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JP5212099B2 - 生物材料からの核酸抽出法 - Google Patents

生物材料からの核酸抽出法 Download PDF

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Description

本発明は、核酸増幅反応に供する核酸を、生体試料中の生物材料から簡便かつ迅速に抽出する方法に関するもので、感染症検査などの医療分野、分子生物学などの研究分野、食品安全管理などの産業分野などに適用可能である。特に、本発明により、マイコバクテリウム属などの硬い細胞壁を有する生物材料から核酸を簡単かつ効率よく抽出でき、その後の核酸増幅反応を用いた遺伝子診断を行うことができる。
従来、目的試料から核酸を調製する場合、試料の性質に応じて適切な抽出法と、精製法を選択し、抽出、精製の2つの工程を順に行うことが一般的である。
ウィルス、微生物、原虫、植物または動物組織などの生物材料から核酸を抽出する一般的方法として、ホモジェナイザー等による機械的方法、変性剤等による化学的な方法、酵素等による生物学的方法がある。又、凍結した試料に粒子状の固形物を添加し混在させ、試料を攪拌することにより細胞を破砕する方法がある。このうち、塩酸グアニジンや、チオシアン酸グアニジンなどの変性剤を用いて抽出する方法(Molecular Cloning,A laboratory manual Appendix 7.23〜7.25(New York Laboratory,1989年)参照)は抽出物中に変性剤を含み、それ自体が核酸の増幅反応を阻害するため、抽出後、精製過程が必要となる。酵素処理による核酸抽出は時間がかかるため処理効率が悪いという問題があり、特にマイコバクテリウム属の細菌や真菌類であるカビなどの胞子など細胞壁が堅いものに適用した場合は、菌体が壊れないために、核酸の抽出効率が極端に悪い。
そこで、細胞壁の堅く、菌体破砕が難しいという問題を克服するため、微粒子を添加し、超音波洗浄器を用いて超音波処理を行い、核酸を放出する方法が報告されている。(米国特許5,374,522号参照)。この核酸放出法は簡便で破砕効率もよいが、喀痰や糞便などの検体から核酸を抽出し、これを遺伝子増幅に使用するためには増幅反応阻害物を除くためにさらに精製工程を加えなければならない。
そこで、多数の検体の処理を迅速に行うために、生物材料中の核酸を簡便かつ効率良く分離し、抽出物をそのまま遺伝子増幅反応に適用可能な核酸抽出法が望まれていた。
遺伝子検査に用いられる検体としては、血液、尿、喀痰、膿、血液培養液、スワブ、コロニー等があげられる。これらの検体から抽出した核酸に対し、直接測定を行う場合もあるが、近年の核酸検査では、微量核酸の定性・定量を可能ならしめるために、種々の増幅反応を用いて検体から抽出した核酸を増幅した後、測定を行うことが一般化してきている。このような核酸増幅反応には、一例を示せば、例えば、特許第2650159号公報に記載されたいわゆるNASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification)法や特表平4−500759号公報に記載されたいわゆるTMA(Transcription−Mediated Amplification)法、および本実施例の方法である特開2000−14400号公報記載のTRC(Transcription−Reverse transcription Concerted reaction)(特願平10−186434)等のRNA増幅法、およびPCR(Polymerase Chain Reaction)等のDNA増幅法が挙げられる。
前記した従来の核酸抽出法によっても前記した種々の検体から核酸を抽出することが可能である。しかしながら、核酸抽出物を前記のような増幅反応に供する頻度が高まるにつれ、従来の核酸抽出法によって得られた核酸抽出物の中には、前記のような核酸増幅反応で使用される逆転写酵素やDNAポリメレース等の酵素類の活性または反応を阻害する核酸増幅反応阻害物質が存在する可能性が指摘されている。前記された検体のなかでも喀痰は、特に気道粘液や各種核酸、細胞などの生体成分に由来する核酸増幅反応を阻害する物質が存在する可能性が高いことが指摘されているが、それらが核酸抽出物に混入すると核酸増幅反応が阻害され、結果的に正確な検査が行えなくなってしまう。
遺伝子検査では、通常、内部標準が用いられ、偽陰性を防止することはできる。しかしながら、核酸増幅反応を阻害する物質を核酸抽出工程において除去することが最も望ましい解決法であることは明らかである。
そこで本願発明の目的は、核酸を抽出すべき生物材料から核酸増幅反応を阻害する物質を除去した上で、とくにマイコバクテリウム属などの硬い細胞壁を有する細菌から核酸を簡単かつ効率よく抽出する方法及び該方法を実施するためのキットを提供することである。
前記目的を達成するためになされた本願第1の発明は、生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、前記生物材料と少なくとも界面活性剤を含む水溶液を混合し、加熱処理を行った後に前記水溶液を除去して生物材料を分離し、引き続いて該生物材料に固形粉末懸濁液を添加し、これを撹拌あるいは超音波処理することによって前記生物材料を破砕し、該生物材料の核酸を抽出することを特徴とする。また、本願第2の発明は前記第1の発明に係り、前記界面活性剤がステロイド骨格を持つアニオン性界面活性剤あるいは両性界面活性剤であることを特徴とする。本願第3の発明は、前記第2の発明に係り、前記アニオン性界面活性剤あるいは両性界面活性剤が胆汁酸、コール酸、デオキシコール酸、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸(CHAPS)及びそれらの塩から選ばれることを特徴とする。本願第4の発明は、前記界面活性剤の濃度が0.1mM〜50mMの範囲であることを特徴とする。本願第5の発明は、前記加熱処理の温度が60℃〜90℃であることを特徴とする。本願第6の発明は、前記固形粉末が無定形であり、その長径が32μm以下であり、その比重が3.5以上であり、その硬度(Hv10)が600以上であることを特徴とする。本願第7の発明は、前記無定形固形粉末がジルコニアであることを特徴とする。本願第8の発明は、生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、(1)前記試料から生物材料を分離する、(2)該生物材料と少なくともコール酸を0.1〜50mMの濃度で含む水溶液を混合する、(3)60〜90℃で加熱処理をした後、前記水溶液を除去して前記生物材料を分離する、(4)引き続いて該生物材料に、無定形で長径が20μm以下であり、その比重が4.5〜6.5であり、その硬度(Hv10)が800以上であるジルコニア粉末を含む懸濁液を添加する、(5)超音波処理により前記生物材料を破砕する、(6)該破砕物の上清中に目的の核酸を得る、工程からなることを特徴とする。本願第9の発明は、前記超音波処理が、少なくとも二つの波長の超音波で同時あるいは交互に処理することによってなされることを特徴とする。本願第10の発明は、前記生物材料がウィルス、微生物、原虫、植物又は動物組織であることを特徴とする。本願第11の発明は、前記微生物がマイコバクテリウム属に属するものであることを特徴とする。本願第12の発明は、前記生物材料を含む試料が、喀痰、胃液、尿、膿、腹水、胸水、心嚢水、血液、組織などの生物由来試料、気管支洗浄液、肺胞洗浄液などの組織洗浄液、培地、又は土、水、空気、などの環境材料であることを特徴とする。本願第13の発明は、前記第1〜12の発明に係る核酸抽出方法を実施するための試薬キットであって、少なくとも、前記界面活性剤を含む試薬、および前記固形粉末を構成成分として含む試薬からなることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
図1は実施例1で行った方法で、喀痰NALC処理物からの核酸抽出物に各種濃度の結核菌16SrRNAの標準RNAを加えてTRC反応を行った際の結果を示す。
図2は実施例2で行ったBCG10菌から160菌を200μLの結核陰性喀痰NALC処理物に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いてRNA増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフを示す。10菌/200μLまでの検体が検出できた。
図3は実施例3で行ったマイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)10菌から160菌を200μLの結核陰性喀痰NALC処理物に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いてRNA増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフを示す。10菌/200μLまでの検体が検出できた。
図4は実施例4で行ったマイコバクテリウム・イントラセルラー(Mycobacterium intracellulare)10菌から160菌を200μLの結核陰性喀痰NALC処理物に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いてRNA増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフである。10菌/200μLまでの検体が検出できた。
図5は実施例5で行ったマイコバクテリウム・カンサシ(Mycobacterium kansasii)10菌から160菌を200μLの模擬喀痰(ムチン2.1mg/mL,ペプトン4.2%溶液)に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いてRNA増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフを示す。10菌/200μLまでの検体が検出できた。
本発明における検体には、喀痰、胃液、尿、気管支洗浄液、膿、肺胞洗浄液、腹水、胸水、心嚢水、糞便、組織、血液、血清、コロニー、スワブ若しくは他の体液等の生体試料の試料懸濁液、食物試料のホモジェナイズ等の試料懸濁液があげられる。試料が喀痰の場合は、NALC処理等の試料の粘性を落す前処理を行うとより好ましい結果が得られる。また、環境分析等における環境水や排水、土壌の懸濁液等があげられる。
本発明における生物材料には、ウィルス、細菌、真菌、原虫、植物又は動物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、特に細胞の破砕が難しい真菌、マイコバクテリウム属などの生物材料に有用である。
本発明の核酸抽出法は、検体から核酸を抽出するにあたり、核酸増幅反応阻害物質を界面活性剤で溶出して除去するものであるが、本願発明者らは、核酸増幅反応阻害物質の一つに糖タンパクがあり、界面活性剤によって糖タンパクが可溶化されることによって核酸増幅反応阻害物質を除去する効果を発揮すると考えられる。ここで、このような糖タンパク質の例として、喀痰に含まれる気道粘液糖タンパク質(ムチンと呼ばれる)がある。
本発明に用いる界面活性剤としてステロイド骨格を有するアニオン性界面活性剤及び両性界面活性剤であれば特に限定されないが、胆汁酸、コール酸、デオキシコール酸、CHAPS及びそれらの塩等から選ばれた少なくとも1種の界面活性剤が好ましい。コール酸を用いる場合にその濃度は0.1mMから50mM、好ましくは1mMから20mMを用いる。また、加熱処理の温度は、特に制限されるわけではないが、好ましくは60℃〜90℃、より好ましくは60℃〜80℃であり、加熱時間も特に制限されるものではないが、好ましくは2分から20分、より好ましくは2分から5分である。ここで、加熱処理は静置して行うのが好ましい。さらに界面活性剤処理の回数は、特に制限されるものではないが、1回から5回程度行うことが好ましい。なお、核酸を含有する検体と界面活性剤を混合して溶出物を選択的に除去するには、例えば遠心操作によって実施すれば良い。遠心操作は、特に制限されるものではないが、16,000×gで5分間行うことで核酸を含有する検体と核酸増幅反応阻害物質含有の界面活性剤溶出物とを分離することができる。本願発明における、界面活性剤を混合して溶出物を選択的に除去する工程は、実際に抽出しようとする核酸や抽出を行う検体を勘案し、予備的な実験を行ったうえで具体的な条件を設定することが重要である。
本発明における固形粉末の材質は特に限定されないが、例えば、ジルコニア、ダイアモンド、アルミナ(酸化アルミニウム)、鉄、合金等が挙げられるが、抽出効率、コストの面から、ジルコニアが好適である。
前記固形粉末は、物理的に生物材料が破砕できればその形状は特に限定されないが、無定形であることが好ましい。該無定形の固形粉末とは、粒子が球形、楕円形等の滑らかな表面を持った形状ではなく、表面に鋭利な凹凸を有する粒子よりなる固形粉末を意味する。前記粒子の大きさはその粒子径の最も長い部分(長径)が平均32μm以下であればよいが、好ましくは平均20μm以下である(測定機器COULTER LS130)。その比重は、超音波や攪拌による粉末の運動エネルギーを利用して組織を破砕することから、大きい方が好ましく、3.0以上あればよい。抽出された核酸を含む上清と前記固形粉末は、遠心あるいは静置により分離することが可能である。また、固形粉末にあらかじめ磁性体を含有させておくことにより、磁力による分離も可能である。固形粉末の硬さは、硬いほど好ましく、ビッカース硬度(Hv10)にして600以上あることが好ましい。本発明の最適な態様では、長径20μm以下、比重5.7〜6.2、硬度(Hv10)900以上のジルコニアの無定形固形粉末を使用する。ジルコニアの無定形粉末の例としては、電融ジルコニアZCO−E6(ASTRON社製、平均長径6μm、比重5.8、ビッカース硬度(Hv10)1200)、電融ジルコニアNST 8H、F350(SAINT−GOBAIN社製、平均長径24μm、比重6.0、ビッカース硬度(Hv10)1200)、電融ジルコニア#400(大平洋ランダム社製、平均長径18μm)等があるが、これに限定されない。試料への固形粉末の添加量は、試料の種類、攪拌方法、攪拌時間によって適宜決められる。固形粉末を添加後、続いて、撹拌及び/又は超音波処理により物理的に菌体を破砕する。
攪拌方法は、試料を入れた容器を手で往復振動させれば良く、振幅の方向は縦でも横でもよいが、好ましくは縦方向に往復振動させるのがよい。あるいは、ボルテックスミキサーで攪拌してもよい。菌体の破砕は、超音波処理による破砕がより好ましく、定常波の影響を除くため、交互または同時に2周波数以上の超音波処理が最も好ましい。超音波処理は試料および粉末固形物を入れた容器を超音波洗浄機の洗浄槽中の液体に浸すか浮かべればよい。攪拌時間または超音波処理時間は、微生物および組織の細胞膜が破壊されるまででよく、具体的には2分間以上でよい。組織が植物の組織の様に、丈夫な細胞壁を持ち硬い場合には、それ以上長くても良い。
本願発明に従えば、核酸増幅反応によって対象生物を同定、検出できる程度に、精製された状態で核酸が細胞から採取できる。また、本願発明は、対象生物として、細胞壁の堅い微生物を含み、さらに核酸阻害物質を多く含む種々の検体に対して有効である。例えば、喀痰に含まれるマイコバクテリウム属の細菌からも効率よく核酸を抽出し、遺伝子の高感度・迅速検査を行うことが可能である。
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例1 喀痰からの核酸抽出試料に存在する阻害物質
非結核性抗酸菌感染患者から同意を得て取得した喀痰(以降「結核陰性喀痰」と記述する)をNALC−NaOH処理(商品名;BBLマイコプレップ、日本ベクトンディッキンソン(株)を使用)して調製した検体200μLを用いて次の2つの処理を行った。即ち、条件1;1mLのPBSに添加し、撹拌した後に16,000×gで5分間遠心し、上清を取り除いた。条件2;1mLのpH9に調製した10mM コール酸ナトリウム、1mM EDTAを含む50mM グリシン−NaOH緩衝液(以降「洗浄液」と記述する)に添加し、80℃のドライヒートブロック上に2分間静置した後、16,000×gで5分間遠心し、上清を取り除いた。上記1、2の条件で得られたそれぞれの沈査に0.005% yeast RNA(SIGMA社製)を含み、0.5g/mLの電融ジルコニアZCO−E6(ASTRON社製、平均粒径6μm)を懸濁させたTE溶液(WAKO社製、10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8)50μL(以降「溶菌試薬」と記述する)を添加し、そのチューブを超音波洗浄器WT−70ST(本多電子製、周波数40kHz、出力70W)の洗浄浴中に浮かべ、5分間超音波処理を行った。その後、16,000×gで3分間遠心し、上清を30μL別のチューブに移し、核酸抽出物を得た。
(1)複数の結核陰性喀痰から上記のように得られた核酸抽出物を混合し、陰性喀痰抽出試料とした。この陰性喀痰抽出試料4.5μLと結核菌16SrRNAの領域を含む標準RNA(塩基番号243〜1843(RNAの塩基番号はGenBankに登録されているZ83862に従った)を含む標準RNAで、結核菌の16SrRNAの塩基配列を含む二本鎖DNAを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製されたRNA、1601塩基)の各種濃度溶液(1mM EDTAとRNaseインヒビターを含む10mMトリス塩酸緩衝液に標準RNAを溶解。以降同緩衝液を「RNA希釈緩衝液」と記述する)0.5μLを混合し、特開2004−194583号公報に記載した方法に従い、核酸増幅反応に供した。なお、コントロール(Nega)では、陰性喀痰抽出試料に代えてRNA希釈緩衝液4.5μLを混合した。
(2)以下の組成の反応液20μLをPCR用チューブ(容量0.5mL;Gene Amp Thin−Walled Reaction Tube、パーキンエルマー製)に分注し、これに上記混合試料を添加した。
反応液の組成(各濃度は最終反応液量30μLにおける濃度)
60mM Tris−塩酸緩衝液(pH 8.6)
17mM 塩化マグネシウム
100mM 塩化カリウム
6U RNase インヒビター(宝酒造(株)製)
1mM DTT
各0.25mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP
3.6mM ITP
各3.0mMのATP、CTP、GTP、UTP
0.16μMの第1オリゴヌクレオチド(MYR−1S−10、配列番号1。3’末端側の水酸基はアミノ化されている。)
1.0μMの第2オリゴヌクレオチド(MYR−1F−10、配列番号2。5’末端側第1番目の「A」から22番目の「A」までの領域はT7プロモーターの領域であり、それに続く23番目の「G」から28番目の「A」までの領域はエンハンサー配列である。)
1.0μMの第3オリゴヌクレオチド(MYR−3RT18、配列番号3)
25nMのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド(YO−MYR−P2−2−S−G、配列番号4。5’末端から7番目の「A」と8番目の「G」との間のリンにインターカレーター性色素が標識されている。また、3’末端側の水酸基はグリコール基で修飾されている。)
13% DMSO
容量調整用蒸留水
(3) 上記の反応液を43℃で5分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ43℃で2分間保温した酵素液5μLを添加した。
酵素液の組成(各濃度は最終反応液量30μLにおける濃度)
2.0% ソルビトール
3.6μg 牛血清アルブミン
142U T7RNAポリメラーゼ(タカラバイオ製)
6.4U AMV逆転写酵素(タカラバイオ製)
容量調整用蒸留水
(4) 引き続きPCRチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、43℃で保温して、励起波長470nm、蛍光波長520nmで、反応溶液を経時的に測定した。
(5) 各核酸抽出物での立ち上がり時間(蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の3倍を加えた値の1.2倍になるまでの時間)の結果を図1に示した。これらの結果、上記の条件1では結核陰性喀痰由来の阻害物により抽出物無添加の立ち上がり時間よりも10コピーの標準RNAで4分以上、10コピーで3分、10コピーで2分以上遅れた。一方、上記の条件2では10コピーで3分、10コピーで1分、10コピーで1分と改善された。
実施例2 結核陰性喀痰の前処理と核酸抽出−その1
結核陰性喀痰をNALC−NaOH処理(商品名;BBLマイコプレップ、日本ベクトンディッキンソン(株)を使用)して調製した検体200μLにそれぞれ10、20、40、80、160菌のBCG溶液を加え、これを検体とした。
1mLの洗浄液を添加し、70℃のドライヒートブロック上に3分間静置した後、16,000×gで5分間遠心し、上清を取り除いた。得られた沈査に溶菌試薬を50μL添加し、そのチューブを超音波洗浄器VS−D100(本多電子製、周波数24、31kHz、出力110W)の洗浄浴中に浮かべ、5分間超音波処理を行った。その後、16,000×gで3分間遠心し、上清を30μL別のチューブに移し、核酸抽出物を得た。そのうち5μLを実施例1と同様の核酸増幅反応に供してBCGの16SrRNAの測定を実施した。
各核酸抽出物での立ち上がり時間(蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の3倍を加えた値の1.2倍になるまでの時間)の結果を図2に示した。これらの結果本願発明の抽出方法によって喀痰中のBCG菌を検出することが示された。
実施例3
本発明の抽出法が非結核性抗酸菌のマイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)に適用できるか確認した。
結核陰性喀痰をNALC−NaOH処理(商品名;BBLマイコプレップ、日本ベクトンディッキンソン(株)を使用)して調製した検体200μLにそれぞれ10、20、40、80、160菌のマイコバクテリウム・アビウム(M.avium)を加え、これを検体とした。
この検体に1mLの洗浄液を添加し、混合した後、70℃のドライヒートブロック上に3分間静置し、16,000×gで5分間遠心して、上清を取り除いた。得られた沈査に溶菌試薬を50μL添加し、そのチューブを超音波洗浄器VS−D100(本多電子製、周波数24、31kHz、出力110W)の洗浄槽中に浮かべ、5分間超音波処理を行った。その後、16,000×gで3分間遠心し、上清を30μL別のチューブに移し、核酸抽出物を得た。そのうち5μLを実施例1と同様の核酸増幅反応に供してマイコバクテリウム・アビウム(M.avium)の16SrRNAの測定を実施した。ただし、使用したプライマー、プローブの組み合わせは以下のとおりである。
第1オリゴヌクレオチド(MYR−1S−40、配列番号5)
第2オリゴヌクレオチド(MYR−1F−40、配列番号6)
第3オリゴヌクレオチド(MYR−3RA16−4、配列番号7)
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド(YO−MYR−P5−S−G、配列番号8)
各核酸抽出物での立ち上がり時間(蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の3倍を加えた値の1.2倍になるまでの時間)の結果を図3に示した。これらの結果、本願発明の抽出方法によって喀痰中の各菌数のマイコバクテリウム・アビウム(M.avium)を検出することが示された。
実施例4
本発明の抽出法が非結核性抗酸菌のマイコバクテリウム・イントラセルラー(Mycobacterium intracellulare)に適用できるか確認した。
結核陰性喀痰をNALC−NaOH処理(商品名;BBLマイコプレップ、日本ベクトンディッキンソン(株)を使用)して調製した検体200μLにそれぞれ10、20、40、80、160菌のマイコバクテリウム・イントラセルラー(M.intracellulare)を加え、これを検体とした。
この検体に1mLの洗浄液を添加し、実施例3と同様に核酸抽出物を得た。そのうち5μLを実施例3と同様の核酸増幅反応に供してマイコバクテリウム・イントラセルラー(M.intracellulare)の16SrRNAの測定を実施した。ただし、使用したプライマー、プローブの組み合わせは以下のとおりである。
第1オリゴヌクレオチド(MYR−1S−40、配列番号5)
第2オリゴヌクレオチド(MYR−1F−40、配列番号6)
第3オリゴヌクレオチド(MYR−3RI18、配列番号9)
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド(YO−MYR−P5−S−G、配列番号8)
各核酸抽出物での立ち上がり時間(蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の3倍を加えた値の1.2倍になるまでの時間)の結果を図4に示した。これらの結果、本願発明の抽出方法によって喀痰中の各菌数のマイコバクテリウム・イントラセルラー(M.intracellulare)を検出することが示された。
実施例5
本発明の抽出法が非結核性抗酸菌のマイコバクテリウム・カンサシ(Myobacterium kansasii)に適用できるか確認した。
結核陰性喀痰のNALC−NaOH処理物の代用物としてムチン溶液(ムチン2.1mg/mL、ペプトン4.2%、10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH8)200μLにそれぞれ10、20、40、80、160菌のマイコバクテリウム・カンサシ(M.kansasii)を加え、これを検体とした。
この検体に1mLの洗浄液を添加し、実施例3と同様に核酸抽出物を得た。そのうち5μLを実施例3と同様の核酸増幅反応に供してマイコバクテリウム・カンサシ(M.kansasii)の16SrRNAの測定を実施した。ただし、使用したプライマー、プローブの組み合わせは以下のとおりである。
第1オリゴヌクレオチド(MYR−1S−40、配列番号5)
第2オリゴヌクレオチド(MYR−1F−40、配列番号6)
第3オリゴヌクレオチド(MYR−3RK16−4、配列番号10)
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド(YO−MYR−P4−S−G、配列番号11)
各核酸抽出物での立ち上がり時間(蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の3倍を加えた値の1.2倍になるまでの時間)の結果を図5に示した。これらの結果、本願発明の抽出方法によって喀痰中の各菌数のマイコバクテリウム・カンサシ(M.kansasii)を検出することが示された。
[配列表]
Figure 0005212099
Figure 0005212099
Figure 0005212099
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Claims (9)

  1. 生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、前記生物材料と少なくともステロイド骨格を持つアニオン性界面活性剤を含む水溶液を混合し、加熱処理を行った後に前記水溶液を除去して生物材料を分離し、引き続いて該生物材料に、長径が32μm以下であり、その比重が3.0以上であり、その硬度(Hv10)が600以上である無定形ジルコニア粉末懸濁液を添加し、これを撹拌あるいは超音波処理することによって前記生物材料を破砕し、該生物材料の核酸を抽出することを特徴とする核酸抽出方法。
  2. 前記アニオン性界面活性剤が、コール酸又はその塩であることを特徴とする請求項1に記載の核酸抽出方法。
  3. 前記界面活性剤の濃度が0.1mM〜50mMの範囲であることを特徴とする請求項1又は2に記載の核酸抽出方法。
  4. 加熱処理の温度が60℃〜90℃である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸抽出方法。
  5. 生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、(1)前記試料と少なくともコール酸又はその塩を0.1〜50mMの濃度で含む水溶液を混合する、()60〜90℃で加熱処理をした後、前記水溶液を除去して前記生物材料を分離する、()引き続いて該生物材料に、無定形で長径が20μm以下であり、その比重が4.5〜6.5であり、その硬度(Hv10)が800以上であるジルコニア粉末を含む懸濁液を添加する、()超音波処理により前記生物材料を破砕する、()該破砕物の上清中に目的の核酸を得る、工程からなることを特徴とする核酸抽出方法。
  6. 前記超音波処理が、少なくとも二つの波長の超音波で同時あるいは交互に処理することによってなされることを特徴とする請求項に記載の核酸抽出方法。
  7. 前記生物材料がウィルス、微生物、原虫、植物又は動物組織であることを特徴とする請求項1〜のいずれか1項に記載の核酸抽出方法。
  8. 前記微生物がマイコバクテリウム属に属するものであることを特徴とする請求項に記載の核酸抽出方法。
  9. 前記生物材料を含む試料が、生物由来試料、組織洗浄液、培地、又は環境材料であることを特徴とする請求項1〜のいずれか1項に記載の核酸抽出方法。
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