JP5371017B2 - 子宮頚部腺癌の診断又は子宮頸癌の予後の診断のためのマーカー - Google Patents
子宮頚部腺癌の診断又は子宮頸癌の予後の診断のためのマーカー Download PDFInfo
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Description
本発明は、子宮頚部腺癌の診断又は子宮頸癌の予後の診断のためのマーカーとしてのVillin1に対する抗体の使用に関する。
子宮頚癌は、子宮癌の１種であり、女性の悪性腫瘍の中で２番目に多い疾患である（非特許文献１）。子宮頚癌は、子宮頚部扁平上皮癌と、子宮頚部腺癌に分類され、子宮頚部腺癌は、腺様分化を伴う子宮頚部癌であり、腺上皮を母細胞とする純粋な腺癌の他、腺扁平上皮癌を含み、総てのタイプの上皮に由来し得る（非特許文献１）。子宮頚部腺扁平上皮癌は、腺上皮を母細胞とする癌細胞と扁平上皮を母細胞とする癌細胞から成る子宮頚部腺癌であり、全子宮頚癌の5〜10％を占める（非特許文献２）。
子宮頚癌は、2000年の全世界での患者数は470,600人であり、233,400人が死に至っている（非特許文献３）。子宮頚癌全体の罹患率及び死亡率は過去30年に亘り大幅に下降しているが、この罹患率の減少は近年停滞傾向を示しており、子宮頚部腺癌の患者数がゆっくりと増加してきている（非特許文献４）。
子宮頚癌の診断のための検査としては、細胞診検査、各種腫瘍マーカーについての血液検査、組織生検、画像検査等が行われており、中でも、パパニコロー染色によるスメアスクリーニングと、ヒトパピローマウイルス検査が広く行われている（例えば、非特許文献５及び６〜１５参照）。
パパニコロー染色によるスメアスクリーニング検査は子宮頚部扁平上皮癌では非常に有効である。しかし、子宮頚部腺癌では偽陰性となり、子宮頚部腺癌の指標とはならない（例えば、非特許文献５参照）。このため、子宮頚部腺癌の検査には不適切である。
また、子宮頚部の腺癌は、初期の子宮内膜腺癌と組織学的外観が類似しており、子宮頚部腺癌の多くのサブタイプは子宮内膜分化を示す。この類似の組織学的外観のために、従来の組織生検では、腫瘍の原発組織が不明瞭な場合には子宮内膜腺癌と子宮頚部腺癌を区別することは困難であった（非特許文献１参照）。
免疫組織化学染色を用いた子宮頚部腺癌を含む癌のバイオマーカーの候補として、MIB1、bcl-2、p16INK4a、CEA、ER、vimentin及びp53が検討されている（例えば、非特許文献６〜１１参照）。
p16INK4aについては、局所的な子宮頚部腺癌や侵襲的な子宮頚部腺癌で染まるが、扁平上皮の異形成や扁平上皮癌などでも染まり、子宮頚部腺癌に対する特異性について疑問がある、とする報告がある（非特許文献８）。実際、後述する通り、本発明者の検討結果によれば、p16INK4aは、子宮頚部扁平上皮癌に対しては特異性が高いものの、子宮頚部腺癌に対しては、特異性は不十分である。なお、p16INK4aの免疫組織化学染色はHPV感染の間接的な解析にも使われている（非特許文献１０）。
SCC 抗原、CYFRA21-1及びCA125などは、臨床上、婦人科腫瘍一般の治療後の経過をモニターするためのマーカーとして血清検査で用いられているが、治療前の子宮頚部腺癌の診断マーカーとしては用いられていない（非特許文献１１）。
癌性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染は子宮頚癌の原因と考えられており、６型、１１型、１６型、１８型、５２型及び５８型を含む多くの型で子宮頚癌との関連性を示す報告がある（非特許文献１２等）。また、子宮頚部扁平上皮癌は、子宮頚部腺癌と比べ、癌性ＨＰＶのタイプに明らかな違いが見られ、欧米諸国では、タイプ16と18のＨＰＶが、ウイルス誘発性子宮頚部腺癌の92％で感染し、特にタイプ18のＨＰＶの感染が多く見られたとの報告がなされている（非特許文献１）。ＨＰＶのタイプを決定する点での有用性から、最近では、HPVの遺伝子型を同定する24-plex PathogenMip（非特許文献１３）や多数のHPVのタイプを同定できるHPVリニアアレイ法（非特許文献１４）がハイスループットの解析方法として開発されている。
もっとも、後述する本発明者の検討結果によれば、ＨＰＶ感染は、子宮頚部扁平上皮癌に比べ子宮頚部腺癌との相関性は低く、ＨＰＶ感染検査は、子宮頚部腺癌のスクリーニング方法として、特異性の点で十分ではない。
上記治療前診断に加え、子宮頸癌、特に子宮頚部腺癌では、癌病変の予後を予測する診断方法に対する要求がある（非特許文献１）。
これに関し、幾つかの研究では初期の子宮頚部腺癌が子宮頚部扁平上皮癌よりも予後が不良であることを提案している（非特許文献１６）。また、組織学的分類が、子宮頚癌患者の生存率と関連しており、子宮頚癌患者の予後診断と成り得るとする報告がある（非特許文献１７）。また、ＨＰＶ感染が、子宮頚癌の重症度に関する重要な指標に成り得るとする報告（非特許文献１８）や、子宮頚癌の患者の中でも、ＨＰＶ感染陰性患者の方が、ＨＰＶ感染陽性患者より、有意に生存期間が短いという報告もある（非特許文献１９）。更に、純粋な子宮頚部腺癌よりも子宮頚部腺扁平上皮癌の方が予後は不良であるとの報告もある（非特許文献２０、２１）。一方、組織学的分類が子宮頚癌患者の予後に影響を及ぼすことを実証する証明は見出されなかった、とする報告もある（非特許文献４）。
もっとも、後述する本発明者の検討結果によれば、ＨＰＶ感染は、子宮頚部扁平上皮癌に比べ子宮頚部腺癌との相関性は低く、ＨＰＶ感染検査は、子宮頚部腺癌のスクリーニング方法として、特異性の点で十分ではない。
上記治療前診断に加え、子宮頸癌、特に子宮頚部腺癌では、癌病変の予後を予測する診断方法に対する要求がある（非特許文献１）。
これに関し、幾つかの研究では初期の子宮頚部腺癌が子宮頚部扁平上皮癌よりも予後が不良であることを提案している（非特許文献１６）。また、組織学的分類が、子宮頚癌患者の生存率と関連しており、子宮頚癌患者の予後診断と成り得るとする報告がある（非特許文献１７）。また、ＨＰＶ感染が、子宮頚癌の重症度に関する重要な指標に成り得るとする報告（非特許文献１８）や、子宮頚癌の患者の中でも、ＨＰＶ感染陰性患者の方が、ＨＰＶ感染陽性患者より、有意に生存期間が短いという報告もある（非特許文献１９）。更に、純粋な子宮頚部腺癌よりも子宮頚部腺扁平上皮癌の方が予後は不良であるとの報告もある（非特許文献２０、２１）。一方、組織学的分類が子宮頚癌患者の予後に影響を及ぼすことを実証する証明は見出されなかった、とする報告もある（非特許文献４）。
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本発明者は、上記の本願の出願当時における技術水準において、Villin１（以下、VIL1と略記する）に対する抗体に着目し、子宮頚癌患者の生検試料を使って鋭意検討を重ねた結果、当該抗体が、子宮頚部腺癌の診断又は子宮頚癌の予後の診断マーカーとして有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の一の実施形態によれば、患者から採取した試料を、VIL1に対する抗体と接触させる工程を含む、子宮頸部腺癌又は子宮頸癌の予後の検査方法、或いは、患者の子宮頚部から採取した細胞を、VIL1に対する抗体と接触させ、当該細胞のVIL1の発現量に基づき、子宮頸部腺癌の存在又は予後を判断する工程を含む、子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断する方法が提供される。
本発明の方法では、試料は、好ましくは患者の子宮頚部から採取した組織である。また、本発明の方法は、他の診断方法と組合せることでより効果的に子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断することができる。例えば、パパニコロー染色による子宮頸部癌の細胞診で陰性の患者、ヒトパピローマウイルス感染が陰性の患者、又はp16INK4aが陰性の患者を対象とすることが有益である。また、本発明の方法は、ｐ５３癌抑制遺伝子に変異を検出する方法と組合せて子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断することも有益である。
本発明の他の実施形態によれば、VIL1に対する抗体を含む子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断するための組成物が提供される。
本発明の更に他の実施形態によれば、VIL1に対する抗体を含む、子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断するためのキットが提供される。また、本発明の更に他の実施形態によれば、子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断するためのマーカーとしてのVIL1に対する抗体のインビトロでの使用が提供される。
本発明の更に他の実施形態によれば、子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断するための組成物を調製するためのVIL1に対する抗体の使用が提供される。
上記の通り、本発明は、VIL1に対する抗体の、子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断するための使用に関するものである。以下、具体的に説明する。
１．VIL1
VIL1は、カルシュウム制御性のアクチン結合タンパクで、ビリン/ゲルソリンファミリーに属するタンパクである。VIL1は、小腸の吸収細胞や近位尿細管の上皮細胞に特異的に発現し、刷毛縁を形成する細胞骨格タンパクである。VIL1は、大きなコアとなるドメインを中心に、N末端側、C末端側、および小さなヘッドピースからなる。
VIL1は、カルシュウム制御性のアクチン結合タンパクで、ビリン/ゲルソリンファミリーに属するタンパクである。VIL1は、小腸の吸収細胞や近位尿細管の上皮細胞に特異的に発現し、刷毛縁を形成する細胞骨格タンパクである。VIL1は、大きなコアとなるドメインを中心に、N末端側、C末端側、および小さなヘッドピースからなる。
ヒトVIL1遺伝子は、２ｑ３５に位置し、ヒトVIL1のアミノ酸配列及びそれをコードするｃＤＮＡの核酸配列は、NCBI Sequence Viewer v2.0から入手又は推測可能である。
VIL1は、アフィニティークロマトグラフィー等の慣用技術を用いてタンパク抽出することによって、腫瘍組織から単離することができる。また、その配列決定方法も当業者に周知である。
２．抗体
本発明で用いられる一次抗体は、VIL1に対して結合するものであればよく、ポリクロナール抗体でもモノクロナール抗体でもよい。
本発明で用いられる一次抗体は、VIL1に対して結合するものであればよく、ポリクロナール抗体でもモノクロナール抗体でもよい。
本発明で用いることができる抗体は、下記表に表されるように多数、販売されているので、市販品を用いるのが便利である。
ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体の調製は、製品の添付書類、販売元のホームページ該当サイト等に従って行えばよい。
本発明の方法は例えば間接法により実施することができる。この方法による場合、通常本発明のVIL1に対する抗体を一次抗体として用い、一次抗体に対する抗体を二次抗体として用いる。
試料は、例えば、0.1M リン酸バッファー液にて、１０分間３回洗浄を行い、0.5%過酸化水素水にて、内因性ペルオキシダーゼの除去を行ったのち、再度、0.1M リン酸バッファー液にて、１０分間３回洗浄を行い、次いで、二次抗体を得た動物種と同種の血清を用いて、例えば、2-10%正常血清を含む0.1M リン酸バッファー液と、30-60分間インキュベートを行い、バックグラウンド染色の原因となる非特異的反応を抑制しておくとよい。次いで、抗体希釈液、例えば、0.1M リン酸バッファー液で適切な濃度に調整しておいた一次抗体を試料に加え、例えば、24-76時間インキュベートする。なお、このまま、直接的に抗体反応として検出する方法、例えば、蛍光物質を直接結合する方法もあるが、間接法の方が応用範囲の広く、高感度の検出が可能となる。
間接法では、次いで、二次抗体を試料に加えてVIL1を可視化する。可視化する方法としては、二次抗体に蛍光標識を用いる方法、二次抗体に酵素を結合させ、発色其質を沈着させる酵素法、ビオチン化二次抗体を用いて、そこに標識済みのアビジン−ビオチン複合体を検出させるABC法などがある。これらの標識化の技術は当業者に周知であり、例えば、製品の添付書類、販売元のホームページ該当サイト等に詳細に記載されている。ABC法は、一次抗体で、インキュベートした後、例えば、0.1M リン酸バッファー液にて、１０分間３回洗浄を行い、ビオチン化二次抗体で、更に2-24時間インキュベートする。これを、再度0.1M リン酸バッファー液にて、１０分間３回洗浄を行ったのち、アビジンービオチン複合体で1-2時間インキュベートする。それをDAB(ジアミノベンジヂン)反応液で発色させる。DAB反応液は、例えば、トリスバッファー液で調整し、過酸化水素水を加えて用いる。また、アンモニウムニッケルサルフェートを加える事もある。
３．診断対象疾患
本発明においては、VIL1に対する抗体を、子宮頸癌の存在又は予後の診断に用いる。特に、本発明で用いられるVIL1に対する抗体は、子宮頸部腺癌に対して特異性が高く、子宮頸癌の予後と特に高い相関性を有するため、これらの診断で特に有益である。
本発明においては、VIL1に対する抗体を、子宮頸癌の存在又は予後の診断に用いる。特に、本発明で用いられるVIL1に対する抗体は、子宮頸部腺癌に対して特異性が高く、子宮頸癌の予後と特に高い相関性を有するため、これらの診断で特に有益である。
また、本発明のVIL1に対する抗体を用いる診断方法は、他の特定の診断方法と組合せることでより効果的に子宮頸部腺癌の存在又は子宮頸癌の予後を診断することができる。
例えば、パパニコロ染色による子宮頸部癌の細胞診は、子宮頚部扁平上皮癌では有効であるが、子宮頚部腺癌では偽陰性となる（非特許文献１）。このため、パパニコロ染色による子宮頸部癌の細胞診で陰性と判断された患者を対象として本発明の方法を実施することは、効率的に子宮頚部腺癌を検出する上で有益である。
例えば、パパニコロ染色による子宮頸部癌の細胞診は、子宮頚部扁平上皮癌では有効であるが、子宮頚部腺癌では偽陰性となる（非特許文献１）。このため、パパニコロ染色による子宮頸部癌の細胞診で陰性と判断された患者を対象として本発明の方法を実施することは、効率的に子宮頚部腺癌を検出する上で有益である。
また、欧米諸国では、１６型及び１８型等のヒトパピローマウイルスの感染は、そのウイルスの型（タイプ）により、子宮頸部腺癌を推定診断できるとの報告があるが、本発明者の検討結果によれば、日本人子宮頚部扁平上皮癌の患者では高い感染頻度を示したものの、日本人子宮頚部腺癌では、その感染頻度は低く、関連性を示さなかった。そのため、日本人子宮頸部腺癌に対しては、ヒトパピローマウイルスタイピングが、補助診断とならない危険性がある。よって、これらヒトパピローマウイルス感染のない患者を対象として本発明の方法を実施することは、子宮頚部腺癌を検出する効率的な検査法となる。
また、欧米諸国においては、今後、パピローマウイルスワクチンの使用が予定されており、その効果により、ヒトパピローマウイルスの感染が原因の子宮頚部腺癌は激減すると期待されている。よって、今後は、ヒトパピローマウイルスの感染が原因でない子宮頚部腺癌が、大きな問題となることが予測される（非特許文献１）。
例えば、ヒトパピローマウイルスは、６型、１１型、１６型、１８型５２型及び５８型を含む多くの型が子宮頸部腺癌の原因と考えられており、これらヒトパピローマウイルスの診断で陰性の患者に対して、本発明の方法を実施することで、上記問題に対応することが可能とする。
例えば、ヒトパピローマウイルスは、６型、１１型、１６型、１８型５２型及び５８型を含む多くの型が子宮頸部腺癌の原因と考えられており、これらヒトパピローマウイルスの診断で陰性の患者に対して、本発明の方法を実施することで、上記問題に対応することが可能とする。
同様に、本発明の方法で検出される子宮頸部腺癌の中には、p16INK4aの検査で陰性と判断された患者も含まれており、汎用される、p16INK4aの検査で陰性と診断された患者に、本発明の方法を実施することで、子宮頚部腺癌の検出率を向上させることができる。
更に本発明者は、今回、子宮頸癌の予後に関し、VIL1を、HPV及び／又はp16INK4aと組み合わせることが有用であることを見出した。具体的には、VIL1のみをマーカーとして用い、VIL1が陽性とされた患者の健存率と、VIL1とHPV及び／又はp16INK4aとを組み合わせてマーカーとして用い、VIL1が陽性で、HPV感染が陰性及び／又はp16INK4がa陰性の患者の健存率を比較したところ、前者に比べ後者で健存率がより悪化していることを見出した（図１Ａ及びＢ）。また、VIL1が陽性で、HPV感染及びp16INK4aが陰性で、且つp53に変異が見られる患者では、VIL1が陽性で、且つHPV感染及びp16INK4aが陰性の患者よりさらに健存率は悪化していた（図１Ｃ）。
このため、HPV、p16INK4a、及びp53の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくはHPV及びp16INK4a、特に好ましくはHPV、p16INK4a、及びp53を、VIL1と組み合わせることで、子宮頸癌の予後を正確に予測する上で有益である。
４．分析及び診断手法
本発明の診断方法は、患者の子宮頚部から採取した細胞のVIL1発現量に基づき、子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断する方法であり、本発明では、患者の子宮頚部から採取した細胞をVIL1に対する抗体と接触させ、抗体に結合したVIL1の量を測定する工程を含む。
本発明の診断方法は、患者の子宮頚部から採取した細胞のVIL1発現量に基づき、子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断する方法であり、本発明では、患者の子宮頚部から採取した細胞をVIL1に対する抗体と接触させ、抗体に結合したVIL1の量を測定する工程を含む。
抗体に結合したVIL1の量、即ち患者の子宮頚部から採取した細胞のVIL1発現量は、例えば、上記で説明した標識の組織化学的染色における発色の有無及び程度に基づき決定することができる。また、例えば、ELISA方法、フローサイトメトリーによる自動分析、ウェスタンブロット法等によって実施することもできる。
また、本発明の方法による子宮頸部腺癌の診断及び子宮頸癌の予後の診断は、用いる分析法に応じて行えばよい。組織化学的染色方法では、例えば、以下の基準によって上記診断を行うことができる。
0：染まらない。
1：腫瘍細胞のごく一部の細胞膜が染まる。
2：細胞質と細胞膜の両方、又は細胞質若しくは細胞膜のどちらかが、いくつもの腫瘍細胞で染まっている。
総合判定：0は陰性、1及び2が陽性。
1：腫瘍細胞のごく一部の細胞膜が染まる。
2：細胞質と細胞膜の両方、又は細胞質若しくは細胞膜のどちらかが、いくつもの腫瘍細胞で染まっている。
総合判定：0は陰性、1及び2が陽性。
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明する。但し、以下の実施例は本発明の技術的範囲に何らの影響を及ぼすものではない。
１．試料
放射線医学総合研究所で子宮頸部、子宮体部又は膣を発生部位とする子宮癌患者と診断され治療を行っている日本人の患者の中から、機関の審査委員会による同意書に同意し、臨床記録と生検組織の研究使用許可へのインフォームドコンセントを行った患者122人を対象とした。患者の平均年齢は６０歳である。全症例中、子宮頸部扁平上皮癌は74例、子宮頸部腺癌は31例、子宮体部腺癌は5例であった。
放射線医学総合研究所で子宮頸部、子宮体部又は膣を発生部位とする子宮癌患者と診断され治療を行っている日本人の患者の中から、機関の審査委員会による同意書に同意し、臨床記録と生検組織の研究使用許可へのインフォームドコンセントを行った患者122人を対象とした。患者の平均年齢は６０歳である。全症例中、子宮頸部扁平上皮癌は74例、子宮頸部腺癌は31例、子宮体部腺癌は5例であった。
122人のうち、44人（子宮頸部扁平上皮癌は31例、子宮頸部腺癌は11例、子宮体部腺癌は2例）は全骨盤に30.6Gyの放射線療法を受け、更に、 192 Ir高線量率腔内近接照射とともに中央遮蔽での骨盤照射を50.6Gyで実施した患者である。他の54症例（子宮頸部扁平上皮癌は33例、子宮頸部腺癌は12例、子宮体部腺癌は1例、その他の症例は8例）は、同様の放射線療法を受け、更に、1週間隔で40mg/m2 のシスプラチンを5回に分けて投与した患者である。他の24症例（子宮頸部扁平上皮癌は6例、子宮頸部腺癌は15例、子宮体部腺癌は2例、その他の症例は1例）は71.2 GyEの炭素線療法を受けた患者である。
全対象患者うち、110人は2年以上、腫瘍の再発転移について追跡した。
23人は遠隔転移を認め（M1）、6人は大きな腫瘍で侵襲的な局所腫瘍（T4）であったので、予後解析対象から除外した。除外した患者の内訳は、子宮頸部扁平上皮癌は19例、子宮頸部腺癌は5例、子宮体部腺癌は0例、その他の症例は3例である。1例は遠隔転移を認め（M1）、且つ大きな侵襲的腫瘍（T4）である。
23人は遠隔転移を認め（M1）、6人は大きな腫瘍で侵襲的な局所腫瘍（T4）であったので、予後解析対象から除外した。除外した患者の内訳は、子宮頸部扁平上皮癌は19例、子宮頸部腺癌は5例、子宮体部腺癌は0例、その他の症例は3例である。1例は遠隔転移を認め（M1）、且つ大きな侵襲的腫瘍（T4）である。
すべての生検試料は放射線療法前に子宮頚部より採取されたものである。生検試料は10％ホルマリンにて固定し、パラフィン包埋を行った。ゲノムDNAはRNAlaterに浸けた生検試料より抽出した（非特許文献２２参照）。
２．統計解析方法
フィッシャーの正確確率検定を、VIL1免疫組織化学法の発現、HPV感染、病理分類、p53変異、及びp16INK4a免疫組織化学法の発現のそれぞれの検討因子間における相関関係を解析するのに用いた。P値が0.05よりも小さければ、有意の差が「ある」とした。予後検定は、二年間の追跡調査中の再発、転移及び腫瘍死を評価項目とし、再発転移のない無病生存について、経時的に、Kaplan-Meier法にて生存曲線を描き、ログランク検定で有意差を計算した。
フィッシャーの正確確率検定を、VIL1免疫組織化学法の発現、HPV感染、病理分類、p53変異、及びp16INK4a免疫組織化学法の発現のそれぞれの検討因子間における相関関係を解析するのに用いた。P値が0.05よりも小さければ、有意の差が「ある」とした。予後検定は、二年間の追跡調査中の再発、転移及び腫瘍死を評価項目とし、再発転移のない無病生存について、経時的に、Kaplan-Meier法にて生存曲線を描き、ログランク検定で有意差を計算した。
３．定量PCR法
３−１．操作手順
VIL1遺伝子をプライマーとして用い、腫瘍DNAと参照DNAについてPCRを行った。93症例の子宮頚癌患者のゲノムDNAをRNAlater中の生検サンプルからGenomic-tip（100/G）（QIAGEN）にて抽出精製した。参照DNAとして市販のHuman genomic DNA from females（Promega）を使用した。PCR反応液には30ngのゲノムDNAを用いた。プライマーはProbeFinder Software（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）でデザインし、ハイブリダイゼーションプローブはUniversal Probe Library（Roche）から適当なものを選択した。用いたプライマーの塩基配列は、下記の表に記載の通りである。
３−１．操作手順
VIL1遺伝子をプライマーとして用い、腫瘍DNAと参照DNAについてPCRを行った。93症例の子宮頚癌患者のゲノムDNAをRNAlater中の生検サンプルからGenomic-tip（100/G）（QIAGEN）にて抽出精製した。参照DNAとして市販のHuman genomic DNA from females（Promega）を使用した。PCR反応液には30ngのゲノムDNAを用いた。プライマーはProbeFinder Software（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）でデザインし、ハイブリダイゼーションプローブはUniversal Probe Library（Roche）から適当なものを選択した。用いたプライマーの塩基配列は、下記の表に記載の通りである。
PCR試薬はLightCycler480 Probes Master（Roche）を使用し、定量PCR装置はLightCycler480（Roche）を使用した。PCR反応条件は95℃で10分間1本鎖に変性させた後、95℃で20秒、55又は60℃で30秒、72℃で30秒温度を変化させるサイクルを40〜45回行って目的の遺伝子を増幅させた。
３−２．結果
ゲノムDNAのVIL1コピー数を参照DNAのVIL1コピー数で除し、相対値を求めた。VIL1コピー数相対値解析では扁平上皮癌と腺癌症例の間で、VIL1のコピー数に有意差を認めた（P=0.049）（図２）。
ゲノムDNAのVIL1コピー数を参照DNAのVIL1コピー数で除し、相対値を求めた。VIL1コピー数相対値解析では扁平上皮癌と腺癌症例の間で、VIL1のコピー数に有意差を認めた（P=0.049）（図２）。
４．免疫組織化学染色
４−１．染色手順及び判断基準
VIL1及びp16INK4aについて、自動染色機Ventana Discovery System （Ventana Medical Systems, Tucson, AZ）を使用し、ストレプトアビジン-ビオチン免疫ペルオキシダーゼ染色を行った（非特許文献２３参照）。一次抗体であるVIL1マウスモノクローナル抗体（CELL MARQUE, CA）と抗ヒトp16INK4aマウスモノクローナル抗体（Thermo Fisher Scientific, IPR, UK）はantibody dilution buffer（Ventana）で100倍希釈にして使用した。二次抗体には、VIL1、p16INK4aとも、Discovery Universal Secondary Antibody (Ventana)を用いた。陰性コントロールには、一次抗体を加えない希釈液のみを使用した。
４−１．染色手順及び判断基準
VIL1及びp16INK4aについて、自動染色機Ventana Discovery System （Ventana Medical Systems, Tucson, AZ）を使用し、ストレプトアビジン-ビオチン免疫ペルオキシダーゼ染色を行った（非特許文献２３参照）。一次抗体であるVIL1マウスモノクローナル抗体（CELL MARQUE, CA）と抗ヒトp16INK4aマウスモノクローナル抗体（Thermo Fisher Scientific, IPR, UK）はantibody dilution buffer（Ventana）で100倍希釈にして使用した。二次抗体には、VIL1、p16INK4aとも、Discovery Universal Secondary Antibody (Ventana)を用いた。陰性コントロールには、一次抗体を加えない希釈液のみを使用した。
免疫組織化学染色による評価は、VIL1、及びp16INK4aの各染色パターンによりそれぞれ以下の基準により行った。
１）VIL1
0：染まらない。
1：腫瘍細胞のごく一部の細胞膜が染まる。
2：細胞質及び細胞膜の両方が、又は細胞質若しくは細胞膜どちらかが幾つもの腫瘍細胞で染まっている。
総合判定：0は陰性、1と2を陽性とした。
0：染まらない。
1：腫瘍細胞のごく一部の細胞膜が染まる。
2：細胞質及び細胞膜の両方が、又は細胞質若しくは細胞膜どちらかが幾つもの腫瘍細胞で染まっている。
総合判定：0は陰性、1と2を陽性とした。
２）p16 INK4a
0：細胞核と細胞質が染まっているものが1％に満たない。
1：細胞核と細胞質が染まっているものが1〜10％で、染まりは弱く、散在している。
2：染まっているのが10〜30％で染まりが強い。
3：染まっているものが30％よりも多く、標本のいくつもの領域で存在し、染まりも強い。
総合判定：スコア0、1、2は陰性で3を陽性とした。
0：細胞核と細胞質が染まっているものが1％に満たない。
1：細胞核と細胞質が染まっているものが1〜10％で、染まりは弱く、散在している。
2：染まっているのが10〜30％で染まりが強い。
3：染まっているものが30％よりも多く、標本のいくつもの領域で存在し、染まりも強い。
総合判定：スコア0、1、2は陰性で3を陽性とした。
４−２．結果
１）VIL1
上記免疫組織化学染色では、VIL1は正常な小腸上皮(図３Ａ)に見られ、正常な子宮体部や子宮頚部では、その発現が観察されなかった（図３Ｂ及び図３Ｃ）。122症例のホルマリン固定パラフィン包埋標本について免疫組織化学染色を実施した。子宮頸部腺癌（図３Ｄ）の症例（13／31）においてVIL1染色陽性となり、総ての扁平上皮癌症例（81／81）においてVIL1染色陰性となった（図３Ｅ）。VIL1免疫染色陽性試料において子宮頸部扁平上皮癌と子宮頸部腺癌との間で有意差が見られた（P < 0.0001）。VIL1陽性腫瘍は総て子宮頚部腺癌であった。子宮頚部腺癌の診断マーカーとしての検出感度は41％であり、選択性は100％であった。
１）VIL1
上記免疫組織化学染色では、VIL1は正常な小腸上皮(図３Ａ)に見られ、正常な子宮体部や子宮頚部では、その発現が観察されなかった（図３Ｂ及び図３Ｃ）。122症例のホルマリン固定パラフィン包埋標本について免疫組織化学染色を実施した。子宮頸部腺癌（図３Ｄ）の症例（13／31）においてVIL1染色陽性となり、総ての扁平上皮癌症例（81／81）においてVIL1染色陰性となった（図３Ｅ）。VIL1免疫染色陽性試料において子宮頸部扁平上皮癌と子宮頸部腺癌との間で有意差が見られた（P < 0.0001）。VIL1陽性腫瘍は総て子宮頚部腺癌であった。子宮頚部腺癌の診断マーカーとしての検出感度は41％であり、選択性は100％であった。
２）p16INK4a
p16INK4aの染色では、評価可能な114例中97例（85％）が陽性であった。子宮頸部扁平上皮癌では、ほとんどの症例（95％）でp16INK4aは陽性であり、対照的に、子宮頸部腺癌では52％の症例でp16INK4aは陰性であった。
p16INK4aの染色では、評価可能な114例中97例（85％）が陽性であった。子宮頸部扁平上皮癌では、ほとんどの症例（95％）でp16INK4aは陽性であり、対照的に、子宮頸部腺癌では52％の症例でp16INK4aは陰性であった。
５．ヒトパピローマウイルス（HPV）遺伝子型タイピング
５−１．HPV linear array assayによるHPV感染の検出
Linear Array HPV Genotyping test（LA HPV GT, Roche）のビオチン化PGMYオリゴヌクレオチドプライマーでHPV遺伝子の標的DNAをPCRにて増幅した。ビオチン化された増幅産物を用いて、Linear Array Detection Kit（LA DK, Roche）を使用し、発色同定により検出した。発色同定はメンブレン上に固相化した37種類のHPV型特異的プローブとビオチン化増幅産物のハイブリダイゼーションを行い、メンブレン上にビオチン化増幅産物を固相化し、続いてストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼを添加してビオチンと反応させた後、さらに3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンを添加し、青色の発色反応を行った。
５−１．HPV linear array assayによるHPV感染の検出
Linear Array HPV Genotyping test（LA HPV GT, Roche）のビオチン化PGMYオリゴヌクレオチドプライマーでHPV遺伝子の標的DNAをPCRにて増幅した。ビオチン化された増幅産物を用いて、Linear Array Detection Kit（LA DK, Roche）を使用し、発色同定により検出した。発色同定はメンブレン上に固相化した37種類のHPV型特異的プローブとビオチン化増幅産物のハイブリダイゼーションを行い、メンブレン上にビオチン化増幅産物を固相化し、続いてストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼを添加してビオチンと反応させた後、さらに3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンを添加し、青色の発色反応を行った。
５−２．結果
122人の女性のうち95人（78％）でHPV陽性の癌であった。HPVタイプ16が最も高い頻度で検出された。子宮頚部扁平上皮癌患者79人のうち72人がHPV陽性症例であるのに対して、子宮頚部腺癌患者37人のうち19人がHPV陽性症例であり、子宮頚部腺癌患者よりも子宮頚部扁平上皮癌患者でHPV陽性症例が極めて多かった（P < 0.0001）。VIL1免疫染色陽性サンプル14症例のうち9例（64％）はHPV陰性であり、HPV感染陰性とVIL1染色陽性の間に相関関係が認められた（P=0.0002）。
122人の女性のうち95人（78％）でHPV陽性の癌であった。HPVタイプ16が最も高い頻度で検出された。子宮頚部扁平上皮癌患者79人のうち72人がHPV陽性症例であるのに対して、子宮頚部腺癌患者37人のうち19人がHPV陽性症例であり、子宮頚部腺癌患者よりも子宮頚部扁平上皮癌患者でHPV陽性症例が極めて多かった（P < 0.0001）。VIL1免疫染色陽性サンプル14症例のうち9例（64％）はHPV陰性であり、HPV感染陰性とVIL1染色陽性の間に相関関係が認められた（P=0.0002）。
６．p53変異
６−１．高精度融解分析法による癌抑制遺伝子p53の変異検出
高精度融解分析法を用いて122症例のDNA試料におけるp53遺伝子のエキソン5〜8の変異検出スクリーニングを行った。p53遺伝子のエキソン5〜8はPCRにて増幅した。鋳型DNAは対象試料中のDNAのみのものと、これを等量の参照DNAと混ぜたものを用いた。20ulのPCR反応液には1xLightCycler480 High Resolution Melting Master（Roche）、それぞれ2.5mMエキソン５、2.5mMエキソン8、3.0mMエキソン6及び3.0mMエキソン7のMgCl2水溶液、0.2uMのforwardプライマー（配列は表2参照）、0.2uMのreverseプライマー（配列は表2参照）、10ngの鋳型DNAが含まれている。ＰＣＲ反応装置は、LightCycler 480 thermal cycler (Roche)を使用した。反応条件は95℃で5分間変性させた後、95℃で10秒、60又は63℃で15秒、72℃で10秒の3ステップを45サイクル行い、続けて4.8℃／sの割合で 、65℃から95℃の融解解離曲線解析を行った。融解曲線のデータはLightCycler 480 Gene Scanning software (Roche)により、解析を行った。
６−１．高精度融解分析法による癌抑制遺伝子p53の変異検出
高精度融解分析法を用いて122症例のDNA試料におけるp53遺伝子のエキソン5〜8の変異検出スクリーニングを行った。p53遺伝子のエキソン5〜8はPCRにて増幅した。鋳型DNAは対象試料中のDNAのみのものと、これを等量の参照DNAと混ぜたものを用いた。20ulのPCR反応液には1xLightCycler480 High Resolution Melting Master（Roche）、それぞれ2.5mMエキソン５、2.5mMエキソン8、3.0mMエキソン6及び3.0mMエキソン7のMgCl2水溶液、0.2uMのforwardプライマー（配列は表2参照）、0.2uMのreverseプライマー（配列は表2参照）、10ngの鋳型DNAが含まれている。ＰＣＲ反応装置は、LightCycler 480 thermal cycler (Roche)を使用した。反応条件は95℃で5分間変性させた後、95℃で10秒、60又は63℃で15秒、72℃で10秒の3ステップを45サイクル行い、続けて4.8℃／sの割合で 、65℃から95℃の融解解離曲線解析を行った。融解曲線のデータはLightCycler 480 Gene Scanning software (Roche)により、解析を行った。
６−２．結果
122症例のうち15例でp53癌抑制遺伝子に変異があった。VIL1免疫染色陽性試料では、高い頻度すなわち35％が、p53変異をもち（P=0.0147）、p53に変異をもつVIL1陽性症例は総てHPV感染陰性であった。従って、子宮頸部腺癌の一部に、VIL1陽性で、HPV感染陰性、かつp53に変異を持つ、特殊な発癌機構を持つサブタイプがあることが想定された。
122症例のうち15例でp53癌抑制遺伝子に変異があった。VIL1免疫染色陽性試料では、高い頻度すなわち35％が、p53変異をもち（P=0.0147）、p53に変異をもつVIL1陽性症例は総てHPV感染陰性であった。従って、子宮頸部腺癌の一部に、VIL1陽性で、HPV感染陰性、かつp53に変異を持つ、特殊な発癌機構を持つサブタイプがあることが想定された。
７．VIL1の予後診断マーカーとしての評価
治療後2年以上、経過観察が可能であった８２人の子宮頸癌患者（子宮頸部扁平上皮癌患者は50例、子宮頸部腺癌患者は25例）について、治療前に生検試料を採取して免疫組織化学染色を実施し、治療後最長で約５年に亘って予後を観察してVIL1の予後診断マーカーとしての評価を行ったところ、VIL1が予後関連因子として有用であることが解った（P=0.0122）。図１Ａ−Ｃに示すKaplan-Meier生存曲線から解るように、VIL1染色陽性腫瘍であると2年健存率は悪く（P = 0.033）(図１Ａ)、子宮頸癌の予後とVIL1が関連することが解った。また、VIL1染色陽性でHPV感染陰性、p16INK4a陰性腫瘍では、さらに2年健存率は悪く（P = 0.005）(図１Ｂ)、VIL1染色陽性でHPV感染陰性、p16INK4a陰性、p53に変異が見られる腫瘍では、よりさらに2年健存率は悪かった（P = 0.0023）(図１Ｃ)。
治療後2年以上、経過観察が可能であった８２人の子宮頸癌患者（子宮頸部扁平上皮癌患者は50例、子宮頸部腺癌患者は25例）について、治療前に生検試料を採取して免疫組織化学染色を実施し、治療後最長で約５年に亘って予後を観察してVIL1の予後診断マーカーとしての評価を行ったところ、VIL1が予後関連因子として有用であることが解った（P=0.0122）。図１Ａ−Ｃに示すKaplan-Meier生存曲線から解るように、VIL1染色陽性腫瘍であると2年健存率は悪く（P = 0.033）(図１Ａ)、子宮頸癌の予後とVIL1が関連することが解った。また、VIL1染色陽性でHPV感染陰性、p16INK4a陰性腫瘍では、さらに2年健存率は悪く（P = 0.005）(図１Ｂ)、VIL1染色陽性でHPV感染陰性、p16INK4a陰性、p53に変異が見られる腫瘍では、よりさらに2年健存率は悪かった（P = 0.0023）(図１Ｃ)。
以上の結果は、VIL1の子宮頸癌の予後診断因子としての有用性を実証すると共に、HPV感染の有無、p16INK4aの免疫染色法による発現の有無、及びp53の変異の有無の少なくとも１つをVIL1と組み合わせることで、子宮頸癌の予後診断の精度が向上することを実証する。
Claims (21)
- Villin１に対する抗体を含む、子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断するための組成物。
- 前記診断が、パパニコロー染色による子宮頸部癌の細胞診で陰性の患者を対象とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記診断が、ヒトパピローマウイルス感染が陰性の患者を対象とする、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記ヒトパピローマウイルスが、６型、１１型、１６型、１８型、５２型及び５８型の何れかである、請求項３に記載の組成物。
- 前記ヒトパピローマウイルスが、１６型である、請求項４に記載の組成物。
- 前記診断が、p16INK4aが陰性の患者を対象とする、請求項１から５の何れか一項に記載の組成物。
- ｐ５３癌抑制遺伝子に変異を検査する方法と組み合わせて子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断するための請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
- ヒトパピローマウイルス感染検査及びp16INK4a検査と組み合わせて子宮頸癌の予後を診断するための請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
- ヒトパピローマウイルス感染検査、p16INK4a検査、及びｐ５３癌抑制遺伝子検査と組み合わせて、子宮頸癌の予後を診断するための請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
- 前記Villin１に対する抗体が、モノクロナール抗体である、請求項１から９の何れか一項に記載の組成物。
- 前記抗体が検出可能な標識を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
- Villin１に対する抗体を含む、子宮頸部腺癌を診断又は子宮頸癌の予後を診断するためのキット。
- 患者の子宮頚部から採取した細胞を、Villin１に対する抗体と接触させ、
該抗体と結合したVillin１を検出する工程を含む、子宮頸部腺癌又は子宮頸癌の予後の検査方法。 - 前記細胞が、パパニコロー染色による子宮頸部癌の細胞診で陰性の患者から採取された細胞である、請求項１３に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒトパピローマウイルス感染が陰性の患者から採取された細胞である、請求項１３又は１４に記載の方法。
- 前記ヒトパピローマウイルスが、６型、１１型、１６型、１８型、５２型及び５８型の何れかである、請求項１３から１５の何れか１項に記載の方法。
- 前記ヒトパピローマウイルスが、１６型である、請求項１６に記載の方法。
- 前記細胞が、p16INK4aが陰性の患者から採取された細胞である、請求項１３から１７の何れか１項に記載の方法。
- 請求項１３から１８の何れか１項に記載の方法を、ｐ５３癌抑制遺伝子の変異を検査する方法と組み合わせて、子宮頸部腺癌を検査又は子宮頸癌の予後を検査する方法。
- 請求項１３から１８の何れか１項に記載の方法を、ヒトパピローマウイルス感染検査及びp16INK4a検査と組み合わせる、子宮頸癌の予後を検査する方法。
- 請求項１３から１８の何れか１項に記載の方法を、ヒトパピローマウイルス感染検査、p16INK4a検査、及びｐ５３癌抑制遺伝子検査と組み合わせる、子宮頸癌の予後を検査する方法。
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