JP5359883B2 - 肝炎の治療剤又は予防剤 - Google Patents

Description

本発明は、肝炎の治療剤又は予防剤に関する。

肝炎とは、ウイルス、アルコール、薬物、毒素及び自己免疫性などの原因で誘発された肝臓の炎症を含む症患を指す。

肝炎ウイルスによる肝炎が大多数を占め、特にＡ，Ｂ，Ｃ型が多いが、他にもＤ，Ｅ，Ｆ，Ｇ型、及び特発性肝炎ウイルスの存在が知られている。また、上記の肝炎ウイルスはＲＮＡ型，ＤＮＡ型など多数の異なるウイルス・ファミリーの間に広がっている。

Ｂ型ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）はそれぞれ急性及び慢性感染を引き起こす。急性肝炎は初期感染や慢性的な感染者における再発に伴って症状が現れる。他方、慢性のＣ型肝炎においては、６ヵ月以上にわたって肝臓の炎症が続き、細胞が破壊され、肝機能の低下を伴う。ＨＣＶ感染では、急性肝炎から慢性肝炎への進行の危険性が高いことも問題である。このような状況から、肝炎ウイルス感染症に対する治療の早期介入と効果の高い治療法の開発が望まれている。

インターフェロン類（ＩＦＮｓ）は天然に存在するタンパク質であり、抗ウイルス活性、増殖抑制活性、免疫制御活性を有する。４つのクラスのインターフェロン（以下、単に「ＩＦＮ」と表記する場合がある）がヒトに存在していることが知られている（例えば、Ｐｅｓｔｋａら，「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｏｎｓ．」，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７年，第５６巻，ｐ．７２７−７７７（非特許文献１）参照。）。Ｉ型インターフェロン（以下、「Ｉ型ＩＦＮ」と表記する場合がある）の抗ウイルス効果は、ウイルス自身に対する直接的な作用ではなく、ウイルス感染に対する防御という意味での標的細胞への作用により成し遂げられる。

このインターフェロンの抗ウイルス作用に着目し、インターフェロンは様々なウイルス性疾患に応用されている。Ｃ型肝炎においては種々のＩＦＮ製剤の単独治療やインターフェロン−α製剤（以下、「インターフェロン−α」を「ＩＦＮ−α」と表記する場合がある）とリバビリンとの併用療法が治療手段の第一選択となっている。併用治療は、単剤治療より持続的反応が期待出来る反面、より高価で、より多くの副作用を伴う。しかも、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た後に治療を中止すると半分以上の患者が再燃する。このような状況から、さらなる治療薬の開発が望まれている。

一方、インターフェロン自体の効果を増強する目的で、インターフェロンにポリエチレングリコールを付加したペグ化インターフェロンが開発されている。ペグ化インターフェロン−αについては既に臨床応用され、その有用性が証明されている。更に、ペグ化コンセンサスインターフェロンやペグ化インターフェロン−β（以下、「インターフェロン−β」のことを「ＩＦＮ−β」と表記する場合がある）についても、基礎検討段階に入っている。

しかし、ペグ化インターフェロンによっても、Ｃ型肝炎の治療は十分では無く、Ｃ型肝炎に対する治療成績も、長期的には、インターフェロン単独療法成績と比較して若干の有効性の向上は期待できるが、満足できる状況には無い。

このような背景から、世界的に、Ｃ型肝炎治療に対し、インターフェロンと併用する新たな薬物を見出す検討がなされている。

徳永らによって特定のタイプの細菌性ＤＮＡは免疫応答を刺激することが報告されている（Ｙａｍａｍｏｔｏら Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８８ ７９：８６６−８７３（非特許文献２））。免疫刺激活性に必須な細菌性ＤＮＡの主成分は、メチル化修飾を受けていないＣｐＧジヌクレオチドモチーフを含む特徴的な短い配列構造である。なお、本明細書においては、「ＣｐＧジヌクレオチドモチーフ」のことを「ＣｐＧモチーフ」と表記する場合がある。特段断らない限り、「ＣｐＧモチーフ」はメチル化修飾を受けていないものを意味する。また、「ＣｐＧモチーフ」を含むオリゴオリゴヌクレオチドを「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」と表記する場合がある。合成したＣｐＧオリゴヌクレオチドについても、マクロファージ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−αとＩＦＮ−β）及びＩＦＮ−γの産生を誘導し、ＮＫ細胞の細胞障害活性を有することが報告されている（特許文献１）。また、ＣｐＧオリゴヌクレオチドはマクロファージのみならず、樹状細胞やＢ細胞等にも作用し、細胞増殖活性、炎症性サイトカインのインターロイキン−１２（以下、ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子−α（以下、ＴＮＦ−α）の産生、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６）の産生を誘導することが報告されている（非特許文献３）。

このことから、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは細胞性免疫を誘導し、かつＴｈ１応答を誘導するため、ワクチンのアジュバントあるいはアレルギー性疾患の治療に有用であると考えられる一方、ＴＮＦ−αやＩＬ−６の産生誘導により敗血症、発熱、関節痛、筋肉痛や発赤等の副作用を誘発する可能性も否定できない。

徳永らはマウスＮＫ細胞の細胞障害活性において、６塩基パリンドロームモチーフからなるＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが強い活性を有することを見出し、５'−ＡＡＣＧＴＴ−３'（配列番号９２）、５'−ＡＧＣＧＣＴ−３'（配列番号９３）、５'−ＧＡＣＧＴＣ−３'（配列番号６１）の配列が最も強いことを報告している（Ｙａｍａｍｏｔｏら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２ １４８：４０７２−４０７６（非特許文献４））。また、他のタイプの免疫調節オリゴヌクレオチド配列も報告されている（国際公開第１９９８／０１８８１０号パンフレット（特許文献２）、国際公開第２００３／０１５７１１号パンフレット（特許文献３）、国際公開第２００４／０５８１７９号パンフレット（特許文献４）。

オリゴヌクレオチドの活性増強を目的とした研究も行われている。徳永らはＣｐＧを含む６塩基パリンドロームモチーフの外側にデオキシグアニル酸の繰り返し構造（以下、デオキシグアニル酸の繰り返し構造を有する配列のことを「ポリＧ配列」という）を挿入するとＮＫ細胞活性とＩＦＮ誘導活性が増強することを見出している（特許文献１）。また、ＣｐＧを含む６塩基配列の外側の配列が少なからず活性に影響を及ぼすことが明らかになっている。

その他の公知のＣｐＧ含有配列としては、Ｄ−タイプ（あるいはＡ−タイプ）及びＫ−タイプ（あるいはＢ−タイプ）の免疫刺激オリゴヌクレオチドがある（国際公開第２０００／６１１５１号パンフレット（特許文献５））。Ｋ−タイプはＢ細胞を活性化することが知られている。Ｄ−タイプはＣｐＧを含むパリンドローム配列の外側にポリＧ配列が付加されており、樹状細胞のＩ型ＩＦＮの産生を誘導し、ヒトＮＫ細胞を活性化させる。Ｄ−タイプのＩＦＮ誘導活性については３'末端側が重要とされており、３'末端側のポリＧ配列の長さは４塩基以上必要である（特許文献５）。さらに、炎症性サイトカインＩＬ−１２やＴＮＦ−αの産生誘導活性においても３'末端側のポリＧ配列が重要であり、その効果の発現には少なくとも４塩基以上のポリＧ配列が必要とされている（大韓民国ＫＲ２００１−０６３１５３号公報（特許文献６）。このように、従来技術によって、免疫刺激活性を向上させるオリゴヌクレオチドの塩基配列、又はポリＧ配列の構造は、ＩＦＮ誘導活性の増強と炎症性サイトカイン誘導活性の増強が連関することが開示されている。しかしながら、従来の知見では、ＩＦＮ誘導活性および炎症性サイトカイン誘導活性のいずれか一方の活性だけを向上させる塩基配列や、それぞれの誘導活性を分離する可能性については明らかにされていない。

パリンドロームモチーフが５'−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−３'（配列番号７６）である免疫刺激ヌクレオチドは、１０個までの最適な長さのポリＧ配列を５'末端及び３'末端に付加することにより、従来の非修飾型（修飾型の効果は後述している）のＣｐＧ含有免疫刺激ヌクレオチドよりも強力なＩＦＮ−α誘導活性を有することが見出されている（特開２００５−２３７３２８号公報（特許文献７）。５'−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−３'（配列番号７６）を有する免疫刺激ヌクレオチドに高いＩＦＮ−α誘導活性をもたらすには、グアニン（Ｇ）を３'末端側又は５'末端側に８〜１０個置くほうがよいが、免疫制御性サイトカインであるインターロイキン−１０（以下、ＩＬ−１０）の産生を抑えるには５'末端側に偏在させるとよいことが開示されている（特許文献７）。また、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αやＩＬ−１２の誘導活性は、ＩＦＮ−α誘導活性と緩やかに相関することが報告されている。これらの報告は、５'−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−３'（配列番号７６）以外のパリンドロームモチーフにおいて５'末端側へのポリＧ配列付加の効果を明らかにしていない。また、これらの報告は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの炎症性サイトカイン誘導活性が減弱し、かつＩＦＮ−γとＩＦＮ−αの両方のＩＦＮ誘導活性が増強する最適なポリＧ配列の塩基数は開示していない。

従来のＤ−タイプのＣｐＧよりも高い免疫刺激活性を有するオリゴヌクレオチドとして５'−ＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧＧＧＧ−３'（配列番号１）が見出されている（特願２００４−２８７１０２号公報（特許文献８）。この塩基配列の１個ないし数個の塩基が置換された誘導体についても開示されている。３個以上変換した具体的配列は開示されていないが、唯一７塩基を置換した５'−ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧ−３'（配列番号５）は、３'末端のポリＧ配列が３塩基でもＩＦＮ誘導活性を有することが見出されている（国際公開第２００６／０３５９３９号パンフレット（特許文献９）。

活性増強を目的としたその他の研究としては、オリゴヌクレオチドの化学修飾による安定化が知られている。天然に存在するホスホジエステルヌクレオチドは細胞内及び細胞培地中において様々な核酸分解活性によって分解されやすい。そのため、核酸分解活性の攻撃標的であるヌクレオチド間のホスホジエステル結合を置換することによる安定化、さらにその結果としての活性増加の検討が行われている。頻繁に用いられている置換方法としては、ホスホロチオエートへの置換である。Ｋｌｉｎｍａｎらの研究では、免疫刺激オリゴヌクレオチドのパリンドロームモチーフの外側のポリＧ配列をホスホロチオエート修飾することにより、免疫応答の誘導が増強されることを示している（国際公開第２０００／６１１５１号パンフレット（特許文献５）。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドの肝炎治療における効果としては、インターフェロン誘導による抗ウイルス効果の増強と、ウイルス感染細胞に対する細胞性免疫や抗ウイルス抗体をはじめとする液性免疫の誘導などが挙げられる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのＨＢＶあるいはＨＣＶ感染による肝炎治療用途に関しては、特表２００３−５２６６６２号公報（特許文献１０）及び特表２００６−５１５２７７号公報（特許文献１１）における技術情報がある。前者はＣｐＧオリゴヌクレオチド（免疫活性化配列：ＩＳＳ）を肝炎ウイルス抗原と一緒には投与せずに治療する方法について開示している。後者はインターフェロン療法などの抗ウイルス剤が無効であった慢性Ｃ型肝炎の個体を処置する方法について開示しており、患者での有用性に関して、開発コード番号ＣｐＧ１０１０１による臨床試験成績が２００６年欧州肝臓学会他において開示されている。しかしながら、その臨床試験成績は、ＣｐＧ１０１０１の単剤治療の効果は従来の治療法と比べると極めて不十分であることを示している。また、該臨床試験成績は、ペグ化ＩＦＮ−α製剤とリバビリンとＣｐＧ１０１０１の３剤の併用治療は、標準的な治療法であるペグ化ＩＦＮ−α製剤とリバビリンの併用療法の成績と比較して若干の有効性の向上は期待できるが、他の抗ウイルス剤との併用（例えばポリメラーゼやプロテアーゼなどウイルス酵素の阻害剤との併用治療）と比べて十分な治療効果が得られないことも明らかにしている。

上述の通り、既存のＣｐＧオリゴヌクレオチドとＩＦＮ−αとの併用によるＣ型肝炎ウイルス感染の治療については特許文献１１において開示されている。また、特表２００３−５１０２９０号公報（特許文献１２）では、ＩＦＮ−α処置の効力を増強し、ＩＦＮ−α処置に関連する副作用を減少するためにＣｐＧオリゴヌクレオチドを併用する技術についても開示されており、その好ましいＣｐＧオリゴヌクレオチドはＩ型インターフェロン誘導活性を有するタイプであるとされている。したがって、ＩＦＮ−αとある種のＣｐＧオリゴヌクレオチドの併用により慢性Ｃ型肝炎の治療効果が高まることが技術的に開示されている。さらには、特表２００５−５３２０６７号公報（特許文献１３）において、特定の配列のＣｐＧオリゴヌクレオチドとＩＦＮ−βとの併用に関する記載がある。しかしながら、ＩＦＮ−βとの併用に好ましいＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は開示されていない。

また、既存のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、炎症性のサイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１２やＩＬ−６の産生誘導により敗血症、発熱、関節痛、筋肉痛や発赤などの望ましくない副作用を誘発する可能性も否定できず、実際にマウスの肝炎モデルを用いた試験例から肝炎の症状を悪化させることが示されている（非特許文献５）。したがって、肝炎治療に適したインターフェロン誘導活性が向上し、かつ炎症性サイトカイン誘導能が低減されたＣｐＧオリゴヌクレオチドの創出が望まれている。

Ｐｅｓｔｋａら，「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｏｎｓ．」，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７年，第５６巻，ｐ．７２７−７７７ Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９８８年，７９：８６６−８７３ Ｋｌｉｎｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９６年，９３：２８７９−２８８３ Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２年，１４８：４０７２−４０７６ Ａｂｅら，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２００５年，５１：４１−４９ 特開平４−３５２７２４号公報 国際公開第１９９８／０１８８１０号パンフレット 国際公開第２００３／０１５７１１号パンフレット 国際公開第２００４／０５８１７９号パンフレット 国際公開第２０００／６１１５１号パンフレット 大韓民国ＫＲ２００１−０６３１５３号公報 特開２００５−２３７３２８号公報 特願２００４−２８７１０２号公報 国際公開第２００６／０３５９３９号パンフレット 特表２００３−５２６６６２号公報 特表２００６−５１５２７７号公報 特表２００３−５１０２９０号公報 特表２００５−５３２０６７号公報

本発明は、従来のインターフェロン製剤と比べて安全で効果の高い肝炎の治療剤又は予防剤を提供することを課題とする。本発明のより具体的目的は、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導活性が増強され、かつ炎症性サイトカイン誘導活性が低減された新規な免疫刺激オリゴヌクレオチドと、ＩＦＮ−βとの併用による、新規な肝炎の治療剤又は予防剤を提供することである。

本発明者らはこの課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、ＩＦＮ誘導活性においてＣｐＧモチーフを含む配列の外側の５'末端側の配列構造が重要であることを見出すと共に、当該配列構造がＩＦＮ−βとの併用において顕著な肝炎治療効果に寄与し得ることを見出した。具体的には、６塩基以上の連続したグアニン配列の５’末端側への付加により、ＩＦＮ誘導活性がそれ以外のものよりも優れたオリゴヌクレオチドが得られることを確認した。更に検討を進めた結果、５'末端側に塩基数が６乃至１０の長さのポリＧ配列を有し、３’末端側に塩基数が０乃至３の長さのポリＧ配列を有し、かつ所定の構造的特徴を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、従来知られているＤ−タイプのＣｐＧ配列からなるオリゴヌクレオチドよりもＩＦＮ誘導活性が増強される一方、炎症性サイトカイン誘導活性が低減し、ＩＦＮ−βとの併用に有用であることを見出した。これらに加えて、マウスの肝炎モデルを用いた試験の結果、この新規なＣｐＧオリゴヌクレオチドと単独治療では無効な用量のＩＦＮ−βとの併用治療が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける肝炎治療効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の肝炎の治療剤又は予防剤、およびその利用方法を提供するものである。
［１］ 式（１）：５’−（Ｇ）_ＭＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）_Ｎ−３’
[式（１）中、Ｃは、シトシン、Ｇは、グアニン、Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、４塩基以上連続したグアニンを含まない０〜１０ヌクレオチド長の塩基配列（但し、Ｘ＋Ｙの長さは、６〜２０ヌクレオチド長である。）、ＸＣＧＹは、少なくとも８ヌクレオチド長のパリンドローム配列を含む８〜２２ヌクレオチド長の塩基配列、Ｐ及びＱは、それぞれ独立に、グアニン以外の１ヌクレオチド、Ｍは、６〜１０の整数、Ｎは、０〜３の整数を表す。]
で示され、全長が１６〜３７ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチド（但し、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるものは除く。）と、
ＩＦＮ−βと、
を有効成分とする、肝炎の治療剤又は予防剤。
［２］ 上記ＩＦＮ−βは、天然型ＩＦＮ−β、遺伝子組換え型ＩＦＮ−β又は修飾されたＩＦＮ−βである、［１］記載の治療剤又は予防剤。
［３］ 上記肝炎は、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎である、［１］又は［２］記載の治療剤又は予防剤。
［４］ 上記オリゴヌクレオチドは、１６〜３５ヌクレオチド長であり、Ｍは、６〜８の整数を表す、［１］〜［３］のいずれか記載の治療剤又は予防剤。
［５］ 上記オリゴヌクレオチドは、１７〜２３ヌクレオチド長であり、前記式（１）中のＸＣＧＹは、９又は１０ヌクレオチド長の塩基配列を表す、［１］〜［４］のいずれか記載の治療剤又は予防剤。
［６］ 上記式（１）中のＸＣＧＹは、配列表の配列番号５９、６０又は６１に記載の塩基配列を含む、［１］〜［５］のいずれか記載の治療剤又は予防剤。
［７］ 上記オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号６、７、９〜１１、１５〜１８、２２、２４、２６、２８、４８、５０〜５２、５４、９５及び９７からなる群から選択される塩基配列からなる、［６］記載の治療剤又は予防剤。
［８］ 上記オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号３０に示される塩基配列からなる、［６］記載の治療剤又は予防剤。
［９］ 上記オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号４０又は４２に示される塩基配列からなる、［６］記載の治療剤又は予防剤。
［１０］ 上記式（１）中の（Ｇ）_Ｍ又は（Ｇ）_Ｎで示される領域に含まれるホスホジエステル結合のうち少なくともその一部がホスホロチオエート修飾されている、［１］〜［９］のいずれか記載の治療剤又は予防剤。

本発明によれば、従来のインターフェロン製剤と比べて安全で効果の高い肝炎の治療剤又は予防剤が提供される。本発明の肝炎の治療剤又は予防剤を用いることにより、より安全で効果的なＣ型肝炎の治療、及び予防が可能となる。
本発明の治療剤又は予防剤の有効成分の一つである免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ誘導活性が増強され、炎症性サイトカイン誘導活性が低減され、また、優れた免疫刺激活性を有するため、高い治療効果を有する。また、本発明において用いられる免疫刺激オリゴヌクレオチドは、炎症性サイトカイン誘導活性が低減されているため、生体に投与された場合、炎症による副作用誘発の危険性が少ない。本発明の治療剤又は予防剤は、マウスの肝炎モデルを用いた試験の結果、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて肝炎治療効果を有することも証明されている。更に、副作用の危険性が低減されているため、高用量の使用も可能である。すなわち、上記のような優れた効果を発揮する免疫刺激オリゴヌクレオチドをＩＦＮ−βと併用することにより、治療または予防効果のみならず安全面でも優れた肝炎の治療剤又は予防剤とすることができる。

図１−１は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図１−２は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。 図１−３は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図１−４は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。 図１−５は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図１−６は、実施例１において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。 図２は、実施例２において、マウスＪ７７４細胞株を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０産生量を測定した結果を示す図である。 図３−１は、実施例３において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド（Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３）及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプのＣｐＧ（Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）で刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図３−２は、実施例３において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド（Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３）及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプのＣｐＧ（Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）で刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。 図３−３は、実施例３において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド（Ｇ６／７−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ２）及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプのＣｐＧ（Ｇ２／３−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）で刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図４は、実施例４において、ヒトＰＢＭＣを本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図５−１は、実施例７において、ヒトＰＢＭＣを本発明及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図５−２は、実施例７において、ヒトＰＢＭＣを本発明及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図５−３は、実施例７において、ヒトＰＢＭＣを本発明及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図５−４は、実施例７において、ヒトＰＢＭＣを本発明及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図６は、実施例８において、ヒトＰＢＭＣを本発明及び公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図７−１は、実施例９において、マウス脾細胞を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプのＣｐＧで刺激し、培養上清中のＩＦＮ−γ産生量を測定した結果を示す図である。 図７−２は、実施例９において、マウス脾細胞を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプのＣｐＧで刺激し、培養上清中のＩＬ−１０産生量を測定した結果を示す図である。 図８−１は、実施例１０において、マウスＪ７７４細胞株を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド（Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３）及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプのＣｐＧ（Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）で刺激し、培養上清中のＩＬ−１２産生量を測定した結果を示す図である。 図８−２は、実施例１０において、マウスＪ７７４細胞株を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド（Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３）及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプのＣｐＧ（Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６）で刺激し、培養上清中のＴＮＦ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図９は、実施例１１において、マウスＪ７７４細胞株を本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチド及びパリンドロームモチーフが同一であるＤ−タイプのＣｐＧと公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激し、培養上清中のＴＮＦ−α産生量を測定した結果を示す図である。 図１０は、実施例１２において、本発明の免疫刺激オリゴヌクレオチドとＩＦＮ−βを含有する治療剤又は予防剤のＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａで誘発したマウスの肝炎モデルにおける血清中ＡＬＴ値の上昇に及ぼす影響について、ＩＦＮ−βをＩＦＮ−αに換えた場合の影響及び各インターフェロン単独の影響とを比較評価した結果を示す図である。 図１１は、実施例１３において、本発明の有効成分の一つであるペグ化インターフェロン−βのＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａで誘発したマウスの肝炎モデルで観察される肝臓の血流量低下に及ぼす影響について、各ＩＦＮ単独の影響を比較評価した結果を示す図である。

本発明は一つの実施形態として肝炎の治療剤または予防剤を提供する。本発明の肝炎の治療剤又は予防剤は、下記に説明する所定の配列を備えるオリゴヌクレオチドと、ＩＦＮ−βとを有効成分として含むことを特徴とする。本発明の肝炎の治療剤又は予防剤の一有効成分となるオリゴヌクレオチドは、
式（１）：５’−（Ｇ）_ＭＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）_Ｎ−３’
[式（１）中、Ｃは、シトシンを表す。Ｇは、グアニンを表す。Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、４塩基以上連続したグアニンを含まない０〜１０ヌクレオチド長の塩基配列を表す。但し、Ｘ＋Ｙの長さは、６〜２０ヌクレオチド長である。ＸＣＧＹは、少なくとも８ヌクレオチド長のパリンドローム配列を含む８〜２２ヌクレオチド長の塩基配列を表す。Ｐ及びＱは、それぞれ独立に、グアニン以外の１ヌクレオチドを表す。Ｍは、６〜１０の整数を表す。Ｎは、０〜３の整数を表す。]で示される配列を備え、その全長が１６〜３７ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドである（以下、これらの要件を満たすオリゴヌクレオチドを「式（１）のオリゴヌクレオチド」と表記する場合がある）。
なお、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるものは、本発明の肝炎の治療剤又は予防剤の有効成分からは除外される。

本発明の治療剤又は予防剤は、式（１）のオリゴヌクレオチドを有効成分の一つとして含む。本発明の治療剤又は予防剤の一有効成分としてのオリゴヌクレオチドは、その免疫刺激性に加え、ＩＦＮ−α単独又はＩＦＮ−β単独による治療効果よりも肝炎に対する治療効果を相乗的に高め得るものがより好適に用いられる。また、本発明の治療剤又は予防剤には、上記式（１）のオリゴヌクレオチドに加え、さらにポリＧ配列を付加されたＣｐＧ−Ａ（Ｄ−タイプのＣｐＧ）、ＣｐＧ−Ｂ（Ｋ−タイプのＣｐＧ）又はＣｐＧ−Ｃといった公知の配列を備える免疫刺激オリゴヌクレオチドを併用してもよい。

式（１）：５’−（Ｇ）_MＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）_N−３’において、「５’−」は５’末端を、「３’−」は３’末端を示す。また、上述の通り、Ｃはシトシンであり、Ｇはグアニンであり、ＸとＹは相互に独立した任意の配列及び長さからなる部分であり、ＰとＱは相互に独立した任意のヌクレオチドである。（Ｇ）_Mと（Ｇ）_Nは、それぞれグアニン（Ｇ）のみからなる連続する配列部分を示し、それぞれのＭとＮはグアニンの数を表す。すなわち、上記式（１）は、本発明の有効成分の一つである免疫刺激オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端の塩基配列を一般化して示したものある。なお、本明細書において、「オリゴヌクレオチド」とは、連続したデオキシリボヌクレオチドから構成されたポリヌクレオチドであり、「ＸＣＧＹ」で示される配列は、上記式（１）中のＸ、Ｃ、Ｇ、及びＹで構成される配列部分全体を意味し、「ＰＸＣＧＹＱ」で示される配列は、上記式（１）中のＰ、Ｘ、Ｃ、Ｇ、Ｙ、及びＱで構成される配列部分全体を意味する。また、上記式（１）に関し「長さ」とは、各配列部分を構成するヌクレオチドの数（ヌクレオチド長）を意味する。さらに、「Ｘ＋Ｙの長さ」とは、Ｘの長さとＹの長さの合計を意味するものとする。

上記式（１）中、ＸとＹの長さはそれぞれ０〜１０ヌクレオチド長の範囲である。特に、２〜６ヌクレオチド長であることが好ましい。Ｘ及びＹの配列はそれぞれ独立した任意のヌクレオチドからなるものであればよいが、４塩基以上の連続したグアニンが含まれないことが必要である。更に、Ｘ＋Ｙの長さは６〜２０ヌクレオチド長であることが必要である。６〜１２ヌクレオチド長が好ましく、７又は８ヌクレオチド長がより好ましく、８ヌクレオチド長が最も好ましい。なお、ＸとＹのヌクレオチド長は必ずしも同じでなくともよい。

上記式（１）中、ＸＣＧＹ配列には、パリンドローム配列が含まれることが必要であり、該パリンドローム配列の長さは、８ヌクレオチド長以上であることが必要である。ＸＣＧＹ配列は、８塩基以上のパリンドローム配列のみで構成されていてもよいし、ＸＣＧＹ配列の一部として８塩基以上のパリンドローム配列を含むものであってもよい。ＸＣＧＹ配列は、一部に８塩基以上のパリンドローム配列を含む限り、必ずしも完全に相補的でなくてもよい。すなわち、ＸＣＧＹ配列中に８塩基以上のパリンドローム配列を含む限り、ＸＣＧＹ配列中における該パリンドローム配列の位置は限定されず、また、該パリンドローム配列以外の部分にパリンドローム配列を構成しないヌクレオチドが付加されていてもよい。なお、パリンドローム配列とは、任意の２塩基の間の軸に対して左右対称に相補的な塩基から構成される塩基配列部分を意味し、回文配列とも別称されることがある。

上記式（１）中のＸＣＧＹ配列は、ＣＧＡＴＣＧ（配列番号５９）、ＡＴＣＧＡＴ（配列番号６０）及びＧＡＣＧＴＣ（配列番号６１）から選ばれるいずれか一つの塩基配列を含むことが好ましい。特に、ＣＧＡＴＣＧ（配列番号５９）を含むことが最も好ましい。これらの配列自体はパリンドローム配列であり、ＸＣＧＹ配列に含まれるパリンドローム配列はこれらの配列を一部として含むことが好ましい。

上記式（１）中のＸＣＧＹ配列に含まれるパリンドローム配列の例を以下に示す。ＸＣＧＹ配列が、８塩基配列のパリンドローム配列としては、ＣＣＧＡＴＣＧＧ（配列番号６２），ＧＣＧＡＴＣＧＣ（配列番号６３），ＡＣＧＡＴＣＧＴ（配列番号６４），ＣＡＴＣＧＡＴＧ（配列番号６５），ＧＡＴＣＧＡＴＣ（配列番号６６），ＡＴＣＧＣＧＡＴ（配列番号６７），ＧＡＡＣＧＴＴＣ（配列番号６８），ＣＡＡＣＧＴＴＧ（配列番号６９），ＡＧＣＧＣＧＣＴ（配列番号７０），ＡＣＧＴＡＣＧＴ（配列番号７１），ＴＡＧＣＧＣＴＡ（配列番号７２），ＡＣＧＧＣＣＧＴ（配列番号７３），ＣＧＡＣＧＴＣＧ（配列番号７４），ＣＧＴＣＧＡＣＧ（配列番号７５）が挙げられる。このうち、ＣＣＧＡＴＣＧＧ，ＧＣＧＡＴＣＧＣ，ＡＣＧＡＴＣＧＴ，ＣＡＴＣＧＡＴＧ，ＣＧＡＣＧＴＣＧが好ましい。ＸＣＧＹ配列が、１０塩基配列のパリンドローム配列としては、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号７６），ＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣ（配列番号７７），ＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧ（配列番号７８），ＧＡＴＣＧＣＧＡＴＣ（配列番号７９），ＧＣＡＡＣＧＴＴＧＣ（配列番号８０），ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣ（配列番号８１），ＣＡＧＣＧＣＧＣＴＧ（配列番号８２），ＧＡＣＧＴＡＣＧＴＣ（配列番号８３），ＣＴＡＧＣＧＣＴＡＧ（配列番号８４），ＣＣＣＧＡＴＣＧＧＧ（配列番号８５），ＧＡＣＧＧＣＣＧＴＣ（配列番号８６），ＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣ（配列番号８７），ＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡ（配列番号８８），ＡＣＧＴＣＧＡＣＧＴ（配列番号８９），ＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴ（配列番号９０）及びＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴ（配列番号９１）が挙げられる。このうち、ＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣ，ＣＣＣＧＡＴＣＧＧＧ，ＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡ，ＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣ，ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ，ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣ，ＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴが好ましい。なお、パリンドローム配列は、その長さが少なくとも８ヌクレオチド長ある配列であれば必ずしもこれらの具体例に限定されない。ＸＣＧＹ配列の長さは８〜２２ヌクレオチド長であり、この範囲でＸとＹのそれぞれの長さやパリンドローム配列の種類に応じて調製することができる。好ましくは、８〜１４ヌクレオチド長が好ましく、９又は１０ヌクレオチド長がより好ましく、１０ヌクレオチド長が最も好ましい。

上記式（１）中のＰ及びＱはグアニン以外の１ヌクレオチドである。具体的には、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）のいずれかである。上記式（１）中のＭは、６〜１０の整数であり、６〜８であることが好ましい。上記範囲を逸脱すると、ＩＦＮ誘導活性が不十分となるため好ましくない。また、Ｎは０〜３の整数である。上記範囲を逸脱すると、炎症性サイトカイン誘導活性を充分に低減させることができないので好ましくない。

上記式（１）で示されるオリゴヌクレオチドの全長は、１６〜３７ヌクレオチド長であり、上記式（１）中のＭやＮ、ＸやＹの長さ等により異なる。上記の通りＭが６〜８の範囲であるときは６〜３５ヌクレオチド長である。また、上記式（１）中のＸＣＧＹ配列の長さが９又は１０ヌクレオチド長の場合には１７〜２３ヌクレオチド長である。

上記治療剤又は予防剤の有効成分の一つであるオリゴヌクレオチドの塩基配列の例として、好ましくは、ＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧ（配列番号９７：Ｍｏｄ９２），ＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧＧ（配列番号２８：Ｍｏｄ４６），ＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＧＡＴＣＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２：Ｍｏｄ４３），ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡＡＧＧＧ（配列番号２４：Ｍｏｄ４４），ＧＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧ（配列番号２６：Ｍｏｄ４５），ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号３０：Ｍｏｄ４７），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧ（配列番号６：Ｍｏｄ５３），ＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧＧ（配列番号７：Ｍｏｄ５４），ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧ（配列番号９：Ｍｏｄ４０），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧ（配列番号１０：Ｍｏｄ５５），ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧ（配列番号１１：Ｍｏｄ４１），ＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡ（配列番号１５：Ｍｏｄ６１），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡ（配列番号１６：Ｍｏｄ６２），ＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡ（配列番号１７：Ｍｏｄ６３），ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡ（配列番号１８：Ｍｏｄ６４），ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧ（配列番号４０：Ｍｏｄ７１）及びＧＧＧＧＧＧＡＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧＧ（配列番号４２：Ｍｏｄ７３）を挙げることができるが、必ずしもこれに限定されない。また、例えば、上記式（１）：５’−（Ｇ）_ＭＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）_Ｎ−３’のＭが７でＮが２である場合、ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号４３），ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＧＧ（配列番号４４），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧ（配列番号４５），ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧ（配列番号４６），ＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＣＧＧ（配列番号４７），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧ（配列番号４８：Ｍｏｄ８４），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＴＧＧ（配列番号４９），ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧ（配列番号５０：Ｍｏｄ８５），ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＴＧＧ（配列番号５１：Ｍｏｄ８３），ＧＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧ（配列番号５２：Ｍｏｄ８７），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＴＡＧＧ（配列番号５３），ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号１００），ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号１０１）及びＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧ（配列番号１０２），ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧ（配列番号１０５）であってもよく、さらに、上記式（１）のＭが７でＮが３である場合、ＧＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧ（配列番号５４），ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧ（配列番号９４），ＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧ（配列番号９９）及びＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＧ（配列番号１０７）、Ｍが８でＮが１である場合、ＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号９５：Ｍｏｄ９３），ＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号９６），ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧ（配列番号１０３）及びＧＧＧＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧ（配列番号１０４）であってもよい。また、上記式（１）のＭが８でＮが０である場合、ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣ（配列番号１０６）であってもよい。

配列表の配列番号６、７、９〜１１及び１５〜１８、２２、２４、２６、２８、３０、４０、４２、４８、５０〜５２、５４、９５及び９７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、上記式（１）において、ＰＸＣＧＹＱ配列の条件を満たすが、その他の条件を満たさないＤ−タイプのＣｐＧ配列よりもＩＦＮ誘導活性が増強され、炎症性サイトカイン誘導活性が低減することが確認されている。すなわち、ＩＦＮ誘導活性においては、オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフを含むパリンドローム配列が必須であるが、ＩＦＮ誘導活性の増強と炎症性サイトカイン誘導活性の低減においては、その外側に付加するポリＧ配列の塩基数が重要である。したがって、上記式（１）のオリゴヌクレオチドの最も重要な部分は、ポリＧ配列と特定のパリンドローム配列との組み合わせではなく、最適なポリＧ配列の付加様式である。また、列挙したオリゴヌクレオチドのうち、配列番号６、７、１０及び１５〜１７、２４、２６、２８、４８及び５０〜５２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、中でも、配列番号６、７、１０、２８、４８及び５０〜５２のオリゴヌクレオチドは、強いインターフェロン（ＩＦＮ）誘導活性を有しており、特に好ましい。

上記式（１）のオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合、各ヌクレオチドのリボース糖部、塩基部のうちの全て又は一部が化学修飾されていてもよい。但し、ＸＣＧＹ配列のシトシン（Ｃ）のメチル化は免疫刺激活性が消失するので好ましくない。このような修飾された免疫刺激オリゴヌクレオチドの好適な実施形態としては、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合におけるリン酸基の酸素原子の置換及び／又は修飾であり、例えばホスホロチオエート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、メチルフォスフォネート（Ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）及びフォスフォラミデート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）を挙げることができる。好ましい実施形態としては、上記式（１）中の（Ｇ）_Ｍおよび（Ｇ）_Ｎで示される領域に含まれるホスホジエステル結合のうち、少なくともその一部がホスホロチオエート修飾されている形態が挙げられる。ホスホロチオエート修飾は、５'−末端のポリＧ配列（上記式（１）中の（Ｇ）_Ｍ）の一部又は全てのヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合においてなされていることが好ましい。５'−末端のポリＧ配列については、該配列を構成するすべての塩基間又は最末端のホスホジエステル結合においてホスホロチエート修飾がなされていることが好ましい。３'−末端のポリＧ配列（上記式（１）中の（Ｇ）_Ｎ）については、最末端の塩基を除く一部又は全ての塩基間のホスホジエステル結合においてホスホロチオエート修飾がなされていることが好ましい。また、上記式（１）におけるＮ＝０又は１のオリゴヌクレオチドはグアニン以外の３’−末端側のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されていてもよい。さらには、５’−末端のポリＧ配列と３’−末端側の最末端のホスホジエステル結合がホスホロチオエート修飾されていることが好ましい。例えば、上記式（１）：５’−（Ｇ）_ＭＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）_Ｎ−３’のＭが７でＮが２であるＧＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧ（配列番号５２：Ｍｏｄ８７）の場合、５’−末端が全てホスホロチオエート修飾されたポリＧ配列（以下、ホスホロチオエート修飾されたＧをｇと表記する）を有するｇｇｇｇｇｇｇＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧ、５’−末端のみホスホロチオエート修飾されたポリＧ配列を有するｇＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧ、５’−末端の２塩基のみホスホロチオエート修飾されたポリＧ配列を有するｇｇＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＧ、５’−末端が全てホスホロチオエート修飾されたポリＧ配列と３’−末端がホスホロチオエート修飾されたｇｇｇｇｇｇｇＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡｇＧ、両末端のみホスホロチオエート修飾されたｇＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡｇＧ、５’−末端の２塩基と３’−末端がホスホロチオエート修飾されたｇｇＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡｇＧが好ましい。さらに、免疫刺激活性を有する限りにおいては、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシン（上記式（１）中の中央部のＣ）においてメチル化以外の化学修飾がされていてもよい。

ホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドの分解は、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼにより媒介される。ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されることによりこれらのヌクレアーゼに対して抵抗性を獲得することが知られている。一部のヌクレオチド残基間が修飾されているオリゴヌクレオチドとしては、例えば、５'及び３'末端のヌクレオチド間がホスホロチオエート修飾結合を有するオリゴヌクレオチドやポリＧ配列のヌクレオチド間がホスホロチオエート修飾結合を有するオリゴヌクレオチドがあり、エキソヌクレアーゼに耐性を有する。また、全てのヌクレオチド残基間がホスホロチオエート修飾されているオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに抵抗性を有する。ヌクレアーゼ耐性のＣｐＧオリゴヌクレオチドは安定であり、例えば、標的受容体に作用する時間の延長や一定の濃度を維持する結果、増強された免疫刺激活性を示す。

なお、上記式（１）のオリゴヌクレオチドは、上述した配列に関する要件を満たしていれば、免疫刺激活性、具体的には増強されたＩＦＮ誘導活性と低減された炎症性サイトカイン誘導活性を有する限り、核酸以外の分子が結合されていてもよい。

本発明において、オリゴヌクレオチドが免疫刺激活性を有するとは、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導活性が増強され、かつ炎症性サイトカイン誘導活性が低減されることを意味する。ここで、炎症性サイトカインとはインターロイキン−１２（以下、ＩＬ−１２という）、腫瘍壊死因子−α（以下、ＴＮＦ−αという）、インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６）及びインターロイキン−１β（以下、ＩＬ−１βという）を意味する。炎症性とは、組織における発熱の誘導や細胞の浸潤及び活性化を引き起こす性質を言う。一方、免疫抑制性とは上記の炎症反応を抑制するような機能あるいは性質を有することを表す。インターロイキン−１０（以下、ＩＬ−１０という）は、免疫抑制性サイトカインの一つであり、機能的に炎症性サイトカインとは異なる。ＩＦＮ誘導活性或いは炎症性サイトカイン誘導活性とは、例えば、ヒトにおいては平均的な反応性を有するヒト検体の末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣと表記する場合がある）、マウスにおいては骨髄由来樹状細胞あるいは脾細胞あるいはＣｐＧ配列を有する免疫刺激オリゴヌクレオチドに感受性の単球系細胞株Ｊ７７４やＲＡＷ２６４．７からの各サイトカイン産生を誘導する作用のことを示す。本発明においては、ヒト末梢血単核球（以下、ヒトＰＢＭＣ）における免疫刺激オリゴヌクレオチド処置によるＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γの産生誘導を指標とした活性として示すことができる。また、マウス脾細胞における免疫刺激オリゴヌクレオチド処置によるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０の産生誘導を指標とした活性として示すことができる。更に、マウス樹状細胞及びＪ７７４細胞株において免疫刺激オリゴヌクレオチド処置によりインターロイキン−１２ｐ４０（以下、ＩＬ−１２ｐ４０という）及びＴＮＦ−αの産生誘導を指標とした活性として示すこともできる。また、本発明において、いくつかの免疫刺激オリゴヌクレオチド配列の活性を比較する際に用いる、増強されたＩＦＮ誘導活性とは、上記細胞を免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激した場合に他よりも低濃度において多量のＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γを誘導することを表わす。一方、低減された炎症性サイトカイン誘導活性とは、上記細胞を免疫刺激オリゴヌクレオチドで刺激した場合に他よりも少量のＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−αを誘導することをいう。

上記式（１）のオリゴヌクレオチドによるＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−αのｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導活性を評価する試験の具体的方法を以下に示す。被検体のオリゴヌクレオチドは、ＰＢＳ（−）で溶解した後、１０％ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳという）入りのＲＰＭＩ１６４０培地で希釈して使用する。ヒト血液からＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７を用いた密度勾配遠心を２０００ｒｐｍ，室温で２５分間行い、ＰＢＭＣを単離する。単離したＰＢＭＣを１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地で１ｍＬあたり４．０×１０^６個の細胞が含まれるように調製後、丸底の９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり４．０×１０^５個の細胞を播き、免疫刺激オリゴヌクレオチドの存在下で２４時間、又は７日間刺激し、それぞれ培養上清を回収する。ＩＦＮαとＩＦＮγの産生量は、２４時間と７日間刺激後それぞれの培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法にて定量する。

上記式（１）のオリゴヌクレオチドによるＰＢＭＣからのＩＬ−１２及びＴＮＦ−αのｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導活性を評価する試験の具体的方法を以下に示す。被検体のオリゴヌクレオチドは、ＰＢＳ（−）で溶解した後、１０％ＦＣＳ入りのＲＰＭＩ１６４０培地で希釈して使用する。ヒト血液からＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７を用いた密度勾配遠心を２０００ｒｐｍ，室温で２５分間行い、ＰＢＭＣを単離する。単離したＰＢＭＣを１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地で１ｍＬあたり２．０×１０^６個の細胞が含まれるように調製後、平底の９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり２．０×１０^５個の細胞を播き、免疫刺激オリゴヌクレオチドの存在下で８時間、又は２４時間刺激し、それぞれ培養上清を回収する。ＩＬ−１２及びＴＮＦ−αの産生量は、８時間と２４時間刺激後それぞれの培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法にて定量する。

上記式（１）のオリゴヌクレオチドによるマウス脾細胞からのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０産生誘導の有無を確認する手段として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導評価試験が挙げられる。具体的方法を以下に示す。被検体となるオリゴヌクレオチドは、ＰＢＳ（−）で溶解した後、１０％ＦＣＳ入りのＲＰＭＩ１６４０培地で希釈して使用する。１０〜２５週齢のＣＬ５７ＢＬ／６Ｎマウス（雄）の脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０／ＦＣＳ １０％の入ったシャーレに移す。擦り付きスライドガラス２枚を用いて脾臓をすり潰し、セルストレイナーで漉しながら丸底遠沈管に移す。１０００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心し、上清を捨てて、５ｍＬの溶血バッファー（０．８３％ ＮＨ₄Ｃｌと１７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６５を９対１で混合して調製する）を加え、ピペッティング操作で細胞塊をほぐして懸濁する。５分間室温でインキュベーションしたのち、５ｍＬの培養液を加えて転倒混和し、１０００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心する。上清を捨てて、１０ｍＬの培養液を加え、ピペッティング操作で細胞塊をほぐして懸濁した。洗浄操作を２回繰り返したのちに、培養液で再懸濁して、トリパンブルーを用いて細胞数をカウントして、１ｍＬあたりの生細胞数が４×１０⁶となるように調製する。丸底の９６穴プレートに１ウェルあたり４．０×１０⁵個の細胞となるように播き、被検体のオリゴヌクレオチドを添加して３日間刺激する。刺激終了後、培養上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０の濃度をＥＬＩＳＡ法にて定量する。

上記式（１）のオリゴヌクレオチドによるマウスＪ７７４細胞からのＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−α産生誘導の有無を確認する手段として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導評価試験が挙げられる。被検体のオリゴヌクレオチドは、ＰＢＳ（−）で溶解した後、１０％ＦＣＳ入りのＲＰＭＩ１６４０培地で希釈して使用する。Ｊ７７４細胞株は培養液（ＲＰＭＩ１６４０，ＦＣＳ １０％，５０μＭ ２−ＭＥ）で１ｍＬあたりに１×１０⁶個となるように調製する。平底９６穴マルチプレートに１ウェルあたり１．０×１０⁵個の細胞となるように播き、被検体のオリゴヌクレオチドを添加して４時間あるいは８時間あるいは４８時間刺激する。刺激終了後、培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０及びＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡ法にて定量する。

上記式（１）のオリゴヌクレオチドは、従来技術又は核酸合成装置で合成できる。これらの合成方法は、酵素的方法や化学的方法等を含むが、必ずしもこれに限定されるものではない。また、修飾されたオリゴヌクレオチドも従来の技術において合成される。例えば、オリゴヌクレオチドホスホルアミデートを硫黄で処理することにより、ホスホロチオエート修飾されたオリゴヌクレオチドが得られるが、必ずしもこれに限定されるものではない。これらのオリゴヌクレオチドの合成技術、修飾技術は本明細中に引用されている特許文献、非特許文献においても用いられており、その他にも多数の報告が確認される公知の技術である。

上記の治療剤又は予防剤に含まれるＩＦＮ−βとしては、特に限定されないが、天然型であっても遺伝子組換え型であってもよい。更に、インターフェロンにポリエチレングリコール（ペグ）などの高分子体を結合させたペグ化ＩＦＮ−βであってもよい。これらのＩＦＮ−βは、細胞表面上にある共通の受容体に結合し作用することが知られている。ＩＦＮ−β自体は、周知であり、市販もされているので、ヒトの治療に対し市販のＩＦＮ−βを好ましく用いることができる。ペグ化ＩＦＮ−βについても現在基礎検討段階だが、同様に用いることができる。

本発明の一実施形態としては、免疫刺激オリゴヌクレオチドを投与することを特徴とする、ＩＦＮ−βの肝炎治療効果を高める方法も提供される。ＩＦＮ−βと上記式（Ｉ）のオリゴヌクレオドの患者への投与は同時であることが好ましいが、ＩＦＮ−βの単独処置、又は上記式（１）のオリゴヌクレオチド以外の抗ウイルス剤とＩＦＮ−βとの併用処置と比べて高い治療効果を有する限り必ずしも同時である必要はなく、効果的なタイミングで連続的に投与してもよい。具体的には、免疫刺激オリゴヌクレオドをＩＦＮ−β処置の前後に投与してもよい。

さらに、本発明の肝炎の治療剤又は予防剤を好適に用い得る症例としては、例えば、免疫系の活性化を伴う肝炎、非ウイルス性の肝炎及び／又はウイルス性肝炎などが挙げられ、さらに好ましくはＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染によるＢ型肝炎及び／又はＣ型肝炎などが挙げられる。

本明細書において、ＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染の症状には、急性及び慢性の肝炎を成因とする症状が含まれる。ウイルス性肝炎の臨床症状は、黄疸、腹痛、倦怠感、吐き気、及び嘔吐、並びに肝炎に関係する臨床的／検査所見、肝酵素レベルの上昇（例えば、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及び／又は乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ））、ビリルビンの上昇、ＨＣＶウイルス血症又は抗原レベル、門脈圧亢進症及び食欲不振等の上昇、肝血流量の低下を含むが必ずしもこれに限定されない。

上記本発明の治療剤又は予防剤のＢ型肝炎及び／又はＣ型肝炎の治療効果は、上記した臨床症状（例として黄疸、倦怠感、腹痛）、肝炎関連の検査所見（例として血中肝酵素レベル）、ウイルス増幅及び複製、あるいはウイルスの量（力価）を指標として評価しうる。すなわち、本発明の治療剤又は予防剤による治療を行わなかった個体と比較し、本発明の治療剤又は予防剤を用いて治療をした個体は、Ｂ型肝炎及び／Ｃ型肝炎の臨床症状の消失、寛解、改善あるいは症状の程度の軽減、さらには罹患期間の短縮が期待できる。肝炎関連の検査所見やウイルス複製及びウイルス量についても治療効果として反映されうる。ウイルス力価の減少は、感染部位又は個体からのウイルスの排除を含む。

評価の方法としては、症状の検出、臨床検査による肝機能の計測、肝生検、肝門脈圧の直接的又は間接的計測や肝血流量測定、及びウイルス粒子、ウイルス核酸又はウイルス抗原力価の計測、そして抗ウイルス抗体の検出及び計測を含む本技術分野で知られるいずれかの手段が選択されうる。腹痛及び倦怠感等の自覚的な身体的症状は症状の有無により判定し、黄疸は定性ベース、ビリルビンの血中又は血清中レベルの計測により定量化する。肝炎に関する検査所見、例えば、血液あるいは血清中の肝酵素ＡＳＴ及びＡＬＴ量は、血液学的、血液生化学的及び組織学的試験により計測する。血液又は血清サンプル中のウイルス力価は当該技術領域における周知の方法、例えばウイルス粒子の定量化（例えば分離及び可視化によるか又はＤＮａｓｅ抵抗性粒子のアッセイ）、血液又は血清サンプル中のウイルス抗原の検出（ＥＬＩＳＡ法による抗原量の定量化）、血液又は血清サンプル中の抗ウイルス抗体の検出、又はウイルス核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）の検出（ＨＣＶ遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅あるいはウイルス特異的プローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）により計測する。肝組織生検においても上記方法で評価可能である。

上記本発明の治療剤又は予防剤は、肝炎の治療又は予防の少なくとも一方の用途に用い得る。また、上記の治療剤又は予防剤は、当初、肝炎発症に対する予防目的で使用を開始し、患者が発症してしまった場合に引き続き肝炎の治療目的で使用してもよい。すなわち、上記の治療剤又は予防剤を治療と予防の双方の目的で使用してもよい。さらに、予防剤としての使用は、再発予防であってもよい。また、治療目的は、その根治に限らず、症状の改善を目的とする使用も含む。
より具体的には、本発明の治療剤又は予防剤は、ＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染の可能性のある個体（例としては身体的症状のない場合やＨＣＶキャリアーである母体内の胎児）、ＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染の認められた個体、上記したＢ型肝炎及び／又はＣ型肝炎の臨床症状を伴う個体（例えば、慢性肝炎や初期感染あるいは慢性感染後の再発等による急性肝炎を含む）に投与されうる。ＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染あるいはその症状の程度により、治療剤又は予防剤の投与はさまざまな回数でなされる。また、上記の治療剤又は予防剤を用いた治療は、インターフェロン単独療法やその他の抗ウイルス剤等の治療（及びその効果）が不十分であった個体あるいは不成功に終わった個体にも用いられうる。さらに、上記の治療剤又は予防剤は単回又は複数回投与されうる。

本発明の治療剤又は予防剤の投与量は、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスによる疾患の治療又は予防に有効な量であればよく、疾患の種類や程度、投与経路等により適宜選択されるが、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスの感染による疾患であるＣ型肝炎に対しては、通常、成人１日当たり、インターフェロンが１０万〜１，０００万国際単位（以下、国際単位をＩＵという）、好ましくは１００〜６００万ＩＵ程度である。さらに、本発明によりＩＦＮの効果が増強されること及びＩＦＮの投与量を低減できる可能性があることから、１，０００〜１０万ＩＵであってもよい。免疫刺激オリゴヌクレオチドは、患者の症状、治療目的、投与経路等により適宜選択されるが、通常、成人１日当り、オリゴヌクレオチド量として、０．１ｐｍｏｌ〜１０μｍｏｌ、好ましくは１ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌ程度である。

ＩＦＮ−βの投与経路は、特に限定されないが、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等の非経口投与が好ましい。免疫刺激オリゴヌクレオチドの投与経路は、特に限定されないが、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射、患部組織への注入、経口投与、経鼻投与、経眼投与等、経咽頭投与、経肺投与、経皮投与、舌下投与などが好ましい。

本発明の治療剤又は予防剤は、上記した２種の有効成分を１つの組成物中に含む１剤系の薬剤であってもよいし、２種の有効成分を別々の組成物中に含む２剤系の薬剤であってもよい。

本発明の治療剤又は予防剤は、上記の有効成分のみを含むものであってもよいが、一般に製剤分野において許容される各種の賦形剤や添加剤と共に製剤することが好ましい。例えば生理緩衝液中に上記の有効成分を含むものを例示することができる。また、他の薬剤、例えば他の抗ウイルス剤や、炎症に対する対症療法剤等を添加してもよい。

以下に実施例を詳細に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下の説明文中で使用されている免疫刺激オリゴヌクレオチドの配列の略号及び特性は、配列表に記載されている。また、実施例中に記載されている公知の免疫刺激オリゴヌクレオチドの配列、略号及び特性は表１に示した。

（実施例１）：ヒトＰＢＭＣにおける免疫刺激オリゴヌクレオチドのＩＦＮ誘導活性に必須な５'末端側ポリＧ配列の塩基数の比較
種々の塩基数からなるポリＧ配列を付加したＣｐＧオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＦＮ誘導活性に必須な長さについて検討した。徳永らが示しているパリンドローム配列ＣＧＡＴＣＧ（特開平４−３５２７２４号公報の配列４９及び配列１５）を含むパリンドローム配列ＴＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡの外側の両末端又は５’末端側のみにホスホロチオエート修飾されたポリＧ配列を含むオリゴヌクレオチドを付加した免疫誘導オリゴヌクレオチド２０種を構築した（配列番号１〜２０）。なお、Ｍｏｄ２（配列番号１）及びＭｏｄ３３（配列番号５）については国際公開２００６／０３５９３９パンフレットにおいて、ＩＦＮ誘導活性を有することが示されている。そしてこれらの配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γ産生の誘導活性を有するものをスクリーニングした（図１−１〜図１−６、表２）。ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γ誘導活性の評価は、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γのｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導活性を評価する試験の具体的方法として示した手順及び条件に従い、それぞれ２４時間刺激及び７日間刺激した培養上清中の産生量をもとに評価した。

表２に表示されたＩＦＮ産生量は免疫刺激オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（終濃度）における値である。図及び表中の配列中の小文字はホスホロチオエート修飾塩基を表わす。図中「ｍｏｃｋ」と記載された処置は、本発明の有効成分の一つであるＣｐＧオリゴヌクレオチドを溶かす溶媒として用いたＰＢＳ（−）による処置のことである。

図１−１及び図１−２は、Ｍｏｄ２（配列番号１：レーン２）、Ｍｏｄ５２（配列番号２：レーン３）、Ｍｏｄ５１（配列番号３：レーン４）、Ｍｏｄ４２（配列番号４：レーン５）、Ｍｏｄ５３（配列番号６：レーン６）、Ｍｏｄ５４（配列番号７：レーン７）、Ｍｏｄ５６（配列番号８：レーン８）、Ｍｏｄ４０（配列番号９：レーン９）、及びＭｏｄ５５（配列番号１０：レーン１０）の、各オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（終濃度）の際のＩＦＮ−α産生量、及び同濃度が３００ｎＭ（終濃度）の際のＩＦＮ−γ産生量の結果をそれぞれ示す。ＩＦＮ−α誘導活性（表２及び図１−１）に関し、３’末端にポリＧ配列が３塩基（Ｎ＝３）ある群（図１−１、レーン３〜７）では、５’末端にポリＧ配列が６塩基以上（Ｍは７以上）持つものの活性が高かった（レーン６及び７）。また３’末端にポリＧ配列が２塩基（Ｎ＝２）ある群（レーン８〜１０）では、５’末端にポリＧ配列を６塩基以上持つものの活性が高かった（レーン９、１０）。さらに、典型的なＤ−タイプのＣｐＧ配列の構造（Ｍ＝２／Ｎ＝６、レーン２）を有するＭｏｄ２と比較して、Ｍｏｄ５２（Ｍ＝３／Ｎ＝３、レーン３）、Ｍｏｄ５１（Ｍ＝４／Ｎ＝３、レーン４）及びＭｏｄ４２（Ｍ＝５／Ｎ＝３、レーン５）の活性は減弱あるいは完全に消失することから、Ｍｏｄ２のポリＧ配列中４乃至６の数塩基を変換した配列を設計するだけでは必ずしも増強されたＩＦＮ−α誘導活性を有するオリゴヌクレオチドが得られるわけではないことが判明した。ＩＦＮ−γ誘導活性（図１−２）についても、Ｍｏｄ５６（配列番号８、Ｍ＝５／Ｎ＝２、レーン８）を除き、同様の傾向であった。特に、Ｍｏｄ５３（Ｍ＝７／Ｎ＝３、レーン６）、Ｍｏｄ５４（Ｍ＝８／Ｎ＝３、レーン７）とＭｏｄ５５（Ｍ＝７／Ｎ＝２、レーン１０）のＩＦＮ−γ誘導活性は、３’末端のポリＧ配列の長さが６塩基であるＭｏｄ２よりも有意に向上した（ｔ検定：Ｐ＜０．０１）。この結果は、オリゴヌクレオチドのＩＦＮ誘導活性は５’末端側に依存し、少なくとも６塩基以上の長さのポリＧ配列が必要であることを示している。

次に、５’末端のポリＧ配列の長さとＩＦＮ誘導活性との関連について明らかにするため、２０塩基までのポリＧ配列を５’末端に付加したオリゴヌクレオチドについてＩＦＮ誘導活性を評価した（図１−３及び図１−４）。図１−３及び図１−４には、Ｍｏｄ２（レーン１）、Ｍｏｄ６１（配列番号１５：レーン２）、Ｍｏｄ６２（配列番号１６：レーン３）、Ｍｏｄ６３（配列番号１７：レーン４）、Ｍｏｄ６４（配列番号１８：レーン５）、Ｍｏｄ６５（配列番号１９：レーン６）、及びＭｏｄ６６（配列番号２０：レーン７）の、各オリゴヌクレオチドの濃度が３００ｎＭ（終濃度）の際のＩＦＮ−α産生量とＩＦＮ−γ産生量をそれぞれ示す。その結果、濃度３００ｎＭにおいて、８塩基までのポリＧ配列を持つもののＩＦＮ−α誘導活性は有意に向上し(図１−３、Ｍ＝６〜８／Ｎ＝０、レーン２〜４)、塩基数１０のポリＧ配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｍ＝１０／Ｎ＝０）はＭｏｄ２を若干上回る活性を示した(図１−３、レーン５)。一方、１２塩基以上（Ｍ＝１２ ｏｒ ２０／Ｎ＝０）では殆ど活性が消失した(レーン６、７)。また、ＩＦＮ−γ誘導活性は、ＩＦＮ−α誘導活性と同様の傾向であったが、ポリＧ配列が１２塩基以上でも従来のＤ−タイプのＣｐＧ配列のＭｏｄ２と同程度の活性であった（図１−４、レーン１、６、７）。

さらに、３’末端のポリＧ配列の塩基数とＩＦＮ誘導活性との関連について評価した。図１−５及び図１−６には、Ｍｏｄ２（レーン２）、Ｍｏｄ５０（配列番号１４：レーン３）、Ｍｏｄ４９（配列番号１３：レーン４）、Ｍｏｄ４０（レーン５）、Ｍｏｄ４１（配列番号１１：レーン６）の、各オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（終濃度）の際のＩＦＮ−α産生量と、同濃度が３００ｎＭ（終濃度）の際のＩＦＮ−γ産生量とを、それぞれ示す。５’末端のポリＧ配列の長さを２塩基（Ｍｏｄ２：Ｍ＝２／Ｎ＝６、レーン２）から６塩基（Ｍｏｄ５０：Ｍ＝６／Ｎ＝６、レーン３）にするとＭｏｄ５５（Ｍ＝７／Ｎ＝２、図１−１及び図１−２のレーン１０参照）と同程度にＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γの産生量は増加した（表２、図１−５及び１−６）。５’末端側に６塩基のポリＧ配列を有するオリゴヌクレオチド（Ｍ＝６／Ｎ＝０〜６）のＩＦＮ−α誘導活性は、３’末端側のポリＧ配列の長さにも依存する傾向を示したが、完全に消失することなく、Ｍｏｄ２を超えていた（図１−５、レーン３〜６）。また、各オリゴヌクレオチドの濃度３００ｎＭにおけるＩＦＮ−γ誘導活性は、いずれもＭｏｄ２を超えていた（図１−６、レーン２〜６）。

以上の結果から、５'末端側のポリＧ配列の塩基数（Ｍ）が６〜１０、好ましくは６〜８である場合、３'末端側にポリＧ配列が全くないオリゴヌクレオチド（Ｍ＝６〜８／Ｎ＝０）であっても、上記式（１）中のＰＸＣＧＹＱ部分が同一である従来のＤ−タイプのＣｐＧ配列よりも増強されたＩＦＮ誘導活性を有することを確認した。

（実施例２）：マウスＪ７７４細胞における免疫刺激オリゴヌクレオチドの炎症性サイトカイン誘導活性に必須な３'末端側ポリＧ配列の塩基数の比較
５'末端側に長さが６塩基のポリＧ配列を付加した免疫刺激オリゴヌクレオチドについて、前述したマウスＪ７７４細胞のＩＬ−１２ｐ４０産生誘導の有無を確認する手段としてのｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導評価試験を行った。すなわち、Ｊ７７４細胞株を各オリゴヌクレオチドで４８時間刺激し、培養上清中の炎症性サイトカインＩＬ−１２（ＩＬ−１２ｐ４０）の産生量を評価した。その結果、（Ｍｏｄ５０（レーン２）、Ｍｏｄ４９（配列番号１３：レーン３）、Ｍｏｄ４８（配列番号１２：レーン４）、Ｍｏｄ３３（配列番号５：レーン５）、Ｍｏｄ４０（レーン６）、Ｍｏｄ４１（レーン７））の、それぞれの終濃度３００ｎＭにおけるＩＬ−１２ｐ４０の産生は、３'末端側のポリＧ配列の塩基数が４以上（Ｍ＝６／Ｎ＝４〜６：レーン２〜４）で誘導されたが、３塩基以下（Ｍ＝６／Ｎ＝０〜３：レーン５〜７）では全く活性が認められなかった（図２）。

以上の結果から、３'末端側のポリＧ配列が３塩基以下のオリゴヌクレオチドは、５'末端側に６塩基のポリＧ配列が付加されていても炎症性サイトカイン誘導活性が低減あるいは消失することを確認した。

（実施例３）：パリンドロームモチーフとしてＣＧＡＴＣＧ、ＡＴＣＧＡＴ及びＧＡＣＧＴＣを有する配列を含む新規な免疫刺激オリゴヌクレオチド及びＤ−タイプのＣｐＧオリゴヌクレオチドのヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ産生誘導効果の比較
式（１）：５’−（Ｇ）_ＭＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）_Ｎ−３’におけるＰがＴ（チミン）、ＱがＡ（アデニン）であり、ＸＣＧＹが１０塩基である６種のパリンドロームモチーフに、それぞれポリＧ配列が５'末端側に６塩基と３'末端側に３塩基を付加したオリゴヌクレオチド（Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３、Ｍ＝６／Ｎ＝３）及びポリＧ配列が５'末端側に２塩基で３'末端側に６塩基付加したＤ−タイプのＣｐＧ配列（Ｄ−ｔｙｐｅ ＣｐＧ： Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６、Ｍ＝２／Ｎ＝６）からなるオリゴヌクレオチドを合成し、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性を評価した。それぞれのオリゴヌクレオチドのパリンドロームモチーフは、配列表、図３−１、及び３−２、及び３−３中で示されており、Ｍｏｄ２９（配列番号２１）及びＭｏｄ４３（配列番号２２）はレーン１のＣＣＣＧＡＴＣＧＧＧ、Ｍｏｄ３７（配列番号２３）及びＭｏｄ４４（配列番号２４）はレーン２のＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡ、Ｍｏｄ３８（配列番号２５）及びＭｏｄ４５（配列番号２６）はレーン３のＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣ、Ｍｏｄ３９（配列番号２７）及びＭｏｄ４６（配列番号２８）はレーン４のＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ、Ｄ１９（配列番号２９）及びＭｏｄ４７（配列番号３０）はレーン５のＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣである。なお、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の評価は、上述のオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例１と同様の手順及び条件にて行った。

濃度１００ｎＭにおける各オリゴヌクレオチドの活性を測定した結果、Ｇ６−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ３のオリゴヌクレオチドは、評価した全てのパリンドロームモチーフにおいて、Ｇ２−ＰＸＣＧＹＱ−Ｇ６（Ｄ−タイプのＣｐＧ）よりもＩＦＮ−αの誘導活性が亢進し（図３−１）、Ｄ−タイプのＣｐＧの１．４〜７４．５倍の範囲で増強された。また、上記オリゴヌクレオチドの濃度１００ｎＭにおけるＩＦＮ−γ産生誘導活性についても、ＩＦＮ−αと同様な傾向を示した（図３−２）。

さらに、上記式（１）中のＰがＡ（アデニン）、ＱがＣ（シトシン）あるいはＴ（チミン）であり、８塩基のパリンドロームモチーフＣＧＡＣＧＴＣＧを含む、２種の免疫刺激オリゴヌクレオチドとＤ−タイプのＣｐＧのヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α誘導活性を評価した。その結果、Ｍｏｄ７１（配列番号４０、Ｍ＝７／Ｎ＝２）とＭｏｄ７３（配列番号４２、Ｍ＝６／Ｎ＝２）は、濃度３００ｎＭにおいて、それぞれのＤ−タイプのＣｐＧ配列であるＭｏｄ７０（配列番号３９、Ｍ＝３／Ｎ＝６）とＭｏｄ７２（配列番号４１、Ｍ＝２／Ｎ＝６）よりも活性が顕著に増強された（図３−３）。

これらの結果は、本発明で用いられる新規な免疫刺激オリゴヌクレオチドの有するポリＧ配列の付加様式が、特定のパリンドローム構造に非依存的にＩＦＮ誘導活性を増強することを示している。

（実施例４）：パリンドロームモチーフとしてＣＧＡＴＣＧを有する免疫刺激オリゴヌクレオチドのヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α産生誘導効果
本発明において有効成分の一つとして用いられる上記式（１）のオリゴヌクレオチドの好ましい配列についてさらに詳細に検討した。本実施例４においては、Ｍ＝７且つＮ＝２であり、ＸＣＧＹ配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣであるオリゴヌクレオチドのＰとＱについて、さらに検討した。ＰがＡ（アデニン）かつＱがＴ（チミン）のオリゴヌクレオチド（Ｍｏｄ８３，配列番号５１）、ＰがＴかつＱがＡのオリゴヌクレオチド（Ｍｏｄ８４，配列番号４８）、ＰとＱがともにＡのオリゴヌクレオチド（Ｍｏｄ８５，配列番号５０）、ＰがＣかつＱがＡのオリゴヌクレオチド（Ｍｏｄ８７，配列番号５２）を合成した。実施例３において見出した、特に強いＩＦＮ誘導活性を有するＭｏｄ４６とこれらのオリゴヌクレオチドのヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α誘導活性について比較評価した。なお、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の評価は、上述のオリゴヌクレオチドを用いたこと、及びＩＦＮ−αのみを測定した他は実施例１と同様の手順及び条件にて行った。

その結果、オリゴヌクレオチドの濃度１００ｎＭにおいて、Ｍｏｄ８３、Ｍｏｄ８４、Ｍｏｄ８５及びＭｏｄ８７はＭｏｄ４６と同程度のＩＦＮ−α誘導活性を示した（図４）。この結果は、本発明において有効成分の一つとして用いられる式（１）のオリゴヌクレオチドのＰとＱが、Ｇ以外の塩基、すなわちＡ、Ｔ及びＣのいずれでも良く、互いに相補的なヌクレオチドでなくても強いＩＦＮ−α誘導活性を有することを示している。

（実施例５）：本発明の有効成分の一つである免疫刺激オリゴヌクレオチドとＧ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１及びＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３のヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の比較
本発明において有効成分の一つとして用いられる上記式（１）のオリゴヌクレオチドと、特開２００５−２３７３２８号公報において強いＩＦＮ−α誘導活性を有する配列として示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１（配列番号３６）及びＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３（配列番号９８）のヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性を比較した。

Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１及びＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３と最近似の配列を有し、ホスホロチオエート修飾していない免疫刺激オリゴオリゴヌクレオチドであるＭｏｄ９２（配列番号９７）及びＭｏｄ９３（配列番号９５）を合成し、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α誘導活性を比較した（表３及び表４）。なお、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の評価は、上述のオリゴヌクレオチドを用いた他は実施例１と同様の手順及び条件にて行った。

その結果、Ｍｏｄ９２及びＭｏｄ９３はＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３及びＧ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１に比べて高いＩＦＮ−α誘導活性を示した。

表３に表示されたＩＦＮ産生量は免疫刺激オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（最終濃度）における値である。いずれのオリゴヌクレオチドもホスホロチオエート修飾塩基を使用していない。

表４に表示されたＩＦＮ産生量は免疫刺激オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（最終濃度）における値である。いずれのオリゴヌクレオチドもホスホロチオエート修飾塩基を使用していない。

以上の結果から、本発明において有効成分の一つとして用いられる上記式（１）のオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート修飾されていなくても強いＩＦＮ−α誘導活性を有していることが確認された。また、上記式（１）におけるＰとＱが、Ｇ以外の塩基であることの重要性が示された。したがって、ＧＡＣＧＡＴＣＧなどの優れたＩＦＮ−α誘導活性を示すパリンドローム配列とポリＧ配列の間に少なくとも１塩基のヌクレオチドを付加することによってさらにＩＦＮ−α誘導活性が向上することが示された。

（実施例６）：本発明の有効成分の一つである免疫刺激オリゴヌクレオチドとＧ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１及びＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３のヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−１２誘導活性の比較
実施例５において用いた免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ９３と特開２００５−２３７３２８号公報で示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１のヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−１２誘導活性を比較した。なお、測定は前述したＰＢＭＣからのＩＬ−１２のｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導活性を評価する試験の具体的方法に沿って行った。

その結果、Ｍｏｄ９３はＩＬ−１２の産生を全く誘導せず、むしろ刺激しなかった対照と比べて抑制する傾向を示した（表５）。一方、Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１は弱いながらＩＬ−１２産生の増加を認めた。したがって、本発明において有効成分の一つとして用いられる上記式（１）オリゴヌクレオチドはヒトにおいても炎症性サイトカインの誘導活性が低いことが示された。

表５に表示されたＩＬ−１２産生量は無刺激（ｎｏ ＣｐＧ−ＯＤＮ）或いは免疫刺激オリゴヌクレオチドの濃度が３００ｎＭ（最終濃度）における値である。いずれのオリゴヌクレオチドもホスホロチオエート修飾塩基を使用していない。

免疫刺激オリゴヌクレオチドの単独刺激ではヒト末梢血細胞からの顕著なＩＬ−１２産生が認められなかったので、強力な炎症反応の誘導因子であるエンドトキシンのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）とともに刺激してＩＬ−１２産生に及ぼす影響を評価した。すなわち、上記の方法に従って単離したＰＢＭＣを１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地で１ｍＬあたり２．０×１０⁶個の細胞が含まれるように調製後、丸底の９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり２．０×１０⁵個の細胞を播き、ＬＰＳと免疫刺激オリゴヌクレオチドの共存下で２４時間処置して培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法にてＩＬ−１２の産生量を定量した。免疫刺激オリゴヌクレオチドはＭｏｄ９２、Ｍｏｄ９３、Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１及びＧ７−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ３を用いた。その結果、いずれの免疫刺激オリゴヌクレオチドにおいてもＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍＬ）刺激で誘導されるＩＬ−１２産生を増強しなかった。むしろ、その産生を抑制する効果が認められ、Ｍｏｄ９３が最も強い阻害活性を示した（表６）。

表６に表示されたＩＬ−１２産生量はＬＰＳ存在下の無刺激（ｎｏ ＣｐＧ−ＯＤＮ）あるいは免疫刺激オリゴヌクレオチドの濃度が１００ｎＭ（最終濃度）における値である。いずれのヌクレオチドもホスホロチオエート修飾塩基を使用していない。

以上の結果、本発明において有効成分の一つとして用いられる上記式（１）のオリゴヌクレオチドは、ヒトにおいて炎症性サイトカイン誘導活性が公知の配列よりも少なく、かつ抗炎症作用を有することを確認した。

（実施例７）：本発明の有効成分の一つである免疫刺激オリゴヌクレオチドとＭ２６、Ｍ２７、Ｍ２６−ＧＳ、Ｍ２７−ＧＳ、Ｉ１、２００６、２３９５、１０１８、Ｃ２７４、Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１及びＤ１９のヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の比較
ＫＲ２００１−００６３１５３（大韓民国公開特許）において示されているオリゴヌクレオチド配列Ｍ２６（配列番号３７）及びＭ２７（配列番号３８）とそれぞれのポリＧ配列のヌクレオチド間をホスホロチオエート修飾したＭ２６−ＧＳ及びＭ２７−ＧＳと、実施例１及び３において見出した免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ５５及びＭｏｄ４６のＩＦＮ−α誘導活性を比較評価した。なお、本実施例５に記載したヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の評価は、上述のオリゴヌクレオチドを用いたこと、及びＩＦＮ−αのみを測定した他は実施例１と同様の手順及び条件にて行った。その結果、オリゴヌクレオチド濃度１００ｎＭにおいて、本発明において有効成分の一つとして用いられる免疫刺激オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドに比べて著しく高いＩＦＮ−α誘導活性を示した（図５−１）。

次に、特開２００５−２３７３２８号公報において強いＩＦＮ−α誘導活性を有する代表的な配列として示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１（配列番号３６）と実施例１及び３において見出した免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ５３、Ｍｏｄ５４、Ｍｏｄ５５、Ｍｏｄ６１、Ｍｏｄ６２、Ｍｏｄ４５、Ｍｏｄ４６、Ｍｏｄ７１及びＭｏｄ７３のＩＦＮ−α誘導活性を比較評価した結果、本発明において有効成分の一つとして用いられる式（１）の免疫刺激オリゴヌクレオチドの方が濃度１μＭにおいて高いＩＦＮ−α誘導活性を示した（図５−２）。

また、特表平１０−５０６２６５号公報において示されているオリゴヌクレオチド配列Ｉ１と、実施例３において見出した免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ４６、Ｍｏｄ４６と同一のパリンドローム配列を有するＤ−タイプのＣｐＧであるＭｏｄ３９及びＭｏｄ３３のＩＦＮ−α誘導活性を比較評価した結果、本発明において有効成分の一つとして用いられる上記式（１）のオリゴヌクレオチドは濃度３０ｎＭにおいて著しく高いＩＦＮ−α誘導活性を示したのに対し、他のオリゴヌクレオチドはほとんど活性を示さなかった（図５−３）。

さらに、国際公開第００／６１１５１号パンフレットにおいて示されているオリゴヌクレオチド配列（Ｄ１９）、特表２００１−５０３２６７号公報及び国際公開第１９９８／０１８８１０号パンフレットにおいて示されているオリゴヌクレオチド配列（２００６）、国際公開第０３／０１５７１１号パンフレットにおいて示されているオリゴヌクレオチド配列（２３９５）、特表２００２−５１７１５６号公報及び特表２００２−５００１５９号公報において示されているオリゴヌクレオチド配列（１０１８）及び国際公開第０４／０５８１７９号パンフレットにおいて示されているオリゴヌクレオチド配列（Ｃ２７４）とＭｏｄ４６（配列番号２８）のヒトＰＢＭＣのＩＦＮ−α誘導活性を比較した。その結果、オリゴヌクレオチド濃度１００ｎＭにおいて、本発明において有効成分の一つとして用いられる式（１）のオリゴヌクレオチドが最も強いＩＦＮ−α誘導活性を有することを確認した（図５−４）。

以上の結果、公知のＣｐＧ配列を有する免疫刺激オリゴヌクレオチドよりも、上記式（１）のオリゴヌクレオチドの方が高いＩＦＮ−α誘導活性を示すことが明らかとなった。

（実施例８）：ポリＧ配列とパリンドローム配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣを有する免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ４６、Ｍｏｄ８３、Ｍｏｄ８５、Ｍｏｄ８７と公知ＣｐＧオリゴヌクレオチドＧ１０、Ｇ３−６、Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１、Ｇ１−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ９及び２３３２のヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−α誘導活性の比較
パリンドローム配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣの外側にポリＧ配列が付加された公知のＣｐＧオリゴヌクレオチドとしては、特開２００５−２３７３２８号公報において示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ９−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ１（配列番号３６）及びＧ１−ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ−Ｇ９（配列番号５５）、国際公開第２００５／０１４１１０号パンフレットにおいて開示されているオリゴヌクレオチド配列Ｇ１０（配列番号５６）及びＧ３−６（配列番号５７）と、特表２００３−５１０２９０号公報において示されているオリゴヌクレオチド２３３２（配列番号５８）がある。そこで、免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ４６、Ｍｏｄ８３、Ｍｏｄ８５及びＭｏｄ８７と上記公知ＣｐＧオリゴヌクレオチドのＩＦＮ−α誘導活性を比較評価した。なお、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮ誘導活性の評価は、上述のオリゴヌクレオチドを用いたこと、及びＩＦＮ−αのみを測定した他は実施例１と同様の手順及び条件にて行った。その結果、本発明において有効成分の一つとして用いられる式（１）のオリゴヌクレオチドの方が、オリゴヌクレオチド濃度３０ｎＭにおいて高いＩＦＮ−α誘導活性を示した（図６）。

（実施例９）：免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ２、Ｍｏｄ３３、Ｍｏｄ３９及びＭｏｄ４６のマウス脾細胞におけるサイトカイン産生誘導活性の比較
Ｃ５７ＢＬ／６系統由来のマウス脾細胞を用いて実施例１及び３で見出した免疫刺激オリゴヌクレオチドであるＭｏｄ４６と、Ｍｏｄ３３、Ｄ−タイプのＣｐＧであるＭｏｄ３９及びＭｏｄ２との間で、サイトカイン誘導活性を比較評価した。

濃度１００ｎＭにおけるＤ−タイプのＣｐＧと本発明で用いられる免疫刺激オリゴヌクレオチドのＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０誘導活性を測定した。測定は、前述したマウスの脾細胞におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０産生誘導の有無を確認する具体的手段として挙げた手順及び条件に従って行った。その結果、Ｍｏｄ４６のＩＦＮ−γ誘導活性はパリンドロームモチーフが同一のＤ−タイプのＣｐＧであるＭｏｄ３９より増強し、Ｍｏｄ３３よりも大きく上回っていた（図７−１）。一方、Ｍｏｄ３３とＭｏｄ４６のＩＬ−１０誘導活性は、それぞれ、Ｍｏｄ２やＭｏｄ３９の誘導活性とほぼ同等であった（図７−２）。免疫刺激オリゴヌクレオチドによる免疫制御性サイトカインＩＬ−１０の誘導については炎症性サイトカインの誘導メカニズムと異なる可能性が示唆された。

以上の結果は、本発明において有効成分として用いられる式（１）のオリゴヌクレオチドが、ＩＬ−１０誘導活性を維持した状態でパリンドロームモチーフ非依存的なＩＦＮ誘導活性を増強することを示している。また、免疫刺激活性はＣｐＧ配列によって種特異性があるが、本発明が提供する免疫刺激オリゴヌクレオチドは種差に影響されず、ＩＦＮ誘導活性を増強させる普遍的な構造であることを確認した。

（実施例１０）：本発明の有効成分の一つである新規な免疫刺激オリゴヌクレオチドの、Ｊ７７４細胞株における炎症性サイトカイン産生誘導活性の低減
実施例３で見出した免疫刺激オリゴヌクレオチドなどによる炎症性サイトカイン産生の誘導活性についてパリンドロームモチーフが同一のＤ−タイプのＣｐＧと比較評価した。それぞれのオリゴヌクレオチドのパリンドロームモチーフは、配列表及び図８−１及び８−２中で示されており、Ｍｏｄ３７及びＭｏｄ４４はレーン１のＴＣＣＧＡＴＣＧＧＡ、Ｍｏｄ３８及びＭｏｄ４５はレーン２のＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣ、Ｍｏｄ３９及びＭｏｄ４６はレーン３のＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣである。なお、評価は、前述したマウスのＪ７７４細胞におけるＩＬ−１２とＴＮＦ−αの誘導活性を確認する具体的手段として挙げた手順及び条件に従って行った。その結果、Ｍｏｄ４４、Ｍｏｄ４５及びＭｏｄ４６は、それぞれの同一のパリンドローム配列を有するＤ−タイプのＣｐＧのＭｏｄ３７、Ｍｏｄ３８及びＭｏｄ３９と比べて、濃度３００ｎＭにおいて、ＩＬ−１２（図８−１）とＴＮＦ−α（図８−２）の誘導活性がどちらも顕著に抑制された。

以上の結果、本発明で見出したポリＧ配列の付加様式を有する新規な免疫刺激オリゴヌクレオチドは同一のパリンドロームモチーフからなる従来のＤ−タイプのＣｐＧよりも低減された炎症性サイトカイン誘導活性を示した。

（実施例１１）：本発明の有効成分の一つである免疫刺激オリゴヌクレオチドと２００６、２３９５、１０１８及びＣ２７４のＪ７７４細胞株におけるＴＮＦ−α誘導活性の比較
実施例８で見出した免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ４６と公知のＣｐＧオリゴヌクレオチドのＴＮＦ−α誘導活性を評価した。Ｊ７７４細胞株にそれぞれの免疫刺激オリゴヌクレオチドを（最終濃度３００ｎＭ）あるいは陽性対照のリポポリサッカライド（ＬＰＳ：最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）で８時間刺激処置して培養上清中のＴＮＦ−α産生量を測定した。その他の手順及び条件は実施例１０と同様とした。その結果、実施例４において示されているオリゴヌクレオチド配列２００６（配列番号３１）、２３９５（配列番号３２）、１０１８（配列番号３３）、Ｃ２７４（配列番号３４）及びＭｏｄ３９とＬＰＳと比べて、Ｍｏｄ４６は減弱されたＴＮＦ−α誘導活性を示した（図９）。このことから、実施例２及び６で示される結果も考慮すると、３'末端のポリＧ配列の塩基数が３塩基以下である免疫刺激オリゴヌクレオチドは炎症性サイトカインの誘導活性が減弱することが示された。

（実施例１２）：本発明において提供される免疫刺激オリゴヌクレオチド及びＩＦＮ−βのマウスにおける肝炎治療効果
マウスの肝炎モデルとして一般的に利用されているＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（以下、ＣｏｎＡという）誘発肝炎モデルを用いて、本発明において用いられる上記式（１）のオリゴヌクレオチド及びＩＦＮ−βのｉｎ ｖｉｖｏにおける抗炎症効果について評価した。ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルは、急激な炎症反応の惹起による肝炎を発症し、免疫反応の活性化を伴う肝炎モデルとして用いられている。ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルにおいて、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを評価した試験（Ａｂｅ ｅｔ ａｌ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（２００５）５１，４１−４９）においてＫ−タイプＣｐＧである１６６８（配列番号１０８）が逆に肝炎の症状を悪化させた結果を示した公知例がある。また、ＣｐＧを含有する免疫刺激オリゴヌクレオチドがＣｏｎＡ誘発肝炎モデルにおいて肝炎のマーカーとなるＡＬＴ値の上昇を抑制したという報告例は開示されていない。

ＣｏｎＡ誘発マウス肝炎モデルの作製、インターフェロンや免疫刺激オリゴヌクレオチドによる処置、血清中ＡＬＴ値の測定は、以下のようにして行った。

５週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー）を用いた。ＣｏｎＡを投与するマウスは、投与前日の夕方からＣｏｎＡ投与完了まで絶食とし、ＣｏｎＡ投与終了後に給餌を再開した。ＣｏｎＡを投与しない群をＮａｉｖｅ群とした。インターフェロンと免疫刺激オリゴヌクレオチドの処置、或いはインターフェロンのみの処置は、ＣｏｎＡを投与する６時間前に尾静脈内投与により１回とした。すなわち、ＰＢＳ（−）で濃度２０μｇ／ｍＬに調製した免疫刺激オリゴヌクレオチド（Ｍｏｄ８７）あるいはＰＢＳ（−）は、２００００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−αあるいはＩＦＮ−βと等量混合して１００μＬずつマウスの尾静脈内に注射した。この処置により一匹あたりの被験物質投与量として免疫刺激オリゴヌクレオチドは１μｇ、インターフェロンは１０００単位（以下、単位（ユニット）のことをＵと表記する）が投与された。ＣｏｎＡは溶媒に生理食塩水を用いて濃度４ｍｇ／ｍｌに調製した後、１００μＬずつマウスの尾静脈内へ投与した。一匹あたり０．４ｍｇを投与した。ＣｏｎＡ投与から２４時間後に採血し、得られた血液を１００００ｒｐｍ、５分間４℃にて遠心分離し、血清を得た。血清中のＡＬＴ値はフジドライケム（ＤＲＩ−ＣＨＥＭ ５５００Ｖ、富士フィルム）で測定した。

ＣｏｎＡ誘発肝炎マウスモデルの炎症惹起から２４時間後の血清中ＡＬＴ値の上昇を評価した（図１０）。まず、１０００ＵのＩＦＮ−β（レーン３）あるいはＩＦＮ−α（レーン４）の肝炎惹起６時間前の単独処置では血清中ＡＬＴ値の上昇を抑制できないことを確認した。ＩＦＮ−βと免疫刺激オリゴヌクレオチドＭｏｄ８７（配列番号５２）の併用処置群（レーン５）は対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ、レーン２）と比べて統計学的に有意（ｔ検定：ｐ＜０．００１）な血清中ＡＬＴ値低下作用が認められた。また、この抑制効果はＩＦＮ−β単独処置群（レーン３）と比較しても有意な低下（ｔ検定：ｐ＜０．０５）であった。一方、ＩＦＮ−αとＭｏｄ８７の併用処置群（レーン６）では全く効果が認められなかった。

したがって、本発明において有効成分の一つとして用いられる式（１）のオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてインターフェロン単剤の効果が十分でない処置用量において、ＩＦＮ−βと併用することにより優れた肝炎治療作用を有することが示された。

（実施例１３）：本発明の有効成分の一つであるペグ化ＩＦＮ−βのＣｏｎＡ誘発肝炎マウスモデルで観察される肝臓の血流量低下に及ぼす影響
ＣｏｎＡ誘発マウス肝炎モデルの作製、インターフェロン（ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α又はペグ化ＩＦＮ−β）の投与、肝臓の血流量測定は、以下のようにして行った。
ＣｏｎＡ誘発マウス肝炎モデルの作製については、実施例１２と同じマウスを用いて、次のとおり作成した。ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α及びペグ化ＩＦＮ−βを、それぞれ１００００Ｕ／匹の用量でＣｏｎＡ投与３時間前にマウスの尾静脈内より投与した。ＣｏｎＡを、実施例１２と同様に生理食塩水に同じ濃度で調製し、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α又はペグ化ＩＦＮ−βの投与後（３時間後）に、１００μＬずつそれぞれのマウスの尾静脈内より投与（一匹あたり０．４ｍｇの投与）した。
肝臓の血流量は、ＣｏｎＡ投与３時間後に測定した。具体的には、マウスをエーテル麻酔下で肝臓を露出させた後、非接触型肝血流計プローブ（ＡＬＥ２１Ｎ、アドバンス社製）を用いて、肝臓の外側左葉の平らな面から１ｃｍの距離に垂直になるようにプローブをセットし、肝血流量を測定した（図１１）。ＣｏｎＡを投与しない群をＮａｉｖｅ群、陰性対照群をｃｏｎｔｒｏｌ群（ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α又はペグ化ＩＦＮ−βを投与しない群）とし生理食塩水を投与した。Ｎａｉｖｅ群の血流量の平均値を１００％として、各個体の血流量を計算した。

ＣｏｎＡ誘発肝炎マウスモデルの炎症惹起から３時間後の肝血流量を評価した（図１１）。ｃｏｎｔｒｏｌ群ではＮａｉｖｅ群との比較で有意な血流量の低下が認められた。１００００ＵのＩＦＮ−αでは血流量の低下を有意には改善しなかったが、同用量のＩＦＮ−β及びペグ化ＩＦＮ−βはｃｏｎｔｒｏｌ群との比較で有意に血流量を増加させ、ＣｏｎＡ誘発肝炎マウスモデルにおける肝血流量の低下に対し、優れた改善効果を示すことが明らかとなった。その上、ペグ化ＩＦＮ−βはＩＦＮ−βよりも改善効果が強いことが示された。なお，統計学的な検定はｔ検定で行い，ｐ＜０．０５を有意とした。

したがって、本発明において有効成分の一つとして用いられるＩＦＮ−βは、ペグ化修飾することによって、より優れた肝炎の治療作用を有することが示され、このことは本発明において有効成分の一つとして用いられる式（１）のオリゴヌクレオチドとの併用でペグ化ＩＦＮ−βは、ペグ化していないＩＦＮ−β同様の、又はそれ以上の肝炎の治療作用を有すると考えられた。

以上の結果、本発明の治療剤又は予防剤は、Ｃ型肝炎の患者に投与された場合、Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤として有用であることが確認された。

Claims (4)

1. 式（１）：５’−（Ｇ）_ＭＰＸＣＧＹＱ（Ｇ）_Ｎ−３’
   [式（１）中、Ｃは、シトシン、Ｇは、グアニン、Ｘ及びＹは、それぞれ独立に、４塩基以上連続したグアニンを含まない０〜１０ヌクレオチド長の塩基配列（但し、Ｘ＋Ｙの長さは、６〜２０ヌクレオチド長である。）、ＸＣＧＹは、少なくとも８ヌクレオチド長のパリンドローム配列を含む８〜２２ヌクレオチド長の塩基配列、Ｐ及びＱは、それぞれ独立に、グアニン以外の１ヌクレオチド、Ｍは、６〜１０の整数、Ｎは、０〜３の整数を表す。]
   で示され、全長が１６〜３７ヌクレオチド長であり、
   前記式で示される塩基配列が、配列番号６、７、１０、１５〜１７、２４、２６、２８、３０、４０、４２、４８、５０〜５２、９５及び９７からなる群より選ばれる塩基配列からなるものであるオリゴヌクレオチドと、
   インターフェロン−βと、
   を有効成分とする、肝炎の治療剤又は予防剤。
2. 前記インターフェロン−βは、天然型インターフェロン−β、遺伝子組換え型インターフェロン−β又は修飾されたＩＦＮ−βである、請求項１記載の治療剤又は予防剤。
3. 前記肝炎は、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎である、請求項１又は２記載の治療剤又は予防剤。
4. 前記式（１）中の（Ｇ）_Ｍおよび（Ｇ）_Ｎで示される領域に含まれるホスホジエステル結合のうち少なくともその一部がホスホロチオエート修飾されている、請求項１〜３のいずれか一項記載の治療剤又は予防剤。
   

Images