。   Furthermore, it is confirmed that the idea is correct by modifying the amino acid sequence of protein A or protein G protein that specifically binds to the Fc domain of immunoglobulin G protein, which has already been invented by the present inventors. That the immunoglobulin G protein can be orientation-controlled and immobilized, that is, the object of the present invention can be achieved, by using an immobilized protein that is covalently bonded and orientation-controlled and immobilized in a form that does not contain any of I found it.

生物は、特定のタンパク質と特異的に結合するタンパク質を有することから、また、タンパク質工学技術やファージディスプレイ技術などにより、対象とするタンパク質と特異的に結合するタンパク質を任意に創製できることは公知である。さらに、そのような結合タンパク質を、すでに、本発明者らが示しているように、任意のタンパク質の機能を失わないように、リジン又はシステイン残基を全く含まないように、構成するアミノ酸残基を変更できることも公知である(特開2008-115151号公報、特開2008-115152号公報、特開2008-115153号公報、特開2008-266219号公報、特開2008-266221号公報、特開2008-280259号公報)。従って、目的とするタンパク質と特異的に結合するタンパク質及びそのタンパク質をリジン及びシステイン残基を全く含まない形で創製することは、当業者にとって、公知技術を駆使することにより可能である。さらに、そのようにして創製したタンパク質を共有結合で且つ配向制御固定化した固定化タンパク質を創製することも公知技術で達成することができる。従って、本発明の大きな構成要素である、リジン又はシステイン残基を全く含まないタンパク質を介在タンパク質として配向制御固定化した固定化タンパク質を任意に創製できることから、本発明の技術が一般化できるとの着想に至り、本発明を完成させた。   Since living organisms have proteins that specifically bind to specific proteins, it is also known that proteins that specifically bind to the target protein can be arbitrarily created by protein engineering technology or phage display technology. . Furthermore, the amino acid residues that constitute such a binding protein not to contain any lysine or cysteine residues so as not to lose the function of any protein, as we have already shown Is also known (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-115151, Japanese Patent Laid-Open No. 2008-115152, Japanese Patent Laid-Open No. 2008-115153, Japanese Patent Laid-Open No. 2008-266219, Japanese Patent Laid-Open No. 2008-266221, Japanese Patent Laid-Open No. 2008-266221, 2008-280259). Therefore, it is possible for those skilled in the art to create a protein that specifically binds to the target protein and a protein that does not contain any lysine and cysteine residues by using known techniques. Furthermore, creation of an immobilized protein in which the protein thus created is immobilized by covalent bond and orientation control can also be achieved by known techniques. Therefore, the protein of the present invention can be generalized because an immobilized protein in which orientation control is immobilized using a protein that does not contain any lysine or cysteine residue, which is a major component of the present invention, as an intervening protein can be created. The idea was reached and the present invention was completed.

本発明の固定化タンパク質は、図1に示す模式図1に示されるように、担体、介在タンパク質、目的タンパク質で構成され、介在タンパク質を介して、配向が制御された形態で、目的タンパク質が、担体と共有結合で結合しているものである。   As shown in the schematic diagram 1 shown in FIG. 1, the immobilized protein of the present invention is composed of a carrier, an intervening protein, and a target protein, and the target protein is in a form in which orientation is controlled via the intervening protein. It is covalently bonded to the carrier.

このような形態での固定化タンパク質構成そのものに関しては、当業者であれば容易に考案できる構成であるが、本発明における大きな特徴は、固定化されたタンパク質を構成するアミノ酸残基のうち、介在タンパク質との共有結合による結合に関与するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基が固定化前と全く同様、すなわち、目的タンパク質の固定化処理において、化学的修飾を受けないことである。   The structure of the immobilized protein itself in such a form can be easily devised by those skilled in the art. However, the major feature of the present invention is that the amino acid residues constituting the immobilized protein are intervening. The amino acid residues other than the amino acid residues involved in the covalent bond with the protein are exactly the same as before immobilization, that is, they are not subjected to chemical modification in the immobilization treatment of the target protein.

本発明以前においては、模式図1の構成の固定化タンパク質を作製する際に、介在タンパク質と目的タンパク質をあらかじめ結合させ、次に、2価性試薬などの架橋試薬で処理することにより、共有結合により結合が行われた。しかしながら、介在タンパク質と目的タンパク質とが共存する状態で架橋試薬などを用いて処理することにより、目的の架橋以外の分子内架橋又は単なるアミノ酸残基の化学修飾が生じ得る。すなわち、生成物が、図2に示す模式図2で表現されるような固定化タンパク質が生成され、本発明の固定化タンパク質を確実に創製することは不可能であった。   Prior to the present invention, when the immobilized protein having the configuration shown in FIG. 1 was prepared, the intervening protein and the target protein were bound in advance, and then treated with a cross-linking reagent such as a bivalent reagent, thereby covalently binding. The connection was made by However, treatment with a crosslinking reagent or the like in the state where the intervening protein and the target protein coexist can cause intramolecular cross-linking other than the target cross-linking or simple chemical modification of amino acid residues. That is, an immobilized protein such as that represented by the schematic diagram 2 shown in FIG. 2 was generated, and it was impossible to reliably create the immobilized protein of the present invention.

本発明は、模式図1に示すタンパク質を確実に生成する方法を提供しており、その結果、本発明以前に創製できなかった、模式図1で示される固定化タンパク質を初めて創製したものである。従って、模式図1で示される本発明の固定化タンパク質は全く新規な物質である。   The present invention provides a method for reliably generating the protein shown in the schematic diagram 1, and as a result, for the first time, the immobilized protein shown in the schematic diagram 1 that could not be created before the present invention was created. . Therefore, the immobilized protein of the present invention shown in the schematic diagram 1 is a completely new substance.

すなわち、本発明は以下の通りである。
[1] 介在タンパク質を介して目的のタンパク質を固定化するための、介在タンパク質と担体を含む、固定化タンパク質作成用活性化担体であって、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質が、該タンパク質のカルボキシ末端を介して、共有結合により結合しており、該タンパク質のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基がスクシイミド化されている、固定化タンパク質作製用活性化担体。
[2] 介在タンパク質を介して目的のタンパク質を固定化するための、介在タンパク質と担体を含む、固定化タンパク質作成用活性化担体であって、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質が該タンパク質のアミノ末端を介して、共有結合により結合しており、該タンパク質のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基がスクシイミド化されている、固定化タンパク質作製用活性化担体。
[3] 担体が不溶性担体である、[1]又は[2]の固定化タンパク質作製用活性化担体。
[4] リジン及びシステインを含まない介在タンパク質が抗体結合機能を有するタンパク質である、[1]〜[3]のいずれかの固定化タンパク質作製用活性化担体。
[5] リジン及びシステインを含まないタンパク質が、プロテインA、プロテインG及びプロテインLからなる群から選択されるタンパク質由来の抗体結合ドメインの改変タンパク質である、[4]の固定化タンパク質作製用活性化担体。
That is, the present invention is as follows.
[1] An activated carrier for preparing an immobilized protein comprising an intervening protein and a carrier for immobilizing a target protein via the intervening protein, wherein the intervening protein not containing lysine and cysteine An activated carrier for preparing an immobilized protein, which is bound by a covalent bond via a carboxy terminus, and the carboxyl group of the side chain of the aspartic acid or glutamic acid residue of the protein is succinimidated.
[2] An activated carrier for preparing an immobilized protein comprising an intervening protein and a carrier for immobilizing a target protein via the intervening protein, wherein the intervening protein not containing lysine and cysteine is an amino acid of the protein An activated carrier for preparing an immobilized protein, which is covalently bonded via a terminal, and the carboxyl group of the side chain of the aspartic acid residue or glutamic acid residue of the protein is succinimidated.
[3] The activated carrier for producing an immobilized protein according to [1] or [2], wherein the carrier is an insoluble carrier.
[4] The activated carrier for preparing an immobilized protein according to any one of [1] to [3], wherein the intervening protein not containing lysine and cysteine is a protein having an antibody binding function.
[5] Activation for producing an immobilized protein according to [4], wherein the protein not containing lysine and cysteine is a modified protein of an antibody binding domain derived from a protein selected from the group consisting of protein A, protein G, and protein L Carrier.

介在タンパク質を活用することにより、配向が制御され且つ機能余分は副反応を防ぐことができ、物質として均質性の高い固定化タンパク質を高効率に製造することができる。このようにして得られた固定化タンパク質は、センシング材料やアフィニテイ精製用の分離材料などを含め多くの分野での利用が期待できる。   By utilizing the intervening protein, the orientation is controlled and the excess function can prevent side reactions, and an immobilized protein with high homogeneity as a substance can be produced with high efficiency. The immobilized protein thus obtained can be expected to be used in many fields including sensing materials and separation materials for affinity purification.

担体、介在タンパク質、目的タンパク質で構成され、介在タンパク質を介して、配向が制御された形態で、目的タンパク質が、担体と共有結合で結合した状態を示す図である。It is a figure which shows the state which the target protein comprised with the support | carrier, the intervening protein, and the target protein, and the target protein couple | bonded with the support | carrier in the form by which orientation was controlled through the intervening protein. 介在タンパク質と目的タンパク質をあらかじめ結合させ、次に、2価性試薬などの架橋試薬で処理することにより、共有結合により結合した状態を示す図である。It is a figure which shows the state couple | bonded by the covalent bond by couple | bonding intervening protein and the target protein previously, and then processing by cross-linking reagents, such as a bivalent reagent.

以下、本発明を詳細に説明する。
抗体の配向制御固定化
本発明の固定化タンパク質は限定されず、特定の機能を有するあらゆるタンパク質が含まれる。その中でも、結合能を有するイムノグロブリンG、特にモノクローナル抗体があげられる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Antibody Orientation Control Immobilization The immobilized protein of the present invention is not limited, and includes any protein having a specific function. Among them, immunoglobulin G having binding ability, particularly monoclonal antibody can be mentioned.

以下に、固定化抗体及び固定化モノクローナル抗体に関して、より詳細に本発明の内容、その利用法及び効果を説明する。   Hereinafter, the content of the present invention, its usage and effects will be described in more detail with respect to the immobilized antibody and the immobilized monoclonal antibody.

構成要素
[抗体及びモノクローナル抗体の入手方法]
抗体は、免疫系を有する生物が作り出すタンパク質であり、抗原に対して特異的に結合する機能を有することから、抗体の物質認識機能を人工的に利用することが幅広く行われている。また、一つの抗原を認識結合できる抗体としては、各種生物由来又は同一の生物種由来でも数多くのタンパク質分子が分離されている。それらのうちでも、利用価値の高い抗体は、市販されており、ある抗原に対して特異的に結合できる抗体については、多くは、市販品として入手できる。入手できない場合でも、免疫動物に対して目的抗原を免疫することにより、当業者であれば目的抗体を作製することができる。従って、固定化抗体を作製する際に、抗体の入手には、ほぼ制限がなく、入手できることから、抗体タンパク質の入手により本発明は制限を受けないことは自明である。
Component [How to obtain antibodies and monoclonal antibodies]
Since an antibody is a protein produced by an organism having an immune system and has a function of specifically binding to an antigen, the substance recognition function of the antibody is widely used artificially. Further, as an antibody capable of recognizing and binding one antigen, many protein molecules are isolated even from various organisms or the same species. Among them, antibodies with high utility value are commercially available, and many antibodies that can specifically bind to a certain antigen are commercially available. Even if it is not available, those skilled in the art can produce the target antibody by immunizing the immunized animal with the target antigen. Accordingly, when preparing an immobilized antibody, there is almost no limitation on the acquisition of the antibody, and it can be obtained. Therefore, it is obvious that the present invention is not limited by the acquisition of the antibody protein.

モノクローナル抗体は、免疫動物が作る抗体タンパク質が、複数の抗体産生細胞由来であることから、エピトープなどの抗原認識においてヘテロであることと大きく異なり、単一の抗体産生細胞由来であるから、それを暗号化する遺伝子配列が一種類であり、したがって、タンパク質配列も均一な抗体であるこという特徴を有する。モノクローナル抗体も、市販品としての入手、又は、当業者による作製が可能である。   Monoclonal antibodies differ greatly from the fact that antibody proteins produced by immunized animals are derived from multiple antibody-producing cells, and heterogeneous in antigen recognition such as epitopes, and are derived from single antibody-producing cells. There is one feature that the gene sequence to be encoded is one kind, and the protein sequence is also a uniform antibody. Monoclonal antibodies can also be obtained as commercial products or produced by those skilled in the art.

本発明は、市販品として入手可能な抗体タンパク質を、特別の処理を施すことなく、共有結合により配向を制御して担体に固定化して、利用できることを可能とする技術を提供する。また、本発明によって作製される固定化抗体においては、固定化反応に関与したリジン残基の側鎖のアミノ基又はアミノ末端のアミノ基以外のアミノ酸残基は、固定化処理によっても化学的に全く変化を受けていない、ということに、特徴を有する。従って、固定化に関与する残基が該抗体タンパク質の機能発現に関与しない場合においては、固定化により該抗体タンパク質の機能が完全に保たれることも保障されることになる。   The present invention provides a technique that enables a commercially available antibody protein to be used by controlling its orientation by covalent bonding and immobilizing it on a carrier without any special treatment. In the immobilized antibody produced by the present invention, amino acid residues other than the side chain amino group or amino terminal amino group of the lysine residue involved in the immobilization reaction can be chemically treated by immobilization treatment. It has the characteristic that it has not undergone any changes. Therefore, when a residue involved in immobilization does not participate in the functional expression of the antibody protein, it is guaranteed that the function of the antibody protein is completely maintained by immobilization.

[介在タンパク質としての抗体分子に結合能を有するタンパク質]
本発明において介在タンパク質として抗体との共有結合による配向制御固定化に利用されるタンパク質としては、すでに、本発明者らが発明している、リジン及びシステイン残基を全く含まず且つアミノ末端又はカルボキシ末端1箇所で担体と共有結合により結合した固定化タンパク質が挙げられる(特開2008-115151号公報、特開2008-115152号公報、特開2008-115153号公報、特開2008-266219号公報、特開2008-266221号公報、特開2008-280259号公報)。
[Protein having binding ability to antibody molecule as intervening protein]
In the present invention, the protein used for orientation control immobilization by covalent bond with an antibody as an intervening protein has already been invented by the present inventors and does not contain any lysine and cysteine residues and has an amino terminal or carboxy group. Examples include immobilized proteins that are covalently bonded to a carrier at one end (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-115151, Japanese Patent Laid-Open No. 2008-115152, Japanese Patent Laid-Open No. 2008-115153, Japanese Patent Laid-Open No. 2008-266219, JP 2008-266221 A, JP 2008-280259 A).

抗体分子に結合能を有するタンパク質としては、Staphylococcus aureus由来のプロテインA(A. Forsgren and J. Sjoquist, J. Immunol. (1966) 97, 822-827.に記載)、Streptococus sp. Group C/G由来のプロテインG (EP0131142A2(1983)に記載)、Preptostreptococcus magnus由来のプロテインL(US5965390(1992)に記載)、group A Streptococcus由来のプロテインH(US5180810(1993)に記載)、Haemophilus influenzae由来のプロテインD(US6025484(1990)に記載)、StreptococcusAP4由来のプロテインArp (Protein Arp 4)(US5210183(1987)に記載)、group C Streptococcus 由来のStreptococcal FcRc(US4900660(1985)に記載)、group A streptococcus, Type II strain 由来のタンパク質(US5556944(1991)に記載)、Human Colonic Mucosal Epithelial Cell由来のタンパク質(US6271362(1994)に記載)、Staphylococcus aureu , strain 8325-4由来のタンパク質(US6548639(1997)に記載)、Pseudomonas maltophilia由来のタンパク質(US5245016(1991)に記載)等が知られている。また、これらのタンパク質に関しては、多くの場合繰り返し配列を持ち、断片化したタンパク質においても抗体分子との結合能を有することが明らかにされているが、これらのタンパク質の抗体結合能を有する断片又はすべての配列を基にして、抗体結合能を保ったままで、該結合タンパク質配列中に存在するすべてのリジン残基及びシステイン残基をほかの18種類のアミノ酸残基に置換することにより、本発明に供する介在タンパク質を作製することができることは、すでに、本発明者らによる発明で公知である(特開2008-115151号公報、特開2008-115152号公報、特開2008-115153号公報、特開2008-266219号公報、特開2008-266221号公報、特開2008-280259号公報)。   Proteins having binding ability to antibody molecules include protein A derived from Staphylococcus aureus (described in A. Forsgren and J. Sjoquist, J. Immunol. (1966) 97, 822-827.), Streptococus sp. Group C / G Protein G (described in EP0131142A2 (1983)), protein L derived from Preptostreptococcus magnus (described in US5965390 (1992)), protein H derived from group A Streptococcus (described in US5180810 (1993)), protein D derived from Haemophilus influenzae (Described in US6025484 (1990)), Streptococcus AP4-derived protein Arp (Protein Arp 4) (described in US5210183 (1987)), group C Streptococcus-derived Streptococcal FcRc (described in US4900660 (1985)), group A streptococcus, Type II Protein derived from strain (described in US5556944 (1991)), protein derived from Human Colonic Mucosal Epithelial Cell (described in US6271362 (1994)), protein derived from Staphylococcus aureu, strain 8325-4 (US6548639 (1997) Wherein) wherein) and the like are known in Pseudomonas maltophilia derived protein (US5245016 (1991). In addition, regarding these proteins, in many cases, it has been clarified that a fragmented protein has a binding ability to an antibody molecule even in a fragmented protein. By replacing all lysine residues and cysteine residues present in the binding protein sequence with other 18 kinds of amino acid residues based on all sequences while maintaining the antibody binding ability, It is already known in the inventions by the present inventors that an intervening protein to be used in (JP 2008-115151, JP 2008-115152, JP 2008-115153, JP 2008-266219, JP 2008-266221, JP 2008-280259).

上記の、抗体結合タンパク質のうち、プロテインA及びプロテインGは、抗体タンパク質イムノグロブリンGのFcドメインと呼ばれる、抗原認識結合部位とは全く異なるドメインを認識し、非共有結合で結合する。また、Fcドメインには、リジン残基が複数含まれ、それらがタンパク質構造において、タンパク質表面に露出しており、リジン残基の側鎖のアミノ基を結合反応に利用できる構造をしている。   Among the antibody-binding proteins described above, protein A and protein G recognize a domain completely different from the antigen recognition and binding site called Fc domain of antibody protein immunoglobulin G, and bind noncovalently. In addition, the Fc domain includes a plurality of lysine residues, which are exposed on the protein surface in the protein structure, and have a structure in which the amino group on the side chain of the lysine residue can be used for the binding reaction.

本発明の実施例においては、介在タンパク質として、リジン残基及びシステイン残基を全く含まない改変プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインをカルボキシ末端をグリシンリンカーを介して結合した固体化タンパク質を担体として用いた例を示しているが、本発明は、介在タンパク質が改変プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインに限定されないことは自明である。   In the examples of the present invention, as an intervening protein, a solidified protein in which a modified protein A domain or modified protein G domain containing no lysine residue and cysteine residue is bound to each other via a glycine linker is used as a carrier. However, it is obvious that the present invention is not limited to the modified protein A domain or the modified protein G domain.

介在タンパク質の担体への固定化に用いるタンパク質としては、すでに本発明者らが発明している、以下に示す一般式(1)で示される配列のタンパク質を大腸菌などの生物宿主で発現精製したものを用いることができる。   As a protein used for immobilizing an intervening protein on a carrier, a protein having a sequence represented by the following general formula (1), which has already been invented by the present inventors, is expressed and purified in a biological host such as Escherichia coli. Can be used.

一般式(1) R1-R2-R3-R4-R5
[式中、配列は、アミノ末端側からカルボキシ末端側に向かう配列を示し、
R1部分の配列は、固定化対象タンパク質の配列であり、リジン残基及びシステイン残基を含まないことを特徴とする配列であり;
R2部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン及びシステイン残基以外のアミノ酸残基により構成されるスペーサー配列であり;
R3部分の配列はシステイン−X(Xは、リジン又はシステイン以外のアミノ酸残基)で表される2残基のアミノ酸で構成される配列であり;
R4部分の配列は存在しなくてもよく、存在する場合はリジン残基及びシステイン残基を含まない配列であり、一般式 R1-R2-R3-R4-R5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質全体の等電点を酸性側にし得る酸性アミノ酸残基を含むことを特徴とする配列であり;そしてR5部分の配列はタンパク質を精製するためのアフィニティータグ配列である]
General formula (1) R1-R2-R3-R4-R5
[In the formula, the sequence represents a sequence from the amino terminal side to the carboxy terminal side,
The sequence of the R1 portion is the sequence of the protein to be immobilized, and is a sequence characterized by not containing lysine residues and cysteine residues;
The sequence of the R2 moiety may not be present, and if present is a spacer sequence composed of amino acid residues other than lysine and cysteine residues;
The sequence of the R3 portion is a sequence composed of two amino acids represented by cysteine-X (X is an amino acid residue other than lysine or cysteine);
The R4 portion sequence may not be present, and if present, is a sequence that does not include lysine residues and cysteine residues, and is a protein comprising an amino acid sequence represented by the general formula R1-R2-R3-R4-R5 A sequence characterized in that it contains acidic amino acid residues that can bring the entire isoelectric point to the acidic side; and the sequence of the R5 moiety is an affinity tag sequence for purifying the protein]

このタンパク質を、シアノシステインを介した固定化反応により、アミノ基を官能基とする担体にアミド結合により末端1箇所で結合し、その後、無水酢酸で処理し、担体中の結合に関与しないアミノ基をアセチル化により、未反応のアミノ基をマスクする。このことにより、介在タンパク質のアミノ末端を含め、フリーなアミノ基が無い、固定化タンパク質担体を作製することができる。なお、アミノ基のマスク反応により、介在タンパク質のアミノ末端もアセチル化されることになる。なお、改変プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインの場合は、マスク反応によりアミノ末端をアセチル化しても抗体結合機能には何らの影響も認められなかった。   This protein is bonded to a carrier having an amino group as a functional group by an amide bond at one end by an immobilization reaction via cyanocysteine, and then treated with acetic anhydride to remove amino groups that are not involved in the binding in the carrier. To mask unreacted amino groups by acetylation. As a result, an immobilized protein carrier having no free amino group including the amino terminus of the intervening protein can be produced. The amino terminus of the intervening protein is also acetylated by the amino group mask reaction. In the case of the modified protein A domain or the modified protein G domain, even if the amino terminus was acetylated by a mask reaction, no effect on the antibody binding function was observed.

[介在タンパク質を介した抗体タンパク質の共有結合による結合]
リジン残基及びシステイン残基を全く含まない改変(変異)プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインのカルボキシ末端側1箇所で固定化したのち、マスク反応を施した固定化タンパク質を用い、これをカルボジイミドとスクシイミドで処理することにより、固定化された改変プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインのアスパラギン酸残基とグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基をスクシイミド化することができる。スクシイミド化されたカルボキシル基は、アミノ基と強い反応性を有し、反応によりアミド結合を形成する。従って、スクシイミド化した固定化担体を抗体タンパク質と混合することにより、抗体分子中のリジン残基のアミノ基又はアミノ末端のアミノ基は、改変プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインのアスパラギン酸残基とグルタミン酸残基の側鎖のスクシイミド化したカルボキシル基と反応して、アミド結合を形成することにより、共有結合で結合する。この反応は、改変プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインが、抗体分子のFcドメインと特異的に結合することから、非常に限定されたアミノ酸側鎖間で優先的に形成される。このことは、実施例において顕著に示され、抗体結合能を失った改変プロテインAドメインを用いた場合、抗体との結合反応がほとんど起こらないこと、さらに、介在タンパク質を固定化した担体と抗体タンパク質と混合した後、できるだけ速やかに、洗浄することにより、非特異的結合を避けることにより達成できる。固定化反応後、介在タンパク質中のスクシイミド化したカルボキシル基は、エタノールアミンなどで処理することによりマスクすることができる。
[Covalent binding of antibody protein via intervening protein]
After immobilization at one position on the carboxy terminal side of the modified (mutated) protein A domain or modified protein G domain containing no lysine residue and cysteine residue, an immobilized protein subjected to mask reaction was used as carbodiimide. By treatment with succinimide, the side chain carboxyl groups of the immobilized modified protein A domain or modified protein G domain of the aspartic acid and glutamic acid residues can be succinidized. The succinimidated carboxyl group has strong reactivity with the amino group, and forms an amide bond by the reaction. Therefore, by mixing the immobilization carrier succinimidized with the antibody protein, the amino group of the lysine residue or the amino group at the amino terminus in the antibody molecule becomes the aspartic acid residue of the modified protein A domain or the modified protein G domain. It binds covalently by reacting with a succinylated carboxyl group on the side chain of the glutamic acid residue to form an amide bond. This reaction is preferentially formed between very limited amino acid side chains because the modified protein A domain or the modified protein G domain specifically binds to the Fc domain of the antibody molecule. This is clearly shown in the Examples, and when the modified protein A domain that lost the antibody binding ability was used, the binding reaction with the antibody hardly occurred, and the carrier and antibody protein on which the intervening protein was immobilized This can be achieved by avoiding non-specific binding by washing as soon as possible after mixing. After the immobilization reaction, the succinimidated carboxyl group in the intervening protein can be masked by treatment with ethanolamine or the like.

本発明においては、介在タンパク質をスクシイミド化した後、抗体タンパク質を加え、固定化反応を起こさせることから、この固定化反応において、抗体タンパク質は、結合反応によりアミド結合を形成したリジン残基以外の側鎖のアミノ酸残基は、化学的に全く変化しない。   In the present invention, after interstitial protein is succinimidated, an antibody protein is added to cause an immobilization reaction. In this immobilization reaction, the antibody protein has a ligation other than a lysine residue that has formed an amide bond. Side chain amino acid residues are not chemically altered at all.

この反応により、固定化された抗体タンパク質は、介在タンパク質である改変プロテインAドメインと抗体のFcドメインとアミド結合で共有結合、すなわち、配向が制御された形態で、固定化されており、抗体タンパク質そのものの抗原認識結合機能は完全に保たれている。また、介在タンパク質そのものも、共有結合で且つ配向が制御された形で固定化されていることから、抗体タンパク質が共有結合で且つ配向が制御された形で固定化した固定化タンパク質が形成されたことになる。このような、形態での固定化タンパク質が、全く新規な物質であることは、従来の方法を駆使しても、固定化反応を制御することが困難であり、本発明以前には作製が不可能であったことなどを考慮すると自明である。従って、本発明は、共有結合で配向が制御された形固定化されたタンパク質の製造方法を提供するだけでなく、物質としても全く新規な物質を提供するものであり、発明の権利が、物質に及ぶことは明白である。   By this reaction, the immobilized antibody protein is immobilized in a form in which the modified protein A domain, which is an intervening protein, and the Fc domain of the antibody are covalently bonded by an amide bond, that is, in a controlled orientation. Its own antigen recognition / binding function is completely maintained. In addition, since the intervening protein itself is immobilized in a covalent bond and controlled orientation, an immobilized protein in which the antibody protein is immobilized in a covalent bond and controlled orientation was formed. It will be. The fact that the immobilized protein in such a form is a completely new substance is that it is difficult to control the immobilization reaction even if the conventional method is used, and it is difficult to prepare it before the present invention. It is self-evident when considering what was possible. Accordingly, the present invention not only provides a method for producing a protein having a fixed shape whose orientation is controlled by a covalent bond, but also provides a completely new substance as a substance. It is obvious that

[介在タンパク質を固定化するための担体]
本発明に用いられる担体としては、タンパク質分子より大きければどのようなものでもよく、可溶性又は不溶性のいずれでもよい。
[Carrier for immobilizing intervening protein]
The carrier used in the present invention may be any carrier as long as it is larger than the protein molecule, and may be either soluble or insoluble.

介在タンパク質は、担体に、介在タンパク質のカルボキシ末端を担体の表面にアミド結合を介して共有結合により固定化することができる。また、介在タンパク質のアミノ末端を担体の表面に共有結合により固定化することができる。すなわち、介在タンパク質を担体の表面にアミノ酸のαアミノ基を介して共有結合により固定化することができる。   The intervening protein can be immobilized on the carrier by covalent bonding of the carboxy terminus of the intervening protein to the surface of the carrier via an amide bond. In addition, the amino terminus of the intervening protein can be immobilized on the surface of the carrier by covalent bonding. That is, the intervening protein can be immobilized on the surface of the carrier by a covalent bond via the α-amino group of the amino acid.

介在タンパク質をカルボキシ末端側で配向を制御して固定化する担体としては、官能基としてアミノ基(R−NH)が導入されていることが必要である。可溶性の担体としては、アミノ基ポリマーとしての、ポリアリルアミン、ポリリジンなどのアミノ基ポリマーやそれらとの共重合体などがあげられる。 An amino group (R—NH 2 ) must be introduced as a functional group as a carrier for immobilizing the intervening protein by controlling the orientation on the carboxy terminal side. Examples of the soluble carrier include amino group polymers such as polyallylamine and polylysine as amino group polymers, and copolymers thereof.

不溶性の担体としては、クロマトフラフィーに利用し得る担体を用いることができる。また、粒子状の担体、モノリスタイプの担体、膜状の担体、繊維状の担体、ホロファイバー状の担体、板状やシート状の基板、磁気ビーズ等タンパク質を固定化し得る不溶性のものならば、いずれも含まれる。「固定化担体」は、「固定化基板」を含む。このような形状の担体を形成する素材としては、表面に介在タンパク質を配向制御固定化するための官能基が導入されているものならどのようなものでもよくポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメタクリエート、ポリビニルアルコールに代表されるプラスチックスやハイドロゲル、アガロース、デキストラン、セルロース、キトサンなどに代表される天然素材、シリカ、ガラス、セラミックなどに代表される無機素材、さらには、金、アルミナ、銀などに代表される金属素材など幅広く利用可能である。さらに、ミクロ流路も担体として利用することができる。ここで、ミクロ流路とは、フローチャンネルセルやガラス基板上にミクロンオーダーの高精度の流路を形成したマイクロチップ等をいい、流路内のガラス上にタンパク質を固定化すればよい。   As the insoluble carrier, a carrier that can be used for chromatography can be used. In addition, particulate carriers, monolith type carriers, membrane carriers, fibrous carriers, holofiber carriers, plate-like or sheet-like substrates, magnetic beads, and the like that can immobilize proteins, Both are included. “Immobilization carrier” includes “immobilization substrate”. As a material for forming the carrier having such a shape, any material having a functional group for orientation-immobilizing and immobilizing the intervening protein on the surface may be used, such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polymethacrylate, Plastics such as polyvinyl alcohol, hydrogels, agarose, dextran, cellulose, natural materials such as chitosan, inorganic materials such as silica, glass, ceramics, gold, alumina, silver, etc. It can be used in a wide range of metal materials. Furthermore, a microchannel can also be used as a carrier. Here, the microchannel refers to a microchip or the like in which a micron-order high-precision channel is formed on a flow channel cell or a glass substrate, and the protein may be immobilized on the glass in the channel.

ここで、官能基を導入した市販の担体としては、アミノ−セルロファイン(生化学工業で販売)、AF-アミノトヨパール(TOSOHで販売)、EAH-セファロース4B及びリジン-セファロース4B(アマシャムバイオサイエンスで販売)、ポラス20NH(ベーリンガーマンハイムで販売)、CNBr活性化セファロースFF、NHS活性化セファロースFF、などがある。また、1級アミノ基を有するシラン化合物(例えば、3−アミノプロピルメトキシシランなど)を用いて、シリカ担体、ガラスビーズ又はガラス平板などにアミノ基などの官能基を導入することは当業者であれば容易にできる。   Here, as a commercially available carrier into which a functional group is introduced, amino-cellulofine (sold by Seikagaku), AF-aminotoyopearl (sold by TOSOH), EAH-sepharose 4B and lysine-sepharose 4B (Amersham Bioscience) Porous 20NH (sold at Boehringer Mannheim), CNBr activated Sepharose FF, NHS activated Sepharose FF, etc. Further, those skilled in the art can introduce a functional group such as an amino group into a silica carrier, glass beads, or glass flat plate using a silane compound having a primary amino group (for example, 3-aminopropylmethoxysilane). If you can.

なお、これらの活性化法では強アルカリ性試薬や劇薬を使用するものもあるが、これは固体・半固体側単独で活性化を行う際に使用するもので、活性化が終了した後に穏和な条件でタンパク質が導入されるために問題は生じない。   Some of these activation methods use strong alkaline reagents or powerful drugs, but this is used when activating on the solid or semi-solid side alone. In this case, no problem occurs because the protein is introduced.

本発明は、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質が共有結合により結合した担体であって、該介在タンパク質のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基がスクシイミド化されている担体をも含む。該担体を本発明では、固定化タンパク質作製用活性化担体といい、該活性化担体に目的タンパク質を配向制御した状態で固定化することができる。   The present invention also includes a carrier in which an intervening protein not containing lysine and cysteine is bound by a covalent bond, and a carrier in which the carboxyl group of the side chain of the aspartic acid or glutamic acid residue of the intervening protein is succinimidated. Including. In the present invention, the carrier is referred to as an activated carrier for preparing an immobilized protein, and the target protein can be immobilized on the activated carrier in a state in which the target protein is orientation-controlled.

本発明の汎用性・一般性
上記のように、抗体分子を固定化した固定化タンパク質を例に本発明を詳細に説明したが、上述のように、固定化目的タンパク質と介在タンパク質との組み合わせは無限にあり、リジン及びシステインを全く含まない介在タンパク質は、当業者であれば創製できることは自明であることから、本発明の固定化タンパク質は、対象となるタンパク質によって制限を受けず、どのようなタンパク質も適用が可能である。例えば、目的タンパク質として、Affibody(登録商標) Moleculeなる一群の小タンパク質が開発、販売されており、各々の小タンパク質はそれぞれ特異的にある目的タンパク質だけと結合することが公知である。Affibody(登録商標) Moleculeは、Staphylococcus aureus由来のプロテインAのBドメイン由来のタンパク質の配列を改変する事により創製されているが、その配列中には、リジン残基が含まれているが、元の機能を保ったままリジン残基部分を他のアミノ酸に変換することは、本発明者らがStaphylococcus aureus由来のプロテインAのAドメインを用いてすでに示しているように、当事者であれば達成できる(特開2008-115151号公報、特開2008-115152号公報、特開2008-115153号公報、特開2008-266219号公報、特開2008-266221号公報、特開2008-280259号公報)。従って、本発明の技術は、対象とするタンパク質によって制限を受けないことは明らかであり、一般性が保たれる。
Generality and generality of the present invention As described above, the present invention has been described in detail by taking an example of an immobilized protein in which an antibody molecule is immobilized. As described above, the combination of an immobilized target protein and an intervening protein is Since it is obvious that a person skilled in the art can create an intervening protein that is infinite and does not contain lysine and cysteine, the immobilized protein of the present invention is not limited by the target protein. Proteins are also applicable. For example, a group of small proteins called Affibody (registered trademark) Molecule has been developed and sold as target proteins, and it is known that each small protein specifically binds only to a certain target protein. Affibody (registered trademark) Molecule was created by modifying the protein sequence derived from the B domain of protein A derived from Staphylococcus aureus, but the sequence contains a lysine residue. The lysine residue portion can be converted to other amino acids while maintaining the function of the protein, as can be achieved by the parties, as already shown by the inventors using the A domain of protein A derived from Staphylococcus aureus. (JP 2008-115151, JP 2008-115152, 2008-115153, 2008-266219, 2008-266221, 2008-280259). Therefore, it is clear that the technique of the present invention is not limited by the target protein, and generality is maintained.

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。   The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

1.材料
ヒトポリクローナル抗体は、市販品を用いた。抗IL8ヒト型モノクローナル抗体は、CHO細胞としてATCCCRL-12445株を培養し、培養上清から精製したものを用いた。ヒトモノクローナル抗体、アバスチン、ハーセプチン、リツキサンは、医薬品として販売されているものを用いた。
1. Materials Commercially available products were used as human polyclonal antibodies. The anti-IL8 human monoclonal antibody used was cultured from the ATCCCRL-12445 strain as CHO cells and purified from the culture supernatant. As human monoclonal antibodies, Avastin, Herceptin, Rituxan, those sold as pharmaceuticals were used.

リガンドタンパク質としては、改変プロテインA用としては、配列番号1に示すタンパク質を、改変プロテインGとしては、配列番号2に示すタンパク質を用い、これを、シアノシステインを介して配向制御固定化反応により固定化して得られたものを用いた。なお、このリガンド固定化反応による固定化により、介在配列としては、リジン残基及びシステイン残基を全く含まない改変プロテインAドメイン(配列番号3)又はリジン残基及びシステイン残基を全く含まない改変プロテインGドメイン(配列番号4)がC末端側を介して担体基材と固定化された形で介在タンパク質の役割を果たす。   For the modified protein A, the protein shown in SEQ ID NO: 1 is used as the ligand protein, and the protein shown in SEQ ID NO: 2 is used as the modified protein G, and this is immobilized by orientation control immobilization reaction via cyanocysteine. What was obtained by forming was used. As a result of the immobilization by the ligand immobilization reaction, the intervening sequence is a modified protein A domain (SEQ ID NO: 3) that does not contain any lysine residues and cysteine residues, or a modification that does not contain any lysine residues and cysteine residues. The protein G domain (SEQ ID NO: 4) plays the role of intervening protein in a form immobilized on the carrier substrate via the C-terminal side.

担体基材としては、アミノ基を担体基材表面に有する物であり、シリカモノリス基材は、京都モノテック社より好意により提供されたもの、シリカビーズ担体としては、AGCエスアイテック社より好意により提供されたものである。また、アミノセルロファイン、AF−アミノトヨパールは、市販品をそのまま用いた。   The carrier substrate has an amino group on the surface of the carrier substrate. The silica monolith substrate was provided by courtesy of Kyoto Monotech Co., and the silica bead carrier was courtesy of AGC S-Tech Co., Ltd. It has been provided. Aminocellulofine and AF-aminotoyopearl were used as they were on the market.

アミノ基を担体基材表面に有する担体基材へのリジン残基及びシステイン残基を全く含まない改変プロテインAドメイン又はプロテインGの固定化は、本発明者らが開示している公知の方法(前述)により行い、固定化反応後担体表面上の余分なアミノ基を無水酢酸で処理することにより、ブロッキング処理を行った。このようにして得られたものを、介在タンパク質を導入した担体として用いた。   Immobilization of a modified protein A domain or protein G that does not contain any lysine residue and cysteine residue on a carrier substrate having an amino group on the surface of the carrier substrate is a known method disclosed by the present inventors ( As described above, after the immobilization reaction, an excess amino group on the support surface was treated with acetic anhydride to perform a blocking treatment. The product thus obtained was used as a carrier into which an intervening protein was introduced.

2.抗体の固定化反応及び固定化効率の測定方法
介在タンパク質を導入した担体約0.1mLをスピンカラムに入れ、10mMのホウ酸緩衝液、pH8.5、0.4mLを加え、3000回転2分の遠心操作を行い、緩衝液をカラムに通し、担体を含んだカラムの洗浄工程とした。カラムから溶出される緩衝液は、1.5mLのエッペンドルフタイプの遠心チューブで受けた。溶出された緩衝液を廃棄し、スピンカラムに再度ホウ酸緩衝液を加え、同じように遠心工程を行い、この工程を3回繰り返すことにより、担体の洗浄を行った。
2. Antibody Immobilization Reaction and Immobilization Efficiency Measurement Method About 0.1 mL of a carrier into which an intervening protein has been introduced is placed in a spin column, 10 mM borate buffer, pH 8.5, 0.4 mL is added, and 3000 rpm is 2 minutes. Centrifugation was performed, the buffer solution was passed through the column, and the column was washed with the carrier. The buffer eluted from the column was received in a 1.5 mL Eppendorf type centrifuge tube. The eluted buffer solution was discarded, the borate buffer solution was added again to the spin column, the centrifugation step was performed in the same manner, and this step was repeated three times to wash the carrier.

次に、担体に固定化されている改変プロテインAドメイン又は改変プロテインGドメインのカルボキシル基の活性化として、50mMのN-ヒヒドロキシスクシイミド(以下、NHS)と200mMの1エチル−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(以下、EDC)溶液(以下、NHS/EDC溶液)を用いた。0.4mLのNHS/EDC溶液をスピンカラムに添加し、3000回転2分の遠心操作を行い、溶出された溶液を捨てたのち、この操作を2回繰り返した後、0.8mLのNHS/EDC溶液を加え、担体を浸した。この状態で、室温中で、2時間放置した後、3000回転2分により、NHS/EDC溶液を溶出、廃棄した。このようにして得られた担体を活性化担体と称する。   Next, as activation of the carboxyl group of the modified protein A domain or the modified protein G domain immobilized on the carrier, 50 mM N-hyhydroxysuccinimide (hereinafter NHS) and 200 mM 1 ethyl- (3- A dimethylaminopropyl) carbodiimide (hereinafter, EDC) solution (hereinafter, NHS / EDC solution) was used. Add 0.4 mL of NHS / EDC solution to the spin column, perform centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes, discard the eluted solution, repeat this operation twice, and then add 0.8 mL of NHS / EDC. The solution was added and the carrier was immersed. In this state, after standing at room temperature for 2 hours, the NHS / EDC solution was eluted and discarded at 3000 rpm for 2 minutes. The carrier thus obtained is referred to as an activated carrier.

固定化対象とする抗体を10mMのホウ酸緩衝液、pH8.5に溶かし、最終濃度、0.1から1.0mgになるようにした。タンパク質濃度は、BCA法により測定し、牛血清アルブミン換算として求めた。   The antibody to be immobilized was dissolved in 10 mM borate buffer, pH 8.5 to a final concentration of 0.1 to 1.0 mg. The protein concentration was measured by the BCA method and determined as bovine serum albumin equivalent.

固定化対象とする抗体溶液0.4mLを添加し、添加攪拌後、速やかに3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した(吸着工程と称する)。この操作を2回行った(非吸着タンパク量と称する)。   0.4 mL of the antibody solution to be immobilized was added, and after the addition and stirring, the solution was quickly separated by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes (referred to as an adsorption step). This operation was performed twice (referred to as the amount of non-adsorbed protein).

分離した溶液を集め、溶液中のタンパク質量を測定した。遠心分離後の担体に、10mMのホウ酸緩衝液、pH8.5、0.4mLを添加攪拌後、速やかに3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した(この操作を、洗浄工程1と称する)。洗浄工程を2回行い、その後、0.4mLの同緩衝液を添加攪拌後、室温で、一晩放置し、抗体の固定化反応を行わせた。   The separated solution was collected and the amount of protein in the solution was measured. To the carrier after centrifugation, 10 mM borate buffer, pH 8.5, 0.4 mL was added and stirred, and then the solution was quickly separated by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes. Called). The washing step was performed twice, and then 0.4 mL of the same buffer solution was added and stirred, and then allowed to stand overnight at room temperature to cause the antibody immobilization reaction.

反応終了後、3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した。洗浄工程により得られた溶液と、本操作により得られた溶液を集め、溶液中のタンパク質量を測定した。   After completion of the reaction, the solution was separated by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes. The solution obtained by the washing step and the solution obtained by this operation were collected, and the amount of protein in the solution was measured.

反応終了後の担体に、0.1Mグリシン緩衝液、pH2.5,0.4mLを添加攪拌後、速やかに3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した(この操作を、洗浄工程2と称する)。洗浄工程2を3回行い、得られた溶液を回収し、溶液中のタンパク質量を測定した。   After the completion of the reaction, 0.1 M glycine buffer solution, pH 2.5, 0.4 mL was added to the support and stirred, and then the solution was quickly separated by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes (this operation was combined with washing step 2). Called). Washing step 2 was performed three times, the resulting solution was recovered, and the amount of protein in the solution was measured.

この操作により得られた担体に、1Mエタノールアミン塩酸塩,pH8.5,0.4mLを添加攪拌後、速やかに3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した(この操作を、ブロッキング操作と称する。)。ブロッキング操作を2回行い、その後、0.4mLの同溶液を添加攪拌後、室温で、一晩放置し、抗体の固定化反応を行わせた。反応終了後、3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した。洗浄工程により得られた溶液と、本操作により得られた溶液を集め、溶液中のタンパク質量を測定した(ブロッキング工程)。   After adding 1M ethanolamine hydrochloride, pH 8.5, 0.4 mL to the carrier obtained by this operation and stirring, the solution was quickly separated by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes (this operation was called blocking operation). Called). The blocking operation was performed twice, and then 0.4 mL of the same solution was added and stirred, and then allowed to stand overnight at room temperature to cause the antibody immobilization reaction. After completion of the reaction, the solution was separated by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes. The solution obtained by the washing step and the solution obtained by this operation were collected, and the amount of protein in the solution was measured (blocking step).

以上の操作により、得られた各種溶液のタンパク質量を求め、その総和として、非吸着タンパク質+洗浄工程1+洗浄工程2+ブロッキング工程(非結合タンパク質総量)を求め、担体に添加した抗体の総タンパク質量(吸着工程に用いた総タンパク質量=タンパク質濃度×1.2mL)から引くことにより、固定化された抗体のタンパク質量を求めた。   By the above operation, the protein amount of each of the various solutions obtained is obtained, and the total amount of the antibody added to the carrier is obtained by obtaining non-adsorbed protein + washing step 1 + washing step 2 + blocking step (total amount of non-binding protein) as the sum total. By subtracting from (total protein amount used in the adsorption step = protein concentration × 1.2 mL), the protein amount of the immobilized antibody was determined.

3.モノリス担体を用いた結果
モノリス担体に改変プロテインA又は改変プロテインGを導入した担体を用いた場合の経過をまず詳細に示す。
3. Results using monolithic carrier The course of using a carrier in which modified protein A or modified protein G is introduced into the monolithic carrier is first shown in detail.

固定化対象となる抗体として、抗ヒトIL8ヒト型抗体を用いた。   An anti-human IL8 human antibody was used as an antibody to be immobilized.

抗体濃度:0.34mg/mL
アプライした抗体タンパク質総量 (これを、Aとする。): 0.34mg×0.8mL=0.272mg
非吸着タンパク質総量:
改変プロテインA担体: 0mg
改変プロテインG担体: 0mg
洗浄工程1溶出タンパク質:
改変プロテインA担体: 0.008mg
改変プロテインG担体: 0.068mg
洗浄工程2溶出タンパク質:
改変プロテインA担体: 0.072mg
改変プロテインG担体: 0.024mg
ブロッキング工程溶出タンパク質:
改変プロテインA担体: 0mg
改変プロテインG担体: 0mg
非固定化タンパク質総量 (これを、Uとする。)
改変プロテインA担体: 0.080mg
改変プロテインG担体: 0.092mg
固定化タンパク質総量 (これを、Bとする。)
改変プロテインA担体: 0.192mg
改変プロテインG担体: 0.180mg
Antibody concentration: 0.34 mg / mL
Total amount of applied antibody protein (hereinafter referred to as A): 0.34 mg × 0.8 mL = 0.272 mg
Total non-adsorbed protein:
Modified protein A carrier: 0 mg
Modified protein G carrier: 0 mg
Washing step 1 eluted protein:
Modified protein A carrier: 0.008 mg
Modified protein G carrier: 0.068 mg
Washing step 2 eluted protein:
Modified protein A carrier: 0.072 mg
Modified protein G carrier: 0.024 mg
Blocking process eluted protein:
Modified protein A carrier: 0 mg
Modified protein G carrier: 0 mg
Total amount of non-immobilized protein (hereinafter referred to as U)
Modified protein A carrier: 0.080 mg
Modified protein G carrier: 0.092 mg
Total amount of immobilized protein (hereinafter referred to as B)
Modified protein A carrier: 0.192 mg
Modified protein G carrier: 0.180 mg

この結果、固定化効率は、
固定化効率=100×(固定化タンパク質総量(B))/(アプライした抗体タンパク質総量(A)−非吸着タンパク質総量(U))
で計算されることから、
固定化効率 (E=100×B/(A−U)の計算式)
改変プロテインA担体: 約71%
改変プロテインG担体: 約66%
という結果であった。
As a result, the immobilization efficiency is
Immobilization efficiency = 100 × (total amount of immobilized protein (B)) / (total amount of applied antibody protein (A) −total amount of non-adsorbed protein (U))
Is calculated from
Immobilization efficiency (E = 100 × B / (A−U) calculation formula)
Modified protein A carrier: about 71%
Modified protein G carrier: about 66%
It was the result.

4.その他の担体を用いた結果
上記と同様にして、担体基材、介在タンパク質、抗体の組み合わせを変えて各種実験を行った。抗体の固定化量の測定は、介在タンパク質を固定化した担体を0.4mL(スピンカラムの場合は、そのまま)、アプライする抗体タンパク質総量を約0.4mgとして行った。表1は、その結果をまとめたものであり、固定化されたタンパク質の総量(B)と、固定化効率(E)をまとめて示している。本測定においては、介在タンパク質の固定化量を最適化していないのと、その固定化量を測定していないが、介在タンパク質が同じ場合、固定化効率にばらつきが少ないため、固定化される抗体タンパク質の総量は、介在タンパク質の量に依存することが明らかである。
4). Results Using Other Carriers Various experiments were carried out in the same manner as described above, changing the combination of carrier substrate, intervening protein, and antibody. Measurement of the amount of antibody immobilized was carried out with 0.4 mL of the carrier on which the intervening protein was immobilized (as is in the case of a spin column) and the total amount of antibody protein to be applied was about 0.4 mg. Table 1 summarizes the results, and collectively shows the total amount (B) of the immobilized protein and the immobilization efficiency (E). In this measurement, the amount of immobilization of the intervening protein is not optimized, and the amount of immobilization is not measured. It is clear that the total amount of protein depends on the amount of intervening protein.

Figure 0005392683
表1 介在タンパク質をあらかじめ固定化した各種担体を用いた時の各種抗体タンパク質の固定化量と固定化効率のまとめ
Figure 0005392683
Table 1 Summary of immobilization amount and immobilization efficiency of various antibody proteins when using various carriers in which intervening proteins are immobilized in advance

5.固定化抗体を用いた抗原の回収
上記3で得られたヒト抗IL8ヒト型抗体を固定化したスピンカラムを用いて、市販品として売られているヒトIL8ペプチドを用いて、結合溶出実験を行った。
5. Recovery of antigen using immobilized antibody Using the spin column on which the human anti-IL8 human antibody obtained in 3 above is immobilized, a binding elution experiment was conducted using a commercially available human IL8 peptide. It was.

ヒトIL8ペプチドを0.1Mのリン酸緩衝液、pH7.4に溶かし、最終濃度、0.1mgになるようにした。タンパク質濃度は、BCA法により測定し、牛血清アルブミン換算として求めた。   Human IL8 peptide was dissolved in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, to a final concentration of 0.1 mg. The protein concentration was measured by the BCA method and determined as bovine serum albumin equivalent.

ペプチド溶液0.4mLを添加し、添加攪拌後、速やかに3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した(吸着工程と称する)。この操作を2回行った。分離した溶液を集め、溶液中のタンパク質量を測定した(非吸着ペプチド量と称する)。   0.4 mL of peptide solution was added, and after the addition and stirring, the solution was quickly separated by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes (referred to as an adsorption step). This operation was performed twice. The separated solution was collected, and the amount of protein in the solution was measured (referred to as the amount of non-adsorbed peptide).

遠心分離後の担体に、0.5MのNaClを含む0.1Mのリン酸緩衝液、pH7.4、0.4mLを添加攪拌後、速やかに3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した(この操作を、洗浄工程と称する)。洗浄工程を3回行った。分離した溶液を集め、溶液中のタンパク質量を測定した。   To the carrier after centrifugation, 0.1 M phosphate buffer solution containing 0.5 M NaCl, pH 7.4, 0.4 mL was added and stirred, and then the solution was quickly separated by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes. (This operation is called a washing step). The washing process was performed 3 times. The separated solution was collected and the amount of protein in the solution was measured.

次に、0.1Mグリシン緩衝液、pH2.5,0.4mLを添加攪拌後、3000回転2分の遠心操作により、溶液を分離した(この操作を、溶出工程と称する)。溶出工程3回行い、得られた溶液を回収し、溶液中のタンパク質量を測定した。   Next, 0.1 M glycine buffer, pH 2.5, 0.4 mL was added and stirred, and then the solution was separated by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes (this operation is referred to as an elution step). The elution process was performed 3 times, and the resulting solution was recovered and the amount of protein in the solution was measured.

その結果
アプライしたペプチド総量: 0.1mg×0.8mL=0.08mg
非吸着ペプチド総量: 0.002
洗浄工程溶出ペプチド総量:0mg
溶出工程タンパク質総量:0.074mg
吸着効率=100×(アプライしたペプチド総量−非吸着IL8ペプチド総量)/アプライしたIL8ペプチド総量=約98%
溶出回収効率=100×溶出工程タンパク質総量/アプライしたペプチド総量=約93%
という結果であった。
The total amount of peptide applied as a result: 0.1 mg × 0.8 mL = 0.08 mg
Total amount of non-adsorbed peptide: 0.002
Total amount of peptide eluted in washing process: 0 mg
Elution process total protein: 0.074mg
Adsorption efficiency = 100 × (total amount of applied peptide−total amount of non-adsorbed IL8 peptide) / total amount of applied IL8 peptide = about 98%
Elution recovery efficiency = 100 × elution step total protein / applied total peptide = approximately 93%
It was the result.

本発明の固定化タンパク質は、固定化タンパク質が関わる幅広い技術分野、例えば、タンパク質の配向制御固定化、アフィニティ分析、アフィニティ分離、クロマトグラフィー用担体、イムノアフィニティ担体、タンパク質センサー、タンパク質アレイ、タンパク質チップ、マイクロタス、抗体アレイ、タンパク質の除去方法、成分検査、臨床検査等に利用することができる。   The immobilized protein of the present invention has a wide range of technical fields related to the immobilized protein, such as protein orientation control immobilization, affinity analysis, affinity separation, chromatographic carrier, immunoaffinity carrier, protein sensor, protein array, protein chip, It can be used for microtuses, antibody arrays, protein removal methods, component tests, clinical tests, and the like.

1 担体(固定化基板)
2 介在タンパク質
3 固定化タンパク質(目的タンパク質)
4 固定化タンパク質の固定化部位(ドメイン)
5 固定化タンパク質の機能発現部位(ドメイン)
6 共有結合
7 架橋試薬による結合・修飾
1 Carrier (immobilized substrate)
2 Intervening protein 3 Immobilized protein (target protein)
4 Immobilization site (domain) of immobilized protein
5 Functional expression site (domain) of immobilized protein
6 Covalent bond 7 Binding / modification with crosslinking reagent

配列番号1〜4 合成 SEQ ID NOs: 1-4 synthesis

Claims (3)

プロテインA、プロテインG及びプロテインLからなる群から選択されるタンパク質由来の抗体結合ドメインの改変タンパク質であり、リジン残基及びシステイン残基を含まない改変タンパク質である介在タンパク質を介して目的の抗体を固定化するための、介在タンパク質と担体を含む、固定化抗体作製用活性化担体であって、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質が、該タンパク質のカルボキシ末端を介して、共有結合により結合しており、該タンパク質のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基がスクシイミド化されている、介在タンパク質のスクシンイミド化したアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基にアミド結合を介して抗体を結合させるための固定化抗体作製用活性化担体。 A modified protein of an antibody binding domain derived from a protein selected from the group consisting of protein A, protein G, and protein L, and the target antibody is passed through an intervening protein that is a modified protein that does not contain lysine residues and cysteine residues. An immobilized carrier for producing an immobilized antibody comprising an intercalation protein and a carrier for immobilization, wherein the intervening protein not containing lysine and cysteine is covalently bound via the carboxy terminus of the protein. The side chain carboxyl group of the aspartic acid or glutamic acid residue of the protein is succinimidated, and an amide bond is attached to the side chain carboxyl group of the succinimidated aspartic acid or glutamic acid residue of the intervening protein. immobilized antibody for the production for binding antibody via Sex of the carrier. プロテインA、プロテインG及びプロテインLからなる群から選択されるタンパク質由来の抗体結合ドメインの改変タンパク質であり、リジン残基及びシステイン残基を含まない改変タンパク質である介在タンパク質を介して目的の抗体を固定化するための、介在タンパク質と担体を含む、固定化抗体作製用活性化担体であって、リジン及びシステインを含まない介在タンパク質が、該タンパク質のアミノ末端を介して、共有結合により結合しており、該タンパク質のアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基がスクシイミド化されている、介在タンパク質のスクシンイミド化したアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基にアミド結合を介して抗体を結合させるための固定化抗体作製用活性化担体。 A modified protein of an antibody binding domain derived from a protein selected from the group consisting of protein A, protein G, and protein L, and the target antibody is passed through an intervening protein that is a modified protein that does not contain lysine residues and cysteine residues. An activated carrier for preparing an immobilized antibody comprising an intervening protein and a carrier for immobilization, wherein the intervening protein not containing lysine and cysteine is covalently bound via the amino terminus of the protein. The side chain carboxyl group of the aspartic acid or glutamic acid residue of the protein is succinimidated, and an amide bond is attached to the side chain carboxyl group of the succinimidated aspartic acid or glutamic acid residue of the intervening protein. immobilized antibody fabrication activity for binding antibody via Carrier. 担体が不溶性担体である、請求項1又は2に記載の固定化抗体作製用活性化担体。 The activated carrier for preparing an immobilized antibody according to claim 1 or 2, wherein the carrier is an insoluble carrier.
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