JP5214455B2 - 空間変調光学力顕微鏡検査を使用して細胞の変形能を検出するための装置および方法 - Google Patents

Description

本発明は、その内容が参照によって全体に本明細書に組み込まれる、２００５年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／７２６，６２０号からの優先権を主張する。

病気はしばしば、病気独特の分子および／または遺伝子の指紋（特有パターン）によって特徴付けられる。しかしながら癌を含む多くの病気に関してこれは、限定された成功しか与えてこなかった。部分的には細胞内の分子経路が病的になる多くの可能な経路が存在するので学ぶべきことは多い。

癌はなお、この問題に対する数１０年の集中した研究活動にもかかわらず米国における主要な死因である。しかしながら細胞はまた、生化学的および遺伝学的エンティティであることに加えて、弾性といった物理的性質を有する機械的エンティティでもある。癌を含む、細胞の細胞骨格的タンパク質ネットワーク（すなわち細胞の構造的完全性）に影響を与える病気は必然的に、変化した機械的性質（例えば弾性）を細胞に与えるはずである。この研究分野はまだ幼少期にあるが、最近の研究は光学的手段によって有効な細胞の弾性を実験的に測定すること（Ｇｕｃｋらの参考文献を参照のこと）に基づいて正常な細胞から癌細胞を首尾よく区別している。

細胞に力を印加する既存の方法は、Ｇｕｃｋ，Ｊｒ．らによる「Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａｎ Ｉｎｈｅｒｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ（悪性の形質変換および転移性反応能をテストするための固有細胞マーカとしての光学的変形能）」、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ８８：３６８９〜９８、２００５に記載されているように、癌細胞が変形能を増加させていることを示している。運動量を保持する光子は媒体（例えば光学的ピンセット）とは異なる屈折率を有する顕微鏡的物体の質量中心に正味の力を作用させ得ることが知られている。以前行われた実験は、生成された表面力が正味の力より遥かに大きい可能性があり、細胞といった生物学的に重要な物体を変形させるために十分に強力であることを示している（Ｇｕｃｋ，Ｊ．らによる「Ｔｈｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ： Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｌａｓｅｒ Ｔｏｏｌ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｅ Ｃｅｌｌｓ（光学的ストレッチャ（伸張具）：細胞を微細操作するための新規なレーザ工具）」、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ８１：７６７〜８４（２００１）を参照のこと）。Ｇｕｃｋらの光学的ストレッチャは、さもなければ同じに見える細胞間で光学力が印加されたときに癌細胞が著しく大きな変形能を示すことを示している。

特にこの光学的ストレッチャでは２つの反対方向に伝播するビームが浮遊状態の細胞を一度に１個、トラップしてストレッチする。ストレッチの大きさは、顕微鏡搭載ＣＣＤカメラに記録され、ストレッチされた細胞のアスペクト比（長軸対短軸）の測定値は光学的変形能パラメータを与える。測定された変形能は実際には、細胞の機械的および光学的性質（すなわち屈折率）のコンボリューションであり、したがって走査力顕微鏡の直接の機械的探査子とは異なり、光学的性質の知識に基づいてこれらの測定値から弾性係数が推定されなくてはならない（Ｌｅｋｋａ，Ｍ．らによる「Ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃｅｌｌｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （走査力顕微鏡検査によって研究された正常および癌性の人間気泡細胞の弾性）」Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８：３１２〜６（１９９９）を参照のこと）。これは、臨床治療目的および大抵の科学的目的のためには、変形能測定パラメータの統計的有意性と信頼性が十分であって、弾性係数の厳密な計算が必要とされないので、大きな障害にはならない。

Ｇｕｃｋらは、測定された変形能が侵襲性によく相関していることと、光学的変形能測定値が細胞のアスペクト比（長軸対短軸）に関連していることとを示している。

しかしながら光学的ストレッチャ技法の本当の限界は、浮遊している細胞だけが測定され得ることである。不都合にもこれは、細胞が通常は細胞同士接触していて固形の細胞外支持体（すなわち固形組織）を有しているので、細胞が存在するためには、非生理的状態である。付着する如何なる表面も持たない細胞はその接着斑点および関連ストレスファイバを直ぐに失うので、浮遊状態の人為結果である細胞の生体内特性と比較して、細胞の弾性特性の大きな変化が存在し得る。

細胞の弾性特性を測定するための他の技法では、表面上の正常細胞の弾性と癌細胞の弾性とを比較するために走査力顕微鏡検査が成功裏に適用されてきたが、この方法は、１）この技法があまりに遅くて（１日にほんの数個の細胞しか測定できない）、臨床的世界への移行を考えることを困難にしていることと、２）サンプルとの機械的接触を避けることが困難であり、したがって１連の細胞を測定するときに探査針の汚染が実際に危険であることという２つの主要な困難に悩まされている。

したがって、表面上の細胞を測定できて、細胞への損傷を避け、商業的に実行可能にするためにこの技法をスピードアップできる技法が必要とされる。

本発明の１つの目的は、付着した細胞に光学的力が印加されることを可能にすることと、結果として生じる表面のたわみに関して光路リンクの高感度で定量化可能な測定を可能にすることとである。

本発明の空間変調光学力顕微鏡（ＳＭＯＦＭ）は、光学的に印加された表面力による細胞表面のたわみの定量化が干渉感度（サブナノメートル感度）で検出されることを可能にする。あるいは、ＳＭＯＦＭは、非光学的に印加された表面力（すなわち流体力学的力、流体静力学的力、静電気力、磁気力、浸透力、機械力または慣性力）による細胞表面のたわみを定量化するために使用され得る。この定量化は、コンピュータ制御空間光変調器を使用して画像の一連の４個の位相偏移レプリカを画像形成し、既存のアルゴリズムを使用してピクセルごとの光路長を計算することによって実行される。光路長の変化とその結果としての形状変化が決定され得る（各成分比の屈折率が変化しないと仮定する）。

光の空間光変調は、本発明では最大２つの異なる方法に関与している。第１にこれは、透過（画像形成）時に低コヒーレンス光で照明されたサンプル画像のフーリエ変化を空間的に変調することによってサンプルの光路長変化の検出に使用される。第２に、視野におけるユーザ定義の強度によってユーザ定義の位置で物体に光学的に力を加える（光学力印加の）ために使用されるレーザ光を形成するために、別の空間光変調器が使用され得る。本実施形態における各空間光変調器は、異なる源（空間光変調器（ＳＬＭ）ＳＬＭ１：画像形成源すなわち低コヒーレンスダイオード）、空間光変調器（ＳＬＭ）ＳＬＭ２：光学力印加のためのレーザ源）からの光信号を変調する。

このようにして本発明によって、如何なるタイプの細胞の光学的変形能でも空間変調光学力顕微鏡（ＳＭＯＦＭ）上で測定され得るので、独自の光学的変形能シグネチャを有する、癌細胞を含む病変細胞が識別され得る。診断ツールとして使用されることに加えて空間光変調力顕微鏡はまた、特定の病変細胞状態による光学的変形能の如何なる変化の原因も理解するための調査ツールとしても使用可能である。このような細胞の光学的変形能は、構造的タンパク質発現のレベルとパターンとに相関付けられる可能性があり、例えば空間変調力顕微鏡が病気によって引き起こされる細胞の粘弾性応答の変化に関して分子的起源を明らかにすることを可能にする。

本発明の装置は、光学に基づいているので、迅速で無菌の測定プラットフォームであるという利点を有する。先行技術とは対照的に、本発明で探査される物体または細胞は、表面（すなわち顕微鏡のカバースリップ表面）に付着している可能性があり、したがって細胞の生来的に存在する接着班とストレスファイバとを保持し得る。

本検出技法（空間変調光学顕微鏡検査を使用する）は、先行技術の方法と比較してサブナノメートルレベルの感度による変形の検出のための遥かに高感度の技法である。本発明のより高い感度は、１）弾性応答のより大きなダイナミックレンジが探査され得ることと、および２）検出可能な変形がより低いレーザパワーで達成され得ることという２つの重要な利点を有する。この第２の利点は、並列化のための重要な考慮事項である。

もう１つの実施形態では正常細胞と病変細胞との光学的変形能は、測定可能であって、細胞骨格的／構造的タンパク質発現の測定値と相関付けられ得る。タンパク質発現は、例えば目標とされたタンパク質を蛍光タグ付けして蛍光画像を収集することによって決定され得る。

この方法において本発明の光学力顕微鏡検査装置は、癌性表現型の特徴付けに新しい特徴を加えて、細胞の分子的および遺伝子的パターンを変形能の機械的測定値に相関付けるための貴重なツールである。本発明はまた、変形能測定パラメータに基づいて癌検診検定のための根拠を提供する。

したがって下記の本発明の詳細な説明がよりよく理解され得るように、また当分野へのこの寄与がよりよく評価され得るように、本発明と一致するある幾つかの特徴が概説されてきた。下記に説明される、また添付の特許請求の範囲の主題事項を形成する本発明に一致する更なる特徴が存在することは勿論である。

これに関して本発明に一致する少なくとも１つの実施形態を詳細に説明するに先立って、本発明がその適用において構成の細部に限定されず、また下記の説明に述べられ、図面に図示された構成要素の配置に限定されないことは理解されるべきである。本発明に一致する方法と装置は、他の実施形態も可能であり、種々の方法で実施および実行されることが可能である。またここで使用される表現と用語ならびに下記に含まれる要約が、説明のためのものであって限定とみなされるべきではないことは理解されるべきである。

そのようなものとして当業者は、本開示が基づく概念が本発明の幾つかの目的を実行するための他の構造、方法およびシステムの設計のための根拠として直ちに利用可能であることを認める。したがってこのような構成が本発明に一致する方法と装置の精神と範囲から逸脱しない限りにおいて、特許請求の範囲がこのような同等の構成を含むものとみなされることは重要である。

本発明は、物体が従来のアプリケーションのように浮遊状態にあるよりはむしろ表面に静止または付着している間に、光学的に基づく力を印加してその結果生じる、細胞といった物体の変形を高感度に検出できる光学力測定装置に関する。

特に、一実施形態において、本発明は、光学力を関心の潜在的に多くの領域に同時に差し向けるために、例えばホログラフィック光学トラッピング技術を使用して、印加光学力の関数として物体の変形を測定する。

もう１つの実施形態では、本発明は、定量的位相顕微鏡検査技法−例えば空間変調光学力顕微鏡検査（ＳＭＯＦＭ）を使用して物体の変形を測定する。

好適な実施形態において本発明は、引き続いて物体の変形が測定され得るように、表面に付着または静止している物体に摂動を起こさせるための力探査子として探査ビームを生成するために、顕微鏡対物レンズに連結された、シングルビーム光学力探査能力を有する、またはマルチビーム光学力探査の可能なホログラフィック光学トラッピングシステムを有する空間変調光学力顕微鏡検査（ＳＭＯＦＭ）を利用する。

本発明は、先行技術の技法とは対照的に、浮遊していない状態で物体が測定されることを可能にする。実際に、本発明で測定される物体は、如何なるタイプの付着細胞であってもよく、細胞が正常細胞または癌細胞であるかどうかを決定するために光学的技法が使用される。他の細胞タイプ（例えば幹細胞）または細胞状態（例えば病変状態）もまた、目標の細胞タイプまたは細胞状態が光学的に基づく力探査子に対して特有の弾性応答または粘弾性応答を有するという条件で、光学的変形能によって検出され、および／または特徴付けられ得る。

関心の細胞のたわみを発生させる光学的に生成された表面力は、光子が異なる屈折率の媒質を横切る際の光子運動量の保存によるものである。屈折率ｎ₁を有する媒質１内の光子が屈折率ｎ₂を有する媒質２に入ってくると、光子の運動量はｎ₁Ｅ／ｃからｎ₂（１−Ｒ）Ｅ／ｃに変化する。ここで、Ｅは光子エネルギーであり、Ｒはフレネルの公式（Ｒ〜１０^-3）によって与えられる反射率である。更にその光子運動量がｎ₁ＲＥ／ｃである反射成分が存在する。運動量保存のために、Δｐによって与えられる表面上の運動量が捕捉される。

こうして表面は、力Ｆ＝Δｐ／Δｔを経験する。この方法で表面力は、より高濃度の媒質から離れるように表面をたわませ、それによってこのより高濃度の媒質の光路長を入射軸に沿って増加させる。異なるサンプルに関して光路長変化を測定することによってそれらの光学的変形能が比較され得る。

このように、物体の表面のたわみ（すなわち歪み）の程度は、物質の粘弾性特性の関数である。同等の照明条件下で同じ光学特性を有する２つの物体の応答を比較することは、それらの粘弾性応答の比較を可能にする。

本発明において、測定は物体の画像の一連の位相偏移レプリカを画像形成し、あるアルゴリズムを使用してピクセルごとの光路長を計算することによって、光学的に印加された表面力による物体表面のたわみを定量化することによって実行される。観測可能な光学的変形能は、所定の入射強度（およびビームプロファイル）における形状変化（例えば光路長の部分変化）の大きさを含む。光路長は、物体の屈折率ｎとビームが横切る物体の真の物理的長さＬとを乗算したもの（すなわち光路長＝ｎＬ）として定義される。したがって癌細胞といった物体に関して光路長変化を測定し、これを他の物体（すなわち非癌細胞）の光路長変化と比較することによって、光学的変形能が取得されて癌診断され得る。

特に口部扁平上皮細胞癌腫（ＯＳＣＣ）の検出は、本技法によって決定され得る。結果として得られた癌性上皮細胞（付着している）は、線維芽細胞（すなわち肉腫）の様な間質細胞から導出される癌より遥かに一般的であって、このような細胞を取り調べる得る本技法による癌腫の検出のための主要な候補である。

しかしながら本技法はまた、任意のタイプの癌腫（すなわち胸部、前立腺などといった任意の器官の任意のタイプの上皮から導き出される癌）に関して任意の細胞をテストするために適用可能である。

特に本発明では、物体（例えば細胞−患者細胞系または培養細胞系のいずれかから与えられる細胞）は、基板の表面上の単分子層上に形成され、光が物体に印加されると光子は屈折率ｎ₁（細胞媒質）、ｎ₂（細胞）、ｎ₃（基板）の物質を横切る。ｎ₂＞ｎ₃かそうでなければ細胞は表面力のために基板から剥れる（すなわち、そうでなければ基板に隣接する細胞の表面は基板から押しのけられて切り離される）ことが認められるはずである。

この関係は、ガラスまたはプラスチックといった典型的な基板に関しては満足されないが、水に匹敵するか水より低い屈折率を有し、透明である特殊クラスの非晶質フッ素重合体（すなわちＴｅｆｌｏｎ（登録商標）ＡＦ、Ｄｕｐｏｎｔ）が存在する。このタイプの非晶質フッ素重合体（化学的に不活性である）の基板上の細胞は、この境界で細胞に印加される光学表面力によって表面から剥れることはない。

細胞がフッ素重合体表面に直接付着できない場合には、表面は細胞が付着することを可能にするためにラミニン５、コラーゲン１またはフィブロネクチンといった種々のタンパク質の１つで被覆され得る。これらの細胞は、正常な、および癌性の（すなわちＯＳＣＣ、口部扁平上皮細胞癌腫）上皮細胞に関して測定され得る。

一実施形態では、癌腫が存在するかどうかを決定するために、細胞の光学的変形能（細胞の弾性／粘弾性の大きさ）は、細胞骨格タンパク質発現（例えば蛍光発光）に相関付けられ、また侵襲性の測定値に相関付けられる。

特に本発明に一致する一実施形態において、図１は、ホログラフィック光学トラッピング技術を使用して付着細胞に空間変調光学力顕微鏡検査（ＳＭＯＦＭ）を実行するための装置１００の概略図を示す。

しかしながら当業者は、本発明がホログラフィック光学トラッピング技術を使用せずに、あるいは光学的に印加される力を使用せずに、空間変調光学力顕微鏡検査を使用して付着細胞に実施され得ることを知る。あるいは、光学力を印加するためにホログラフィック光学トラッピング技術が使用される場合には、本発明は本発明において概説されたようにフーリエ位相技法なしで実現可能であり、代わり、他の定量的位相顕微鏡検査技法を利用し得る。

本発明のレーザ連結空間変調光学力顕微鏡（ＳＭＯＦＭ）装置１００は、プラットフォームとして、例えば温度制御サンプルステージ１０２を有する倒立Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２００顕微鏡１０１を利用する。非晶質フッ素重合体で被覆されたカバーガラスまたはスライド１０４上で、あるいは例えば上述のようなタンパク質で被覆された非晶質フッ素重合体被覆カバーガラスまたはスライド１０４上で成長する物体（すなわち付着細胞）１０３は、サンプルステージ１０２上に置かれ得る（例えば３７℃に制御されて）。

一実施形態では、物体１０３が顕微鏡１０１の接眼レンズ１０６を通して、およびカメラ（ＣＣＤ１０７）といった画像形成機構を通して適切に観察され得るように、顕微鏡スライド１０５上の物体１０３を照明するために、十分なワット数のランプ１０５が使用される。ランプ１０５によるこの照明は、必要であれば除去され得る。

画像形成のために超光発光ダイオード１０８といった低コヒーレンス源が使用される（すなわち８２０ｎｍの中心波長と１４ｎｍ帯域幅とを有するＯＬＳＬＤ−８２０−ＨＰ１、レーザ２０００）。超光発光ダイオード１０８は、視野全体に亘って光路長差を測定するために、透過時の狭帯域幅と低コヒーレンス長とを、スライド１０４上の物体１０３の広視野照明に与え、また特に空間光変調力顕微鏡検査技法に適している。

しかしながら空間光変調力顕微鏡検査を含む定量的位相顕微鏡検査技法のいずれにも、超光発光ダイオード１０８の代わりに適当なレーザといった代替のコヒーレント光源が使用可能である。超光発光ダイオード１０８からの光は、ビームの直径が観察領域を一杯にし過ぎるように、対物レンズ１１１を使用して物体平面で適切にコリメートされる。

唯一の探査ビームを有する空間変調光学力顕微鏡１０１のために、自由空間ビームを有する、またはファイバ光学的連結ビームを有するダイクロイックミラー１１３を介して対物レンズ１１１に、光学力レーザ（すなわち１０６４ｎｍ、Ｖ１０６Ｃ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）１０９が連結される。このビームは、対物レンズ１１１からコリメートビームを発生させるために対物レンズ１１１の後方開口平面に焦点合わせされる。レーザ１０９出力パワーは、物体１０３に印加される光学力の大きさを制御するために、レーザ１０９の出力開口に配置された較正済みのコンピュータ制御レーザ減衰器１１９（すなわちＯＺ Ｏｐｔｉｃｓ）によって制御され得る。

スライド１０４上の多数の物体１０３の光路長を同時に測定するための手段を与えるために、光源としてホログラフィック光学トラッピング（ＨＯＴ）装置１１０（例えば参照によってここに組み込まれるＧｒｉｅｒらへの米国特許第６，００５，１０６号を参照のこと）が適用される。物体１０３を照明するＨＯＴ光源は、光学的に生成された力を印加するために使用されるレーザ１０９（例えば１０６４ｎｍ、Ｖ１０６Ｃ、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓレーザ）である。

動的に変更され得るユーザ定義可能な数のトラップを有する空間変調光学力顕微鏡１０１に関して、関心の場所（例えば物体１０３または細胞が視野内に存在する場所）に光点を印加するように光学力レーザ１０９からの波面を修正するために、ＨＯＴ装置１１０が利用され得る。

特に、ＨＯＴ装置１１０（図２を参照のこと）は、回折光学要素２０２によって形作られ、例えば望遠鏡レンズ２０４、２０５とダイクロイックミラー２０６とを介して対物レンズ２０３の後方開口に伝達され、ビーム２０８によって照明される複数の光学トラップ２０７に焦点合わせされるコリメートレーザビーム２０１を含む。点Ｂ’はＢに関して共役である。しかしながら望遠鏡レンズ２０４、２０５は必要であればこの装置から除去され得ることに留意されたい。

図１には、図２のＨＯＴ装置１１０の幾つかの要素が示されている。例えば対物レンズ２０３は、スライド１０４上の物体１０３に影響を与える光学トラップ２０７を形成するように光ビーム２０８を焦点合わせする顕微鏡対物レンズ１１１である。

したがって、スライド１０４上の物体１０３（例えば細胞）は、高い強度源（すなわち光学探査のためのレーザ１０９）としてＨＯＴ装置１１０を使用することによって圧力が物体１０３に印加されるようにできる。この圧力は、スライド１０４上の物体１０３の各々に向けられる。

更に物体１０３または細胞の光路長の測定をより効率的に実行するために、光学力探査を並列処理するようにホログラフィック光学技法が使用される。単一レーザ１０９の波面の位相を制御するためにコンピュータ制御ＳＬＭ１１５を使用することによって、視野内の多数の光学力探査子を同時に位置決めして適用することが可能である。

更に、空間変調光学力顕微鏡検査技法を使用する検出方法は、全視野に関して光路長をピクセルごとに同時に測定するので、本発明は多くの物体１０３または細胞を同時に測定するために容易に拡張可能（必要であれば自動化によって）。したがって多くの物体１０３または物体サンプル１０４（例えば細胞）内の多くの点は、単一源によって（例えばＨＯＴ１１０を使用して）多くの探査ビーム（ビームレット）を作り出すことによって同時に探査され得る。

本発明では、物体１０３の照明は、ランプ１０５の前に配置され、可視光帯域がランプ１０５から出て観察カメラ（ＣＣＤ）１０７に行くことを可能にし、他の２つの光源（すなわちレーザ１０９と超光発光ダイオード１０８）からの光を排除することを可能にする帯域フィルタ１１４によって達成される。上記のようにこの可視光帯域は、ユーザによる観察のためのもであって必要であれば本装置から省略できる。

超光発光ダイオード１０８からの透過光は、未変調画像と画像の位相偏移バージョンの重ね合わせとして画像形成され、また図３に示されたＳＭＯＦＭ３００の一部であるプログラム可能位相変調器（ＰＰＭ）（すなわち、Ｘ８２６７浜松ホトニクス株式会社）としても知られる空間光変調器（ＳＬＭ）１１５によって達成される。この透過光は、超光発光ダイオード１０８からの光だけが画像形成機構またはＣＣＤ１１６上で画像形成されることを可能にし、レーザ１０９光をＣＣＤ１１６に到達しないように遮断する帯域フィルタ１１８を通り抜ける。

コンピュータ制御インタフェース１１７は、ＳＬＭ１１５とＣＣＤ１１６画像取得とＨＯＴ１１０およびレーザ減衰器１０９の制御（すなわちＯＺ Ｏｐｔｉｃｓからの）と位置依存光路長計算に必要な画像処理とを統合し、図形処理プログラミング言語で書かれたソフトウエアを持ち得る。

本発明では、物体１０３の光学的変形の測定は空間変調光学力顕微鏡検査（ＳＭＯＦＭ）を使用して実行される。上記のようにＳＭＯＦＭは、ＨＯＴ１１０によって印加された光学力の結果としての光路長変化を定量的に測定する。

本技法は、シングルモードファイバから出た後にファイバコリメートされる（空間コヒーレンスを保証する）第２の光源（すなわち低コヒーレンス超光発光ダイオード１０８）の導入を含む。超光発光ダイオード１０８は物体１０３の平面波照明に空間コヒーレント光を与え、ダイオード１０８からの光の低い時間的コヒーレンスは検出時に、問題となる反射アーチファクトを防止する。画像フィールドのフーリエ変換は、ＳＬＭ１１５の表面に投影される。次いでこの画像は、ＣＣＤ１１６上に物体１０３の実像を形成するために変換し直される。ＳＬＭ１１５上での如何なる変調もなしに、元の画像はＣＣＤ１１６上に再構成される。ＳＬＭ１１５のｋ＝０成分（中心部分のピクセルによって与えられる）だけを変調することによって、画像のＤＣレベルの位相は空間的に変化する成分１１５とは独立に変調され得る。

本技法は、画像のＤＣ成分の位相に４回の位相偏移（各々π／２の）を行うことと、画像のＤＣと空間的に変化する画像のフィールドとの干渉をピクセルごとに記憶する、得られた４個のＣＣＤ画像を捕捉することとを含む。

得られた４個の画像を使用してＤＣフィールドと空間的に変化するフィールドとの間の位相差をピクセルごとに取得するために、既存のアルゴリズム（下記の式１〜式４を参照のこと）が使用される。この位相偏移は、このピクセル位置において光が受ける光路長変化と同等である。

上記の数学的関係によって４個の位相偏移された画像からの情報は、Ｅフィールドの位相分布として表され得る。また光学力印加の前後の位相分布を比較することによって、所望のピクセルごとの光路長変化情報が取得される。

例えば像平面における電界はＥ＝Ｅ₀＋Ｅ₁であり、ここで全電界Ｅは空間的に変化しないフィールド（ＤＣ成分）Ｅ₀と空間的に変化する成分Ｅ₁とに分割される。４回の位相偏移（ｎ＝０、１、２、３）の各々に関してＣＤＤ１１６上で測定される強度は下記の数式、
Ｉ（ｘ，ｙ；ｎ）＝｜Ｅ₀｜²＋｜Ｅ₁（ｘ，ｙ）｜²
＋｜Ｅ₀｜｜Ｅ₁（ｘ，ｙ）｜ｃｏｓ［Δφ（ｘ，ｙ）＋ｎπ／２］
ただしｎ＝０、１、２、３ （式１）
によって与えられる。
Δφ（ｘ，ｙ）は、Ｅ₀とピクセル位置（ｘ、ｙ）におけるＥ₁（ｘ、ｙ）との間の位相差であって下記の数式、
ｔａｎ（Δφ（ｘ，ｙ））＝［Ｉ（３）−Ｉ（１）］／［Ｉ（０）−Ｉ（２）］
（式２）
によって与えられる。
Ｅフィールドの位相分布φ（ｘ、ｙ）は下記の数式、
φ（ｘ，ｙ）＝ｔａｎ^-1｛β（ｘ，ｙ）ｓｉｎ［Δφ（ｘ，ｙ）］／（１+β（ｘ，ｙ）ｃｏｓ［Δφ（ｘ，ｙ）］）｝
（式３）
および、
β（ｘ，ｙ）＝｜Ｅ₁（ｘ，ｙ）｜／｜Ｅ₀｜
＝Ｙ［Ｉ（ｘ，ｙ；０）］−Ｉ（ｘ，ｙ；２）＋Ｉ（ｘ，ｙ；３）−Ｉ（ｘ，ｙ；１）］／［ｓｉｎ［Δφ（ｘ，ｙ）］＋ｃｏｓ［Δφ（ｘ，ｙ）］］
（式４）
によって与えられる。
ここで、Ｙ＝１／４｜Ｅ₀｜²である。

これらの既存の数学的関係（Ｐｏｐｅｓｃｕ，Ｇ．らの「Ｆｏｕｒｉｅｒ ｐｈａｓｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ（生物学的構造および力学の調査のためのフーリエ位相顕微鏡検査）」、Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒ ２９（２１）：２５０３〜５（２００４）を参照のこと）によって４個の位相偏移画像からの情報はＥフィールドの位相分布として表され得る。光学力印加の前後の位相分布を比較することによって、所望のピクセルごとの光路長変化情報が取得される。

したがって、本発明では、超光発光ダイオード１０８からの画像信号は画像の焦点面に補正レンズ（ＣＬ）３０７（図３を参照のこと）を最初に配置することによって修正される（ＣＬ３０７は像平面（ＩＰ）３０６／仮想点源（ＶＰＳ）３０８距離に等しい焦点距離を有するように選択され得る）。次いで画像は、標準４−ｆ形状を使用するフーリエレンズ３０２（例えば５０ｃｍの焦点距離）を使用してＳＬＭまたはＰＰＭ３０１（図１のＳＬＭ１１５）の表面にフーリエ変換される。

空間光変調器ＳＬＭ１１５（すなわちプログラム可能位相変調器（ＰＰＭ）（すなわちＸ８２６７浜松ホトニクス株式会社））は、各ピクセルに関して少なくとも８ビット解像度で０から２πの間で独立の位相制御を有するように設計された個別にアドレス可能な２次元液晶アレイであり得る。この位相制御は、偏光子Ｐ３０４を挿入することによって液晶の分子軸の方向に整合するように入射光の偏光を選択することによって可能である。ＳＬＭ３０１から反射された位相変調画像は、ビームスプリッタ（ＢＳ）３０３からＣＣＤ１１６への反射によってＣＣＤカメラ３０５（図１のＣＣＤ１１６）上に画像形成される。

したがって各物体１０３の測定は、１）光学力が存在しないときの物体１０３の光路長の測定（光路長Ｌを与える）と、２）光学力が印加された後の物体１０３の光路長の測定（光路長Ｌ’を与える）とを含み得る。本発明の技法は、細胞の弾性が癌腫の確認を与えるかどうかを決定するために他の物体の光学的変形能と比較され得る光学的変形能（すなわち歪み（Ｌ’−Ｌ）／Ｌ）の測定を与える。こうして、印加された光学力の持続時間と大きさは物体１０３からの弾性および／または粘弾性応答が導き出されたかどうか、ならびにこの弾性および／または粘弾性応答の大きさが癌腫を示しているかどうかを決定する。

もう１つの実施形態では、物体または細胞の光学的変形能が測定されて、細胞骨格的／構造的タンパク質発現の測定値と相関付けられ得る（細胞の蛍光顕微鏡検査を介して）。例えば画像に蛍光発光を使用し、免疫学的局在決定を使用してタンパク質発現を定量化するための、当分野で公知の多くの方法が存在する（Ｉｍａｉ，Ｋらの「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ（人間の口部扁平上皮細胞癌腫におけるデスモグレインおよび中間繊維の免疫学的局在決定）」、Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ １７：２０４〜１２（１９９５）を参照のこと）。

更に、癌性口部上皮細胞はビメンチンを表すことが示されている。細胞の変形能の仮説的ビメンチン間接変化を潜在的に望ましい診断マーカにする間葉形態を腫瘍細胞が示す前でもビメンチン発現が検出可能であることを示唆する報告も存在している。

免疫学的局在決定を介してタンパク質発現を相関付けるために、細胞を特定の抗体（すなわちアンチビメンチン）で培養し、これらの細胞を洗浄し、次いでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４二次抗体といった蛍光標識された二次抗体で細胞を培養して洗浄し、最後にＳＭＯＦＭと組み合わせて蛍光画像分析のために細胞を準備することができる。

同様の方法で本発明の技法は、任意の所望のタンパク質発現マーカを細胞の光学的変形能と相関付けるために使用され得る。

このようにして、本発明の装置は光学力が例えば付着細胞に印加されることを可能にし、および、細胞の結果的に生じる表面のたわみは高感度で定量的に測定され得る。本発明の空間変調光学力顕微鏡検査コンポーネントは、光学的に印加された表面力による細胞表面のたわみの定量化が干渉感度（サブナノメートル感度）で検出されることを可能にする。光路長変化の変化およびその結果の形状変化は、独自の光学的変形能シグネチャを有する、癌細胞を含む病変細胞が識別され得るように、決定され得る。

このようにして、本発明の光学力顕微鏡検査装置は、癌の表現型の特徴付けに新しい特徴を加える、変形能の機械的測定を示す細胞内の分子パターンと遺伝子パターンとを相関付けるための貴重なツールである。本発明はまた、変形能測定パラメータに基づいて癌診断検定のための根拠を提供する。

本発明の前述の実施形態が本発明の原理の明らかな理解のために述べられた実施の例の単に可能な例であることは強調されるべきである。本発明の精神と原理から逸脱せずに本発明の前述の実施形態に対して、種々の変形と修正が行われ得る。このような修正と変形のすべては本発明の範囲内に含まれ、特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。

本発明に一致する一実施形態による、光学力測定装置を示す図である。 本発明に一致する一実施形態による、図１の装置の一部である例示的ホログラフィック光学トラッピングシステムを示す図である。 本発明に一致する一実施形態による図１の装置の一部である、空間光変調光学力顕微鏡検査を実行するために必要な光学部品の図を示す図である。

Claims (57)

1. 複数の物体の変形を検出するための装置であって、
   光学的に発生した力を前記物体の各々に印加するレーザビームを放射するためのレーザ装置を備えた第１の光源と、
   低コヒーレンス光源でありかつ前記物体の広視野照明を提供する第２の光源と、
   前記低コヒーレンス光源によって照明されて画像が形成される前記複数の物体を支持する支持機構と、
   前記低コヒーレンス光源から照明された後、前記支持機構上に配置された前記物体の前記画像をフーリエ変換するためのフーリエレンズと、
   前記フーリエレンズから前記物体の前記画像を受取りかつ予め定められた方法で前記画像を位相偏移する空間光変調器と、
   前記光学的に発生した力が前記物体の各々に印加される前と印加された後との前記物体の画像中に生成された位相偏移に基づいて前記物体の光路長の変化を検出しかつ光学的な変形能の計測値を生成する第１の画像形成機構と、
   を備えた前記複数の物体の変形を検出するための装置。
2. 前記レーザは、ホログラフィック光学トラッピング機構の１つの要素である、請求項１に記載の装置。
3. 前記物体は付着細胞である、請求項２に記載の装置。
4. 前記物体を照明するランプを備えた第３の光源と、
   前記第１の画像形成機構のために可視光帯域が前記物体を照明するため及び前記低コヒーレンス光源、及び前記レーザからの光を排除するための第１の帯域フィルタから現れることを可能にする、前記ランプより下流で前記支持機構より上流に配置された第１の帯域フィルタと、
   を更に備える、請求項３に記載の装置。
5. 前記空間変調器は、空間変調光学力顕微鏡検査機構の１つの要素である、請求項４に記載の装置。
6. 前記ホログラフィック光学トラッピング機構は、対物レンズを含む顕微鏡を含み、前記顕微鏡は、前記支持機構上に配置された非晶質フッ素重合体で被覆されたカバーガラスを備え、
   前記細胞は非晶質フッ素重合体で被覆されたカバーガラス上で成長する、請求項３に記載の装置。
7. 前記カバーガラスはタンパク質で被覆される、請求項６に記載の装置。
8. 前記低コヒーレンス光源は超光発光ダイオードである、請求項１に記載の装置。
9. 前記低コヒーレンス光源はレーザである、請求項１に記載の装置。
10. 前記ホログラフィック光学トラッピング機構は、対物レンズを更に備え、
    前記ホログラフィック光学トラッピング機構の前記レーザから発生した光ビームは前記対物レンズの後方開口に焦点合わせされる、請求項６に記載の装置。
11. 前記レーザのパワーの大きさと前記細胞に印加される光学的に発生した力とを制御する、前記レーザの出力開口に配置されるコンピュータ制御レーザ減衰器を更に備える、請求項６に記載の装置。
12. 前記ホログラフィック光学トラッピング機構は光学力を前記細胞に与えるために前記細胞にビームレットを印加するように前記レーザからの波面を修正する、請求項１１に記載の装置。
13. 前記ホログラフィック光学トラッピング機構は、回折光学素子を更に備え、
    前記ビームレットは前記回折光学素子によって形作られる、請求項１２に記載の装置。
14. 前記ビームレットは圧力を前記細胞に同時に印加する光学力探査子として働く、請求項１２に記載の装置。
15. 前記空間光変調器はプログラム可能位相変調器である、請求項１に記載の装置。
16. 前記空間変調光学力顕微鏡機構は、
    前記細胞の各々の位相偏移を画像形成する第２の画像形成機構を更に備え、
    前記低コヒーレンス光源からの送られた光が、前記第２の画像形成機構を用いて前記空間光変調器によって、前記細胞の前記画像の位相偏移に加えた前記細胞の修正されていない画像の重ね合せとして撮影される、請求項５に記載の装置。
17. 前記空間光変調器と前記第２の画像形成機構と前記ホログラフィック光学トラッピング機構と前記コンピュータ制御レーザ減衰器とを統合するコンピュータ制御インタフェースを更に備える、請求項１１に記載の装置。
18. 前記空間光変調器の前に配置され、前記低コヒーレンス光源からの光だけが前記第２の画像形成機構上に撮像されることを許す第２の帯域フィルタを更に備えた、請求項１７に記載の装置。
19. 前記未修正画像のＤＣ成分の位相は前記空間光変調器によって４回の位相偏移を介して進められ、前記結果として得られた４個の位相偏移画像は前記ＤＣと前記位相偏移画像の空間的に変化するフィールドとの干渉を記憶する、請求項１６に記載の装置。
20. 前記位相偏移の各々はこのピクセル位置で光が受ける光路長変化と同等である、請求項１９に記載の装置。
21. 前記空間変調光学力顕微鏡機構は、前記画像の焦点面に配置された補正レンズを更に備える、請求項１６に記載の装置。
22. 前記空間光変調器は各ピクセルに関して少なくとも８ビットの解像度で０から２πの間で独立の位相制御を有する個別にアドレス可能な２次元液晶アレイである、請求項２１に記載の装置。
23. 前記空間変調光学力顕微鏡機構は、前記補正レンズよりも下流で前記フーリエレンズより上流に配置された偏光子を更に備え、
    前記液晶アレイへの入射光は前記液晶アレイの分子軸の方向に整合するように偏光させられる、請求項２２に記載の装置。
24. 前記空間変調光学力顕微鏡機構は、前記偏光子より下流で前記フーリエレンズより上流に配置されたビームスプリッタを更に備え、
    前記空間光変調器から反射された位相変調画像は前記ビームスプリッタからの反射によって前記第２の画像形成機構上に画像形成される、請求項２３に記載の装置。
25. 前記光学的変形能の測定は前記物体の歪みを測定することを含む、請求項１に記載の装置。
26. 前記歪みはＬ’−Ｌ／Ｌとして定義され、ここで、Ｌは、光学力が存在しないときの前記物体の各々の前記光路長の測定値であり、Ｌ’は前記光学的に発生した力が印加された後の前記物体の各々の前記光路長の測定値である、請求項２５に記載の装置。
27. 光学的変形能の前記測定値は前記物体の粘弾性または弾性の変化が病気または損傷の確認を与えるかどうかを決定するために他の以前に測定された物体の光学的変形能と比較される、請求項２５に記載の装置。
28. 前記物体の前記光学的変形能は測定されて、細胞骨格的／構造的タンパク質発現の測定値と相関付けられる、請求項２７に記載の装置。
29. 前記タンパク質はビメンチンである、請求項２８に記載の装置。
30. レーザビームを発生するレーザを用いて細胞に光学的に発生した力を印加することと、
    前記細胞の広視野照明を提供しかつ前記細胞の画像を形成する低コヒーレンス光源を用いて基板上の前記細胞を照明することと、
    フーリエレンズを用いて、前記低コヒーレンス光源からの照明の後に前記基板に配置された前記細胞の画像を変形することと、
    予め定められた方法で前記画像を位相偏移する空間光変調器上で前記画像を受け取ることと、
    前記光学的に発生した力が前記物体の各々に印加される前と印加された後との前記物体の画像中に生成された位相偏移に基づいて前記細胞の各々の光路長における差を決定することと、
    他の変形していない細胞の光路長と前記差を比較することにより前記細胞の光学的な変形能を決定することと、
    を備えている
    複数の細胞における変形能の測定値を検出する方法。
31. 前記レーザは、ホログラフィック光学トラッピング機構の一部である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記細胞は付着細胞である、請求項３０に記載の方法。
33. 前記照明するステップは、
    ランプを用いて前記細胞を照明することと、
    第１の画像形成機構のために前記細胞を照明しかつ前記低コヒーレンス光源及び前記レーザからの光を排除する第１の帯域フィルタを使用して可視光帯域が前記細胞を照明することを可能にすることと、
    前記第１の画像形成機構によって前記照明された物体を観察することとを備える、請求項３０に記載の方法。
34. 前記細胞のよりよい計測値のために、前記照明することよりも前に、前記細胞を、非晶質フッ素重合体で被覆されたカバーガラス上で成長することを更に備える、請求項３２に記載の方法。
35. 前記カバーガラスはタンパク質で被覆される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記低コヒーレンス光源は超光発光ダイオードである、請求項３０に記載の方法。
37. 前記低コヒーレンス光源はレーザである、請求項３０に記載の方法。
38. 前記ホログラフィック光学トラッピング機構の前記レーザから発生した光ビームを前記ホログラフィック光学トラッピング機構の対物レンズの後方開口に焦点合わせして、前記光学的に発生した力を前記細胞に印加することを更に備える、請求項３１に記載の方法。
39. 前記レーザのパワーの大きさと前記細胞に印加される光学力とを、前記レーザの出力開口に配置されたコンピュータ制御レーザ減衰器によって制御することを更に備える、請求項３８に記載の方法。
40. 前記物体にビームレットを前記細胞に印加するために前記ホログラフィック光学トラッピング装置を使用して前記レーザからの波面を修正することを更に備える、請求項３９に記載の方法。
41. 前記ビームレットは前記ホログラフィック光学トラッピング機構の回折光学素子によって形作られる、請求項４０に記載の方法。
42. 前記光学的に発生した力を前記細胞に印加することは、
    光学力探査子として前記ビームレットを使用することによって圧力を前記細胞に同時に印加することを更に備える、請求項４０に記載の方法。
43. 第２の画像形成機構を用いて前記細胞の各々の位相偏移を画像形成することと、
    前記第２の画像形成機構を使用して、前記細胞の前記画像の位相偏移に加えて前記細胞の未修正画像の重ね合わせとして前記低コヒーレンス光源からの送られた光を画像形成することと、を更に備える、請求項４２に記載の方法。
44. 前記空間光変調器はプログラム可能位相変調器である、請求項４３に記載の方法。
45. 前記空間光変調器の前に配置された第２の帯域フィルタを使用して第２の画像形成機構上に前記低コヒーレンス光源からの光を画像形成することを更に備える、請求項４３に記載の方法。
46. コンピュータ制御インタフェースを使用して、空間変調光学力顕微鏡の一部である前記空間光変調器と、前記第２の画像形成機構と、前記ホログラフィック光学トラッピング機構と、前記ホログラフィック光学トラッピング機構の前記コンピュータ制御レーザ減衰器と、を統合することを更に備える、請求項４５に記載の方法。
47. 前記ホログラフィック光学トラッピング機構のレーザによって印加された光学的に発生した力の結果としての前記細胞の前記光路長の前記差を定量的に測定することを更に備える、請求項４５に記載の方法。
48. 前記画像形成することは、
    前記細胞の未修正画像のＤＣ成分の位相の４回の位相偏移を進めることを更に備え、前記結果として得られた前記細胞の４個の位相偏移画像は前記ＤＣと前記細胞の前記位相偏移画像の空間的に変化するフィールドとの干渉を記憶する、請求項４３に記載の方法。
49. 前記空間光変調器は各ピクセルに関して少なくとも８ビットの解像度で０から２πの間で独立の位相制御を有する個別にアドレス可能な２次元液晶アレイである、請求項４６に記載の方法。
50. 前記液晶アレイの分子軸の方向に整合するように、前記フーリエレンズの前に配置された偏光子を用いて前記液晶アレイへの入射光を偏光させることを更に備える、請求項４９に記載の方法。
51. 前記空間光変調器から反射された位相変調画像をビームスプリッタからの反射によって前記第２の画像形成機構上に画像形成することを更に備える、請求項５０に記載の方法。
52. 前記光学的変形能の計測値を決定するために前記細胞の歪みを測定することを更に備える、請求項３０に記載の方法。
53. 前記歪みはＬ’−Ｌ／Ｌとして定義され、ここで、Ｌは、光学力が存在しないときの前記細胞の１つの前記光路長の測定値であり、Ｌ’は光学的に発生した力が印加された後の前記細胞の１つの前記光路長の測定値である、請求項５２に記載の方法。
54. 前記画像形成された細胞の粘弾性または弾性が病気または損傷の確認を与えるかどうかを決定するために光学的変形能の前記測定値を前記変形していない細胞の光学的変形能と比較することを更に備える、請求項５３に記載の方法。
55. 細胞骨格的／構造的タンパク質発現が病気または損傷の確認であるかどうかを決定するために前記画像形成された細胞の前記光学的変形能を測定して、前記細胞骨格的／構造的タンパク質発現の測定値と相関付けることを更に備える、請求項５４に記載の方法。
56. 前記タンパク質はビメンチンである、請求項５５に記載の方法。
57. 前記変形能を測定するために前記物体に印加される光学的に発生した力は非光学的である、請求項１に記載の装置。

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