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JP5192234B2 - 化学修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents

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Description

本発明は一般に、遺伝子発現を調節するのに有用な、化学修飾されたオリゴヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、遺伝子発現を阻害するための、1本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチド、および修飾オリゴヌクレオチドの作製および使用方法に関する。
さまざまな核酸種が、遺伝子発現を修飾する能力を有している。これらは、アンチセンスRNA、siRNA、microRNA、RNAおよびDNAアプタマー、およびデコイRNAを含む。これらの核酸種はそれぞれ、異なる機序により遺伝子発現を阻害することができる。
本発明は、オリゴヌクレオチド剤(以下で定義される)およびリガンドの複合体を使用することにより遺伝子発現を調節する、つまり阻害もしくはアップレギュレートのいずれかを行うための方法および組成物を特徴とする。組成物は、複合されたオリゴヌクレオチド剤だけでなく、複合されたオリゴヌクレオチド剤のいくつかの成分であるか、または複合されたオリゴヌクレオチド剤を作製するために使用することができる複合されたモノマーを含む。複合されたオリゴヌクレオチド剤は、核酸、例えば、プレmRNA、mRNA、microRNA(miRNA)、mi−RNA前駆体(プレmiRNA)、もしくはDNA、またはタンパク質を標的とし、それらに結合することにより遺伝子発現を修飾することができる。本発明の特徴とするオリゴヌクレオチド剤は、例えば、miRNA、アンチセンスRNA、デコイRNA、DNA、またはアプタマーでもよい。
したがって、本発明は、リガンドに連結されたオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。リガンドは、モノマー、例えば、オリゴヌクレオチド剤内に組み込まれた化学修飾モノマーを介してオリゴヌクレオチド剤に結合され得る。好ましい一実施形態では、本願に記載されているように、この連結はテザーまたはリンカー(またはその両方)によるものであり、この複合体は以下のように表される式を有する。
リガンド−[リンカー]オプション−[テザー]オプション−オリゴヌクレオチド剤
ほとんどの場合、実施形態は多数のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド剤に関して説明されているが、本発明は、以下の構造を有するモノマーサブユニットを含む。
リガンド−[リンカー]オプション−[テザー]オプション−モノマー
本発明には、モノマーを作製してオリゴヌクレオチド剤中に組み込む方法、およびそれらの薬剤を使用する方法が含まれる。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド剤のヌクレオチドの(例えば、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド)サブユニットの1つまたは複数の糖、例えばリボース糖を、他の構成成分、例えば非炭水化物(好ましくは、環式)担体で置き換えることが可能である。サブユニットの糖がそうして置き換えられたヌクレオチド・サブユニットは、本願では糖置換修飾サブユニット(SRMS)と呼ばれる。これは、本願では「テザー」(または「繋留(する)」)と呼ばれることが多い。環状担体は炭素環系であり、つまり、すべての環原子が炭素原子であり、または複素環系であり、つまり、1つまたは複数の環原子がヘテロ原子、例えば窒素、酸素、または硫黄でもよい。環状担体は単環系であるか、または2つもしくはそれ以上の環を含む例えば縮合環でもよい。環状担体は完全飽和環系であるか、または2つもしくはそれ以上の二重結合を含んでもよい。
担体は、さらに(i)少なくとも2つの「骨格結合点」および(ii)少なくとも1つの「繋留結合点」を含む。本願で使用されている「骨格結合点」は、官能基、例えばヒドロキシル基、または一般に、担体を骨格に、例えばリボ核酸のリン酸、または修飾リン酸、例えば硫黄含有リン酸骨格に組み込むのに利用可能であり、また好適である結合を指す。本願で使用されている「繋留結合点」は、環状担体の構成環原子、例えば選択された構成成分をつなぐ炭素原子またはヘテロ原子(骨格結合点を与える原子とは異なる)を指す。構成成分は、例えばリガンド、例えば標的または送達構成成分、または物理的特性を改変する構成成分でもよい。最も好ましい構成成分の一つは、細胞内への進入を促進する構成成分、例えば親油性部分、例えばコレステロールである。理論に縛られることは望まないが、親油性薬剤の結合は、オリゴヌクレオチド剤の親油性を高めると考えられている。任意で、選択された構成部分が環状担体への介在テザーによりつながれる。そのため、多くの場合、官能基、例えばアミノ基を含むか、または一般的に、構成環への他の化学物質例えばリガンドの組み込み、または繋留に適している結合をもたらす。
本願に記載されている1つまたは複数のSRMSをオリゴヌクレオチド剤に組み込むことで、特に適切な化学物質に繋留した場合に、1つまたは複数の新しい特性をオリゴヌクレオチド剤に付加し、および/またはオリゴヌクレオチド剤中の1つまたは複数の既存の特性を改変、強化、または調節することができる。例えば、親油性またはヌクレアーゼ耐性のうちの1つまたは複数を改変することができる。本願に記載されている1つまたは複数のSRMSをオリゴヌクレオチド剤中に組み込むことにより、特にSRMSが適切な化学物質に繋留される場合に、対象の標的RNA、例えばプレmRNA、mRNA、または対象のmiRNAもしくは病原体へのオリゴヌクレオチド剤の結合親和力を調節、例えば増大させることができる。1つまたは複数のSRMSを組み込むことにより、分布を改変するか、オリゴヌクレオチド剤標的を人体の特定の部分とするか、核酸結合タンパク質との相互作用を調節するか(例えば、RISC形成および鎖分離時に)、配列を著しく増やし、例えば部位を外れた標的を阻害することができる。
したがって、一態様では、本発明は構造式(I)を有する少なくとも一つのサブユニットを好ましくは含むオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
式中、
Xは、N(CO)R、NR、またはCHであり、
Yは、NR、O、S、CR10であるか、または存在せず、
Zは、CR1112であるか、または存在せず、
、R、R、R、R、およびR10はそれぞれ独立して、H、OR、OR、(CHOR、または(CHORであるが、R、R、R、R、R、およびR10のうちの少なくとも一つはORまたはORであり、R、R、R、R、R、およびR10のうちの少なくとも一つは(CHORまたは(CHOR(SRMSが末端の場合、R、R、R、R、R、およびR10のうちの一つがRを含み、一つがRを含み、SRMSSが内部にある場合、R、R、R、R、R、およびR10のうちの2つはそれぞれRを含む)であり、さらに、好ましくはORは(CHORとのみ存在することがあり、(CHORはORとのみ存在することがあり、
、R、R11、およびR12はそれぞれ独立して、H、1〜3個のR13で任意に置換されたC〜Cアルキル、もしくはC(O)NHRであるか、またはRおよびR11はともに、R14で任意に置換されたC〜Cシクロアルキルであり、
はリガンドでもよく、例えばRは、Rでもよく、または例えば繋留構成成分、例えばNRで置換されたC〜C20アルキル、もしくはNHC(O)Rで置換されたC〜C20アルキルを介して担体に間接的に繋留されたリガンドでもよく、
は、C〜Cアルキルであり、
13は、ヒドロキシ、C〜Cアルコキシ、またはハロであり、
14は、NRであり、
は、
であり、
は、
であり、
AおよびCのそれぞれは独立して、OまたはSであり、
Bは、OH、O、または
であり、
は、HまたはC〜Cアルキルであり、
は、Hまたはリガンド、例えば親油性リガンド、例えばコレステロールであり、
nは、1〜4である。
実施形態は、以下の特徴のうちの1つまたは複数を含むことができる。
はCHORであるとともにRはORでもよいし、RはCHORであるとともにRはORでもよいし、またはRはCHORであるとともにRはORでもよい。
はCHORであるとともにRはORでもよいし、RはCHORであるとともにRはORでもよいし、RはCHORであるとともにRはORでもよいし、RはCHORであるとともにRはORでもよいし、RはCHORであるとともにRはORでもよいし、RはCHORであるとともにRはORでもよい。
はORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよい。
はORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよい。
はCHORであるとともにRはORでもよいし、RはCHORであるとともにRはORでもよい。
はCHORであるとともにRはORでもよいし、RはCHORであるとともにRはORでもよいし、RはCHORであるとともにRはORでもよいし、RはCHORであるとともにRはORでもよい。
はORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよい。
はORであるとともにRはCHORでもよいし、RはORであるとともにRはCHORでもよい。
はCHORであるとともにR10はORでもよい。
はCHORであるとともにR10はORでもよいし、RはCHORであるとともにR10はORでもよい。
好ましい一実施形態では、リボースはピロリン骨格または4−ヒドロキシプロリン由来骨格で置き換えられており、XはN(CO)RまたはNRであり、YはCR10であり、Zは存在しない。
およびRはシス型でもよいし、RおよびRはトランス型でもよい。
nは1でもよい。
AはOまたはSでもよい。
は(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよい。
は(CHNHRまたは(CHNHRでもよい。Rは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンA基、ビタミンE基、ビタミンK基から選択され得る。好ましくは、Rはコレステロール基である。
はORであるとともにRは(CHORでもよいし、RはORであるとともにRは(CHORでもよいし、RはORであるとともにRは(CHORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよい。
およびRはシス型でもよいし、RおよびRはトランス型でもよい。
はORであるとともにRは(CHORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORはORでもよいし、RはORであるとともにRは(CHORでもよいし、RはORであるとともにRは(CHORでもよい。
は(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよいし、RはORであるとともにRは(CHORでもよいし、RはORであるとともにRは(CHORでもよいし、RはORであるとともにRは(CHORでもよい。
およびRはシス型でもよいし、RおよびRはトランス型でもよい。
好ましい他の実施形態では、リボースはピペリジン骨格で置き換えられており、XはN(CO)RまたはNRであり、YはCR10であり、ZはCR1112である。
は(CHORであるとともにR10はORでもよい。
nは1または2でもよい。
は(CHORであるとともにR10はORでもよいし、Rは(CHORであるとともにR10はORでもよい。
Aは、OまたはSでもよい。
は、(CHNHRまたは(CHNHRでもよい。Rは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンA基、ビタミンE基、ビタミンK基から選択され得る。好ましくは、Rはコレステロール基である。
は(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよい。
は(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよい。
は(CHORであるとともにRはORでもよい。
およびRはシス型でもよいし、RおよびRはトランス型でもよい。
は(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよい。
は(CHORであるとともにRはORでもよい。
およびRはシス型でもよいし、RおよびRはトランスでもよい。
はORであるとともにRは(CHORでもよい。
はORであるとともにRは(CHORでもよい。
好ましい他の実施形態では、リボースはピペラジン骨格で置き換えられており、XはN(CO)RまたはNRであり、YはNRであり、ZはCR1112である。
は(CHORであるとともにRはORでもよい。
およびRはシス型でもよいし、RおよびRはトランス型でもよい。
nは1でもよい。
は(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよい。
Aは、OまたはSでもよく、好ましくはSである。
は(CHNHRまたは(CHNHRでもよい。Rは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンA基、ビタミンE基、ビタミンK基の群から選択され得る。好ましくは、Rはコレステロール基である。
はCHでもよい。
はORであるとともにRは(CHORでもよい。
好ましい他の実施形態では、リボースはモルホリノ骨格で置き換えられており、XはN(CO)RまたはNRであり、YはOであり、ZはCR1112である。
は(CHORであるとともにRはORでもよい。
およびRはシス型でもよいし、RおよびRはトランス型でもよい。
nは1でもよい。
は(CHORであるとともにRはORでもよいし、Rは(CHORであるとともにRはORでもよい。
AはOまたはSでもよい。
は(CHNHRまたは(CHNHRでもよい。Rは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンA基、ビタミンE基、ビタミンK基の群から選択され得る。好ましくは、Rはコレステロール基である。
はCHでもよい。
はORであるとともにRは(CHORでもよい。
好ましい他の実施形態では、リボースはデカリン骨格で置き換えられており、XはCHであり、YはCR10であり、ZはCR1112であり、RおよびR11はともにCシクロアルキルである。
はC(O)NHRでもよい。
12は水素でもよい。
およびR12はトランス型でもよい。
はORであるとともにRは(CHORでもよい。
およびRはシス型でもよいし、RおよびRはトランス型でもよい。
nは1または2でもよい。
はORであるとともにRは(CHORでもよいし、RはORであるとともにRは(CHORでもよい。
AはOまたはSでもよい。
は、(CHNHRまたは(CHNHRでもよい。Rは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンA基、ビタミンE基、ビタミンK基の群から選択され得る。好ましくは、Rはコレステロール基である。
好ましい他の実施形態では、リボースはデカリン/インダン骨格で置き換えられており、例えばXはCHであり、YはCR10であり、ZはCR1112であり、RおよびR11はともにCシクロアルキルである。
はCHでもよい。
12は水素でもよい。
およびR12はトランス型でもよい。
はORであるとともにRは(CHORでもよい。
およびRはシス型でもよいし、RおよびRはトランス型でもよい。
nは1または2でもよい。
はORであるとともにRは(CHORでもよいし、RはORであるとともにRは(CHORでもよい。
AはOまたはSでもよい。
14はN(CH)Rでもよい。Rは、(CHNHRまたは(CHNHRでもよい。Rは、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンA基、ビタミンE基、ビタミンK基の群から選択され得る。好ましくは、Rはコレステロール基である。
他の態様では、本発明は、構造式(II)を有する少なくとも一つのサブユニットを含むオリゴヌクレオチド剤を特徴する。
Xは、N(CO)RまたはNRであり、
およびRはそれぞれ独立して、OR、OR、(CHOR、または(CHORであるが、RおよびRの一方はORまたはORであり、他方は(CHORまたは(CHOR(SRMSが末端の場合、RまたはRの一方がRを含み、もう一方がRを含み、SRMSSが内部にある場合、RおよびRは両方ともそれぞれRを含む)であり、好ましくは、ORは(CHORとのみ存在することがあり、(CHORはORとのみ存在することがあり、
は、NRで置換されたC〜C20アルキルであり、
は、C〜Cアルキルであり、
13は、ヒドロキシ、C〜Cアルコキシ、またはハロであり、
14は、NRであり、
は、
であり、
は、
であり、
AおよびCはそれぞれは独立して、OまたはSであり、
Bは、OH、O、または
であり、
は、HまたはC〜Cアルキルであり、
は、Hまたはリガンドであり、
nは、1〜4である。
複合体のオリゴヌクレオチド剤は実質的に1本鎖であり、約12から約29個のサブユニット、好ましくは約15から約25個のサブユニットからなる。実質的に1本鎖のオリゴヌクレオチド剤は、二重でない少なくとも60%、70%、80%、または90%以上のヌクレオチドを含む。
実施形態は、以下に説明されている特徴のうちの1つまたは複数を含むことができる。
他の態様では、本発明は、式(I)または式(II)からなる少なくとも1つのサブユニットを有するオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
一態様では、本発明は、式(I)および/または式(II)からなる少なくとも2つのサブユニットを有するオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。
他の態様では、本発明は、式(I)および/または式(II)からなる少なくとも一つのサブユニットを有する、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤を作製する方法を提示する。さらに他の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を調節する方法を提示する。本発明は、式(I)および/または式(II)からなる少なくとも一つのサブユニットを有する、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤を対象に投与する工程を含む。
一態様では、本発明は、式(I)および/または式(II)からなる少なくとも一つのサブユニットを有する、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤および薬剤として許容される担体を有する薬剤組成物を特徴とする。
本願に記載されているSRMSまたはテザーは、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤に組み込まれることができる。オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されているSRMSのうちの1つまたは複数を含むことが可能である。SRMSは、オリゴヌクレオチド剤内の1つまたは複数の部位に導入されることができる。SRMSは、オリゴヌクレオチドの3’または5’末端のところ、またはその(1、2、または3位置内の)近くに配置することができる。いくつかの実施形態では、SRMSを、オリゴヌクレオチドの5’末端のところ、またはその(1、2、または3位置内の)近くに配置しないようにすることが好ましい。SRMSは、内部に入ることができ、標的に結合するうえで重要な意味を持たない領域に位置決めされることが好ましい。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、SRMSを3’末端に(または1、2、または3位置内に)持つことが可能である。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、SRMSを内部の位置に持つことが可能である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、SRMSを3’末端に、またSRMSを内部の位置に持つことが可能である。
本願に記載されている糖、塩基、または骨格への他の修飾も、オリゴヌクレオチド剤に組み込まれることができる。
オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されているアーキテクチャまたは構造を取ることができる。
オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている遺伝子のどれかを含む、広範にわたる遺伝子のどれかを標的とするように選択されることができる。
好ましい一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されているアーキテクチャ(アーキテクチャは全長の1つまたは複数を指す)を有する。本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤のSRMS含有塩基に加えて、ヌクレアーゼ耐性モノマー(NRM)を含むことができる。
他の態様では、本発明は、親油性部分、例えばコレステロールが、例えばオリゴヌクレオチド剤のSRMSへの複合により複合されるオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。好ましい一実施形態では、親油性部分は、オリゴヌクレオチド剤が細胞内に入ることを促進する。好ましい一実施形態では、細胞は、生命体、組織、または細胞系、例えば初代細胞系、不死化細胞系、または本願で開示されている任意の種類の細胞系の一部である。そのため、複合されたオリゴヌクレオチド剤は、生命体、例えば哺乳類、例えばヒトの標的遺伝子の発現を阻害するために、または細胞系もしくは生命体の外部にある細胞内の標的遺伝子の発現を阻害するために使用されることができる。
親油性部分は、例えば脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リトコール酸、O3−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択されることができる。好ましい親油性部分はコレステロールである。
オリゴヌクレオチド剤は、式(I)または式(II)からなる少なくとも一つのサブユニットを組み込むことができる。オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている特徴のどれかの1つまたは複数を含むことができる。例えば、サブユニットが式(I)の場合、Rはコレステロールでもよく、XはN(CO)RまたはNRであり、YはCR10であり、Zは存在せず、Rは(CHORであり、およびRはORでもよく、XはN(CO)RまたはNRであり、YはCR10であり、ZはCR1112であり、Rは(CHORであり、およびR10はORでもよく、XはN(CO)RまたはNRであり、YはNRであり、ZはCR1112であり、Rは(CHORであり、およびRはORでもよく、XはCHでもよく、YはCR10でもよく、ZはCR1112であるとともにRはC(O)NHRであり、XはCHでもよく、YはCR10でもよく、ZはCR1112であるとともにR11またはR12はC(O)NHRであり、またはRおよびR11はともにN(CH)Rで置換されたCまたはCシクロアルキルでもよい。
好ましい一実施形態では、親油性部分、例えばコレステロールは、オリゴヌクレオチド剤が滑膜細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、肝細胞、白血球、内皮細胞(例えば、腎細胞)、B細胞、T細胞、上皮細胞、中胚葉細胞、骨髄性細胞、神経系細胞、腫瘍細胞、肥満細胞、または線維芽細胞に進入することを促進する。いくつかの態様では、筋細胞は、平滑筋細胞または心筋細胞でもよく、線維芽細胞は皮膚線維芽細胞でもよく、白血球は単球でもよい。他の好ましい実施形態では、細胞は、膀胱、肺、胸、頸部、結腸、膵臓、前立腺、腎臓、肝臓、皮膚、または神経系(例えば、中枢神経系)などの組織に由来する付着腫瘍細胞系に由来してもよい。
他の態様では、本発明は、親油性部分が複合されるオリゴヌクレオチド剤、例えば本願に記載されている親油性複合オリゴヌクレオチド剤を細胞に与えることにより標的遺伝子の発現を阻害する方法を提示する。好ましい一実施形態では、複合されたオリゴヌクレオチド剤は、生命体、例えば哺乳類、例えばヒトの標的遺伝子の発現を阻害するために、または細胞系もしくは生命体の外部にある細胞内の標的遺伝子の発現を阻害するために使用可能である。生命体全体の場合、この方法は、遺伝子、例えば本願に記載されている遺伝子の発現を阻害し、遺伝子によって媒介される疾患を治療するために使用可能である。生命体の一部ではない細胞、例えば初代細胞系、2代目細胞系、腫瘍細胞系、または形質転換もしくは不死化細胞系上で使用される場合、親油性部分が複合されるオリゴヌクレオチド剤を使用して、遺伝子、例えば、本願に記載されている遺伝子の発現を阻害することができる。生命体全体の一部ではない細胞は、オリゴヌクレオチド剤が遺伝子の発現を阻害する効果を有するかどうかを判定するために、初期スクリーンにおいて使用可能である。生命体全体の一部ではない細胞の試験の後に、動物全体におけるオリゴヌクレオチド剤の試験を行うことができる。好ましいいくつかの実施形態では、送達を容易にするか、または高める他の試薬、例えば細胞膜の通過を高める化合物が存在しない(または量が少ない)場合に、親油性部分に複合されたオリゴヌクレオチド剤が生命体に投与されるか、または生命体の一部ではない細胞に接触する。(少ない量とは、標的細胞に等量の非複合オリゴヌクレオチド剤を入れるために必要であろうものと比較して低い試薬の量でもよい。)例えば、親油性部分に複合されるオリゴヌクレオチド剤が生命体に投与されるか、または生命体の一部ではない細胞に接触することは、追加の親油性部分、トランスフェクション剤、例えばオリゴヌクレオチド剤への細胞透過性を実質的に改変するイオンまたは他の物質の濃縮物、Lipofectamine(商標)(インビトロジェン社(Invitrogen)、[米国カリフォルニア州カールズバッド(Carlsbad)所在])、Lipofectamine 2000(商標)、TransIT−TKO(商標)(ミラス社(Mirus)、[米国ウィスコンシン州マディソン(Madison)所在])、FuGENE 6(ロシュ社(Roche)、[米国インディアナ州インディアナポリス(Indianapolis)所在])、ポリエチレンイミン、X−tremeGENE Q2 (ロシュ社(Roche)、[米国インディアナ州インディアナポリス(Indianapolis)]所在)、DOTAP、DOSPER、Metafectene(商標)(ビオンテックス社(Biontex)、[ドイツ、ミュンヘン(Munich)所在])などのトランスフェクション剤が存在しない(または量が少ない)場合である。
好ましい一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、インビボ細胞、例えば生命体内の細胞への送達に適している。他の態様では、オリゴヌクレオチド剤は、インビトロ細胞、例えば細胞系内の細胞への送達に適している。
親油性部分が結合されるオリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている遺伝子を標的とすることができ、本願に記載されている任意の細胞型、例えば生命体、組織、または細胞系内の細胞型に送達することができる。オリゴヌクレオチド剤の送達は、例えば生命体内の細胞に対してはインビボ、または細胞系内の細胞に対してはインビトロでもよい。
他の態様では、本発明は、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤の組成物、特に親油性部分が複合されるオリゴヌクレオチド剤、例えば本願に記載されている親油性複合オリゴヌクレオチド剤の組成物を提供する。好ましい実施形態では、組成物は薬剤として許容される組成物である。
好ましい実施形態では、組成物、例えば薬剤として許容される組成物は、送達を容易にするか、または増強する他の薬剤、例えば細胞膜の通過を高める化合物を含まないか、その量が少ないか、または本質的に含まない。(少ない量とは、標的細胞に等量の非複合オリゴヌクレオチド剤を入れるために必要であろうものと比較して低い試薬の量でもよい。)例えば、この組成物は、追加の親油性部分、トランスフェクション剤、例えばオリゴヌクレオチド剤への細胞透過性を実質的に改変するイオンまたは他の物質の濃縮物、Lipofectamine(商標)(インビトロジェン社(Invitrogen)、[米国カリフォルニア州カールズバッド(Carlsbad)所在])、Lipofectamine 2000(商標)、TransIT−TKO(商標)(ミラス社(Mirus)、[米国ウィスコンシン州マディソン(Madison)所在])、FuGENE 6(ロシュ社(Roche)、[米国インディアナ州インディアナポリス(Indianapolis)所在])、ポリエチレンイミン、X−tremeGENE Q2 (ロシュ社(Roche)、[米国インディアナ州インディアナポリス(Indianapolis)]所在)、DOTAP、DOSPER、Metafectene(商標)(ビオンテック社(Biontex)、[ドイツ、ミュンヘン(Munich)所在])などのトランスフェクション剤を含まないか、量が少ないか、または本質的に含まない。
好ましい一実施形態では、組成物は、インビボ細胞、例えば生命体内の細胞への送達に適している。他の態様では、オリゴヌクレオチド剤は、インビトロ細胞、例えば細胞系内の細胞への送達に適している。
SRMS含有オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている方法のいずれかで、例えば本願に記載されている遺伝子のどれかを標的とするか、または本願に記載されている障害のどれかを治療するために使用可能である。これらは、製剤、送達方法、送達様式、キットまたは調製物、例えば、本願に記載されている医薬品のどれかに組み込まれることができる。例えば、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤の1つまたは複数、オリゴヌクレオチド剤が開示されている滅菌容器、および使用説明書を含むキットである。
本発明の方法および組成物、例えば本願に記載されているSRMS含有オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されているオリゴヌクレオチド剤のどれかとともに使用可能である。それに加えて、本発明の方法および組成物は、本願に記載されている疾病または障害の治療に、および対象、例えば動物、ヒトなどの哺乳類の治療に使用可能である。
本発明の方法および組成物、例えば本願に記載されているSRMS含有オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている投与量および/または製剤だけでなく、本願に記載されている投与経路とともに使用可能である。
非リボース骨格とともに、本願に記載されているSRMSモノマーおよび二量体は本発明の範囲内にある。
「オリゴヌクレオチド剤」は、標的に関するアンチセンスである、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)またはその両方の1本鎖オリゴマーまたはポリマー、あるいはその修飾形態を指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖類、および共有インターヌクレオシド(骨格)結合、さらには類似の機能を持つ天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾された、または置換されたオリゴヌクレオチドは多くの場合、例えば細胞取り込みの増強、核酸標的の親和力の増大、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの望ましい特性があることから天然型よりも好ましい。
オリゴヌクレオチド剤は、核酸標的(NAT)オリゴヌクレオチド剤およびタンパク質標的(PT)オリゴヌクレオチド剤の両方を含む。NATとPTオリゴヌクレオチド剤は、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)またはその両方の1本鎖オリゴマーまたはポリマーあるいはその修飾形態を指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖類、および共有インターヌクレオシド(骨格)結合、さらには類似の機能を持つ天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾された、または置換されたオリゴヌクレオチドは多くの場合、例えば細胞取り込みの増強、核酸標的の親和力の増大、および/またはヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの望ましい特性があることから天然型よりも好ましい。特定のRNAまたはDNA標的に結合するように設計されたNATは、実質的な相補性、例えば少なくとも70、80、90、または100%の相補性を標的核酸の少なくとも10個、20個、または30個以上の塩基とともに有し、アンチセンスRNA、miRNA、および発現を調節することができる他の2本鎖でない構造を含む。他のNATオリゴヌクレオチド剤は、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド(オリゴザイム)、DNAザイム、およびリボザイムを含む。NATオリゴヌクレオチド剤は任意の核酸、例えばmiRNA、プレmiRNA、プレmRNA、mRNA、またはDNAを標的とすることができる。これらのNATオリゴヌクレオチド剤は、Watson−Crick相補性を介してその標的に結合する場合もあれば結合しない場合もある。PTオリゴヌクレオチド剤は、好ましくは3次元相互作用に基づいてタンパク質標的に結合し、タンパク質活性を調節する。これらはデコイRNA、アプタマーなどを含む。
本発明による化合物は、好ましくは約5から約100個の核酸塩基、例えば約8個から約75個の核酸塩基、例えば約8個から約50個の核酸塩基を含む。NATオリゴヌクレオチド剤の長さは、好ましくは約12または約15ヌクレオチド長、より好ましくは約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である。PTオリゴヌクレオチド剤は、好ましくは約18ヌクレオチド長、より好ましくは23ヌクレオチド長である。特に好ましい化合物は、miRNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド、なおいっそう好ましいのは、約12から約30個の核酸塩基を含む。
理論に縛られることは望まないが、オリゴヌクレオチド剤は、切断依存または切断独立の機序を含む多数の機序のうちの1つまたは複数により作用することができる。切断に基づく機序は、RNAse H依存性でもよく、および/またはRISC複合機能を含んでもよい。切断に依存しない機序は、miRNAにより媒介可能な占有に基づく翻訳阻止、またはアプタマーを行うような、タンパク質へのオリゴヌクレオチド剤の結合を含む。また、オリゴヌクレオチド剤を使用することで、プレmRNA内のスプライス部位の選択を変更することにより遺伝子の発現を変えることも可能である。スプライシングの阻害でも、不適切に処理されたメッセージが分解し、遺伝子発現のダウンレギュレーションが生ずることができる。
オリゴヌクレオチド剤は、例えば細胞またはヒトに、1本鎖または2本鎖形態で投与可能である。2本鎖形態であるオリゴヌクレオチド剤は、実質的に相補的なオリゴヌクレオチド鎖に結合される。2本鎖形態のオリゴヌクレオチド剤の送達では、ヌクレアーゼへの耐性が高まるなど、オリゴヌクレオチド剤にいくつかのメリットが生ずることができる。オリゴヌクレオチド剤が2本鎖形態で与えられる場合、オリゴヌクレオチド剤および実質的に相補的な鎖の一方または両方が、修飾、例えば塩基修飾、糖修飾、テザー・リガンドなどを含む、本願に記載されている修飾を含むことができる。
本発明において特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、実質的に相補的なmiRNAを標的とすることができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、特定の疾病または障害に関連するmiRNAなどの内因性miRNAを標的とすることができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、腫瘍細胞、例えば肺腫瘍細胞においてアップレギュレーションされるmiRNAを標的とする。例えば、オリゴヌクレオチド剤はmiR−21を標的とすることができる(シンガラら(Shingara et al)、Ambion TechNotes 11(6)、2005年)。他の例では、オリゴヌクレオチド剤は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)またはバーキットリンパ腫においてアップレギュレーションされることが判明しているmiRNAを標的とする。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、miR−155を標的とすることができる(アイスら(Eis et al.)、Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.102:3627〜3632頁、2005年、メツラーら(Metzler et al.)、Genes Chromosom.Cancer 39:167〜169頁、2004年)。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、特定の組織、または特定の細胞型、例えば膵島細胞中に豊富に存在するmiRNAを標的とする。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、miR−375、つまりグルコース誘発インスリン分泌を抑制することが証明されている膵臓ランゲルハンス島に特異的なmiRNAを標的とすることができる(ポイら(Poy et al)、Nature 432:226〜230頁、2004年)。他の実施形態では、本発明で特徴とされているmiRNAオリゴヌクレオチド剤は、過小発現が疾病に関連する遺伝子を結合する内因性miRNAを標的とする。miRNAオリゴヌクレオチド剤でこのようなmiRNAを標的とすることにより、疾病に関連した遺伝子のアップレギュレーションが生じ、それにより疾病または障害の症状が緩和する。
例示的な1本鎖オリゴヌクレオチド剤は、ポリペプチドである血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、アプロプロテインB(ApoB)、ルシフェラーゼ(Luc)、アンドロゲン受容体(AR)、血液凝固第VII因子(FVII)、低酸素誘導因子1−アルファ・サブユニット(Hif−1α)、胎盤成長因子(PLGF)、ラミンA/C、および緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするRNAを標的とすることができる。例示的な1本鎖オリゴヌクレオチド剤は、以下の表1にまとめられている。追加の好適なmiRNA標的は、例えば、ジョンら(John et al)、PLoS Biology 2:1862〜1879頁、2004年(correction in PLoS 3:1328頁、2005年)、およびThe microRNA Registry(グリフィス−ジョーンズ エス.(Griffiths−Jones S.)、NAR 32:D109〜D111頁、2004年)で説明されている。
本発明の特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、内因性miRNAなどの、miRNAのヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。第2のヌクレオチド配列に実質的に同一であるオリゴヌクレオチド配列は、その第2のヌクレオチド配列と70%、80%、90%、またはそれ以上同一である。好ましくは、薬剤は内因性miRNAと配列が同じである。miRNAのヌクレオチド配列と実質的に同一であるオリゴヌクレオチド剤は、miRNA欠乏が疾病または障害に連関している場合などに細胞またはヒトに送達され、内因性miRNAの活性を置き換えるか、または補完することができる。一実施形態では、本発明で特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、特定の癌においてダウンレギュレーションされるか、または失われることが知られているmiRNAと実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、B細胞慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、および前立腺癌の多くの場合にダウンレギュレーションされるか、失われることが知られているmiRNAであるmiR−15(例えば、miR−15aまたはmiR−15b)またはmiR−16と実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる(カリンら(Callin et al)、Proc.Natl.Acad.Sci 99:15524〜15529頁、2002年)。他の実施例では、オリゴヌクレオチド剤は、結腸直腸新生物の腺腫様および癌段階の多くの場合にダウンレギュレーションされることが知られているmiRNAであるmiR−143またはmiR−145と実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる(マイケルら(Micheal et al)、Mol.Cancer Res.1:882〜891頁、2003年)。さらに他の実施例では、オリゴヌクレオチド剤は、肺癌組織中でダウンレギュレーションされることが知られているmiRNAであるlet−7と実質的に同一であるヌクレオチド配列を持つことができる(ジョンソンら(Johnson et al)、Cell 120:635〜647頁、2005年)。上述のようなmiRNAの少なくとも一部と実質的に同一であるオリゴヌクレオチド剤を対象に投与して、miRNA発現のダウンレギュレーションに関連する疾病または障害を治療することができる。他の好適なオリゴヌクレオチド剤は、例えば、ジョンら(John et al)、PLoS Biology 2:1862〜1879頁、2004年(correction in PLoS 3:1328頁、2005年)、およびThe microRNA Registry(グリフィス−ジョーンズS.(Griffiths−Jones S.)、NAR 32:D109〜D111頁、2004年)で説明されているmiRNAと実質的に同一である。
ミクロRNA型オリゴヌクレオチド剤
オリゴヌクレオチド剤はミクロRNA(miRNA)を含む。ミクロRNAは、翻訳阻止または標的mRNAの分解などにより、細胞中の特定の遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こすことが可能な小さな非コーディングRNA分子である。miRNAは、完全相補的であるか、または標的核酸との非相補性を有する領域を持つ可能性があり、その結果、非相補性を有する領域に「バルジ」が生じる。非相補性の領域(バルジ)は、十分な相補性、好ましくは2本鎖を形成できる完全な相補性を持つ領域によりその両脇を固めることができる。好ましくは、相補性を持つ領域は、少なくとも8から10ヌクレオチド長である(例えば、8、9、または10ヌクレオチド長)。miRNAは、ミクロRNAが標的核酸に対し完全には相補的でない場合などに翻訳を抑制することにより、またはmiRNAが完全な相補性を有する標的を結合する場合にのみ発生すると信じられる標的RNA分解を引き起こすことにより、遺伝子発現を阻害することができる。本発明はさらに、標的に結合された場合にバルジを形成する場合もしない場合もあるmiRNAの2本鎖前駆体を含むことができる。
好ましい一実施形態では、本発明で特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、内因性miRNAまたはプレmiRNAを標的とすることができる。本発明で特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、天然に存在する核酸塩基、糖類、および共有インターヌクレオシド(骨格)結合、さらには類似の機能を持つ天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。このような修飾された、または置換されたオリゴヌクレオチドは多くの場合、例えば細胞取り込みの増強、内因性miRNA標的の親和力の増大、および/またはヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの望ましい特性があることから天然型よりも好ましい。特定の内因性miRNAに結合するように設計されたオリゴヌクレオチド剤は実質的相補性を有しており、例えば少なくとも70、80、90、または100%の相補性を有しており、標的miRNAの少なくとも10個、20個、または25個もしくはそれ以上の塩基を有する。
miRNAまたはプレmiRNAは、18〜100ヌクレオチド長、より好ましくは18〜80ヌクレオチド長でもよい。成熟miRNAは、19〜30ヌクレオチド長、好ましくは21〜25ヌクレオチド長、特に21、22、23、24、または25ヌクレオチド長でもよい。ミクロRNA前駆体は、70〜100ヌクレオチド長でもよいし、ヘアピン立体配座でもよい。ミクロRNAは、長いプレmiRNAを機能的miRNAに特異的に処理するDicerおよびDroshaと呼ばれる酵素により、プレmiRNAからインビボ生成することができる。本発明で特徴とされているミクロRNAまたは前駆体miRNAは、細胞に基づいたシステムによりインビボで合成可能であるか、または化学合成可能である。ミクロRNAは、所望の特性を付与する修飾を含むように合成可能である。例えば、修飾をすることで、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞型に対するターゲッティング、または例えばエンドサイトーシス依存または独立の機序による細胞透過性を改善することができる。また、修飾は配列特異性を高めることができ、その結果、部位外れターゲッティング(off−site targeting)を減少させることができる。合成および化学修飾の方法について、以下でさらに詳しく説明する。
センス鎖配列(例えば、cDNA分子のセンス鎖の配列)が与えられた場合、miRNAは、Watson−Crick塩基対合の規則に従って設計可能である。miRNAは、RNA、例えばmiRNA、プレmiRNA、プレmRNA、またはmRNAの一部に相補的なものでもよい。例えば、miRNAは、mRNAまたはプレmRNAのコード領域または非コード領域、例えば5’UTRなどのプレmRNAまたはmRNAの翻訳開始部位を囲む領域に相補的なものでもよい。miRNAオリゴヌクレオチドは、例えば約12または30ヌクレオチド長、好ましくは約15から28ヌクレオチド長(例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド長)でもよい。
特に、本発明で特徴とされているmiRNAまたはプレmiRNAは、標的核酸との非相補性を有する内部(つまり、非末端)領域内のヌクレオチド上に化学修飾を持つことが可能である。例えば、修飾ヌクレオチドは、バルジを形成するmiRNAの領域に組み込まれることができる。この修飾は、例えばリンカーにより、miRNAに結合されたリガンドを含むことができる(例えば、以下の図OT−IからOT−IVを参照)。修飾は、例えば治療用miRNAの薬物動態または安定性を改善するか、または標的核酸へのmiRNAのハイブリダイゼーション特性(例えば、ハイブリダイゼーション熱力学)を改善することができる。いくつかの実施形態では、miRNAのバルジ領域に組み込まれるか、または繋留される修飾またはリガンドの配向は、バルジ領域内の空間を占有するように向けられることが好ましい。例えば、修飾は、核酸鎖上の修飾塩基もしくは糖またはインターカレーターとして機能するリガンドを含むことができる。これらはバルジ内に配置されることが好ましい。インターカレーターは、芳香族、例えば多環芳香族または複素環芳香族化合物でもよい。多環式インターカレーターはスタッキング能力を有することができ、2、3、または4個の縮合環を持つ系を含むことができる。後述のユニバーサル塩基はmiRNAに組み込まれることができる。いくつかの実施形態では、miRNAのバルジ領域に組み込まれるか、または繋留される修飾またはリガンドの配向は、バルジ領域内の空間を占有するように向けられることが好ましい。この配向により、miRNAの改善されたハイブリダイゼーション特性または他の何らかの形で望ましい特性が強化される。
一実施形態では、miRNAまたはプレmiRNAは、miRNAに改善されたハイブリダイゼーション特性または改善された配列特異性を持たせられるアミノグリコシド・リガンドを含むことができる。例示的なアミノグリコシドは、グリコシル化ポリリシン、ガラクトシル化ポリリシン、ネオマイシンB、トブラマイシン、カナマイシンA、およびNeo−N−アクリジン(Neo−N−acridine)、Neo−S−アクリジン(Neo−S−acridine)、Neo−C−アクリジン(Neo−C−acridine)、Tobra−N−アクリジン(Tobra−N−acridine)、およびKanaA−N−アクリジン(KanaA−N−acridine)などのアミノグリコシドのアクリジン複合体を含む。アクリジン類似体を使用することで配列特異性を高めることができる。例えば、ネオマイシンBは、DNAとは対照的にRNAに対し高い親和性を有するが、配列特異性は低い。アクリジン類似体であるneo−S−アクリジンは、HIV Rev応答エレメント(RRE)に高い親和性を有する。いくつかの実施形態では、アミノグリコシド・リガンドのグアニジン類似体(グアニジノグリコシド(guanidinoglycoside))はオリゴヌクレオチド剤に繋留される。グアニジノグリコシドではアミノ酸のアミン基がグアニジン基に交換されている。グアニジン類似体の結合により、オリゴヌクレオチド剤の細胞透過性が高まる可能性がある。
一実施形態では、リガンドは、標的核酸の切断により標的遺伝子阻害に寄与する開裂基を含むことができる。好ましくは、開裂基は、バルジ領域内に配置されるようにしてmiRNAに繁留され、そこで標的RNAに接近して切断することができる。開裂基は、例えばブレオマイシン(例えば、ブレオマイシン−A、ブレオマイシン−A、またはブレオマイシン−B)、ピレン、フェナントロリン(例えば、O−フェナントロリン)、ポリアミン、トリペプチド(例えば、lys−tyr−lysトリペプチド)、または金属イオンキレート基でもよい。金属イオンキレート基は、例えばLu(III)またはEU(III)大環状錯体、Zn(II)2,9−ジメチルフェナントロリン誘導体、Cu(II)テルピリジン、またはアクリジンを含むことができ、Lu(III)などの遊離金属イオンによりバルジの部位にある標的RNAの選択的切断を促進することができる。いくつかの実施形態では、標的RNAの切断を、例えばバルジ領域のところで促進するために、ペプチド・リガンドをmiRNAまたはプレmiRNAに繋留することができる。例えば、1,8−ジメチル−1,3,6,8,10,13−ヘキサアザシクロテトラデカン(シクラム)を(例えばアミノ酸誘導体により)ペプチドに複合し、標的RNA切断を促進することができる。本発明で特徴とされている方法および組成物は、切断または非切断依存の機序により標的遺伝子発現を阻害するmiRNAを含む。
miRNAまたはプレmiRNAは、2本鎖を形成する、十分に相補性のある領域(例えば、7、8、9、10、または11ヌクレオチド長である領域)により両脇を固められている非相補性の領域(例えば、3、4、5、または6ヌクレオチド長である領域)を含むように設計されて合成されることが可能である。
ヌクレアーゼ耐性および/または標的に対する結合親和力を高めるために、miRNAは、2’−O−メチル、2’−フッ素、2’−O−メトキシエチル、2’−O−アミノプロピル、2’−アミノ、および/またはホスホロチオエート結合を含むことができる。ロックト核酸(LNA)、2−チオピリミジン(例えば、2−チオ−U)、2−アミノ−A,G−Clamp修飾(G−clamp modification)、およびエチレン核酸(ENA)、例えば2’−4’エチレン架橋核酸を含めた場合も、標的への結合親和力を高めることが可能である。オリゴヌクレオチド骨格にフラノース糖を含めることでも、エンドヌクレアーゼ切断を減少させることができる。miRNAまたはプレmiRNAはさらに、3’カチオン基を含めることにより、または3’−3’結合を有する3’末端でヌクレオシドを反転することにより修飾することができる。他の代替手段では、3’末端は、アミノアルキル基、例えば3’C5−アミノアルキルdTでブロックすることができる。他の3’複合体は、3’−5’エキソヌクレアーゼ切断を阻害することができる。理論には縛られないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの3’複合体は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの3’末端に結合するのを立体的に妨害することによりエキソヌクレアーゼ切断を阻害することが可能である。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環式複合体または修飾糖(D−リボース、デオキシリボース、グルコースなど)でさえ、3’−5’−エキソヌクレアーゼをブロックすることができる。
5’末端は、アミノアルキル基、例えば、5’−O−アルキルアミノ置換基でブロックすることができる。他の5’複合体は、5’−3’エキソヌクレアーゼ切断を阻害することができる。理論には縛られないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの5’複合体は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの5’末端に結合することを立体的に妨害することにより、エキソヌクレアーゼ切断を阻害することが可能である。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環式複合体または修飾糖(D−リボース、デオキシリボース、グルコースなど)でさえ、3’−5’ −エキソヌクレアーゼをブロックすることができる。
一実施形態では、miRNAまたはプレmiRNAは、ターゲッティング、例えば本願に記載されているターゲッティング修飾を改善する修飾を含む。特定の細胞型へのmiRNA分子を標的とする修飾の例は、ガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノ−スなどの炭水化物糖質、葉酸塩などのビタミン、RGDおよびRGD模倣薬などの他のリガンド、およびナプロキセン、イブプロフェン、または他の知られているタンパク結合分子を含む小分子を含む。
miRNAまたはプレmiRNAは、当業で知られている手順を使用する化学合成および/または酵素的ライゲーション反応を使用して構築可能である。例えば、miRNAまたはプレmiRNAを、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を高めるか、またはmiRNAまたはプレmiRNAと標的核酸との間に形成される2本鎖の物理的安定性を高めるように設計された各種修飾ヌクレオチドを使用して化学合成することが可能であり、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。他の適切な核酸修飾について、ここで説明する。miRNAまたはプレmiRNA核酸は、発現ベクターを使用して生物学的に生産することが可能であるが、アンチセンス配向で核酸はこの発現ベクターにサブクローン化されている(つまり、挿入核酸から転写されたRNAは、注目する標的核酸に対しアンチセンス配向となる)。
アンチセンス型オリゴヌクレオチド剤
本発明で特徴とされている1本鎖オリゴヌクレオチド剤は、アンチセンス核酸を含む。「アンチセンス」核酸は、遺伝子発現産物をコードする「センス」核酸に相補的である、例えば、2本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的な、またはRNA配列、例えばプレmRNA、mRNA、miRNA、またはプレmiRNAに相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸標的と水素結合を形成することができる。
コード鎖配列(例えば、cDNA分子のセンス鎖の配列)が与えられた場合、アンチセンス核酸は、Watson−Crick塩基対合の規則に従って設計可能である。アンチセンス核酸分子は、RNA、例えばプレmRNAまたはmRNAのコードまたは非コード領域の一部に相補的なものでもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、プレmRNAまたはmRNA、例えば5’UTRの翻訳開始部位を囲む領域に相補的なものでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約10から25ヌクレオチド長(例えば、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチド長)でもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに、miRNAまたはプレmiRNAに相補的でもよい。
アンチセンス核酸は、当業で知られている手順を使用する化学合成および/または酵素的ライゲーション反応を使用して構成可能である。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を高めるか、またはアンチセンスと標的核酸との間に形成される2本鎖の物理的安定性を高めるように設計された各種修飾ヌクレオチドを使用して化学合成可能であり、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。他の適切な核酸修飾について、ここで説明する。アンチセンス核酸は、発現ベクターを使用して生物学的に生産可能であるが、アンチセンス配向で核酸はこの発現ベクターにサブクローン化されている(つまり、挿入核酸から転写されたRNAは、注目する標的核酸に対しアンチセンス配向となる)。
アンチセンス剤は、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ(例えば、オリゴデオキシヌクレオチド)、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含むことができる。例えば、リボヌクレオチドのみからなるアンチセンス剤は相補的RNAにハイブリダイズし、翻訳機構が標的RNA転写に接近するのを妨げ、それによりタンパク質合成を阻害することができる。デオキシリボヌクレオチドのみ、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチド、例えばアンチセンス剤の5’および3’末端のところでRNA配列により両脇を固められたDNA配列を含むアンチセンス分子は、相補的RNAにハイブリダイズすることができ、RNA標的はその後、酵素、例えばRNAse Hにより切断可能である。標的RNAの分解により翻訳が妨げられる。両脇を固めるRNA配列は、2’−O−メチル化ヌクレオチド、およびホスホロチオエート結合を含むことができ、内部DNA配列はホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。内部DNA配列は、RNAseH活性によるターゲッティングが望ましい場合に、好ましくは少なくとも5ヌクレオチド長である。
ヌクレアーゼ耐性を高めるために、アンチセンス剤はさらに、3’−3’結合を有する3’末端でヌクレオシドを反転することにより修飾可能である。他の代替手段では、3’末端はアミノアルキル基でブロック可能である。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド剤は、ターゲッティング、例えば本願に記載されているターゲッティング修飾を改善する修飾を含む。
デコイ型オリゴヌクレオチド剤
本発明において特徴としているオリゴヌクレオチド剤は、デコイ核酸、例えばデコイRNAでもよい。デコイ核酸は天然核酸に類似しているが、天然核酸の活性を阻害または遮断するような形で修飾されている。例えば、デコイRNAは、リガンドに対する天然の結合領域を模倣することができる。したがって、デコイRNAは、特定のリガンドの結合について天然の結合標的と競合する。天然の結合標的は、内因性核酸、例えばプレmiRNA、miRNA、プレmRNA、mRNA、またはDNAでもよい。例えば、HIVトランス活性化応答(TAR)RNAの過剰発現は「デコイ」として作用し、HIV tatタンパク質を効率よく結合し、それによりHIV RNA内でコードされたTAR配列に結合するのを防止することができることがわかった。
一実施形態では、デコイRNAは、ターゲッティング、例えば本願に記載されているターゲッティング修飾を改善する修飾を含む。
miRNAおよびアンチセンスRNAについて上で説明され、本願の別のところで説明されている化学修飾も、デコイ核酸で使用するのに適している。
アプタマー型オリゴヌクレオチド剤
本発明において特徴とされているオリゴヌクレオチド剤は、アプタマーでもよい。アプタマーは、小さな有機分子またはタンパク質、例えば転写または翻訳因子などの非核酸リガンドに結合し、その後、活性を修飾(例えば阻害)する。アプタマーは、非核酸リガンド上の標的結合部位の認識を導く特定の構造内に畳み込まれることができる。アプタマーは、本願に記載されている修飾のどれでも含むことができる。
一実施形態では、アプタマーは、ターゲッティング、例えば本願に記載されているターゲッティング修飾を改善する修飾を含む。
miRNAおよびアンチセンスRNAについて上で説明され、本願の別のところで説明されている化学修飾も、デコイ核酸で使用するのに適している。
本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細は、付属の図面および以下の説明で述べられる。本発明の他の特徴および利点は、説明および図面、ならびに請求項から明白になるであろう。引用されているすべての参考文献、特許、および特許出願は、あらゆる目的に関して本願明細書に援用する。
典型的な一実施形態では、対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、または霊長類などの哺乳類である。対象は、乳畜(例えば、ウシやヤギ)、または他の家畜(例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ヒツジ、ブタ、魚、エビ)とすることができる。好ましい一実施形態では、対象は、ヒト、例えば正常人または疾病もしくは障害を有しているか、または疾病もしくは障害があると診断されているか、または疾病もしくは障害にかかると予測されている個人である。
さらに、オリゴヌクレオチド剤を介した調節は、オリゴヌクレオチド剤組成物を投与してから数日間持続することから、多くの場合に、1日1回よりも少ない頻度で、または場合によっては治療計画全体を通して1回のみ、組成物を投与することが可能である。例えば、ある種の癌細胞は単回ボーラス投与によって治療することができるが、慢性ウイルス感染では定期的投与、例えば、週1回または月1回の投与を必要とすることがある。例えば、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)またはバーキットリンパ腫の治療を、1本鎖オリゴヌクレオチド剤、例えば、miR−155を標的とする1本鎖オリゴヌクレオチド剤の単回ボーラス投与で行うことができる。
オリゴヌクレオチド剤を対象に投与するために使用可能な多数の例示的な送達経路が説明されている。それに加えて、オリゴヌクレオチド剤は、本願に記載されている例示的な方法により製剤可能である。
リガンド複合モノマーサブユニットおよびオリゴヌクレオチド合成のためのモノマー
定義
「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素の基を指す。
「アルキル」という用語は、指示されている数の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖でもよい炭化水素鎖を指す。例えば、C〜C12アルキルは、基が1から12(含む)個の炭素原子を中に持つことができることを示す。「ハロアルキル」という用語は、1つまたは複数の水素原子がハロにより置き換えられたアルキルを指し、すべての水素原子がハロにより置き換えられたアルキル構成成分(例えば、ペルフルオロアルキル)を含む。アルキルおよびハロアルキル基は、O、N、またはSを任意に挿入され得る。「アラルキル」という用語は、すべての水素原子がアリール基により置き換えられたアルキル構成成分を指す。アラルキルは、複数の水素原子がアリール基により置き換えられた基を含む。「アラルキル」の例としては、ベンジル基、9−フルオレニル基、ベンズヒドリル基、およびトリチル基がある。
「アルケニル」という用語は、2〜8個の炭素原子を含み、1つまたは複数の二重結合を持つことを特徴とする直鎖または分枝鎖炭化水素を指す。典型的なアルケニルの例としては、限定はしないがアリル基、プロペニル基、2−ブテニル基、3−ヘキセニル基、および3−オクテニル基がある。「アルキニル」という用語は、2〜8個の炭素原子を含み、1つまたは複数の三重結合を持つことを特徴とする直鎖または分枝鎖炭化水素を指す。典型的なアルキニルのいくつかの例として、エチニル、2−プロピニル、および3−メチルブチニル、およびプロパルギルがある。spおよびsp炭素は、アルケニルおよびアルキニル基の結合点としての機能をそれぞれ場合によって果たすことができる。
「アルキルアミノ」および「ジアルキルアミノ」という用語は、−NH(アルキル)基および−NH(アルキル)基をそれぞれ指す。「アラルキルアミノ」という用語は−NH(アラルキル)基を指す。「アルコキシ」という用語は−O−アルキル基を指し、「シクロアルコキシ」および「アラルコキシ」という用語は、−O−シクロアルキル基およびO−アラルキル基をそれぞれ指す。「シロキシ」という用語はRSiO−基を指す。「メルカプト」という用語はSH基を指す。「チオアルキル」という用語は−S−アルキル基を指す。
「アルキレン」という用語は、2価アルキル(つまり、−R−)例えば−CH−、−CHCH−、および−CHCHCH−を指す。「アルキレンジオキソ」という用語は、構造−O−R−O−を持つ2価化学種を指し、式中、Rはアルキレンを指す。
「アリール」という用語は、芳香族単環式、2環式、または3環式炭化水素環系を指し、環原子はどれも置換可能である。アリール構成成分の例としては、限定はしないがフェニル、ナフチル、アントラセニル、およびピレニルがある。
本願で採用されている「シクロアルキル」という用語は、3から12個の炭素を有する飽和環式、2環式、3環式、または多環式炭化水素基を含み、環原子はどれも置換可能である。本願に記載されているシクロアルキル基は縮合環を含むこともできる。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子(例えば、スピロ縮合環)を共有する環である。シクロアルキル構成成分の例としては、限定はしないがシクロヘキシル、アダマンチル、およびノルボルニル、およびデカリンがある。
「ヘテロシクリル」という用語は、単環式の場合は1〜3個のヘテロ原子、2環式の場合は1〜6個のヘテロ原子、または3環式の場合は1〜9個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子はO、N、またはSから選択され(例えば、炭素原子および単環式、2環式、または3環式の場合にそれぞれN、O、またはSの1〜3、1〜6、または1〜9個のヘテロ原子)、環原子はどれも置換可能である、非芳香族の3〜10員の単環式、8〜12員の2環式、または11〜14員の3環式の環系を指す。本願に記載されているヘテロシクリル基は縮合環を含むこともできる。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子(例えば、スピロ縮合環)を共有する環である。ヘテロシクリルの例としては、限定はしないがテトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピロリニル、およびピロリジニルがある。
本明細書で採用されている「シクロアルケニル」という用語は、5から12個の炭素、好ましくは5から8個の炭素を有する部分不飽和、非芳香族、環式、2環式、3環式、または多環式炭化水素基を含み、環原子はどれも置換可能である。本願に記載されているシクロアルケニル基は縮合環を含むこともできる。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子(例えば、スピロ縮合環)を共有する環である。シクロアルケニル構成成分の例としては、限定はしないがシクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、またはノルボルネニルがある。
「ヘテロシクロアルケニル」という用語は、単環式の場合は1〜3個のヘテロ原子、2環式の場合は1〜6個のヘテロ原子、または3環式の場合は1〜9個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子はO、N、またはSから選択され(例えば、炭素原子および単環式、2環式、または3環式の場合にそれぞれN、O、またはSの1〜3、1〜6、または1〜9個のヘテロ原子)、環原子はどれも置換可能である、部分飽和非芳香族の5〜10員の単環式、8〜12員の2環式、または11〜14員の3環式の環系を指す。本願に記載されているヘテロシクロアルケニル基は縮合環を含むこともできる。縮合環は、共通の炭素−炭素結合または共通の炭素原子(例えば、スピロ縮合環)を共有する環である。ヘテロシクロアルケニルの例としては、限定はしないがテトラヒドロピリジルおよびジヒドロピランがある。
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合は1〜3個のヘテロ原子、2環式の場合は1〜6個のヘテロ原子、または3環式の場合は1〜9個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子はO、N、またはSから選択され(例えば、炭素原子および単環式、2環式、または3環式の場合にそれぞれN、O、またはSの1〜3、1〜6、または1〜9個のヘテロ原子)、環原子はどれも置換可能である、芳香族の5〜8員環の単環式、8〜12員環の2環式、または11〜14員環の3環式の環系を指す。本願に記載されているヘテロアリール基は、共通炭素−炭素結合を共有する縮合環を含むこともできる。
「オキソ」という用語は、炭素に結合されたときにカルボニルを形成し、窒素に結合されたときにN−オキシドを形成し、硫黄に結合されたときにスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、そのどれもが、さらに置換基で置換可能である。
「置換基」という用語は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルケニル、シクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリール基上でその基の任意の原子のところで「置換された」基を指す。好適な置換基は、限定はしないがアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、SOH、硫酸塩、リン酸塩、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、カルボキシル、オキソ、チオキソ、イミノ(アルキル、アリール、アラルキル)、S(O)アルキル(nは0〜2)、S(O)アリール(nは0〜2)、S(O)ヘテロアリール(nは0〜2)、S(O)ヘテロシクリル(nは0〜2)、アミン(モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ)、エステル(アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル)、アミド(モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ)、スルホンアミド(モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ)、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロシクリル、および非置換シクロアルキルを含む。他の態様では、1つの基上の置換基は独立して、上述の複数の置換基のうちのどれか単一の1つの置換基、または任意の部分集合である。
「アデニニル(adeninyl)、シトシニル、グアニニル(guaninyl)、チミニル、およびウラシリル(uracilyl)」という用語などは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルの基を指す。
「保護された」構成成分は、官能基の反応性が結合された保護基の存在により一時的にブロックされる反応性官能基、例えばヒドロキシル基もしくはアミノ基、あるいは1つまたは複数の官能基を有する、あるクラスの分子、例えば糖類を指す。本願に記載されているモノマーおよび方法で使用される保護基は、例えば本願明細書に援用するグリーン、ティー.ダブリュー.(Greene,T.W.)、Protective Groups in Organic Synthesis(John Wiley and Sons:New York)、1981年で説明されている。
概要
オリゴヌクレオチド剤、例えば好ましいが限定されないリガンド複合モノマーサブユニットを含む複合オリゴヌクレオチド剤は、以下および図1のスキームに式(II)として提示されている。担体(いくつかの実施形態では「リンカー」とも呼ばれる)は環式または非環式構成部分でもよく、2つの「骨格結合点」(例えば、ヒドロキシル基)およびリガンドを含む。リガンドは、担体に直接結合される(例えば、複合される)か、または介在するテザー(例えば1つまたは複数の原子の非環式鎖、または核酸塩基、例えば1つまたは複数の化学修飾、例えば異常塩基を適宜有する天然に存在する核酸塩基、またはユニバーサル塩基)により担体に間接的に結合される(例えば複合される)ことが可能である。したがって、担体はさらに、それぞれリガンドおよびテザー/テザー・リガンドに対する「リガンドまたは繋留結合点」を含む。
リガンド複合モノマーサブユニットは、RNA分子の5’または3’末端サブユニットでもよく、つまり2つの「W」基のうちの1つがヒドロキシル基であり、他の「W」基は2つまたはそれ以上の非修飾または修飾リボヌクレオチドの鎖でもよい。それとは別に、リガンド複合モノマーサブユニットは内部位置を占有し、両方の「W」基は1つまたは複数の非修飾または修飾リボヌクレオチドでもよい。複数のリガンド複合モノマーサブユニットは、RNA分子、例えばオリゴヌクレオチド剤中に存在することができる。テザー・リガンド複合モノマーサブユニット、例えば親油性部分、例えばコレステロールが担体に繋留されるサブユニットを包含するための好ましい位置は、3’末端、5’末端、または内部位置である。
式(II)の修飾RNA分子は、当業で知られているオリゴヌクレオチド合成方法を使用して得られる。好ましい一実施形態では、式(II)の修飾RNA分子は、例えばホスホラミダイトまたはH−ホスホネート結合法を使用して、対応するモノマー化合物のうちの1つまたは複数(例えば、以下および図1のスキームのA、B、およびCを参照)を成長する鎖に組み込むことにより調製可能である。
モノマー、例えばリガンド複合モノマーは一般に、担体分子(以下および図1のAを参照)に連結されている官能化の異なる2つのヒドロキシル基(OFGおよびOFG)、およびリガンド/繋留結合点を含む。本願で使用されているように、「官能化ヒドロキシル基」という用語は、ヒドロキシルプロトンが他の置換基により置換されていることを意味する。以下および図1の代表的な構造BおよびCに示されているように、担体上の1つのヒドロキシル基(OFG)は、保護基(PG)により官能化される。他のヒドロキシル基(OFG)は、(1)Bの場合のように直接的に、またはリンカーLを通じて間接的に、液相または固相合成担持試薬(中身の詰まった丸)により、または(2)Cの場合のようにリン含有構成成分、例えばホスホラミダイトにより官能化可能である。繋留結合点は、モノマーが成長する鎖内に組み込まれるときに水素原子、好適な保護基、テザー、またはテザー・リガンドに接続可能である(以下のAの中の変数「R」を参照)。そのため、テザー・リガンドは、モノマーが成長する鎖に組み込まれるときにモノマーに結合できるが、そうする必要はない。いくつかの実施形態では、テザー、リガンド、またはテザー・リガンドは、「前駆体」リガンド複合モノマーサブユニットが鎖に組み込まれた後に「前駆体」リガンド複合モノマーサブユニットに連結することができる。以下で(また明細書の別のところで)使用されている波線は接続を指しており、構成成分と結合点または構成成分結合点との間に入れられているテザー分子との間の直接結合を表すことができる。直接繋留されるということは、構成成分が結合点に直接結合されることを意味する。間接的に繋留されるということは、結合点と構成成分との間に入れられたテザー分子があることを意味する。
(OFG)保護基は、例えばT.W.グリーンおよびピー.ジー.エム.ウッツ(T.W.Greene and P.G.M.Wuts)、Protective Groups in Organic Synthesis,2d.Ed.,John Wiley and Sons(1991年)から、必要に応じて選択可能である。保護基は、アミダイト合成条件、貯蔵条件、およびオリゴヌクレオチド合成条件の下で安定していることが好ましい。ヒドロキシル基、−OHは求核基(つまりルイス塩基)であり、酸素を通して求電子剤(つまりルイス酸)と反応する。水素が保護基、例えばトリアリールメチル基またはトリアルキルシリル基で置き換えられたヒドロキシル基は、置換反応において求核剤として本質的に非反応性である。そのため、保護ヒドロキシル基は、例えばオリゴヌクレオチド合成時に構造Cにより例示される化合物のホモカップリングを防ぐ際に有用である。いくつかの実施形態では、好ましい保護基はジメトキシトリチル基である。他の実施形態では、好ましい保護基は以下の式を持つケイ素に基づく保護基である。
X5’、X5’’、およびX5’’’は、置換または非置換アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、アルコキシ、シクロアルコキシ、アラルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、またはシロキシから選択可能である(つまり、RSiO−、3つの「R」基は、上記の基の任意の組み合わせでもよい)。X’、X’’、およびX’’’はすべて同じであるか、または異なる可能性があり、またX’、X’’、X’’’のうちの2つが同一であるが、3番目が異なる組み合わせが考えられる。いくつかの実施形態では、X’、X’’、およびX’’’は少なくとも一つのアルコキシまたはシロキシ基を含み、図2に示されている基のうちの一つでもよく、好ましい組み合わせは、X’、X’’=トリメチルシロキシおよびX’’’=1,3−(トリフェニルメトキシ)−2−プロポキシまたはシクロドデシルオキシを含む。
’、X’’、およびX’’’の他の好ましい組み合わせは、以下で述べる脱保護および安定性基準を満たすOFG基を結果として生じることができるものを含む。この基は、アミダイト合成条件、貯蔵条件、およびオリゴヌクレオチド合成条件の下で安定していることが好ましい。シリル基を例えば担持結合オリゴヌクレオチドから素早く、つまり1分以内に取り除くことが望ましいが、それは合成時間を短縮し、それにより、成長するオリゴヌクレオチド鎖を試薬に曝す時間を短縮できるからである。オリゴヌクレオチド合成は、例えば発色団のシリル置換基の添加から脱保護時にシリル保護基が見える場合に改善可能である。
シリル保護基の選択は、安定していることと簡単に取り除けることという本質的特性の競合する要求、およびそれらの競合する目標のバランスをとる必要があることにより複雑化する可能性がある。安定性を高めるほとんどの置換基はさらに、シリル基を取り除くために要する反応時間も引き延ばし、基を取り除く難しさのレベルが高まる可能性がある。
アルコキシおよびシロキシ置換基をOFGケイ素含有保護基に加えると、シリルエーテル結合をフッ化物で切断することに対する保護基の感受性が高まる。置換基の立体的大きさを大きくすると安定性を保つが、同じ程度にフッ化物の不安定性を減少させることはない。シリル基上で置換基のバランスを上手くとることで、シリルエーテルは存続可能なヌクレオシド保護基になる。
OFGケイ素含有保護基の候補は、室温でOFG基の候補を担持した好ましい担体のテトラヒドロフラン溶液を5モル当量のテトラヒドロフランに曝すことにより試験可能である。薄層クロマトグラフィーによって出発物質の消失を監視することにより、反応時間を決定可能である。
BにおけるOFGが、可溶性または不溶性担持試薬に連結されたリンカー、例えば比較的長い有機リンカーを含む場合、OFGが脱保護され、求核剤として電子吸引性基(例えば、アミダイト基)を含む他のヌクレオシドまたはモノマーと自由に反応できるようになると、溶液または固相合成技術を使用して、天然の、および/または修飾されたリボヌクレオチドの鎖を作製することができる。それとは別に、天然の、または修飾されたリボヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド鎖は、OFGのところのアミダイト基またはH−ホスホン酸基を介してモノマーCに連結することができる。この動作の後、OFGをブロック解除し、復元された求核ヒドロキシル基を、電子吸引性基を含む他のヌクレオシドまたはモノマーと反応させることができる。R’は、置換または非置換アルキルまたはアルケニルとすることができる。好ましい実施形態では、R’は、メチル、アリル、または2−シアノエチルである。R’’は、C〜C10アルキル基とすることができ、好ましくは、3つまたはそれ以上の炭素を含む枝分かれした基、例えばイソプロピルである。
BにおけるOFGは、リンカーで官能化されたヒドロキシルでもよく、これはさらに、他のリンカー末端の液相または固相合成担持試薬を含む。この担持試薬は、本願に記載されているモノマーを担持することが可能な担持媒体でもよい。モノマーは、担体が入れられている溶媒中でモノマー(および成長する鎖)を可溶化することが可能な、リンカーLを介して不溶性担体に結合可能である。可溶化されているが、それでも固定化されているモノマーは、周囲の溶媒中で試薬と反応可能であり、未反応試薬および可溶性副産物を、モノマーまたはモノマー誘導生成物が結合されている固体担体から容易に洗い流すことができる。それとは別に、モノマーを、可溶性担持構成成分、例えばポリエチレングリコール(PEG)に結合することができ、液相合成技術を使用して鎖を作製することができる。リンカーおよび担持媒体の選択は当業の範囲内にある。一般に、リンカーは、−C(O)(CHC(O)−、または−C(O)(CHS−でもよく、式中、qは0、1、2、3、または4であり、リンカーは、好ましくはオキサリル、スクシニル、またはチオグリコリルである。標準対照多孔質ガラス固相合成担体は、フッ化物不安定な5’シリル保護基とともには使用可能でない。というのも、ガラスは、完全長生成物の量が著しく少ないフッ化物により劣化するためである。フッ化物安定なポリスチレンに基づく担体またはPEGが好ましい。
リガンド/繋留結合点は、2価、3価、4価、5価、または6価原子でもよい。いくつかの実施形態では、リガンド/繋留結合点は、炭素、酸素、窒素、または硫黄原子でもよい。例えば、リガンド/繋留結合点前駆体官能基は、求核ヘテロ原子、例えば−SH、−NH、第2級アミノ、ONH、または、NHNHを持つことが可能である。他の例としては、リガンド/繋留結合点前駆体官能基は、オレフィン、例えば−CH=CHまたはDiels−Alderジエンまたは求ジエンでもよく、前駆体官能基は、例えば遷移金属触媒による炭素−炭素(例えば、オレフィン・メタセシス)工程または付加環化(例えば、Diels−Alder)を使用して、リガンド、テザー、またはテザー・リガンドに結合することができる。さらに例として、リガンド/繋留結合点前駆体官能基は、求電子性構成成分、例えばアルデヒドでもよい。担体が環式担体である場合、リガンド/繋留結合点は、環内原子(つまり、環式構成成分、例えば、窒素原子の構成原子)または環外原子(つまり、環式構成成分中の構成原子に結合された原子または原子群)でもよい。
担体は、OFG、OFG、およびリガンドに対する結合点を含む有機分子でもよい。いくつかの実施形態では、担体は環状分子であり、ヘテロ原子(例えば、O、N、またはS)を含むことができる。例えば、担体分子は、アリール(例えば、ベンゼン、ビフェニルなど)、シクロアルキル(例えば、シクロヘキサン、シスまたはトランスデカリンなど)、またはヘテロシクリル(ピペラジン、ピロリジンなど)を含むことができる。他の実施形態では、担体は、例えばセリノールに基づく非環式構成成分でもよい。上記の環式系はどれも、OFG、OFG、およびリガンドに加えて置換基を含むことができる。
糖類に基づくモノマー
いくつかの実施形態では、担体分子は酸素含有複素環である。好ましくは、担体は、以下の構造式LCM−Iで示されているようなリボース糖である。この実施形態では、リガンド複合モノマーは、ヌクレオシドである。
「B」は、核酸塩基、例えば1つまたは複数の化学修飾を任意で有する、天然に存在する核酸塩基、例えば異常塩基、またはユニバーサル塩基を表す。
本願で使用されているように、「異常」核酸塩基は、以下のうちのどれか1つを含むことができる。
2−メチルアデニニル(methyladeninyl)、
N6−メチルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−メチルアデニニル、
N6−イソペンテニルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニニル、
N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデニニル、
2−メチルチオ−N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデニニル、
N6−グリシニルカルバモイルアデニニル、
N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
N6−メチル−N6−トレオニルカルバモイルアデニニル、
N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
N6,N6−ジメチルアデニニル、
3−メチルシトシニル、
5−メチルシトシニル、
2−チオシトシニル、
5−ホルミルシトシニル、
N4−メチルシトシニル、
5−ヒドロキシメチルシトシニル、
1−メチルグアニニル、
N2−メチルグアニニル、
7−メチルグアニニル、
N2,N2−ジメチルグアニニル、
N2,7−ジメチルグアニニル、
N2,N2,7−トリメチルグアニニル、
1−メチルグアニニル、
7−シアノ−7−デアザグアニニル、
7−アミノメチル−7−デアザグアニニル、
プソイドウラシリル、
ジヒドロウラシリル、
5−メチルウラシリル、
1−メチルプソイドウラシリル、
2−チオウラシリル、
4−チオウラシリル、
2−チオチミニル
5−メチル−2−チオウラシリル、
3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウラシリル、
5−ヒドロキシウラシリル、
5−メトキシウラシリル、
ウラシリル5−オキシ酢酸、
ウラシリル5−オキシ酢酸メチルエステル、
5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシリル、
5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシリルメチルエステル、
5−メトキシカルボニルメチルウラシリル、
5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシリル、
5−アミノメチル−2−チオウラシリル、
5−メチルアミノメチルウラシリル、
5−メチルアミノメチル−2−チオウラシリル、
5−メチルアミノメチル−2−セレノウラシリル、
5−カルバモイルメチルウラシリル、
5−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、
5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシリル、
3−メチルウラシリル、
1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)プソイドウラシリル、
5−カルボキシメチルウラシリル、
5−メチルジヒドロウラシル、または
3−メチルプソイドウラシリル。
ユニバーサル塩基は、天然のDNA/RNA塩基のそれぞれと塩基対を形成することができ、それらは比較的違いが小さい。一般に、ユニバーサル塩基は、スタッキング相互作用を介して、例えば2本鎖RNAまたはRNA類似分子を安定化することができる非水素結合、疎水性、芳香族構成成分である。ユニバーサル塩基はさらに、水素結合置換基を含むこともできる。
本願で使用されているように、「ユニバーサル塩基」は、アントラセン、ピレン、または以下のうちのどれか1つを含むことができる。
いくつかの実施形態では、Bは、リガンドを担体に連結するテザーの一部を形成することができる。例えば、テザーは、B−CH=CH−C(O)NH−(CH−NHC(O)−リガンドでもよい。好ましい一実施形態では、二重結合はトランス型であり、リガンドは、置換または非置換コレステロリル基(例えば、D環側鎖またはC−3ヒドロキシルを通じて結合されている)、少なくとも1つの立体中心および少なくとも1つの置換基をアラルキル基のアリール部分に有するアラルキル構成成分、または核酸塩基である。いくつかの実施形態では、上述のテザーのBは、ウラシリルまたはユニバーサル塩基、例えば追加の置換基、例えば1つまたは複数のフルオロ基を任意に有するアリール構成成分、例えばフェニルである。Bは、任意の原子でテザーの残り部分と置換可能である。
は、「オキシ」または「デオキシ」置換基を2’−OHの代わりに含むか、またはリガンドもしくはテザー・リガンドでもよい。
「オキシ」置換基の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ(OR、例えばR=H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、糖、または保護基)、ポリエチレングリコール(PEG)、O(CHCHO)CHCHOR、2’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋により同じリボース糖の4’炭素に連結されている「ロックト」核酸(LNA)、O−PROTECTED AMINE(AMINE=NH、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)、およびアミノアルコキシ、O(CHPROTECTED AMINE、(例えば、AMINE=NH、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)、およびオルトエステルがある。アミン保護基は、ホルミル、アミド、ベンジル、アリルなどを含むことができる。
好ましいオルトエステルは一般化学式Jを有する。基R31およびR32は、同じでもよいし異なってもよいし、図3に示されている基の任意の組み合わせでもよい。好ましいオルトエステルは、以下で構造Kとして示されている「ACE」基である。
「デオキシ」置換基は、水素(つまり、デオキシリボース糖)、ハロ(例えば、フルオロ)、保護アミノ(例えば、NH、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはすべてのアミノが保護されるアミノ酸)、完全保護ポリアミノ(例えば、NH(CHCHNH)CHCH−AMINE、式中、AMINE=NH、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノおよびすべてのアミノ基は保護されている)、−NHC(O)R(R=アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖類)、シアノ、アルキル−チオ−アルキル、チオアルコキシ、および例えば保護アミノ官能基で任意に置換可能である、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルを含む。好ましい置換基は、2’−メトキシエチル、2’−OCH、2’−O−アリル、2’−C−アリル、および2’−フルオロである。
は、上でOFGについて説明されている通りである。
PGは、トリアリールメチル基(例えば、ジメトキシトリチル基)またはSi(X’)(X’’)(X’’’)でもよく、(X’)、(X’’)、および(X’’’)は他のところで説明されている通りである。
糖置換に基づくモノマー
環式糖置換に基づくモノマー、例えば糖置換に基づくリガンド複合モノマーは、本願では糖置換モノマーサブユニット(SRMS)モノマー化合物ともいう。好ましい担体は、以下に示す一般式(LCM−2)を有する。その構造において、好ましい骨格結合点は、RまたはR、RまたはR、あるいはYがCR10の場合にRおよびR10から選択可能である(2つの位置は、2つの骨格結合点、例えばRおよびR、またはRおよびRを与えるように選択される)。好ましい繋留結合点は、R、XがCHの場合にRまたはRを含む。担体は、以下では、鎖中に組み込むことができる構成要素として説明されている。そのため、これらの構造はさらに、結合点の1つ(末端位置の場合)または2つ(内部位置の場合)、例えばRまたはR、RまたはR、あるいはRまたはR10(YがCR10の場合)がホスフェート、もしくは修飾ホスフェート、例えば硫黄含有、骨格に連結されている状況も含む。例えば、上記のR基の1つは−CH−でもよいが、一方の結合は担体に連結され、他方は骨格原子、例えば結合酸素または中心リン原子に連結される。
式中、
Xは、N(CO)R、NR、またはCHであり、
Yは、NR、O、S、CR10であり、
Zは、CR1112であるか、または存在せず、
、R、R、R、R、およびR10はそれぞれ独立して、H、OR、または(CHORであり、R、R、R、R、R、およびR10のうちの少なくとも2つはORおよび/または(CHORであり、
、R、R11、およびR12はそれぞれ独立して、リガンド、H、1〜3個のR13で任意に置換されたC〜Cアルキル、またはC(O)NHRであるか、またはRおよびR11はともに、R14で任意に置換されたC〜Cシクロアルキルであり、
はリガンドでもよく、例えばRはRでもよく、Rは例えば繋留構成成分、例えばNRで置換されたC〜C20アルキル、またはNHC(O)Rで置換されたC〜C20アルキルを介して担体に間接的に繋留されたリガンドでもよく、
は、HまたはC〜Cアルキルであり、
13は、ヒドロキシ、C〜Cアルコキシ、またはハロであり、
14は、NRであり、
15は、シアノで任意に置換されたC〜Cアルキル基、またはC〜Cアルケニルであり、
16は、C〜C10アルキルであり、
17は、液相または固相担体試薬であり、
Lは、−C(O)(CHC(O)−、または−C(O)(CHS−であり、
は、保護基、例えばCAr(例えば、ジメトキシトリチル基)またはSi(X’)(X’’)(X’’’)であり、(X’)、(X’’)、および(X’’’)は他のところで説明されている通りであり、
は、P(O)(O)H、P(OR15)N(R16、またはL−R17であり、
は、HまたはC〜Cアルキルであり、
は、Hまたはリガンドであり、
各Arは独立して、C〜Cアルコキシで任意に置換されたC〜C10アリールであり、
nは1〜4であり、qは0〜4である。
例示的な担体が含むのは、例えばXはN(CO)RもしくはNRであり、YはCR10であり、Zは存在しないか、またはXはN(CO)RもしくはNRであり、YはCR10であり、ZはCR1112であるか、または、XはN(CO)RもしくはNRであり、YはNRであり、ZはCR1112であるか、またはXはN(CO)RもしくはNRであり、YはOであり、ZはCR1112であるか、またはXはCHであり、YはCR10であり、ZはCR1112であり、RおよびR11はともにCシクロアルキル(H、z=2)を形成するもの、またはインダン環系、例えばXはCHであり、YはCR10であり、ZはCR1112であり、RおよびR11はともにCシクロアルキル(H、z=1)を形成するものを含む。
いくつかの実施形態では、担体は、ピロリン環系または4−ヒドロキシプロリン環系に基づくことが可能であり、例えば、XはN(CO)RまたはNRであり、YはCR10であり、Zは存在しない(D)。OFGは、好ましくは5員環中の炭素の1つに連結された第1炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基に結合される(D中の−CHOFG)である。
OFGは、好ましくは5員環中の炭素の1つに直接結合される(D中の−OFG)。ピロリンに基づく担体では、−CHOFGはC−2に結合することができるとともにOFGはC−3に結合することがで、または−CHOFGはC−3に結合することができるとともにOFGはC−4に結合することができる。いくつかの実施形態では、CHOFGおよびOFGは、上で参照されている炭素の1つにジェミナル置換される(geminally substituted)ことが可能である。3−ヒドロキシプロリンに基づく担体では、−CHOFGはC−2に結合することができ、OFGはC−4に結合することができる。したがって、ピロリン−および4−ヒドロキシプロリンに基づくモノマーは結合(例えば、炭素−炭素結合)を含むことができるが、結合回転は、その特定の結合の周りに制約され、例えば制約は環の存在から生じる。そのため、CHOFGおよびOFGは、上で述べた対のどれかで互いに関してシス型またはトランス型でもよい。したがって、すべてのシス/トランス異性体は明らかに含まれる。モノマーはさらに、1つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現することができる。モノマーのそのようなすべての異性体は明らかに含まれる(例えば、CHOFGおよびOFGを伴う中心は、両方とも、R配置を持つか、または両方ともS配置を有するか、または一方の中心がR配置を有し、他方の中心がS配置を有し、これは入れ換え可能である)。繋留結合点は、好ましくは窒素である。担体Dの好ましい実施例は以下を含む。
いくつかの実施形態では、担体は、ピペリジン環系(E)に基づくことが可能であり、例えば、XはN(CO)RまたはNRであり、YはCR10であり、ZはCR1112である。OFGは、好ましくは6員環中の炭素の1つに連結された第1炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基(n=1)またはエチレン基(n=2)に結合される[Eの−(CHOFG]。
OFGは、好ましくは6員環中の炭素の1つに直接結合される(E中の−OFG)。−(CHOFGおよびOFGは、環上にジェミナル形態で配置可能である、つまり、両方の基は同じ炭素、例えばC−2、C−3、またはC−4のところで結合することができる。あるいは、−(CHOFGおよびOFGは、環上に近接形態で(in a vicinal manner)配置可能であり、つまり両方の基は、隣接する環炭素原子に結合することができ、例えば、−(CHOFGはC−2に結合することができるとともにOFGはC−3に結合することができ、−(CHOFGはC−3に結合することができるとともにOFGはC−2に結合することができ、−(CHOFGはC−3に結合することができるとともにOFGはC−4に結合することができ、または−(CHOFGはC−4に結合することができるとともにOFGはC−3に結合することができる。したがって、ピペリジンに基づくモノマーは結合(例えば炭素−炭素結合)を含むことができ、結合回転は、その特定の結合の周りに制約され、例えば、制約は環の存在から生じる。そのため、−(CHOFGおよびOFGは、上で述べた対のどれかで互いに関してシス型またはトランス型でもよい。したがって、すべてのシス/トランス異性体は明らかに含まれる。モノマーはさらに、1つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現することができる。モノマーのそのようなすべての異性体は明らかに含まれる(例えば、CHOFGおよびOFGを伴う中心は、両方ともR配置を有するか、または両方ともS配置を有するか、または一方の中心がR配置を有するとともに他方の中心がS配置を有し、これは入れ換え可能である)。繋留結合点は、好ましくは窒素である。
いくつかの実施形態では、担体は、ピペラジン環系(F)に基づくことが可能であり、例えば、XはN(CO)RもしくはNRであり、YはNRであり、ZはCR1112であるか、またはモルホリン環系(G)に基づくことが可能であり、例えばXはN(CO)RもしくはNRであり、YはOであり、ZはCR1112である。OFGは、好ましくは6員環中の炭素の1つに連結された第1炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基に結合される(FまたはG中の−CHOFG)。
OFGは、好ましくは6員環中の炭素の1つに直接結合される(FまたはG中の−OFG)。FおよびGの両方について、−CHOFGはC−2に結合することができ、OFGはC−3に結合することができ、またはこれを入れ換えて結合することができる。いくつかの実施形態では、CHOFGおよびOFGは、上で参照されている炭素の1つにジェミナル置換されることが可能である。したがって、ピペラジンおよびモルホリンに基づくモノマーは結合(例えば、炭素−炭素結合)を含むことができ、結合回転はその特定の結合の周りに制約され、例えば、制約は環の存在から生じる。そのため、CHOFGおよびOFGは、上で述べた対のどれかで互いに関してシス型またはトランス型でもよい。したがって、すべてのシス/トランス異性体は明らかに含まれる。モノマーはさらに1つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現可能である。モノマーのそのようなすべての異性体は明らかに含まれる(例えば、CHOFGおよびOFGを伴う中心は両方ともR配置を有するか、または両方ともS配置を有するか、または一方の中心がR配置を有するとともに他方の中心がS配置を有し、これは入れ換え可能である)。R’’’は、例えばC〜Cアルキル、好ましくはCHでもよい。FおよびGの両方において、繋留結合点は好ましくは窒素である。
いくつかの実施形態では、担体はデカリン環系に基づくことが可能であり、例えばXはCHであり、YはCR10であり、ZはCR1112であり、RおよびR11はともにCシクロアルキル(H、z=2)を形成するか、またはインダン環系に基づくことが可能であり、例えばXはCHであり、YはCR10であり、ZはCR1112であり、RおよびR11はともにCシクロアルキル(H、z=1)を形成する。OFGは、好ましくはC−2、C−3、C−4、またはC−5の1つに連結された第1炭素、例えば、環外メチレン基(n=1)またはエチレン基(n=2)に結合される[Hの−(CHOFG]。
OFGは、好ましくはC−2、C−3、C−4、またはC−5の1つに直接結合される(H中の−OFG)。−(CHOFGおよびOFGは、環上にジェミナル形態で配置可能であり、つまり両方の基は同じ炭素、例えばC−2、C−3、C−4、またはC−5のところで結合することができる。あるいは、−(CHOFGおよびOFGは、環上に近接形態で配置することができ、つまり両方の基は隣接する環炭素原子に結合することができ、例えば−(CHOFGはC−2に結合することができるとともにOFGはC−3に結合することができ、−(CHOFGはC−3に結合することができるとともにOFGはC−2に結合することができ、−(CHOFGはC−3に結合することができるとともにOFGはC−4に結合することができ、または−(CHOFGはC−4に結合することができるとともにOFGはC−3に結合することができ、−(CHOFGはC−4に結合することができるとともにOFGはC−5に結合することができ、または−(CHOFGはC−5に結合することができるとともにOFGはC−4に結合することができる。したがって、デカリンまたはインダンに基づくモノマーは結合(例えば、炭素−炭素結合)を含むことができ、結合回転はその特定の結合の周りに制約され、例えば、制約は環の存在から生じる。そのため、−(CHOFGおよびOFGは、上で述べた対のどれかで互いに関してシス型またはトランス型でもよい。したがって、すべてのシス/トランス異性体は明らかに含まれる。モノマーはさらに1つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現可能である。モノマーのそのようなすべての異性体は明らかに含まれる(例えば、CHOFGおよびOFGを伴う中心は、両方ともR配置を有するか、または両方ともS配置を有するか、または一方の中心がR配置を有し、他方の中心がS配置を有し、これは入れ換え可能である)。好ましい一実施形態では、C−1およびC−6の置換基は互いに関してトランス型である。繋留結合点は、好ましくはC−6またはC−7である。
他の担体は、3−ヒドロキシプロリンに基づくものを含むことができる(J)。そのため、−(CHOFGおよびOFGは、互いに関してシス型またはトランス型でもよい。したがって、すべてのシス/トランス異性体は明らかに含まれる。モノマーは、さらに1つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現可能である。
モノマーのそのようなすべての異性体は明らかに含まれる(例えば、CHOFGおよびOFGを伴う中心は、両方ともR配置を有するか、または両方ともS配置を有するか、または一方の中心がR配置を有し、他方の中心がS配置を有し、これは入れ換え可能である)。繋留結合点は、好ましくは窒素である。
代表的な環式糖置換に基づく担体は図4〜図7に示されている。
糖置換に基づくモノマー(非環式)
非環式糖置換に基づくモノマー、例えば糖置換に基づくリガンド複合モノマーは、本願では糖置換モノマーサブユニット(SRMS)モノマー化合物ともいう。好ましい非環式担体は、以下に示す式LCM−3またはLCM−4を有することができる。
いくつかの実施形態では、x、y、およびzはそれぞれ互いに独立して、0、1、2、または3でもよい。式LCM−3において、yおよびzが異なる場合、第三炭素はR配置またはS配置のいずれかでもよい。好ましい実施形態では、式LCM−3においてxは0であり、yおよびzはそれぞれ1であり(例えば、セリノールに基づく)、式LCM−3においてyおよびzはそれぞれ1である。以下の式LCM−3またはLCM−4はそれぞれ、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで任意に置換可能である。
テザー
いくつかの実施形態では、構成成分、例えばリガンドは、介在テザーの仲介を介して担体に間接的に連結することが可能である。テザーは、繋留結合点(TAP)のところで担体に連結され、C〜C100炭素含有構成成分(例えば、C〜C75、C〜C50、C〜C20、C〜C10、C、C、C、C、C、C、C、C、C、またはC10)、好ましくは少なくとも一つの窒素原子を有するものを含むことができる。好ましい実施形態では、窒素原子は、テザー上に末端アミノまたはアミド(NHC(O)−)基の一部を形成し、これは、リガンドの連結点として使用されることができる。好ましいテザー(「TAP」の後の部分)としては、TAP−(CH NH−、TAP−C(O)(CH NH−、TAP−NR’’’’(CH NH−、TAP−C(O)−(CH C(O)−、TAP−C(O)−(CH −C(O)O−、TAP−C(O)−O−、TAP−C(O)−(CH −NH−C(O)−、TAP−C(O)−(CH 、TAP−C(O)−NH−、TAP−C(O)−、TAP−(CH −C(O)−、TAP−(CH −C(O)O−、TAP−(CH 、またはTAP−(CH −NH−C(O)−があり、式中、nは、1〜20(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20)であり、R’’’’はC〜Cアルキルである。好ましくは、nは、5、6、または11である。他の実施形態では、窒素は末端オキシアミノ基、例えば−ONH、またはヒドラジノ基、−NHNHの一部を形成することが可能である。テザーは、例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで任意に置換可能であり、および/または1つまたは複数の追加ヘテロ原子、例えば、N、O、またはSを挿入可能である。好ましいテザー・リガンドとしては、例えばTAP−(CH NH(リガンド)、TAP−C(O)(CH NH(リガンド)、TAP−NR’’’’(CH NH(リガンド)、TAP−(CH ONH(リガンド)、TAP−C(O)(CH ONH(リガンド)、TAP−NR’’’’(CH ONH(リガンド)、TAP−(CH NHNH (リガンド)、TAP−C(O)(CH NHNH (リガンド)、TAP−NR’’’’(CH NHNH (リガンド)、TAP−C(O)−(CH −C(O)(リガンド)、TAP−C(O)−(CH −C(O)O(リガンド)、TAP−C(O)−O(リガンド)、TAP−C(O)−(CH −NH−C(O)(リガンド)、TAP−C(O)−(CH (リガンド)、TAP−C(O)−NH(リガンド)、TAP−C(O)(リガンド)、TAP−(CH −C(O)(リガンド)、TAP−(CH −C(O)O(リガンド)、TAP−(CH (リガンド)、またはTAP−(CH −NH−C(O)(リガンド)が考えられる。いくつかの実施形態では、アミノ末端テザー(例えば、NH、ONH、NHNH)は、リガンドとイミノ結合(つまり、C=N)を形成することができる。いくつかの実施形態では、アミノ末端テザー(例えば、NH、ONH、NHNH)は、例えばC(O)CFでアシル化可能である。
いくつかの実施形態では、テザーは、メルカプト基(つまり、SH)またはオレフィン(例えば、CH=CH)で終端可能である。例えば、テザーは、TAP−(CH −SH、TAP−C(O)(CH SH、TAP−(CH −(CH=CH 、またはTAP−C(O)(CH (CH=CH でもよく、式中、nは、別のところで説明されている通りでもよい。いくつかの実施形態では、オレフィンは、Diels−Alderジエンまたは求ジエン体でもよい。テザーは、例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで任意に置換可能であり、および/または1つまたは複数の追加ヘテロ原子、例えばN、O、またはSを挿入可能である。二重結合は、シス型もしくはトランス型またはEもしくはZでもよい。
他の実施形態では、テザーは、好ましくはテザーの末端位置にある、求電子性構成成分を含むことができる。好ましい求電子性構成成分は、例えばアルデヒド、ハロゲン化アルキル、メシレート、トシレート、ノシレート、またはブロシレート(brosylate)、または活性カルボン酸エステル、例えばNHSエステル、またはペンタフルオロフェニルエステルを含む。好ましいテザー(「TAP」の後の部分)としては、nを1〜6とし、R’’’’をC−CアルキルとしてTAP−(CH CHO、TAP−C(O)(CH CHO、またはTAP−NR’’’’(CH CHO、あるいは、nを1〜6とし、R’’’’をC〜CアルキルとしてTAP−(CH C(O)ONHS、TAP−C(O)(CH C(O)ONHS、またはTAP−NR’’’’(CH C(O)ONHS、あるいは、nを1〜11とし、R’’’’をC〜CアルキルとしてTAP−(CH C(O)OC 、TAP−C(O)(CH C(O)OC 、またはTAP−NR’’’’(CH C(O)OC 、あるいは、nを別のところで説明されている通りとし、R’’’’をC〜Cアルキルとして(LGは離脱基、例えばハロゲン化物、メシレート、トシレート、ノシレート、ブロシレートとすることができる)−(CHCHLG、TAP−C(O)(CHCHLG、またはTAP−NR’’’’(CHCHLGがある。繋留は、リガンドの求核基、例えばチオール、アミノ基をテザー上の電子吸引性基と結合することにより実行可能である。
他の実施形態では、そのリガンド複合モノマーまたはある1つのリガンド複合モノマーが、テザーの末端位置でフタルイミド基(K)を含むことが望ましい場合がある。
他の実施形態では、他の保護アミノ基を、テザーの末端位置、例えばalloc、モノメトキシトリチル(MMT)、トリフルオロアセチル、Fmoc、またはアリールスルホニルに置くことができる(例えば、アリール部分は、オルト−ニトロフェニルまたはオルト、パラ−ジニトロフェニルとすることができる)。
本願に記載されているテザーはどれも、さらに1つまたは複数の連結基、例えば−O−(CH−、−(CH−SS−、−(CH−、または−(CH=CH)−を含むことができる。
テザー・リガンド
さまざまな化学物質を、オリゴヌクレオチド剤に、例えばリガンド複合モノマーの担体に繋留することができる。実施例は、リガンド複合モノマーとの関連で以下に説明されているが、好ましい実施形態の1つにすぎない。化学物質は、オリゴヌクレオチド剤に他の位置で結合することができる。
オリゴヌクレオチド剤(例えば、miRNAを標的とするオリゴヌクレオチド剤)に繋留されたリガンドは、そのオリゴヌクレオチド剤に有利な効果をもたらすことができる。例えば、リガンドは、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞型に対するターゲッティング、または例えばエンドサイトーシス依存または独立の機序による細胞透過性を改善することができる。リガンドおよび関連する修飾は配列特異性を高めることもでき、その結果、部位外れターゲッティングを減少させることができる。
テザー・リガンドは、インターカレーターとして機能可能な1つまたは複数の修飾塩基または糖を含むことができる。これらは、好ましくはmiRNA/標的2本鎖のバルジ内などの内部領域に配置される。インターカレーターは、芳香族、例えば多環芳香族または複素環芳香族化合物でもよい。多環式インターカレーターはスタッキング能力を有しており、2、3、または4個の縮合環を持つ系を含むことができる。本願に記載されているユニバーサル塩基はリガンド上に組み込まれることができる。
一実施形態では、リガンドは、標的核酸の切断により標的遺伝子阻害に寄与する開裂基を含むことができる。開裂基は、例えばブレオマイシン(例えば、ブレオマイシン−A5、ブレオマイシン−A2、またはブレオマイシン−B2)、ピレン、フェナントロリン(例えば、O−フェナントロリン)、ポリアミン、トリペプチド(例えば、lys−tyr−lysトリペプチド)、または金属イオンキレート基でもよい。金属イオンキレート基は、例えばLu(III)またはEU(III)大環状錯体、Zn(II)2,9−ジメチルフェナントロリン誘導体、Cu(II)テルピリジン、またはアクリジンを含むことができ、Lu(III)などの遊離金属イオンによりバルジの部位にある標的RNAの選択的切断を促進することができる。いくつかの実施形態では、標的RNAの切断を例えばバルジ領域のところで促進するために、ペプチド・リガンドをmiRNAに繋留することができる。例えば、1,8−ジメチル−1,3,6,8,10,13−ヘキサアザシクロテトラデカン(シクラム)を(例えばアミノ酸誘導体により)ペプチドに複合し、標的RNA切断を促進することができる。
テザー・リガンドはアミノグリコシド・リガンドでもよく、これによりオリゴヌクレオチド剤は、ハイブリダイゼーション特性を改善するか、または配列特異性を改善することが可能になる。例示的なアミノグリコシドは、グリコシル化ポリリシン、ガラクトシル化ポリリシン、ネオマイシンB、トブラマイシン、カナマイシンA、およびNeo−N−アクリジン、Neo−S−アクリジン、Neo−C−アクリジン、Tobra−N−アクリジン、およびKanaA−N−アクリジンなどのアミノグリコシドのアクリジン複合体を含む。アクリジン類似体を使用することで配列特異性を高めることができる。例えば、ネオマイシンBはDNAと比較するとRNAに対し高い親和性を有するが、配列特異性は低い。アクリジン類似体であるneo−S−アクリジンは、HIV Rev応答エレメント(RRE)に高い親和性を有する。いくつかの実施形態では、アミノグリコシド・リガンドのグアニジン類似体(グアニジノグリコシド(guanidinoglycoside))はオリゴヌクレオチド剤に繋留される。グアニジノグリコシドでは、アミノ酸のアミン基がグアニジン基に交換されている。グアニジン類似体の結合で、オリゴヌクレオチド剤、例えばmiRNAまたはプレmiRNAを標的とするオリゴヌクレオチド剤の細胞透過性が高まる可能性がある。
テザー・リガンドは、ポリアルギニンペプチド、ペプトイド、またはペプチド模倣薬でもよく、これはオリゴヌクレオチド剤の細胞取り込み能力を高めることができる。
好ましい構成成分は、好ましくは共有結合的に、直接的または介在テザーを介して間接的にリガンド複合担体に結合されるリガンドである。好ましいいくつかの実施形態では、リガンドは、介在テザーを介して担体に結合される。上述のように、リガンドまたはテザー・リガンドは、モノマーが成長する鎖内に組み込まれる場合にモノマー上に存在することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、「前駆体」であるリガンド複合モノマーが成長する鎖に組み込まれた後に「前駆体」であるリガンド複合モノマーサブユニット内に組み込まれることができる。例えばアミノ末端テザー、例えばTAP−(CHNHを有するモノマーは、成長するオリゴヌクレオチド鎖内に組み込まれることができる。その後の動作において、つまり前駆体モノマーを鎖に組み込んだ後、電子吸引性基、例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドは、リガンドの電子吸引性基を前駆体モノマーサブユニット・テザーの末端求核基と結合することにより前駆体モノマーサブユニットに結合することができる。
好ましい実施形態では、リガンドは、リガンドが組み込まれるオリゴヌクレオチド剤の分布、ターゲッティング、または寿命を変える。好ましいいくつかの実施形態では、リガンドは、リガンドなどの種の存在がない場合と比べて、選択された標的、例えば分子、細胞または細胞型、コンパートメント、例えば細胞内または器官内コンパートメント、組織、器官または身体の領域に対する親和性を高める。
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を改善し、さらに、その結果得られる天然または修飾オリゴヌクレオチド、または本願に記載されているモノマーの任意の組合せおよび/または天然もしくは修飾リボヌクレオチドを含む高分子のヌクレアーゼ耐性を改善することも可能である。
リガンドは一般に、例えば摂取を高めるための治療用修飾剤、例えば分布を監視するための診断用化合物またはレポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ耐性付与構成成分、および天然または異常核酸塩基を含むことができる。一般的な例として、親油性物、脂質、ステロイド(例えば、ウバオール、ヘコゲニン、ジオスゲニン)、テルペン(例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸(epifriedelanol derivatized lithocholic acid)、ビタミン(例えば、葉酸、ビタミンA、ビオチン、ピリドキサール)、炭水化物類、タンパク質、タンパク結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン剤、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣薬がある。
リガンドは、天然に存在する物質(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、低比重リポタンパク質(LDL)、またはグロブリン)、炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸)、アミノ酸、または脂質を含むことができる。リガンドはさらに、合成高分子、例えば、合成ポリアミノ酸などの組換えまたは合成分子でもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン(PLL)、ポリL−アスパラギン酸、ポリL−グルタミン酸、スチレン無水マレイン酸共ポリマー、ポリ(L−ラクチド−co−グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸共ポリマー、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド共ポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2−エチルアクリル酸)、N−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンがある。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチドポリアミン、ペプチド模倣(peptidomimetic)ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第4級塩、またはアルファヘリックスペプチドがある。
リガンドはさらに、標的基、例えば細胞もしくは組織標的薬剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば腎細胞などの指定された細胞型に結合する抗体も含むことができる。標的基には、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタント・タンパク質A、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンB12、ビオチン、またはRGDペプチドもしくはRGDペプチド模倣薬がある。
リガンドの他の例としては、染料、挿入剤(例えば、アクリジンおよび置換アクリジン)、架橋剤(例えばプソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サップフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン)、lys−tyr−lysトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジウム・アミノグリコシド、人工エンドヌクレアーゼ(例えばEDTA)、親油性分子、例えばコレステロール(およびそのチオ類似体)、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール(例えばエステル(例えばモノ、ビス、またはトリス脂肪酸エステル、例えばC10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸)およびそのエーテル、例えばC10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20アルキル、例えば1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、1,3−ビス−O(オクタデシル)グリセロール)、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸(例えばステアリン酸グリセリル)、オレイン酸、ミリスチン酸、O−(オレオイル)リトコール酸、O−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン)およびペプチド複合体(例えばアンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化薬、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG(例えばPEG−40K)、MPEG、[MPEG]、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えばアスピリン、ナプロキセン、ビタミンE、葉酸)、合成リボ核酸(例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール・クラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状分子のEu3+錯体)、ジニトロフェニル、HRP、またはAPがある。
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク、またはペプチド、例えばコリガンド、または抗体に対し特異親和性を有する分子、例えば癌細胞、内皮細胞、または骨細胞などの指定された細胞型に結合する抗体でもよい。リガンドはさらに、ホルモンおよびホルモン受容体も含むことができる。これらはさらに、脂質、レクチン、炭水化物類、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド種も含むことができる。リガンドは、例えばリポ多糖類、p38 MAPキナーゼの活性化剤、またはNF−κBの活性化剤でもよい。
リガンドは、例えば細胞骨格をバラバラにする、例えば細胞の微小管、微小繊維、および/または中間径繊維をバラバラにすることによりオリゴヌクレオチド剤を細胞内に取り込む能力を高めることができる物質、例えば薬物でもよい。この薬物は、例えばタキソン(taxon)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド(japlakinolide)、ラトランクリンA、ファロイジン、スウィンホライドA、インダノシン、またはミオセルビン(myoservin)でもよい。
リガンドは、例えば炎症反応を活性化することにより、オリゴヌクレオチド剤を細胞内に取り込む能力を高めることが可能である。このような効果を有する例示的なリガンドは、腫瘍壊死因子アルファ(TNFアルファ)、インターロイキン−1ベータ、またはガンマ・インターフェロンを含む。
一態様では、リガンドは脂質または脂質に基づく分子である。このような脂質または脂質に基づく分子は、好ましくは血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン(HSA)に結合する。HSA結合リガンドでは、複合体を標的組織、例えば身体の非腎標的組織に分配することができる。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞も含めて肝臓でもよい。HSAを結合可能な他の分子は、リガンドとしても使用可能である。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンが使用可能である。脂質または脂質に基づくリガンドは、(a)複合体の分解に対する耐性を高め、(b)標的細胞または細胞膜内へのターゲッティングまたは輸送の能力を高めることができ、および/または(c)血清タンパク質、例えばHSAへの結合を調整するために使用可能である。
脂質に基づくリガンドは、標的組織への複合体の結合を調節、例えば制御するために使用可能である。例えば、HSAにより強く結合する脂質または脂質に基づくリガンドは、腎臓を標的とする可能性が小さく、したがって、身体から取り除かれる可能性が低い。HSAに結合する力が比較的弱い脂質または脂質に基づくリガンドは、複合体の標的を腎臓にするために使用可能である。
好ましい一実施形態では、脂質に基づくリガンドはHSAを結合する。脂質に基づくリガンドは、複合体が好ましくは非腎組織に分配される十分な親和性によりHSAを結合することができる。しかし、親和性は、HSAリガンド結合を逆にできないほど強いものでないことが好ましい。
他の好ましい実施形態では、脂質に基づくリガンドは、HSAを結合する程度は弱いか、または全く結合せず、複合体は、好ましくは腎臓に分配されている。腎細胞を標的とする他の構成成分も、脂質に基づくリガンドの代わりに、またはそれに加えて使用可能である。他の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞により取り込まれる構成成分、例えばビタミンである。これらは、例えば悪性または悪性でないタイプの、例えば癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するために特に使用される。例示的なビタミンとしては、ビタミンA、E、およびKがある。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンB、例えば葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞により取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素がある。また、HSAおよび低比重リポタンパク質(LDL)も含まれる。
他の態様では、リガンドは、細胞浸透剤、好ましくはヘリックス細胞浸透剤(helical cell−permeation agent)である。好ましくは、この薬剤は両親媒性である。薬剤はtatまたはアンテナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドである場合、修飾が可能であり、この修飾はペプチジル模倣薬、インバートマー(invertomers)、非ペプチドまたは擬ペプチド結合、およびD−アミノ酸の使用を含む。ヘリックス薬剤(helical agent)は、好ましくはアルファヘリックス薬剤であり、これは、好ましくは親油性相および疎油性相を有する。
増殖細胞中に豊富に存在するマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ペプチドおよびペプチド模倣薬を含むRGDは、癌細胞、特にαβインテグリンを示す細胞を標的とすることができる。そのため、RGDペプチド、RGDを含む環状ペプチド、D−アミノ酸を含むRGDペプチド、さらには合成RGD模倣薬をも使用することが可能であろう。RGDに加えて、αβインテグリン・リガンドを標的とする他の構成成分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管形成を制御するために使用可能である。この種類の好ましい複合体は、PECAM−1、VEGF、または他の癌遺伝子、例えば本願に記載されている癌遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド剤を含む。
本発明のオリゴヌクレオチド剤は、特に肝臓を標的とした場合に有用である。例えば、本発明で特徴とされる1本鎖オリゴヌクレオチド剤は、肝臓内に豊富に存在するmiRNAを標的とし、オリゴヌクレオチド剤は、肝臓への送達を高めるためのリガンドを含むことができる。オリゴヌクレオチド剤は、肝臓標的とするリガンドにより誘導体化されたモノマーを組み込むことにより肝臓を標的とするようにできる。例えば、肝臓標的薬剤は親油性部分でもよい。好ましい親油性部分は、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、またはコレステリル残基を含む。肝臓標的薬剤として機能することができる他の親油性部分は、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O−(オレオイル)リトコール酸、O−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンを含む。
オリゴヌクレオチド剤はさらに、ラクトシル化LDLなどの低比重リポタンパク質(LDL)との関連により肝臓を標的とするようにすることもできる。糖残基と錯化された高分子担体は、オリゴヌクレオチド剤の標的を肝臓にするように機能することもできる。
糖、例えばガラクトースおよび/またはその類似体を組み込んだ標的薬剤は、特に有用である。これらの薬剤は、特に肝臓の実質細胞を標的とする(表2を参照)。例えば、ターゲッティング部分は、互いから約15オングストローム離して並んでいる複数のまたは好ましくは2つもしくは3つのガラクトース構成成分を含むことができる。ターゲッティング部分は、それとは別に乳糖(例えば、3つの乳糖構成成分)でもよく、これは、ガラクトースに結合されたブドウ糖である。ターゲッティング部分はさらに、N−アセチル−ガラクトサミン、N−Ac−グルコサミンでもよい。マンノースまたはマンノース−6−ホスフェート・ターゲッティング部分は、マクロファージ・ターゲッティングに使用可能である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣薬でもよい。ペプチド模倣薬(本願ではオリゴペプチド模倣薬ともいう)は、天然ペプチドに類似の定義された3次元構造内に折り畳まれることができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬がオリゴヌクレオチド剤に結合すると、細胞認識および吸収を高めることなどによりiRNAの薬物動態的分布に影響を及ぼす可能性がある。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、約5〜50アミノ酸長、例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸長とすることができる(例えば、表2を参照)。
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド(例えば、主にTyr、Trp、またはPheからなる)でもよい。ペプチド構成成分は、デンドリマーペプチド、制約ペプチド、または架橋ペプチドでもよい。他の実施形態では、ペプチド構成成分は、疎水性膜輸送配列(MTS)を含むことができる。例示的な疎水性MTS含有ペプチドは、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAP(配列番号16)を有するRFGFである。疎水性MTSを含むRFGF類似体(例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP(配列番号17))もまた、ターゲッティング部分でもよい。ペプチド構成成分は、細胞膜間でペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を運ぶ「送達」ペプチドでもよい。例えば、HIV Tatタンパク質(GRKKRRQRRRPPQ(配列番号18))およびショウジョウバエ・アンテナペディア・タンパク質(RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号19))は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが判明している。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ提示ライブラリー、または1ビーズ1化合物(one−bead−one−compound)(OBOC)コンビナトリアルライブラリーから識別されたペプチドなどの、DNAのランダムな配列によりコードされることが可能である(ラムら(Lam et al)、Nature,354:82〜84頁、1991年)。好ましくは、組み込まれているモノマーユニットを介してオリゴヌクレオチド剤に繋留されているペプチドまたはペプチド模倣薬は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)−ペプチド、またはRGD模倣薬などの細胞標的ペプチドである。ペプチド構成成分の長さは、アミノ酸約5個からアミノ酸約40個にわたる。ペプチド構成成分は、安定性または直接配座特性を高めるなどの構造修飾を有することができる。後述の構造修飾はどれも使用可能である。
RGDペプチド構成成分は、内皮系腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用可能である(ツィツマンら(Zitzmann et al)、Cancer Res.、62:5139〜43頁、2002年)。RGDペプチドは、オリゴヌクレオチド剤(例えば、miRNAまたはプレmiRNAを標的とするオリゴヌクレオチド剤)が、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含むさまざまな他の組織の腫瘍を容易に標的にできるようにすることができる(アオキら(Aoki et al)、Cancer Gene Therapy 8:783〜787頁、2001年)。好ましくは、RGDペプチドは、オリゴヌクレオチド剤が腎臓を容易に標的にできるようにする。RGDペプチドは、直線状または環状でもよく、または修飾、例えばグリコシル化またはメチル化して特定の組織を標的にし易くすることができる。例えば、グリコシル化RGDペプチドは、オリゴヌクレオチド剤を、αβを発現する腫瘍細胞に送達することができる(ハウブナーら(Haubner et al)、Jour.Nucl Med.,42:326〜336頁、2001年)。
増殖細胞中に豊富に存在するマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ペプチドおよびペプチド模倣薬を含むRGDは、癌細胞、特にαβインテグリンを示す細胞を標的とすることができる。そのため、RGDペプチド、RGDを含む環状ペプチド、D−アミノ酸を含むRGDペプチド、さらには合成RGD模倣薬をも使用することが可能であろう。RGDに加えて、αβインテグリンリガンドを標的とする他の構成成分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管形成を制御するために使用可能である。この種類の好ましい複合体は、PECAM−1、VEGF、または他の癌遺伝子、例えば本願に記載されている癌遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド剤を含む。
「細胞浸透ペプチド」は細胞、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞を浸透することができる。微生物細胞浸透ペプチドは、例えばαヘリックス直鎖ペプチド(例えばLL−37またはセロピンP1)、ジスルフィド結合含有ペプチド(例えばα−デフェンシン、β−デフェンシン、またはバクテネシン)、または1つまたは2つの支配的アミノ酸のみを含むペプチド(例えばPR−39またはインドリシジン)でもよい。細胞浸透ペプチドは、さらに核内保留シグナル(NLS)を含むことができる。例えば、細胞浸透ペプチドは、HIV−1 gp41の融合ペプチド・ドメインおよびSV40大T抗原に由来する、MPGなどの2分両親媒性ペプチドでもよい(シメオニら(Simeoni et al)、Nucl.Acids Res.31:2717〜2724頁、2003年)。
一実施形態では、リガンド複合モノマーに繋留される標的ペプチドは、両親媒性αヘリックスペプチドでもよい。例示的な両親媒性αヘリックスペプチドは、限定はしないがセクロピン、リコトキシン(lycotoxins)、パラダキシン(paradaxins)、ブフォリン(buforin)、CPF、ボンビニン類似ペプチド(BLP)、カテリシジン、セラトトキシン(ceratotoxins)、サッカメーバ(S.Clava)ペプチド、ヌタウナギ腸内抗微生物ペプチド(hagfish intestinal antimicrobial peptides)(HFIAP)、マゲイニン、ブレビニン−2(brevinins−2)、デルマセプチン、メリチン、プルロシジン(pleurocidin)、HAペプチド、ゼノパスペプチド、エスクレンチニス−1(esculentinis−1)、およびセリン(caerins)を含む。多数の因子がヘリックス安定性の完全性を保持すると考えることが好ましい。例えば、最大数のヘリックス安定化残基を利用し(例えば、leu、ala、またはlys)、最小数のヘリックス不安定化残基を利用する(例えば、プロリン、または環状モノマー単位)。キャッピング残基(capping residue)が考えられ(例えば、Glyは、例示的なN−キャッピング残基)、および/またはC末端アミド化を使用し、余分のH結合を与えてヘリックスを安定化することができる。i±3またはi±4位置で分離される、反対の電荷を持つ基同士の塩橋の形成は、安定性をもたらすことができる。例えば、リシン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、またはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性残基、グルタミン酸塩またはアスパラギン酸塩と塩橋を形成することができる。
ペプチドおよびペプチド模倣薬リガンドは、天然に存在する、または修飾されたペプチド、例えばDまたはLペプチド、α、β、またはγペプチド、N−メチルペプチド、アザペプチド、1つまたは複数のアミドを有するペプチド、つまり結合が1つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で置き換えられたペプチド、または環状ペプチドを有するものを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、カチオン性および/または疎水性構成部分を有することができる。
いくつかの実施形態では、リガンドは、本願に記載されている核酸塩基のどれかでもよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは、置換アミン、例えばジメチルアミノでもよい。いくつかの実施形態では、置換アミンは、例えばプロトン化またはアルキル化により四級化し、カチオン性になってもよい。いくつかの実施形態では、置換アミンは、比較的疎水性のテザー、例えばアルキレンの末端位置でもよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは、以下のトリテルペンのうちの1つでもよい。
いくつかの実施形態では、リガンドは、置換もしくは非置換コレステロール、またはその立体異性体、または以下のステロイドのうちの1つでもよい。
いくつかの実施形態では、テザー・リガンドは、対応する非テザーまたは非結合リガンドよりも多い1つまたは複数の原子を含むことができる(例えば、ヘテロ原子に基づく官能基またはヘテロ原子に基づく官能基全体の1つまたは複数のプロトンを、リガンドを担体またはテザーに結合している間に非結合リガンドから追い出すことができる)。例えば、コレステロールの全3−ヒドロキシ基のプロトンを、テザー(例えば、Chol−3−OH(非結合)およびChol−3−O−テザー(結合))で置き換えることができるか、またはコレステロールの全3−ヒドロキシ基を、硫黄原子(例えば、Chol−3−OH(非結合)およびChol−3−S−テザー(結合、例えば、チオコレステロール))で置き換えることができる。
オリゴヌクレオチド剤を作製する方法
本願に記載されている異常塩基を含むリボヌクレオシドのリストは、ユタ大学(University of Utah)[84112米国ユタ州ソルトレークシティー(Salt Lake City)所在]のDepartments of Medicinal Chemistry and Biochemistryのパメラ エフ.クレイン(Pamela F.Crain)、ジェフ・ロゼンスキ(Jef Rozenski)、およびジェームス エー.マックロスキー(James A.McCloskey)により保持されている「The RNA Modification Database」で説明されている。
5’シリル保護基を、リボヌクレオシドの2’位置にある酸に不安定なオルトエステルとともに使用し、ホスホラミダイト化学作用を介してオリゴヌクレオチドを合成することができる。最終的な脱保護条件は、RNA生成物を著しく劣化させないということが知られている。異常およびユニバーサル塩基上の官能基は、本願に記載されている、実行中の操作と比較できる保護基とのオリゴヌクレオチド合成中にブロックされる。すべての合成は、自動的な、または手動による合成装置において、大規模、中規模、または小規模に実施可能である。さらに、合成を複数のウェルプレートまたはスライド・ガラスで行うことも可能である。
5’−O−シリル基を、フッ化物イオン源、例えば、無機対イオンと対合するフッ化物イオンを含む塩、例えばフッ化セシウムおよびフッ化カリウム、または有機対イオンと対合するフッ化物イオンを含む塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムを含むことができる、フッ化物イオンに曝すことにより除去することができる。脱保護反応において、クラウン・エーテル触媒を無機フッ化物と組み合わせて使用することができる。好ましいフッ化物イオン源は、フッ化テトラエチルアンモニウムまたはアミンヒドロフルオリドである(例えば水性HFを双極性非プロトン性溶媒、例えばジメチルホルムアミド中のトリエチルアミンと組み合わされる)。
ホスファイトトリエステルおよびホスホトリエステル上で使用する保護基の選択により、フッ化物に向けてトリエステルの安定性を変えることができる。ホスホトリエステルまたはホスファイトトリエステルのメチル保護はフッ化物イオンに対する結合を安定化し、収率を改善することができる。
リボヌクレオシドは反応2’−ヒドロキシル置換基を有することから、RNA内の反応2’位置を5’−O−シリル保護基に適合すること、例えばフッ化物に対し安定している保護基で保護することが望ましい場合がある。オルトエステルはこの基準を満たすものであり、RNA分解を最小限に抑えることができる最終的な酸脱保護工程において容易に取り除かれることができる。
テトラゾール触媒を標準ホスホラミダイト結合反応で使用することができる。好ましい触媒は、例えばテトラゾール、S−エチル−テトラゾール、p−ニトロフェニルテトラゾールを含む。
一般的工程は次の通りである。ヌクレオシドを、RNAオリゴヌクレオチドの液相または固相合成で使用できるように適宜保護して官能化する。リボヌクレオチド内の2’−ヒドロキシル基を、トリスオルトエステル試薬を使用して修飾することができる。2’−ヒドロキシルを修飾して2’−O−オルトエステルヌクレオシドを生成するために、酸性触媒、例えばピリジニウムp−トルエンスルホネートの存在下で、リボヌクレオシドをトリスオルトエステル試薬と反応させる。この反応は当業者に知られている。次いで、この生成物に、さらなる保護基反応(例えば、5’−シリル化)および官能化(例えば、3’−O−ホスフィチル化)を作用させて所望の試薬(例えばヌクレオシドホスホラミダイト)を生成し、当業者に知られている反応により、オリゴヌクレオチドまたは高分子内に組み込むことができる。
好ましいオルトエステルとしては、アシルまたはエステル保護基で保護されているエチレングリコールリガンドを含むものがある。特に、好ましいアシル基はアセチルである。次いで、当業者であれば、ヌクレオシド試薬を使用して、市販の合成装置計装、例えばGene Assembler Plus (ファーマシア社(Pharmacia))、380B (アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems))上でRNAオリゴヌクレオチドを合成することができる。オリゴヌクレオチドまたは高分子の合成(液相または固相のいずれか)に続いて、非酸性試薬を使用し、生成物に1つまたは複数の反応を作用させることができる。これらの反応のうちの1つは、強塩基性条件とする、例えば55℃で10分間、40%のメチルアミンを使用するという条件でもよく、これにより、エチレングリコールリガンドからアシル保護基を取り除くが、オルトエステル構成成分は結合されたままである。その結果得られるオルトエステルは、高分子またはオリゴヌクレオチドが後の用途で使用される場合に結合されたままでもよいし、または最終的な弱酸性反応、例えば55℃で10分間、50mMの酢酸(pH 3.0)中に入れ、次いで、55℃で10分間、等量の150mMのTRIS緩衝液を加えることで取り除くことができる。
ユニバーサル塩基は、本願明細書に援用する「Survey and Summary:The Applications of Universal DNA base analogues」、ロークス、ディー.(Loakes,D.)、Nucleic Acid Research 2001年,29、2437で説明されている。具体的な実施例は、リュー、ディー.(Liu,D.)、モラン、エス.(Moran,S.)、クール、イー.ティー.(Kool,E.T.)、Chem.Biol.、1997年、4、919〜926頁、モラレス、ジェイ.シー.(Morales,J.C)、クール、イー.ティー.(Kool,E.T.)Biochemistry、2000年,39,2626〜2632頁、マトライ、ティー.ジェイ.(Matray,T,J.)、クール、イー.ティー.(Kool,E.T.)、J.Am.Chem.Soc,1998年、120,6191〜6192頁、モラン、エス.(Moran,S.)、レン、アール.エックス.−エフ.(Ren,R.X.−F.)、ラムネイIV,エス.(Rumney IV,S.)、クール、イー.ティー.(Kool,E.T.)、J.Am.Chem.Soc,1997年、119,2056〜2057頁、グッキアン、ケイ.エム.(Guckian,K.M.)、モラレス、ジェイ.シー.(Morales,J.C)、クール、イー.ティー.(Kool,E.T.)、J.Org.Chem.,1998年、63,9652〜9656頁、バーガー、エム.(Berger,M.)、ウー、ワイ.(Wu.Y.)、オガワ、エー.ケイ.(Ogawa,A.K.)、マクミン、ディー.エル.(McMinn,D.L.)、シュルツ、ピー.ジー.(Schultz,P.G.)、ロメスバーグ、エフ.イー.(Romesberg,F.E.)、Nucleic Acids Res.,2000年,28,2911〜2914頁、オガワ、エー.ケイ.(Ogawa,A.K.)、ウー、ワイ.(Wu,Y.)、マクミン、ディー.エル.(McMinn,D.L.)、リュー、ジェイ.(Liu,J.)、シュルツ、ピー.ジー.(Schultz,P.G.)、ロメスバーグ、エフ.イー.(Romesberg,F.E.)、J.Am.Chem.Soc,2000年,122,3274〜3287頁、オガワ、エー.ケイ.(Ogawa,A.K.)、ウー、ワイ.(Wu.Y.)、バーガー、エム.(Berger,M.)、シュルツ、ピー.ジー.(P.G.)、ロメスバーグ、エフ.イー.(Romesberg,F.E.)、J.Am.Chem.Soc,2000年,122,8803〜8804頁、タエ、イー.エル.(Tae,E.L.)、ウー、ワイ.(Wu,Y.)、シァ、ジー.(Xia,G.)、シュルツ、ピー.ジー.(Schultz,P.G.)、ロメスバーグ、エフ.イー.(Romesberg,F.E.)、J.Am.Chem.Soc,2001年,123,7439〜7440頁、ウー、ワイ.(Wu,Y.)、オガワ、エー.ケイ.(Ogawa,A.K.)、バーガー、エム.(Berger,M.)、マクミン、ディー.エル.(McMinn,D.L.)、シュルツ、ピー.ジー.(Schultz,P.G.)、ロメスバーグ、エフ.イー.(Romesberg,F.E.)、J.Am.Chem.Soc,2000年,122,7621〜7632頁、マクミン、ディー.エル.(McMinn,D.L.)、オガワ、エー.ケイ.(Ogawa.A.K.)、ウー、ワイ.(Wu,Y.)、リュー、ジェイ.(Liu,J.)、シュルツ、ピー.ジー.(Schultz,P.G.)、ロメスバーグ、エフ.イー.(Romesberg,F.E.)、J.Am.Chem.Soc,1999年,121,11585〜11586頁、ブロツキ、シー.(Brotschi,C)、ハーバーリ、エー.(Haberli,A.)、ロイマン、シー.ジェイ.(Leumann,C.J.)、Angew.Chem.Int.Ed.,2001年,40,3012〜3014頁、ワイズマン、エイチ.(Weizman,H.)、トル、ワイ.(Tor,Y.)、J.Am.Chem.Soc,2001年,123,3375〜3376頁、ラン、ティー.(Lan,T.)、マクローリン、エル.ダブリュー.(McLaughlin,L.W.)、J.Am.Chem.Soc,2000年,122,6512〜13頁で説明されている。
上述のように、本願に記載されているモノマーおよび方法は、修飾RNA分子、または本願に記載されているモノマー化合物の任意の組合せを含む高分子および/または1つまたは複数のサブユニットが、異常またはユニバーサル塩基を含む天然もしくは修飾リボヌクレオチドの調製で使用可能である。修飾RNA分子として、例えば化学または立体化学修飾ヌクレオシド(例えば1つまたは複数の骨格修飾、例えばホスホロチオエートまたはP−アルキルを有するもの、1つまたは複数の糖修飾、例えば2’−OCHまたは2’−Fを有するもの、および/または1つまたは複数の塩基修飾、例えば5−アルキルアミノまたは5−アリルアミノを有するもの)またはヌクレオシド代用薬を含む分子がある。
5’−ヒドロキシル基とホスホラミダイトとのカップリングによりホスファイトエステル中間体が形成され、次いで、これは、例えばヨウ素により酸化されてホスフェートジエステルになる。それとは別に、ホスファイトを、例えば硫黄、セレン、アミノ、およびホウ素試薬により処理し、修飾ホスフェート骨格を形成することができる。本願に記載されているモノマーとヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド鎖との結合も、ヨウ素、硫黄、セレン、アミノ、およびホウ素試薬で処理し、非修飾および修飾ホスフェート骨格をそれぞれ形成することができる。同様に、本願に記載されているモノマーは、本願に記載されている修飾またはヌクレオシド代用薬を含むヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドと結合することができる。
オリゴヌクレオチドペプチド複合体の合成および精製を、定められた方法により行うことができる。例えば、トリュフェルトら(Trufert et al)、Tetrahedron,52:3005,1996年、およびマノハラン(Manoharan)「Oligonucleotide Conjugates in Antisense Technology」、in Antisense Drug Technology,ed.S.T.Crooke,Marcel Dekker,Inc.,2001年を参照のこと。例示的な方法は図8および図9に示されている。
本発明の一実施形態では、ペプチド模倣薬を修飾し、ペプチドの効力と選択性とを高めることができる、異なる特定の優先配座を採用する制約ペプチドを作製することができる。例えば、制約ペプチドはアザペプチドでもよい(ガント(Gante)、Synthesis,1989年,405〜413頁)。アザペプチドは、アミノ酸側鎖の構造を変えることなく、アミノ酸のα炭素を窒素原子で置き換えることにより合成される。例えば、アザペプチドは、ヒドラジンを「カルボニル供与体」、例えばフェニルクロロホルメートと反応させることなどにより、従来のペプチド合成カップリング法においてヒドラジンを使用することにより合成可能である。一般的なアザペプチド合成が図10に示されている。
本発明の一実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣薬(例えば、リガンド複合モノマーに繋留されたペプチドまたはペプチド模倣薬)は、N−メチルペプチドでもよい。N−メチルペプチドはN−メチルアミノ酸からなり、これはペプチド骨格内に付加メチル基を与え、それにより、タンパク分解的切断に抵抗する付加的手段を実現することが可能である。N−メチルペプチドは、当業で知られている方法により合成可能である(例えば、リンドグレンら(Lindgren et al)、Trends Pharmacol.Sci.21:99頁、2000年、Cell Penetrating Peptides:Processes and Applications,Langel,ed.,CRC Press,Boca Raton,FL,2002年、フィッシュら(Fische et al.),、Bioconjugate.Chem.12:825頁,2001年、ワンダーら(Wander et al)、J.Am.Chem.Soc,124:13382頁、2002年を参照)。例えば、AntまたはTatペプチドはN−メチルペプチドでもよい。例示的合成は図11に示されている。
本発明の一実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣薬(例えば、リガンド複合モノマーに繋留されたペプチドまたはペプチド模倣薬)は、βペプチドでもよい。βペプチドは、ヘリックス、プリーツ・シート、ターン、およびヘアピンなどの安定した2次構造を溶液中に形成する。これらの環状誘導体は、固体状態でナノチューブに折り畳まれることができる。βペプチドは、タンパク質分解酵素による分解に対する耐性を有する。βペプチドは、当業で知られている方法により合成可能である。例えば、AntまたはTatペプチドはβペプチドでもよい。例示的合成は図12に示されている。
本発明の一実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣薬(例えば、リガンド複合モノマーに繋留されたペプチドまたはペプチド模倣薬)は、オリゴカルバメートでもよい。オリゴカルバメートペプチドは、カルバメートトランスポータにより促進される輸送経路により細胞内に内部化される。例えば、AntまたはTatペプチドはオリゴカルバメートでもよい。例示的合成は図13に示されている。
本発明の一実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣薬(例えば、リガンド複合モノマーに繋留されたペプチドまたはペプチド模倣薬)は、オリゴ尿素複合体(またはオリゴチオ尿素複合体)でもよく、この場合、ペプチド模倣薬のアミド結合は尿素構成成分で置き換えられる。アミド結合の置換により、タンパク質分解酵素、例えば消化管内のタンパク質分解酵素による分解に対する耐性が高まる。一実施形態では、オリゴ尿素複合体をオリゴヌクレオチド剤に繋留し、経口送達に使用できるようにする。オリゴ尿素ペプチド模倣薬のそれぞれの反復単位内の骨格は、天然アミノ酸と比べて炭素原子1つ分伸ばすことができる。1回の炭素元素伸張で、例えばペプチドの安定性および親油性を高めることができる。したがって、オリゴ尿素ペプチドは、オリゴヌクレオチド剤が細菌細胞壁を通過するように導かれた場合、または神経障害の治療などのためにオリゴヌクレオチド剤が血液脳関門を横断しなければならない場合に有利である。一実施形態では、受容体との高い親和性を生み出すなどのために、水素結合ユニットはオリゴ尿素ペプチドと複合体を形成する。例えば、AntまたはTatペプチドは、オリゴ尿素複合体(またはオリゴチオ尿素複合体)でもよい。例示的合成は図14に示されている。
本発明のsiRNAペプチド複合体は、オリゴヌクレオチド剤上のさまざまな位置に出現するリガンド複合モノマーに関連付けられ、例えば繋留可能である。例えば、ペプチドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかで末端的に複合することができるか、またはペプチドはビス複合することができる(1つのペプチドがそれぞれの末端に繋留され、1つのペプチドがセンス鎖に複合され、1つのペプチドがアンチセンス鎖に複合される)。他の選択では、ペプチドは、短ヘアピンのオリゴヌクレオチド剤のループ内などで内部的に複合可能である。さらに他の選択では、ペプチドは、ペプチド担体複合体などの複合体に関連付けることができる。
ペプチド担体複合体は、1つまたは複数のオリゴヌクレオチド剤(生体系および/または細胞への送達などのための)を封入できる、少なくとも1つの担体分子、および担体複合体の標的を特定の組織または細胞型にするなどのために担体分子の外側に繋留されるペプチド構成成分からなる。担体複合体は、複合体、または融合誘導因子の外側に付加標的分子を付けて、細胞送達を補助することができる。担体内に封入された1つまたは複数のオリゴヌクレオチド剤は、担体の内側に薬剤を送達するのを補助することができる親油性分子と複合体を形成することが可能である。
担体分子または構造は、例えばミセル、リポソーム(例えば、カチオン性脂質)、ナノ粒子、ミクロスフェア、または生分解性高分子でもよい。ペプチド構成成分は、ジスルフィド結合、酸に不安定な結合、ペプチドに基づく結合、オキシアミノ結合、またはヒドラジン結合などのさまざまな結合により担体分子に繋留することが可能である。例えば、ペプチドに基づく結合はGFLGペプチドでもよい。いくつかの結合には特別な利点があり、それらの利点(または欠点)は、組織標的または意図された用途に応じて考察可能である。例えば、ペプチドに基づく結合は血流内で安定しているが、リソソーム内の酵素的切断には弱い。好ましい担体の概略が図15に示されている。
保護モノマー化合物は、カラムクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、または再結晶化などの方法により反応混合物から分離され、さらに精製されることができる。当業者であれば理解できるように、本願の式の化合物を合成する他の方法は、当業者にとっては明らかなことである。それに加えて、他の順序、または所望の化合物をもたらすために、さまざまな合成工程を実行することができる。本願に記載されている化合物を合成する際に使用可能な他の合成化学変換、保護基(例えば、塩基上に存在する、ヒドロキシル、アミノなどの)、および保護基の方法(保護および脱保護)は当業で知られており、例えば、アール.ラロック(R.Larock)、Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers (1989年)、ティー.ダブリュー.グリーン(T.W.Greene)およびピー.ジー.エム.ウッツ(P.G.M.Wuts)、Protective Groups in Organic Synthesis,2d.Ed.,John Wiley and Sons (1991年)、エル.フィーザー(L.Fieser)およびエム.フィーザー(M.Fieser)、Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons (1994)、およびエル.パケット(L.Paquette)、ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons (1995年)、これ以降の版で説明されているようなものを含む。
本発明の保護モノマー化合物は1つまたは複数の不斉中心を含むことができ、そのため、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマ、個々のジアステレオ異性体、およびジアステレオ異性体混合物として出現することができる。これらの化合物のこのような異性体はすべて、明らかに本発明に含まれる。本願に説明されている化合物はさらに、結合回転を制約することができる結合(例えば、炭素−炭素結合、炭素窒素結合、例えばアミド)または置換基を含むことができるが、例えば制約は環または二重結合が存在する結果生じる。したがって、すべてのシス/トランス、E/Z異性体、および回転異性体(ロタマー)は明らかに本明細書に含まれる。本発明の化合物は、さらに複数の互変異性形態で表されることがあり、そのような場合、本発明は明らかに本願に記載されている化合物のすべての互変異性型を含む(例えば、環系のアルキル化の結果、複数部位にアルキル化が生じ、本発明は明らかにすべてのそのような反応生成物を含む)。このような化合物のこのような異性体はすべて明らかに本発明に含まれる。本願に記載されているこれらの化合物の結晶体はすべて明らかに本発明に含まれる。
代表的なリガンド複合モノマーならびにリガンド複合モノマーおよび本願に記載されている、関係する化合物を調製するための典型的な合成を以下に示す。他のところで説明されているように、リガンド複合モノマーヒドロキシル基、例えばOFGの保護基は、限定はしないがジメトキシトリチル基(DMT)を含む。例えば、いくつかの実施形態では、OFGに対する保護基としてケイ素に基づく保護基を使用することが望ましい場合がある。したがって、ケイ素に基づく保護基は、必要に応じて、または望ましい場合にDMT基と併用して、またはその代わりに使用可能である。そのため、OFGの保護基としてDMT保護基を特徴付ける、以下で述べるリガンド複合モノマーおよび合成は、いかなる形でも本発明への制限として解釈すべきでない。
ピロリン担体の合成
スキーム1.シス−(−(3S,4R)−ピロリジンジオールの合成
スキーム2.シス−(−(2R,3S)−ピロリジンジオールの合成
5’標識siRNAの合成
2526はそれぞれ、3’,5’複合に使用可能である。
フタリミド誘導体の合成
30および31は、siRNAの3’および5’複合に対するスキーム2〜4に示されているような類似の誘導体に転換可能である。
タリミド誘導体の合成
40および41は、siRNAの3’および5’複合に対するスキーム2〜4に示されているような類似の誘導体に転換可能である。
N−アルキルピロリン誘導体の合成
中間体50および51は、類似の反応を使用してsiRNAと複合することも可能な類似体に転換可能である。
ピペリジンシリーズリガンド:
ピロリンシリーズと同様に、ピペリジンシリーズを合成することができる。
ピペリジンシリーズリガンド:
ピロリンシリーズと同様に、ピペリジンシリーズを合成することができる。
ヒドロキシプロリンシリーズリンカー:
市販のシス−3−ヒドロキシプロリンおよび(s)−ピロリドンカルボン酸から
siRNAを安定化するフタリミド誘導体
4−ヒドロキシプロリン誘導体
フタリミド誘導体
六員環のリンカーの合成
類似の反応は、2−ピペリドンおよび3−ピペリドンにより実行可能である。
4−ピペリドンからのリンカー
3−ピペリドンからのリンカー
2−ピペリドンからのリンカー
デカリン系を介した複合
デカリン系からの複合体:
Wieland−Miescherケトンからのデカリンリンカー
Wieland−Miescherケトンからの複合体
ピロリンリンカーの合成
固相合成および合成後複合:
例示的なリガンド複合モノマー
オリゴヌクレオチド剤へのリガンドの複合
オリゴヌクレオチド剤、例えばmiRNAまたはpre−miRNAを標的とするオリゴヌクレオチド剤へのリガンドの複合は、該オリゴヌクレオチド剤の調節作用に有益な効果を及ぼすことができる。例えば、該オリゴヌクレオチド剤は、薬物動態、安定性、および/または組織特異性を改善することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド剤(以下の式OT−I〜OT−IVにおいては「NA」、例えばRNA、DNA、キメラRNA−DNA、DNA−RNA、RNA−DNA−RNAまたはDNA−RNA−DNAと呼ぶ)は、リガンド(L)を結合するための1つまたは複数の化学結合を有するリガンドを含んだ部分をオリゴヌクレオチドまたは核酸に複合することによって化学的に修飾可能である。あるオリゴヌクレオチド剤のリガンドは、テザーおよびリンカーの一方または両方によって結合可能である。以下の図では、例示的な化学結合をX、YおよびZとして表す。これらはテザーまたはリンカーの一部でもよい。
リガンドは、3’末端、5’末端、および内部の位置の1つまたは両方に結合することができる。特定の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、式OT−Iを有する1つまたは複数の部分を複合することによって化学修飾可能である。
例示的リガンドを表4に示し、本明細書中の別の個所で考察する。表4に示した例示的リガンド(L)が好ましい。
L=
コレステロール
チオコレステロール
5β−コラン酸
コール酸
リトコール酸
ビオチン
ビタミンE
ナプロキセン
イブプロフェン
アミン(モノアミン、ジアミン、トリアミン、テトラアルキルアミンまたはアリールアミン)
葉酸
糖(N−アセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、ガラクトース、マンノース)
−(CHNQ(式中、n=0〜40、Q、Q=H、MeまたはEt;Q=H、Q=H、Me、Etまたはアリール)
−(CHCH=CH(CHNQ(式中、pおよび/またはq=0〜40、Q、Q=H、MeまたはEt;Q=H、Q=H、Me、Etまたはアリール(Eおよび/またはZ配置を有する。))
−(CHCH=CH(CHNQ(式中、pおよび/またはq=0〜40、Q、Q=H、MeまたはEt;Q=H、Q=H、Me、Etまたはアリール)
−(CHCH=CH(CHCH=CH(CHNQ(式中、p、qおよび/またはr=0〜40、Q、Q=H、MeまたはEt;Q=H、Q=H、Me、Etまたはアリール(Eおよび/またはZ配置を有する。))
−O(CH(OCHCH−OR(式中、m、n=0〜40およびR=H、Me、NQ、−C(O)NR’R’’−C(S)NR’R’’)
−NH(CH(OCHCH−OR(式中、m、n=0〜40およびR=H、Me、NQ、−C(O)NR’R’’−C(S)NR’R’’)
−O(CH(NHCHCH−R(式中、m、n=0〜40およびR=H、OH、Me、NQ、−C(O)NR’R’’−C(S)NR’R’’)
−NH(CH(NHCHCH−R(式中、m、n=0〜40およびR=H、OH、Me、NQ、−C(O)NR’R’’−C(S)NR’R’’)
ジアルキルグリセロール(sn3、sn1、sn2およびラセミ)(メチレンの数は0〜40で変動する。)
ジアルキルグリセロール(sn3、sn1、sn2およびラセミ)(メチレンの数は0〜40で変動する。)
ジアルキルグリセロール(sn3、sn1、sn2およびラセミ)(メチレンの数は0〜40で変動し、およびアルキル鎖はEおよび/またはZ異性体1つまたは複数の二重結合を含む。)
ジアルキルグリセロール(sn3、sn1、sn2およびラセミ)(メチレンの数は0〜40で変動し、およびアルキル鎖はEおよび/またはZ異性体1つまたは複数の二重結合を含む。)
脂質
例示的X、YおよびZ部分を表5に示す。該X、YおよびZ部分は相互に独立して選択されることができる。
例示的テザーを表7に示す。
本願に記載の化合物は、本願に記載の方法または従来の方法によって、市販の試薬および開始材料から調製可能である。
化合物1はフレイザーら(Fraser et al.)(Tetrahedron Lett.第41巻:1523、2000年)によって報告されているように調製される。工程(ii)、(iii)(a)、(iii)(c)、(iv)、(v)および(vii)は、文献の手順(フレイザーら(Fraser et al.)、Tetrahedron Lett.第41巻:1523、2000年)に従って実施される。工程(iii)(b)および(v)(b)は、文献(Bioorg.Med.Chem.Lett.第13巻:1713、2003年)に報告されているように実施される。工程(iv)は文献(コーレイとベンカテスワール(Corey and Venkateswarlu)、J.Am.Chem.Soc.第94巻:6190、1972年)に報告されているように実施される。
(i)2,2−ジ−O−メチルプロパン、PTSA;(ii)NaH/DMF、3または4、−45℃〜室温;(iii)(a)NH、NHMeまたはNHMe、THF、オートクレーブ、(b)HCOOH−HOおよび(c)Pd(OH)、EtOH、AcOH、H、55psi;(iV)Pd(OH)、EtOH、AcOH、H、55psi;(v)NaSMe/DMF、80℃および(b)HCOOH−HO(vi)TBDMS−Cl、イミダゾール/Py;(vii)ジイソプロピルアミンテトラゾリド、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト/CHCl
ある種の化合物の合成を以下のスキーム2に記載する。工程(i)はダボウチックとラディア(Dubowchik and Radia)(Tetrahedron Lett.、第38巻:5257、1997年)に報告されているように実施される。工程(ii)はコーレイとベンカテスワール(Corey and Venkateswarlu)(J.Am.Chem.Soc.第94巻:6190、1972年)に報告されているように実施される。工程(iii)はフレイザーら(Fraser et al.)(Tetrahedron Lett.第41巻:1523、2000年)に報告されているように実施され、工程(iv)はミラーら(Miller et al.)(Current Protocol in Nucleic Acids Chemistry、2000年、2.5.1〜2.5.36、ジョンワイリーアンドサンズ社[John Wiley and Sons,Inc.])に記載されているように実施される。
(i)MMTr−Cl、TEA/CHCl;(ii)TBDMS−Cl、イミダゾール/Py;(iii)ジイソプロピルアミンテトラゾリド、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト/CHCl;(iv)(a)AcO/Py、(b)トリアゾール、TEA、4−クロロフェニルジクロロリン酸/MeCN、(c)NHOHおよび(d)ペンタフルオロフェニルベンゾエート/Py
ある種の化合物の合成は以下のスキーム3に記載のように実施される。工程(i)はミラーら(Miller et al.)(Current Protocol in Nucleic Acids Chemistry、2000年、2.5.1〜2.5.36、ジョンワイリーアンドサンズ社[John Wiley and Sons,Inc.])に記載されているように実施される。工程(ii)はコーレイとベンカテスワール(Corey and Venkateswarlu)(J.Am.Chem.Soc.第94巻:6190、1972年)に報告されているように実施される。工程(iii)はフレイザーら(Fraser et al.)(Tetrahedron Lett.第41巻:1523、2000年)に報告されているように実施される。
(i)(a)AcO/Py、(b)トリアゾール、TEA、4−クロロフェニルジクロロリン酸/MeCN、(c)NHOHおよび(d)ペンタフルオロフェニルベンゾエート/Py;(ii)TBDMS−Cl、イミダゾール/Py;(iii)ジイソプロピルアミンテトラゾリド、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト/CHCl
ある種の化合物の合成は以下のスキーム4に記載のように実施される。工程(ii)はコーレイとベンカテスワール(Corey and Venkateswarlu)(J.Am Chem.Soc.第94巻:6190、1972年)に報告されているように実施され、工程(iii)はフレイザーら(Fraser et al.)(Tetrahedron Lett.第41巻:1523、2000年)に報告されているように実施される。
(i)N−フタルイミド−6−アミノカプロン酸、DCC、DMAP、HOBT;(ii)TBDMS−Cl、イミダゾール/Py;(iii)ジイソプロピルアミンテトラゾリド、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト/CHCl
ある種の化合物の合成を以下のスキーム5に記載する。工程(i)はミラーら(Miller et al.)(Current Protocol in Nucleic Acids Chemistry、2000年、2.5.1−2.5.36、ジョンワイリーアンドサンズ社[John Wiley and Sons,Inc.])に報告されているように実施される。工程(ii)はコーレイとベンカテスワール(Corey and Venkateswarlu)(J.Am Chem.Soc.第94巻:6190、1972年)に記載されているように実施され、工程(iii)はフレイザーら(Fraser et al.)(Tetrahedron Lett.第41巻:1523、2000年)に報告されているように実施される。
(i)(a)AcO/Py、(b)トリアゾール、TEA、4−クロロフェニルジクロロリン酸/MeCN、(c)NHOHおよび(d)ペンタフルオロフェニルベンゾエート/Py;(ii)TBDMS−Cl、イミダゾール/Py;(iii)ジイソプロピルアミンテトラゾリド、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト/CHCl
ある種の化合物の合成を以下のスキーム6に記載する。スキーム6に記載の化合物130は、リウとオースチン(Liu and Austin)、J.Org.Chem.66:8643、2001年)に報告されているように得られる。工程(i)および(iii)(b)は、文献(Chem.rev.,1954、54,1)に報告されているように実施される。工程(ii)(a)は文献の手順(J.Org.Chem.,1993年、58、2334)に従って実施される。工程(ii)(b)、(iii)(a)および(iv)(b)は、文献(Bioorg.Med.Chem.Lett.,2003年、第13巻、1713)に報告されているように実施される。工程(iii)(c)はダボウチックとラディア(Dubowchik and Radia)(Tetrahedron Lett.第38巻:5257、1997年)に報告されているように実施される。工程(iv)(a)は文献(Organic Lett.,2001年、3、1809)に報告されているように実施される。工程(v)はコーレイとベンカテスワール(Corey and Venkateswarlu)(J.Am Chem.Soc.第94巻:6190、1972年)に報告されているように実施され、工程(vi)はフレイザーら(Fraser et al.)(Tetrahedron Lett.第41巻:1523、2000年)に報告されているように実施される。
(i)H、Pd−C(10%)/MeOH、1気圧;(ii)(a)N−フタルイミド−6−アミノカプロン酸、DCC、DMAP、HOBTおよび(b)HCOOH−HO;(iii)(a)HCOOH−HO、(b)H、Pd−C(10%)/MeOH、1気圧および(c)MMTr−Cl、TEA/CHCl;(iv)(a)CDI(カルボニルイミダゾール)/THF、MeNH、またはp−ニトロフェニルクロロホルメート、DMAP/Py、MeNH、および(b)HCOOH−HO(v)TBDMS−Cl、イミダゾール/Py;(vi)ジイソプロピルアミンテトラゾリド、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト/CHCl
ある種の化合物の合成を以下のスキーム7に記載する。化合物146はリウとオースチン(Liu and Austin)(J.Org.Chem.66:8643、2001年)に報告されているように得られる。工程(i)(b)および(iii)(c)は、文献(Chem.Rev.,1954、54,1)に報告されているように実施される。工程(ii)(a)は文献の手順(J.Org.Chem.,1993年、58、2334)に従って実施される。工程(ii)(b)、(iii)(b)および(iv)(b)は文献(Bioorg.Med.Chem.Lett.,2003年、第13巻、1713)に報告されているように実施される。工程(iii)(d)はダボウチックとラディア(Dubowchik and Radia)(Tetrahedron Lett.1997年、第38巻、5257)に報告されているように実施される。工程(iv)(a)は文献(Organic Lett.,2001年、3、1809)に報告されているように実施される。工程(v)はコーレイとベンカテスワール(Corey and Venkateswarlu)(J.Am Chem.Soc.1972年、第94巻、6190)に報告されているように実施され、工程(vi)はフレイザーら(Fraser et al.)(Tetrahedron Lett.2000年、第41巻、1523)に報告されているように実施される。
(i)BzO/Pyおよび(b)H、Pd−C(10%)/MeOH、1気圧;(ii)(a)N−フタルイミド−6−アミノカプロン酸、DCC、DMAP、HOBTおよび(b)HCOOH−HO;(iii)(a)BzO/Py、(b)HCOOH−HO、(c)H、Pd−C(10%)/MeOH、1気圧および(d)MMTr−Cl/Py;(iv)(a)CDI(カルボニルイミダゾール)/THF、MeNH、またはp−ニトロフェニルクロロホルメート、DMAP/Py、MeNH、および(b)HCOOH−HO、(v)TBDMS−Cl、イミダゾール/Py;(vi)ジイソプロピルアミンテトラゾリド、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト/CHCl
ある種の化合物を合成を以下のスキーム8に記載する。化合物163はリウとオースチン(Liu and Austin)(J.Org.Chem.2001年、66、8643)に報告されているように得られる。
(i)(a)BzO/Pyおよび(b)H、Pd−C(10%)/MeOH、1気圧;(ii)(a)N−フタルイミド−6−アミノカプロン酸、DCC、DMAP、HOBTおよび(b)HCOOH−HO;(iii)(a)BzO/Py、(b)HCOOH−HO、(c)H、Pd−C(10%)/MeOH、1気圧および(d)MMTr−Cl/Py;(iv)(a)CDI(カルボニルイミダゾール)/THF、MeNH、またはp−ニトロフェニルクロロホルメート、DMAP/Py、MeNH、および(b)HCOOH−HO、(v)TBDMS−Cl、イミダゾール/Py;(vi)ジイソプロピルアミンテトラゾリド、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト/CHCl
ある種の化合物の合成を以下のスキーム9に記載する。化合物180はリウとオースチン(Liu and Austin)(J.Org.Chem.2001年、66、8643)に報告されているように得られる。
(i)(a)iBuCOCl/Pyおよび(b)H、Pd−C(10%)/MeOH、1気圧;(ii)(a)N−フタルイミド−6−アミノカプロン酸、DCC、DMAP、HOBTおよび(b)HCOOH−HO;(iii)(a)iBuCOCl/Py、(b)HCOOH−HO、(c)H、Pd−C(10%)/MeOH、1気圧および(d)MMTr−Cl/Py;(iv)(a)CDI(カルボニルイミダゾール)/THF、MeNH、またはp−ニトロフェニルクロロホルメート、DMAP/Py、MeNH、および(b)HCOOH−HO、(v)TBDMS−Cl、イミダゾール/Py;(vi)ジイソプロピルアミンテトラゾリド、2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト/CHCl
ターゲティング
本発明において特徴付けられるオリゴヌクレオチド剤、例えばmiRNAまたはpre−miRNAを標的にするオリゴヌクレオチド剤は、特定の組織型または細胞型を標的にすることができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、肝臓、腎臓、神経系細胞、または筋細胞を標的にすることができる。肝臓へのターゲティングのために、例えば、あるオリゴヌクレオチド剤は肝臓、例えば親油性部分をターゲティングするリガンドを含んだSRMSを含むことができる。親油性部分としては、脂質、コレステロール、オレイル、レチニルまたはコレステリル残基が挙げられる。肝ターゲティング剤として機能することができる他の親油性部分には、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リトコール酸、O3−(オレオイル)コラン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが挙げられる。オリゴヌクレオチド剤は、例えばラクトシル化されたLDLなどの低密度リポタンパク質(LDL)と組み合わされることによって肝臓をターゲティングすることができる。糖残基と混成されたポリマー担体も肝臓に対してオリゴヌクレオチド剤をターゲティングするように機能することができる。
オリゴヌクレオチド剤とヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン(SA)との複合を用いて、非腎組織に対してオリゴヌクレオチド剤をターゲティングすることもできる。
本願に記載のSRMSターゲティング部分によって組織を標的にするオリゴヌクレオチド剤は、該組織に発現した遺伝子を標的にすることができる。例えば、肝臓をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、肝癌を治療するためなど、p21(WAF1/DIP1)、P27(KIP1)、βカテニン、またはc−METをターゲティングすることができる。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、HDL/LDLコレステロールの不均衡;異常脂質血症、例えば家族性混合型高脂血症(FCHL)または後天性高脂血症;高コレステロール血症;スタチン耐性高コレステロール血症;冠動脈疾患(CAD);冠動脈心疾患(CHD);またはアテローム性動脈硬化症の治療のためなどに、apoB−100を標的とすることができる。
糖、例えばガラクトースおよび/またはその類似体を組み込んだターゲティング剤が有用であることができる。これらの薬剤は、例えば肝実質細胞を標的にする。例えば、ターゲティング部分は、相互に約15Å離間した2つ以上あるいは好適には3または4つ以上のガラクトース部分を含むことができる。該ターゲティング部分は、別の場合には、ガラクトースに結合したグルコースであるラクトース(例えば、3つのラクトース部分)でもよい。該ターゲティング部分は、N−アセチル−ガラクトサミン、N−Ac−グルコサミンでもよい。マンノースまたはマンノース−6−リン酸ターゲティング部分は、マクロファージのターゲティングに使用可能である。
本発明のオリゴヌクレオチド剤は、例えば腎臓をターゲティングするリガンドを含んだSRMSが組み込まれることによって腎臓もターゲティングすることができる。
本願に記載のSRMSターゲティング部分によって腎臓をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、腎臓に発現した遺伝子をターゲティングすることができる。
SRMS上のリガンドは、葉酸、グルコース、コレステロール、コール酸、ビタミンE、ビタミンKまたはビタミンAを含むことができる。
リガンドとの複合により細胞への進入を促進する
miRNAまたはpre−miRNAをターゲティングするmiRNAオリゴヌクレオチド剤などのオリゴヌクレオチド剤は、細胞、例えばエンドサイトーシス機構または非エンドサイトーシス機構への進入を増強するように修飾可能である。細胞透過性を増大させるリガンドが、SRMS、例えばピロリンをベースにしたSRMSへの結合などによる多数の方法でオリゴヌクレオチド剤に結合可能である。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、多様な細胞型への取り込みを増強させるポリアルギニンに複合可能である。理論によって拘束されるものではないが、増強された取り込みは、非エンドサイトーシス経路によるものと考えられる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドをアミノグリコシドのグアニジウム類似体に複合して、細胞透過性を促進することができる。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドを親油性部分に複合することができる。この親油性部分を、ピロリンをベースにしたSRMSの窒素原子に結合することができる。親油性部分の例としては、コレステロール、脂質、オレイル、レチニル、またはコレステリル残基が挙げられる。他の親油性部分には、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リソコール酸、O3−(オレオイル)コラン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジンが挙げられる。コレステロールは特に好適な例である。
細胞透過性を増強するリガンドを3’末端、5’末端または内部に結合することが可能である。該リガンドをSRMS、例えばピロリンをベースにしたSRMSの3’末端、5’末端、または内部結合で結合することが可能である。この結合は直接的であるか、またはテザー分子を介したものでもよい。本願に記載のテザー、スペーサまたはリンカーを用いて、該部分をSRMSに結合することができる。
1つまたは複数の細胞浸透性リガンドが複合されたオリゴヌクレオチド剤(「OA−細胞透過性複合体」と呼ぶ)は、インビボでは、例えば哺乳動物の対象(例えば、ヒトまたはマウス)などのある対象の組織の細胞などの細胞へ送達されることができる。あるいは、またはそれに加えて、該オリゴヌクレオチド剤はインビトロで、例えば細胞系の細胞に送達されることができる。細胞系は、例えば哺乳動物(例えば、ヒトまたはマウス)などの脊椎生物からのものでもよい。細胞系へのOA−細胞透過性複合体の送達は、他のトランスフェクション試薬が存在しない状態で可能である。例えば、細胞へのOA−細胞透過性複合体の送達は、Lipo fectamine(商標)(インビトロジェン社(Invitrogen)、[米国カリフォルニア州カールズバッド(Carlsbad)所在]、Lipofectamine2000(商標)、TransIT−TKO(商標)(ミラス社(Mirus)、[米国ウィスコンシン州マディソン(Madison)所在]、FuGENE6(ロシュ社(Roche)、[米国インディアナ州インディアナポリス(Indiana polis)所在]、ポリエチレンイミン、X−tremeGENE Q2(ロシュ社(Roche)、[米国インディアナ州インディアナポリス(Indiana polis)所在]、DOTAP、DOSPER、Metafectene(商標)(ビオンテックス社(Biontex)、[ドイツ、ミュンヘン(Munich)所在]、または別のトランスフェクション試薬が存在しない状態で、または任意に存在下で可能である。例示的細胞系はAmerican Type Culture Collection(ATCC)[バージニア州マナッサス所在]によって提供可能である。OA−細胞透過性複合体を本願に記載の任意の細胞系などの細胞系に送達し、特定の遺伝子をターゲティングしてダウンレギュレーションすることができる。
一例では、オリゴヌクレオチド剤−親油性複合体は、一次細胞系、例えば滑膜細胞系(例えば、B型滑膜細胞)、心筋細胞系、ケラチノサイト系、肝細胞系、平滑筋細胞系、内皮細胞または皮膚線維芽細胞系に送達されることができる。
オリゴヌクレオチド剤の構造
NAT(「核酸ターゲティング」)であるオリゴヌクレオチド剤は、標的遺伝子に対して十分に相補性のある領域を含み、ヌクレオチドとしては十分に長いことから、該オリゴヌクレオチド剤は標的核酸とともに2本鎖を形成する。該オリゴヌクレオチド剤は標的分子の機能を調節することができる。例えば、標的分子がmRNAまたはpre−mRNAである場合、該NATは遺伝子発現を抑制することができる。標的がmiRNAである場合、該NATはmiRNA機能を抑制し、故に、特定のmiRNAによってターゲティングされたmRNAの発現をアップレギュレーションする。標的がpre−mRNAの領域でスプライシングに影響する場合、該NATはスプライス部位の選択を、故にmRNA配列を改変することができる。該NATがmiRNAとして機能する場合、ターゲティングされたmRNAの発現が抑制される。わかり易いように、オリゴヌクレオチド剤の1つまたは複数の単量体サブユニットに関連して、「ヌクレオチドまたはリボヌクレオチド」という用語を、本願において用いることがある。本願の「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、修飾されたRNAまたは代替ヌクレオチドの場合、修飾ヌクレオチドまたは1つまたは複数の位置の代替置換部分も指すことを理解されたい。
NATオリゴヌクレオチド剤は、標的RNAと少なくとも部分的に相補的であり、いくつかの実施形態では完全に相補的である領域であるか、または該領域を含む。該オリゴヌクレオチド剤とその標的との間に必ずしも完全な相補性が存在するべきであるというわけではないが、該オリゴヌクレオチド剤またはその切断産物が標的遺伝子発現を調節(例えば、抑制)することができるように、対応は十分なものでなければならない。
オリゴヌクレオチド剤は以下の特性の1つまたは複数を有することが好ましい。
(1)オリゴヌクレオチド剤は以下の式1、2、3または4である。
(2)オリゴヌクレオチド剤は、1つまたは複数のリン酸基またはリン酸基の1つまたは複数の類似体を含む5’修飾を有する。
(3)オリゴヌクレオチド剤は、非常に多くの塩基、特に塩基対が修飾されても、ターゲティングされたRNAの活性の調節を可能にするために十分な熱力学的安定性を有する相同的な標的RNAと2本鎖構造を形成する。
(4)オリゴヌクレオチド剤は、非常に多くの、またはすべてのヌクレオシドで修飾されても、依然として「RNA様の」特性を有する。すなわち、オリゴヌクレオチド剤は、排他的でなくても、または部分的であっても、リボヌクレオチドをベースにした成分のRNA分子の全体的な構造的、化学的および物理的特性を有する。例えば、ヌクレオチド糖はすべて2’ヒドロキシルの代わりに、例えば2’OMe,2’フルオロを含むことができる。このデオキシリボヌクレオチドを含んだオリゴヌクレオチド剤は、依然としてRNA様の特性を呈することを期待することができる。理論によって拘束しようとするものではないが、電気的陰性のフッ素はリボースのC2’位置に結合しているときに、軸方向の配向を好む。また、フッ素のこの空間選択性は糖にC3’内向き歪みを導入させることができる。RNA分子で観察されるような糖の歪みの形態と同じであり、RNAに特徴的なA−ファミリー型のらせんを生じる。さらにフッ素は良好な水素結合受容体であることから、RNA構造を安定させることが知られている水分子との同じ水素結合相互作用に関与し得る。(一般に、2’糖位置の修飾部分はデオキシリボヌクレオチドの2’−H部分よりもリボヌクレオチドの2’−OH部分により特徴的な水素結合に入ることが可能になることが好ましい。好適なオリゴヌクレオチド剤は、糖の全部または少なくとも50、75、80、85、90または95%においてC3’内向き歪みを呈し、C3’内向き歪みをその糖の十分な量で呈するので、オリゴヌクレオチド剤はRNAに特徴的なA−A−ファミリー型のらせんを生じ得、C3’内向き歪み構造ではない糖を20、10、5、4、3、2または1個以下を有する。
C3’内向き歪みを有する好適な2’修飾には以下のものを含む。
2’−OH、2’−O−Me、2’−O−メトキシエチル、2’−O−アミノプロピル、2’−F、2’−O−CH−CO−NHMe、2’−O−CH−CH−O−CH−CH−N(Me)、LNA
(5)修飾の性質に関係なく、またオリゴヌクレオチド剤がデオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含むことが可能であっても、DNA分子、分子中のヌクレオチドの50、60または70%より多くがデオキシリボヌクレオチドである任意の分子、または2’位置がデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド剤の定義から除外されることが好ましい。
C2’内向き歪みを有する好適な2’修飾には以下のものを含む。
2’−H、2’−Me、2’−S−Me、2’−エチニル、2’−アラ−F。
糖修飾にはL−糖および2’−5’結合糖も含むことができる。
本願で用いられる「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」とは、標的RNAに結合するNATオリゴヌクレオチド剤の場合、安定的で特異的な結合が本発明の化合物と標的RNA分子との間に生じるのに十分な程度の相補性を示すのに用いられる用語である。特異的結合が望ましい条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療上の処置の場合の生理学的条件下、またはインビトロアッセイの場合、該アッセイが実施される条件下で、特異的結合には、非標的配列との相補性が十分に欠けていることが必要である。ターゲティング配列と非ターゲティング配列との間に単一のミスマッチが存在すれば、mRNAのsiRNAターゲティングを識別するのに十分であることが明らかとなっている(ブルメルカンプら(Brummelkamp et al.)、Cancer Cell、2002年、2:243)。
一実施形態では、NATオリゴヌクレオチド剤は、オリゴヌクレオチド剤が標的mRNAによってコードされるタンパク質の産生を抑制するように、標的RNAに対して「十分に相補的」である。該標的RNAは、例えば、対象に内因性のpre−mRNA、mRNA、またはmiRNAでもよい。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、標的RNA、例えば標的RNAに対して「正確に相補的」(SRMSを含んだサブユニットは除外する)である。オリゴヌクレオチド剤はアニールすると正確に相補的な領域において、ワトソン・クリック塩基対から独占的に作られるハイブリッドを形成することができる。「十分に相補的」な標的RNAは、標的RNAに対して正確に相補的である(例えば、少なくとも7ヌクレオチドの)領域を含むことができる。また、いくつかの実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は単一ヌクレオチドの差を特異的に識別する。この場合、正確な相補性がその領域、単一のヌクレオチド差に認められれば、該オリゴヌクレオチド剤は遺伝子発現を下方調節するだけである。
本願で考察されたオリゴヌクレオチド剤は、別の場合には、非修飾RNAおよびDNAのほか、例えば有効性を改善するために修飾されたRNAおよびDNAならびに代替ヌクレオシドのポリマーを含む。非修飾RNAとは、天然に発生する分子と、好適には人体で天然に発生する分子と、核酸の成分、すなわち糖、塩基、およびリン酸部分が同じであるか本質的に同じである分子を指す。この技術はまれであるか例外的ではあるが天然の修飾RNAであるRNAについては、例えばリンバッハら(Limbach et al.)(Nucleic Acids Res.、1994年、22:2183〜2196頁)を参照されたい。多くの場合、修飾RNAと呼ばれるこのようなまれなまたは異常なRNAは、典型的には転写後修飾の結果であり、本願で用いられる「非修飾RNA」という用語の範囲にある。本願で用いられる場合「修飾RNA」とは、核酸の成分、すなわち糖、塩基およびリン酸部分の1つまたは複数が自然に発生する成分とは異なる分子、好適には人体で発生する成分とは異なる分子を指す。このような分子は「修飾RNA」と呼ばれるが、当然修飾されているので、正確に言えばRNAではない分子を含む。代替ヌクレオシドとは、リボリン酸骨格が、ハイブリダイゼーションがリボリン酸骨格、例えばリボリン酸骨格の非荷電模倣体に見られるものと実質的に類似するように正確な空間的関係で塩基を存在させる非リボリン酸構造と置換された分子である。上記すべての例を本願中で考察する。
核酸はサブユニットのポリマーまたはモノマーであることから、以下に記載の修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置で生じ、例えば、塩基、リン酸部分またはリン酸部分の非結合Oの修飾である。ある場合には、この修飾は核酸内のあらゆる対象位置で生じるが、多くの場合、実際にはほとんどの場合生じない。例を挙げると、修飾は3’または5’末端位置でのみ生じてもよく、末端領域、例えば末端ヌクレオチドのある位置またはある鎖の最後の2、3、4、5または10ヌクレオチドでのみ生じてもよい。リガンドは3’末端、5’末端、または内部位置、あるいはこれらの位置の組合せで結合することができる。例えば、該リガンドは3’末端および5’末端;3’末端および1つまたは複数の内部位置;5’末端および1つまたは複数の内部位置;または3’末端、5’末端、および1つまたは複数の内部位置にあってもよい。例えば、非結合Oの位置のホスホロチオエート修飾は、末端の一方または両方においてのみ生じてよいし、末端領域、例えば末端ヌクレオチド上のある位置またはオリゴヌクレオチドの最後の2、3、4、5または10ヌクレオチドでのみに生じてもよい。5’末端はリン酸化可能である。
修飾および代替ヌクレオチドを以下で考察する。
式1の上に示した骨格は、リボ核酸の一部を示す。この基本成分はリボース糖、塩基、末端リン酸、およびリン酸−ヌクレオチド間リンカーである。該塩基が天然塩基、例えばアデニン、ウラシル、グアニンまたはシトシンであり、糖が非修飾2’ヒドロキシルリボース糖(示したような)であり、W、X、YおよびZがすべてOである場合、式1は天然の非修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。
いくつかの用途では、非修飾オリゴリボヌクレオチドは最適ではないことがある。例えば非修飾オリゴリボヌクレオチドは、例えば細胞ヌクレアーゼによって分解し易い。ヌクレアーゼは核酸のリン酸ジエステル結合を加水分解することができる。しかし、上記RNA成分の1つまたは複数に対して化学修飾すれば特性を改善することができ、例えば、オリゴリボヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安定したものにすることができる。リガンドまたは他の部分をオリゴヌクレオチド剤に結合する連結地点を提供するという点では、非修飾オリゴリボヌクレオチドはまた最適ではないかもしれない。
修飾核酸および代替ヌクレオチドは、以下の1つまたは複数を含むことができる。
(i)非結合(XおよびY)リン酸酸素の一方または両方および/または結合(WおよびZ)リン酸酸素の一方または両方の改変、例えば置換(リン酸が末端位置にある場合、位置WまたはZの一方は天然リボ核酸中の付加的な要素にリン酸を結合しない。しかし、別途記載する場合を除き、用語をわかり易くするために、核酸の5’末端にあるW位置および核酸の3’末端にあるZ末端位置は、本願で用いられるような「リン酸酸素を結合する」という用語の範囲にある。)、
(ii)リボース糖の成分の、例えばリボース糖上の2’ヒドロキシルの改変、例えば置換、あるいは例えば本願に記載したようなリボース糖のリボース以外の構造とのホールセール置換、
(iii)リン酸部分(括弧I)の「脱リン酸」リンカーとのホールセール置換、
(iv)天然塩基の修飾または置換、
(v)リボース−リン酸骨格(括弧II)の置換または修飾、
(vi)RNAの3’末端または5’末端の修飾、例えば末端リン酸基の除去、修飾または置換、あるいはRNAの3’末端または5’末端のいずれかへの、部分、例えば蛍光標識部分の複合。
この文脈で用いられる場合、置換、修飾、改変等の用語は、任意の方法も制限することを暗示するものではない。例えば、修飾とは、基準リボ核酸または天然リボ核酸を用いて開始し、これを修飾して修飾リボ核酸を生成しなければならないことを意味するものではなく、むしろ修飾とは天然分子との差を示すものにすぎない。
いくつかの化学的実体の実際の電子構造をただ一つの限界構造式(すなわち、ルイス構造)によって適切に表すことはできないことを理解されたい。理論によって拘束しようとするものではないが、その代わりに、実際の構造は集合的に共鳴形式または共鳴構造として知られている、何らかの2つ以上の限界構造式のハイブリッドまたは加重平均であることができる。共鳴構造とは化学的実体ではなく、紙上にのみ存在する。共鳴構造は特定の化学的実体に対する結合電子および非結合電子の配置または「限局化」という点においてのみ相互に異なる。他のものよりも一つの共鳴構造によって、ハイブリッドの程度をさらに拡大させることが可能である。したがって、本発明の実施形態の記載された説明および図による説明は、当該分野が特定の種に対する有力な共鳴構造として認識しているものの点でなされている。例えば、任意のホスホロアミデート(非結合酸素を窒素と置換したもの)も上図のX=OおよびY=Nによって表されよう。
具体的な修飾を以下でさらに詳細に考察する。
リン酸基
該リン酸基は負電荷の種である。この電荷は2個の非結合酸素原子(すなわち、上の式1のXおよびY)にわたって等しく分布される。しかし、このリン酸基を酸素原子の一方を異なる置換基と置換することによって修飾することができる。RNAリン酸骨格に対するこの修飾の1つの結果として、核酸分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性が増大されることができる。したがって、理論によって拘束しようとするものではないが、いくつかの実施形態では、非荷電リンカーまたは非対称の電荷分布を有する荷電リンカーが結果的に得られる改変を導入することが望まれる。
修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルホスホン酸またはアリールホスホン酸およびアルキルリン酸トリエステルおよびアリールリン酸トリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは硫黄によって置換された両非結合酸素を有する。XまたはYの一方のみが改変される場合とは異なり、ホスホロジチオエートのリン中心はオリゴリボヌクレオチド・ジアステレオマーの形成を排除するアキラルである。ジアステレオマー形成によって、個々のジアステレオマーが種々のヌクレアーゼ耐性を呈する製剤を得ることができる。さらに、キラルリン酸基含有RNAのハイブリダイゼーション親和性は、それに対応する非修飾RNA種に対して低くなることができる。したがって、理論によって拘束しようとするものではないが、キラル中心を排除するXおよびY両方に対する修飾、例えばホスホロジチオエート形成は、それらがジアステレオマー混合物を生成することができないという点で望ましいであろう。したがって、XはS、Se、B、C、H、NまたはOR(Rはアルキルまたはアリールである。)のいずれか1つでもよい。したがって、YはS、Se、B、C、H、NまたはOR(Rはアルキルまたはアリールである。)のいずれか1つでもよい。Xおよび/またはYを硫黄と置換することが好ましい。
リン酸リンカーは、結合酸素(すなわち、式1のWまたはZ)を窒素(架橋ホスホロアミデート)、硫黄(架橋ホスホロチオエート)および炭素(架橋メチレンホスホン酸)と置換することによって修飾することもできる。この置換は末端酸素(位置W(3’)または位置Z(5’)において生じることができる。Wを炭素と置換することおよびZを窒素と置換することが好ましい。
以下に記載のように、候補物質の適合性を評価することができる。
糖基
修飾RNAは、リボ核酸の糖基の全部または一部の修飾を含むことができる。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)を、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基を用いて修飾または置換することができる。理論によって拘束しようとするものではないが、ヒドロキシルは脱プロトン化されて2’アルコキシドイオンを最早形成することができないことから、安定性の増強が期待される。該2’アルコキシドはリンカーリン原子に対する分子内求核攻撃によって分解を触媒することができる。また、理論によって拘束しようとするものではないが、いくつかの実施形態に対しては、2’位のアルコキシド形成が不可能である改変を導入することが望ましいであろう。
「オキシ」−2’ヒドロキシル基修飾の例には、アルコキシまたはアリールオキシ(OR、例えばR=H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖);ポリエチレングリコール(PEG)、O(CHCHO)CHCHOR;2’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋またはエチレン架橋(例えば、2’−4’−エチレン架橋核酸(ENA))によって同じリボース糖の4’炭素に連結された「固定された」核酸(LNA);O−AMINE(AMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)およびアミノアルコキシ、O(CHAMINE、(例えば、AMINE=NH;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)が挙げられる。メトキシエチル基(MOE)のみを含んだオリゴヌクレオチド(OCHCHOCH、PEG誘導体)が、強固なホスホロチオエート修飾で修飾されたオリゴヌクレオチドに匹敵するヌクレアーゼ安定性を呈することは注目すべきである。
「デオキシ」修飾には、水素(すなわち、デオキシリボース糖);ハロ(例えば、フルオロ);アミノ(例えば、NH;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸);NH(CHCHNH)CHCH−AMINE(AMINE=NH;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ)、−NHC(O)R(R=アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖)、シアノ;メルカプト;アルキル−チオ−アルキル;チオアルコキシ;および例えばアミノ官能基で任意に置換されてよいアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルが挙げられる。好適な置換基は2’−メトキシエチル、2’−OCH、2’−O−アリル、2’−C−アリル、および2’−フルオロである。
糖基は、対応するリボース中の炭素の立体化学構成とは反対の立体化学構成を有する1つまたは複数の炭素も含むことができる。したがって、修飾RNAは糖として、例えばアラビノースを含んだヌクレオチドを含むことができる。
修飾RNAは、C−1’に核酸塩基がない「非塩基」糖も含むことができる。これらの非塩基糖は、成分である糖原子の1つまたは複数において修飾をさらに含んでもよい。
ヌクレアーゼ耐性を最大化するために、1つまたは複数のリン酸リンカー修飾(例えば、ホスホロチオエート)と組み合わせて2’修飾を用いることができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドとは、2つ以上の異なる修飾を含むオリゴヌクレオチドである。
該修飾は、オリゴヌクレオチド剤の1つまたは複数の部位においてリボース構造を他の実体とホールセール置換することも伴うことができる。これらの修飾をSRMSの糖置換と題する項目で説明する。
候補修飾を以下に記載のように評価することができる。
リン酸基の置換
リン酸基を非リン酸含有連結基(参考、上記式1の括弧I)によって置換することができる。理論によって拘束しようとするものではないが、荷電リン酸ジエステル基は核酸分解における反応中心であることから、中性の構造上の模倣体と該荷電リン酸ジエステル基とを置換すれば、ヌクレアーゼ安定性は増強されるはずであると考えられる。また、理論によって拘束しようとするものではないが、いくつかの実施形態では、荷電リン酸基が中性部分によって置換される改変を導入することは、中性部分によって置換されることが望ましい。
リン酸基を置換し得る部分の例には、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸塩、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。好適な置換基には、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が挙げられる。
候補修飾を下記のように評価することができる。
リボリン酸骨格の置換
リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたは代替ヌクレオチドによって置換された、オリゴヌクレオチドを模倣する骨格を構成することも可能である(上記式1の括弧IIを参照)。理論によって拘束しようとするものではないが、繰り返し荷電された骨格が存在しないことでポリアニオン(例えば、ヌクレアーゼ)を認識するタンパク質への結合が縮小されると考えられる。また、理論によって拘束しようとするものではないが、いくつかの実施形態では、塩基が中性の代替骨格によって繁留される改変を導入することが望ましいことがある。
例として、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸(PNA)代替ヌクレオシドが挙げられる。好適な代替は代替PNAである。
候補修飾を以下のように評価することができる。
末端修飾
オリゴヌクレオチドの3’末端および5’末端を修飾することができる。このような修飾は、分子の3’末端、5’末端またはこの両方であってよい。修飾は、末端リン酸全体またはリン酸基の原子の1つまたは複数を修飾または置換することを含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの3’末端および5’末端を、標識部分、例えばフルオロフォア(例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3またはCy5染料)または保護基(例えば、硫黄基、シリコン基、ホウ素基またはエステル基に基づく)などの他の機能分子実体に複合することができる。該機能分子実体をリン酸基および/またはスペーサを介して糖に結合することができる。該スペーサの末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のC−3’またはC−5’O、N、SまたはC基に連結するか、またはこれらを置換することができる。あるいは、該スペーサは、代替ヌクレオチド(例えば、PNA)の末端原子に連結するか、またはこれを置換することができる。これらのスペーサまたはリンカーには、例えば−(CH−、−(CHN−、−(CHO−、−(CHS−、0(CHCHO)CHCHOH(例えば、n=3または6)、非塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミドまたはモルホリノ、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を挙げることができる。理論によって拘束しようとするものではないが、ある種の部分を複合すれば、輸送性、ハイブリダイゼーション性および特異性を改善することができると考えられる。また、理論によって拘束しようとするものではないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端改変を導入することが望ましいと思われる。末端修飾の他の例には、染料、相互作用剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、ソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、Sapphyrin)、多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性担体(例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リソコール酸、03−(オレオイル)コラン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン)およびペプチド複合体(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール・クラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロサイクルのEu3+混成物)が挙げられる。
活性を調節するか、または分解に対する耐性を調節するために本願の別の個所で考察するようなものを含む多くの理由で、末端修飾を付加することができる。好適な修飾には、メチルホスホネートホスホネートを3’−最末端結合に付加すること;3’C5−アミノアルキル−dTを付加すること;3’カチオン基を付加すること;または別の3’複合体を付加して3’−5’エキソヌクレアーゼ分解を抑制することが挙げられる。
活性を調節するのに有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体で5’末端を修飾することが挙げられる。例えば、好適な実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は5’リン酸化されているか、5末端にホスホリル類似体を含む。5’−リン酸修飾には、RISC媒介性遺伝子サイレンシングと適合するものを含む。適した修飾には、5’−1リン酸((HO)(O)P−O−5’);5’−2リン酸((HO)2(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−3リン酸((HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−グアノシン・キャップ(7−メチル化または非メチル化)(7m−G−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−アデノシン・キャップ(Appp)および任意の修飾または非修飾ヌクレオチド・キャップ構造(N−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−モノチオリン酸(ホスホロチオエート;(HO)(S)P−O−5’);5’−モノジチオリン酸(ホスホロジチオエート;(HO)(HS)(S)P−O−5’)、5’−ホスホロチオレート((HO)2(O)P−S−5’);酸素/硫黄で置換した1リン酸、2リン酸および3リン酸(例えば、5’−α−チオ3リン酸、5’−γ−チオ3リン酸等)の任意の付加的な組合せ、5’−ホスホロアミデート((HO)(O)P−NH−5’、(HO)(NH)(O)P−O−5’)、5’−アルキルホスホネート(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えば、RP(OH)(O)−O−5’−、(OH)(O)P−5’−CH−)、5’−アルキルエーテルホスホネート(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH−)、エトキシメチル等、例えば、RP(OH)(0)−O−5’−)が挙げられる。
末端修飾は分布をモニタリングするのにも有用であることができ、このような場合、付加されるのに好適な基には、フルオロフォア、例えばフルオレセインまたはアレクサ色素、例えばアレクサ488が挙げられる。末端修飾は取り込みを増強するのにも有用であることができる。これに有用な修飾にはコレステロールが挙げられる。末端修飾はオリゴヌクレオチド剤を別の部分に架橋するのにも有用であることができる。これに有用な修飾にはマイトマイシンCが挙げられる。
候補修飾を以下のように評価することができる。
塩基
アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルはRNAに見出される最も一般的な塩基である。これらの塩基を修飾または置換して特性が改善されたRNAを提供することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドはこれらの塩基を用いて、または合成および天然核酸塩基(例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ハイポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシンまたはツベルシジン)および上記修飾のいずれか1つを用いて調製することができる。あるいは、上記塩基、例えば本願に記載の「特異な塩基」および「一般的な塩基」のいずれかの置換または修飾類似体を用いてよい。例としては、これに限定するものではないが、2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3−デアザ−5−アザシトシン、2−アミノプリン、5−アルキルウラシル、7−アルキルグアニン、5−アルキルシトシン、7−デアザアデニン、N6,N6−ジメチルアデニン、2,6−ジアミノプリン、5−アミノ−アリル−ウラシル、N3−メチルウラシル、置換1,2,4−トリアゾール、2−ピリジノン、5−ニトロインドール、3−ニトロピロール、5−メトキシウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸、5−メトキシカルボニルメチルウラシル、5−メチル−2−チオウラシル、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシル、5−メチルアミノメチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3カルボキシプロピル)ウラシル、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N−アセチルシトシン、2−チオシトシン、N6−メチルアデニン、N6−イソペンチルアデニン、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、N−メチルグアニン、またはO−アルキル化塩基を含む、2−アミノアデニン、6−メチル誘導体およびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2−プロピルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、5−ハロウラシル、5−(2−アミノプロピル)ウラシル、5−アミノアリルウラシル、8−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニン、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジンおよびN−2、N−6およびO−6置換プリンが挙げられる。さらなるプリンおよびピリミジンには、米国特許第3687808号明細書に開示のもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,858〜859頁、クロシュヴィッツ、ジェイ.エル編集(Kroschwitz,J.L,ed.)John Wiley & Sons、1990年に記載のもの、およびイングリッシュら(Englisch et al.)、Angewandte Chemie,International Edition,1991年、30、613に開示されたものが挙げられる。
一般に、塩基を変更することは安定性を促進するのにはあまり好ましくないが、他の理由で有用であることができる。例えば、その一部は、例えば2,6−ジアミノプリンおよび2アミノプリン(例えば、2−アミノアデニン)は蛍光性である。修飾塩基は標的特異性を低減することができる。このことはオリゴヌクレオチド剤の設計に考慮されるべきである。
候補修飾を以下のように評価することができる。
候補オリゴヌクレオチド剤の評価
候補オリゴヌクレオチド剤、例えば修飾オリゴヌクレオチド剤に関して、該オリゴヌクレオチド剤または修飾分子および対照分子を適した条件に曝露し、選択された特性の存在を評価することによって、選択された特性を評価することができる。例えば、分解耐性を次のように評価することが可能である。候補修飾RNA(および好適には対照分子、一般には非修飾形態)を分解性の条件に曝露すること、例えば分解剤、例えばヌクレアーゼを含んだある環境に曝露することができる。例えば、生物試料、例えば治療的使用、例えば血液または細胞分画、例えば無細胞ホモジネートまたは分解細胞において遭遇するかもしれない環境に類似する試料を用いることができる。次いで、該候補および対照に関して、多数のアプローチのいずれかを用いて分解耐性を評価することができる。例えば、該候補および対照は、例えば放射性標識または酵素標識、あるいはCy3またはCy5などの蛍光標識を用いて、好適には曝露前に標識することができる。対照および修飾RNAを分解剤とともにインキュベートすることができ、場合によって、対照、例えば不活化された例えば熱不活性化された分解剤とともにインキュベートすることができる。次いで、修飾分子および対照分子の物理的パラメータ、例えば大きさが決定される。それらを物理的方法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイジングカラムによって決定し、分子がその元の長さを維持しているかどうかを検定することができるか、または機能検定することができる。あるいは、ノーザンブロット分析を用いて未標識の修飾分子の長さを検定することができる。
機能検定を用いて候補オリゴヌクレオチド剤を評価することもできる。機能検定を最初に、またはそれ以前の非機能検定(例えば、分解耐性検定)の後に適用して、修飾が分子の遺伝子発現抑制能を改変するかどうかを決定することができる。例えば、ある細胞、例えばマウスまたはヒト細胞などの哺乳類細胞を、蛍光タンパク質を発現するプラスミド、例えばGFP、および蛍光タンパク質をコードする転写産物と相同性の候補オリゴヌクレオチド剤と同時にトランスフェクトすることができる(例えば、国際特許公開第00/44914号パンフレットを参照)。例えば、GFP mRNAと相同性の修飾オリゴヌクレオチド剤に関し、トランスフェクションが候補オリゴヌクレオチド剤を含んでいなかった対照細胞、例えばオリゴヌクレオチド剤が付加されていない対照および/または非修飾RNAが付加された対照と比較して、細胞蛍光の低減をモニタリングすることによってGFP発現抑制能を検定することができる。遺伝子発現に対する候補オリゴヌクレオチド剤の有効性は、修飾および非修飾のオリゴヌクレオチド剤の存在下で細胞蛍光を比較することによって検定することができる。代替の機能検定では、マウスの内在性遺伝子、好適にはc−mosなどの母親性発現性遺伝子に相同の候補オリゴヌクレオチド剤をマウス未成熟卵母細胞に注入して、インビボにおいてオリゴヌクレオチド剤の遺伝子発現抑制能を検定することができる(例えば、国際特許公開第01/36646号パンフレットを参照)。卵母細胞の表現型、例えば分裂中期IIにおいて停止を維持する能力を、オリゴヌクレオチド剤が発現を抑制している指標としてモニタリングすることができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤によってc−mos mRNAが切断されると、卵母細胞は分裂中期停止を出て単為発生を開始する(カレッジら(Colledge et al.)、Nature 370:65〜68頁、1994年;ハシモトら(Hashimoto et al.)、Nature、第370巻:68〜71頁、1994年)。陰性対照と比較して、該修飾オリゴヌクレオチド剤の標的RNA濃度に対する効果をノーザンブロット分析によって検証して、標的RNAの濃度の低下を検定することができるか、またはウェスタンブロット分析によって検証して標的タンパク質の濃度の低下を検定することができる。対照は、修飾物質が付加されていないおよび/または非修飾RNAが付加された細胞を含むことができる。
miRNAまたはpre−miRNAを標的とするオリゴヌクレオチド剤を、miRNAによってターゲティングされた転写物の発現をモニタリングすることによって検定することができる。例えば、GFPを標的とするmiRNAを結合するように設計されたオリゴヌクレオチド剤を、トランスフェクションが候補オリゴヌクレオチド剤を含んでいない対照細胞、例えば修飾物質が添加されていない対照および/または非修飾RNAが添加された対照と比較して、細胞蛍光の増大をモニタリングすることによって検定することができる。他の例では、内因性酵素をターゲティングするmiRNAを結合するように設計されたオリゴヌクレオチド剤を、対照細胞と比較して、酵素活性の増大をモニタリングすることによって検定することができる。修飾オリゴヌクレオチド剤の標的miRNA濃度に対する効果を、ノーザンブロット分析によって検証して標的miRNAの濃度の低減を検定することができる。
参照文献
一般的な参照文献
本発明に従って用いられるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成を用いたものでもよい(例えば、「Oligonucleotide synthesis,a practical approach」、エム.ジェイ.ゲイト(M.J.Geit)編集、IRL Press、1984年;「Oligonucleotides and Analogues,A Practical Approach」、エフ.エクスタイン(F.Eckstein)編集、IRL Press、1991年(特にChapter 1、Modern machine−aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis、Chapter 2、Oligoribonucleotide synthesis、Chapter 3、2’−O−Methyloligoribonucleotide−s:synthesis and applications、Chapter 4、phosphorothioate oligonucleotides、Chapter 5、Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates、Chapter 6、Synthesis of oligo−2’−deoxyribonucleoside methylphosphonates、およびChapter 7、Oligodeoxynucleotides containing modified basesを参照されたい。)。特に有用な他の合成手順、試薬、保護基および反応条件は、マルチン、ピー.(Martin,P.)、HeIv.Chim.Acta、1995年、78、486〜504頁;ビューケージ、エス.エル.とイエール、アール.ピー.(Beaucage,S.L.and Iyer,R.P.)、Tetrahedron、1992年、48、2223〜2311頁およびビューケージ、エス.エル.とイエール、アール.ピー.(Beaucage,S.L.and Iyer,R.P.)、Tetrahedron、1993年、49、6123〜6194頁、またはそれらに引用されている参考文献に記載されている。
本願においては、国際特許公開第00/44895号パンフレット、同第01/75164号パンフレットまたは同第02/44321号パンフレットに記載の修飾を用いることができる。
ここに列挙した刊行物、特許および特許出願すべての開示を援用する。
リン酸基の参考文献
ホスフィン酸オリゴリボヌクレオチドの調製法は、米国特許第5508270号明細書に記載されている。アルキルホスホネートオリゴリボヌクレオチドの調製法は、米国特許第4469863号明細書に記載されている。ホスホロアミダイト・オリゴリボヌクレオチドの調製法は、米国特許第5256775号明細書または米国特許第5366878号明細書に記載されている。リン酸トリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製法は、米国特許第5023243号明細書に記載されている。ボラノリン酸オリゴリボヌクレオチドの調製法は米国特許第5130302号明細書および同第5177198号明細書に記載されている。3’−デオキシ−3’−アミノホスホロアミデートオリゴリボヌクレオチドの調製法は、米国特許第5476925号明細書に記載されている。3’−デオキシ−3’−メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドは、アン、エッチら(An,H,et al.)、J.Org.Chem.、2001年、66、2789〜2801頁に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製法は、スプロートら(Sproat et.al.)、Nucleosides Nucleotides 1988年、7,651およびクロスチックら(Crosstick et al.)、Tetrahedron Lett.1989年、30,4693に記載されている。
糖基の参考文献
2’修飾に対する修飾については、ベルマ、エス.ら(Verma,S.et al.)、Annu.Rev.Biochem.1998年、67、99〜134頁およびその中の全参考文献に見ることができる。リボースに対する具体的な修飾については、以下の参考文献:2’−フルオロ(カワサキら(Kawasaki et.al.)、J.Med.Chem.、1993年、36、831〜841頁)、2’−MOE(マルチン、ピー.(Martin,P.)、HeIv.Chim.Acta、1996年、79、1930〜1938頁)、「LNA」(ヴェンゲル、ジェイ.(Wengel,J.)、Acc.Chem.Res.1999年、32、301〜310頁)に見ることができる。
リン酸基置換の参考文献
本願ではMMI結合オリゴリボヌクレオシドとも呼ばれるメチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド、本願ではMDH結合オリゴリボヌクレオシドとも呼ばれるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド、および本願ではアミド−3結合オリゴリボヌクレオシドとも呼ばれるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、本願ではアミド−4結合5オリゴリボヌクレオシドとも呼ばれるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、ならびに例えばMMIおよびPOまたはPS結合が交互になっている混合された骨格化合物は、米国特許第5378825号明細書、同5386023号明細書、同5489677号明細書および国際出願公開PCT/US92/04294号および同PCT/US92/04305号(国際出願公開第92/20822号パンフレットおよび同第92/20823号パンフレットとしてそれぞれ公開されている)に記載されているように調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第5264562号明細書および同第5264564号明細書に記載されているように調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第5223618号明細書に記載されているように調製することができる。シロキサン置換はコルミエール、ジェイ.エフ.ら(Cormier,J.F.et al.)、Nucleic Acids Res.、1988年、16、4583頁に記載されている。炭酸塩置換はチッテンソル、ジェイ.アール.ら(Tittensor,J.R.)、J.Chem.Soc.C 1971、1933に記載されている。カルボキシメチル置換は、エッジ、エム.ディー.ら(Edge,M.D.et al.)、J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 1972、1991に記載されている。カルバメート置換は、スティアチャック、イー.ピー.(Stirchak,E.P.)、Nucleic Acids Res.1989、17、6129に記載されている。
リン酸−リボース骨格置換の参考文献
シクロブチル糖代替化合物は、米国特許第5359044号明細書に記載されているように調製することができる。代替ピロリジン糖は、米国特許第5519134号明細書に記載されているように調製することができる。代替モルホリノ糖は米国特許第5142047号明細書および同5235033号明細書および関連する他の特許の開示に記載されているように調製することができる。ペプチド核酸(PNA)は周知であり、Peptide Nucleic Acids(PNAs):Synthesis,Properties and Potential Applications,Bioorganic & Medicinal Chemistry、1996、4、5−23で参照した種々の手順のいずれかに従って調製することができる。ペプチド核酸は、米国特許第5539083号明細書に従って調製してもよい。
末端修飾の参考文献
末端修飾はモノハラン、エムら(Manoharan,M.et al.)、Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12、103〜128頁(2002年)およびその中の参照に記載されている。
塩基の参考文献
N−2置換プリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5459255号明細書に記載されているように調製することができる。3−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5457191号明細書に記載されているように調製することができる。5,6−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5614617号明細書に記載されているように調製することができる。5−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5484908号明細書に記載されているように調製することができる。付加的な参考文献については、塩基修飾に関する上記のセクションに開示されている。
好適なオリゴヌクレオチド剤
好適なオリゴヌクレオチド剤は以下の構造を有する(以下の式2を参照)。
上記式2を参照すると、R、RおよびRは各々独立して、2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3−デアザ−5−アザシトシン、2−アミノプリン、5−アルキルウラシル、7−アルキルグアニン、5−アルキルシトシン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、N6,N6−ジメチルアデニン、2,6−ジアミノプリン、5−アミノ−アリル−ウラシル、N3−メチルウラシル、置換1,2,4−トリアゾール、2−ピリジノン、5−ニトロインドール、3−ニトロピロール、5−メトキシウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸、5−メトキシカルボニルメチルウラシル、5−メチル−2−チオウラシル、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシル、5−メチルアミノメチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3カルボキシプロピル)ウラシル、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N−アセチルシトシン、2−チオシトシン、N6−メチルアデニン、N6−イソペンチルアデニン、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、N−メチルグアニン、またはO−アルキル化塩基を含む、H、(すなわち、非塩基ヌクレオチド)、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ハイポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、2−アミノアデニン、6−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、5−ハロウラシル、5−(2−アミノプロピル)ウラシル、5−アミノアリルウラシル、8−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−トリフルオロメチルならびに他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニン、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジンおよびN−2、N−6およびO−6置換プリンである。
、RおよびRは各々独立して、OR、O(CHCHO)CHCHOR;O(CH;O(CH、H;ハロ;NH;NHR;N(R;NH(CHCHNH)CHCHNHR;NHC(O)R;;シアノ;メルカプト、SR;アルキル−チオ−アルキル;ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノまたはウレイドで任意に各々置換されてよい、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニルであるか;あるいはR、RまたはRはRとともに結合して糖2’炭素と4’炭素との間に[−O−CH−]共有結合橋を形成する。
;H;OH;OCH;W;非塩基ヌクレオチド;または存在しない。
(好適なA1は、特にアンチセンス鎖に関して、5’−1リン酸((HO)(O)P−O−5’)、5’−2リン酸((HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’)、5’−3リン酸((HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’)、5’−グアノシン・キャップ(7−メチル化または非メチル化)(7m−G−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’)、5’−アデノシン・キャップ(Appp)およびあらゆる修飾または非修飾ヌクレオチド・キャップ構造(N−0−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’)、5’−モノチオリン酸(ホスホロチオエート;(HO)(S)P−O−5’)、5’−モノジチオリン酸(ホスホロジチオエート;(HO)(HS)(S)P−O−5’)、5’−ホスホロチオール酸((HO)(O)P−S−5’);酸素/硫黄置換1リン酸、2リン酸および3リン酸(例えば、5’−α−チオ3リン酸、5’−γ−チオ3リン酸等)、5’−ホスホルアミデート((HO)(O)P−NH−5’、(HO)(NH)(O)P−O−5’)、5’−アルキルホスホネート(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えば、RP(OH)(O)−O−5’−、(OH)(O)P−5’−CH−)、5’−アルキルエーテルホスホネート(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH−)、エトキシメチル等、例えば、RP(OH)(O)−O−5’−))のあらゆる組合せから選択される。
であり、
であり、
およびA
;H;Z;反転ヌクレオチド;非塩基ヌクレオチド;または存在しない。
はOH、(CH10、(CHNHR10、(CHOR10、(CHSR10;O(CH10;O(CHOR10、O(CHNR10、O(CHSR10;O(CHSS(CHOR10、O(CHC(O)OR10、NH(CH10;NH(CHNR10;NH(CHOR10、NH(CHSR10;S(CH10、S(CHNR10、S(CHOR10、S(CHSR10O(CHCHO)CHCHOR10;O(CHCHO)CHCHNHR10、NH(CHCHNH)CHCHNHR10;Q−R10、O−Q−R10、N−Q−R10、S−Q−R10または−O−である。WはO、CH、NHまたはSである。
、X、XおよびXは各々独立してOまたはSである。
、Y、YおよびYは各々独立してOH、O、OR、S、Se、BH 、H、NHR、N(Rアルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリールまたはヘテロアリールであり、各々任意に置換されていてもよい。
、ZおよびZは各々独立してO、CH、NHまたはSである。ZはOH、(CH10、(CHNHR10、(CHOR10、(CHSR10;O(CH10;O(CHOR10、O(CHNR10、O(CHSR10、O(CHSS(CHOR10、O(CHC(O)OR10;NH(CH10;NH(CHNR10;NH(CHOR10、NH(CHSR10;S(CH10、S(CHNR10、S(CHOR10、S(CHSR10O(CHCHO)CHCHOR10、O(CHCHO)CHCHNHR10、NH(CHCHNH)CHCHNHR10;Q−R10、O−Q−R10、N−Q−R10、S−Q−R10である。
Xは、本願に記載のオリゴヌクレオチド剤の長さに適合するように選択された5〜100である。
はHであるか;あるいはR、RまたはRとともに結合して糖2’炭素と4’炭素との間に[−O−CH−]共有結合橋を形成する。
はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミノ酸または糖である。RはNH、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸である。R10はH;フルオロフォア(ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3またはCy5染料);硫黄、シリコン、ホウ素またはエステル保護基;挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋リンカー(例えば、ソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン、(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性担体(コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミ酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リソコール酸、O3−(オレオイル)コラン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン)およびペプチド複合体(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]、ポリアミノ;アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール;放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール・クラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロサイクルのEu3+混成物);またはオリゴヌクレオチド剤である。Mは0〜1,000,000であり、nは0〜20である。Qは非塩基糖、アミド、カルボキシ、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノ、ビオチンまたはフルオレセイン試薬からなる群から選択されたスペーサである。
リン酸基全体が置換された好適なオリゴヌクレオチド剤は以下の構造を有する(以下の式3を参照)。
式3を参照すると、A10〜A40はL−G−Lである。A10および/またはA40はなくてもよく、Lはリンカーである(式中、Lの一方または両方は存在してよいか、または存在しなくてもよく、CH(CH;N(CH;O(CH;S(CHからなる群から選択される。)。Gはシロキサン、炭酸、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸塩、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノからなる群から選択された官能基である。
10、R20およびR30は各々独立して、2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3−デアザ−5−アザシトシン、2−アミノプリン、5−アルキルウラシル、7−アルキルグアニン、5−アルキルシトシン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、N6,N6−ジメチルアデニン、2,6−ジアミノプリン、5−アミノ−アリル−ウラシル、N3−メチルウラシル置換1,2,4−トリアゾール、2−ピリジノン、5−ニトロインドール、3−ニトロピロール、5−メトキシウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸、5−メトキシカルボニルメチルウラシル、5−メチル−2−チオウラシル、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシル、5−メチルアミノメチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3カルボキシプロピル)ウラシル、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N−アセチルシトシン、2−チオシトシン、N6−メチルアデニン、N6−イソペンチルアデニン、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、N−メチルグアニン、またはO−アルキル化塩基を含む、H、(すなわち、非塩基ヌクレオチド)、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ハイポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、2−アミノアデニン、6−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、5−ハロウラシル、5−(2−アミノプロピル)ウラシル、5−アミノアリルウラシル、8−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−トリフルオロメチルならびに他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニン、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジンおよびN−2、N−6およびO−6置換プリンである。
40、R50およびR60は各々独立して、OR、O(CHCHO)CHCHOR;O(CH;O(CHOR、H;ハロ;NH;NHR;N(R;NH(CHCHNH)CHCH;NHC(O)R;;シアノ;メルカプト、SR;アルキル−チオ−アルキル;ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノまたはウレイド基で任意に各々置換されてよい、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニルであるか;あるいはR40、R50またはR60はR70とともに結合して糖2’炭素と4’炭素との間に[−O−CH−]共有結合橋を形成する。
Xは5〜100であるか、または本願に記載のオリゴヌクレオチド剤の長さに適合するように選択される。
70はHであるか;あるいはR40、R50またはR60とともに結合して糖2’炭素と4’炭素との間に[−O−CH−]共有結合橋を形成する。
はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミノ酸または糖であり;RはNH、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸である。Mは0〜1,000,000、nは0〜20、gは0〜2である。
好適な代替ヌクレオシドは以下の構造を有する(以下の式4を参照)。
Sはmophilino、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸からなる群から選択される代替ヌクレオシドである。Lはリンカーであり、CH(CH;N(CH;O(CH;S(CH;−C(O)(CH−からなる群から選択されるか、またはなくてもよい。Mはアミド結合;スルホンアミド;スルフィン酸;リン酸基;本願に記載の修飾リン酸基;またはなくてもよい。
100、R200およびR300は各々独立して、2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3−デアザ−5−アザシトシン、2−アミノプリン、5−アルキルウラシル、7−アルキルグアニン、5−アルキルシトシン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、N6,N6−ジメチルアデニン、2,6−ジアミノプリン、5−アミノ−アリル−ウラシル、N3−メチルウラシル置換1,2,4−トリアゾール、2−ピリジノン、5−ニトロインドール、3−ニトロピロール、5−メトキシウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸、5−メトキシカルボニルメチルウラシル、5−メチル−2−チオウラシル、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシル、5−メチルアミノメチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3カルボキシプロピル)ウラシル、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N−アセチルシトシン、2−チオシトシン、N6−メチルアデニン、N6−イソペンチルアデニン、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、N−メチルグアニン、またはO−アルキル化塩基を含む、H、(すなわち、非塩基ヌクレオチド)、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ハイポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、2−アミノアデニン、6−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、5−ハロウラシル、5−(2−アミノプロピル)ウラシル、5−アミノアリルウラシル、8−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−トリフルオロメチルならびに他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニン、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジンおよびN−2、N−6およびO−6置換プリンである。
Xは5〜100であるか、または本願に記載のオリゴヌクレオチド剤の長さに適合するように選択される。gは0〜2である。
ヌクレアーゼ耐性モノマー
本願に記載のモノマーおよび方法を用いて、ヌクレアーゼ耐性モノマー(NRM)を組み込んだオリゴヌクレオチド剤を調製することができる。
オリゴヌクレオチド剤は、例えば対象の体に見られるヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによって分解を抑制するように修飾されたモノマーを含むことができる。これらのモノマーは、本願においてはNRM、またはヌクレアーゼ耐性促進モノマーまたは修飾と呼ばれる。多くの場合、これらの修飾はオリゴヌクレオチド剤の他の特性、例えばタンパク質、例えば輸送タンパク質、例えば血清アルブミン、またはRISC(RNA誘導サイレンシング混成物)のメンバーと相互作用する能力、あるいは相互に2本鎖を形成するか、または別の配列、例えば標的分子と2本鎖を形成する第1および第2の配列の能力も調節する。
理論によって拘束しようとするものではないが、オリゴヌクレオチド剤において糖、塩基および/またはリン酸骨格を修飾すれば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ耐性を増強することができ、輸送タンパク質およびRISC混成物の機能成分の1つまたは複数の相互作用を増強することができると考えられる。好適な修飾は、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ耐性を増大させ、故にRISC混成物と相互作用する前のオリゴヌクレオチド剤の半減期を引き延ばすが、同時にRISC混成物においてはエンドヌクレアーゼ活性に対する耐性をオリゴヌクレオチド剤に与えない修飾である。また、理論によって拘束しようとするものではないが、オリゴヌクレオチド剤の3’および/または5’末端あるいはその近傍に修飾を配置すれば、上で示した好適なヌクレアーゼ耐性基準を満たす薬剤を得ることができると考えられる。
上で示した好適なヌクレアーゼ耐性基準を満たすオリゴヌクレオチド剤を生成するのに有用であり得る修飾には、以下の糖、塩基および/またはリン酸骨格の化学的および/または立体化学的修飾の1つまたは複数を含むことができる。
(i)キラル(S)チオエート。したがって、好適なNRMは、非結合位置、例えばSまたはRに、X位置(これは通常は酸素が占める位置である)にヘテロ原子を含んだ修飾リン酸基の純粋なキラル型が豊富であるか、該キラル型を有するヌクレオチド2量体を含む。Xの原子は、S、Se、NrまたはBrでもよい。XがSの場合、豊富であるか、キラル的に純粋なS結合が好ましい。「豊富な」とは好適な型の少なくとも70、80、90、95または99%を意味する。このようなNRMを以下で詳細に考察する。
(ii)リン酸または修飾リン酸骨格部分の糖、塩基および/またはリン原子への1つまたは複数のカチオン基の結合。したがって、好適なNRMは、カチオン基において誘導体化された末端位置にモノマーを含む。オリゴヌクレオチド剤の5’末端は末端−OHまたはリン酸基を有するべきであるので、このNRMは該オリゴヌクレオチド剤の5’末端において使用されないことが好ましい。該基はH結合形成およびハイブリダイゼーションの干渉を最小にする塩基上のある位置、例えば他の鎖上の相補的塩基と相互作用する面から離れた位置、例えばピリミジンの5’位置またはプリンの7位置に結合しているべきである。これらを以下で詳細に考察する。
(iii)末端の非リン酸結合。したがって、好適なNRMは、非リン酸結合、例えばリン酸結合が与えるよりも高い切断耐性を与える4個の原子の結合を含む。例には3’CH−NCH−O−CH−5’および3’CH−NH−(O=)−CH−5’が挙げられる。
(iv)3’架橋チオリン酸および5’架橋チオリン酸。したがって、好適なNRMはこれらの構造を含み得る。
(v)L−RNA、2’−5’結合、反転結合、a−ヌクレオシド。したがって、他の好適なNRMは:LヌクレオシドおよびL−ヌクレオシド由来の2量体ヌクレオチド;2’−5’リン酸、非リン酸および修飾リン酸結合(例えば、チオリン酸、ホスホルアミドエートおよびリン酸ホウソ);反転結合、例えば、3’−3’または5’−5’結合を含む2量体;糖上の1’位にα結合を有するモノマー、例えば、α結合を有する本明細書に記載の構造が挙げられる。
(vi)複合体基。したがって、好適なNRMは、例えば、ターゲティング部分または本願に記載の複合されたリガンド、例えば糖、塩基、または骨格を介して例えばモノマーと複合されたリガンドを含むことができる。
(vi)非塩基結合。したがって、好適なNRMは、非塩基モノマー、例えば、本明細書に記載のような非塩基モノマー(例えば、無核酸塩基(nucleobaseless)モノマー);本願に記載のような芳香族モノマーまたはヘテロ環またはポリヘテロ環芳香族モノマーを含むことができる。
(vii)5’−ホスホネートおよび5’リン酸プロドラッグ。したがって、好適なNRMはリン酸基の1つまたは複数の原子が保護基で誘導体化されたモノマーを好適には末端位置に、例えば5’位置に含む。該保護基または複数の保護基は対象の身体の成分、例えばカルボキシエステラーゼ、または対象の身体に存在する酵素の作用の結果除去される。例えば、カルボキシエステラーゼが保護された分子を切断し、その結果リン酸のOに隣接する炭素を攻撃するチオエートアニオンが生成され、またその結果脱保護されたリン酸が生成されるリン酸プロドラッグ。
1つまたは複数の異なるNRM修飾をあるオリゴヌクレオチド剤に、またはあるオリゴヌクレオチド剤の配列に導入することができる。ある配列またはあるオリゴヌクレオチド剤において、NRM修飾を2回以上用いることができる。いくつかのNRMはハイブリダイゼーションに干渉することから、組み込まれる総数は許容されるレベルのオリゴヌクレオチド剤/標的RNA2本鎖形成が維持されるようにすべきである。
キラルSチオエート
修飾には非結合(XおよびY)リン酸酸素の一方または両方および/または結合(WおよびZ)リン酸酸素の1つまたは複数を改変すること、例えば置換することを含むことができる。以下の式Xは、2つの糖/糖代替−塩基部分であるSBおよびSBを結合するリン酸部分を表す。
ある実施形態では、リン酸骨格部分(XおよびY)の非結合リン酸酸素の一つを、S、Se、BR(Rは水素、アルキル、アリール等)、C(すなわち、アルキル基、アリール基等)、H、NR(Rは水素、アルキル、アリール等)またはOR(Rはアルキルまたはアリール)のいずれか1つによって置換することができる。非修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。しかし、非結合酸素の一つを上記原子の1つまたは原子のグループと置換すれば、リン原子はキラルになる。言い換えれば、このように修飾したリン酸基のリン原子は立体中心である。立体中心であるリン原子は、「R」配置(ここではR)または「S」構成(ここではS)のいずれかを有することができる。したがって、立体中心リン原子の集団の60%がR配置を有する場合、立体中心リン原子の集団の残りの40%はS配置を有する。
いくつかの実施形態では、リン酸非結合酸素が別の原子または原子の集団によって置換されたリン酸基を有するオリゴヌクレオチド剤は、これらの原子の少なくとも約50%(例えば、これらの原子の少なくとも約60%、これらの原子の少なくとも約70%、これらの原子の少なくとも約80%、これらの原子の少なくとも約90%、これらの原子の少なくとも約95%、これらの原子の少なくとも約98%、これらの原子の少なくとも約99%)がS配置を有する立体中心リン原子の集団を含んでもよい。あるいは、リン酸非結合酸素が別の原子または原子の集団によって置換されたリン酸基を有するオリゴヌクレオチド剤は、これらの原子の少なくとも約50%(例えば、これらの原子の少なくとも約60%、これらの原子の少なくとも約70%、これらの原子の少なくとも約80%、これらの原子の少なくとも約90%、これらの原子の少なくとも約95%、これらの原子の少なくとも約98%、これらの原子の少なくとも約99%)がR配置を有する立体中心リン原子の集団を含んでもよい。他の実施形態では、立体中心リン原子の集団はS配置を有してよく、R配置を有する立体中心リン原子が実質的になくてもよい。さらに他の実施形態では、立体中心リン原子の集団はR配置を有してよく、S配置を有する立体中心リン原子が実質的になくてもよい。本願で用いられる場合、「R配置を有する立体中心リン原子が実質的にない」という句は、R配置を有する立体中心リン原子を含んだ部分を当該分野で知られた従来の方法(キラルHPLC、キラル・シフト試薬を用いたH NMR分析等)によって検出することができないということを意味する。本願で用いられる「S配置を有する立体中心リン原子が実質的にない」という句は、S配置を有する立体中心リン原子を含んだ部分を当該分野で知られた従来の方法(キラルHPLC、キラル・シフト試薬を用いたH NMR分析等)によって検出することができないということを意味する。
好適な一実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド剤はホスホロチオエート基、すなわち、リン酸非結合酸素が硫黄原子によって置換されたリン酸基を含む。特に好適な実施形態では、ホスホロチオエート立体中心リン原子の集団はS配置を有してもよく、R配置を有する立体中心リン原子が実質的になくてもよい。
2量体、例えば式X−1およびX−2を用いて、ホスホロチオエートをオリゴヌクレオチド剤に組み込むことができる。式X−1を用いて、ホスホロチオエートを
鎖の3’末端に導入することができ、式X−2を用いて、5’末端または該鎖のいずれかの末端から例えば1、2、3、4、5または6ヌクレオチドで生じる位置にこの修飾を導入することができる。上式では、Yは2−シアノエトキシでもよく、WおよびZはOでもよく、R2’は、例えばC−3内部配置を糖(例えば、OH、F、OCH)に付与することができる置換基でもよく、DMTはジメトキシトリチルであり、「BASE」は天然塩基、特異な塩基、または一般的な塩基でもよい。
X−1およびX−2を、キラル試薬、または結果的にR配置のみ(すなわち、実質的にS配置がない)またはS配置のみ(すなわち、実質的にR配置がない)を実質的に有する立体中心リン原子の集団を有するホスホロチオエートを含んだ2量体を得ることができる制御基を用いることによって調製することができる。あるいは、原子の約50%がR配置を有し原子の約50%がS配置を有する立体中心リン原子の集団を有する2量体を調製することができる。例えば、酵素分解および/または従来のクロマトグラフィー法を用いて、R配置を有する立体中心リン原子を有する2量体を同定し、S配置を有する立体中心リン原子を有する2量体から分離することができる。
カチオン基
修飾は、糖、塩基、および/またはリン酸のリン原子または修飾リン酸骨格部分に1つまたは複数のカチオン基に結合することも含むことができる。天然塩基、特異な塩基または一般的な塩基上で置換が可能な任意の原子にもカチオン基を結合することができる。好適な位置とは、ハイブリダイゼーションに干渉しない位置、すなわち塩基対合に必要な水素結合相互作用に干渉しない位置である。例えば糖のC2’位置または環状または非環状代替糖の類似する位置を介して、カチオン基を結合することができる。カチオン基には、例えば例えばO−AMINE(AMINE=NH;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)由来のプロトン化アミノ基;アミノアルコキシ、例えば、O(CHAMINE、(例えば、AMINE=NH;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ);アミノ(例えば、NH;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸);あるいはNH(CHCHNH)CHCH−AMINE(AMINE=NH;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ)が挙げられる。
非リン酸結合
修飾は、非リン酸結合をある鎖の5’および/または3’末端に組み込むことも含むことができる。リン酸基を置換し得る非リン酸結合の例には、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸塩、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。好適な置換基には、メチルホスホネートおよびヒドロキシルアミノ基が挙げられる。
3’架橋チオリン酸および5’架橋チオリン酸;固定された−RNA、2’−5’結合、反転結合、α−ヌクレオシド;複合体基;非塩基結合;および5’−ホスホネートおよび5’−リン酸プロドラッグも、オリゴヌクレオチド剤に含むことのできる結合である。
上式Xを参照すると、修飾はリン酸骨格部分(WおよびZ)の架橋および結合リン酸酸素の一方を置換することを含むことができる。XまたはYの一方のみが変えられた場合と異なり、ホスホロジチオエートのリン酸中心は、立体中心リン原子を含んだオリゴヌクレオチド剤の形成を排除するアキラルである。
修飾は、リン酸または修飾リン酸基により第1の糖の2’位置および第2の糖の5’位置を介して、2つの糖を結合させることも含むことができる。第1および第2の糖の両方の各々が個々の3’位置を介して結合された反転結合も意図される。修飾RNAは、C−1’に核酸塩基のない「非塩基」糖も含むことができる。該糖基は、対応するリボースの炭素の立体化学構成とは反対の立体化学構成を有する1つまたは複数の炭素も含むことができる。したがって、修飾オリゴヌクレオチド剤は、糖として例えばアラビノースを含んだヌクレオチドを含むことができる。この修飾の別のサブセットでは、天然塩基、特異な塩基、または一般的な塩基はα配置を有することができる。修飾はL−RNAも含むことができる。
修飾は、5’−ホスホネート、例えばP(O)(O−X−C5’−糖(X=CH、CF2、CHF)および5’−リン酸プロドラッグ、例えばP(O)[OCHCHSC(O)R]CHCC5’−糖も含むことができる。後者の場合、該プロドラッグ基は、最初にカルボキシエステラーゼとの反応により分解可能である。分子内S2の移動を介した残りのエチルチオラート基は、エピスルフィドとして出発して誘導体化されていないリン酸基を与えることができる。
修飾は、複合に利用可能な任意のアミノ基も介してオリゴヌクレオチド剤に結合していることが好ましい、本願の別の場所に記載の複合体基を付加することも含むことができる。
ヌクレアーゼ耐性の修飾は、末端にのみ配置することのできる修飾および任意の場所にも可能な他の修飾を含む。一般に、これらの修飾はハイブリダイゼーションを抑制することができることから、末端領域のみにそのような修飾を用いることが好ましく、配列の切断部位または切断領域にはそのような修飾を用いないことが好ましい。
エンドヌクレアーゼ切断に干渉するか、それを抑制する修飾は、RISC媒介性の切断を受け易いオリゴヌクレオチド剤の領域、例えば切断部位または切断領域に挿入されるべきである。本願で用いる場合、切断部位とは、標的上の切断部位のいずれかの側にあるヌクレオチド、またはそれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド剤鎖上のヌクレオチドを指す。切断領域とは、いずれかの方向での切断部位の1、2または3ヌクレオチドのヌクレオチドを意味する。
このような修飾は、末端領域、例えば末端位置あるいは末端の2、3、4または5位置に導入することができる。
オリゴヌクレオチド剤は以下を含むことができる。
3’末端または3’末端から1、2、3、4、5または6位置以内でのNMR修飾、
5’末端または5’末端から1、2、3、4、5または6位置以内でのNMR修飾(5’末端NRM修飾は選択的にはその末端ではなく、むしろオリゴヌクレオチド剤の5’末端から位置1、2、3、4、5または6離れている。)、
3’末端または3’末端から1、2、3、4、5または6位置以内であり、5’末端または5’末端から1、2、3、4、5または6位置以内にNMR修飾を有するNMR修飾、
切断部位または切断領域におけるNRM修飾、
切断部位または切断領域におけるNRM修飾であり、NRM修飾の1つまたは複数は3’末端または3’末端から1、2、3、4、5または6位置以内であるか、NRM修飾が5’末端または5’末端から1、2、3、4、5または6位置以内であるか、NRM修飾が3’および5’末端または3’および5’末端から1、2、3、4、5または6位置以内である(5’末端NRM修飾は選択的にはその末端ではなく、むしろオリゴヌクレオチド剤の5’末端から位置1、2、3、4、5または6離れている。)。
リボース模倣体
本願に記載のモノマーおよび方法を用いて、リボース模倣体を組み込んだオリゴヌクレオチド剤を調製することができる。
したがって、本発明の一態様は、効果を増大させおよび/またはヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチド剤に与え得る2級ヒドロキシル基を含んだオリゴヌクレオチド剤を特徴とする。ヌクレアーゼ、例えば細胞ヌクレアーゼは核酸−リン酸ジエステル結合を加水分解し、その結果、核酸の部分的または完全な分解を生じることができる。該2級ヒドロキシ基は、修飾のないオリゴヌクレオチド剤に対してオリゴヌクレオチド剤をヌクレアーゼ分解されにくくすることによって、ヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチド剤に与える。理論によって拘束しようとするものではないが、オリゴヌクレオチド剤上に2級ヒドロキシル基が存在することにより、3’リボースヒドロキシル基の構造上の模倣体として働き、これによって、オリゴヌクレオチド剤を分解されにくくすることができると考えられる。
2級ヒドロキシル基とは、「2つの他の炭素および水素によって置換された炭素原子に結合したOH」基を指す。上記のようなヌクレアーゼ耐性を付与する2級ヒドロキシル基は、任意の非環式炭素含有基の一部でもよい。該ヒドロキシルは任意の環式炭素含有基の一部でもよく、以下の条件の1つまたは複数を満たすことが好ましい。(1)ヒドロキシル基と末端リン酸基との間にリボース部分が存在しないか、または(2)ヒドロキシル基は塩基に結合した糖部分上にはない。該ヒドロキシル基は、オリゴヌクレオチド剤の末端リン酸基から少なくとも結合数2個(例えば、少なくとも結合数3個、少なくとも結合数4個、少なくとも結合数5個、少なくとも結合数6個、少なくとも結合数7個、少なくとも結合数8個、少なくとも結合数9個、少なくとも結合数10個等離れている)離れて位置する。好適な実施形態では、末端リン酸基と2級ヒドロキシル基との間に結合数が5個存在する。
末端リン酸基のリンと2級ヒドロキシル基との間に介在する結合が5個ある好適なオリゴヌクレオチド剤送達モジュールは、以下の構造を有する(以下の式Yを参照)。
式Yを参照すると、Aは本願に記載の任意のオリゴヌクレオチド剤を含むオリゴヌクレオチド剤である。該オリゴヌクレオチド剤は直接または間接的(例えば、スペーサまたはリンカーを介して)にリン酸基の「W」に連結されてよい。これらのスペーサまたはリンカーには、例えば−(CH−、−(CHN−、−(CHO−、−(CHS−、O(CHCHO)CHCHOH(例えば、n=3または6)、非塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノ、あるいはビオチンおよびフルオレセイン試薬が挙げられる。
該オリゴヌクレオチド剤は、非修飾(例えばW、X、YおよびZはOである。)または修飾された末端リン酸基を有することができる。修飾リン酸基では、WおよびZは独立してNH、OまたはSでよく;XおよびYは独立してS、Se、BH 、C〜Cアルキル、C〜C10アリール、H、O、O、アルコキシまたはアミノ(アルキルアミノ、アリールアミノ等を含む)でもよい。W、XおよびZはOであり、YはSであることが好ましい。
およびRは各々独立して、水素;またはヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸で任意に置換されたC〜C100アルキルであり、および/またはN、O、S、アルケニルまたはアルキニルが任意に挿入されてもよい。
は水素;ヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸で任意に置換されたC〜C100アルキルであり、および/またはN、O、S、アルケニルまたはアルキニルが任意に挿入されてよく;あるいはnが1のとき、RはRまたはRと一緒になって5〜12個の原子の環を形成してもよい。
は水素;ヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸で任意に置換されたC〜C100アルキルであり、および/またはN、O、S、アルケニルまたはアルキニルが任意に挿入されてよく;あるいはnが1のとき、RはRまたはRと一緒になって5〜12個の原子の環を形成してもよい。
は水素またはヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸で任意に置換されたC〜C100アルキルであり、および/またはN、O、S、アルケニルまたはアルキニルが任意に挿入されてよく;あるいはnが1のとき、RはRと一緒になって5〜12個の原子の環を形成してよい。
は水素またはヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸で任意に置換されたC〜C100アルキルであり、および/またはN、O、S、アルケニルまたはアルキニルが任意に挿入されてよく;あるいはnが1のとき、RはRと一緒になって6〜10個の原子の環を形成してよい。
は水素、C〜C100アルキル、またはC(O)(CHC(O)NHR;Tは水素または官能基;nおよびqは各々独立して1〜100である。RはC〜C10アルキルまたはC〜C10アリールである。Rは水素、C〜C10アルキル、C〜C10アリールまたは固体支持剤である。
好適な実施形態は、オリゴヌクレオチド剤送達モジュールの以下のサブセットの1つまたは複数を含むことができる。
オリゴヌクレオチド剤送達モジュールの1サブセットでは、Aは直接的または間接的にオリゴヌクレオチド剤の末端3’または5’リボース糖炭素を介して連結されることができる
オリゴヌクレオチド剤送達モジュールの別のサブセットでは、X、WおよびZはOであり、YはSである。
オリゴヌクレオチド剤送達モジュールのさらに他のサブセットでは、nは1であり、RおよびRは一緒になって6個の原子を含んだ環を形成し、RおよびRは一緒になって6個の原子を含んだ環を形成する。該環系はトランス−デカリンであることが好ましい。例えば、このサブセットのオリゴヌクレオチド剤送達モジュールは、式(Y−1)の化合物を含むことができる。
該官能基は、例えばターゲティング基(例えば、ステロイドまたは糖質)、レポーター基(例えば、フルオロフォア)または標識基(同位体で標識された部分)でもよい。該ターゲティング基は、タンパク質結合剤、内皮細胞ターゲティング基(例えば、RGDペプチドおよび模倣剤)、癌細胞ターゲティング基(例えば、葉酸ビタミンB12、ビオチン)、骨細胞ターゲティング基(例えば、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸)、(例えば、マクロファージ試験のための)多価マンノース、ラクトース、ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、モノクローナル抗体、糖タンパク質、レクチン、メラノトロピンまたは甲状腺刺激ホルモンをさらに含むことができる。
当業者には理解されるように、本願の式の化合物を合成する方法は当業者には明白となろう。合成された化合物を反応混合物から分離し、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは再結晶化などの方法によってさらに精製することができる。また、種々の合成工程を交互の順序または順番で実施して、所望の化合物を得ることができる。本願に記載の化合物を合成するのに有用な合成化学の変形および保護基法(保護および脱保護)は当該分野では知られており、例えばアール.ラロック(R.Larock)、Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989年);ティー.ダブリュー.グリーンとピー.ジー.エム.ウッツ(T.W.Greene and P.G.M.Wuts)、Protective Groups in Organic Synthesis,2d.Ed.,John Wiley and Sons(1991年);エル.フィーザーとエム.フィーザー(L.Fieser and M.Fieser)、Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994年);およびエル.パケット編集(L.Paquette,ed)、Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995年)、およびこの次の版に記載されたようなものを含む。
送達モジュール
本願に記載のモノマーおよび方法を用いて、薬物送達複合またはモジュールとともに用いることができるオリゴヌクレオチド剤、例えば本願に記載の複合化オリゴヌクレオチド剤を調製することができる。
該オリゴヌクレオチド剤を、モジュール混成物を特徴とする送達剤に混成することができる。該混成物は、以下の1つまたは複数(そのうちの2つ以上が好ましく、3つ全部がより好ましい)に結合した担体剤を含むことができる、(a)縮合剤(例えば引き付けることが可能な、例えばイオン相互作用または静電相互作用を介して、例えば核酸を結合することが可能な剤);(b)膜融合剤(例えば細胞膜、例えばエンドソーム膜を融合することが可能な、および/または細胞膜、例えばエンドソーム膜を介して輸送されることが可能な剤)、および(c)ターゲティング基、例えば腎細胞などの指定された細胞型に結合する、細胞または組織ターゲティング剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば抗体。
オリゴヌクレオチド剤をモジュール混成物に連結、例えばカップリングまたは結合させることができる。該オリゴヌクレオチド剤は混成物の縮合剤と相互作用することができ、該混成物を用いて、例えばインビトロまたはインビボの細胞にオリゴヌクレオチド剤送達させることができる。例えば、該混成物を用いてオリゴヌクレオチド剤を、それを必要とする対象、例えば疾患または障害のある対象に送達させることができる。
該膜融合剤および該縮合剤は異なった剤でもよいし、同一の剤でもよい。例えばポリアミノ鎖、例えばポリエチレンイミン(PEI)は、膜融合剤および/または縮合剤でもよい。
該送達剤はモジュール混成物でもよい。例えば、該混成物は、以下の1つまたは複数の(好適には、以下の2つ以上、より好適には3つ全部の)担体剤を含むことができる。
(a)縮合剤(例えば例えばイオン相互作用を介して、核酸を引き付けることのできる、例えば核酸を結合することのできる剤)、
(b)膜融合剤(例えば細胞膜、例えばエンドソーム膜を融合することが可能な、剤および/または細胞膜、例えばエンドソーム膜を介して輸送されることが可能な剤)、
(c)腎細胞などの指定の細胞型に結合する、ターゲティング基、例えば細胞または組織ターゲティング剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば抗体。ターゲティング基は甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタント・タンパク質A、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンB12、ビオチン、ネプロキシン、またはRGDペプチドまたはRGDペプチド模倣体。
担体剤
本願に記載のモジュール混成物の担体剤は、縮合剤、膜融合剤およびターゲティング基の1つまたは複数を結合するための基質でもよい。該担体剤には内在性酵素活性がないことが好ましいであろう。該担体剤は生体分子であることが好ましく、高分子が好ましいであろう。ポリマー性の生物学的担体が好ましい。該担体分子は生分解性であることも好ましいであろう。
該担体剤は、タンパク質(例えばヒト血清アルブミン(HSA)、低密度リポタンパク質(LDL)またはグロブリン);糖質(例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸);または脂質などの天然物質でもよい。該担体分子は、組換え型分子または合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸などの合成分子でもよい。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン(PLL)、ポリL−アスパラギン酸、ポリL−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ(L−ラクチド−コ−グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2−メチルアクリル酸)、N−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。他の有用な担体分子は、一般的方法によって同定可能である。
担体剤は、以下の1つまたは複数によって特徴付けられることができる。(a)大きさが少なくとも1ダルトンである;(b)少なくとも5個の荷電基、好適には5〜5000個の荷電基を有する;(c)担体剤対膜融合剤の比が少なくとも1:1で混成物中に存在する;(d)担体剤対縮合剤の比が少なくとも1:1で混成物中に存在する;(e)担体剤対ターゲティング剤の比が少なくとも1:1で混成物中に存在する。
膜融合剤
本願に記載のモジュール混成物の膜融合剤は、例えばpH環境に応じた荷電の変化に反応する剤でもよい。あるエンドソームのpHに遭遇すると、膜融合剤は物理的変化、例えばエンドソーム膜の浸透性を破壊または増大する浸透圧特性の変化を生ずることができる。該膜融合剤は、生理学的範囲未満のpHで電荷を変化させる、例えばプロトン化されることが好ましい。例えば、該膜融合剤をpH4.5〜6.5でプロトン化することができる。該膜融合剤は、細胞による例えばエンドサイトーシスによって混成物が取り込まれた後で、細胞の細胞質にオリゴヌクレオチド剤を放出するように働き、これによってオリゴヌクレオチド剤の細胞内濃度をその細胞内で増大させることができる。
一実施形態では、該膜融合剤は指定の特定のpH範囲に曝露されたときに、例えば荷電、例えばプロトン化イオンの変化を受ける部分、例えばアミノ基を有することができる。該膜融合剤の電荷の変化が、小胞、例えばエンドサイトーシス小胞、例えばエンドソームにおいて変化、例えば浸透圧変化を引き起こすことができる。例えば、該膜融合剤は、あるエンドソームのpH環境に曝露されると、エンドソーム膜の多孔性を増大させる(好適には破裂させる)のに実質的に十分な溶解性変化または浸透圧変化を生ずることができる。
該膜融合剤は、ポリマー、好適にはポリアミノ鎖、例えばポリエチレンイミン(PEI)でもよい。このPEIは直鎖、分鎖、合成または天然でもよい。該PEIは、例えばアルキル置換PEI、または脂質置換PELでもよい。
他の実施形態では、該膜融合剤はポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチン、またはポリアセタール物質、例えば、カチオン性ポリアセタールでもよい。いくつかの実施形態では、該膜融合剤はアルファヘリックス構造を有することができる。該膜融合剤は膜破壊剤、例えばメリチンでもよい。
膜融合剤は、以下の特徴の1つまたは複数を有することができる。(a)大きさが少なくとも1ダルトンである;(b)少なくとも10個の荷電基、好適には10〜5000個の荷電基、さらに好適には50〜1000個の荷電基を有する;(c)膜融合剤対担体剤の比が少なくとも1:1で混成物中に存在する;(d)膜融合剤対縮合剤の比が少なくとも1:1で混成物中に存在する;(e)少なくとも1:1膜融合剤対ターゲティング剤の比が少なくとも1:1で混成物中に存在する。
他の適した膜融合剤は、当業者によって試験および同定されることができる。例えば、pH環境に応じた荷電の変化に反応するある化合物の能力を、例えば細胞アッセイにおいて一般的方法によって試験することができる。例えば、ある試験化合物をある細胞と合わせ、または接触させ、例えばエンドサイトーシスによって該細胞に試験化合物を取り込ませる。次いで、エンドソーム調製物を該接触させた細胞から作製し、該エンドソーム調製物を対照細胞からのエンドソーム調製物と比較することができる。変化、例えば接触させた細胞対対照細胞からのエンドソーム断片が低減している場合、試験化合物が膜融合剤として機能することができることを示す。あるいは、接触させた細胞および対照細胞を、例えば顕微鏡、例えば光学顕微鏡または電子顕微鏡によって評価して、細胞中のエンドソーム数の差を決定することができる。試験化合物を標識することができる。別のタイプのアッセイでは、本願に記載のモジュール混成物は、1つまたは複数の試験膜融合剤または推定の膜融合剤を用いて作製される。該モジュール混成物は、オリゴヌクレオチドの代わりに標識核酸を用いて作製することができる。モジュール混成物が細胞によって取り込まれると、例えばpH環境に応じた荷電の変化に反応する膜融合剤の能力を、例えば上記のような、エンドソーム調製物の調製によって、または顕微鏡技術によって評価することができる。2ステップ・アッセイを実施することもできる。このアッセイでは、第1のアッセイが、例えば、pH環境に応じた荷電の変化に反応する試験化合物のみの能力を評価し、第2のアッセイが、例えば、pH環境に応じた荷電の変化に反応する試験化合物を含んだモジュール混成物の能力を評価する。
縮合剤
本願に記載のモジュール混成物の縮合剤はオリゴヌクレオチド剤と相互作用(例えば、引き付け、保持または結合する)し、(a)縮合、例えばオリゴヌクレオチド剤の大きさ、または電荷を低減させ、および/または(b)オリゴヌクレオチド剤を保護するように、例えば分解に対してオリゴヌクレオチド剤を保護するように働くことができる。該縮合剤は、例えばイオン相互作用によって核酸、例えばオリゴヌクレオチド剤と相互作用することができる部分、例えば荷電部分を含むことができる。該縮合剤は、荷電ポリマー、例えばポリカチオン鎖であることが好ましいであろう。該縮合剤は、ポリリシン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスペプチドでもよい。
縮合剤は以下の特徴を有することができる。(a)大きさが少なくとも1ダルトンである、(b)少なくとも2個の荷電基、好適には2〜100個の荷電基を有し、(c)縮合剤対担体剤の比が少なくとも1:1で混成物中に存在し、(d)縮合剤対膜融合剤の比が少なくとも1:1で混成物中に存在し、(e)縮合剤対ターゲティング剤の比が少なくとも1:1で混成物中に存在する。
他の適した縮合剤は、例えば核酸、例えばオリゴヌクレオチド剤と相互作用する試験剤の能力を評価することによって、当業者によって試験および同定されることができる。核酸、例えばオリゴヌクレオチド剤と相互作用する試験剤の能力、例えばオリゴヌクレオチド剤を縮合または保護する試験剤の能力を、一般的な方法によって評価することができる。アッセイでは、ある試験剤を核酸と接触させ、分子量および/または分子電荷の変化を検出するのに適した技術によって、この接触させた核酸の大きさおよび/または電荷を評価する。このような技術には、非変性ゲル電気泳動、免疫学的方法、例えば免疫沈殿法、ゲル濾過、イオン相互作用クロマトグラフィー等が挙げられる。対照と比較して接触させた核酸の質量および/または電荷(好適には両方)を変化させた場合には、試験剤は縮合剤であると同定される。2ステップ・アッセイを用いることもできる。このアッセイでは、第1のアッセイが核酸と相互作用し、例えば核酸に結合し、例えば核酸の電荷および/または質量を減少させる試験化合物のみの能力を評価し、第2のアッセイが、核酸と相互作用し、例えば核酸に結合し、例えば核酸の電荷および/または質量を減少させる、該試験化合物を含んだモジュール混成物の能力を評価する。
両親媒性送達剤
本願に記載のオリゴヌクレオチド剤は、本願に記載のもの、および2003年3月13日出願の同一譲受人の同時係属米国特許仮出願シリアル番号第60/455050号および2004年3月8日出願の国際出願シリアル番号第PCT/US04/07070号に記載のものなどの両親媒性送達複合体またはモジュールとともに用いることができる。これらを本願に援用する。
オリゴヌクレオチド製品
オリゴヌクレオチド剤は種々の方法によって、例えば大量製造可能である。例示的方法は、有機合成およびRNA切断、例えばインビトロでの切断を含む。
有機合成
大型のバイオリアクタ、例えばファルマシア バイオテック エービー社(Pharmacia Biotec AB)[スウェーデン、ウプサラ(Uppsala)所在]からのOligoPilot IIを用いて、大量のオリゴヌクレオチド剤を製造することができる。このOligoPilot IIリアクタは、1.5モルだけ過剰なホスホルアミダイトヌクレオチドを用いてヌクレオチドを効果的にカップリングすることができる。RNA鎖を作製するために、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。標準的周期でモノマーを添加して、オリゴヌクレオチド剤を合成することができる。
有機合成を用いて別個のオリゴヌクレオチド剤種を生成することができる。特定の標的遺伝子に対する該種の相補性が正確に指定されることができる。例えば、該種は多型、例えば単一ヌクレオチド多型を含んだ領域に対して相補的でもよい。さらに、該多型の場所を正確に定めることができる。いくつかの実施形態では、多型は内部領域、例えば末端の一方または両方から少なくとも4、5、7または9ヌクレオチドに位置する。
オリゴヌクレオチド剤調製物を、製剤に適した溶液(例えば、水溶液および/または有機溶液)で調製することができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤調製物を二重蒸留した純水中で沈殿、再溶解させ、凍結乾燥させることができる。次いで、この乾燥させたオリゴヌクレオチド剤を、意図する製剤工程に適した溶液中に再懸濁させることができる。
修飾オリゴヌクレオチド剤および代替ヌクレオチドオリゴヌクレオチド剤の合成を以下で考察する。
製剤
本願に記載のオリゴヌクレオチド剤は、対象に投与するために配合されることができる。
わかり易いように、このセクションの製剤、組成物および方法は、主に非修飾オリゴヌクレオチド剤に関して考察する。しかし、これらの製剤、組成物および方法を、他のオリゴヌクレオチド剤、例えば修飾オリゴヌクレオチド剤を用いて実施することができ、このような実施は本発明の範囲内にあることを理解されたい。
配合されたオリゴヌクレオチド剤組成物は、種々の状態を取ることができる。いくつかの例では、該組成物は少なくとも部分的に結晶質、均一に結晶質、および/または無水(例えば、水が80、50、30、20または10%未満)である。別の例では、該オリゴヌクレオチド剤は、例えば水を含んだ溶液中で水相である。
この水相または結晶組成物は、例えば送達ビヒクル、例えば(特に水相用の)リポソームまたは粒子(例えば、結晶組成物に適し得るような微粒子)に組み込まれることができる。一般に、該オリゴヌクレオチド剤組成物は、意図する投与方法に適合する様式で配合される(以下参照)。
特定の実施形態では、該組成物は以下の方法の少なくとも1つによって調製される:噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、またはこれらの技術の組合せ;あるいは脂質を用いた超音波処理、凍結乾燥、濃縮、および他の自己集合。
オリゴヌクレオチド剤調製物は、別の剤、例えば別の治療剤またはオリゴヌクレオチド剤を安定させる別の剤、例えばオリゴヌクレオチド剤と混成するタンパク質と組み合わせて配合されることができる。さらに他の剤としては、キレート剤、例えば(例えば、Mg2+などの二価陽イオンを除去するための)EDTA、塩、RNAse阻害剤(例えば、RNAsinなどの、広い特異性を有するRNAse阻害剤)等が挙げられる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤調製物としては、第2のオリゴヌクレオチド剤、例えば第2の遺伝子に対してまたは同じ遺伝子に対して遺伝子発現を調節することができる第2のオリゴヌクレオチド剤が挙げられる。さらに他の調製物は、少なくとも3、5、10、20、50または100種以上の異なったオリゴヌクレオチド剤種を含むことができる。このようなオリゴヌクレオチド剤は、同様の数の遺伝子に対して遺伝子発現を調節することができる。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤調製物は、少なくとも第2の治療剤(例えば、RNAまたはDNA以外の剤)を含む。例えばウイルス性疾患、例えばHIVの治療のためのオリゴヌクレオチド剤組成物は、知られた抗ウイルス剤(例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害薬)を含んでもよい。別の例では、癌治療用のオリゴヌクレオチド剤組成物は、化学療法をさらに含んでもよい。
本願に記載のオリゴヌクレオチド剤は、膜性の分子集合、例えばリポソームまたはミセルにおいて送達するために配合されることができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤を含む調製物は、界面活性剤を含んだ乳剤として配合されることができる。
ターゲティング
わかり易いように、このセクションの製剤、組成物および方法は、主に非修飾オリゴヌクレオチド剤に関して考察する。しかし、これらの製剤、組成物および方法を、他のオリゴヌクレオチド剤、例えば修飾オリゴヌクレオチド剤を用いて実施することができ、このような実施は本発明の範囲内にあることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド剤、またはオリゴヌクレオチド剤をコードするDNA、あるいはそれらの前駆物質は、特定の細胞をターゲティングする。例えば、オリゴヌクレオチド剤を含んだリポソームまたは粒子あるいは他の構造は、標的細胞上の特定の分子を認識するターゲティング部分も含むことができる。該ターゲティング部分は、ある標的細胞に対する特異的親和性を有する分子でもよい。ターゲティング部分には、標的細胞の表面に見られるタンパク質に向けられた抗体、あるいはリガンドまたは標的細胞の表面に見られる分子のリガンドの受容体結合部分を含むことができる。例えば、該ターゲティング部分は腎臓の癌特異的抗原(例えば、G250、CA15−3、CAl9−9、CEA、またはHER2/neu)またはウイルス抗原を認識し、これによってオリゴヌクレオチド剤を癌細胞またはウイルス感染した細胞に送達することができる。例示的なターゲティング部分は、抗体(IgM、IgG、IgA、IgD等、またはそれらの機能部分など)、細胞表面受容体のリガンド(例えば、それらの細胞外ドメイン)を含む。
表6は腎臓以外の組織にオリゴヌクレオチド剤をターゲティングすることが望ましい場合など、オリゴヌクレオチド剤を選択された細胞にターゲティングするのに用いることのできる多数の抗原を提供する。
一実施形態では、該ターゲティング部分はリポソームに結合している。例えば、米国特許第6245427号明細書は、タンパク質またはペプチドを用いてリポソームをターゲティングする方法を記載している。別の例では、リポソームのカチオン性脂質成分はターゲティング部分で誘導体化される。例えば、国際特許出願公開公報第96/37194号パンフレットは、N−グルタリルジオレオイルホスファチジルエタノールアミンをN−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルに転換する方法を記載している。次いで、該製剤をRGDペプチドにカップリングさせた。
腎臓へのターゲティング
腎臓は遺伝子発現の重要な部位である。本発明の諸態様は、例えば、腎臓に関連する疾患を治療するための腎臓に発現するサイレンシング遺伝子に関する。したがって、本発明は、オリゴヌクレオチド剤を腎臓に送達するため組成物および方法を含む。本発明はオリゴヌクレオチド剤の腎臓への送達を最小化する組成物および方法も含む。
本発明のオリゴヌクレオチド剤組成物は、腎臓に有利に分布を改変するように修飾されたものでもよい。本発明の組成物は、オリゴヌクレオチド剤、例えば、本願に記載のオリゴヌクレオチド剤を含む。
本発明の一態様は腎疾患を有するか、腎疾患を有するリスクのあるヒトを治療する方法を提供する。該治療方法はオリゴヌクレオチド剤をヒトに投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチド剤は核酸、例えば腎臓に発現したRNAをターゲティングする。一実施形態では、ヒトは、腎臓における核酸の発現の増大または好ましくない発現、例えば遺伝子発現レベルの増大またはRNAレベルの増大を特徴とする障害に罹患する。好ましくない発現レベルは、RANTES、MCPlまたはオステオポンチンなどのケモカインをコードする遺伝子;または補体因子をコードする遺伝子または成長因子(例えば、形質転換成長因子−β(TGFβ)、血小板由来成長因子(PDGF)、IGF−1、IGF−2または血管内皮細胞成長因子(VEGF))に相当することができる。別の実施形態では、該遺伝子はIL1αまたはTNFαなどの炎症性サイトカイン;線維形成サイトカイン;アンジオテンシンIIまたはET1などの血管作動性タンパク質;あるいはKDR(VEGF受容体)、上皮細胞増殖因子受容体または線維芽細胞増殖因子受容体などの成長因子受容体をコードすることができる。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は腎臓に発現したmiRNAをターゲティングする。別の実施形態では、ヒトは腎臓におけるmiRNAの過剰発現または蓄積または腎臓に発現したmiRNAの標的である核酸の発現の減少が特徴である障害に罹患する。該対象または該対象の腎細胞にオリゴヌクレオチド剤を投与すれば、オリゴヌクレオチド剤を標的miRNAと対にすることができ、続いてmiRNAを下方調節することができる。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は腎組織に通常発現するmiRNAと実質的に同一であり、別の実施形態では、ヒトは腎臓におけるmiRNAの発現の減少が特徴である障害に罹患する。オリゴヌクレオチド剤を対象に、または腎細胞に投与すれば、下方調節されたmiRNAの機能が少なくとも部分的に救済される。
一実施形態では、ヒトは腎血管性高血圧、尿管閉鎖、糖尿病、糖尿病性ネフロパシー、糸球体硬化、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、HIV関連ネフロパシー、腎線維症、タンパク尿、腎癌、ファンコーニ症候群またはバーター症候群を有するか、または有するリスクがある。別の実施形態では、腎臓をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤をショック状態の対象に投与するか、または該オリゴヌクレオチド剤を腎移植の前、間および/または後に投与することができる。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、TGFβなどの成長因子または成長因子受容体をターゲティングし、ヒトは、糖尿病性ネフロパシー、進行性腎疾患、慢性組織損傷または糸球体硬化症を有するか、またはそのリスクがある。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はTGFβなどの成長因子をターゲティングし、ヒトは腎移植を受けたか、受ける予定であるか、あるいは腎移植の候補であるとみなされている。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はPDGFをターゲティングし、ヒトは腎移植を受けたか、受ける予定であるか、あるいは腎移植の候補であるとみなされている。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はアンジオテンシンIIなどの血管収縮またはアンジオテンシン受容体Iなどの血管収縮受容体をターゲティングし、ヒトはアンジオテンシンII依存性高血圧症またはII型糖尿病を有するか、またはそれを有するリスクがあるか、あるいはヒトは高血糖性状態である。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はエンドセリン−1(ET−1)などの血管収縮剤またはETAまたはETBなどのET−1受容体をターゲティングし、ヒトは常染色体優性多発性嚢胞腎疾患および/または慢性腎疾患を有するか、またはそれを有するリスクがある。例えば、ヒトは常染色体優性多発性嚢胞腎疾患を有する可能性があり、一実施形態では、該患者の状態は慢性腎疾患へ進行している。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、リガンド活性化転写因子、例えば核ホルモン受容体ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体(PPAR)などの転写因子をターゲティングし、ヒトは糖尿病性ネフロパシー、腎腫瘍または糸球体硬化症を有するか、またはそれを有するリスクがある。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はPPAR−α、PPAR−β/δまたはPPAR−γをターゲティングする。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はIGF受容体(例えばIGFR1)などの成長因子受容体、VEGF受容体KDR、上皮成長因子受容体、または線維芽細胞成長因子受容体をターゲティングし、ヒトは腎細胞癌、糖尿病性ネフロパシー、腎肥大、糸球体肥大、尿アルブミン排泄量低下および/または糖尿病を有するか、または有するリスクがある。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は副刺激分子、例えばB7−1、B7−2、ICOS、CD40および/またはCD154をターゲティングし、ヒトは自己免疫疾患または移植片拒絶反応を有するか、または有するリスクがある。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はMCP−1、RANTESおよび/またはオステオポンチンなどのケモカインをターゲティングし、ヒトは全身性高血圧、腎実質損傷、腎同種移植の急性または慢性拒絶、慢性酸素欠乏誘発性高血圧症を有するか、またはそれを有するリスクがある。
本発明の一態様は、補体因子C3、C4、C5またはBなどの補体成分をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤を提供する。補体成分をターゲティングするオリゴヌクレオチドは、例えば免疫応答を阻害することが望ましいであろう。
一態様では、本発明はオリゴヌクレオチド剤を対象、例えばマウスまたはヒトなどの哺乳類対象の腎臓に送達する方法を提供する。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤を細胞または腎臓の糸球体の細胞、例えば糸球体内皮細胞、糸球体上皮細胞、メサンギウム細胞等に送達することができ、および/または該オリゴヌクレオチド剤を腎臓の近位尿細管細胞に送達することができる。例えば、ショック、尿管閉鎖、糖尿病、タンパク尿、腎癌、またはファンコーニ症候群またはバーター症候群などの尿細管異常疾患の治療のために、オリゴヌクレオチド剤を腎臓の近位尿細管細胞に送達することができる。腎移植患者の治療に向けられたオリゴヌクレオチド剤を、腎臓の近位尿細管細胞に向けることもできる。一実施形態では、腎臓の近位尿細管細胞に向けられたオリゴヌクレオチドは、さらに間質および下流の他の細胞まで送達される。オリゴヌクレオチド剤は腎内の標的部位において標的遺伝子を沈静することが好ましい。
腎臓、例えば腎臓の近位尿細管細胞に送達されるオリゴヌクレオチド剤は、非修飾オリゴヌクレオチド剤でもよい。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤はホスホジエステル結合により安定化されることができる。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤の3’末端を、カチオン基、例えばアルキルアミン(2’O−アルキルアミンなど)、ポリアミン、カチオン性ペプチドまたはカチオン性アミノ酸によって修飾することができる。該修飾は外部または末端カチオン性残基でもよい。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤を、糖、例えば、複合糖質またはアルキルグリコシド成分、例えばグルコース、マンノース、2−デオキシ−グルコース、またはそれらの類似体で修飾することができる。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、酵素基質、例えば身体の他の組織の酵素レベルに比して関連の酵素が高い量で存在するための基質に複合することができる。例えば、該オリゴヌクレオチド剤は、γ−グルタミルトランスフェラーゼまたはn−アセチル−γ−グルタミルトランスフェラーゼの基質に複合することができる。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、葉酸または葉酸誘導体、例えば、γ−葉酸、α−葉酸、5−メチルテトラヒドロ葉酸、プテリジン類似体、またはこれらの代替類似体に複合することができる。
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド剤は、全身投与されたときに腎臓に蓄積するタンパク質に複合することができる。例えば、該オリゴヌクレオチド剤は、リゾチーム、シトクロム−cまたはアプロチニン・タンパク質に複合することができる。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、タンパク質のリシン残基に複合することができる。
一実施形態では、腎臓をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、低分子量エチレングリコール(PEG)分子、またはグアニジウム基に複合することができ、別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、RGDペプチド、ペプチド類似体またはペプチド模倣体またはそれらの誘導体に複合することができる。RGDペプチド、ペプチド類似体またはペプチド模倣剤に複合させたオリゴヌクレオチドは、αβインテグリンと結合することができる。
参考文献:グッドマン、エス.エル(Goodman,S.L.);ホルツマン、ジー(Holzemann,G.);スリオク、ジー.エー.ジー(Sulyok,G.A.G.);ケスラー、エッチ(Kessler,H.)、J.Med.Chem.、2002年、45、1045〜1051。
参考文献:スリオク、ジー.エー.ジー.(Sulyok,G.A.G.);ギブソン、シー.(Gibson,C.);グッドマン、エス.エル.(Goodman,S.L.);ホルツマン、ジー(Holzemann,G.);ヴィエスナー、エム(Wiesner,M.);ケスラー、エッチ(Kessler,H.)、J.Med.Chem.、2001年、44、1938〜1950頁。
好適な実施形態では、対象に投与されたオリゴヌクレオチド剤の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上が腎臓に上手くターゲティングされる。好適な実施形態では、対象に投与されたオリゴヌクレオチド剤の30〜90%、40〜80%または50〜70%、50〜80%、あるいは50〜90%が腎臓に上手くターゲティングされる。
上記実施形態のいずれにおいても、オリゴヌクレオチド剤/複合体は安定化修飾などの付加的な修飾を有することができる。例えば、リンカー分子を、タンパク質、PEGまたはRGDペプチドを該オリゴヌクレオチド剤に繋留することができる。例示的なリンカーを以下に記載し、これはアミノリンカー(例えば、アミノオキシリンカー)、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、アルデヒドリンカー、ハロアセチルリンカー等を含むことができる。
別の態様では、本発明は複合化オリゴヌクレオチド剤を特徴とする。該複合は、リガンドまたは治療剤にカップリング、例えば連結されたオリゴヌクレオチド剤を含む。該オリゴヌクレオチド剤は任意に、リンカー(例えば、ペプチドリンカーまたは本明細書に記載の他のリンカー)によってリガンドまたは治療剤にカップリングされる。該リガンドは、例えば体内でのオリゴヌクレオチド剤の分布に影響を及ぼすように、および/またはオリゴヌクレオチド剤を特定の組織または細胞にターゲティングするように機能することができる。
該リガンドをオリゴヌクレオチド剤の末端、好適にはオリゴヌクレオチド剤の3’末端に配置することができる。該リガンドをオリゴヌクレオチド剤の5’末端または中間に配置することもできる。いくつかの実施形態では、2つ以上のリガンドをオリゴヌクレオチド剤にカップリングすることができる。例えば、リガンドをオリゴヌクレオチド剤の3’末端にカップリングすることができる。リガンドをある末端、例えばオリゴヌクレオチド剤3’末端および中間にカップリングすることができる。リガンドをオリゴヌクレオチド剤の3’末端および5’にカップリングすることができる。リガンドをオリゴヌクレオチド剤の3’末端、5’末端、および1つまたは複数の内部位置にカップリングすることができる。
一実施形態では、複合したオリゴヌクレオチド剤のリガンドは、脂質または脂質をベースにした分子である。このような脂質または脂質をベースにした分子は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン(HSA)と結合することが好ましい。HSA結合リガンドは、該複合体が標的組織、例えば身体の非腎標的組織まで行き渡らせることを可能にする。例えば、該標的組織は、これに限定するものではないが肝実質細胞を含む肝臓でもよい。HSAと結合することができる他の分子をリガンドとして用いることもできる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを用いてもよい。脂質または脂質をベースにしたリガンドは、(a)該複合の分解耐性を増大させることができ、(b)標的の細胞または細胞膜へのターゲティングおよび輸送を増大させることができ、および/または(c)これを用いて血清タンパク質、例えばHSAへの結合を調節することができる。
脂質をベースにしたリガンドを用いて、標的組織への該複合体の結合を調節、例えば制御することができる。例えば、HSAにより強力に結合する脂質または脂質ベースのリガンドは腎臓を標的にしにくくなり、したがって身体から除去されにくい。HSAへの結合が弱い脂質または脂質をベースにしたリガンドを用いれば、該複合を腎臓へターゲティングすることができる。
好適な実施形態では、該脂質をベースにしたリガンドはHSAと結合する。該脂質をベースにしたリガンドは、該複合体が好適には非腎組織まで行き渡るような十分な親和性でHSAを結合することが好ましい。しかし、該親和性はHSA−リガンド結合が反転されないようにそれほど強力なものでないことが好ましい。
他の好適な実施形態では、該脂質をベースにしたリガンドは、該複合体が好適には腎臓に行き渡るように、HSAと弱く結合するか、全く結合しない。腎細胞にターゲティングする他の部分が、脂質をベースにしたリガンドの代わりに、またはそれに加えて用いられてもよい。
好適な実施形態では、該脂質または脂質をベースにしたリガンドはホスホロチオエートである。この実施形態では、血清タンパク質、例えばHSAとの結合に干渉するように、ホスホロチオエート上の硫黄の数がそれほど優勢でないことが好ましい。
別の実施形態では、該リガンドはペプチドまたはペプトイドである。ペプトイド、特に、アンテナペディアまたはtatなどの両親媒性種が好ましい。
別の実施形態では、該リガンドは、ポリエチレングリコール(PEG)またはその誘導体である。PEGは、例えばオリゴヌクレオチド剤の循環を維持させることを可能にすることができる。PEGは本質的に両親媒性であり、該オリゴヌクレオチド剤3’末端にカップリングされた場合特に、安定性を促進することができる。
別の実施形態では、該リガンドは荷電基または部分、例えばポリアミンまたはカチオン基または部分である。この種のテザー部分は、例えばその電荷、例えばその負電荷のために、オリゴヌクレオチド剤が細胞内に入る抵抗性を克服し易くすることができる。好適には、これらは3’末端で複合されるが、オリゴヌクレオチド分子の5’末端または中央内であってもよい。例示的なポリアミンには、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン、ポリプレプロジン、またはポリモルホリノ、ポリオルニチンが挙げられる。
別の実施形態では、該リガンドは標的細胞、例えば増殖細胞によって取り込まれるビタミンまたは他の部分である。これらは、例えば、悪性型または非悪性型の例えば癌細胞の好ましくない細胞増殖が特徴である障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンは、癌細胞によって取り込まれる、ビタミンB、例えば、葉酸、B12、リポフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは他のビタミンまたは栄養がある。HSAおよび低密度リポタンパク質(LDL)も含まれる。
別の実施形態では、該リガンドは細胞浸透剤、好適にはヘリックス細胞浸透剤である。該浸透剤は両親媒性であることが好ましい。例示的な浸透剤はtatまたはアンテナペディアなどのペプチドである。浸透剤がペプチドである場合、修飾することが可能であり、この修飾は、ペプチジル模倣薬、インバートマー、非ペプチド結合または擬ペプチド結合、およびD−アミノ酸の使用を含む。該ヘリックス薬剤は、親油性相および疎油性相を有することが好ましいα−ヘリックス薬剤であることが好ましい。
該リガンドはターゲティング剤でもよい。該ターゲティング剤は、糖、ペプチド、例えばRGD含有ペプチドでもよい。
別の有用なターゲティング剤は、糖、例えばガラクトースおよび/またはそれらの類似体を組み込んだものである。これらは肝臓、特に肝実質細胞をターゲティングするので有用である。好適な実施形態では、該ターゲティング剤は1つまたは複数のガラクトース部分、好適には2または3個のガラクトース部分を含む。該ターゲティング剤は、例えば相互に約15Å離間された3ガラクトース部分を含むことが好ましい。該ターゲティング剤はラクトースでもよい。ラクトースは、ガラクトースにカップリングされたグルコースである。該ターゲティング剤は3個のラクトースを含むことが好ましい。該ターゲティング剤は、N−アセチル−ガラクトサミン、N−Ac−グルコサミンでもよい。マンノース、またはマンノース−6−リン酸ターゲティング剤をマクロファージ・ターゲティングに用いることができる。
増殖細胞に豊富にあるマーカーを標的とするペプチドを用いることができる。例えば、RGD含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、癌細胞、特にαβインテグリンを呈する細胞を標的とすることができる。したがって、RGDペプチド、RGDを含んだ環状ペプチド、D−アミノ酸を含むRGDペプチドのほか、合成RGD模倣体を使用してもよい。RGDに加え、αβインテグリン・リガンドをターゲティングする他の部分を使用することができる。一般に、そのようなリガンドを用いて増殖細胞および血管新生を制御することができる。このタイプの好適な複合体には、PECAM−1、VEGFまたは他の癌遺伝子、例えば本願に記載の癌遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド剤が挙げられる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、ターゲティング剤、例えば本願に記載のターゲティング剤に結合、例えば直接結合、例えば共有結合または非共有結合される。これは「複合」法と呼ばれる。別の実施形態では、該ターゲティング剤(例えば、同じターゲティング剤)は、該オリゴヌクレオチド剤と単純に混合される。これは「混成」法と呼ばれる。混成法では、該オリゴヌクレオチド剤は、例えばターゲティング基を有するか、または有さない、例えば本願に記載の糖またはRGD構成を有するか、または有さない、例えばカチオン性分子、例えばカチオン性脂質と混合されることができる。いくつかの実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、例えばターゲティング基を有するか有さないポリマーをベースにした系と混合される。他の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤をナノ粒子と混合する。
本願に記載の複合体オリゴヌクレオチド剤は、該オリゴヌクレオチド剤を所望の標的細胞または組織にターゲティングするターゲティング剤を含むことができる。該標的細胞または組織は、癌細胞、脈管構造、例えば腫瘍脈管構造の細胞、血管新生細胞、例えば腫瘍血管新生細胞、またはエンドソームでもよい。好適な標的は腎臓である。別の実施形態では、肝臓、例えば肝実質細胞が好適な標的である。
本発明の方法および組成物、例えば本願に記載の複合体を、本願に記載のオリゴヌクレオチド剤のいずれもとともに用いることができる。また、本発明の方法および組成物を、本願に記載の任意の疾患または障害の治療にも、および任意の対象、例えば任意の動物、任意のヒトなどの任意の哺乳動物の治療にも用いることができる。
本発明の方法および組成物、例えば本願に記載の複合を、本願に記載の任意の用量および/または製剤とともに、また本願に記載の任意の投与経路とも用いることができる。
本願で用いられる場合「複合する」とは、例えば2つの実体間の結合の治療上の有益性が実現されるような十分な親和性で2つの実体を結合することを意味する。複合には、共有結合または非共有結合のほか、例えばミセルなどの、他方の実体の上または内の1つの実体の、あるいは第3の実体の上または内の実体のいずれかまたは両方の封入といった他の結合の形態を含むことができる。複合の特に好適な形態は、共有結合、例えば本願に記載したものによる。ある実体を、オリゴヌクレオチド剤の例えば3’または5’末端あるいは内部に複合することができる。遺伝子発現の阻害を媒介するという該オリゴヌクレオチド剤の能力を保持するような様式で、ある実体をオリゴヌクレオチド剤に複合することが好ましい。
眼疾患の治療
本発明の特徴であるオリゴヌクレオチド剤を用いて、加齢性黄斑変性症(AMD)、緑内障、白内障、視神経萎縮、糖尿病性網膜症(DR)、または網膜色素変性症などの眼疾患を治療することができる。表9は眼疾患の治療のために、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤用の遺伝子標的をまとめたものである。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、例えばAMDおよび糖尿病性黄斑浮腫(DME)の治療のために、VEGFまたはプロテインキナーゼCをターゲティングする。
別の実施形態では、あるオリゴヌクレオチド剤が、例えばアンジオテンシン転換酵素(ACE)、アンジオテンシンII受容体、成長因子(例えば、c−Abl、c−Kit、血小板由来成長因子(PDGF)、上皮成長因子(EGF)、インスリン様成長因子(IGF)、成長ホルモン1(GHl)、インスリン様成長因子−I(IGF−I)、またはc−rafキナーゼ(raf−1)、またはそれらの受容体)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)−2、−9、−13または−14の阻害剤、インテグリンαβ、またはαβをターゲティングすることによって、AMDまたはDRを治療するための療法として用いられる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、カスパーゼ、Bclファミリー・メンバー、一酸化窒素合成酵素、エンドセリン、TNF−αまたはTNF−α受容体、ERK2、MEK1/2、またはサイクリンD1をターゲティングする。これらのオリゴヌクレオチド剤は、例えば緑内障、網膜色素変性症、白内障形成、網膜芽細胞腫、網膜虚血、糖尿病性網膜症、またはウイルス感染症または硝子体網膜症などの後眼部に及ぶ眼疾患の治療に有用であることができる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、炭酸脱水酵素(CA2、CA4およびCA12)またはプロテインキナーゼ、例えばプロテインキナーゼCまたはミオシン軽鎖キナーゼをターゲティングする。これらのオリゴヌクレオチド剤は、例えば緑内障の治療に有用であることができる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、接着分子、サイトカイン、ケモカイン、MMP、またはメタロプロテアーゼの組織阻害剤(TIMP)をターゲティングする。これらのオリゴヌクレオチド剤は、例えば免疫学的攻撃、創傷、感染、遺伝性疾患、糖尿病、またはビタミンA欠乏症の治療に有用であることができる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、NOS−IIをターゲティングする。これらのオリゴヌクレオチド剤は、例えばブドウ膜炎の治療に有用であることができる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、サイクリンD1をターゲティングして、例えば眼の細胞、例えば網膜色素上皮細胞における細胞増殖を低減させる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、眼に発現したmiRNAをターゲティングする。別の実施形態では、ヒトは、眼におけるmiRNAの発現または蓄積の増大あるいは眼に発現したmiRNAの標的である核酸の発現の減少が特徴である障害に罹患している。該オリゴヌクレオチド剤を対象、例えば対象の眼に投与すれば、その結果、該オリゴヌクレオチド剤が標的miRNAと対になり、続いてmiRNAを下方調節させる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は通常、眼に発現するmiRNAと実質的に同一であり、別の実施形態では、ヒトは、眼におけるmiRNAの発現の減少が特徴である障害に罹患している。オリゴヌクレオチド剤を対象、例えば対象の眼に投与すれば、下方調節されたmiRNAの機能が少なくとも部分的に救われる。
眼疾患を治療するのに有用なオリゴヌクレオチド剤は、例えばイオン泳動(例えば、経強膜角膜イオン泳動)、局所投与(例えば、パッチまたはディスクによる、あるいは目薬による)、あるいは硝子体内注射によって眼に送達することができる。該オリゴヌクレオチド剤を、立体的に安定化されたリポソーム内に配合することができる。
肝臓へのターゲティング
本発明の態様は、肝臓に発現するサイレンシング遺伝子に関連するか、または1つもしくは複数の内在性miRNAによって調節された遺伝子をアップレギュレーションすることに関する。したがって、本発明は、例えば肝臓の障害または肝臓に関連する障害を治療するために、オリゴヌクレオチド剤を肝臓に送達するための組成物および方法を含む。
本発明のオリゴヌクレオチド剤組成物は、肝臓に有利に分布を改変するように修飾されたものでもよい。本発明の組成物には、オリゴヌクレオチド剤、例えば本願に記載のオリゴヌクレオチド剤を含む。
肝臓に向けられたオリゴヌクレオチド剤は、apoB−100を標的として、apoB−100の増大または望ましくない発現、コレステロールの増大または望ましくないレベル、および/または脂質代謝の調節不全が特徴である障害を治療することができる。該オリゴヌクレオチド剤を該障害のリスクのある個人に投与して、その障害の発症またはその障害の徴候を遅延させることができる。これらの障害には、HDL/LDLコレステロールの不均衡;異常脂質血症、例えば家族性混合型高脂血症(FCHL)、後天性高脂血症;高コレステロール血症;スタチン抵抗性高コレステロール血症;冠動脈疾患(CAD)、冠状動脈性心臓病(CHD)、アテローム性動脈硬化症が挙げられる。一実施形態では、apoB−100をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、スタチン抵抗性高コレステロール血症を有すると診断された対象に投与される。
apoB−100オリゴヌクレオチド剤は、対象における血清LDL−Cおよび/またはHDL−Cおよび/または総コレステロールのレベルを低減させるのに十分な量で投与されることができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、対象の心筋梗塞のリスクを低減させるのに十分な量で投与される。
一実施形態では、apoB−100の発現レベルは、apoB−100オリゴヌクレオチド剤投与後の肝臓において低減される。例えば、該オリゴヌクレオチド剤を、肝臓、例えば肝の受容体に結合する抗体またはリガンドをターゲティングする部分と混成することができる。
他の実施形態では、肝臓をターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、例えばβカテニンまたはグルコース−6−ホスファターゼRNAの発現を調節して、肝臓に関連する障害を治療することができる。
別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は、肝臓に発現したmiRNAまたはpre−miRNAをターゲティングする。別の実施形態では、ヒトは、肝臓におけるmiRNAの過剰発現または蓄積または肝臓に発現したmiRNAの標的である核酸の発現の減少が特徴である障害に罹患している。オリゴヌクレオチド剤を対象に、または対象の肺細胞に投与すれば、オリゴヌクレオチド剤を標的miRNAと対にすることができ、続いてmiRNAを下方調節することができる。
一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は肝組織に通常発現するmiRNAと実質的に同一であり、別の実施形態では、ヒトは肝臓におけるmiRNAの発現の減少が特徴である障害に罹患している。オリゴヌクレオチド剤を対象に、または肝細胞に投与すれば、下方調節されたmiRNAの機能が少なくとも部分的に救われる。
肺疾患の治療
本発明の特徴であるオリゴヌクレオチド剤を、肺疾患、例えば慢性気管支炎(慢性気管支炎を含む)、肺気腫、喘息(小児喘息を含む)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺癌、または呼吸器感染症を有すると診断された患者を治療するのに用いることができる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、例えばストレス・キナーゼ(JNK、MAPKまたはp38など)、レドックス感受性転写因子(NF−κB、KJEまたはAP−1など)、インターロイキン−5(IL−5)またはIL−5受容体、ホスホジエステラーゼ4、ICAM−1、CDl1/CD18、E−セレクチン、インターロイキン−10、幹細胞因子(SCF)、MUC5AC、またはアデノシンA1受容体をターゲティングする。これらのオリゴヌクレオチド剤は、例えばCOPDまたは気管支喘息などの喘息の治療に有用であることができる。
COPD治療のための他の遺伝子標的には、β2アドレナリン受容体、ロイコトリエンD、5’−リポキシゲナーゼ、インターロイキン−8、MCP−1、TNF−α、上皮成長因子受容体、チロシン・キナーゼ、MUC4、MUC8、ならびにセリン・エラスターゼ、ELA2、OMIM130130および好中球エラスターゼなどのマトリクス分解性プロテアーゼが挙げられる。
本願に記載のオリゴヌクレオチド剤は、病原性感染症の治療に有用であることができる。例えば、A型インフルエンザに感染したヒトには、A型インフルエンザPB2遺伝子またはPA遺伝子を標的にするオリゴヌクレオチド剤を投与することができる。A型インフルエンザなどの病原体の遺伝子を標的にするオリゴヌクレオチド剤は、生物戦争の攻撃の犠牲者を治療するのにも有用であることができる。
オリゴヌクレオチド剤は、Rasファミリー遺伝子またはファルネシルトランスフェラーゼ、Stat3、ヒトリボヌクレオチドリダクターゼのR2小サブユニット成分、BcI遺伝子(例えば、Bcl−2)、ポロ様キナーゼ−1(PLK1)、VEGF受容体、抗−Flt−1(VEGFR−1)または抗−KDR(VEGFR−2)を標的とすることができる。これらのオリゴヌクレオチド剤は肺癌治療に有用であろう。
オリゴヌクレオチド剤は、SCR、SCF、またはアレルゲンに対する肺反応を抑制または治療するためのNF−κBのp65サブユニットをターゲティングすることができる。例えば、これらのオリゴヌクレオチド剤を用いて肺炎症を抑制または治療することができる。
NF−κBのp65サブユニットをコードする遺伝子を標的にするオリゴヌクレオチド剤を用いて、肺炎を治療することができる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、例えば肺における肺系統の組織に発現したmiRNAを標的にする。別の実施形態では、ヒトは、肺におけるmiRNAの過剰発現または蓄積あるいは肺に発現したmiRNAの標的である核酸の発現の減少が特徴である障害に罹患している。オリゴヌクレオチド剤を対象に、または対象の肺細胞に投与すれば、該オリゴヌクレオチド剤を標的miRNAと対にすることができ、続いてmiRNAを下方調節することができる。
喘息治療に有用なオリゴヌクレオチド剤は、例えばエアロゾルの吸入を介して直接的に肺に送達されることができる。リポソーム送達剤を用いて、オリゴヌクレオチド剤を肺に送達することができる。オリゴヌクレオチド剤および特にホスホロチオエート結合を含んだオリゴヌクレオチド剤は吸入によって投与することができ、続いて気管支および肺胞の上皮および内皮に限局することができる。オリゴヌクレオチド剤は、約15mg/kg未満、例えば12mg/kg、10mg/kg、8mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.1mg/kg、または0.001mg/kg未満の用量で吸入投与されることができる。
肺疾患の治療のために、オリゴヌクレオチド剤を、気道内注入、鼻腔内、静脈内投与することができる。
ウイルス感染症の治療
オリゴヌクレオチド剤、例えば複合オリゴヌクレオチド剤を用いて、ウイルス遺伝子、例えばC型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、HIV、エプスタインバーウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、またはインフルエンザ、例えばA型インフルエンザの遺伝子をターゲティングすることができる。
オリゴヌクレオチド剤を用いてウイルス感染症または癌を治療することができる。例えば、子宮頸部新生物の治療のために、オリゴヌクレオチド剤はHPV、例えばHPV16、18、31、33または45をターゲティングすることができる。オリゴヌクレオチド剤は、例えばHPVのE6、E7、またはMCP−1をターゲティングすることができる。これに加えて、あるいは代替的には、オリゴヌクレオチド剤は宿主のヌクレオリンをターゲティングすることができる。
HIV感染症の治療のためのオリゴヌクレオチド剤は、例えばHIVウイルスのgag、tat、vpr、rev、env、nef、pol、virまたはgp120遺伝子をターゲティングすることができる。
ウイルス遺伝子を標的にするオリゴヌクレオチド剤は、組換え型アデノ・ベクターの形態で、またはレトロウイルス・デリバリーによって、対象に送達することができる。例えば、腫瘍組織には送達は直接でもよい。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は病原体、例えばウイルス性病原菌または細菌性病原菌によって発現したmiRNAをターゲティングする。例えば、オリゴヌクレオチド剤はウイルス、例えばヘルペスウイルスによって発現したmiRNAをターゲティングすることができる。ヘルペスウイルスは、例えばエプスタインバーウイルス(EBVまたはHHV4)、γヘルペスウイルス(例えばカポジ肉腫関連ウイルス(KSHVまたはHHV8)、マウスγヘルペスウイルス68(MHV68))、またはβヘルペスウイルス(例えばヒトサイトメガロウイルス(HCMVまたはHHV5))でもよい(フェッファーら(Pfeffer et al.)Sience、304:734〜736頁、2004年およびフェッファーら(Pfeffer et al.)、Nature Methods 2:269〜276頁、2005年)。オリゴヌクレオチド剤を対象に投与すれば、該オリゴヌクレオチド剤は標的miRNAと対になり、続いて病原性miRNAとその標的、例えば該病原体またはその宿主に内在性の標的miRNAとの相互作用を低減させる。この相互作用の結果、病原による宿主の感染が低減される。
他の例示的な治療遺伝子標的
オリゴヌクレオチド剤、例えば本願に記載の複合化オリゴヌクレオチド剤は、細胞接着に関与する遺伝子、例えばICAM−1、VCAM−1、またはELAM−1を阻害することができる。
オリゴヌクレオチド剤は、細胞増殖の調節に必要とされる遺伝子、例えばc−myb、血管内皮成長因子(VEGF)、Ha−ras、A−rafキナーゼ、c−rafキナーゼまたはMRPを阻害することができる。
オリゴヌクレオチド剤は、疾患の発症機序に関与する遺伝子、例えばβ−サラセミアを阻害することができる。
オリゴヌクレオチド剤は、病原体によって引き起こされる疾患の発症機序に関与する遺伝子を阻害することができる。例えば、マラリア原虫はマラリアPS1またはPSIIを引き起こし、日本住血吸虫は住血吸虫感染症を引き起こす可能性がある。該病原体の遺伝子をターゲティングするアリゴヌクレオチド剤を用いて、その疾患を治療することができる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は疾患の発症機序に関与するmiRNAに結合する。
神経疾患または神経障害、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病のリスクがあるか、それに苦しんでいるヒトに、オリゴヌクレオチド剤を投与することができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤はアミロイド−ファミリー遺伝子、例えばAPP;プレセニリン遺伝子、例えばPSENlおよびPSEN2、またはα−シヌクレインをターゲティングすることができる。
オリゴヌクレオチド剤をヒトに投与して、神経変性トリヌクレオチドリピート障害、例えば、ハンチントン病(HD)、状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)、または脊髄小脳失調、例えばSCAl、SCA2、SCA3(マシャド・ジョセフ病)、SCA7またはSCA8を治療することができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤は、HD、DRPLA、SCAl、SCA2、MJDl、CACNLlA4、SCA7またはSCA8遺伝子の発現を低減することができる。
本発明の特徴のオリゴヌクレオチド剤を用いて、膵臓の疾患、例えば膵炎、膵癌、糖尿病または高血糖症を治療することができる。例えば、ras、JNK、またはスルビビンをターゲティングするオリゴヌクレオチド剤は、膵癌の治療に有用であることができる。一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、糖尿病を治療するためなどの、膵臓に発現するmiRNA、例えばmiR−375をターゲティングすることができる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、膵臓に発現するmiRNA、例えばmiR−375と実質的に同一である。
本発明の特徴のオリゴヌクレオチド剤を用いて、腸の疾患、例えば胃腸炎を治療することができる。
送達経路
本願に記載のオリゴヌクレオチド剤を、種々の送達経路、例えば、2004年4月16日出願の国際特許出願シリアル番号PCT/US2004/11829号に記載されているような、例えば眼球、肺、静脈内、局所、直腸、肛門または膣送達によって投与することができる。この参照の内容を全体的に本願に援用する。
用量
一態様では、本発明は、オリゴヌクレオチド剤を対象(例えば、ヒト対象)に投与する方法を特徴とする。該方法は、該オリゴヌクレオチド剤、RNA、例えば対象のmiRNA、またはタンパク質(例えば、内在性または病原性標的RNAまたはタンパク質)を標的とする、例えばミクロRNA、アンチセンスRNA、デコイRNAまたはアプタマーの単位用量を投与する工程を含む。一実施形態では、該単位用量は1.4mg/kg体重未満、または10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005または0.00001mg/kg体重未満、オリゴヌクレオチド剤(例えば、約4.4×1016個)/kg体重の200nM未満、あるいはオリゴヌクレオチド剤/kg体重1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015nM未満を含む。
この定められた量は、疾患または障害、例えば腎臓に存在するRNAなどの標的RNAに関連する疾患または障害を治療または予防するのに有効な量であることができる。この単位用量を、例えば、注射(例えば、静脈内または筋内)、吸入投与、または局所投与によって投与することができる。特に好適な用量は2、1または0.1mg/kg体重未満である。
好適な実施形態では、該単位用量は1日1回未満の頻度で、例えば2、4、8または30日未満毎に投与される。別の実施形態では、該単位用量はある頻度では投与されない(例えば規則的な頻度ではない)。例えば、該単位用量が1回で投与されてよい。
一実施形態では、該有効用量は他の従来の治療法を用いて投与される。一実施形態では、対象はウイルス感染症を有しており、そのモダリティはオリゴヌクレオチド剤以外の抗ウイルス剤である。別の実施形態では、対象はアテローム性動脈硬化症を有しており、そのオリゴヌクレオチド剤の有効用量は、例えば外科的介入、例えば血管形成術と併用して後から投与される。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤、または前駆物質、例えばオリゴヌクレオチド剤に加工することができるより大きいオリゴヌクレオチド剤、またはオリゴヌクレオチド剤をコードするDNA、あるいはこれらの前駆物質の初回用量および1回以上の維持用量を対象に投与する。該維持用量または複数の維持用量は一般に、初回用量未満、例えば初回用量の1/2未満である。維持レジメンには、0.01μg〜1.4mg/kg体重/日、例えば、10、1、0.1、0.01、0.001、または0.00001mg/kg体重/日の用量または複数の用量範囲で対象を治療することを含むことができる。該維持用量は、5、10または30日に1回以下で投与されることが好ましい。さらに、該治療計画は特定の疾患の性質、その重篤度、および患者の全体的状態に応じて変動するある時間間隔の間、継続してよい。好適な実施形態では、該用量は、1日1回以下、例えば24、36、48時間以上に1回以下、例えば5日または8日毎に1回以下で送達されてよい。治療後、患者の状態の変化および疾患状態の徴候の軽減について、患者をモニターすることができる。本化合物の用量は、患者が現行の用量に対して有意に反応しない場合は増量してもよいし、または疾患状態の徴候の軽減が認められる、疾患状態が除去された場合、または望ましくない副作用が認められる場合には用量を減量してもよい。
特定の条件下で必要に応じてまたは適切と考慮される場合、該有効量は単回投与または2回以上の投与で投与されることができる。反復的または高頻度の注入を容易にしようとする場合、送達装置、例えばポンプ、半永久的ステント(例えば、静脈内、腹腔内、嚢内または関節包内)、またはリザーバの植え込みが妥当であるかもしれない。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド剤の医薬組成物は、複数のオリゴヌクレオチド剤種を含む。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤種は、天然の標的配列に関して他の種と重ならず、また隣接しない配列を有する。別の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチド剤種は、異なる天然標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は対立遺伝子特異的である。
いくつかの場合、患者は他の治療法と併用してオリゴヌクレオチド剤で治療される。例えば、腎疾患、例えば初期段階の腎疾患について治療中の患者に、標的遺伝子産物の活性を抑制することが知られている薬剤と併用して該疾患の進行を増強することが知られている標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド剤を投与することができる。例えば、初期段階の腎疾患を有する患者は、ナトリウム−グルコースの共輸送をブロックし、続いて1ネフロンの糸球体濾過量を低減させることが知られている小分子のフロリジンと併用して、SGLT2 RNAをターゲティングするオリゴヌクレオチド剤を用いて治療することができる。別の実施形態では、腎臓の癌について治療中の患者に、腫瘍細胞増殖に必須の標的に対して特異的なオリゴヌクレオチド剤を化学療法と併用して投与することができる。
治療が奏功した後、疾患状態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが望ましいと思われ、この場合、本発明の化合物は0.01μg〜100g/kg体重の範囲の維持用量で投与される(米国特許第6107094号明細書を参照)。
オリゴヌクレオチド剤組成物の濃度は、ヒト障害を治療または予防するか、またはヒトにおける生理学的状態を調節する際に有効であるのに十分な量である。投与されるオリゴヌクレオチド剤の濃度または量は、オリゴヌクレオチド剤について決定されるパラメータ、および投与方法、例えば鼻腔内投与、口腔投与、肺投与に左右される。例えば、鼻腔の炎症または灼熱痛を回避するために、鼻腔投与製剤はいくつかの成分のより低い濃度を必要とすることが多い。適した鼻腔投与製剤を提供するために、10〜100倍まで経口製剤を希釈することが時に望ましい。
特に限定するものではないが、疾患または障害の重症度、それまでに受けた治療、対象の全体的な健康および/または年齢、および存在する他の疾患といったある種の要因が、対象を効果的に治療するのに必要な用量に影響することがある。さらに、オリゴヌクレオチド剤、例えば2本鎖オリゴヌクレオチド剤またはオリゴヌクレオチド剤をコードするDNA、またはそれらの前駆物質)の治療有効量で対象を治療することには、1回の治療を含むことができ、好適には、一続きの治療を含むことができる。治療に用いられるオリゴヌクレオチド剤の有効量は、特定の治療の過程にわたって増大または低減することができることも理解されよう。用量の変更が生じ、本願に記載のような診断分析の結果から明白となることができる。例えば、オリゴヌクレオチド剤組成物を投与後に対象をモニターすることができる。モニタリングからの情報に基づいて、オリゴヌクレオチド剤組成物の付加的な量を投与することができる。
投薬は、治療される疾患状態の重篤度または応答性に左右され、治療過程は数日から数カ月続くか、治癒がもたらされるまで、または疾患状態の縮小が得られるまで続く。最適な投薬計画は患者の身体内の薬剤の蓄積量の測定値から算出することができる。当業者であれば、最適な用量、投薬方法および反復率を容易に決定することができる。最適な用量は個々の化合物の相対的有効性に応じて変化するかもしれず、一般に、インビトロおよびインビボ動物モデルで有効であると認められたEC50に基づいて推定することができる。いくつかの実施形態では、この動物モデルにはヒト遺伝子、例えば、標的RNAを産生する遺伝子を発現するトランスジェニック動物が挙げられる。トランスジェニック動物は対応する内在性RNAが欠損することができる。別の実施形態では、試験用の組成物には、少なくとも内部領域において動物モデルの標的RNAとヒトの標的RNAとの間で保存された配列と相補的なオリゴヌクレオチド剤を含む。
一態様では、本発明は標的核酸と実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド剤、またはオリゴヌクレオチド剤、例えば2本鎖オリゴヌクレオチド剤またはその前駆物質をコードするDNAを含んだ組成物の第1の量を対象に投与する工程;該標的核酸によってコードされたタンパク質に関連する活性を評価し、この評価を用いて第2の量を投与すべきかどうかを決定する工程を含む方法を特徴とする。好適な実施形態では、該方法には該組成物の第2の量を投与する工程を含み、該第2の量の投与のタイミングまたは用量は前記評価の関数である。該方法は本願に記載の他の特徴を含むことができる。
別の態様では、本発明はオリゴヌクレオチド剤の源を対象に投与する方法を特徴とする。該方法はオリゴヌクレオチド剤の源を投与または埋め込む工程を含む。一実施形態では、該源はオリゴヌクレオチド剤を経時的に放出する。例えば、該源は制御放出性または持続放出性の源、例えばオリゴヌクレオチド剤を徐々に放出する微粒子である。別の実施形態では、該源はポンプ、例えばセンサを備えたポンプまたは1つまたは複数の単位用量を放出することができるポンプである。
一態様では、本発明は、標的核酸との2本鎖形成を可能にするのに十分に標的RNAと相補的なヌクレオチド配列を含んだ、NATオリゴヌクレオチド剤またはオリゴヌクレオチド剤をコードするDNAを含む医薬組成物を特徴とする。該標的RNAは内在性ヒト遺伝子転写産物でもよい。一実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤(a)は約5〜約100核酸塩基長、例えば約8〜約75、例えば約8〜約50ヌクレオチド長、例えば約15〜約30ヌクレオチド長、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチド長であり;および(b)内在性標的RNAに対して相補的である。一実施形態では、該医薬組成物はエマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーまたはリポソームでもよい。
ある種の他の態様では、本発明はオリゴヌクレオチド剤またはオリゴヌクレオチド剤をコードするDNAまたはオリゴヌクレオチド剤の前駆物質の医薬製剤を含む、適した容器を備えたキットが提供される。ある種の実施形態では、該医薬製剤の個々の成分は1つの容器で提供されてよい。別の場合には、該医薬製剤の成分を2つ以上の容器、例えば、オリゴヌクレオチド剤調製物の1つの容器および担体化合物用の少なくとも別の容器に別個に提供することが望ましいこともある。該キットは、1つまたは複数の容器を1つの箱に入れるといった多数の異なった構成にパッケージングされてよい。例えばキットとともに提供される説明に従って、異なる成分を組み合わせることができる。例えば、ある医薬組成物を調製および投与するために、本願に記載のような方法に従って、成分を組み合わせることができる。該キットは送達装置を含んでもよい。
別の態様では、本発明は装置、例えば植え込み可能な装置を特徴とし、該装置はオリゴヌクレオチド剤、または前駆物質、例えばオリゴヌクレオチド剤に加工することのできるより大きなオリゴヌクレオチド剤、またはオリゴヌクレオチド剤をコードするDNAを含んだ組成物を分注または投与することができる。該オリゴヌクレオチド剤は内在性転写産物の発現を阻害することができる。一実施形態では、該装置は該組成物でコーティングされている。別の実施形態では、該オリゴヌクレオチド剤は該装置内に設けられる。別の実施形態では、該装置は該組成物単位用量を分注するための機構を含む。別の実施形態では、該装置は、例えば拡散によって、該組成物を連続的に放出する。例示的な装置には、ステント、カテーテル、ポンプ、人工器官または器官部品(例えば、人工心臓、心臓弁等)、および縫合材が挙げられる。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、それらはさらに限定的なものとして解釈されるべきではない。
実施例1
2−アザブタン−1,4−ジカルボン酸ジエチルAA
4.7Mの水酸化ナトリウム水溶液(50mL)を、グリシン酸エチル塩酸塩(32.19g、0.23モル)を攪拌した氷冷水溶液(50mL)に添加した。次いで、アクリル酸エチル(23.1g、0.23モル)を添加し、反応の完了がTLCによって確認されるまで(19時間)、該混合物を室温で攪拌した。19時間後、該反応物をジクロロメタン(3×100mL)で分配した。この有機層を、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、濾過、蒸発させた。この残渣を蒸留してAA(28.8g、61%)を得た。
実施例2
3−{エトキシカルボニルメチル−[6−(9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニル−アミノ)−ヘキサノイル]−アミノ}−プロピオン酸エチルエステルAB
Fmoc−6−アミノ−ヘキサン酸(9.12g、25.83ミリモル)をジクロロメタン(50mL)に溶解して氷冷した。ジイソプロピルカルボジイミド(3.25g、3.99mL、25.83ミリモル)を0℃で該溶液に添加した。次いで、2−アザブタン−1,4−ジカルボン酸ジエチル(5g、24.6ミリモル)およびジメチルアミノピリジン(0.305g、2.5ミリモル)を添加した。該溶液を室温にし、さらに6時間攪拌した。TLCによって反応が終了したことを確認した。この反応混合物を減圧濃縮し、酢酸エチルを添加してジイソプロピル尿素を沈殿させた。この懸濁液を濾過した。濾液を5%塩酸水溶液、5%重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。該混合有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して粗生成物をえた後、これをカラムクロマトグラフィー(50%EtOAC/ヘキサン)によって精製して11.87g(88%)のABを得た。
実施例3
3−[(6−アミノ−ヘキサノイル)−エトキシカルボニルメチル−アミノ]プロピオン酸エチルエステルAC
3−{エトキシカルボニルメチル−[6−(9H−フルオレン−9−イルメトキシカルボニルアミノ)−ヘキサノイル]−アミノ}−プロピオン酸エチルエステルAB(11.5g、21.3ミリモル)を、0℃のジメチルホルムアミド中の20%ピペリジンに溶解した。該溶液の攪拌を1時間継続した。この反応混合物を減圧濃縮し、残留水を添加し、生成物を酢酸エチルで抽出した。この粗生成物を塩酸塩に転換することによって精製した。
実施例4
3−({6−[17−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルオキシカルボニルアミノ]−ヘキサノイル}エトキシカルボニルメチル−アミノ)−プロピオン酸エチルエステルAD
3−[(6−アミノ−ヘキサノイル)−エトキシカルボニルメチル−アミノ]プロピオン酸エチルエステルAC(4.7g、14.8ミリモル)の塩酸塩をジクロロメタンに入れた。この懸濁液を0℃まで氷冷した。該懸濁液にジイソプロピルエチルアミン(3.87g、5.2mL、30ミリモル)を添加した。得られた溶液にクロロギ酸コレステリル(6.675g、14.8ミリモル)を添加した。この反応混合物を一晩攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、10%塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュ・クロマトグラフィーで精製した(10.3g、92%)。
実施例5
1−{6−[17−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルオキシカルボニルアミノ]−ヘキサノイル}−4−オキソ−ピロリジン−3−カルボン酸エチルエステルAE
カリウムt−ブトキシド(1.1g、9.8ミリモル)を乾燥トルエン30mLでスラリー化した。該混合物を0℃まで冷却し、5g(6.6ミリモル)のジエステルを攪拌しながら20分以内にゆっくりと添加した。添加中、温度を5℃以下に維持した。攪拌を0℃で30分間続け、1mLの氷酢酸を添加し、直後に4gの40mLの水中のNaHPO−HOを添加した。得られた混合物を2つの100mLのジクロロメタンで抽出し、混合された有機抽出物を10mLのリン酸緩衝液で2回洗浄し、乾燥させ、蒸発乾燥させた。該残渣を60mLのトルエンに溶解し、0℃まで冷却し、pH9.5の冷たい炭酸緩衝液の3つの50mL部分で抽出した。この水性抽出物をリン酸でpH3に転換し、混合されたクロロホルムの5つの40mL部分で抽出し、乾燥、蒸発させて残渣を得た。該残渣を25%酢酸エチル/ヘキサンを用いてカラムクロマトグラフィーによって精製し、1.9gのβ−ケトエステル(39%)を得た。
実施例6
[6−(3−ヒドロキシ−4−ヒドロキシメチル−ピロリジン−1−イル)−6−オキソ−ヘキシル]−カルバミン酸17−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルエステルAF
テトラヒドロフラン(10mL)中のケトエステルAE(1.5g、2.2ミリモル)および水素化ホウ素ナトリウム(0.226g、6ミリモル)の還流混合物にメタノール(2mL)を1時間かけて液滴で添加した。還流温度で攪拌を1時間続けた。室温まで冷却後、NHCl(12.5mL)を添加し、該混合物を酢酸エチル(3×40mL)で抽出した。混合された酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー(10%MeOH/CHCl)によって精製した生成物を得た(89%)。
実施例7
(6−{3−[ビス−4−メトキシ−フェニル)−フェニル−メトキシメチル]−4−ヒドロキシ−ピロリジン−1−イル}−6−オキソ−ヘキシル)−カルバミン酸17−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テテトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルエステルAG
ジオールAF(1.25gm、1.994ミリモル)をピリジン(2×5mL)とともに減圧蒸発で乾燥させた。無水ピリジン(10mL)および4,4’−ジメトキシトリチルクロライド(0.724g、2.13ミリモル)を攪拌しながら添加した。この反応を室温で一晩実施した。メタノールを添加することにより該反応を急冷した。該反応混合物を減圧濃縮し、残渣にジクロロメタン(50mL)を添加した。該有機層を1M重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。該有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過、濃縮した。トルエンとともに蒸発させることによって、残ったピリジンを除去した。該粗生成物をカラムクロマトグラフィー(2%MeOH/クロロホルム、5%MeOH/CHCl中のR=0.5)によって精製した(1.75g、95%)。
実施例8
コハク酸モノ−(4−[ビス−(4−メトキシ−フェニル)−フェニル−メトキシメチル]−1−{6−[17−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10,13−ジメチル2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1Hシクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルオキシカルボニルアミノ]−ヘキサノイル}−ピロリジン3−イル)エステルAH
化合物AG(1.0g、1.05ミリモル)を無水コハク酸(0.150g、1.5ミリモル)およびDMAP(0.073g、0.6ミリモル)と混合し、40℃で一晩減圧乾燥させた。該混合物を無水ジクロロエタン(3mL)に溶解し、トリエチルアミン(0.318g、0.440mL、3.15ミリモル)を添加し、該溶液をアルゴン雰囲気下において室温にて16時間攪拌した。次いで、これをジクロロメタン(40mL)で希釈し、氷冷したクエン酸(5wt%、30mL)水溶液および水(2×20mL)で洗浄した。この有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾燥させた。残渣をそのまま次工程に用いた。
実施例9
コレステロール誘導CPG AI
コハク酸AH(0.254g、0.242ミリモル)をジクロロメタン/アセトニトリルの混合物(3:2、3mL)に溶解した。この溶液に、アセトニトリル(1.25mL)中のDMAP(0.0296g、0.242ミリモル)、アセトニトリル/ジクロロエタン(3:1、1.25mL)中の2,2’−ジチオビス(5−ニトロピリジン)(0.075g、0.242ミリモル)を連続して添加した。得られた溶液に、アセトニトリル(0.6mL)中のトリフェニルホスフィン(0.064g、0.242ミリモル)を添加した。該反応混合物は明るいオレンジ色に変わった。該溶液を手首動作振とう機を使って簡単に攪拌した(5分)。長鎖アルキルアミン−CPG(LCAA−CPG)(1.5g、61μm/g)を添加した。該懸濁液を2時間攪拌した。CPGを焼結ガラス漏斗で濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびエーテルで連続して洗浄した。未反応のアミノ基を無水酢酸/ピリジンを用いてマスクした。UV測定を行うことによって、CPGのローディング容量を測定した(37μM/g)。
実施例10
(4−[ビス−(4−メトキシ−フェニル)−フェニル−メトキシメチル]−1−{6−[17−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10,13−ジメチル2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1Hシクロペンタ[a]フェナントレン−3−イルオキシカルボニルアミノ]−ヘキサノイル}−ピロリジン−3−イル)ホスホロアミダイトAJ
化合物AG(0.15g、0.158ミリモル)をトルエン(5mL)と共蒸発させた。N,N−テトライソプロピルアンモニウムテトラゾリド(0.0089g、0.079ミリモル)を残渣に添加し、該混合物を真空オーブン中40℃で、P上で一晩乾燥させた。該反応混合物を無水アセトニトリル/ジクロロメタンの混合物(2;1、1mL)に溶解し、および2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロアミダイト(0.0714g、0.0781mL、0.237ミリモル)を添加した。該反応混合物を周囲温度で一晩攪拌した。この反応が終了したことをTLC(1;1酢酸エチル:ヘキサン)によって確認した。減圧下で溶媒を除去し、残渣を酢酸エチル(10mL)に溶解し、5%NaHCO(4mL)およびブライン(4mL)で洗浄した。この酢酸エチル層を無水NaSO上で乾燥させ、減圧濃縮した。得られた混合物をクロマトグラフィー(50:49:1、EtOAc:ヘキサン:トリメチルアミン)にかけて、AJを白色発泡体として得た(0.152g、84%)。
実施例11
RNA合成、脱保護および精製プロトコル
1.合成:
RNA分子を、以下に記載するような2〜3の待機段階の変更を加え、製造業者によって記載された標準的な93ステップ・サイクルを用いて、394ABI機器で合成した。固体支持体は細孔性ガラスであり(CPG、1μMm、500Å、グレンリサーチ社(Glen Research)、[米国バージニア州スターリング所在]、モノマーは、標準的な保護基(マサチューセッツ州所在のChemgenes社からの、N−ベンゾイル−5’−O−ジメトキシトリチルアデノシン−2’tブチルジメチルシリル−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシトリチルウリジン−2’tブチルジメチルシリル−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト、N−イソブチリル−5’−O−ジメトキシトリチルグアノシン−2’tブチルジメチルシリル,3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト、およびN−ベンゾイル−5’−O−ジメトキシトリチルシチジン−2’tブチルジメチルシリル−3’−O−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホロアミダイト)を有するRNAホスホロアミダイト(ケムジーン社(Chemegenes Corp)[米国マサチューセッツ州所在])で、アセトニトリル(CHCN)中0.15Mの濃度および7.5分のカップリング時間で用いた。賦活剤をチオテトラゾール(0.25M)とした。PO−酸化にはヨウ素/水/ピリジンを用い、PS−酸化にはアセトニトリル中のBeaucage試薬0.5M溶液を用いた。合成のための試薬もすべて、グレンリサーチ社(Glen Research)のものとした。
2.脱保護−I(オリゴマー切断、塩基およびリン酸脱保護)
合成完了後、細孔性ガラス(CPG)をねじ蓋付きバイアル内((フィッシャー社(Fisher)、カタログ番号03−340−5N)またはねじ蓋付きのRNaseを含まない微量遠沈管中に移した。オリゴヌクレオチドをCPGから切断し、これと同時に、エタノール・アンモニア[アンモニア:エタノール(3:1)]の混合物1.0mLを用いて55℃で6時間から一晩、塩基およびリン酸基を脱保護した。バイアルを短時間氷冷し、次いで、エタノール・アンモニア混合物を新しい微量遠沈管に移した。CPGを50%アセトニトリル0.25mLで3回洗浄した(コレステロールおよびそのような疎水性複合オリゴマーに対しては70%CHCN)。約1.75mLのこの溶液を2つの微量遠沈管に等しく分け、しっかり蓋をして、−80℃で15分間冷却してから、speed vac凍結乾燥機で約90分間乾燥させた。
3.脱保護−II(2’TBDMS基の除去)
得られた白色残渣を200μLのトリエチルアミントリヒドロフルオライド(TEA、3HF、Aldrich社)に再懸濁させ、65℃で1.5時間加熱し、2’位置のテルトブチルジメチルシリル(TBDMS)基を除去した。次いで、この反応物を400μLのイソプロポキシトリメチルシラン(ιPrOMeSi、Aldrich社)でクエンチし、15分間キャップを開けたままにして加熱ブロック上でさらにインキュベートした(これによって揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオライド付加化合物を蒸発させた)。Speed vac中で乾燥させることによって、残ったクエンチ試薬を除去した。次いで、オリゴマーを無水メタノール(MeOH、800μL)に沈殿させた。使用可能な最高速度で5分間遠心分離した後、非常に注意深く液体を取り出した。−80℃で凍結させた後、残ったメタノールをSpeed vac中において短時間で乾燥させて除去した。粗RNAがふわふわした白色物質として微量遠沈管中に得られた。
4.粗オリゴマーの定量化または粗分析
試料を50%アセトニトリル(0.5mL)水溶液に溶解し、以下のように定量化した。まず、50%アセトニトリル水溶液(1mL)のみを用いてブランク測定を行った。
5μLの試料および995μLの50%アセトニトリルを微量遠沈管中で十分に混合し、キュベットに移し、260nmで吸光度を読み取った。この粗物質を乾燥させ、−20℃で保管した。
5.オリゴマーの精製
粗オリゴマーを分析し、HPLC(Mono Q Pharmacia Biotech5/50)によって精製した。この緩衝系は、A=100mMトリスHCl、10%HPLCグレードのアセトニトリルpH=8、B=100mMトリスHClpH8、10%HPLCグレードのアセトニトリル1MNaClであり、流速1.0mL/分、波長260nmである。非修飾RNA21merについては、0〜0.6MNaClの勾配が一般に適切である。CGEまたはMSによって、少量(約5OD)の材料を精製し、分析することができる。この物質の同定がいったん確認されると、より大きな量の材料、すなわち、操作当たり40OD、流速1mL/分および検出器が飽和しないように感度の弱い280nmの波長を用いて、粗オリゴマーを精製することができる。次いで、完全長オリゴヌクレオチドを含んだ断片を一緒にプールし、蒸発させ、最後に以下のように脱塩した。
6.精製オリゴマーの脱塩
次いで、C−18Sepakカートリッジ(Waters社)またはSephadex G−25M(Amersham Biosciences社)のいずれかを用いて、精製したオリゴマーを脱塩した。このカートリッジを各々10mLのアセトニトリル、次に50%アセトニトリル、100mM緩衝液(これは酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸ナトリウム、または酢酸アンモニウムでもよい)で調整した。最後に、RNAseを含まない水10mLに完全に溶解させた精製オリゴマーを、非常にゆっくりと滴状を溶出させながらカートリッジに入れた。カートリッジを水(10mL)で洗浄して、塩を除去した。最後に、塩を含まないオリゴマーを50%アセトニトリルまたは50%メタノールでねじ蓋付きバイアル内に直接溶離させた。
7.キャピラリーゲル電気泳動(CGE)およびエレクトロスプレー液体クロマトグラフィー質量分析
約0.04ODのオリゴマー1μLをまずドライダウンさせ、水(2μL)に再溶解し、次いで、CGEおよび液体クロマトグラフィー質量分析用の特別なバイアルにピペットで分注した。一般には、分析前に脱塩を行うべきである。
実施例14
5’コレステロール−CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT−3’(配列番号24
化合物14−aを用いて、コレステロールがRNA分子の5’末端に複合されたオリゴヌクレオチド複合体を合成した。
ホスホロアミダイト14−aをアセトニトリル/塩化メチレン1:1溶液に溶解して0.2M溶液を得た。オリゴヌクレオチド合成中、これを末端カップリングに用いた。PO酸化のために、ヨウ素/水/ピリジンを用い、アセトニトリル中のPS酸化 Beaucage 試薬0.5M溶液を用いた。シンセサイザー中でジメトキシトリオチル基を除去した。
実施例15
siRNA修飾による2本鎖安定性の増強
siRNA2本鎖の血清安定性をモニターするための放射性標識法:センス(S)またはアンチセンス鎖(AS)のいずれか微量の5’−32Pで標識した材料を(例えば、32P−S/ASおよびS/32P−AS)を含んだsiRNA2本鎖を1μMのストック濃度で調製した。末端標識センスまたはアンチセンス鎖が存在することは、siRNA2本鎖に関連して個々の鎖をモニターすることが可能にした。したがって、2つの2本鎖調製物を試験される各siRNA配列について作製した。100nM2本鎖の最終濃度でsiRNA2本鎖を90%ヒト血清中でインキュベートした。試料を取り出し、停止混合物中で適時急冷した。典型的な経時変化として、10秒、15分、30分、1時間、2時間および4時間の時間ポイントを選択した。対照試料(4時間緩衝液のみでインキュベート)およびマーカーとして標識したセンスまたはアンチセンス鎖の部分アルカリ加水分解ラダーと一緒に、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって試料を分析した。Fujiホスフォイメージャーを用いて該ゲルを画像化し、インキュベート中に血清ヌクレアーゼによって生成された分解フラグメントと一緒に完全長センスおよびアンチセンス鎖を検出した。
血清中のホスファターゼ活性に起因して5’リン酸標識が失われる可能性があるので、5’末端標識化に代わるものが、センスまたはアンチセンス鎖のいずれかの中に内部32Pまたは33P標識を配置する。この標識方法は5’末端標識化よりも労力がかかり、現在、われわれは脱リン酸化が血清インキュベート中に生じるという証拠を得ていない。
骨格修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および3’複合体に分類される一連の化学的修飾を試験し、非修飾siRNA2本鎖と比較して血清安定性が増大することがわかった。各修飾、siRNA2本鎖内のその場所および血清安定性のデータの説明は以下の通りである。
非修飾親2本鎖の血清安定性:非修飾親2本鎖であるAL−DUP−1000を用いて、血清安定性のベースラインを確立し、ヌクレアーゼ耐性に対する化学修飾の効果を評価した。
AL−DUP−1000を血清安定性検定に供して、その固有のヌクレアーゼ耐性を評価し、その分解パターンを画定した(図18)。ヒト血清安定性検定において、変性ゲル電気泳動を用いてAL−DUP−1000を分析した。5’末端標識センスRNA(*s/as)を含んだsiRNA2本鎖Aおよび5’末端標識アンチセンスRNA(as/s*)を含んだ2本鎖を各々90%ヒト血清中でインキュベートし、時間ポイントを10秒、5分、15分、30分、1時間、2時間および4時間で検定した。PBS緩衝液のみでインキュベートしたsiRNA2本鎖に関し、対照は4時間の時間ポイントとし、OH−をアルカリ加水分解マーカーとした。3’−5’エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの両方によってこの非修飾2本鎖が分解されるのが観察された(図18)。
3’−5’エキソヌクレアーゼによるセンスおよびアンチセンス鎖両方の3’末端の切断は、インキュベートの最初の5分以内に発生し、その結果、3’末端dT残基が失われた(図18のs*/asおよびs/as*パネルの上部の垂直線)。エキソヌクレアーゼ分解に加え、両鎖はエンドヌクレアーゼによって切断された。アンチセンス鎖の位置16には、10秒という早い段階で出現する主要なエンドヌクレアーゼ部位が存在した(図18のs*/asおよびs/as*パネルの一番下の垂直線)。1時間後、ヒト血清に残っている完全長センスまたはアンチセンス鎖はごく僅かであった。親2本鎖に関連して化学修飾を導入し、ヌクレアーゼ耐性に対するその修飾の効果を評価した。これらの化学修飾は、次のクラスの1つに分類される:骨格修飾、糖修飾、核酸塩基修飾、カチオン性修飾および複合体。
骨格修飾によるヌクレアーゼ耐性の増強:siRNA2本鎖の特異的リン酸ジエステル結合をホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのいずれかにより置換し、ヒト血清安定性検定においてその安定性を評価した。表11は試験した2本鎖の配列を含む。センスおよびアンチセンス鎖両方の3’末端のリン酸ジエステル結合を置換することにより、非修飾親2本鎖(図18参照)に比して、3’オーバーハングのエキソヌクレクアーゼ分解が阻害された(図19Aおよび図19B)。センスおよびアンチセンス鎖両方について、完全長開始材料は4時間存在した。非修飾2本鎖に見られるエンドヌクレアーゼ切断パターンは変化しなかった。同様の結果が付加的なホスホロチオエートをその3’末端に含む2本鎖についても得られた(データ示さず)。エンドヌクレアーゼ切断部位(2本鎖1419、1420および1421)にホスホロチオエートを配置したところ、これらの部位ではエンドヌクレアーゼ切断が阻害されなかった(データ示さず)。まとめると、2つの3’末端ヌクレオチド間に1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートが存在することが、エキソヌクレアーゼ分解から3’を保護するのに十分であった。3’末端にホスホロチオエートを付加すれば、血清ヌクレアーゼに対する長期曝露に必要であるかもしれないこの効果を増強するように思われる。
糖修飾によるヌクレアーゼ耐性の増強:エンドヌクレアーゼ切断の部位のほかsiRNA2本鎖の3’末端において2’OHを2’OMeで置換することの効果を評価した。ヒト血清安定性検定において試験した2本鎖を表12に示す。2つの修飾の組合せがヌクレアーゼ耐性をより有意に増強するか否かを評価するために、これらの2本鎖の一部もホスホロチオエート結合を含んだ。末端dT残基を2’OMe−U(AL−DUP−1027)で置換したところ、3’−5’エキソヌクレアーゼ分解は、非修飾親2本鎖にわたって僅かに低減された(データ示さず)。しかし、2’OMe−Uによるエキソヌクレアーゼ保護の程度は、2つの末端dT残基の間にホスホロチオエートを配置することによって得られる程度よりもはるかに小さかった(図19A参照)。
2つの末端2’OMe−ウリジン残基の間にホスホロチオエートを1つ付加したところ、2本鎖AL−DUP−1036、AL−DUP−13ffおよびAL−DUP−1363について図20に見られるように、3’−5’エキソヌクレクアーゼ切断が効果的に阻害された。それ自身に2’OMe置換することは、内部切断部位に配置されるときにエンドヌクレアーゼ切断から保護する際にさらにより効果的であった。親2本鎖は2本鎖の2つのUpA部位のUの3’で切断された。両鎖はこのジヌクレオチド・リピートの対称性に起因して切断され、マッピング・データを用いて切断の部位を確認した(データ示さず)。強力なエンドヌクレアーゼ部位((図20、s/*asゲルの星印、AL−DUP−13ff)に2’OMeを配置したところ、この部位の切断が阻害された。しかし、強力な部位を2’OMeで保護したとき、第2の弱いエンドヌクレアーゼ部位(図20、*s/asの黒い星)が僅かに増強された(図20、AL−DUP−3ffをAL−DUP−1036と比較)。2’OMe(AL−DUP−1363)で両部位を保護したところ、両部位のエンドヌクレアーゼ切断が低減された(図20)。2’OMe置換による阻害作用は、切断反応における求核試薬として2’OHを必要とするエンドヌクレアーゼ切断の機構と一致する。2’OMe修飾は3’オーバーハングがリボヌクレオチドで構成された単一のオーバーハングsiRNA2本鎖の3’オーバーハングを保護するのにも有効な手段となる。この場合、2’OMe置換を用いて、エンドヌクレアーゼ切断によって生じ得る末端2つのヌクレオチドの損失をブロックすることができ、ホスホロチオエートを用いてエキソヌクレアーゼ分解から保護することができる。
カチオン性修飾によるヌクレアーゼ耐性の増強:異なる3つのカチオン性化学修飾によるヌクレアーゼ耐性への効果を試験し、親非修飾2本鎖と比較した。試験した3つのカチオン性修飾の構造を以下に示す。
ヒト血清安定性検定で検定した2本鎖の配列を表13に示す。アルキルアミノ−dTおよびカチオン性非塩基性ピロリジン修飾の両方を3’末端オーバーハングに配置して、3’−5’エキソヌクレアーゼ分解に対するその効果を評価した。アリルアミノ−ウリジンを内部エンドヌクレアーゼ切断部位に配置して、それがエンドヌクレアーゼ切断を阻害する能力を評価した。図21に示すように、3’末端dT残基を単一のアルキルアミノ−dTで置換したところ、3’−5’エキソヌクレクアーゼ分解が効果的に阻害された(図21、AL−DUP−10aa、左のゲル像)。オーバーハング部分の両dT残基をアルキルアミノ−dTで置換したところ、同程度の阻害がもたらされた(データ示さず)。各鎖の3’末端にカチオン性非塩基ピロリジン修飾を付加したところ、エキソヌクレクアーゼ分解からも保護した(図21、真中のゲル像)。アルキルアミノ−dTおよび非塩基ピロリジン修飾の両方が、最長23時間、3’−5’エキソヌクレクアーゼ切断から保護された(データ示さず)。アリルアミノ−Uを内部切断部位に配置したところ、2本鎖AL−DUP−1403について図21に示すようにエンドヌクレアーゼ切断を阻害した。異なる2つの切断事象を分離するために、2’OMe−Uおよびホスホロチオエート置換によって、エキソヌクレクアーゼ分解からこの2本鎖の末端を安定化した。エンドヌクレアーゼ切断はAL−DUP−1406のアリルアミノ−U置換によって、両方の内部切断部位において阻害された(データ示さず)。
3’複合体によるヌクレアーゼ耐性の増強:ナプロキセンおよびイブプロフェンのsiRNAの3’末端への複合について、3’−5’エキソヌクレクアーゼ分解を阻害するその能力を試験した。ナプロキセンの構造を以下に示す。
表14はヒト血清安定性検定において試験したsiRNAを列挙している。ナプロキセンまたはイブプロフェンのいずれかを3’末端に複合したところ、エキソヌクレクアーゼ分解が阻害された。図22はナプロキセン修飾2本鎖(AL−DUP−1069)の血清安定性データを示しており、同様の結果がAL−DUP1413について得られた。siRNA2本鎖の3’末端からエキソヌクレアーゼを立体的にブロックすることによって、該複合体はエキソヌクレクアーゼ切断を阻害すると思われる。同様のデータが、マウス・プール血清中のAL−DUP−1069についても得られた。
モノマー合成および複合戦略の付加的な例を別紙Iに記載し、これを本願の開示の一部として明示的に包含する。
実施例16
適した1本鎖iRNA剤を用いたマイクロRNAのサイレンシング
化学的に安定化させた、miRNAに対して相補的なコレステロール−複合1本鎖RNAを設計し、合成した。これらの1本鎖修飾RNAを本明細書では「antagomir」と呼ぶ(以下参照)。これらの合成RNAの可能性を探って内在性miRNAをサイレンシングするために、antagomir−122を設計して、肝臓に発現したmiR−122、miRNAを標的とした。antagomir−122の配列を表15に示す。antagomir−122をマウスに少量(0.2ml、80mg/kg、連続3日)、常圧で静脈内投与した。antagomir−122を投与したところ、ノーザンブロット分析によって検出されたように内在性miR−122レベルは著しく低減された(図23A)。非修飾1本鎖RNA(抗−122)の投与は肝miR−122発現レベルに影響を及ぼさず(図23A)、複合していないが、部分(pS)または完全(fS)ホスホロチオエート骨格および2’−O−メチル糖修飾(抗−122fS、抗−22pS、表15参照)で化学的に安定化させた1本鎖鎖RNAは不完全な効果をもたらした(図23A)。4つのミスマッチ変異を有する対照antagomir−122誘導体(mm−antagomir−122)を注射した動物は肝のmiR−122発現に効果を及ぼさなかったように、antagomir−122の作用は特異的であることが認められた。さらに、antagomir−122およびmm−antagomir−122で処理したマウスではmiR−let7およびmiR−22の発現レベルは影響を受けず、このことはサイレンシングがmiRNA特異的であることを示唆している(図23B)。マウスに注射した1本鎖RNAの構造を表15に記載する。
miR−122は細胞1個当たり50000以上の高いレベルで肝細胞で発現される(チャン ジェイら(Chang J.et al)、RNA Biology 1:2、106〜113頁、2004年)。antagomir処理後のmiR−122のサイレンシングがmiR−122とantagomir−122との間の化学量論的2本鎖形成によって、またはmiR−122の触媒分解によって引き起こされたものかどうかを決定するために、ホルムアミドを含んだストリンジェントな変性条件下で、非複合1本鎖抗−miR−122RNA(抗−122fS、抗−122pS)またはantagomir−122で処理したマウスの肝からの総RNAを検証した(図23C)。PBS肝と非複合抗−miR−122RNA処理肝との間にmiR−122レベルの差は検出できず、これは非ストリンジェント条件下で観察されたmiR−122レベル低減は分解によるものではないが、その代わりにmiR−122/RNA2本鎖の形成によるものであることを示している。対照的に、miR−122はantagomir−122で処理したマウスの肝蔵では検出不能のままであった。これらのデータからは、antagomir−122で処理したマウスの肝臓におけるmiRNA−122のサイレンシングはmiRNAの分解、および非複合抗−122RNAではなくantagomir−122の能力に起因するものであり、miR−122の分解はantagomirが肝細胞に効果的に送達されることに起因するものであるかもしれないという結果に至ることが示唆される。
完全にmiR−122をサイレンシングし得るantagomir−122の用量を決定するために、80、160または240mg/kg体重でantagomir−122をマウスに投与し、miR−122発現レベルを測定した。最高用量(240mg/kg体重)のときにmiR−122シグナルが完全に消え、他の験すべてにこの用量を続いて用いた(図24A)。
antagomir−122によるサイレンシングの持続時間も測定した。投与後23日間もの間、miR−122のレベルは検出不能であり(図24B)、これはantagomirを用いたmiRNAのサイレンシングが長く続いたことを示している。投与されたantagomirは長期に及ぶ治療過程の間でも良好な耐性があった。つまり、肝毒性の体重マーカーまたは血清マーカー(アラニンアミノトランスフェラーゼ)の変化は検出されなかった。インビボにおけるantagomirのバイオアベイラビリティおよび異なる組織においてmiRNA発現をサイレンシングするその能力を試験するために、あらゆる組織に豊富に発現するmiR−16(miR−16は、TGFβシグナリングに関与するアクチビンII型受容体遺伝子およびHox−A5Iの一方または両方をターゲティングする。(ジョンら(John et al)、PLoS Biology 2:1862〜1878頁、2004年;correction in PLoS Biology 3:1328、2005年))に向けられたantagomir−16をマウスに投与した。最終投与1日後に組織を収集し、miRNA発現レベルをPBS投与マウスと比較した。ノーザンブロット分析によって、miRの発現は脳を除く試験した全組織において効果的にサイレンシングされたことが明らかとなった(図25A)。antagomir−16は骨髄で検出されるようなmiR−16の89nt前駆体の発現に影響を及ぼさなかった。上記組織試料を用いて、antagomir−16のバイオアベイラビリティもノーザンブロット分析によって検定した。miR−16レベルをサイレンシングする能力に従って、antagomir−16の有意なレベルが脳を除く全組織で検出された(図25B)。これとともに、これらのデータはantagomirが幅広い体内分布を達成し、インビボの大半の組織においてmiRNAを効果的にサイレンシングし得ることを実証している。
多数のmiRNA遺伝子は、近接して位置し、協調的に転写されることが認められている。これらの多シストロン性miRNA遺伝子は転写されて長い一次転写産物(pri−miRNA)を生成し、この転写産物は細胞核および細胞質における多数の酵素によって処理されて成熟miRNAを生成する。多シストロンmiRNAをターゲティングするantagomirが隣接するmiRNAの発現に影響を及ぼさずに標的特異性を保持するかどうかを調べるために、シストロン性クラスターmiR−192/194のmiR−192またはmiR−194いずれかをターゲティングするantagomirをマウスに投与した。antagomir−192をマウスに投与したところ、肝および腎臓においてmiR−192がサイレンシングされ、miR−194の発現レベルに影響を及ぼさなかった。逆に、antagomir−194をマウスに投与したところ、miR−194発現は消滅したが、PBS投与マウスに比して、miR−192レベルに実証できる効果を及ぼさなかった。これらのデータはantagomirには同じ一次転写産物由来の特定のmiRNAを区別してサイレンシングする能力があることを実証している。
マイクロRNAはmRNAの3’UTRにおいて不完全に相補的な標的部位に結合し、翻訳および恐らくはmRNA安定性に干渉すると考えられる。したがって、miRNAがサイレンシングされると、相応して、標的タンパク質レベルが増加し、恐らくはmRNAレベルが低減するものと予想される。この予想を試験するために、肝細胞では抑制されてmiR−122の標的となると予想される遺伝子であるアルドラーゼAの発現を試験した。アルドラーゼ−A mRNAは、オープン・リーディング・フレームの下流のヌクレオチド29と36との間に、miR−122に対して完全な配列相補性を有する細胞核を保持した。antagomir−122を投与したマウスの肝蔵では、アルドラーゼ−Aの発現はスクランブルな対照(mm−antagomir−122)に比して4〜5倍上昇した。この調節は、複数の実験において、投与後の異なる時間ポイントで観察された。ルシフェラーゼ・オープン・リーディング・フレームの下流で3’UTRアルドラーゼ−Aをクローニングし、このベクターを、対照miRNA(miR−124(5’−UAAGGCACGCGGUGAAUGCCA−3(配列番号104);クレックら(Krek et al)、Nature Genetics 37:495〜500頁、2005年およびリムら(Lim et al)、Nature 433:769〜773頁、2005年を参照)およびmiR−192)およびmiR−122と、miR−122発現のないHEK293細胞に共トランスフェクトすることによっても、この標的を独立して確認した。miR−122を共トランスフェクトしたところ、ルシフェラーゼ活性はmiR−124およびmiR−192トランスフェクト細胞に比して有意に低減した。これとともに、これらのデータはアルドラーゼ−AがmiR−122の生理学的標的であることを示している。
antagomir−122で処理したマウスにおけるアルドラーゼ−Aのアップレギュレーションは、このmiRNAが機能的にサイレンシングすることを実証する。アルドラーゼ−Aはあらゆる細胞で発現するハウスキーピング遺伝子である。この遺伝子は筋肉で大量に産生され、そこでは総細胞タンパク質の5%以上になり得る。成人肝蔵では、アルドラーゼ−Aの発現は抑制され、アルドラーゼ−Bが産生される。逆に、脱分化した肝細胞および形質転換肝細胞がアルドラーゼ−Aの発現レベルを増大させ、アルドラーゼ−Bに取って代わり得る。miR−122の発現はアルドラーゼ−Aの発現と逆相関を示し、分化した成人肝細胞のレベルは最高で、HepG2などの未分化細胞は完全に欠損している。対照的に、miR−122標的部位のないアルドラーゼ−BのmRNAレベルは、antagomir−122によって影響を受けなかった。これらの知見から、哺乳動物ではマイクロRNAは組織特異的な遺伝子発現を定めるという非遺伝的な薬理学的証明が得られる。
データからインビボではantagomir、特異的miRNAに対し相補的な1本鎖コレステロール−複合RNAはmiRNAの効果的な阻害剤であることがわかる。この結果は、この過程が、多シストロン性の共通の前駆物質のmiRNA前駆物質または非標的miRNAに影響を及ぼさないので、非常に特異的であり、細胞基質で生じ易いことも示唆している。
方法
antagomirの合成 RNAは市販の6−N−ベンゾイルアデノシン(ABz)、4−N−ベンゾイルシチジン(CBz)、2−N−イソブチルグアノシン(GiBu)およびウリジン(U)の5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−O−メチル−3’−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル)RNAホスホロアミダイトモノマーを用い、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコル(ダムハとオギルビー(Damha and Ogilvie)、Methods Mol.Biol.20:81〜114頁、1993年)に従って合成した。antagomir、すなわちコレステロール複合RNAに関し、合成はコレステロール−ヒドロキシ・プロリノールリンカー担持細孔性ガラス固体支持体(マノハランら(Manoharan et al.,)、米国特許出願公開第20050107325号)から開始した。オリゴヌクレオチド合成中にフェニルアセチルジスルフィド(PADS)で亜リン酸エステルを酸化させることによってホスホロチオエート骨格を所与の位置に有するantagomirを得た(シェルバラスら(Cheruvallath et al.,)、Nucleosides Nucleotides、18:485〜492頁、1999年)。切断および脱保護後、antagomirを逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、非複合RNAオリゴヌクレオチドをアニオン交換高速液体クロマトグラフィーによって精製した。ES質量分析およびキャピラリーゲル電気泳動によって、精製オリゴヌクレオチドを特徴付けた。
動物.動物モデルはすべてRockefeller大学の無菌動物施設において、12時間の明/暗サイクルでC57Bl/6Jバックグラウンドで維持した。1〜3日連続で6週齢マウスに生食水または異なるRNAを尾静脈投与した。RNAは80mg/kg体重の用量で注入1回当たり0.2ml投与した。特に示さない限り、組織中のmiRNAレベルは最後の注入の24時間後に測定した。組織を収集し、急速冷凍し、−80℃で保存した。
ノーザンブロット分析.Trizol試薬(インビトロジェン社(Invitrogen)、[米国カリフォルニア州カールズバッド所在]およびエタノール沈殿を用いて総RNAを単離した。8M尿素および20%ホルムアミドを含んだ14%ポリアクリルアミドゲル上で、45mAでRNAを分離した。「マイクロRNAレジストリ」(Griffiths−Jones、NAR32:D109―D111、2004年)に従ってアンチセンス・プローブを設計した。
RT−PCR.総RNA抽出、cDNA合成およびPCRをシンら(Shih et al.,)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:3818〜3823頁、2002年に記載のように実施した。
ルシフェラーゼ活性の検定。次のプライマー:5’d−CCAGAGCTGAACTAAGGCTGCTCCA)−3’ (配列番号105)および5’d−(CCCCTTAAATAGTTGTTTATTGGCA)−3’ (配列番号106)を用いて、マウス完全長アルドラーゼ−A3’UTRをPCR増幅し、pRL−TK(Promega社)において停止コドンの下流でクローンした。HEK293細胞を24ウェル・プレートで培養し、各々pRL−TK(Rr−luc)50ng、pGL3対照ベクター(Pp−luc)(Promega社)50ngおよび2本鎖siRNA(Dharmacon社)200ngでトランスフェクトした。細胞を収集し、トランスフェクション後24〜30時間で検定した。
統計学的分析。結果を平均±標準偏差で示す。統計学的分析はスチューデントのt検定によって行い、帰無仮説は0.05レベルで棄却した。
他の実施形態
本発明の多数の実施形態を記載した。しかし、種々の修飾は本発明の精神および範囲から逸脱せずになされ得ることを理解されたい。したがって、他の実施形態は添付の特許請求の範囲にある。
SRMSモノマーをオリゴヌクレオチド内に組み込む合成スキームの概略図。 OFGにおいてケイ素上に存在し得る置換基の一覧。 C2’−オルトエステル基上に存在し得る置換基の一覧。 代表的な環式糖置換モノマーサブユニットSRMS)担体の一覧。パネル1は、ピロリンに基づくSRMSを示しており、パネル2は、3−ヒドロキシプロリンに基づくSRMSを示している。R1は、コハク酸塩またはホスホルアミデートであり、R2は、Hまたは複合体リガンドである。 代表的な環式糖置換モノマーサブユニットSRMS)担体の一覧。ピペリジンに基づくSRMSを示している。R1は、コハク酸塩またはホスホルアミデートであり、R2は、Hまたは複合体リガンドである。 代表的な環式糖置換モノマーサブユニットSRMS)担体の一覧。モルホリンおよびピペラジンに基づくSRMSを示している。R1は、コハク酸塩またはホスホルアミデートであり、R2は、Hまたは複合体リガンドである。 代表的な環式糖置換モノマーサブユニットSRMS)担体の一覧。デカリンに基づくSRMSを示している。R1は、コハク酸塩またはホスホルアミデートであり、R2は、Hまたは複合体リガンドである。 ペプチドをオリゴヌクレオチド剤中に3’複合する反応スキームの概要を示す図。 ペプチドをオリゴヌクレオチド剤中に5’複合する反応スキームの概要を示す図。 アザペプチドを合成する反応スキームの概要を示す図。 Nメチルアミノ酸およびペプチドを合成する反応スキームの概要を示す図。 β−メチルアミノ酸ならびにAntおよびTatペプチドを合成する反応スキームの概要を示す図。 AntおよびTatオリゴカルバメートを合成する反応スキームの概要を示す図。 AntおよびTatオリゴウレアを合成する反応スキームの概要を示す図。 ペプチド担体の概略図。 代表的なコレステロール繋留SRMSモノマーの一覧。 PAGE精製後の3’コレステロール複合体に対するLCMSデータを示す図。 AL−DUP−1000に対するヒト血清安定性アッセイの変性ゲル分析の図。Cは、PBS緩衝液だけでインキュベートしたsiRNA2本鎖に対する4時間点であり、OH−は、部分的アルカリ加水分解マーカーであり、*s/asは、5’末端標識されたセンスRNAを含むsiRNA2本鎖を表し、s/*asは、5’末端標識されたアンチセンスRNAを含む2本鎖を表す。試料は、90%ヒト血清中でインキュベートされ、時間点は、10秒、5分、15分、30分、1時間、2時間、および4時間でアッセイされた。バンドの右の黒い線は、エキソヌクレアーゼ分解断片を示し、赤色の線は、エンドヌクレアーゼ分解断片のうちの少数を強調している。 Aは、AL−DUP−1393に対するヒト血清安定性アッセイの変性ゲル分析の図。Cは、PBS緩衝液だけでインキュベートしたそれぞれのsiRNA2本鎖に対する4時間点であり、*s/asは、5’末端標識されたセンスRNAを含むsiRNA2本鎖を表し、s/*asは、5’末端標識されたアンチセンスRNAを含む2本鎖を表す。試料は、10秒、15分、30分、1時間、2時間、および4時間でアッセイされた。Bは、AL−DUP−1329に対するヒト血清安定性アッセイの変性ゲル分析の図。レーンは標識されており、実験は、図19Aについて説明されている通りに実施された。 AL−DUP−1036、AL−DUP−13ff、およびAL−DUP−1363の変性ゲル分析の図(配列については表12を参照)。黒色の縦線は、エキソヌクレアーゼ切断が抑制されている領域を強調しており、星は、アンチセンス鎖における強いエンドヌクレアーゼ切断およびセンス鎖における弱いエンドヌクレアーゼ切断の部位を示す。Cは、PBS緩衝液だけでインキュベートしたそれぞれのsiRNA2本鎖に対する4時間点であり、*s/asは、5’末端標識されたセンスRNAを含むsiRNA2本鎖を表し、s/*asは、5’末端標識されたアンチセンスRNAを含む2本鎖を表す。試料は、10秒、15分、30分、1時間、2時間、および4時間でアッセイされた。 カチオン修飾を含むsiRNA2本鎖のヒト血清安定性プロファイル。AL−DUP−10aa(アルキルアミノ−dT)、AL−DUP−1ccc(脱塩基ピロリジン陽イオン)、およびAL−DUP−1403(配列については表13を参照)の変性ゲル分析。黒色の線は、エキソヌクレアーゼ切断が抑制される領域を強調しており、赤色の星は、アンチセンス鎖内の強いエンドヌクレアーゼ切断の部位を示す。Cは、PBS緩衝液だけでインキュベートしたそれぞれのsiRNA2本鎖に対する4時間点であり、*s/asは、5’末端標識されたセンスRNAを含むsiRNA2本鎖を表し、s/*asは、5’末端標識されたアンチセンスRNAを含む2本鎖を表す。試料は、10秒、15分、30分、1時間、2時間、および4時間でアッセイされた。 AL−DUP−1069に対するヒト血清安定性アッセイの変性ゲル分析の図。黒色の縦線は、エキソヌクレアーゼ切断が抑制される領域を強調している。Cは、PBS緩衝液だけでインキュベートしたそれぞれのsiRNA2本鎖に対する4時間点であり、*s/asは、5’末端標識されたセンスRNAを含むsiRNA2本鎖を表し、s/*asは、5’末端標識されたアンチセンスRNAを含む2本鎖を表す。試料は、10秒、15分、30分、1時間、2時間、および4時間でアッセイされた。 Aは、miR−122を標的とする修飾の異なるRNA(240mg/kg)を注入してから24時間後にマウス肝臓から分離した全RNA(15μg)のノーザンブロットのパネル。試料は、ホルムアミドがない14%ポリアクリルアミドゲル中で分離され、miR−122について膜の調査が行われた。tRNAの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。Bは、miR−122に対して修飾の異なるRNA(240mg/kg)を注入してから24時間後にマウス肝臓から分離した全RNA(15μg)のノーザンブロットのパネル。試料は、ホルムアミドがない14%ポリアクリルアミドゲル中で分離され、miR−122、let7、およびmiR−22 RNAについて膜の調査が行われた。tRNAの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。Cは、miR−122に対して修飾の異なるRNA(240mg/kg)を注入してから24時間後にマウス肝臓から分離した全RNA(15μg)のノーザンブロットのパネル。試料は、20%ホルムアミドの存在下14%ポリアクリルアミドゲル中で分離され、miR−122について膜の調査が行われた。tRNAの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。 Aは、マウス肝臓から分離した全RNA(15μg)のノーザンブロットのパネル。RNAは、示されているように1、2、または3日連続で80 mg/kg体重のantagomir−122(n=2)を注入してから24時間後に分離された。内因性miR−122と注入antagomir−122の両方について膜を調査した。tRNAの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。Bは、マウス肝臓から分離した全RNA(15μg)のノーザンブロットのパネル。RNAは、antagomir−122を注入してから3、6、9、13、および23日後に分離された。内因性miR−122と注入antagomir−122の両方について膜を調査した。tRNAの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。 Aは、antagomir−16(n=3)を注入してから24時間後に別のマウス組織から分離した全RNA(10〜30μg)のノーザンブロットのパネル。miR−16について膜を調査した。前駆体miR−16転写は、骨髄のノーザンブロット上で見え、発現は、すべてのマウスにおいて類似していた。tRNAの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。Bは、antagomir−16(n=3)を注入してから24時間後に別のマウス組織から分離した全RNA(10〜30μg)のノーザンブロットのパネル。3匹のマウスの全RNAは、miR−16およびその注入されたantagomir−16の検出のためプールされた。tRNAの臭化エチジウム染色は、ローディング対照として示されている。

Claims (36)

  1. 式(I)を有する少なくとも一つのサブユニットが組み込まれているオリゴヌクレオチド剤、およびリガンドを備え、前記オリゴヌクレオチド剤は、相補的なmiRNAを標的とすることができる複合体。
    (式中、
    Xは、N(CO)RまたはNRであり、
    Yは、NR、O、S、CR10であるか、または存在せず、
    Zは、CR1112であるか、または存在せず、
    、R、R、R、R、およびR10はそれぞれ独立して、H、OR、OR、(CHOR、または(CHORであるが、R、R、R、R、R、およびR10のうちの少なくとも一つはORまたはORであり、R、R、R、R、R、およびR10のうちの少なくとも一つは(CHORまたは(CHORであり、R、R、R、R、R、およびR10のうちの少なくとも一つはRを含み、
    、R、R11、およびR12はそれぞれ独立して、H、1〜3個のR13で任意に置換されたC〜Cアルキル、もしくはC(O)NHRであるか、またはRおよびR11はともに、R14で任意に置換されたC〜Cシクロアルキルであり、
    は、R、またはNRもしくはNHC(O)Rで置換されたC〜C20アルキルであり、
    は、C〜Cアルキルであり、
    13は、ヒドロキシ、C〜Cアルコキシ、またはハロであり、
    14は、NRであり、
    は、
    であり、
    は、
    であり、
    AおよびCはそれぞれ独立して、OまたはSであり、
    Bは、OH、O、または
    であり、
    は、HまたはC〜Cアルキルであり、
    は、リガンドであり、
    nは、1〜4である)
  2. はCR10であり、Zは存在しない請求項1に記載の複合体。
  3. は(CHNHRまたは(CHNHC(O)Rである請求項2に記載の複合体。
  4. は、葉酸基、コレステロール基、炭水化物基、ビタミンA基、ビタミンE基、ビタミンK基、およびビタミンB12基からなる群から選択される請求項3に記載の複合体。
  5. はコレステロール基である請求項4に記載の複合体。
  6. は(CHORであり、RはORである請求項2に記載の複合体。
  7. およびRはトランス型である請求項6に記載の複合体。
  8. nは1である請求項6に記載の複合体。
  9. は(CHORであり、RはORである請求項2に記載の複合体。
  10. は(CHORであり、RはORである請求項2に記載の複合体。
  11. は(CHORであり、RはORである請求項2に記載の複合体。
  12. は(CHORであり、RはORである請求項2に記載の複合体。
  13. は(CHORであり、RはORである請求項2に記載の複合体。
  14. はORであり、Rは(CHORである請求項2に記載の複合体。
  15. はORであり、Rは(CHORである請求項2に記載の複合体。
  16. はORであり、Rは(CHORである請求項2に記載の複合体。
  17. はCR10であり、ZはCR1112である請求項1に記載の複合体。
  18. はNRであり、ZはCR1112である請求項1に記載の複合体。
  19. はOであり、ZはCR1112である請求項1に記載の複合体。
  20. はCR10であり、ZはCR1112であり、RおよびR11はともにCシクロアルキルを形成する請求項1に記載の複合体。
  21. はCR10であり、ZはCR1112であり、RおよびR11はともにCシクロアルキルを形成する請求項1に記載の複合体。
  22. 前記リガンドは、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リトコール酸、O3−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択された親油性部分を備える請求項1に記載の複合体。
  23. 前記リガンドは3’末端サブユニットに結合している請求項1に記載の複合体。
  24. 前記リガンドは5’末端サブユニットに結合している請求項1に記載の複合体。
  25. 前記リガンドは内部サブユニットに結合している請求項1に記載の複合体。
  26. 前記miRNAは、miR−21、miR−16、miR−22、miR−122、miR−155、miR−192、miR−194及びmiR−375からなる群より選ばれる、請求項1に記載の複合体。
  27. 標的遺伝子を阻害するのに使用される、請求項1に記載の複合体。
  28. 生物に投与して使用される、請求項27に記載の複合体。
  29. 請求項1に記載の複合体を、生物の外にある細胞に与える工程を備える標的遺伝子を阻害する方法。
  30. 前記細胞は細胞系の一細胞である請求項29に記載の方法。
  31. 請求項1に記載の複合体を非ヒト動物に投与する工程を備える、非ヒト動物の標的遺伝子の発現を調節する方法。
  32. 請求項1に記載の複合体、および薬剤として許容される担体を備える薬剤組成物。
  33. 請求項1に記載の複合体、該複合体が封じ込められている滅菌容器、および使用説明書を備えるキット。
  34. 腎臓の障害を治療するための薬剤の製造に請求項1に記載の複合体を使用する方法。
  35. 眼障害を治療するための薬剤の製造に請求項1に記載の複合体を使用する方法。
  36. ウイルス性障害を治療するための薬剤の製造に請求項1に記載の複合体を使用する方法。
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