JP5238710B2 - インターロイキン−１３レセプターアルファ１の高親和性抗体アンタゴニスト - Google Patents

Description

本出願は、米国仮特許出願60/852,884（2006年10月19日出願）（本出願の内容は参照によりその全体が本明細書に含まれる）の優先権を主張する。

人間での研究および実験動物モデルから得られたデータは、アトピー性喘息の要因としてTh2-由来サイトカインの密接な関連性を示し、特にインターロイキン-4（IL-4）およびインターロイキン-13はもっとも中心的な役割を果たすことを示唆している（IL-13については例えば以下を参照されたい：Minty et al. 1993, Nature 362:248-250；McKenzie et al. 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:3735-3739；Acc No. U31120およびL13029（ヒト）並びにNM_001032929（マカカ・ムラッタ（Macaca mulatta））。これら2つのサイトカインは顕著な構造類似性を有し、一定のレセプター構成要素を共有する。IL-4およびIL-13が共有するレセプターは、IL-4およびIL-13の両方と結合する二元性IL-4/IL-13レセプター（またはII型レセプター）である。このレセプターは、IL-4Rα鎖（例えば以下を参照されたい：Idzerda et al. 1990 J Exp Med 171:861-873）およびIL-13Rα1鎖（例えば以下を参照されたい：Hilton et al. 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:497-501；Aman et al 1996, J Biol Chem 271:29265-29270；Miloux et al. 1997, FEBS Lett 401:163-166；Acc. No. U62858およびCAA70508（ヒト）並びにAAP78901（マカカ・ファシクラリス（Macaca fascicularis））を含む。前記二元性IL-4R/IL-13Rレセプターは、造血細胞および非造血細胞（肺上皮細胞および平滑筋細胞が含まれる）で発現される。さらにまたIL-4およびIL-13はともにそれぞれ、他方を排除するためにそれらを認識する１つのレセプターを有する。例えば、IL-4レセプター（IL-4R）I型（IL-4Rα鎖および共通ガンマ鎖（γc）から構成される）は、IL-4と特異的に結合する。IL-4RのI型はもっぱら造血細胞起源の細胞で発現される。IL-13に特異的なレセプター、IL-13Rα2は高い親和性でIL-13と結合するが、外見的にはシグナル伝達を行わない。むしろ、前記レセプターは、おとりとして作用しIL-13への応答を減弱させる。

IL-13およびIL-4は多数の機能を実行し、ともにアレルギー表現型（例えばB-細胞のIgEに対するアイソタイプクラス切り替え、マスト細胞および好酸球の活性化、内皮細胞における血管細胞粘着分子-1（VCAM-1）のアップレギュレーション、およびケモカイン（例えばエオタキシン、胸腺および活性化調節ケモカイン（TARC）、並びにマクロファージ由来ケモカイン（MDC））の産生）に関連する多数の機能を調節する。
しかしながら、IL-4およびIL-13は、それらのレセプター複合体の相違のためにin vitroおよびin vivoで多くの別個の機能を有する。例えば、IL-13の除去は、マウスの喘息モデルで気道の過反応性を予防し粘液産生を減少させることが示されたが、IL-4では減少は示されなかった。IL-13と喘息応答との間のこの相関関係は他の研究によっても支持された（例えば以下を参照されたい：Hershey et al. 2003, J Allergy Clin Immunol 111(4):677-690；Gruning et al. 1998, Science 282(5397):2261-2263；Mattes et al. 2001, J Immunol 167(3):1683-1692；およびFulkerson et al. 2006, Am J Respir Cell Mol Biol 35(3):337-346）。例えば、IL-13の肺へのデリバリーは、マウスで完全な喘息様現象を誘発するために十分であることが見出された。処理動物は、気道の過反応性、好酸球に富む細胞炎症、杯細胞過形成とそれに付随する粘液過剰産生および上皮下線維症を引き起こす（例えば以下を参照されたい：Wills-Karp et al. 1998, Science 282(5397):2258-2261；Reiman et al. 2006, Infect Immun 74(3):1471-1479；およびKaviratne et al. 2004, J Immunol 173(6):4020-4029）。さらにまた、IL-13の発現は、ヒトの喘息肺で上昇することが報告された。その他にも、いくつかのグループが、IL-13遺伝子の多形性とアレルギー体質のリスク増加および喘息徴候との密接な関係を報告している。これらの多形性のいくつかは、IL-13の発現の増加と相関することが示された（例えば以下を参照されたい：Huang et al. 1995, J Immunol 155(5):2688-2694；Naseer et al. 1997, Am J Respir Crit Care Med 155(3):845-851；Vladich et al. 2005, J Clin Invest 115(3):747-754；Chen et al. 2004, J Allergy Clin Immunol 114(3):553-560；およびVercelli et al. 2002, Curr Opin Allergy Clin Immunol 2(5):389-393）。

IL-13はまた、多様な他の症状（多様な呼吸系およびアレルギー関連疾患、線維症、皮膚硬化症、炎症性腸疾患およびある種の癌が含まれるが、ただしこれらに限定されない）に付随している（例えば以下を参照されたい：T.A. Wynn 2003, Annu Rev Immunol 21:425-456；Terabe et al. 2000, Nat Immunol 1(6):515-520；Fuss et al. 2004, J Clin Invest 113(10):1490-1497；Simms et al. 2002, Curr Opin Rheumatol 14(6):717-722；およびHasegawa et al. 1997, J Rheumatol 24(2):328-332）。
したがって、IL-13のアンタゴニストは、IL-13関連疾患の治療の開発に使用される極めて魅力的な分子であろう。有効な抗体アンタゴニストは、IL-13とIL-13Rとの結合を阻害しよう。IL-13Rα1に対する有効な抗体アンタゴニストもまたIL-13の結合を阻害して、IL-4RαおよびIL-13Rα1のヘテロダイマー化を妨げることができる。そのような抗体は、II型レセプターを介しIL-13およびIL-4の両方のシグナル伝達を阻害する一方で、I型レセプターを介するIL-4シグナル伝達は温存しえよう。I型レセプターを介するシグナル伝達は、その間にTh2細胞が分化する免疫応答誘導期に必須である。T細胞はIL-13Rα1を発現せず、したがってII型レセプターはTh2分化に役割を果たすことはない。したがって、IL-13Rα1抗体は全体的なTh1/Th2バランスに影響を与えることはない。II型IL-4/IL-13レセプターを介するシグナル伝達は、アレルギー性炎症確立後の免疫応答のエフェクター期には極めて重要である。したがって、II型レセプターの封鎖は、喘息の徴候および他のIL-13R仲介症状の多くに有益な作用を有し、したがって効果的な疾患調整薬剤であるはずである。

IL-13Rα1に対する抗体（モノクローナルおよびポリクローナルのいずれも）が当分野では報告されている（例えば以下を参照されたい：WO97/15663；WO03/80675；WO03/46009；WO06/072564；Gauchat et al. 1998, Eur J Immunol 28:4286-4289；Gauchat et al. 2000, Eur J Immunol 30:3157-3164；Clement et al. 1997, Cytokine 9(11):959（会合要旨）；Ogata et al. 1998, J Biol Chem 273:9864-9871；Graber et al. 1998, Eur J Immunol 28:4286-4289；C. Vermot-Desroches et al. 2000, Tissue Antigens 5(補遺1):52-53（会合要旨）；Poudrier et al. 2000, Eur J Immunol 30:3157-3164；Akaiwa et al. 2001, Cytokine 13:75-84；Cancino-Diaz et al. 2002, J Invest Dermatol 119:1114-1120；およびKrause et al. 2006, Mol Immunol 43:1799-1807）。
アレルギーおよび喘息応答とともにIL-13Rα1の発現／機能の強化に少なくとも部分的に寄与している他の様々な症状に関連する活性に強い影響を与ええる生物学的活性が強化された抗体が希求されている。さらにまたヒトでの免疫原性が低くIL-13Rα1に対する親和性が高い抗体分子が希求されている。したがって、IL-13Rα1および、種々の治療状態でIL-13Rα1が果たすその対応する役割を阻害するかまたは前記に拮抗する、IL-13Rα1の治療薬型ヒト抗体アンタゴニストを作製することは極めて重要であろう。

発明の概要
本発明は、IL-13Rα1および特にヒトIL-13Rα1の高親和性抗体アンタゴニストに関連する。開示の抗体分子は、IL-13Rα1、特にヒトIL-13Rα1を選択的に認識し、5ｘ10^-9以下、より好ましくは2ｘ10^-9以下、さらに好ましくは1ｘ10^-9以下のK_DでヒトIL-13Rα1との結合を示す。本発明の特異的抗体分子は、その他に霊長類のIL-13Rα1と高い親和性で結合し、このことは、ヒトでの有効性および安全性プロフィルを予測するための非ヒト霊長類モデルへのアクセス性を与える望ましい品質である。本発明の抗体分子は、IL-13Rα1仲介活性の阻害に有効であり、したがって前記に関連する症状（喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、慢性副鼻腔炎、枯草熱、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（“COPD”）、肺線維症、食道の好酸球増加症、皮膚硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、線維症、炎症性腸疾患（特に潰瘍性大腸炎）、アナフィラキシーおよび癌（特にホジキンリンパ腫、グリオーマおよび腎癌）並びに一般的なTh2-仲介異常／症状を含むが、ただしこれらに限定されない）の治療で重要である。IL-13Rα1特異的抗体はまた、IL-13Rα1の検出および定量での多様な診断目的にも有用である。

ある特定の特徴では本発明は単離抗体、10G5を提供する。前記抗体は、IL-13Rα1を介して機能するIL-13と非常に効果的に拮抗する。10G5は、NHDF細胞におけるIL-13およびIL-4誘導エオタキシン放出阻害、NHDF細胞におけるIL-13およびIL-4誘導STAT6リン酸化阻害、ならびに、血中または抹消血単核球（PBMC）におけるTARCのIL-13刺激放出の阻害を示す。したがって、本発明は、ATCC寄託番号PTA-6933として寄託したハイブリドーマ細胞株により産生される抗体を包含する。本発明はまた、hIL-13Rα1とPTA-6933の抗体との結合について競合する抗体を包含する。本発明の特定の実施態様は、10G5の重鎖および／または軽鎖可変領域配列を含む抗体分子とともに、その等価物（1つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とする）またはホモローグを含む抗体分子を含む。具体的な実施態様は、本明細書に開示のCDRドメイン、または本明細書に開示の重鎖および／または軽鎖ドメインのセット、または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物を有する単離抗体分子を包含する。特に、本発明の抗体分子は、配列番号:82、配列番号:83および配列番号:121にそれぞれ示されるCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を有する重鎖可変領域、並びに配列番号:84、配列番号:85および配列番号:122に示されるCDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。より具体的には、本発明の抗体分子は、配列番号:45、配列番号:51、配列番号:55、配列番号:59、配列番号:63または配列番号:67に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；配列番号:49、配列番号:71、配列番号:75または配列番号:79に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または上記に記載の重鎖および軽鎖可変領域の組合せを有する。

当業者には理解されるところであるが、hIL-13Rα1と結合する能力を保持する抗体のフラグメントを多様なフレームワークに挿入することができる。例えば以下を参照されたい：米国特許6,818,418号およびその中に含まれる参考文献（前記文献は、抗原との結合を基準にして以前に選択した抗体ループを提示するために用いることができる多様な骨組みについて考察している）。さらにまた、組換え方法を用いて、例えばV_LおよびV_Hを単一タンパク質鎖として形成させることができる合成リンカーを用いて、V_LおよびV_Hをコードする遺伝子を結合させることができる（この場合V_LおよびV_H領域は対をなして一価分子（あるいは単鎖Fv（ScFV）としても知られている）を形成する）（例えば以下を参照されたい：Bird et al. 1988, Science 242:423-426；およびHuston et al. 1988, Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883）。
別の特徴では、本発明は、開示の抗体分子をコードする核酸を提供する。本発明はまた、可変重鎖および軽鎖、並びにその精選成分、特に開示した対応するCDR3領域をコードする核酸を提供する。別の特徴では、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。別の特徴では、本発明は、開示の抗体分子および記載したその成分をコードする核酸を保有する単離細胞を提供する。別の特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドまたはベクターを含む単離細胞を提供する。
別の特徴では、本発明は、IL-13Rα1と選択的に結合する本発明の抗体分子（抗体、抗原結合フラグメント、誘導体、キメラ分子、前述のいずれかと別のポリペプチドとの融合物、前述のいずれかを取り込んだまた別の構造物／組成物を含む）を作製する方法を提供する。前記方法は、重鎖および／または軽鎖（生成される抗体分子に左右される）をコードする核酸を保有する細胞を、前記重鎖および／または軽鎖の発現および／または抗体分子へのアッセンブリを可能にする条件下で培養する工程、および前記抗体分子を細胞から単離する工程を含む。当業者は、標準的な組換えDNA技術を用いて本明細書に開示した抗体分子を入手することができる。

別の特徴では、本発明は、IL-13Rα1の活性または機能（シグナル伝達であれ他のものであれ）に拮抗する方法を提供する。前記方法は、IL-13Rα1を発現する細胞を本明細書に開示の抗体分子と、前記抗体分子がIL-13Rα1と結合することを可能にする条件下で接触させる工程を含む。本発明の特定の実施態様は、細胞がヒトの細胞である当該方法を含む。本発明の抗体分子は、IL-13Rα1仲介活性の阻害に有効である。本発明の抗体分子は、正常なヒト皮膚の線維芽細胞（以下では“NHDF”細胞）のエオタキシン放出を効果的に阻害することが見出された。本発明の抗体分子は、NHDF細胞でIL-13およびIL-4刺激STAT6リン酸化を効果的に阻害することが見出され、さらに全血（ヒト／アカゲザル）におけるTARC（CCL17）のIL-13刺激放出を効果的に阻害することが見出された。
別の特徴では、本発明は、IL-13Rα1活性関連症状（またはIL-13Rα1の機能が特定の対象者にとって有益ではないと思われる症状）を示す対象者でIL-13Rα1の活性に拮抗させる方法を提供する。前記方法は、対象者に治療的に有効量の本発明の抗体分子を投与する工程を含む。精選した実施態様では、前記症状は、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、慢性副鼻腔炎、枯草熱、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（“COPD”）、肺線維症、食道の好酸球増加症、乾癬、乾癬性関節炎、線維症、皮膚硬化症、炎症性腸疾患（特に潰瘍性大腸炎）、アナフィラキシーおよび癌（特にホジキンリンパ腫、グリオーマおよび腎癌）並びに一般的なTh2-仲介異常／症状でありえる。別の特徴では、本発明は、本発明の抗体（または本明細書に開示のIL-13Rα1特異的抗原結合部分を含むまた別の抗原結合構造もしくはタンパク質）および医薬的に許容できる担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤、緩衝剤、または所望の量の抗体分子の治療される個体への投与を容易にするために設計されたまた別の物質を含む医薬組成物または他の組成物を提供する。

本発明の別の特徴は、本明細書に開示の抗体とhIL-13Rα1との重要な接触点の検証に関する。この重要な接触点は、抗体によるレセプターの結合に強い影響を与える特定の変異の生成によって検証された。より具体的には、配列番号:101の233位のフェニルアラニン残基のアラニン残基による置換は、前記抗体とレセプターとの結合の低下をもたらすことが見出された。これは、10G5およびその誘導体の特徴に関して非常に有用な発見である。アミノ酸233を取り囲む狭い領域を利用するペプチドは、類似の特異性を有するまた別のモノクローナル抗体の作出に有用であろう。したがって、本発明は、Phe233Ala変異を有するhIL-13R配列を含む単離ペプチド（完全長であれ、変異を含むそのフラグメントであれ）を包含する。さらにまた、本発明はまた、10G5または10G5誘導体の評価、類似のエピトープに対し特異性を有する抗体の識別、あるいは類似の特異性を有する抗体の作製を目的とする前記ペプチドのアッセイにおける使用を包含する。

抗体10G5の重鎖可変領域のヌクレオチド配列および誘導アミノ酸配列を示す。CDRおよびCDRをコードする核酸には下線が付されている。 抗体10G5の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列および誘導アミノ酸配列を示す。CDRおよびCDRをコードする核酸には下線が付されている。 pFab3dの遺伝子地図を示す。 図4Aおよび4Bは、pFab3dにおける10G5Fabの重鎖および軽鎖構築物（それぞれ配列番号:86および87）を示す。 ペリプラズム調製物から得た変異FabとアカゲザルIL-13Rα1との結合を示す。 10G5変異体のペリプラズム調製物とヒトIL-13Rα1との結合のELISA分析を示す。 10G5変異体のペリプラズム調製物とヒトIL-13Rα1との結合のELISA分析を示す。 軽鎖変種クローンについてのMyc-捕捉ELISAデータを示す。 NHDFエオタキシン放出アッセイにおける10G5、10G5H6および10G5-6の機能を示す。 NHDF細胞でのIL-13およびIL-4刺激エオタキシン放出の阻止における10G5-6の機能を示す。 IL-13誘導STAT6アッセイにおける10G5および10G5H6の機能を示す。 IL-4誘導STAT6アッセイにおける10G5および10G5H6の機能を示す。 ヒト全血でのTARC（CCL17）のIL-13刺激放出の阻止における10G5-6の機能を示す。 ヒト全血でのIL-13刺激TARC放出アッセイにおける10G5および10G5H6の機能を示す。 ヒト全血でのTARCのアカゲザルIL-13刺激放出の阻止における10G5H6および10G5-6の機能を示す。 IgG1（配列番号:97）、IgG2（配列番号:98）、IgG4（配列番号:99）およびIgG2m4（配列番号:100）アイソタイプのFcドメインの配列比較を示す。 10G5、10G5H6および10G5-6によるホジキン症細胞株L1236の細胞分化の阻害を示す。

発明の詳細な説明
本発明は、IL-13Rα1（特にヒトIL-13Rα1）の高親和性抗体アンタゴニストに関する。開示した抗体分子は、IL-13Rα1を選択的に認識しこれと特異的に結合する。具体的な実施態様では、本抗体は、霊長類IL-13Rα1（例えばカニクイザルIL-13Rα1）と高い親和性で結合し、このことは、ヒトでの有効性および安全性プロフィルを予測するための非ヒト霊長類モデルへのアクセス性を与える望ましい品質である。本明細書の“選択的”または“特異的”という用語の使用は、開示の抗体分子がIL-13Rα1以外のものと有意な結合を示さないという事実を指す。開示の抗体分子は、5ｘ10^-9以下、より好ましくは2ｘ10^-9以下、さらに好ましくは1ｘ10^-9以下のK_DでヒトIL-13Rα1と結合する。K_Dは、K_d（特定の抗体-抗原相互作用の解離速度）対K_a（前記特定の抗体-抗原相互作用の結合速度）のモル濃度（M）で表した比（すなわちK_d/K_a）から得られる解離定数を指す。K_D値は、当分野で確立された方法を用いて決定することができる。抗体のK_Dを決定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、例えばバイオセンサーシステム（例えばBIACORE^TM（Pharmacia AB Corporation）システム）を用いることによる。

本明細書に記載の抗体は、IL-13Rα1機能または本明細書で述べるIL-13Rα1仲介活性との拮抗において特に有効である。“IL-13Rα1仲介”活性／機能という言葉は、IL-13Rα1の機能を必要とするか、またはIL-13Rα1の機能によって悪化もしくは強化される任意の活性／機能を指すために本明細書では用いられる。開示の抗体分子は、以下の機能的特性の少なくとも1つを有することが示された：（i）NHDF細胞におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害；（ii）NHDF細胞におけるIL-4誘導エオタキシン放出の阻害；（iii）NHDF細胞におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害；（iv）NHDF細胞におけるIL-4誘導STAT6リン酸化の阻害；または（v）血液またはPBMCにおけるTARCのIL-13刺激放出の阻害。本発明の具体的な実施態様は、1.0μg/mL以下、より好ましくは0.5μg/mL以下、さらに好ましくは0.1μg/mL以下のIC₅₀でNHDF細胞のIL-13Rα1仲介エオタキシン放出に拮抗する抗体分子を提供する。本発明の特定の実施態様は、NHDF細胞におけるIL-13Rα1仲介STAT6リン酸化に拮抗する抗体分子を提供する。本発明の特定の実施態様は、1000ng/mL以下、より好ましくは500ng/mL以下、さらに好ましくは250ng/mL以下のIC₅₀で全血またはPBMCにおけるIL-13Rα1仲介TARC（CCL17）放出に拮抗する抗体分子を提供する。個々の任意の抗体による拮抗の程度は、コントロールと統計的に比較したIC₅₀値として、またはIL-13Rα1機能に対する負の作用もしくはIL-13Rα1機能の阻害を評価するための当分野で利用可能なまた別の任意の方法（すなわちIL-13Rα1機能の拮抗作用を判定することができる任意の方法）により定量的に測定することができる。

本明細書で用いられる、“抗体分子”または“抗体”は、hIL-13Rα1と選択的に結合する免疫グロブリン由来構造物を指し、完全長もしくは全抗体、抗原結合フラグメント（抗体構造物から物理的または概念的に誘導されるフラグメント）、前述のいずれかの誘導体、キメラ分子、前述のいずれかと別のポリペプチドとの融合物、またはIL-13Rα1機能の選択的結合／阻害のために前述のいずれかを取り込んだまた別の任意の構造物／組成物が含まれるが、ただし前記に限定されない。“全”抗体または“完全長”抗体は、ジスルフィド結合によって互いに連結された2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖を有するタンパク質を指し、以下を含む：（1）重鎖との関係では、重鎖可変領域（本明細書では“V_H”と略される）および重鎖定常領域（3つのドメイン、C_H1、C_H2およびC_H3を有する）；および（2）軽鎖との関係では、軽鎖可変領域（本明細書では“V_L”と略される）および軽鎖定常領域（1つのドメイン、C_Lを有する）。本明細書で用いられる、“単離”とは、天然に見出される特性と開示の抗体分子、核酸または他のものとの相違を示す前記抗体分子等に付随する特性をいう。前記相違は、例えば、それらが天然に見出されるものとは異なる純度を有すること、またはそれらが天然に見出されるものと異なる構造または形態を有することでもよい。天然で見いだされない構造には、例えば組換えヒト免疫グロブリン構造が含まれ、前記は例えば、最適化された相補性決定領域（CDR）を有する組換えヒト免疫グロブリン構造が含まれるが、ただしこれらに限定されない。天然には見出されない構造の他の例は、他の細胞性物質を実質的に含まない抗体分子または核酸である。単離された抗体は一般的には、異なる抗原特異性（IL-13Rα1以外）を有する他の抗体を含まない。

抗体フラグメント、より具体的には抗原結合フラグメントは、抗体可変領域またはそのセグメントを保持する分子であり（開示のCDRの3ドメイン、重および／または軽鎖の1つ以上を含む）、前記は、IL-13Rα1（および特にヒトIL-13Rα1（hIL-13Rα1））との選択的結合を付与する。そのような抗体可変領域を含む抗体フラグメントには以下の抗体分子が含まれる（ただしこれらに限定されない）：Fab、F(ab')₂、Fd、Fv、scFv、二特異性抗体分子（すなわち本抗体とは異なる結合特異性を有する第二の機能的部分（別のペプチドまたはタンパク質（例えば抗体またはレセプターリガンド）を含むがただしこれらに限定されない）と連結された、IL-13Rα1特異的抗体または本明細書に開示の抗原結合フラグメントを含む抗体分子）、二重特異性単鎖Fvダイマー、単離CDR3、ミニボディ、‘scAb’、dAbフラグメント、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびタンパク質の骨組みを土台にした人工抗体（以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：フィブロネクチンIII型ポリペプチド抗体（例えば米国特許6,703,199号、WO02/32925およびWO00/34784を参照されたい）またはチトクロームB（例えばNygrenら（Curr Opinion Struc Biol, 1997, 7:463-469）を参照されたい））。抗体の部分または結合フラグメントは、天然であっても、または部分的にもしくは完全に合成により生成されてもよい。そのような抗体部分は、当業者に公知の多様な手段（通常の技術、例えばパパインまたはペプシン消化を含むが、ただしこれらに限定されない）によって調製することができる。

ある具体的な特徴では、本発明は、IL-13Rα1を介して非常に効果的にIL-13機能に拮抗する単離抗体10G5を提供する。10G5は、NHDF細胞におけるIL-13およびIL-4誘導エオタキシン放出、NHDF細胞におけるIL-13およびIL-4誘導STAT6リン酸化、ならびに、血中または抹消血単核球（PBMC）におけるTARCのIL-13刺激放出の阻害を示した。したがって、本発明は、ATCC寄託番号PTA-6933として寄託したハイブリドーマ細胞株により産生される抗体を包含する。本発明はまた、hIL-13Rα1とPTA-6933の抗体との結合について競合する抗体を包含する。本発明のさらに別の実施態様は、hIL-13Rα1と本明細書に開示した抗体との結合について競合する抗体分子である。本発明の具体的な実施態様は、IL-13とhIL-13Rα1との結合を阻害する単離抗体分子を提供する。
本発明の特定の実施態様は、10G5の重鎖および／または軽鎖可変領域配列を有する抗体分子とともにその等価物（1つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とする）またはそのホモローグを含む。具体的な実施態様は、本明細書に開示したCDRドメインまたは本明細書に開示した重鎖および／または軽鎖CDRドメイン一式、またはその等価物（1つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とする）を含む単離抗体分子である。本明細書における“ドメイン”または“領域”という用語の使用は、問題の配列またはセグメントが存在することとなるか、あるいは現時点で存在している、抗体分子の対応する部分を単に指す。

表1は本発明に包含される配列の概括を提供する。
表1

*注記：特定の配列番号が1つ以上の指定抗体に対応する場合、別個の抗体の略称として以下の様式を利用することがある：抗体基準名称−1つの割り当て番号，別の割り当て番号など。前記の例は以下のとおりである：10G5-1,3とは、10G5-1および10G5-3の両方を指す。

具体的な実施態様では、本発明は、配列番号:45の重鎖可変領域、1つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物、およびそのホモローグを含む単離抗体分子を提供する。本開示抗体は、以下の機能的特性の少なくとも1つを示す：（i）NHDF細胞におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害；（ii）NHDF細胞におけるIL-4誘導エオタキシン放出の阻害；（iii）NHDF細胞におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害；（iv）NHDF細胞におけるIL-4誘導STAT6リン酸化の阻害；または（v）血液またはPBMCにおけるTARCのIL-13刺激放出の阻害。特定の実施態様では、本発明は、開示の抗体分子と少なくとも90％相同であり、上記の機能特性の少なくとも1つを示すことを特徴とする開示抗体分子のホモローグを提供する。提供される特定の抗体は、hIL-13Rα1とハイブリドーマ細胞株（ATCC寄託番号PTA-6933として寄託）によって産生される抗体との結合について競合するであろう。
具体的な実施態様では、本発明は、配列番号:49の軽鎖可変領域、1つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物、およびそのホモローグを含む単離抗体分子を提供する。本開示抗体は、以下の機能的特性の少なくとも1つを示す：（i）NHDF細胞におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害；（ii）NHDF細胞におけるIL-4誘導エオタキシン放出の阻害；（iii）NHDF細胞におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害；（iv）NHDF細胞におけるIL-4誘導STAT6リン酸化の阻害；または（v）血液またはPBMCにおけるTARCのIL-13刺激放出の阻害。具体的な実施態様では、本発明は、開示の抗体分子と少なくとも90％相同であり、上記の機能特性の少なくとも1つを示すことを特徴とする開示抗体分子のホモローグを提供する。提供される特定の抗体は、hIL-13Rα1とハイブリドーマ細胞株（ATCC寄託番号PTA-6933として寄託）によって産生される抗体との結合について競合するであろう。

具体的な実施態様では、本発明は、配列番号:45を含む重鎖可変領域および配列番号:49を含む軽鎖可変領域；または1つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物を含む単離抗体分子を提供する。具体的な実施態様は、以下の機能的特性の少なくとも1つを示す前記抗体である：（i）NHDF細胞におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害；（ii）NHDF細胞におけるIL-4誘導エオタキシン放出の阻害；（iii）NHDF細胞におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害；（iv）NHDF細胞におけるIL-4誘導STAT6リン酸化の阻害；または（v）血液またはPBMCにおけるTARCのIL-13刺激放出の阻害。
特定の実施態様では、本発明は、可変重鎖CDR3配列、配列番号:40、およびその保存的改変を含み、以下の機能的特性の少なくとも1つを示す単離されたIL-13Rα1抗体分子が提供さる：（i）NHDF細胞におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害；（ii）NHDF細胞におけるIL-4誘導エオタキシン放出の阻害；（iii）NHDF細胞におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害；（iv）NHDF細胞におけるIL-4誘導STAT6リン酸化の阻害；または（v）血液またはPBMCにおけるTARCのIL-13刺激放出の阻害。特に本発明に包含される重鎖可変領域CDR3配列は表2に列挙される。

表2

特定の実施態様では、CDR1、CDR2および／またはCDR3配列がそれぞれ配列番号:82、配列番号:83および／または配列番号:40である重鎖可変領域；またはCDR配列のいずれか1つ以上に1つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とする前記の等価物を含む単離抗体分子が提供される。さらに別の精選実施態様は、CDR1、CDR2および／またはCDR3配列がそれぞれ配列番号:82、配列番号:102および／または配列番号:40である重鎖可変領域；またはCDR配列のいずれか1つ以上に1つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とする前記の等価物を含む単離抗体分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、配列番号:41の可変軽鎖CDR3配列およびその保存的改変を有し、以下の機能的特性の少なくとも1つを示す単離されたIL-13Rα1抗体分子を提供する：（i）NHDF細胞におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害；（ii）NHDF細胞におけるIL-4誘導エオタキシン放出の阻害；（iii）NHDF細胞におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害；（iv）NHDF細胞におけるIL-4誘導STAT6リン酸化の阻害；または（v）血液またはPBMCにおけるTARCのIL-13刺激放出の阻害。特に本発明に包含される軽鎖可変領域CDR3配列は表3に列挙される。

表3

特定の実施態様では、CDR1、CDR2および／またはCDR3配列がそれぞれ配列番号:84、配列番号:85および／または配列番号:41に示される軽鎖可変領域、または前記CDR配列のいずれか1つ以上に1つ以上の保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物を含む単離抗体分子が提供される。
特定の実施態様では、本発明は、それぞれ配列番号:40および41の重鎖可変領域CDR3配列および軽鎖可変領域CDR3配列、または前記CDR3配列のいずれか1つ以上にその保存的改変を含み、以下の機能的特性の少なくとも1つを示す単離IL-13Rα1抗体分子を提供する：（i）NHDF細胞におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害；（ii）NHDF細胞におけるIL-4誘導エオタキシン放出の阻害；（iii）NHDF細胞におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害；（iv）NHDF細胞におけるIL-4誘導STAT6リン酸化の阻害；または（v）血液またはPBMCにおけるTARCのIL-13刺激放出の阻害。
特定の実施態様では、それぞれ配列番号:82、83、40、84、85および41の重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびに軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3配列；ならびに前記CDR配列のいずれか1つ以上に1つ以上の保存的アミノ酸置換を含むことを特徴とするその等価物を含む単離IL-13Rα1抗体分子が提供される。

当業者には理解されるところであるが、保存的アミノ酸置換は、類似のまたは（意図する目的について）より良好な機能的および／または化学的特徴を付与するアミノ酸残基によるあるアミノ酸の置換である。例えば、保存的アミノ酸置換はしばしば、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換するものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野では既に規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するもの（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するもの（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するもの（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖を有するもの（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するもの（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。そのような改変は、当該アミノ酸配列を含む抗体の結合または機能阻害の特性を有意には低下または変化させないが、前記特性を改善することがある。置換を実施する目的は重要ではない。前記目的には、分子の構造、分子の電荷もしくは疎水性、または分子のサイズを維持または強化することができるより良好なものによる置換が含まれるが、ただし前記に限定されない。例えば、あまり好ましくない残基を同じ極性または電荷をもつ残基で単に置換したい場合があるかもしれない。そのような改変は、当分野で公知の標準的技術、例えば位置特異的変異導入およびPCR仲介変異導入によって導入することができる。当業者が保存的アミノ酸置換を実施するある特別な手段はアラニン走査変異導入である（前記は例えば以下で考察される：MacLennan et al. 1998, Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67；およびSasaki et al. 1998, Adv Biophys 35:1-24）。続いて、当分野で利用可能であるか、または本明細書に記載の機能アッセイを用いて、保持されている機能またはより良好な機能について改変抗体分子を試験する。1つ以上のそのような保存的アミノ酸置換を保有する抗体分子であって、そのようなアミノ酸改変をもたない分子よりも良好なレベルまたは同じレベルでhIL-13Rα1と選択的に結合し、さらにIL-13Rα1機能に拮抗する能力を保持する抗体分子は、本明細書では開示の抗体の“機能的等価物”と称され、本発明の具体的実施態様を構成する。

また別の特徴では、本発明は、開示の抗体の対応するアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含む抗体分子であって、ヒトインターロイキン13レセプターα1（hIL-13Rα1）に関して5nM未満の平衡解離定数（K_D）を示し、さらにhIL-13Rα1仲介活性に拮抗する抗体分子を提供する。具体的な実施態様は、開示の重鎖および／または軽鎖可変領域とそれぞれ少なくとも90％相同である重鎖および／または軽鎖可変領域を含み、以下の機能的特性の少なくとも1つを示す抗体分子である：（i）NHDF細胞におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害；（ii）NHDF細胞におけるIL-4誘導エオタキシン放出の阻害；（iii）NHDF細胞におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害；（iv）NHDF細胞におけるIL-4誘導STAT6リン酸化の阻害；または（v）血液またはPBMCにおけるTARCのIL-13刺激放出の阻害。本発明の他の実施態様は、開示の重鎖および／または軽鎖可変領域とそれぞれ少なくとも90％相同である重鎖および／または軽鎖可変領域を含み、hIL-13Rα1とATCC寄託番号PTA-6933として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体との結合について競合する抗体分子である。可変領域において“少なくとも90％相同”であるとの言及は、少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100％相同な配列を含む。
本明細書に開示した具体的な抗体分子のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有する抗体は、典型的にはIL-13Rα1に対するその特異性を変化させることなく抗体の1つ以上の特性を改善するために生成される。そのような配列を入手するある方法（前記は当業者が利用できる唯一の方法というわけではない）は、本明細書に開示の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする配列を位置特異的またはランダム変異導入によって変異させ、変異した可変領域を含む抗体分子を発現させ、さらに本明細書に記載の機能アッセイを用いてコードされた抗体分子を保持機能について試験することである。

本明細書で用いられるように、2つのアミノ酸配列間のパーセント相同性は、2つの配列間のパーセント同一性と等価である。2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮しつつ、配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、％相同性＝同一の位置の数／位置の総数ｘ100）である（前記ギャップは2つの配列の最適なアラインメントのために導入されねばならない）。配列の比較および配列間のパーセント同一性の測定は、当業者に一般的に知られている方法を用いて決定することができ、数学的アルゴリズムを用いて実施することができる。例えば、アミノ酸配列間および／またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、Meyers and Millerのアルゴリズム（Comput Appl Biosci 1988, 4:11-17）（前記はアラインプログラム（ヴァージョン2.0）に取り込まれている）を用いて決定することができる。さらにまた、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ（Accelrysからオンラインで入手できる）のGAPプログラムによりその規定値パラメーターを用いて決定することができる。

本発明の具体的な抗体は、IL-13とIL-13Rα1との結合を阻害することができる。本発明の具体的な抗体は、hIL-13Rα1と本明細書に開示の抗体のいずれか、特に10G5との結合について競合する。そのような競合抗体は、標準的なIL-13Rα1結合アッセイで、本明細書に開示の105G又はその誘導体と交差競合する（例えば統計的に有意な態様で結合を競合的に阻害する）それらの能力を基準に検証することができる。10G5またはその誘導体とヒトIL-13Rα1との結合を阻害する被検抗体の能力は、被検抗体がヒトのIL-13Rα1との結合について前記抗体と競合することができることを示している。非拘束的理論に従えば、そのような抗体は、ヒトIL-13Rα1上のそれらが競合する抗体と同じまたは関連する（例えば構造的に類似するか、または空間的に接近している）エピトープと結合しえる。10G5または開示したその誘導体との結合について競合する抗体は続いて以下の機能特性の少なくとも1つを有することについて判定することができる：（i）NHDF細胞におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害；（ii）NHDF細胞におけるIL-4誘導エオタキシン放出の阻害；（iii）NHDF細胞におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害；（iv）NHDF細胞におけるIL-4誘導STAT6リン酸化の阻害；または（v）血液またはPBMCにおけるTARCのIL-13刺激放出の阻害。続いて抗体をまた、ヒトIL13-Rα1のPhe233Ala残基における結合感受性について評価することができる。
特定の実施態様では、本発明は、IL−13Rα1機能（IL-13Rα1仲介活性）に拮抗し、さらに200pM未満、好ましくは100pM未満のhIL-13Rα1との平衡解離定数（K_D）を示す単離抗体分子を提供する。前記平衡解離定数は、当業者が容易に利用でき、周知している表面プラズモン共鳴技術（BIACORE^TM（Upsala, Sweden）およびKINEXA(登録商標)（Sapidyne Instruments, Boise, ID）または適切なその等価物が含まれるが、ただしこれらに限定されない）によって決定される。特定の実施態様では、本単離抗体分子は上記のK_Dとともに以下の機能特性の1つを示す：（i）NHDF細胞におけるIL-13誘導エオタキシン放出の阻害；（ii）NHDF細胞におけるIL-4誘導エオタキシン放出の阻害；（iii）NHDF細胞におけるIL-13誘導STAT6リン酸化の阻害；（iv）NHDF細胞におけるIL-4誘導STAT6リン酸化の阻害；または（v）血液またはPBMCにおけるTARCのIL-13刺激放出の阻害。

特定の実施態様では、本発明は、上記のK_Dを示し、IL-13Rα1仲介活性に拮抗し、さらに配列番号:5に示す相補性決定領域3（CDR3）ドメインまたはその中のアミノ酸1位、7位および／または9位に保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物を有する重鎖可変領域を含む単離抗体分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、上記のK_Dおよび重鎖可変領域を示し、さらに配列番号:38に示すCDR3ドメインまたはその中のアミノ酸2位、4位および／または5位に保存的アミノ酸置換を有することを特徴とするその等価物を有する軽鎖可変領域をさらに含む単離抗体分子を提供する。特定の実施態様では、そのような保存的アミノ酸置換は以下を含む：
配列番号:5の1位で、F、M、Q、LおよびVから成る群から選択される置換；
配列番号:5の7位で、F、L、AおよびMから成る群から選択される置換；
配列番号:5の9位で、Y、Q、K、R、WおよびHから成る群から選択される置換；
配列番号:38の2位で、Q、R、M、SおよびTから成る群から選択される置換；
配列番号:38の4位で、E、A、GおよびSから成る群から選択される置換；
配列番号:38の5位で、T、AおよびSから成る群から選択される置換。
したがって、本発明のある実施態様は、配列Xaa₁-Pro-Asn-Trp-Gly- Xaa₂- Xaa₃-Asp- Xaa₄（配列番号:121）を有する重鎖可変領域CDR3をもつ抗体分子を包含し、ここでXaa₁はPhe、Met、Gln、LeuまたはValであり；Xaa₂はSerまたはAlaであり；Xaa₃はPhe、Leu、AlaまたはMetであり；さらにXaa₄はTyr、Gln、Lys、Arg、Trp、His、Ala、Thr、Ser、AsnまたはGlyである。別の実施態様は、配列Gln-Xaa₁-Xaa₂- Xaa₃-Xaa₄（配列番号:122）を有する軽鎖可変領域CDR3をもつ抗体分子を包含し、ここでXaa₁はGln、Arg、Met、Ser、ThrまたはValであり；Xaa₂はTyrまたはValであり；Xaa₃はGlu、Ala、GlyまたはSerであり；さらにXaa₄はThr、AlaまたはSerである。

本発明のある特徴は、
配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18および配列番号:26から成る群から選択される配列を有するCDR3ドメインを有する重鎖可変領域；またはCDR3ドメインを含む配列を有する重鎖可変領域であって、前記配列が配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24および配列番号:25から成る群から選択される、前記重鎖可変領域；および／または
配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38および配列番号:39から成る群から選択される配列を有するCDR3ドメインを有する軽鎖可変領域を含む、単離抗体または抗原結合フラグメントであり、特定の実施態様では、200pM未満である、hIL-13Rα1とのK_Dを示す。
特定の実施態様では、配列番号:50、配列番号:54、配列番号:58、配列番号:62および配列番号:66から成る群から選択される配列を含む重鎖を有する。特定の実施態様では、配列番号:51、配列番号:55、配列番号:59、配列番号:63および配列番号:67から成る群から選択される配列を含む重鎖可変ドメインを有する。特定の実施態様では、配列番号:70、配列番号:74および配列番号:78から成る群から選択される配列を有する軽鎖を有する。特定の実施態様では、配列番号:71、配列番号:75および配列番号:79から成る群から選択される配列を有する軽鎖可変ドメインを有する。

本発明の別の特徴は、以下を保有する、本開示の単離抗体または抗原結合フラグメントである：
配列番号:85に示す配列を有するCDR2ドメインを含む軽鎖可変領域；
配列番号:83に示す配列を有するCDR2ドメインを含む重鎖可変領域；
配列番号:84に示す配列を有するCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域；および／または
配列番号:82に示す配列を有するCDR1ドメインを含む重鎖可変領域。したがって、本発明の特定実施態様は、本明細書に記載の重鎖および軽鎖可変領域ならびにCDR一式（CDR1、CDR2およびCDR3）を有する抗原結合領域を含む、ヒトIL-13レセプターに特異的な抗体分子を提供する。本発明はまた、以下の成分、（1）CDR一式を有する重鎖可変領域および（2）CDR一式を有する軽鎖可変領域の一方および／または両方を含む組成物を提供する。
ある特徴では、本発明は、その中に少なくとも1つの軽鎖可変ドメインおよび少なくとも1つの重鎖可変ドメイン（それぞれV_LおよびV_H）を有するヒトIL-13Rα1に対する単離抗体分子を提供する。
特定の実施態様では、本開示の重鎖可変鎖領域を有する抗体分子は、配列番号:41に示すCDR3配列を有する軽鎖可変領域とともに発現される。他の実施態様では、本開示の軽鎖可変領域を有する抗体分子は、配列番号:40に示すCDR3配列を有する重鎖可変領域とともに発現される。具体的な実施態様では、上述の処方の軽鎖および重鎖は合体した状態で用いられる。本発明の特定の実施態様は、さらに以下を含む抗体分子を提供する：
配列番号:85に示すCDR2ドメインを有する軽鎖可変領域；
配列番号:83に示すCDR2ドメインを有する重鎖可変領域；
配列番号:84に示すCDR1ドメインを有する軽鎖可変領域；および／または
配列番号:82に示すCDR1ドメインを有する重鎖可変領域、または適切なその等価物もしくは誘導体であって上述の保存的アミノ酸置換を含む、前記等価物もしくは誘導体。

開示の重鎖および／または軽鎖CDR、可変領域、または軽鎖もしくは重鎖、または任意のその組合せを含むいずれの抗体分子も本発明に包含される。前記には以下の抗体分子が含まれる（ただしこれらに限定されない）：（1）その中に配列番号:5に示すCDR3配列を有する重鎖可変領域およびその中に配列番号:38に示すCDR3配列を有する軽鎖可変領域を有する単離抗体分子；（2）その中に配列番号:5に示すCDR3配列を有する重鎖可変領域およびその中に配列番号:39に示すCDR3配列を有する軽鎖可変領域を有する単離抗体分子；（3）その中に配列番号:5に示すCDR3配列を有する重鎖可変領域およびその中に配列番号:41に示すCDR3配列を有する軽鎖可変領域を有する単離抗体分子；（4）その中に配列番号:22に示すCDR3配列を有する重鎖可変領域およびその中に配列番号:38に示すCDR3配列を有する軽鎖可変領域を有する単離抗体分子；（5）その中に配列番号:23に示すCDR3配列を有する重鎖可変領域およびその中に配列番号:38に示すCDR3配列を有する軽鎖可変領域を有する単離抗体分子；および（6）その中に配列番号:7に示すCDR3配列を有する重鎖可変領域およびその中に配列番号:38に示すCDR3配列を有する軽鎖可変領域を有する単離抗体分子。

いくつかの実施態様では、本発明の単離抗体は、配列番号:85に示す配列を有するCDR2ドメインを含む軽鎖可変領域；配列番号:83に示す配列を有するCDR2ドメインを含む重鎖可変領域；配列番号:84に示す配列を有するCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域；および配列番号:82に示す配列を有するCDR1ドメインを含む重鎖可変領域を有する。
他の実施態様では、本発明の単離抗体分子は、配列番号:82、配列番号:83および配列番号:7にそれぞれ示すCDR1、CDR2およびCDR3配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号:84、配列番号:85および配列番号:38にそれぞれ示すCDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を有する。
さらに本発明に包含されるものは、（i）配列番号:63に示す重鎖可変領域および／または配列番号:71に示す軽鎖可変領域；（ii）配列番号:62に示す重鎖および配列番号:71に示す軽鎖可変領域；および（iii）配列番号:94に示す重鎖および配列番号:71に示す軽鎖可変領域を含む抗体分子である、

原型抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を生成するためにモノクローナルおよび他の抗体を操作することは当業者の技術範囲内である。前記は、例えば組換えDNA技術を用いて実施することができる。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域または1つ以上のCDRをコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの可変領域、定常領域、または適切な場合には定常領域プラスフレームワーク領域に導入することを必要とするかもしれない。そのような分子は本発明の重要な特徴を形成する。具体的な免疫グロブリン（開示の配列がその中に挿入されるか、あるいはその必須の部分を形成しえる）には、本発明の具体的な実施態様を形成する以下の抗体分子が含まれる（ただしこれらに限定されない）：Fab（可変軽鎖（V_L）ドメイン、可変重鎖（V_H）ドメイン、定常軽鎖（C_L）ドメインおよび定常重鎖1（C_H1）ドメインを有する一価のフラグメント）、F(ab')2（ジスルフィド架橋によって連結されるか、あるいはヒンジ領域で連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント）、Fd（V_HおよびC_H1ドメイン）、Fv（V_LおよびV_Hドメイン）、scFv（単鎖Fvで、V_LおよびV_Hがリンカー、例えばペプチドリンカーによって結合されている、例えば以下を参照されたい：Bird et al. 1988, Science 242:423-426；Huston et al. 1988, Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883）、二特異性抗体分子（本明細書に開示のIL-13Rα1特異的抗体または抗原結合フラグメントを含む抗体分子であって、前記抗体以外の異なる結合特異性を有する第二の機能的部分（別のペプチドまたはタンパク質、例えば抗体またはレセプターリガンドが含まれるが、ただしこれらに限定されない）に連結された前記抗体分子）、二重特異性単鎖Fvダイマー（例えばPCT/US92/09965を参照されたい）、単離CDR3、ミニボディ（自己アッセンブリングして約80kDaの二価ダイマーを形成した単鎖C_H3融合物）、‘scAb’（C_LまたはC_H1のどちらかとともにV_HおよびV_Lを含む抗体フラグメント）、dAbフラグメント（V_Hドメイン、例えば以下を参照されたい：Ward et al. 1989, Nature 341:544-546、およびMcCafferty et al. 1990, Nature 348:552-554；またはV_Lドメイン、例えば以下を参照されたい：Holt et al. 2003, Trends in Biotechnology 21:484-489）、ジアボディ（例えば以下を参照されたい：Holliger et al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448およびWO94/13804）、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（C_H3と結合したscFv、例えば以下を参照されたい：Hu et al. 1996, Cancer Res 56:3055-3061）、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE、または任意のその誘導体、およびタンパク質の骨組みを土台にした人工抗体（以下を含むがただしこれらに限定されない：フィブロネクチンIII型ポリペプチド抗体（例えば米国特許6,703,199号およびWO02/32925を参照されたい）またはチトクロームB（例えば以下を参照されたい：Koide et al. 1998, J Mol Biol 284:1141-1151；およびNygren et al. 1997, Current Opinion in Structural Biology 7:463-469））。ある種の抗体分子（Fv、scFvおよびジアボディ分子が含まれるがただしこれらに限定されない）は、ジスルフィド架橋を取り込んでV_HおよびV_Lドメインを一直線に並べることによって安定化することができる（例えば以下を参照されたい：Reiter et al. 1996, Nature Biotech 14:1239-1245）。二重特異性抗体は、通常の技術（例えば以下を参照されたい：Holliger & Winter, 1993, Current Opinion Biotechnology 4:446-449、前記文献中の個々の方法は化学的またはハイブリドーマからの生成を含む）および他の技術（以下を含むがただしこれらに限定されない：BITE^TM技術（ペプチドリンカーを含む種々の特異性を有する抗原結合領域を保有する分子）および嵌合（knobs-into-holes）操作（例えば以下を参照されたい：Ridgeway et al. 1996, Protein Eng 9:616-621））を用いて作製することができる。二重特異性ジアボディは大腸菌（E. coli）で生成することができ、当業者には理解されるところであるが、これらの分子は他の分子と同様に、適切なライブラリーでファージディスプレーを用いて選別することができる（例えばWO94/13804を参照されたい）。

対象のCDRがその中に挿入される可変ドメインは、任意の生殖系列または再構成されたヒト可変ドメインから入手することができる。可変ドメインはまた、合成により生成することもできる。CDR領域は、対応する可変ドメインに組換えDNA技術を用いて導入することができる。前記を実施することができるある手段は以下に記載されている：Marks et al. 1992 Bio/Technology 10:779-783。発現および選別は以下を含む適切な技術を用いて実施することができる（ただしこれに限定されない）：ファージディスプレー（例えば以下を参照されたい：WO92/01047；Kay et al. 1996, Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press）、酵母ディスプレー、細菌ディスプレー、T7ディスプレー、およびリボソームディスプレー（例えば以下を参照されたい：Lowe & Jermutus, 2004, Curr Pharm Biotech 517-527）。可変重鎖ドメインを可変軽鎖ドメインと対にして、抗原結合部位を提供してもよい。さらにまた、独立した領域（例えば可変重鎖ドメイン単独）を抗原結合に用いてもよい。同様に、当業者には周知のことであるが、Fvフラグメントの2つのドメイン（V_LおよびV_H）は、おそらく別個の遺伝子によってコードされるが、組換えの方法を用い、それらドメインを単一タンパク質鎖とすることができる合成リンカーによって結合させることができる（この場合、V_LおよびV_H領域は対となって一価分子を形成する（scFV））。
特定の実施態様は、生殖系列フレームワーク領域内のCDRを提供する。本明細書の具体的な実施態様は、VH5-51（JH4）に対象の対応するCDRの代わりに重鎖CDRを挿入したものを、例えば配列番号:50、54、58、62および66の場合のように提供する。本明細書の具体的な実施態様は、Vκ3 A27（JK1）に軽鎖CDRを対応するCDRの代わりに挿入したものを、例えば配列番号:70、74、および78の場合のように提供する。

本発明は、ヒト、ヒト化、脱免疫化、キメラ、および霊長類化抗体分子を包含する。本発明はまたベニヤ化(veneering）法によって生成した抗体を包含する（例えば以下を参照されたい：Mark et al. 1994, Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 113：The Pharmacology oh Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp. 105-134および米国特許6,797,492号）。開示の抗体分子に関して“ヒト”と言う場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および／または定常領域を有する抗体分子を特に指し、この場合、前記配列は、ある種のアミノ酸置換を有するか、またはヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされない残基を有するように修飾／改変されてあってもよい（ただし必ずしも必要ではない）。そのような変異は、in vitroランダム変異導入または位置特異的変異導入を含む方法によって、またはin vivo体細胞変異導入によって導入することができる。文献で考察されている変異技術の個々の例は、例えば以下に開示されている技術である：Gram et al. 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580；Barbas et al. 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:3809-3813；およびSchier et al. 1996, J Mol Biol 263:551-567。これらは単なる具体例であり、利用可能な唯一の技術を示しているわけではない。利用可能であり、当業者に周知されている多数の変異技術が学術文献に存在する。開示の抗体分子に関して“ヒト化”とは、別の哺乳動物種（例えばマウス）由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体分子を特に指す。開示の抗体分子に関して“霊長類化”とは、非霊長類のCDR配列が霊長類のフレームワーク配列に挿入された抗体分子を指す（例えばWO93/02108およびWO99/55369を参照されたい）。

本発明の特定の抗体はモノクローナル抗体であり、具体的な実施態様では、それらは以下の抗体様式として存在する：IgD、IgA、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4または前述のいずれかの誘導体。“その誘導体”または“誘導体”という語にはとりわけ以下が含まれる：（i）一方もしくは両方の可変領域（すなわちV_Hおよび／またはV_L）のフレームワーク内またはCDR領域内に改変を有する抗体または抗体分子、（ii）重鎖および／または軽鎖の定常領域内に操作が施された抗体または抗体分子、および（iii）通常は免疫グロブリン分子の部分ではない追加された化学的部分（例えばPEG化）を含む抗体または抗体分子。
可変領域の操作は、1つ以上のV_Hおよび／またはV_LCDR領域内に施すことができる。位置特異的変異導入またはランダム変異導入を実施して変異を導入し、対象の抗体の機能特性における影響を、利用可能なin vitroまたはin vivoアッセイ（本明細書に記載のアッセイを含む）によって判定することができる。
本発明の抗体にはまた、V_Hおよび／またはV_L内のフレームワーク残基に改変が実施され、対象の抗体の1つ以上の特性が改善された抗体が含まれる。典型的には、そのようなフレームワーク改変は抗体の免疫原性を低下させるために実施される。例えば、あるアプローチは、1つ以上のフレーム残基を対応する生殖系列配列に“復帰変異”させることである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来した生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含む可能性がある。抗体が由来した生殖系列配列と抗体のフレームワーク配列を比較することによって、そのような残基を検証することができる。そのような“復帰変異”を実施した抗体もまた本発明に包含される。別のタイプのフレームワーク改変は、フレームワーク領域内で（または1つ以上のCDR領域内でも）1つ以上の残基を変異させてT細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的免疫原性を低下させることを必要とする。このアプローチはまた“脱免疫化”と称され、米国特許公開公報20030153043（Carr et al）にさらに詳細に記載されている。

フレームワークまたはCDR領域内に施された改変に加えて、または前記改変とはまた別に、本発明の抗体を操作してFc領域内を修飾し、典型的には抗体の1つ以上の機能的特性（それらが存在する場合）（例えば血清半減期、補体の固定、Fcレセプター結合、および／または抗原依存細胞性細胞傷害）を改変する。
ある実施態様では、C_H1のヒンジ領域を改変してヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変（たとえば増加または減少させる）して、例えば軽鎖および重鎖のアッセンブリを容易にするか、または抗体の安定性を増加または低下させる。このアプローチは米国特許5,677,425号（Bodmer et al.）にさらに記載されている。
別の実施態様では、抗体のFcヒンジ領域を変異させて抗体の生物学的半減期を短縮する。このアプローチは米国特許6,165,745号（Ward et al.）にさらに記載されている。
別の実施態様では、抗体を改変してその生物学的半減期を延長する。多様なアプローチが可能である。例えば、1つ以上の以下の変異を導入することができる：Thr252Leu、Thr254Ser、Thr256Phe（前記は米国特許6,277,375号（Ward）に記載されている）。あるいは、生物学的半減期を延長するために、IgGのFc領域のC_H2ドメインの2つのループから採取したサルベージレセプター結合エピトープを含むようにC_H1またはCL領域内を改変することができる（前記はPrestaらの米国特許5,869,046号および6,121,022号に記載されている）。

さらに別の実施態様では、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることによってFc領域を改変して、抗体のエフェクター機能を変更させる。例えば、米国特許5,624,821号および5,648,260号（ともにWinter et al.）を参照されたい。
別の例では、アミノ酸残基329、331および322から選択される1つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換え、抗体のC1q結合を改変するか、補体依存細胞傷害性（CDC）を低下または停止させることができる。このアプローチは、米国特許6,194,551号（Idusogie et al）にさらに詳細に記載されている。
別の例では、アミノ酸231位および239位内で1つ以上のアミノ酸残基を改変し、それによって抗体の補体固定能力が改変される。このアプローチは、WO94/29351（Bodmer et al）にさらに記載されている。
さらに別の例では、Fc領域を改変して、抗体依存細胞性細胞傷害性（ADCC）を仲介する抗体の能力を高め、および／または1つ以上のアミノ酸を改変することによってFcγレセプターに対する抗体の親和性を高める（例えばWO 00/42072（Presta）を参照されたい）。さらにまた、FcγR1、FcγRII、FcγRIIIおよびFcRnに対するヒトIgG1上の結合部位をマッピングし、結合が改善された変種が報告されている（例えば以下を参照されたい：Shields et al. J Biol Chem 276:6591-6604, 2001）。

所望のエフェクター機能性に関して精錬するために種々の抗体アイソタイプを含む“ハイブリッド”または“コンビナトリアル”IgG型を作出する概念は全般的に既に記載されている（例えば以下を参照されたい：Tao et al. 1991, J Exp Med 173:1025-1028）。本発明の具体的な実施態様は、抗体部分上でのFcγRレセプターまたはC1qとの結合低下をもたらすことが判明したFc領域に特別な操作が実施された抗体分子を包含する。したがって、本発明は、抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）、補体仲介細胞傷害（CMC）または免疫複合体形成を増長させない（または増長の程度が低い）が、一方、通常の薬物動態（PK）特性は維持する本発明の抗体を包含する。本発明の具体的な実施態様は、その免疫グロブリン構造の部分として配列番号:92に示す配列を含む、本発明に規定した抗体分子を提供する。図16は、配列番号:92を含むIgG2m4（米国特許公開公報US20070148167(A1)に記載）とIgG1、IgG2およびIgG4のアミノ酸配列との比較を示す。上述の実施態様のある具体的な例は、配列番号:94を含む抗体分子であり、前記は10G5-6抗体の基準から外れた配列を有する。上述の実施態様のまた別の具体的な例は、配列番号:96を含む抗体分子であり、前記は10G5H6抗体の基準から外れた配列を有する。
さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、非グリコシル化抗体（すなわち抗体はグリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化は、例えば抗原に対する抗体の親和性を高めるために改変することができる。そのような炭水化物の改変は、例えば抗体配列内の1つ以上のグリコシル化部位を改変することによって実施することができる。例えば、1つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の除去をもたらす1つ以上のアミノ酸置換を実施し、それによって当該部位におけるグリコシル化を排除することができる。そのようなアプローチは、Coらによる米国特許5,714,350号および6,350,861号にさらに詳細に記載されている。

前記に加えまたは前記とは別に、改変されたグリコシル化型を有する抗体、例えばフコシル残基量が低下した低フコシル抗体または2-枝分れGlcNac構造が増加した抗体を作製することができる。そのような改変グリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を高めることが示された。そのような炭水化物の改変は、例えば改変グリコシル化機構を有する宿主細胞で抗体を発現させることによって実施することができる。改変グリコシル化機構を有する細胞は当分野では既に記載されてあり、本発明の組換え抗体を発現させるための宿主細胞として用いて、それによって改変グリコシル化を有する抗体を生産することができる。
特定の抗体分子は検出可能な標識を保有することができるが、または毒素（例えば細胞毒）、放射性同位元素、放射性核種、リポソーム、標的誘導成分、バイオセンサー、陽イオンテールまたは酵素（例えばペプチジル結合またはリンカーによる）と結合させてもよい。そのような抗体分子組成物は、また別の本発明の特徴を構成する。
別の特徴では、本発明は開示した抗体分子をコードする単離核酸を提供する。前記核酸は全細胞中に存在していても、細胞溶解物中に存在していても、または部分精製もしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、他の細胞成分または他の夾雑物（例えば他の細胞の核酸またはタンパク質）から、例えば標準的技術（アルカリ／SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および他の適切な当分野で公知の方法が含まれが、ただしこれらに限定されない）を用いて精製された場合、“単離されている”か、または“実質的に純粋にされている”。前記核酸は、DNA（cDNAを含む）および／またはRNAを含むことができる。本発明の核酸は標準的な分子生物学的技術を用いて入手することができる。ハイブリドーマ（例えばヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ）によって発現された抗体の場合、ハイブリドーマによって産生された抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAを、標準的なPCR増幅またはcDNAクローニング技術によって入手することができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えばファージディスプレー技術を用いて）入手した抗体の場合、抗体をコードする核酸はライブラリーから回収することができる。

本発明は、開示の重鎖および／または軽鎖およびその精選成分、特に対応する開示CDR3領域をコードする単離核酸を包含する。その具体的な実施態様では、CDRは抗体のフレームワーク領域内で提供される。具体的な実施態様では、生殖系列のフレームワーク領域内に挿入されたCDRをコードする単離核酸が提供される。本明細書の具体的な実施態様では、例えば配列番号:52、56、60、64および68のように、対応するCDRをコードする核酸に代わって、VH5-51（JH4）生殖系列に挿入された重鎖CDRをコードする単離核酸が提供される。本明細書の具体的な実施態様は、例えば配列番号:72、76および80のように、対応するCDRをコードする核酸に代わって、Vκ3 A27（JK1）生殖系列に挿入された軽鎖CDRをコードする単離核酸を提供する。可変領域をコードする単離核酸は、以下を含む（ただしこれらに限定されない）任意の所望される抗体分子様式として提供することができる：F(ab')₂、Fab、Fv、scFv、二特異性抗体分子（当該抗体とは異なる結合特異性を有する第二の機能的部分（別のペプチドまたはタンパク質（例えば抗体またはレセプターリガンド）を含むがただしこれらに限定されない）と連結された、本明細書に開示のIL-13Rα1特異的抗体または抗原結合フラグメントを含む抗体分子）、二重特異性単鎖Fvダイマー、ミニボディ、dAbフラグメント、ジアボディ、トリアボディもしくはテトラボディ、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgEまたはその任意の誘導体。

具体的な実施態様では、配列番号:52、配列番号:56、配列番号:60、配列番号:64および配列番号:68から成る群から選択される配列を有する重鎖を含む抗体分子をコードする単離核酸が提供される。具体的な実施態様では、配列番号:43、配列番号:53、配列番号:57、配列番号:61、配列番号:65および配列番号:69から成る群から選択される配列を有する重鎖可変ドメインを含む抗体分子をコードする単離核酸が提供される。本発明の特定の実施態様は、（i）重鎖CDR1ヌクレオチド配列、配列番号:106、（ii）重鎖CDR2ヌクレオチド配列、配列番号:107、および／または（iii）重鎖CDR3ヌクレオチド配列、配列番号:108または配列番号:112を含む抗体分子をコードする単離核酸を提供する。具体的な実施態様では、配列番号:72、配列番号:76、配列番号:80から成る群から選択される配列を有する軽鎖を含む抗体分子をコードする単離核酸が提供される。具体的な実施態様では、配列番号:47、配列番号:73、配列番号:77および配列番号:81から成る群から選択される配列を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体分子をコードする単離核酸が提供される。本発明の特定の実施態様は、（i）軽鎖CDR1ヌクレオチド配列、配列番号:109または配列番号:123、（ii）軽鎖CDR2ヌクレオチド配列、配列番号:110、および／または（iii）軽鎖CDR3ヌクレオチド配列、配列番号:111または配列番号:113を含む抗体分子をコードする単離核酸を提供する。本発明の具体的な実施態様は、抗体部分上でのFcγRレセプターまたはC1qとの結合低下をもたらす、Fc領域に操作を実施した抗体分子をコードする核酸を包含する。本発明のある特定の実施態様は配列番号:93を含む単離核酸である。そのような実施態様のある特定の例は、配列番号:95の配列を含む抗体分子、または配列番号:94の抗原結合フラグメントをコードする核酸である。具体的な実施態様では、合成抗体分子は、適切な発現ベクター内で合成およびアッセンブリングしたオリゴヌクレオチドから作製した核酸を発現させることによって製造することができる（例えば以下を参照されたい：Knappick et al. 2000, J Mol Biol 296:57-86；およびKrebs et al. 2001, J Immunol Methods 254:67-84）。

本発明に含まれるものはまた、本明細書に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約90％同一、より好ましくは少なくとも約95％同一であるヌクレオチド配列を含み、さらに前記ヌクレオチド配列が本発明の抗体をコードする核酸である。同一性を決定するための配列比較の方法は当業者には公知であり、以前に考察したものが含まれる。“少なくとも約90％同一”ということは、少なくとも約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％同一を含む。
本発明はさらに、本明細書に開示した例えば以下を含む核酸相補物と特定のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸であって、当該核酸が、hIL-13Rα1と特異的に結合し、さらにIL-13Rα1仲介活性に拮抗する抗体分子をコードする、前記核酸を提供する：（i）重鎖ヌクレオチド配列、配列番号:52、配列番号:56、配列番号:60、配列番号:64、配列番号:68または配列番号:95；（ii）V_Hヌクレオチド配列、配列番号:43、配列番号:53、配列番号:57、配列番号:61、配列番号:65または配列番号:69；（iii）重鎖CDR1ヌクレオチド配列、配列番号:106；（iv）重鎖CDR2ヌクレオチド、配列番号:107；（v）重鎖CDR3ヌクレオチド配列、配列番号:108または配列番号:112；（vi）軽鎖ヌクレオチド配列、配列番号:72、配列番号:76または配列番号:0；（vii）V_Lヌクレオチド配列、配列番号:47、配列番号:73、配列番号:77または配列番号:81；（viii）軽鎖CDR1ヌクレオチド配列、配列番号:109または配列番号:123；（ix）軽鎖CDR2ヌクレオチド配列、配列番号:110；または（x）配列番号:111または配列番号:113を含む軽鎖CDR3ヌクレオチド配列。核酸をハイブリダイズさせる方法は当分野で周知である（例えば以下を参照されたい：Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989）。本明細書に規定したように、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、5ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）、0.5％w/v SDS、1.0mMのEDTA（pH8.0）を含む前洗浄溶液、約50％v/vホルムアミド、6ｘSSCのハイブリダイゼーション緩衝液および55℃のハイブリダイゼーション温度（または他の同様なハイブリダイゼーション溶液（例えば約50％v/vホルムアミド含むもの）を42℃のハイブリダイゼーション温度とともに使用する）、ならびに0.5ｘSSC、0.1％w/v SDS中で60℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、45℃で6ｘのSSC、続いて68℃で0.1ｘのSSC、0.2％SDS中で1回以上の洗浄である。さらにまた、当業者はハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を操作してハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加または低下させ、互いに少なくとも65、70、75、80、85、90、95、98または99％同一のヌクレオチド配列を含む核酸を典型的には互いにハイブリダイズしたままにすることができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的パラメータおよび適切な条件を設定するための手引きは以下で説明され(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Chapters 9 and 11. 1989；およびAusubel et al.(eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 2.10および6.3-6.4, 1995)、さらにこれらは例えばDNAの長さおよび／または塩基組成を基準にして当業者が容易に決定することができる。

本発明は、本明細書に開示した軽鎖および／または重鎖可変ドメインをコードする核酸（例えば配列番号:43、配列番号:47、配列番号:53、配列番号:57、配列番号:61、配列番号:65、配列番号:69、配列番号:73、配列番号:77および配列番号:81から成る群から選択される）の相補物と中等度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によって少なくとも部分的にコードされる軽鎖および／または重鎖可変ドメインを含む単離抗体を提供する。別の実施態様では、本発明は、本明細書に開示した軽鎖および／または重鎖可変ドメインを含む核酸の相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によって少なくとも部分的にコードされる、軽鎖および／または重鎖可変ドメインを含む単離抗体を包含する。
別の特徴では、本発明は前記核酸を含むベクターを提供する。本発明のベクターには、意図した目的について適切なレベルで所望の抗体分子を発現させるために適切なプラスミドおよび他の発現構築物（適切な場合には例えばファージまたはファージミド）が含まれるが、ただしこれらに限定されない（例えば以下を参照されたい：Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press.）。たいていのクローニング目的のためにはDNAベクターを用いることができる。典型的なベクターには、プラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、およびエピソーム系または組み込み系DNAの他の形態が含まれる。特定の遺伝子の移転、組換えヒト抗体の作製、または他の使用を目的とする適切なベクターを決定することは、当業者の技術範囲内である。特定の実施態様では、組換え遺伝子に加えて、ベクターはまた、宿主細胞内での自律的複製のための複製起点、適切な調節配列、例えばプロモータ、終止配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選別可能マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、適切な場合には他の配列、および高コピー数のための能力を含むことができる。抗体および抗体フラグメント製造のための発現ベクターの例は当分野では周知である（例えば以下を参照されたい：Persic et al. 1997, Gene 187:9-18；Boe et al. 2000, J Immunol Methods 239:153-166；およびLiang et al. 2001 J Immunol Methods 247:119-130）。所望の場合は、当分野で周知の技術を用いて、抗体をコードする核酸を宿主染色体に組み込んでもよい（例えば以下を参照されたい：Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1989；およびMarks et al. WO95/17516）。核酸はまた、エピソームとして維持されるプラスミド上で発現させてもよく、または人工染色体に組み込んで発現させてもよい（例えば以下を参照されたい：Csonka et al. 2000 J Cell Science 113:3207-3216；Vanderbyl et al. 2002, Molecular Therapy 5:10）。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入することができるが、より典型的には、両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は標準的な方法によって発現ベクターに挿入される（例えば抗体遺伝子フラグメントおよびベクターの相補性制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合は平滑単の連結）。本明細書に記載の軽鎖および重鎖可変領域を用い、既に所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードする発現ベクターにそれらを挿入して、V_Hセグメントをベクター内のC_Hセグメントに機能的に連結し、さらにV_Lセグメントをベクター内のC_Lセグメントに機能的に連結することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作出することができる。前記に加えて、または前記とは別に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の抗体鎖分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクター中でクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドであってもまたは異種のシグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。当業者が利用できる任意の技術を用いて、宿主細胞に核酸を導入することができる（例えば以下を参照されたい：Morrison, 1985, Science 229:1202）。対象の核酸分子を発現ベクター中でサブクローニングし、ベクターを含む宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする方法、および実質的に純粋なタンパク質を生成する方法（対応する発現ベクターを宿主細胞に導入する工程および適切な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む）は周知である。そのようにして生成した抗体を通常の方法で宿主細胞から採集することができる。核酸を対象の細胞に導入するために適切な技術は使用する細胞のタイプに左右されるであろう。一般的技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム仲介トランスフェクション、および対象の細胞株に適したウイルス（例えばレトロウイルス、ワクシニア、バキュロウイルス、またはバクテリオファージ）を用いる形質導入が含まれるが、ただしこれらに限定されない。

別の特徴では、本発明は、開示の抗体分子およびその記載したような構成要素をコードする核酸を含む単離細胞を提供する。異なる多様な細胞株を組換え抗体分子の製造に用いることができる。前記細胞株には、原核生物（例えば大腸菌、バシルスおよびストレプトマイセス）由来の細胞、および親核生物（例えば酵母、バキュロウイルス、および哺乳動物）由来の細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない（例えば以下を参照されたい：Breitling et al. Recombinant antibodies, John Wiley & Sons, Inc. and Spektrum Akademischer Verlag, 1999）。開示の核酸または抗体分子を含む植物細胞（トランスジェニック植物を含む）および動物細胞（ヒト以外のトランスジェニック動物を含む）もまた本発明の部分として意図される。適切な哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（例えばDHFR選別可能マーカーとともに用いられた（Kaufman & Sharp, 1982 Mol Biol 159:601-621）DHFR-CHO細胞（Urlaub & Chasin, 1980 Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220）を含むが、ただし前記に限定されない）、NS0ミエローマ細胞（WO87/04462、WO89/01036およびEP338,841に記載のGS発現系を用いることができる）、COS細胞、SP2細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞、YB2/0ラットミエローマ細胞、ヒト胎児腎細胞、ヒト胎児網膜細胞、および本明細書に開示の核酸または抗体分子を保有する他の細胞を含むが、ただしこれらに限定されない）は、本発明のさらに別の実施態様を形成する。本発明の特定の実施態様は、大腸菌（例えば以下を参照されたい：Pluckthun, 1991, Bio/Technology 9:545-551）、または酵母（例えばピキア（Pichia）およびその組換え誘導株）（例えば以下を参照されたい：Li et al. 2006, Nat Biotechnol 24:210-215）を利用することができる。本発明のまた別の特定の実施態様は、抗体分子の生成に真核細胞を利用することができる（例えば以下を参照されたい：Chadd & Chamow, 2001, Current Opinion in Biotechnology 12:188-194：Andersen & Krummen, 2002, Current Opinion in Biotechnology 13:117：Larrick & Thomas, 2001, Current Opinion in Biotechnology 12:411-418）。本発明の特定の実施態様は、適切な翻訳後修飾を有する抗体分子を生成することができる哺乳動物細胞を利用することができる。翻訳後修飾には、ジスルフィド結合の形成およびグリコシル化が含まれるが、ただしこれらに限定されない。別のタイプの翻訳後修飾はシグナルペプチド切断である。本明細書の特定の実施態様は適切なグリコシル化を有する（例えば以下を参照されたい：Yoo et al. 2002, J Immunol Methods 261:1-20）。天然に存在する抗体は、重鎖に結合した少なくとも1つのN-結合炭水化物を含む（前掲書）。種々のタイプの哺乳動物宿主細胞を用いて、効率的な翻訳後修飾を提供することができる。そのような宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、HeLa、C6、PC12、およびミエローマ細胞が含まれる（例えば以下を参照されたい：Yoo et al. 2002, J Immunol Methods 261:1-20；およびParsick et al. 1997, Gene 187:9-18）。
また別の特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドを含む単離細胞を提供する。

また別の特徴では、本発明は本発明の抗体分子を生成する方法を提供する。前記方法は、ヒトIL-13Rα1に対して特異性を有する重鎖および／または軽鎖をコードする核酸を保有する細胞を、前記重鎖および／または軽鎖の発現ならびに抗体分子へのアッセンブリを可能にする条件下でインキュベートする工程、および前記抗体分子を細胞から単離する工程を含む。所望の重鎖および／または軽鎖配列を作出するある例は、PCRを用いて先ず生殖系列重鎖および／または軽鎖可変配列を増幅（および改変）するものである。ヒト重鎖および／または軽鎖可変領域の生殖系列配列は当業者には容易に利用可能である（例えば以下を参照されたい：“Vbase”ヒト生殖系列配列データベースおよびE.A. Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；I.M. Tomlinson et al. 1992, “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH segments with Different Hypervariable Loops”, J Mol Biol 227:776-798；およびJ.P.L. Cox et al. 1994 “A Directory of Human Germ-line Vk Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur J Immunol 24:827-836）。生殖系列配列の変異導入は、標準的方法、例えばPCR仲介変異導入（この場合変異はPCRプライマーに取り込まれる）または部位置特異的変異導入を用いて実施することができる。完全長抗体を所望する場合は、ヒト重鎖定常領域遺伝子のための配列を利用することができる（例えば以下を参照されたい：E.A. Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。これらの領域を含むフラグメントは、例えば標準的PCR増幅によって入手することができる。あるいは、当業者は、既に重鎖および／または軽鎖定常領域をコードするベクターを利用することができる。

原型抗体の特異性を維持する他の抗体分子を組換えにより生成する利用可能な技術が存在する。前記技術の具体例は、免疫グロブリン可変領域またはCDRをコードするDNAを、抗体分子の定常領域、または定常領域およびフレームワーク領域に導入する場合である（例えばEP-184,187、GB2188638およびEP-239400ならびに当分野の学術文献を参照されたい）。抗体分子（キメラ分子を含む）のクローニングおよび発現は文献に記載されている（例えばEP-0120694およびEP-0125023ならびに当分野の他の学術文献を参照されたい）。
本発明のまた別の抗体を生じさせることができ、さらに本明細書で特定した特徴について公知の技術を用いてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体を調製するための基本的技術は文献に記載されている（例えば以下を参照されたい：Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497）。完全にヒトのモノクローナル抗体は利用可能な方法によって作製される。これらの方法は、マウス抗体遺伝子が不活化されて機能的なヒト抗体遺伝子レパートリーにより置き換えられているがマウス免疫系の他の構成要素は不変である免疫系を有する遺伝的に操作されたマウス系統の使用を含むが、ただしこれらに限定されない。そのような遺伝的に操作されたマウスは、天然のin vivo免疫応答および親和性成熟プロセス（高親和性の完全なヒトモノクローナルを生じる）を可能にする。この技術は当分野では周知であり、以下を含む（ただしこれらに限定されない）多様な刊行物に極めて詳細に記載されている：米国特許5,545,806号；同5,569,825号；同5,625,126号；同5,633,425号；同5,789,650号；同5,877,397号；同5,661,016号；同5,814,318号；同5,874,299号；同5,770,249号（GenPharm Internationalに譲渡され、”UltraMab Human Antibody Development System”の傘下のMedarexから入手可能である）；ならびに米国特許5,939,598号；同6,075,181号；同6,114,598号；同6,150,584号および関連するファミリーメンバー（Abgenixに譲渡、彼らのXENOMOUSE(商標)技術を開示する）。さらにまた以下の概説を参照されたい：Kellerman & Green, 2002 Curr Opinion in Biotechnology 13:593-597；およびKontermann & Stefan, 2001, Antibody Engineering, Springer Laboratory Manuals。

また別には、本発明の抗原結合フラグメントのライブラリーをIL-13Rα1と接触させ、所定レベルでの結合（例えば前記抗原に関し200pM未満のK_Dを示す）および選択したIL-13Rα1仲介活性に拮抗する能力を示すことができる。濃縮技術を用いてライブラリーから抗体フラグメントを選別する以下を含む技術（ただしこれらに限定されない）が利用できる：ファージディスプレー（例えば米国特許5,565,332号；同5,733,743号；同5,871,907号；同5,872,215号；同5,885,793号；同5,962,255号；同6,140,471号；同6,225,447号；同6,291,650号；同6,492,160号；同6,521,404号；同6,544,731号；同6,555,313号；同6,582,915号；同6,593,081号ならびにGB9206318の優先権出願（1992年5月24日出願）に基づく他のUSファミリーメンバーおよび／または出願を参照されたい：さらにまたVaughnら（Nature Biotechnology 1996, 14:309-314）を参照されたい）、リボソームディスプレー（例えば以下を参照されたい：Hanes and Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942 ）、細菌ディスプレー（例えば以下を参照されたい：Georgiou et al. 1997 Nature Biotechnology 15:29-34）および／または酵母ディスプレー（例えば以下を参照されたい：Kieke et al. 1997, Protein Engineering 10:1303-1310）。例えば、ライブラリーはバクテリオファージ粒子の表面にディスプレーされ、抗原結合フラグメントをコードする核酸がその表面で発現されディスプレーされる。続いて所望レベルの活性を示すバクテリオファージ粒子から核酸を単離し、この核酸を抗体分子の開発に用いることができる。本発明の個々の重鎖または軽鎖クローンはまた、それぞれ互いに相互作用して結合重鎖および軽鎖分子を形成することができる相補的重鎖または軽鎖についてスクリーニングすることができる（例えばWO92/01047を参照されたい）。ファージディスプレーは文献に記載されている（例えば以下を参照されたい：Kontermann & Stefan（上掲書）およびWO92/01047）。
モノクローナル抗体(Mab)は当業者が利用可能な技術によって精製することができる。対応する腹水、ハイブリドーマ培養液、または対象の被検サンプルの抗体力価は、多様な血清学的または免疫学的アッセイによって決定することができる。前記アッセイには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：沈殿、受動的凝集、酵素結合免疫吸着抗体（ELISA）技術および放射性免疫アッセイ（RIA）技術。

別の特徴では、本発明は、IL-13Rα1の活性に拮抗させる方法を提供する。前記方法は、IL-13Rα1を発現する細胞を本明細書に開示の抗体と、前記抗体分子がIL-13Rα1と結合することを可能にする条件下で接触させる工程を含む。本発明の特定の実施態様は細胞がヒトの細胞である方法を含む。
別の特徴では、本発明は、IL-13Rα1活性に関連する症状を示す対象者においてIL-13Rα1の活性に拮抗させる方法を提供する。前記方法は、対象者に治療的に有効量の本発明の抗体分子を投与する工程を含む。本明細書で“拮抗する”とは、標的の1つ以上の機能、例えば結合、シグナル伝達または他の機能に対抗する、妨害するまたは縮小させる作用を指す。IL-13Rα1の機能的特性の1つ以上の阻害または拮抗は、当分野で公知の方法論とともに本明細書に記載の方法論にしたがって容易に決定することができる。さらにまた、そのような阻害または拮抗は、抗体の非存在下、または例えば無関係の特異性を有するコントロール抗体が存在するときに観察される活性に比して特定の活性の低下を引き起こすはずであることは理解されよう。好ましくは、本発明の抗体分子は、IL-13および／またはIL-4仲介IL-13Rα1機能に、測定されるパラメータの少なくとも10％低下、より好ましくは測定されたパラメータの少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％および95％低下が存在する点まで拮抗する。IL-13Rα1機能のそのような阻害／拮抗は、レセプター機能が、対象者に負の影響を与える特定の表現型、疾患、異常または症状に少なくとも部分的に寄与している事例で特に有効である。
さらにまた意図されるものは、IL-13Rα1仲介疾患、異常または症状の治療のための医薬の製造における開示の抗体分子の使用方法である。したがって、別の特徴では、本発明は医薬的に許容できる組成物を提供し、前記組成物は、本発明の抗体分子および医薬的に許容できる担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤、緩衝剤、または治療される個体に所望の様式および量での抗体分子の投与を容易にするために設計された他の物質を含む。本明細書に開示の抗体分子を、特定の個体（ヒトまたは霊長類）の治療または診断方法で用いることができる。前記治療方法は性質として予防的でも治療的でもよい。本発明の治療方法は、治療的に（予防的に）有効な量の本発明の抗体分子を個体に投与することを含む。“治療的に有効”または“予防的に有効”な量とは、所望の治療／予防効果を所望の期間達成するために意図される投薬において必要な量を指す。所望の効果は、例えば治療される症状に関連する少なくとも1つの徴候の緩和でありえる。当業者には理解されるところであるが、これらの量は、種々の要因（疾患の状態、個体の年齢、性別および体重、ならびに個体で所望の効果を引き出す抗体分子の性能を含むが、ただしこれらに限定されない）にしたがって変動するであろう。応答は、in vitroアッセイ、in vivo非ヒト動物実験によって実証され、および／または臨床試験によってさらに立証されえる。本発明の抗体基剤医薬組成物は当分野で公知の多数の方法によって処方することができる（例えば以下を参照されたい：McGoff and Scher, 2000, Solution Formulation of Proteins/peptides, In: E.J. McNally ed. Protein Formulation and Deliverry, New York, NY: Marcel Dekker; pp. 139-158；Akers & Defilippis, 2000, Peptides and Proteins as Parental Solutions, In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, Philadelphia PA: Taylor and Francis; pp.145-177；Akers et al. 2002, Pharm Biotechnol 14:47-127）。患者の投与に適した医薬的に許容できる組成物は、許容可能な温度範囲内での保存のために最大の安定性を支援しつつ生物学的活性も維持する処方物中に有効量の抗体分子を含むであろう。

医薬的に許容できる抗体ベースの組成物は液体形でも固体形でもよい。液体または固体処方物のいずれの製造技術も利用することができる。そのような技術は当業者の能力の範囲内である。固体処方物は、凍結乾燥、噴霧乾燥または臨界超過液技術による乾燥を含む（ただしこれらに限定されない）任意の利用可能な方法によって製造できる。経口投与用の固体処方物は、処方された量および処方された時間、患者を抗体分子に近づけることができる任意の形でありえる。経口処方物は、錠剤、カプセルまたは散剤を含む（ただしこれらに限定されない）多数の固体処方物の形態をとることができる。あるいは固体処方物は凍結乾燥させ、1回投与または多数回投与のために投与前に溶液にすることができる。抗体組成物は、一般的には生物学的に適切なpH範囲内で処方されるべきであり、保存中に適切なpH範囲を維持するために緩衝させることができる。液体処方物も固体処方物もともに、長期間安定性を維持するために、一般的により低温（例えば2−8℃）で保存することが要求される。処方された抗体組成物、特に液体処方物は、保存中のタンパク質の分解を防止または最低限にするために、有効濃度（例えば1％w/v以下）のベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベンおよび／またはプロピルパラベンを含む（ただしこれらに限定されない）制菌剤を含むことができる。制菌剤はいくらかの患者については禁忌であるかもしれない。したがって、凍結乾燥処方物は、そのような成分を含むかまたは含まない溶液中で再構成することができる。さらに別の成分を緩衝液処方物または固体の抗体処方物に添加してもよい。前記成分には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：糖類、例えば凍結保護剤（以下を含むがただしこれらに限定されない：ポリヒドロキシ炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびドゥルシトール）および／または二糖類（例えばシュクロース、ラクトース、マルトースまたはトレハロース））およびいくつかの事例では対応する塩（NaCl、KClまたはLiClを含むが、ただしこれらに限定されない）。そのような抗体処方物、特に長期間保存を予定されている液体処方物は、例えば2−8℃またはそれより高い温度での長期安定性を促進するとともに、非経口的注射に有用な処方物の製造のために有用な範囲の全体的浸透圧を必要とするであろう。適切な場合には、保存料、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加物を混合することができる。処方物は、二価陽イオン（MgCl₂、CaCl₂およびMnCl₂を含むが、ただしこれらに限定されない）および／または非イオン性界面活性剤（ポリソルベート-80（TWEEN80^TM）、ポリソルベート-60（TWEEN60^TM）、ポリソルベート-40（TWEEN40^TM）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（BRIJ58^TM、BRIJ58^TMを含むがただしこれらに限定されない）とともに他のもの（例えばTRITON X-100^TM、TRITON X-114^TM、NP40^TM、Span85、および非イオン性界面活性剤のPLURONIC(商標)シリーズ（例えばPLURONIC(商標)121）を含むが、ただしこれらに限定されない）を含むことができる。そのような成分の任意の組合せは本発明の特定の実施態様を構成する。

液体様式の医薬組成物は、液状担体、例えば水、石油、動物油、植物油、鉱物油、または合成油を含むことができる。液体様式はまた、生理食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはグリコール（例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）を含むことができる。
前記医薬組成物は、適切なpH、張度および安定性を有する発熱源を含まない医薬的に許容できる水溶液の形態であってもよい。医薬組成物は、等張なビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、または乳酸添加リンゲル注射液による希釈後の投与のために処方することができる。
抗体治療薬の投与用量は当業者の能力の範囲内であり（例えば以下を参照されたい：Lederman et al. 1991, Int J Cancer 47:659-664；Bagshawe et al. 1991, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922）、利用される抗体分子、治療される患者、患者の状態、治療面積、投与経路および所望される治療を含む（ただしこれらに限定されない）多数の要因により変動するであろう。当分野の医師または獣医師は抗体の有効な治療量を容易に決定および処方することができる。投薬範囲は、約0.01から100mg/kg宿主体重、より通常は0.05から25mg/kg宿主体重でありえる。例えば、投薬は、0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重または10mg/kg体重、または1−10mg/kgの範囲内でもよい。限定ではなく例示を目的として、特定の実施態様では、5mgから2.0gの用量を用いて抗体分子を全身にデリバーすることができる。毒性を示さない有効性をもたらす範囲内の抗体濃度を達成する最適な精度は、標的部位での薬剤の利用可能性の動力学に基づく投薬計画を必要とする。前記は、抗体分子の分布、平衡および排泄を考慮することを必要とする。本明細書に記載の抗体は適切な投薬量で単独で用いてもよい。あるいは、他の薬剤の同時投与または連続投与も所望しえる。また別の治療計画と併用する本発明の抗体分子のための治療用投与計画を提供することも可能である。治療することができる個体（対象者）には霊長類、ヒトおよび非ヒトが含まれ、さらに任意の非ヒト哺乳動物または産業的もしくは家畜として重要性を有する脊椎動物が含まれる。

抗体分子は、当分野で公知の任意の投与経路（経口投与、注射による投与（特定の実施態様は静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射を含む）、吸入による投与、または鼻内もしくは局所投与を含むがただしこれらに限定されない）によって、単独でまたは当該個体の治療を促進するために設計された他の薬剤と一緒に個体に投与することができる。投与経路は、当該治療の所望される生理化学的特徴を含む（ただし前記に限定されない）、当業者に公知の多くの配慮を基にして決定されるべきである。治療は、1日単位、週単位、二週間単位、もしくは一ヶ月単位で、または適切な量の抗体分子を処方された期間、所望の治療を達成し維持することができるように任意の他の投与計画に基づいて提供することができる。処方物は、1回の投薬として、または別々の時間での2回以上の投薬として投与することができる。
具体的な実施態様では、治療される症状は、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、慢性副鼻腔炎、枯草熱、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺線維症、食道の好酸球増加症、乾癬、乾癬性関節炎、線維症、皮膚硬化症、炎症性腸疾患（特に潰瘍性大腸炎）、アナフィラキシー、および癌（特にホジキンリンパ腫、グリオーマ、および腎癌）、および一般的なTh2-仲介疾患／症状から成る群から選択される。

本発明はさらに、遺伝子治療の目的で開示の抗hIL-13Rα1抗体分子の投与を提供する。そのような方法では、対象者の細胞は、本発明の抗体分子をコードする核酸で形質転換されよう。前記核酸を含む対象者はその後内因的に抗体分子を生成する。以前にAlvarezら（Clinical Cancer Research 2000, 6:3081-3087）は、単鎖抗ErbB2抗体を対象者に遺伝子治療アプローチを用いて導入した。Alvarezらが開示したこの方法は、本発明の抗hIL-13Rα1抗体をコードする核酸の対象者への導入のために容易に適応させることができる。
本発明のいずれのポリペプチドまたは抗体分子をコードする核酸も対象者に導入することができる。特定の実施態様では、抗体分子はヒトの単鎖抗体である。
核酸は当分野で公知の任意の手段によって対象者の細胞に導入することができる。特定の実施態様では、核酸はウイルスベクターの部分として導入される。ベクターを誘導することができる具体的なウイルスの例には、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、インフルエンザウイルス、および所望の細胞向性を有する他の組換えウイルスが含まれる。
種々の会社が商業的にウイルスベクターを製造している。前記会社には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：AVIGEN, Inc.（Alameda, CA；AAVベクター）、Cell Genesys（Foster City, CA；レトロウイルス、アデノウイルス、AAVベクターおよびレンチウイルスベクター）、CLONTECH（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、Genovo, Inc.（Sharon Hill, PA；アデノウイルスおよびAAVベクター）、GENVEC（アデノウイルスベクター）、IntroGene（Leiden, Netherlands；アデノウイルスベクター）、Molecular Medicine（レトロウイルス、アデノウイルス、AAVおよびヘルペスウイルスベクター）、Norgen（アデノウイルスベクター）、Oxford BioMedica（Oxford、英国；レンチウイルスベクター）、およびTransgene（Strasbourg, France；アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター）。

ウイルスベクターの構築および使用方法は当分野で公知である（例えば以下を参照されたい：Miller et al. BioTechniques 1992, 7:980-990）。特定の実施態様では、ウイルスベクターは複製欠損である、すなわちそれらは自律的に複製することができず、したがって標的細胞で感染性ではない。複製欠損ウイルスは最少ウイルスでありえる。すなわち、前記は、ウイルス粒子を産生するためにゲノムをキャプシドに包み込むために必要なそのゲノム配列のみを保持する。完全にまたはほぼ完全にウイルス遺伝子を欠く欠損ウイルスも同様に用いることができる。欠損ウイルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞に感染しえるという懸念を払拭して特定の局在化領域の細胞への投与を可能にする。したがって、特定の組織を特異的に標的とすることができる。
弱毒または欠損DNAウイルス配列を含むベクターの例には、欠損ヘルペスウイルスベクター（Kanno et al. Cancer Gen Ther 1999, 6:147-154；Kaplitt et al. J Neurosci Meth 1997, 71:125-132；およびKaplitt et al. J Neuro Onc 1994, 19:137-147）が含まれるが、ただし前記に限定されない。
アデノウイルスは、多様な細胞タイプに本発明の核酸を効率的にデリバーするために改変することができる真核細胞DNAウイルスである。弱毒アデノウイルスベクター（例えばStrafford-Perricaudetら（J Clin Invest 1992, 90:626-630）が記載したベクター）はいくつかの事例で望ましい。多様な複製欠損アデノウイルスおよび最少アデノウイルスベクターが報告されている（例えば、WO94/26914、WO94/28938、WO94/28152、WO94.12649、WO95/02697およびWO96/22378を参照されたい）。本発明の複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術によって調製することができる（Levrero et al. Gene 1991, 101:195；EP185573；Graham, EMBO J 1984, 3:2917；Graham et al. J Gen Virol 1977, 36:59）。

アデノ関連ウイルス（AAV）は比較的小さなサイズのウイルスであり、前記は、それらが感染した細胞のゲノムに安定的で位置特異的態様で組み込まれえる。それらは、細胞の増殖、形態学または分化に対し全く影響を引き起こすことなく広域の細胞に感染でき、それらはヒトの病気に関与するようには思われない。遺伝子をin vitroおよびin vivoで伝達させるためにAAV由来のベクターを使用することについて既に記載されている（以下を参照されたい：Daly et al. Gene Ther 2001, 8:1343-1346；Larson et al. Adv Exp Med Bio 2001, 489:45-57；WO91/18088およびWO93/09239；米国特許4,797,368号および5,139,941号ならびにEP488528B1）。
別の実施態様では、遺伝子はレトロウイルスベクターに導入することができる。前記は例えば以下に記載されている：米国特許5,399,346号、4,650,764号、4,980,289号および5,124,263号；Mann et al. Cell 1983, 33:153；Markowitz et al. J Virol 1988, 62:1120；EP453242およびEP178220。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組み込みウイルスである。
レンチウイルスは、いくつかの組織（脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含む）における本発明の抗体分子をコードする核酸の直接デリバリーおよび持続発現のための因子として用いることができる。前記ベクターは、これらの組織の分裂および非分裂細胞を効率的に形質導入し、抗体分子の長期発現を維持することができる。概説のために以下を参照されたい：Zufferey et al. J Virol 1998, 72:9873-80およびKafri et al. Curr Opin Mol Ther 2001, 3:316-326。レンチウイルスパッケージング細胞株が利用可能であり、当分野では一般的知られている。それら細胞株は遺伝子治療のために高力価のレンチウイルスベクターの産生を促進する。その例はテトラサイクリン誘発性VSV-G仮性タイプレンチウイルスパッケージング細胞株であり、前記は少なくとも3から4日間10⁶ IU/mLを超える力価でウイルス粒子を生成することができる（以下を参照されたい：Kafri et al. J Virol 1999, 73:576-584）。前記誘発性細胞株によって生成されたベクターは、非分裂細胞をin vitroおよびin vivoで効率的に形質導入するために必要に応じて濃縮することができる。

シンドビスウイルスはアルファウイルス属のメンバーであり、1953年に始まって世界の多様な箇所でのその発見以来、広範囲に研究されてきた。アルファウイルス、特にシンドビスウイルスによる遺伝子形質導入は、in vitroで多く研究されてきた（以下を参照されたい：Straus et al. Microbiol Rev 1994, 58:491-562；Bredenbeek et al. J Virol 1993, 67:6439-6446；Ijima et al. Int J Cancer 1999, 80:110-118；およびSawai et al. Biochem Biophyr Res Comm 1998, 248:315-323）。アルファウイルスベクターの多くの特性は、開発中の他のウイルス由来ベクターよりもそれらを望ましい代替物にした。前記特性には、発現構築物の迅速な操作、感染性粒子の高力価ストックの生成、非分裂細胞の感染、および高い発現レベルが含まれる（Strauss et al.上掲書）。遺伝子治療のためのシンドビスウイルスの使用は既に報告されている（Wahlfors et al. Gene Ther 2000, 7:472-480；およびLundstrom J Recep Sig Transduct Res 1999, 19(1-4):673-686）。
別の実施態様では、ベクターは、リポフェクションによって、または他のトランスフェクション促進因子（ペプチド、ポリマーなど）を用いて細胞に導入することができる。合成陽イオン脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のin vivoおよびin vitroトランスフェクションのためのリポソームを調製することができる（Feiger et al. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:7413-7417；およびWang et al. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:7851-7855）。核酸の伝達のために有用な脂質化合物および組成物はWO95/18863およびWO96/17823、ならびに米国特許5,459,127号に記載されている。

さらに、裸のDNAプラスミドとしてベクターをin vivoで導入することも可能である。遺伝子治療用の裸のDNAベクターは、当分野で公知の方法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはDNAベクタートランスポーターの使用によって所望の宿主細胞に導入することができる（例えば以下を参照されたい：Wilson et al. J Biol Chem 1992, 267:963-967；Williams et al. Proc Natl Acad Sci USA 1991, 88:2726-2730）。レセプター仲介DNAデリバリーアプローチもまた用いることができる（Wu et al. J Biol Chem 1988, 263:14621-16624）。米国特許5,580,859号および5,589,466号は、トランスフェクション促進因子の非存在下での哺乳動物における外因性DNA配列のデリバリーを開示している。最近、比較的低い電圧での高効率in vivo DNA導入技術（エレクトロトランスファーと称される）が報告された（Vilquin et al, Gene Ther 2001, 8:1097；Payen et al. Exp Hematol 2001, 29:295-300；Mir, Bioelectrochemistry 2001, 53:1-10；WO99/01157；WO99/01158；およびWO99/01175）。
そのような遺伝子治療法に適切であり、本発明の抗hIL-13Rα1抗体分子をコードする核酸を含む医薬組成物は、本発明の範囲内に含まれる。

別の特徴では、本発明は、本発明の抗体分子を用いて問題のサンプル中のIL-13Rα1を識別、単離、定量する方法、または前記IL-13Rα1に拮抗させる方法を提供する。本抗体分子は、研究用ツールとして免疫化学的アッセイで（例えばウェスタンブロット、ELISA、放射性免疫アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫沈澱、または当分野で公知の他の免疫化学的アッセイ（例えば以下を参照されたい：Immunological Techniques Laboratory Manual, ed. J. Goers, 1993, Academic Press）、または種々の精製プロトコルで利用することができる。本抗体分子は、当該抗体分子に付随する活性の識別または測定を容易にするために標識することができる。上記のプロトコルで有用な、検出可能な多様なタイプの標識（例えば酵素、色素、または検出が容易であるかもしくは容易に検出できる何らかの活性／結果を生じる他の適切な分子）を当業者は既に周知している。
本発明のさらに別の特徴は、本明細書に開示した抗体分子または医薬組成物および使用のための指示を含むキットである。キットは典型的には（ただし必ずというわけではない）、キットの内容物の意図される使用を指示するラベルを含む。ラベルという用語は、キット上にまたはキットと一緒に提供されるか、あるいはキットに付随する任意の書き物、または記録資料を含む。

本発明のまた別の特徴に関連して、本明細書に開示の抗体とhIL-13Rα1レセプターとの間の重要な接触点を検証した。この臨界重要接触点は、抗体によるレセプターの結合に強い影響を与える特定の変異を導入することによって検証された。より具体的には、配列番号:101の233位のフェニルアラニン残基のアラニン残基による置換は、抗体と野生型レセプターとの間の結合と比較して、当該抗体と変異体レセプターとの結合の低下をもたらすことが見出された。これは、10G5およびその誘導体の特徴に関して非常に有用な発見である。アミノ酸233周辺の領域を利用するペプチドは、類似の特異性を有するまた別のモノクローナル抗体の生成に有用であろう。したがって、本発明は、Phe233Ala変異を有するhIL-13R配列（すなわち配列番号:120）を含む（完全長であれ、変異を含むそのフラグメント、例えば5から350アミノ酸残基フラグメントであれ）単離ペプチドを包含する。さらにまた、本発明はまた、10G5または10G5誘導体の評価、類似のエピトープに対し特異性を有する抗体の識別、あるいは類似の特異性を有する抗体の作製を目的とする前記ペプチドのアッセイにおける使用を包含する。特定の実施態様では、したがって本発明は、ATCC寄託番号PTA-6933として寄託されたハイブリドーマ細胞によって産生される抗体と同じhIL-13Rα1上の領域を標的とする抗体分子についてスクリーニングする方法を提供する。前記方法は、（a）対象の抗体分子と（i）配列番号:101の単離hIL-13Rα1ポリペプチドまたは配列番号:101の残基233に対応するアミノ酸を含むそのフラグメント、および（ii）配列番号:101の残基233に対応するアミノ酸がフェニルアラニンではなくアラニンである、単離hIL-13Rα1ポリペプチドまたはそのフラグメントとの結合を分析する工程；（b）工程（a）（i）の単離ポリペプチドまたはフラグメントと結合するが、工程（a）（ii）の単離ポリペプチドまたはフラグメントとの結合が有意に低下している抗体を同定する工程；および（c）工程（b）で同定された抗体を回収する工程を含む。有意な減少は、典型的には、抗体と野生型レセプターとの結合と比較して、抗体と変異体レセプターとの結合が10倍を超える低下である。本方法で有用なポリペプチドは、ATCC寄託番号PTA-6933として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生された抗体と結合する、配列番号:101の残基233と対応するアミノ酸を含む配列番号:101のフラグメント、および配列番号:101の残基233に対応するアミノ酸がフェニルアラニンではなくアラニンである対応するフラグメントである。例えば、ヒトIL-13Rα1の細胞外領域（配列番号:101のアミノ酸番号1から317）をその対応するPhe233Ala変異体と一緒に用いることができる。
本発明の別の特徴は、（i）ATCC寄託番号PTA-6933として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生された抗体とhIL-13Rα1との結合について競合し；（ii）IL-13シグナル伝達を阻害する単離抗体であって；（iii）配列番号:101の233位に対応するフェニルアラニン残基のアラニン残基によるhIL-13Rα1の置換が、前記抗体と前記置換をもたないhIL-13Rα1ペプチドとの結合と比較したとき、前記抗体と前記変異体hIL-13Rα1ペプチドとの結合の低下をもたらす、前記単離抗体を含む。
本発明を以下の非限定的な例によってさらに詳しく説明する。

実施例１．ヒトIL-13Rα1細胞外領域を土台にする組換えタンパク質の製造および精製
本明細書に記載のプロトコルを用い、N-末端FLAG(商標)タグ付加融合タンパク質（ヒトIL-13Rα1の細胞外領域の大半（配列番号:101のアミノ酸番号3から317）を含む）を、安定的にトランスフェクトされたCHO細胞クローン（IL-13Rα1.ECRをコードするpEFBOS-S-FLAG(商標)ベクター）によって条件付けした培養液から精製した。この精製hIL-13Rα1.ECRタンパク質を濃縮し、続いてリン酸緩衝食塩水（PBS）、0.02％v/v TWEEN^TMにて脱塩し、続いてろ過滅菌した。典型的な回収は、条件付け培養液1リットル当たり0.4mgタンパク質であった。タンパク質は必要になるまで-80℃で保存した。
方法：IL-13シグナル配列およびFLAG(商標)タグ融合物とともにヒトIL-13Rα1の細胞外領域（ECR）をコードするcDNAを取り込んだpEFBOS-S-FLAG(登録商標)発現ベクターを、標準的な方法を用いて安定的な発現のためにCHO細胞にトランスフェクトした。続いて、10kDaカットオフメンブレンを用いて限外ろ過によりCHO由来条件付け培養液を10倍に濃縮した。濃縮培養液をM2（抗FLAG(登録商標)）アフィニティークロマトグラフィーカラムに適用し、100μg/mLの濃度でFLAG(登録商標)ペプチドにより溶出させた。溶出物を凍結乾燥によって濃縮し、カラム（2.6cmｘ40cm）に充填したGF50 SEPHAROSE^TM樹脂を用いて、トリス（pH8.0）で緩衝液交換を実施した。続いて緩衝液交換分画をMONO^TM Q5/5カラムを用いて陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。IL-13Rα1のタンパク質分解フラグメントは強力に保持され、完全長のIL-13Rα1（より低い塩濃度で溶出した）から分離された。プールした画分およびろ過滅菌した最終生成物をSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析によって評価した。続いてUV吸収を用いてサンプルを定量した（この場合1吸収単位はほぼ1mg/mLとした）。

実施例２．ヒト抗ヒトIL-13Rα1モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の作製
トランスジェニックマウスの免疫：HCo7、HCo12およびHCo7ｘHCo12系統（HUMAB^TMマウス、Medarex, USA）由来の雄および雌のトランスジェニックマウスを実施例1のhIL-13Rα1.ECRで免疫した。最初の免疫については、20−50μgのhIL-13Rα1.ECRを完全フロイントアジュバント（CFA）で乳化し、腹腔内（i.p.）経路により投与した。最低2回および最大3回のその後のi.p.免疫については、20−50μgのhIL-13Rα1.ECRを不完全フロイントアジュバント（IFA）で乳化した。IFA中のhIL-13Rα1.ECRによる第二および第三の免疫の後で、血清をサンプル採取し（後眼窩神経叢より）、本明細書に記載のようにELISAによりhIL-13Rα1.ECRに対するヒト抗体についてアッセイした。高応答マウス（一般的に血清力価は＞1：3200）をハイブリドーマ作製のために選択した。いくつかの事例では、この時点でハイブリドーマ作製に使用されなかった動物には20−50μgのPBS中のhIL-13Rα1.ECRで更なるi.p.免疫を実施した。これらの動物の血清をELISAによってhIL-13Rα1.ECRに対するヒト抗体について再度アッセイし、高応答マウスをハイブリドーマ作製に用いた。ハイブリドーマ作製のために選択したマウスを、脾細胞融合の3−4日前に20−50μgのhIL-13Rα1.ECRで静脈内に追加免疫した。

抗原特異的ELISA：以下のような標準的ELISA様式を用い、プレート結合hIL-13Rα1.ECRと結合することができるmAbについてマウス血清またはハイブリドーマ培養上清液（SNF）を調べた。平底96ウェルMAXISORP^TMプレート（NUNC, Invitro Technologies, #439454）を、PBSで希釈したhIL-13Rα1.ECR（2.5μg/mL）を含む溶液50μLで被覆し、4℃で一晩インキュベートした。PBSで2回洗浄後、PBS中の2%w/vの脱脂乳（ブロッキング緩衝液、200μL/ウェル）を用いてプレートを37℃で1時間ブロックし、続いて0.1％v/vのTWEEN^TM20を含むPBS（洗浄緩衝液）で2回さらに洗浄した。50μLの被検ハイブリドーマSNFまたはマウス血清を各ウェルに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄した。結合したヒトmAbは抗ヒトIgG HRP結合二次試薬（1％w/vスキムミルクおよび0.1%v/v TWEEN^TM20を含むPBSで希釈）を用いて検出した。抗ヒトIgG HRP結合二次試薬の50μL/ウェルを室温で1時間プレートに添加した。続いて、プレートを3回洗浄し、TMB基質で反応させて、ODを450nmで読み取った。

ハイブリドーマの作製：選択した高応答マウスを犠牲にし、脾臓および対応するリンパ節を採取した。脾臓およびリンパ節細胞と融合パートナーSP2/Oとの融合およびその後のハイブリドーマのHAT（ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン）（GIBCO-BRL, #21060-017）選別は、標準的な方法にしたがって実施した（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。略記すれば、37℃水浴および37℃ヒートブロックを用いて遠心を室温に調整した。ポリエチレングリコール（PEG）を37℃に温めた。融合完了後に細胞を培養するために培養液を準備した。培養液は、ハイブリドーマ無血清培養液（HSFM）（GIBCO-BRL, #12045-084）、5％超低IgG FBS（FBS）（GIBCO-BRL, #16250−078）、2mMのGlutamax-1（GIBCO-BRL, #35050-061）、50U/50μg/mLのペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO-BRL, #15070-063）および1ｘのHATを含んでいた。培養液は37℃に温めた。SP2/O細胞を採取し、生存細胞計測を実施した。これらの細胞は、健康で活発に分裂し、さらにログ期にあった。生存率は＞95％であった。SP2/Oは、融合前にHSFM／5％超低IgG FBSで培養し、融合の前日に1：2または1：3に分割した。融合の日に、動物を犠牲にし、直ちに脾臓（および必要ならばリンパ節）を氷上の無菌的培養液（ダルベッコー改変イーグル培養液（GIBCO-BRL, #11995-073）またはDME）に取り出した。脾臓から単一細胞懸濁液を調製し、DME中で2回洗浄し（1800rpmで7分）、2回目の洗浄液は温めた。このSP2/O細胞を温かいDMEで3回洗浄し（1500rpm、7分）、血清の痕跡を完全に除去した。マウスの脾臓1個に対しSP2／O細胞（10⁸）を用い、別々に2回融合を実施した。SP2/Oおよび脾臓細胞を同じ試験管に一緒にプールし、2100rpm（400g）で5分遠心した。DMEを完全に取り除き、一体になったペレットのみにした。DMEを37℃ヒートブロックに置いた。1mLの温PEGを滴々と細胞ペレットに1分間にわたって加え、その間ペレットを穏やかにピペットで攪拌した。攪拌をさらに1分間穏やかに続けた。1mLの温DMEを1分間にわたって滴々と加えた。さらに1mLのDMEを1分間にわたって加えた。続いて20mLのDMEを5分間にわたって加え、その間ゆっくりと攪拌した。前記を続いて1500rpmで5分遠心した。上清を全て除去し、細胞を上記の培養液におだやかに再懸濁した。マウスの脾臓1個を各ウェルに0.2mLとして5枚のマイクロタイタープレートにHAT培養液にてプレートした。3または4日毎に各ウェルから約0.1mLを取り出し、新しいHAT培養液で置き換えることによってこのプレートを培養した。7−10日目でハイブリドーマの増殖についてウェルを調べた（融合の10−14日後のルーチンスクリーニング）。少なくとも2−3日間は前もって培養液を交換しないようにして、約100μLの上清を各ウェルからアッセイのために取り出した。陽性のものを1mLまたは2mLのウェルに移し、徐々に6ウェル-プレートまで増やした。この時点ではハイブリドーマはクローン性ではない。HAT培養液で14日後に、ハイブリドーマをHT（GIBCO-BRL, #11067-030）（HSFM、5％超低IgG FBS、10ng/mLのrhIL-6（R&D Systems, #206-IL-050）およびHT）中でさらに約2週間培養し、続いてHT無しで培養した。

ハイブリドーマの培養：一次ELISAスクリーニングおよびその後の確認ELISAスクリーニングで陽性の結果であったハイブリドーマを限界希釈によってクローニングした。単一コロニーを含む限界希釈ウェルをELISAによってスクリーニングし、陽性ウェルを拡張増殖のために選択した。ウェルの100％で試験が陽性となるまで、さらに何回かの限界希釈クローニングを実施した。
抗体精製用上清液（SNF）の生産のために、T175cm²フラスコ（Falcon, #3028）またはローラーボトル（900cm²）（CORNING, #430849）のどちらかでハイブリドーマを増殖させた。ハイブリドーマSNFの生産に用いた培養液は、5％超低IgG FBS、2mMのグルタミンおよび50U/50μg/mLのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したHSFMであった。ハイブリドーマをコンフルエントまで増殖させ、ほぼ5−10日後に90％を超える細胞が死んでときに遠心によって培養液を採集した。全ての条件付け培養液をSTERICUP^TMフィルター装置（MILLIPORE, #SCGPU11RE）（0.45μm）を用いてろ過した後、mAbを精製した。

精製mAbの製造：モノクローナル抗体は、標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる方法を用いてSNFから精製した。例えば以下の装置および試薬を参照されたい：HPLC：AKTAエクスプローラー（AMERSHAM Biosciences, Sweden）；カラム：プロテインA（HITRAP^TM, 1mL, Amersham Biosciences, Sweden）；緩衝液A：PBS、0.02％TWEEN^TM 20；緩衝液B：0.1MグリシンpH2.8；および緩衝液C：2MトリスpH8.0。
カラムは5体積の緩衝液Aで洗浄することによって調製した。この調製カラムに条件付け培養液を装荷した。100体積の緩衝液Aを用いて洗浄を実施し、20mLの緩衝液Bで溶出させた（10ｘ2mL）。0.2mLの緩衝液Cを含む試験管に採取した。カラムを緩衝液Aで洗浄し、4℃で保存した。10Kカットオフ透析膜を用いPBS、0.02％TWEEN^TM 20に対して脱塩を行った。mAbの純度は、COOMASSIE(登録商標)ブルー染色によるSDS-PAGEを用いて示した。
1.0吸収単位を1.34mg/mLに等価であるとする免疫グロブリンの吸光係数を用い、280nmでの分光測定分析によって抗体を定量した。

実施例３．ヒトIL-13Rα1に対する抗ヒトIL-13Rα1モノクローナル抗体10G5の分析
BIACORE ^TM による実験：標準的なNHS/EDC化学を用い製造業者の指示に従って、実施例1のヒトIL-13Rα1.ECR（20mMクエン酸ナトリウム（pH4.2）中の40μg/mL）を、センサーチップ（CM5, Biosensor, Sweden）に設定固定値（例えば1000RU）で固定した。エタノールアミン（1.0M）（pH8.0）を用い、hIL-13Rα1.ECR固定化後に残留する活性エステルを消失させる。
固定化されたhIL-13Rα1.ECRへの10G5（1.4nMから150nMの濃度範囲、2倍希釈）の結合分析は、デュープリケートで実施した。作成したセンサー図を二価リガンド結合モデルに適合させて結合（K_a）および解離（K_d）速度を同時に導き出し、結合親和性の決定に用いた（K_D, Biaevaluationソフト、BIACORE^TM, Sweden）。
抗IL-13Rα1ヒトmAb 10Ｇ5の結合親和性（K_D）は約254pM（n＝8）であった。

実施例４．抗ヒトIL-13Rα1モノクローナル抗体10G5とカニクイザルおよびマウスIL-13Rα1との結合の分析
カニクイザル(cynomolgus macaque)のIL-13Rα1（cyIL-13Rα1）をコードするcDNAを、カニクイザルの脾臓および骨髄から抽出したmRNAを用いるPCRによってクローニングした。成熟配列はカニクイザルとヒトIL-13Rα1との間で高度に保存されており、アミノ酸同一性は約97％であった（GENBANKアクセッション番号AAP78901を参照されたい）。
精製カニクイザルIL-13Rα1.ECRタンパク質を生産するために、本質的にhIL-13Rα1.ECRに関して上記に記載したようにN-末端FLAG(登録商標)タグ付加融合タンパク質として発現させるために、カニクイザルIL-13Rα1.ECR（GENBANKアクセッション番号AAP78901のアミノ酸9から325、または配列番号:104のアミノ酸1から317）をコードするcDNAをpEFBOS-S-FLAG(登録商標)ベクターにクローニングした。
マウスIL-13Rα1.ECR（GENBANKアクセッション番号O09030のアミノ酸27から344、または配列番号:105のアミノ酸1から318）も発現させ、本質的に上記に記載したようにN-末端FLAG(登録商標)タグ付加融合物として精製した。
mAb 10G5とマウスおよびカニクイザルIL-13Rα1.ECRとの潜在的な交差反応性は、BIACORE^TMによるアプローチを用いて評価した。精製したマウス、ヒトおよびカニクイザルIL-13Rα1.ECRをセンサーチップ（CM5, BIACORE^TM, Sweden）の3つのチャネルに標準的な固定化化学を用いて個々に固定した。15μL/分の流速でレセプターとの結合について、モノクローナル抗体（312.5nMから下に125pMの濃度範囲）を同時に評価した。mAbの親和性の分析は上記の実施例3に記載したように実施した。
この分析の結果により、mAb 10G5は、ヒトレセプター（約254pM）と比較してカニクイザルレセプターに対して10倍低い親和性（約2.9nM）が示され、マウスレセプターとは無視できる程度の結合しか示さないことが分かった。

実施例５．ヒトIL-13Rα1との結合についてIL-13と競合する10G5の能力の分析
IL-13Rα1との結合についてIL-13と競合する10G5の能力を、BIACORE^TM装置による競合アッセイによって評価した。センサーチップは、製造業者の指示に従い標準的なNHS/EDC化学を用いてヒトIL-13を固定することによって調製した。ヒトIL-13Rα1.ECRタンパク質（8μg/mL）を過剰なmAb（50μg/mL）とともに2時間室温でインキュベートし、続いてセンサーチップ上に注入した。固定化IL-13と結合したhIL-13Rα1.ECRタンパク質レベルをセンサー図内の固定時点で記録し、mAbの非存在下で結合した対応するhIL-13Rα1.ECRタンパク質レベルで割った（“相対的IL-13結合”）。1より小さい結合比はIL-13Rα1との結合についてmAbとIL-13との間の競合を示し、一方、1以上の値は、IL-13が結合する位置と異なる位置でmAbがIL-13Rα1と結合したことを示している。
mAb 105Gは、固定したIL-13とhIL-13Rα1.ECRタンパク質との結合を阻害することが判明した。

実施例６．IL-13仲介およびIL-4仲介細胞応答に拮抗する抗ヒトIL-13Rα1モノクローナル抗体の能力の分析
正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）のエオタキシンアッセイ：NHDF細胞は、IL-13に応答してエオタキシンを産生することが示され、IL-13Rα1に対して作製されたmAbはこの応答を阻害するかもしれない。さらにまた、NHDF細胞は、γcレセプターを発現しないことが示され、したがってIL-4のII型レセプターを介して仲介されるIL-4活性を阻害するmAbの能力を分析することを可能にする（すなわち。IL-4RαプラスIL-13Rα1）。種の交差反応性のために、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えばアカゲザル）のIL-13を用いてエオタキシン産生を刺激することができる。
NHDF細胞（Cambrex, ＃CC-2509）を、製造業者の指示にしたがい推奨添加物を補充したFGM培養液（Cambrex, #CC3132）（完全培養液）で培養した。1週間に1度、細胞を1：3または1：5で継代し、使用前にIL-13に対する応答性をモニターした。hIL-13Rα1特異的mAbの拮抗活性を評価するために、20ng/mLのPMA（SIGMA, #P8139）および20μg/mLのポリミキシン（SIGMA, #P4932）を含む完全培養液に2ｘ10⁶/mLに再懸濁し、1ｘ10⁵細胞/ウェルで 96ウェルの平底プレート（COSTAR, #3595）にプレートした。力価測定抗体を細胞に添加し、5%CO₂の湿潤大気中にて37℃で30分インキュベートした。続いて組換えIL-13（ヒトまたは非ヒト霊長類）を30ng/mLの最終濃度でプレートに添加し、5%CO₂の湿潤大気中にて37℃で一晩インキュベートした。続いて上清を取り出し、ELISAによってエオタキシン含有量を評価した。IL-4誘導アッセイについては、IL-13の代わりに組換えIL-4（PHARMINGEN）を最終濃度0.5ng/mLでプレートに添加した。

エオタキシンELISAプロトコル：IMMULON(商標)-4プレート（DYNATECH, #3855）を、PBS（INVITROGEN, #14190-144）中の4ng/mLのマウス抗ヒトエオタキシン抗体（R&D Systems, MAB320）により4℃で一晩被覆した。プレートを1時間室温にてブロックし（200μL/ウェル、1%のBSAおよび0.05%のTWEEN^TM20を補充したTBS）、さらに3回洗浄した（洗浄緩衝液、TBSプラス0.05%のTWEEN^TM20）。NHDF細胞に被検SNFを50μL/ウェルで添加し、プレートを室温で2時間インキュベートし、続いて3回洗浄した。ブロッキング緩衝液中で200ng/mLのビオチン化抗ヒトエオタキシン抗体（R&D Systems, BAF320）を添加し（60mL/ウェル）、室温で1時間インキュベートし、続いて3回洗浄した。ユーロピウム緩衝液中で100ng/mLのストレプトアビジン-ユーロピウム（Wallac, #1244-360）を添加し（100μL/ウェル）、室温で20分インキュベートし、続いて3回洗浄した。強化溶液（Wallac, #12244-105）を150μL/ウェルで添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートリーダーを用いて遅延蛍光をVICTOR（PERKIN-ELMER）読み取った。
組換えヒトエオタキシン（R&D Systems, #320-EO）を用いて標準曲線を確立した。この分析の結果は、IL-13に対する10G5のEC₅₀は0.25μg/mLで、一方、IL-4に対するEC₅₀は2.7μg/mLであることを示した。

NHDFのIL-13／IL-4誘導STAT6リン酸化アッセイ：STAT6のリン酸化（pSTAT6）は、IL-13／IL-4シグナル伝達の必須の要素であり、レセプターの二量体化の数分以内に発生する。IL-13Rα1特異的mAbは、IL-13および／またはIL-4に対する応答におけるSTAT6のリン酸化をブロックすることができる。
このことを確認するために、RPMI培養液（INVITROGEN, #22400-071）の50μL中の2ｘ10⁶のNHDF細胞を96ウェルのV底ポリプロピレンPCRプレート（USA Scientific, #1442-9596）にプレートした。抗IL-13R mAbを必要な濃度で25μL添加し、プレートを4℃で30分インキュベートした。組換えhIL-13（100ng/mL）またはhIL-4（PHARMINGEN, 0.5ng/mL）を25μL添加し、プレートをPCRマシーンで37℃に20分温めた。20分後に、等体積の2ｘの溶解緩衝液（100mMのHEPES、200mMのNaCl、2%v/vのTRITON(商標)X100、100mMのNaF、10mMのDTT、プロテアーゼ阻害剤）を添加し、pSTAT6をELISAにより測定した。

STAT6 ELISAプロトコル：IMMULON(登録商標)-4プレート（DYNATECH, #3855）を、PBS（INVITROGEN, #14290-144）中の10μg/mLの抗ヒトホスホSTAT6（BD Transduction Labs, #621995）で被覆し（50μL/ウェル）、4℃で一晩インキュベートした。プレートを室温で1時間ブロックし（200μL/ウェル、1%のBSAおよび0.05%のTWEEN^TM20を補充したTBS）、3回洗浄した（洗浄緩衝液、TBSプラス0.05%v/vのTWEEN^TM20）。被検溶解物を50μL/ウェルで添加し、プレートを室温で2時間インキュベートし、続いて3回洗浄した。ブロッキング緩衝液中の2μg/mLのビオチン抗STAT6（BD Transduction Labs, #621141、ビオチン結合物、モル比20：1）を添加し（60μL/ウェル）、室温で1時間インキュベートし、続いて3回洗浄した。ユーロピウム緩衝液中で100ng/mLのストレプトアビジン-ユーロピウム（Wallac, #1244-360）を添加し（100μL/ウェル）、室温で20分インキュベートし、続いて3回洗浄した。強化溶液（Wallac, #12244-105）を添加し（150μL/ウェル）、室温で1時間インキュベートした。プレートリーダーを用いて遅延蛍光をVICTOR（PERKIN-ELMER）読み取った。
この分析の結果は、10G5のEC₅₀はIL-13に対しては1.0μg/mLで、一方、IL-4に対するEC₅₀は1.3μg/mLであることを示した。

実施例７．10G5ネズミ抗体可変領域のクローニングおよび配列決定
抗体10G5を産生しているハイブリドーマ細胞からメッセンジャーRNAを調製し、オリゴ-dTプライマーを用いて逆転写してcDNAを生成した。いくつかの別個のPCR反応を実施した。PCR反応は以下の条件で実施した：94℃で2分；94℃で30秒、60℃で30秒および68℃で1分を30サイクル；および68℃で10分。別の2つのPCR条件も抗体遺伝子のクローニングで開発した：1）94℃で2分；94℃で30秒、60℃で30秒および68℃で1分を30サイクル；および68℃で10分；ならびに2）94℃で1分、55℃で1分および72℃で1分を30サイクル。PCRアンプリコンを1.2%アガロースゲルで分離した。重鎖可変領域に関しては、以下のプライマーセットがPCR生成物を生じた。重鎖可変領域の5'末端のためには、プライマーは、VH5、5'-G GGG TCA ACC GCC ATC CTY G-3'（配列番号:114）（ここでYはCまたはT（Degen 2））；およびVH6,5'-GTC TCC TTC CTC ATC TTC CTG CCC-3'（配列番号:115）（Degen 1）であり、一方、V_Hの3'末端のためのプライマーは、HA、5'-C CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA C-3'（配列番号:116）であった。軽鎖可変領域に関しては、4つのプライマーセットがPCR生成物を生じた。PCR生成物は、プラスミドTOPO(登録商標) pCK2.1（INVITROGEN）でクローニングした。重鎖クローンの配列分析は生殖系列、VH5-51と最高の一致を示した。軽鎖可変領域については、生殖系列、VL VKIII A27と最高の一致を示す配列を生じた5'末端のためのプライマーは、VK3、5'-YTC TTC CTC CTG CTA CTC TGG CTC-3'（配列番号:117）（ここでYはC/Tであった（Degen 2））；およびVK4、5'-ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC TTC-3'（配列番号:118）（Degen 1）であり、一方、V_Lの3'末端のためのプライマーは、KA、5'-G AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC C-3'（配列番号:119）であった。
10G5の重鎖および軽鎖可変領域を含む、最初に同定されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、リーダー配列およびいくつかのまた別の下流配列の両方を含んでいた（重鎖については配列番号:42および44、軽鎖については配列番号:46および48を参照されたい）。10G5の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図1ならびに配列番号:43および45にそれぞれ示されている。10G5の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図2ならびに配列番号:47および49にそれぞれ示されている。

実施例８．ファージディスプレーヒトIL-13Rα1ペプチドと結合するmAbの分析
ヒトIL-13Rα1細胞外領域アミノ酸配列の233位フェニルアラニンのアラニンへの変異は、野生型ヒトIL-13Rα1細胞外領域と抗体10G5との結合と比較したとき、本抗体との結合で有意な低下をもたらした。したがって、Phe233は、抗体10G5の結合のためのレセプター上の重要な残基であることが明らかにされた。便利なように、ヒトIL-13Rα1細胞外領域または対応するPhe233Ala変異体を、遺伝子3タンパク質のフラグメント（アミノ酸249−406）とC-末端を介して融合させた（前記は、一般的にLowmanら（Biochem 1991, 30:10832-10838）に記載された方法にしたがった）。続いて、これらIL-13Rα1誘導ペプチドをM13バクテリオファージ上にディスプレーし、固定化10G5または1D9との結合についてELISAによってアッセイした。略記すれば、PBS緩衝液で希釈したmAb（2.5μg/mL）（100μL/ウェル）で一晩インキュベートしてmAbを96ウェルのMAXISORPTMプレート（NUNC）に受動的に吸着させた。被覆溶液を廃棄し、ブロッキング緩衝液で室温にて1時間インキュベートすることによりプレートをブロックし、続いて洗浄緩衝液で1回洗浄した。PBS中の1%w/v脱脂粉乳（希釈緩衝液）により段階的に希釈したファージサンプルを続いてmAb被覆プレートに移した（100μL/ウェル）。室温で2時間インキュベートした後、プレートを3回洗浄し、抗M13 IgG HRP結合ポリクローナル抗体で標識された結合ファージをTMB基質の添加によって検出した。TMB発色は2Mの硫酸水溶液の添加によって停止させ、450nmでの吸収を測定した。

実施例９．抗体の同定
方法：抗体10G5 可変重鎖および可変軽鎖配列（それぞれ配列番号:43および47）を、Fabファージディスプレーベクター、pFab3d（軽鎖構築物中の充填物としてXhoI/ApaIでクローニングした菌類のグラレア・ロゾイェンシス（Glarea lozoyensis）のPKS3対立遺伝子由来1929bp XhoI/ApaIフラグメントを含む）にてクローニングし、続いて可変重鎖および軽鎖CDR3領域内でランダムに変異させた（各ライブラリーは10⁸以上の機能的多様性を有する）。続いて、標準的ファージディスプレープロトコル（例えば以下を参照されたい：Phage Display: A Laboratory Manual, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用い、得られた変異体を溶液中のビオチン化ヒトおよび霊長類（アカゲザルおよびカニクイザル）のIL-13Rα1に対して選別した。ヒトおよび霊長類の配列は文献に開示されている（例えば以下を参照されたい：GENBANKアクセッション番号U62858、CAA70508およびAAP78901）。以降の選別毎に標的の濃度を低下させることによって（例えば10nM、1nM、0.1nMおよび0.01nM）、選別の厳密性を効果的に高め、それによってますます高い親和性ファージを以降の選別毎に濃縮した。ELISAを一次アッセイとして用い、ストレプトアビジンプレートに固定したビオチン化IL-13Rα1を認識するファージ結合組換えFabの能力を決定した（例えば以下を参照されたい：Phage Display: A Laboratory Manual（上掲書））。Myc-捕捉ELISAおよび解離アッセイ（全般的プロトコルは本明細書に記載）を二次スクリーニングツールとして使用した。BIACORE^TM表面プラズモン共鳴およびKINEXA^TMカイネティックエクスクルージョンアッセイを実施して、検証抗体の結合動態の性状を決定した。これらのアッセイは、製造業者の公表プロトコルに従って実施した。特異的抗体は、哺乳動物細胞での発現、生産および性状決定のためにサブクラスIgG4の完全長抗体に変換した（全般的プロトコルは以下に記載）。

Myc-捕捉および解離アッセイ：2つのアッセイを並行して実施した。第一のアッセイ（I）により、ペリプラズム調製物（periprep）から捕捉された抗体量を測定した。このアッセイは、十分かつ等価量の抗体を有するウェルからのみデータが収集されたことを担保した。第二のアッセイ（II）により、プレート結合抗体からのIL-13レセプターの解離を測定した。
アッセイ（I）：IMMULON(登録商標)-4プレート（DYNATECH, #3855）を、PBS（INVITROGEN, #14290-144）中で5μg/mLのポリクローナル抗ヒトカッパ抗体（Immunology Consultants Lab, #GKBF-80A-K116）で被覆し（50μL/ウェル）、4℃で一晩インキュベートした。ブロッキング緩衝液を添加し（200μL/ウェル）、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。適切な（neat）ペリプラズム調製物を添加し（50μL/ウェル）、2時間室温に置いた。このプレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。ブロック緩衝液中で50μg/mLのヒトガンマグロブリン（Pierce, #31879）を添加し、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回午前と午後に洗浄し、その後150μL/ウェルのブロック緩衝液を添加し、その間ずっと37℃でインキュベートした。このプレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。ブロッキング緩衝液中で1μg/mLのビオチン抗Myc（Upstate, #16-212）を用いて（60μL/ウェル）、結合抗体を室温で1時間検出した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。ユーロピウム緩衝液中で100ng/mLのストレプトアビジン-ユーロピウム（Wallac, #1244-360）を室温で20分添加した。最終洗浄工程（3回）を実施し、増感溶液（Wallac, #1244-105）を室温で1時間添加した（150μL/ウェル）。VICTOR（PERKIN-ELMER）プレートリーダーで遅延蛍光によってプレートを読み取った。

アッセイ（II）：IMMULON(登録商標)-4プレート（DYNATECH, #3855）を、PBS（INVITROGEN, #14290-144）中で5μg/mLのポリクローナル抗ヒトカッパ抗体（Immunology Consultants Lab, #GKBF-80A-K116）で被覆し（50μL/ウェル）、4℃で一晩インキュベートした。ブロッキング緩衝液を添加し（200μL/ウェル）、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。適切な（neat）ペリプラズム調製物を添加し（50μL/ウェル）、2時間室温に置いた。このプレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。400ng/mLのFLAG(登録商標)タグ付加ヒトIL13レセプターの60μL/mLを、ブロック緩衝液中で50μg/mLのヒトガンマグロブリン（Pierce, #31879）とともに添加し、4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で2回、6時間間隔で洗浄し、その後150μL/ウェルのブロック緩衝液を添加した。インキュベーションは37℃で実施した。このプレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。ブロッキング緩衝液中で1μg/mLのビオチン抗FLAG(登録商標)（IBI, #3081/6H2411）（60μL/ウェル）を室温で1時間用いて、残留IL-13レセプターを検出した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。ユーロピウム緩衝液中で100ng/mLのストレプトアビジン-ユーロピウム（Wallac, #1244-360）を室温で20分添加した。最終洗浄工程（3回）を実施し、増感溶液（Wallac, #1244-105）を室温で1時間添加した（150μL/ウェル）。VICTOR（PERKIN-ELMER）プレートリーダーで遅延蛍光によってプレートを読み取った。

完全長IgGへの変換：哺乳動物細胞での発現および製造のために抗IL-13Rα1モノクローナル抗体をサブクラスIgG4の抗体に変換した。それらの可変領域を対応するFabベクターからPCR増幅し、LONZA pCON抗体発現ベクター（抗体配列の前にリーダー配列を有する）中でインフレームクローニングを実施した。前記ベクターでは、軽鎖および重鎖のための全ての定常領域のゲノムDNA配列がベクター内で既に操作されていた。発現はヒトサイトメガロウイルス（CMV）初期プロモータによって駆動され、さらにSV40ポリアデニル化シグナルが後に続く。前記プラスミドは、プラスミドの複製およびアンピシリン選別マーカーのための細菌性配列を有し、さらに軽鎖のためのプラスミド、pCONKAPPAは哺乳動物細胞における選別マーカーとしてグルタミンシンターゼのためのGS遺伝子を有する。可変領域のインフレーム融合は全抗体の適切な発現を可能にする。設計によって、マウス軽鎖および重鎖由来のリーダー配列が、抗体のオープンリーディングフレームの前に加えられた。コンセンサスコザック配列（イタリック体のみ）もまたATG開始コドンの周囲に提供され、タンパク質発現レベルを改善した。4つの可変領域のPCR増幅のためにフォワードおよびリバースプライマーを設計した。10G5軽鎖可変領域のためには、以下のフォワードプライマー（配列番号:88）、

および、以下のリバースプライマー（配列番号:89）を用いた。

10G5の重鎖可変領域のためには、以下のフォワードプライマー（配列番号:90）、

および以下のリバースプライマー（配列番号:91）を用いた。

リーダー配列は太字および下線で示され、クローニング部位（軽鎖および重鎖の両鎖のフォワードプライマーにHindIII、リバースプライマーでは、軽鎖についてはBsiWIおよび重鎖についてはApaI）は、下線およびイタリック体で示されている。
これらのプライマー対および10G5可変領域配列を保有するFabベクターを用い、可変領域について20サイクルのPCR増幅を実施した。軽鎖についてはHindIIIおよびBsiWIで、重鎖についてはHindIIIおよびApaIでPCR生成物を消化した。酵素消化PCRフラグメントをLonzaベクターでクローニングした（軽鎖についてはpCONKAPPAおよび重鎖についてはpCONGAMMA4）。続いて、NotIおよびSalIで消化したpCONGAMMA4ベクター由来の対応する重鎖の全発現カセットを、同じ酵素で消化した対応する軽鎖ベクターに挿入した。軽鎖および重鎖の両鎖の全オープンリーディングフレームをDNA配列分析によって確認した。

抗体の発現、精製および特性決定：合体させた軽鎖および重鎖プラスミドDNAまたは1：1の混合比の対応する軽鎖および重鎖プラスミドDNAのどちらかを293由来細胞株にトランスフェクトした。pCONベクターについては、INVITROGEN社の293FREESTYLE^TM懸濁細胞株をそのトランスフェクション試薬と一緒に用いた。200mLの293FREEESTYLE^TM細胞については、各々100μgの重鎖および軽鎖プラスミドDNAおよび300μLの試薬をトランスフェクションに用いた。トランスフェクトした細胞を、採集の前に7−8日間37℃／5%CO₂下でインキュベートした。培養液を採集し、低速MILLIPORE CENTRICON(登録商標)遠心沈殿（濃縮装置、MILLIPORE）によってろ過および濃縮を実施した。

結果：ELISA分析は図5−8に提示されている。図5−7で、それらの活性によって明瞭に識別された変異体は、10G5H6（VHCDR3：配列番号:5；VLCDR3：配列番号:41）；10G5H5（VHCDR3：配列番号:4；VLCDR3：配列番号:41）；10G5H11（VHCDR3：配列番号:3；VLCDR3：配列番号:41）；および10G5H33（VHCDR3：配列番号:25（最後から３番目のアミノ酸残基にThe＝＞Ileの残基変化を含む）；VLCDR3：配列番号:41）であった。図8は、10G5H6よりも効率的に機能することが明瞭に示された10個の変異体を示す。図8で試験したこれらの変異体は、表4に列挙したEC₅₀値ならびに重鎖および軽鎖CDR3領域を有する。

表４

KINEXA(登録商標)分析を精選抗体について実施した。特定の完全長抗体に関するデータを表5および6に示す（これらの表は2つの別個の実験のデータを含む）。
表５

表６

BIACORE（商標）分析をFab様式の種々の抗体について実施した。表7および8は2つの別個の実験のデータを示す。
表７

表８

示したデータは、実施した種々のスクリーニングおよび分析により、IL−13Rα1に対して極めて強化された親和性を有する抗体を同定できたことを示している。明らかになった抗体は、共通のコンセンサスをそれらの配列中に極めて頻繁に明示した。より具体的には、これらの実験から、（1）重鎖可変領域CDR3ドメインの3つの残基（すなわち配列番号:40の残基1、7および9）は変異に関する機能により強く影響を及ぼしがちであること、および（2）軽鎖可変領域CDR3ドメインの3つの残基（すなわち配列番号:４１の残基2、4および5）は変異に関する機能により強く影響を及ぼしがちであることが結論された。
Fc領域が操作された抗体もまた開発した。Fc領域の操作は、FcγRレセプターまたはC1qとの結合の低下を示す抗体を可能にした。FcRn（新生児レセプターまたはブランベル（Brambell）レセプターとしても知られている）との結合は実質的に変化せず、抗体半減期にも変化はない。この改変の目的は、抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）、補体仲介細胞傷害（CMC）を引き起こさないか（または引き起こす程度が弱い）、または免疫複合体を形成しないが、一方、通常の薬物動態（PK）特性を保持する抗体を生成することである。当業者には理解されるところであるが、開示したヒト抗体IgG構造（配列番号:92を包含する）を、本明細書に開示した多様な任意のVHおよびVL配列と一緒に、適切なCκまたはCλと併せて完全長抗体の開発で用いることができる。
操作したFcを有する精選抗体についてKINEXA(登録商標)分析を実施した。操作したIgG様式の10G5-6のアミノ酸およびヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号:94および95に示されている。表9は、KINEXA(登録商標)を用いた2曲線K_d分析で、精選完全長抗体について得られたデータのまとめである。

表９

このようにして操作した抗体は、天然のIgGアイソタイプに比していくつかの利点を示すことが判明した。第一は、それらはIgG2と同じようにはC1qと強く結合せず、補体カスケードの活性化にそれほど有効性を示さないことである。操作抗体はまた、Fcγレセプター、特にFcγRIと生理学的に意味のあるレベルで結合しないか、または極めて低い結合を示し、前記事象は、望ましくないいずれのNK細胞またはT細胞の活性化も排除し（または有意に低下させ）；抗体のADCC仲介能力を有意に妨げ；さらに抗体に対する潜在的なまた別のin vivo排出を排除する（または有意に低下させる）。得られた抗体はまた、IgG2の半減期および基本構造を保持し、これは極めて望ましいことである。10G5-6 IgG2m4の血中半減期は、別個の実験ではSCIDマウスで試験したとき306時間の規模であることが見出された。この半減期はIgG2について報告された数字に匹敵する（例えば以下を参照されたい：Zuckier et al. 1994, Cancer Suppl 73:794-799）。

実施例１０．機能実験−エオタキシン放出
NHDFエオタキシン放出アッセイ：NHDF細胞はCambrex（#CC-2509）から購入し、提供された添加物を補充したFGM培養液（Cambrex, #CC-3132）（下記では完全培養液と称する）で培養した。細胞は、週に1回1：3または1：5で継代し、使用前にIL-13に対する応答性をモニターした。IL-13Rα1抗体の拮抗活性を評価するために、20ng/mLのPMA（SIGMA, #P8139）および20μg/mLのポリミキシン（SIGMA, #P4932）を含む完全培養液に2ｘ10⁶/mLで再懸濁させ、96ウェルの平底プレート（COSTAR, #3595）に1ｘ10⁵細胞/ウェルでプレートした。力価測定抗体を細胞に添加し、5%CO₂インキュベーターにて37℃で30分インキュベートした。続いて、組換えアカゲザルIL-13または組換えヒトIL4（BD PHARMINGEN, #554605）を、各サイトカインについて対応するEC₅₀で用い、5%CO₂インキュベーターにて37℃で一晩インキュベートした。上清を取り出し、免疫アッセイによってエオタキシン含有量をアッセイした。略記すれば、IMMULON(登録商標)-4プレート（DYNATECH, #3855）を、PBS（INVITROGEN, #14190-144）中で2μg/mLの抗ヒトエオタキシン抗体（PHARMINGEN, #555035）で4℃にて一晩被覆した。このプレートをブロッキング緩衝液で室温にて1時間ブロックし、洗浄緩衝液で3回洗浄した。組換えヒトエオタキシン標準物（R&D Systems, #320-EO）とともにNHDF細胞の上清をプレートに添加した。サンプルを室温で2時間捕捉させ、洗浄し、ビオチン化抗ヒトエオタキシン検出抗体（PHARMINGEN, #555060）を200ng/mLで室温にて1時間添加した。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン-ユーロピウム（Wallac, #1244-360）を100ng/mLの濃度で室温にて20分添加した。最終洗浄工程を実施し、増感溶液（Wallac, #12244-105）を室温で1時間添加した。VICTOR（PERKIN-ELMER）プレートリーダーで遅延蛍光によってプレートを読み取った。

結果：IL-13Rα1特異的抗体と接触した時の正常なヒト皮膚線維芽（NHDF）細胞のエオタキシン放出を分析した。刺激因子として、IL-13および／またはIL-4のどちらかを用いてアッセイを実施した。誘発因子としてIL-13を用いたとき、これらのタイプのアッセイでは、最適化抗体は親型（10G5）よりも少なくとも2倍強力であった。倍数で表した機能の相違の例は図9に示されている、この場合10G5、10G5H6および10G5-6のIC₅₀はそれぞれ310ng/mL（約2nM）、110ng/mL（約730pM）、および70ng/mL（約467pM）であることが判明し、IL-13は刺激因子と決定した。図10は、NHDF細胞によるエオタキシン形成の抗体阻害を示し、この場合刺激因子としてIL-4が用いられている。本明細書に記載の多数の完全長抗体を用いて実験を実施した。IL-13によって刺激したときのNHDF細胞のエオタキシン放出阻害に関するデータは表10にまとめられている。

表10

IL-4によって刺激したときのNHDF細胞のエオタキシン放出阻害に関するデータは表11にまとめられている。

表11

実施例１１．機能実験−STAT6リン酸化
NHDF STAT6リン酸化アッセイ：NHDF細胞はCambrex（#CC-2509）から購入し、提供された添加物を補充したFGM培養液（Cambrex, #CC-3132）で培養した。96ウェルのV-底ポリプロピレンPCRプレート（USA Scientific, #1442-9596）にRPMI培養液（INVITROGEN, #22400-071）中で2e6/mLのNHDF細胞を、50μL体積でプレートした。抗IL-13Rα1抗体を25μLの体積で添加し、30分4℃でインキュベートした。組換えアカゲザルIL-13または組換えヒトIL-4（PHARMINGEN）を25μLの体積で添加した。プレートをPCRマシーンで37℃20分間温め、直ちに等体積の2ｘの溶解緩衝液（100μL）を添加した。pSTAT6を免疫アッセイで測定した。IMMULON(登録商標)-4プレート（DYNATECH, #3855）を、PBS（INVITROGEN, #14290-144）中で10μg/mLの抗ヒトホスホSTAT6（BD Transduction Labs, 621995）で4℃にて一晩被覆した（200μL/ウェル）。ブロッキング緩衝液（200μL/ウェル）を室温で1時間添加した。洗浄緩衝液で3回プレートを洗浄した。50μL/ウェルの溶解物を添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄緩衝液で3回プレートを洗浄した。ブロッキング緩衝液中で2μg/mLのビオチン抗STAT6（BD Transduction Labs, 20：1のモル比で結合）を室温で1時間添加して検出を実施した。洗浄緩衝液で3回プレートを洗浄した。ユーロピウム緩衝液中で100ng/mLのストレプトアビジン-ユーロピウム（Wallac, #1244-360）を室温で20分添加した（100μL/ウェル）。プレートを3回洗浄緩衝液で洗浄した。増感溶液（Wallac, #12244-105）を室温で1時間添加し（150μL/ウェル）、VICTOR（PERKIN-ELMER）プレートリーダーで遅延蛍光によってプレートを読み取った。

結果：IL-13およびIL-4誘導STAT6リン酸化の抗体による阻害をNHDF細胞で調べた。誘発因子としてIL-13を用いたとき、最適化抗体は、これらのタイプのアッセイで親型（10G5）よりも少なくとも3倍強力であった。倍数で表した機能の相違の例は図11に示され、この場合10G5および10G5H6のEC₅₀はそれぞれ2.9μg/mLおよび0.8μg/mLと測定され、IL-13は刺激因子であることが決定された。図12は、NHDF細胞でのSTAT6リン酸化の抗体阻害を示している（この場合IL-4が刺激因子として用いられている）。この分析の結果は、10G5および10G5H6についてそれぞれ5.0μg/mLおよび1.8μg/mLのEC₅₀を示した。

実施例１２．機能実験−TARC放出
胸腺および活性化調節ケモカイン（TARC）放出アッセイ（イヌ、アカゲザルまたはヒト）：血液をヘパリン添加VACUTAINER(登録商標)チューブ（VWR, VT6480）に採集した。リンパ球分離メジウム（Lymphocyte Separation Medium, ICN, 50494X）でPBMCを単離した。PBMCまたは全血を96ウェルの平底プレート（COSTAR, #2595）にプレートした。抗体を添加し室温で30分インキュベートした。組換えアカゲザルIL-13を最終濃度10ng/mLで添加し、湿潤チャンバー内でCO₂とともに37℃で24−72時間インキュベートした。上清または血漿を採集した（TARCは24時間から検出できるが、レベルは増加し続ける）。免疫アッセイによってTARCを測定した。IMMULON(商標)-4プレート（DYNATECH, 3855）を、PBS（INVITROGEN, #14290-144）中で2μg/mLの抗ヒトTARC（R&D, #AF364）で被覆した（50μL/ウェル）。プレートを4℃で一晩インキュベートした。ブロッキング緩衝液（200μL/ウェル）を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄緩衝液で3回プレートを洗浄した。血漿または上清を添加し（50μL/ウェル）、室温で2時間インキュベートした（血漿希釈1：2）。標準曲線には20ng/mLで始まる2倍希釈の組換えヒトTARCが含まれていた。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。検出は、ブロッキング緩衝液中で250μg/mLのビオチン抗ヒトTARC（RDI, #RDI-TarcabrP1、20：1のモル比でビオチンと結合）を用いて室温で1時間実施した（60μL/ウェル）。プレートを3回洗浄緩衝液で洗浄した。ユーロピウム緩衝液中で100ng/mLのストレプトアビジン-ユーロピウム（Wallac, #1244-360）を室温で20分添加した（100μL/ウェル）。プレートを3回洗浄緩衝液で洗浄した。増感溶液（Wallac, #12244-105）を添加し（150μL/ウェル）、室温で1時間インキュベートした。遅延蛍光をVICTOR（PERKIN-ELMER）リーダーで読み取った。
結果：10ng/mLのIL-13による刺激後のTARC放出に対する本抗体の影響を調べた。図13は、例えばヒト全血におけるTARC（CCL17）のIL-13刺激放出を阻止する10G5-6の能力を示している。抗体は約112ng/mL（746pM）のIC₅₀を示した。図14は、ヒト全血のIL-13刺激TARC放出アッセイにおける、また別の抗体（10G5H6）の10G5 WT（野生型）に対する機能を示している。図15は、アカゲザルの全血のアカゲザルIL-13による刺激後のTARC放出阻止における10G5-6の影響を10G5H6の影響とともに示している。

実施例１３．機能実験−ホジキン症の細胞増殖の阻害
方法：10G5、10G5H6および10G5-6をアッセイして、前記抗体がホジキン症細胞株L1236の細胞増殖の阻害に有効であるか否かを決定した。ホジキン細胞およびリード-スターンバーグ細胞は、サイトカインIL-13に関して以前に調べられたことがあり（例えば以下を参照されたい：Kapp et al. 1999, J Exp Med 189:1939-1945；Skinnider et al. 2001, Blood 97:250-255；Skinnider et al. 2002, Blood 99:618-626；および米国特許6,468,528号）、本明細書では前記を分析する方法が考察される。
結果：このアッセイでは、10G5は約300ng/mL（2nM）のIC₅₀を示し、一方、10G5H6および10G5-6の両方は約50ng/mL（約330pM）のIC₅₀をもたらし、両値は、親の10G5 IgGのIC₅₀よりも約6倍高い改善を示した。図17を参照されたい。

Claims (2)

1. 重鎖可変領域が配列番号:63に示されるアミノ酸配列を含み、さらに軽鎖可変領域が配列番号:71に示されるアミノ酸配列を含む、ヒトインターロイキン13レセプターアルファ1と結合する単離抗体。
2. 請求項１に記載の抗体および医薬的に許容できる担体を含む組成物。

Images