JP5186217B2 - Ｐｐａｒアゴニスト含有医薬 - Google Patents

Description

本発明は、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体；Peroxisome Proliferator Activated Receptor）αまたはδアゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞または角膜上皮細胞の増殖促進剤に関する。

マイボーム腺は上下のまぶた（眼瞼）に内包された脂質産生腺であり、眼瞼のまつげ（睫毛）より結膜側に位置する開口部から脂質を分泌する。涙液を構成する油層は、マイボーム腺から供給される脂質を成分としており、眼表面からの涙液の蒸発を防いでいる。マイボーム腺機能不全やマイボーム腺炎患者においては、マイボーム腺の機能が低下して脂質の分泌量が少なくなるため、涙液蒸発亢進型ドライアイ、ドライアイに伴う角結膜上皮障害、角膜上皮糜爛、角膜潰瘍などを引き起こすことが知られている。
また、角膜は、外胚葉性の上皮と中胚葉性の外境界板（ボーマン膜）・実質・内境界板（デスメ膜）・内皮から成り立っている。角膜は眼球の最前部に位置しているので、外界の環境の影響を受けやすく、その結果として種々の障害が生じる。角膜上皮細胞の損傷または欠損を伴う疾患としては、ドライアイ症候群、角膜潰瘍、点状表層角膜症、角膜上皮糜爛、春季カタルやアトピー性角結膜炎などの角膜病変を伴う眼アレルギー性疾患などが挙げられる。

一方、ＰＰＡＲは、殆どの脊椎動物において発現している核内レセプターの一種であり、細胞内の糖・脂質代謝や細胞の分化に密接に関与している転写因子群であるとされている。サブタイプとしては、α、δ、γ型が知られている。なお、ＰＰＡＲδは、ＰＰＡＲβと表記されることもある（非特許文献１）。
ＰＰＡＲの眼組織における分布としては、ＰＰＡＲαおよびβがウサギの角膜上皮細胞に発現していることが知られている（非特許文献２）。
これまでに、ＰＰＡＲ活性化作用を有する５−［４−（６−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル］チアゾリジン−２，４−ジオンが、角結膜障害の治療剤として利用できること（特許文献１および２）、眼疾患（結膜炎、ドライアイ症候群、角膜炎など）の治療においてＰＰＡＲα、δまたはγアゴニストが投与されること（特許文献３）が報告されている。また、ＰＰＡＲαに関しては、肝臓、腎臓などに分布し、脂質代謝・輸送に作用することが知られており、さらに、そのアゴニストが角膜疾患の治療剤として利用できることも報告されている（特許文献４）。ＰＰＡＲδアゴニストについては、これまで、ラット皮脂腺上皮細胞の増殖および分化を促進すること（非特許文献３）、皮膚の創傷治癒を促進すること（非特許文献４）についての報告がある。その他にも、非チアゾリジンジオンＰＰＡＲリガンドとＧＬＰ−１誘導体を投与することによりβ−細胞の増殖を刺激する方法（特許文献５）、ＰＰＡＲγアゴニストであるピオグリタゾンが白血病細胞や前立腺癌細胞などの増殖を阻害すること（特許文献６）などが知られている。

しかしながら、ＰＰＡＲα、δまたはγの各動物種および各組織・細胞における発現や機能については不明な点が多く、どのＰＰＡＲアゴニストが、ヒトの眼疾患に有用であるかについては知られていない。
国際公開第２００５／０３９５７４号パンフレット 特開２００１−３９９７６号公報 国際公開第２００２／０７６１７７号パンフレット 特開２００５−００８５７０号公報 国際公開第２００２／６９９９４号パンフレット 国際公開第１９９８／２５５９８号パンフレット J Med Chem 2000, 43: 527-550 J Biol Chem 2000, 275: 2837 Molecular Genetic and Metabolism 2001, 74: 362-369 Am J Clin Dermatol 2003, 4(8): 523-530

本発明の課題は、ドライアイなどの眼疾患の根本的な治療となり得るマイボーム腺上皮細胞および角膜上皮細胞の増殖を促進しうる薬剤を提供すること、並びに、該促進剤を用いたマイボーム腺機能不全・涙液蒸発亢進型ドライアイ等の眼疾患の治療剤を提供することである。

本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストが、マイボーム腺上皮細胞および角膜上皮細胞の増殖促進作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
したがって、本発明は以下の内容を少なくとも含む。
（１）ＰＰＡＲαまたはδアゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤。
（２）ＰＰＡＲαまたはδアゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮細胞の増殖促進剤。
（３）ＰＰＡＲαまたはδアゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺機能不全の治療剤。
（４）ＰＰＡＲαまたはδアゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮障害の治療剤。
（５）ＰＰＡＲαまたはδアゴニストを有効成分として含有する、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤。
（６）ＰＰＡＲδアゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤。
（７）ＰＰＡＲδアゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮細胞の増殖促進剤。
（８）ＰＰＡＲδアゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺機能不全の治療剤。
（９）ＰＰＡＲδアゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮障害の治療剤。
（１０）ＰＰＡＲδアゴニストを有効成分として含有する、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤。
（１１）ＰＰＡＲαまたはδアゴニストが一般式（Ｉ）

[式中、
Ａは水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｂは−ＣＯ−、−ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｓ−、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−および−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−（式中、ｎは１〜３の整数を表す）からなる群から選択されるリンカーを示し、
ＸおよびＹは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、
Ｚは酸素原子、硫黄原子または−ＣＨ_２−を示し、
Ａｒ_１は１〜３個の置換基を有していてもよい５〜６員環である芳香環基を示し、
Ｒ_ｌおよびＲ_２は同一または異なって水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｒ_３は水素、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基を示す]
で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、（１）〜（５）のいずれかに記載の剤。
（１２）ＰＰＡＲδアゴニストが一般式（II）

[式中、
Ａは水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｂは−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｓ−および−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−（式中、ｎは１〜３の整数を表す）からなる群から選択されるリンカーを示し、
ＸおよびＹは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、
Ｚは酸素原子、硫黄原子または−ＣＨ_２−を示し、
Ａｒ_１は１〜３個の置換基を有していてもよい５〜６員環である芳香環基を示し、
Ｒ_ｌおよびＲ_２は同一または異なって水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｒ_３は水素、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基を示す]
で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、（６）〜（１０）のいずれかに記載の剤。
（１３）ＰＰＡＲδアゴニストが、（４−（３−（４−アセチル−３−ヒドロキシ−２−プロピル）フェノキシ）プロポキシフェノキシ）酢酸、（２−メチル−４−（（（４−メチル−２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−５−チアゾリル）メチル）チオ）フェノキシ）酢酸もしくは（４−(((２−（３−フルオロ−４−(トリフルオロメチル)フェニル）−４−メチル−５−チアゾリル)メチル)チオ)−２−メチルフェノキシ）酢酸、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、（１１）または（１２）に記載の剤。
（１４）ＰＰＡＲαアゴニストが、２−（４−（４−クロロベンゾイル）フェノキシ）−２−メチルプロピオン酸１−メチルエチルエステルもしくは（（４−クロロ−６−（（２，３−ジメチルフェニル）アミノ）−２−ピリミジニル）チオ）酢酸、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、（１１）に記載の剤。
（１５）マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの使用。
（１６）角膜上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの使用。
（１７）マイボーム腺機能不全の治療剤を製造するための、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの使用。
（１８）角膜上皮障害の治療剤を製造するための、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの使用。
（１９）涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤を製造するための、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの使用。
（２０）マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、ＰＰＡＲδアゴニストの使用。
（２１）角膜上皮細胞の増殖促進剤を製造するための、ＰＰＡＲδアゴニストの使用。
（２２）マイボーム腺機能不全の治療剤を製造するための、ＰＰＡＲδアゴニストの使用。
（２３）角膜上皮障害の治療剤を製造するための、ＰＰＡＲδアゴニストの使用。
（２４）涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤を製造するための、ＰＰＡＲδアゴニストの使用。
（２５）マイボーム腺上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの有効量を投与することを含む、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進方法。
（２６）角膜上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの有効量を投与することを含む、角膜上皮細胞の増殖促進方法。
（２７）マイボーム腺機能不全の治療のために行われる、（２５）記載の方法。
（２８）角膜上皮障害の治療のために行われる、（２６）に記載の方法。
（２９）涙液蒸発亢進型ドライアイを患う患者に、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの有効量を投与することを含む、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療方法。
（３０）マイボーム腺上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、ＰＰＡＲδアゴニストの有効量を投与することを含む、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進方法。
（３１）角膜上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、ＰＰＡＲδアゴニストの有効量を投与することを含む、角膜上皮細胞の増殖促進方法。
（３２）マイボーム腺機能不全の治療のために行われる、（３０）記載の方法。
（３３）角膜上皮障害の治療のために行われる、（３１）に記載の方法。
（３４）涙液蒸発亢進型ドライアイを患う患者に、ＰＰＡＲδアゴニストの有効量を投与することを含む、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療方法。

本発明によれば、新規のマイボーム腺上皮細胞増殖促進剤または角膜上皮細胞増殖促進剤が提供され、該促進剤は、マイボーム腺上皮細胞および角膜上皮細胞の増殖を促進する。また、本発明の治療剤は、マイボーム腺機能不全、角膜上皮障害、涙液蒸発亢進型ドライアイなどの疾患の治療・改善に有効に用いることができる。

図１は、培養ヒト角膜上皮細胞（上段）、培養ウサギ角膜上皮細胞（中段）、および培養サルマイボーム腺上皮細胞（下段）でのＰＰＡＲα、δ、γのｍＲＮＡの発現を示す。

本発明は、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤を提供する。該促進剤はマイボーム腺上皮細胞の増殖を促進するものである。また、本発明は、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮細胞の増殖促進剤を提供する。該促進剤は角膜上皮細胞の増殖を促進するものである。なお、本発明にいう細胞増殖促進剤とは、細胞分裂を促進し細胞数を増加させる作用を有するもの、および細胞死を抑制して細胞数を増加させる作用を有するものの両者を意味する。

本発明の促進剤は、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストを有効成分として含有するものである。ＰＰＡＲαアゴニストとは、ＰＰＡＲαと結合してＰＰＡＲαを活性化する作用を有する物質をいう。また、ＰＰＡＲδアゴニストとは、ＰＰＡＲδと結合してＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質をいう。

ＰＰＡＲαまたはδアゴニストとしては、種々の公知のＰＰＡＲαまたはδアゴニストが挙げられる。具体的なＰＰＡＲαまたはδアゴニストとしては、例えば、ＷＯ２００１／００６０３、ＷＯ９９／６２８７２、ＷＯ２００２／１００８１３、ＷＯ９７／２８１４９、ＷＯ２００４／０２２５５１、ＷＯ２００１／７９１９７、ＷＯ２００３／０９９７９３、ＷＯ２００５／１０５７３６、ＷＯ２００５／１０５７２６、ＷＯ２００５／０８５２３５、ＷＯ２００５／１１３６００、ＷＯ２００５／１０５７５４、ＷＯ２００５／０４９６０６、ＷＯ２００４／１１１０２０、ＷＯ２００６／０５５１８７、ＷＯ２００６／０８４１７６、ＷＯ２００５／０６０９５８、ＷＯ２００５／０９７７８６、ＷＯ２００４／０９２１１７、ＷＯ２００５／０３７７６３、ＷＯ２００５／０３０６９４、ＷＯ２００５／０１６３３５、ＷＯ２００３／０７４４９５、ＷＯ２００４／０５８１７４、ＪＰ２００３−１７１２７５Ａ、ＪＰ２００５−１７９２８１Ａ、ＷＯ２００６／０３１９６９、ＷＯ２００５／０９７７６３、ＷＯ２００４／０６３１６５、ＷＯ２００２／０５００４８、ＷＯ２００５／０９０９６６、ＷＯ２００３／０９９７９３、ＷＯ２００２／０７６９５９、ＷＯ２００２／０５３５４７、ＷＯ２００１／００６０３、ＷＯ９７／２８１４９、ＷＯ２００４／０６３１８４、ＷＯ２００６／０９０９２０、ＷＯ２００６／０５９７４４、ＷＯ２００６／０４１１９７、ＷＯ２００３／０３３４９３、ＷＯ２００３／０１６２９１、ＷＯ２００２／０７６９５７、ＷＯ２００２／０４６１７６、ＷＯ２００２／０４６１５４、ＷＯ２００２／０１４２９１、ＷＯ２００１／０７９１９７などに記載されている物質などが挙げられる。

ＰＰＡＲαまたはδアゴニスト化合物の具体例としては、２−（４−（４−クロロベンゾイル）フェノキシ）−２−メチルプロピオン酸１−メチルエチルエステル（fenofibrate; CAS登録番号49562-28-9）、（（４−クロロ−６−（（２，３−ジメチルフェニル）アミノ）−２−ピリミジニル）チオ）酢酸（WY-14643; CAS登録番号50892-23-4）、（４−（３−（４−アセチル−３−ヒドロキシ−２−プロピル）フェノキシ）プロポキシフェノキシ）酢酸（L-165041; CAS登録番号79558-09-1）、（２−メチル−４−（（（４−メチル−２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−５−チアゾリル）メチル）チオ）フェノキシ）酢酸（GW-501516; CAS登録番号317318-70-0）、（４−(((２−（３−フルオロ−４−(トリフルオロメチル)フェニル）−４−メチル−５−チアゾリル)メチル)チオ)−２−メチルフェノキシ）酢酸（GW-0742; CAS登録番号317318-84-6）、2-メチル-4-((2R)-2-(3-メチル-5-(4-(トリフルオロメチル)フェニル)-2-チエニル)プロポキシ)-ベンゼンプロピオン酸（CAS登録番号728038-95-7）、2-エチル-2-(4-(4-(4-(4-メトキシフェニル)-ピペラジン-1-イル)-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾル-5-イルメチルスルファニル)-フェノキシ)酪酸（GSK-677954；CAS登録番号884324-15-6）、(4-(3-(3-フェニル-7-プロピル-ベンゾフラン-6-イルオキシ)-プロピルスルファニル)-フェニル)酢酸（L-796449；CAS登録番号194608-80-5）、2-(4-(3-(1-(2-(2-クロロ-6-フルオロ-フェニル)-エチル)-3-(2,3-ジクロロ-フェニル)-ウレイド)-プロピル)-フェノキシ)-2-メチルプロピオン酸（GW-2433；CAS登録番号227941-61-9）などが挙げられる。

本発明においては、さらに、今までにＰＰＡＲαまたはδアゴニストであることが知られていない物質群からＰＰＡＲαまたはδを活性化する物質（化合物）をスクリーニングにより得て、それらを本発明の有効成分として使用しても良い。ＰＰＡＲαまたはδアゴニストは、それぞれ、ＰＰＡＲαまたはδのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合して、当該受容体を活性化し、ＰＰＡＲ標的遺伝子の転写を調節することが知られている。この性質を利用するとともに、哺乳動物の細胞に内在する他の核受容体の影響を除外するため、ＬＢＤと酵母（ｙｅａｓｔ）のＧＡＬ４とのキメラ受容体と、レポーター遺伝子とを用いたスクリーニング方法により、新規なＰＰＡＲαまたはδアゴニストを選択することができる。

前記スクリーニング方法としては、ＰＰＡＲ−ＧＡＬ４アッセイ（参考文献、T.M. Willson et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2000, vol.43, No.4, p.528-550およびJ.M.Lehmann et al., The Journal of Biological Chemistry, 1995, vol.270, No.22, p.12953-12956）が例示される。具体的には、
（ａ）ｙｅａｓｔの転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とＰＰＡＲαまたはδのＬＢＤとの融合タンパク質を発現させるベクターおよびＧＡＬ４のＤＮＡ結合エレメントとレポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを細胞に導入する工程、
（ｂ）前記細胞と試験物質とを接触させ、当該細胞におけるレポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を試験物質を接触させない対照細胞における発現量と比較する工程、および
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＰＰＡＲαまたはδを活性化する物質を選択する工程
を含む方法が挙げられる。

上記方法の工程（ａ）において、用いる細胞はＧＡＬ４を内在的に発現しない細胞、好ましくは、哺乳動物細胞である。レポーター遺伝子は、検出可能なタンパクまたは酵素をコードする遺伝子であればよく、例えば、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＳＰＡＰ（分泌型胎盤由来アルカリホスファターゼ)遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
上記融合タンパク質発現ベクターおよびレポータープラスミドの調製、ならびに当該ベクターおよびプラスミドの細胞への導入は、上記参考文献または自体公知の方法により行うことができる。

上記方法の工程（ｂ）において、試験物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
また、工程（ｂ）では、いわゆるレポーターアッセイにより試験物質の有無によるＰＰＡＲαまたはδの転写活性を調べる。レポーターアッセイは、用いるレポーター遺伝子に応じて自体公知の方法により行うことができる。

上記方法の工程（ｃ）において、試験物質存在下でのレポーター活性が非存在下でのレポーター活性よりも有意に高い場合、その試験物質はＰＰＡＲαまたはδ作動活性を有する化合物と判定され得る。

本発明に用いられるＰＰＡＲαアゴニストのヒトＰＰＡＲαに対する活性は、ＥＣ_５０値として、５０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、さらに好ましくは５μＭ以下である。本発明に用いられるＰＰＡＲδアゴニストのヒトＰＰＡＲδに対する活性は、ＥＣ_５０値として、１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下、さらに好ましくは０．１μＭ以下である。ＥＣ_５０値は、ヒトＰＰＡＲαまたはδを用いたＰＰＡＲ−ＧＡＬ４アッセイ（T.M. Willson et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2000, vol.43, No.4, p.527-550参照）により、測定した値である。

好ましいＰＰＡＲαまたはδアゴニストとしては、例えば下記一般式（Ｉ）：

[式中、
Ａは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｂは−ＣＯ−、一ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｓ−、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−および−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−（式中、ｎは１〜３の整数を表す）からなる群から選択されるリンカーを示し、
ＸおよびＹは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、
Ｚは酸素原子、硫黄原子または−ＣＨ_２−を示し、
Ａｒ_１は１〜３個の置換基を有していてもよい５〜６員環である芳香環基を示し、
Ｒ_ｌおよびＲ_２は同一または異なって水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｒ_３は水素、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基を示す]で表される構造を有する化合物、またはその薬理学的に許容される塩が挙げられる。

上記一般式（Ｉ）中、Ａで示される「炭素数１〜６のアルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、へキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル等が挙げられる。該炭素数１〜６のアルキル基は、好ましくはイソプロピルである。

上記一般式（Ｉ）中、Ｂで示されるリンカーは、好ましくは−ＣＯ−、−ＮＨ−、−ＣＨ_２−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−であり、さらに好ましくは−ＣＨ_２−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−である。

上記一般式（Ｉ）中、Ａｒ_１で示される５〜６員環である芳香環基としては、フェニル、フリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、フラザニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニルなどが挙げられる。該芳香環基は、好ましくはフェニルまたはチアゾリルである。

上記一般式（Ｉ）中、Ａｒ_１が有していてもよい置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のハロアルキル基、炭素数２〜７のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のハロアルキル基を有していてもよいフェニル基が挙げられる。該置換基は、好ましくは塩素原子、ヒドロキシ基、メチル基、アセチル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、３−フルオロ−４−メチルフェニル基である。

上記一般式（Ｉ）中、Ｒ_ｌおよびＲ_２で示される「炭素数１〜６のアルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、へキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル等が挙げられる。該炭素数１〜６のアルキル基は、好ましくはメチルである。

上記一般式（Ｉ）中、Ｒ_３で示される「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。該ハロゲン原子は、好ましくは塩素原子である。

上記一般式（Ｉ）中、Ｒ_３で示される「炭素数１〜６のアルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、へキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル等が挙げられる。該炭素数１〜６のアルキル基は、好ましくはメチルである。

一般式（Ｉ）で表される化合物の製薬学的に許容される塩としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸等との酸付加塩などが挙げられる。また、これらの塩には、その溶媒和物も含まれる。一般式（Ｉ）で表される化合物には不斉炭素原子や二重結合が存在していてもよく、そのような化合物については、光学異性体、幾何異性体が存在することがある。これらの異性体も本発明の範囲内に包含され、自体公知の方法によって単離、精製できる。本発明においては、それらの各異性体の混合物、単離されたものいずれでも使用することができる。

本発明において、一般式（Ｉ）で表される化合物の中で、好ましいＰＰＡＲαアゴニストとしては、２−（４−（４−クロロベンゾイル）フェノキシ）−２−メチルプロピオン酸１−メチルエチルエステル（fenofibrate; CAS登録番号 49562-28-9）、（（４−クロロ−６−（（２，３−ジメチルフェニル）アミノ）−２−ピリミジニル）チオ）酢酸（WY-14643; CAS登録番号50892-23-4）などが挙げられる。また、好ましいＰＰＡＲδアゴニストとしては、４−（３−（４−アセチル−３−ヒドロキシ−２−プロピル）フェノキシ）プロポキシフェノキシ酢酸（L-165041; CAS登録番号 79558-09-1）、（２−メチル−４−（（（４−メチル−２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−５−チアゾリル）メチル）チオ）フェノキシ）酢酸（GW-501516; CAS登録番号 317318-70-0）、（４−(((２−（３−フルオロ−４−(トリフルオロメチル)フェニル）−４−メチル−５−チアゾリル)メチル)チオ)−２−メチルフェノキシ）酢酸（GW-0742; CAS登録番号 317318-84-6）などが挙げられる。

好ましいδアゴニストとしては、例えば下記一般式（II）：

[式中、
Ａは水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｂは−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｓ−および−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−（式中、ｎは１〜３の整数を表す）からなる群から選択されるリンカーを示し、
ＸおよびＹは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、
Ｚは酸素原子、硫黄原子または−ＣＨ_２−を示し、
Ａｒ_１は１〜３個の置換基を有していてもよい５〜６員環である芳香環基を示し、
Ｒ_ｌおよびＲ_２は同一または異なって水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｒ_３は水素、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基を示す]
で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩が挙げられる。

上記一般式（II）中、Ａで示される「炭素数１〜６のアルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、へキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル等が挙げられる。

上記一般式（II）中、Ｂで示されるリンカーは、好ましくは−ＣＨ_２−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ_２）_３−Ｏ−である。

上記一般式（II）中、Ａｒ_１で示される５〜６員環である芳香環基としては、フェニル、フリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、フラザニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニルなどが挙げられる。該芳香環基は、好ましくはフェニルまたはチアゾリルである。

上記一般式（II）中、Ａｒ_１が有していてもよい置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のハロアルキル基、炭素数２〜７のアシル基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のハロアルキル基を有していてもよいフェニル基が挙げられる。該置換基は、好ましくは塩素原子、ヒドロキシ基、メチル基、アセチル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、３−フルオロ−４−メチルフェニル基である。

上記一般式（II）中、Ｒ_ｌおよびＲ_２で示される「炭素数１〜６のアルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、へキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル等が挙げられる。該炭素数１〜６のアルキル基は、好ましくはメチルである。

上記一般式（II）中、Ｒ_３で示される「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。該ハロゲン原子は、好ましくは塩素原子である。

上記一般式（II）中、Ｒ_３で示される「炭素数１〜６のアルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、へキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル等が挙げられる。該炭素数１〜６のアルキル基は、好ましくはメチルである。

一般式（II）で表される化合物の製薬学的に許容される塩としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸等との酸付加塩などが挙げられる。また、これらの塩には、その溶媒和物も含まれる。一般式（II）で表される化合物には不斉炭素原子や二重結合が存在していてもよく、そのような化合物については、光学異性体、幾何異性体が存在することがある。これらの異性体も本発明の範囲内に包含され、自体公知の方法によって単離、精製できる。本発明においては、それらの各異性体の混合物、単離されたものいずれでも使用することができる。

本発明において、一般式（II）で表される化合物の中で、好ましいＰＰＡＲδアゴニストとしては、４−（３−（２−プロピル−３−ヒドロキシ−４−アセチル）フェノキシ）プロピルオキシフェノキシ酢酸（L-165041; CAS登録番号 79558-09-1）、（２−メチル−４−（（（４−メチル−２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−５−チアゾリル）メチル）チオ）フェノキシ）酢酸（GW-501516; CAS登録番号 317318-70-0）、（４−(((２−（３−フルオロ−４−(トリフルオロメチル)フェニル）−４−メチル−５−チアゾリル)メチル)チオ)−２−メチルフェノキシ）酢酸（GW-0742; CAS登録番号 317318-84-6）などが挙げられる。

本発明の促進剤において、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの含有量は、通常０．０００００１〜１重量％、好ましくは０．００００１〜１重量％、最も好ましくは０．０００１〜０．１重量％である。

本発明の促進剤は、上記有効成分に加え、任意の担体を含むことができる。かかる担体としては、例えば、溶媒（例えば、水、アルコールなど）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸など）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル類、エデト酸ナトリウム、ホウ酸など）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）などが挙げられる。

本発明の促進剤は、医薬または試験用試薬などとして、インビボまたはインビトロにおいて用いられ得る。
本発明の促進剤を試験用試薬として使用する場合、生理学・生物化学分野における試験用試薬として、様々な態様で利用可能である。

医薬として用いる場合、本発明の促進剤は、マイボーム腺上皮細胞の増殖を促進するため、マイボーム腺上皮細胞の損傷または萎縮を伴う疾患、およびマイボーム腺上皮細胞の機能が低下することによって生じる疾患の治療剤として有用である。該疾患としてはマイボーム腺機能不全などが挙げられる。さらに、マイボーム腺上皮細胞は、涙液中の脂質成分を分泌し、この脂質は涙液の蒸発を防ぎ、涙液層を安定化するものであるため、本発明の治療剤は涙液中の脂質異常(分泌量減少、成分変化)を伴う疾患に対して有用である。該疾患としては、涙液蒸発亢進型ドライアイが挙げられる。また、本発明の促進剤は、ドライアイ、角膜潰瘍、点状表層角膜症、角膜上皮糜爛などの治療にも有用である。

また、本発明の促進剤は、角膜上皮細胞の増殖を促進するため、角膜上皮細胞の損傷（すなわち、創傷または欠損）を伴う疾患の治療剤としても有用である。本発明の促進剤は、角膜上皮障害、具体的には、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼球乾燥症候群（ドライアイ）等の内因性疾患に伴う角膜上皮障害；術後、薬剤性、外傷、コンタクトレンズ装用等における外因性疾患に伴う角膜上皮障害；角膜潰瘍、春季カタルやアトピー性角結膜炎等の角膜病変を伴う眼アレルギー性疾患に伴う角膜上皮障害の治療剤として有用である。本発明の促進剤は、点状表層角膜症、角膜上皮糜爛の治療にも有用である。さらに、本発明の促進剤は、角膜創傷治癒促進剤としても有用である。

さらに、本発明の促進剤は、角膜上皮細胞増殖促進作用とマイボーム腺上皮細胞増殖作用を併せ持つことにより、角膜組織に直接作用する効果とマイボーム腺細胞に働くことにより涙液の機能を改善するという効果を発揮するため、特に涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤として非常に有用である。

本発明の治療剤において、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの含有量は、通常０．０００００１〜１重量％、好ましくは０．００００１〜１重量％、最も好ましくは０．０００１〜０．１重量％である。

本発明の促進剤または治療剤の投与対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）が挙げられる。

本発明の治療剤は、点眼剤、貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、経口剤等の剤形で用いられ得、上記有効成分に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。

本発明の治療剤は、上述の治療効果を奏する限りその投与経路は特に限定されないが、好ましくは眼局所投与される。眼局所投与用剤形には、例えば、点眼剤や眼軟膏剤が挙げられる。
例えば、本発明の治療剤を点眼剤または眼軟膏剤として用いる場合、安定剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、溶解補助剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、乳化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０など）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸など）、粘稠剤（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル類、エデト酸ナトリウム、ホウ酸など）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）、清涼化剤（例えば、ｌ−メントール、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ハッカ油など）、軟膏基剤（白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン、植物油（オリーブ油、椿油、落花生油など）など）などを添加剤として加えることができる。これら添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。
本発明の治療剤を点眼剤または眼軟膏剤とする場合、製剤分野で通常用いられている方法に従って製造すればよく、例えば第１４改正日本薬局方、製剤総則、点眼剤の項および眼軟膏剤の項に記載された方法に基づき製造することができる。

本発明は、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの有効量を投与することを含む、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進方法を提供する。当該方法は、マイボーム腺機能不全の治療のために行われることが望ましい。

また、本発明は、角膜上皮細胞の増殖促進を必要とする対象に、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの有効量を投与することを含む、角膜上皮細胞の増殖促進方法を提供する。当該方法は、角膜上皮障害の治療のために行われることが望ましい。

また、本発明は、涙液蒸発亢進型ドライアイを患う患者に、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの有効量を投与することを含む、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療方法を提供する。

ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの有効量は、化合物の種類、投与対象の年齢、体重、状態、治療目的等により一概に規定できないが、本発明の促進剤または治療剤をヒトに投与する場合には、ＰＰＡＲαまたはδアゴニストの濃度として通常０．０００００１〜１重量％、好ましくは０．００００１〜１重量％、最も好ましくは０．０００１〜０．１重量％のＰＰＡＲαまたはδアゴニストを含む溶液を、１日１回〜８回、１回に片眼あたり１〜２滴、すなわち、１回当り約５０〜２００μＬの量が例示され、かかる濃度と容量の範囲内の溶液に含まれるＰＰＡＲαまたはδアゴニストの量を有効量として例示することができる。

以下、本発明を詳細に説明するため試験例を挙げるが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。

（試験例１）
角膜上皮細胞を用いた細胞数の増加に対するPPARアゴニストの効果
１．使用動物
雄性日本白色種ウサギ（北山ラベス）を用いた。実験動物の使用にあたっては、動物を用いる生物医学研究に関する原則（International Guiding Principles for Biomedical Research involving Animals）に従った。
２．角膜上皮細胞の調製
角膜上皮細胞はウサギ眼球から調製した。摘出した眼球から角膜を切り出してDulbecco’s phosphate buffered saline（D-PBS; Invitrogen）中に保存し、これをクリーンベンチ内に移した。以下の細胞調製操作は全て無菌的に行なった。
摘出角膜片を1%のpenicillin-streptomycin（Invitrogen）を添加したD-PBS中で3回洗浄し、minimum essential medium（MEM; Invitrogen）中に移した。MEM中に浸漬した角膜片の角膜内皮細胞およびデスメ膜を眼科手術用ナイフ（Alcon）で剥離し、剥離後の角膜片（角膜実質および角膜上皮）を2.4U/mLとなるようにdispase II（Roche Diagnostics）を添加したMEMに移した。これを３７℃で1時間加温し、その後、dispase II処理した角膜片をMEM中に移した。MEM中に浸漬した角膜片の角膜上皮を眼科用手術ナイフで剥離し、角膜片残渣（角膜実質）をMEMから取り除いた。剥離した角膜上皮細胞は、これを含むMEMごと50mLの遠沈管に回収し、室温，1,500回転，5分間の遠心分離に供して上清を廃棄することにより、角膜上皮細胞層を得た。角膜上皮細胞層に1mLのtrypsin-EDTA（Invitrogen）を添加してよく混合した後、37℃で5分間加温して細胞間の接着を乖離させた。これに10%のfetal bovine serum（FBS; Invitrogen）を含むMEMを9mL添加して酵素反応を停止させ、再度、室温，1,500回転，5分間の遠心分離に供して角膜上皮細胞層を得た。得られた角膜上皮細胞層に1mLの正常ウサギ角膜上皮細胞増殖用無血清液体培地（RCGM2; クラボウ）を添加して細胞を懸濁させ、9mLのRCGM2を添加した直径10cmの細胞培養用培養皿（IWAKI）中に播種した。播種細胞は37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器（SANYO）内で培養した。培養液は試験当日まで48時間ごとに新しいものに交換した。

３．被験物質および調製方法
被験物質として下記の化合物を使用した。
PPARαアゴニスト：WY-14643（Calbiochem）およびfenofibrate（Sigma-Aldrich）
PPARδアゴニスト：L-165041（Sigma-Aldrich）
それぞれの被験物質は、培養液中での最終濃度の200倍濃度になるようにエタノール（和光純薬）に溶解し、使用直前まで-80℃で保存した。
なお、各被験物質による細胞増殖促進効果の検討には、RCGM2からこれに添付されたマウス由来上皮成長因子（mEGF）を除いた培養液を基礎培地として用い、一方、細胞増殖促進効果確認のための陽性対照として、RCGM2調製プロトコルの指示どおりにmEGFを添加した培地（基礎培地＋10ng/mL mEGF）を用いた。

４．試験方法
１）培養皿のコラーゲン処理
細胞増殖促進試験のための培養皿として96穴組織培養用培養皿（Corning）を用いた。試験の前日、培養皿の各穴に0.01%のI型コラーゲン（新田ゼラチン）を50μLずつ分注して試験直前まで4℃でコーティングを行なった。試験当日、I型コラーゲン溶液を除去した後、D-PBSを用いて3度、培養皿底面を洗浄し、これをコラーゲン処理培養皿として試験に用いた。
２）細胞培養および被験物質の添加
試験には、直径10cmの培養皿でサブコンフルエントになるまで培養したウサギ角膜上皮細胞を用いた。培養液を除去した後、培養皿底面をD-PBSを用いて2度洗浄し、これに1mLのtrypsin-EDTAを添加して37℃で5分間加温することにより、細胞を培養皿底面から剥離させた。加温後、培養皿に10%のFBSを含むMEMを9mL添加して酵素反応を停止させた後、室温，1,500回転，5分間の遠心分離に供して角膜上皮細胞層を得た。得られた細胞に対し、その細胞濃度が2×10⁵細胞／ｍLとなるように適量のRCGM2を添加して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を、コラーゲン処理した96穴組織培養用培養皿の底面面積（0.32 cm²）あたりの細胞数が4×10⁴細胞／cm²となるよう、各穴に64μLずつ分注した。細胞播種完了後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移し、24時間培養した。細胞播種の24時間後、培養液を廃棄し、新たに培養皿の各穴に下記の培養液を100μLずつ分注した。
〔１〕基礎培地のみ（無添加群）
〔２〕基礎培地＋mEGF（最終濃度：10ng/mL；陽性対照群）
〔３〕基礎培地＋WY-14643（最終濃度：0.1μMおよび1μM）
〔４〕基礎培地＋fenofibrate（最終濃度：1μMおよび10μM）
〔５〕基礎培地＋L-165041（最終濃度：0.1μMおよび1μM）
なお、全ての培養液中のエタノール濃度を0.5%に統一させるため、培養液〔１〕および〔２〕に対してはそれぞれ1mLあたり5μLのエタノールを添加した。
３）細胞数測定
培養液交換の48時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に10%のCell Counting Kit-8（DOJINDO）を添加した基礎培地を100μLずつ分注した。分注後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して2時間加温した。2時間の加温後、マイクロプレートリーダー（大日本製薬）を用いて450nmの吸光度を測定し、これを細胞数増加の指標とした。

５．統計学的解析
無添加群の吸光度の平均値を100%としたときの、無添加群，各被験物質添加群および陽性対照群の各群の値を算出し、無添加群と各被験物質添加群および陽性対照群との比較をDunnettの多重比較検定法（両側）を用いて行なった。検定の結果、危険率5%未満の場合を有意と判定した。

６．試験結果
各群の細胞数増加効果を表1に示した。無添加群の細胞増殖を100%とした場合、全ての被験物質添加群および陽性対照群での細胞増殖は無添加群よりも有意（p<0.01）に高く、細胞増殖が亢進していることが示された。この試験結果より、PPARαアゴニストおよびPPARδアゴニストは角膜上皮細胞の細胞数を増加させることが明らかとなった。

培養ウサギ角膜上皮細胞にPPARαアゴニストまたはPPARδアゴニストあるいはmEGF（陽性対照）を添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を100%とした際の値として示している(平均値±標準偏差，N=5)。表中の**は無添加群に対する有意差（p<0.01）を示す。

（試験例２）
角膜上皮細胞を用いた細胞数の増加に対するPPARδアゴニストの効果
１．使用動物
雄性日本白色種ウサギ（体重約1.5kg，北山ラベス）を用いた。実験動物の使用にあたっては、動物を用いる生物医学研究に関する原則（International Guiding Principles for Biomedical Research involving Animals）に従った。
２．角膜上皮細胞の調製
ウサギ角膜上皮細胞は（試験例１）と同様の手法を用いて調製した。

３．被験物質および調製方法
被験物質として下記の化合物を使用した。
PPARδアゴニスト：L-165041（Sigma-Aldrich）およびGW-501516（Alexis）
それぞれの被験物質は、培養液中での最終濃度の200倍濃度になるようにエタノール（和光純薬）に溶解し、使用直前まで-80℃で保存した。
なお、各被験物質による細胞増殖促進効果の検討には、RCGM2からこれに添付されたマウス由来上皮成長因子（mEGF）を除いた培養液を基礎培地として用い、一方、細胞増殖促進効果確認のための陽性対照として、RCGM2調製プロトコルの指示どおりにmEGFを添加した培地（基礎培地＋10ng/mL mEGF）を用いた。

４．試験方法
１）培養皿のコラーゲン処理
培養皿のコラーゲン処理は（試験例１）と同様の手法を用いて施した。
２）細胞培養および被験物質の添加
試験には、直径10cmの培養皿でサブコンフルエントになるまで培養したウサギ角膜上皮細胞を用いた。培養液を除去した後、培養皿底面をD-PBSを用いて2度洗浄し、これに1mLのtrypsin-EDTAを添加して37℃で5分間加温することにより、細胞を培養皿底面から剥離させた。加温後、培養皿に10%のFBSを含むMEMを9mL添加して酵素反応を停止させた後、室温，1,500回転，5分間の遠心分離に供して角膜上皮細胞層を得た。得られた細胞に対し、その細胞濃度が1×10⁵細胞／mLとなるように適量のRCGM2を添加して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を、コラーゲン処理した96穴組織培養用培養皿の底面面積（0.32 cm²）あたりの細胞数が2×10⁴細胞／cm²となるよう、各穴に64μLずつ分注した。細胞播種完了後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移し、24時間培養した。細胞播種の24時間後、培養液を廃棄し、新たに培養皿の各穴に下記の培養液を100μLずつ分注した。
〔１〕基礎培地のみ（無添加群）
〔２〕基礎培地＋mEGF（最終濃度：10ng/mL；陽性対照群）
〔３〕基礎培地＋L-165041（最終濃度：0.1μMおよび1μM）
〔４〕基礎培地＋GW-501516（最終濃度：0.01μMおよび0.1μM）
なお、全ての培養液中のエタノール濃度を0.5%に統一させるため、培養液〔１〕および〔２〕に対してはそれぞれ1mLあたり5μLのエタノールを添加した。
３）細胞数測定
被験物質等を含む培養液交換から48時間ごとに各穴の培養上清を除去し、新たに調製した上記の培養液を各ウェルに100μLずつ分注した。被験物質等を含む培養液への初回の交換から120時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に10%のCell Counting Kit-8（DOJINDO）を添加した基礎培地を100μLずつ分注した。分注後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して2時間加温した。2時間の加温後、マイクロプレートリーダー（大日本製薬）を用いて450nmの吸光度を測定し、これを細胞数増加の指標とした。

５．統計学的解析
無添加群の吸光度の平均値を100%としたときの、無添加群，各被験物質添加群および陽性対照群の各群の値を算出し、無添加群と各被験物質添加群および陽性対照群との比較をDunnettの多重比較検定法（両側）を用いて行なった。検定の結果、危険率5%未満の場合を有意と判定した。

６．試験結果
各群の細胞数増加効果を表2に示した。無添加群の細胞増殖を100%とした場合、全ての被験物質添加群および陽性対照群での細胞増殖は無添加群よりも有意（p<0.01）に高く、細胞増殖が亢進していることが示された。この試験結果より、PPARδ作動作用を有する化合物は角膜上皮細胞の細胞数を増加させることが明らかとなった。

培養ウサギ角膜上皮細胞にPPARδアゴニストあるいはmEGF（陽性対照）を添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を100%とした際の値として示している(平均値±標準偏差，N=5)。表中の**は無添加群に対する有意差（p<0.01）を示す。

（試験例３）
マイボーム腺上皮細胞を用いた細胞数の増加に対するPPARアゴニストの効果
１．使用動物
雌性カニクイザル（環境バイリス）を用いた。実験動物の使用にあたっては、動物を用いる生物医学研究に関する原則（International Guiding Principles for Biomedical Research involving Animals）に従った。
２．マイボーム腺上皮細胞の調製
マイボーム腺上皮細胞はサル眼瞼から調製した。眼瞼を摘出してDulbecco’s phosphate buffered saline（D-PBS; Invitrogen）中に保存し、これをクリーンベンチ内に移した。以下の細胞調製操作は全て無菌的に行なった。
摘出眼瞼を80%のエタノール中に30秒間浸漬した後、1%のpenicillin-streptomycin（Invitrogen）を添加したD-PBS中で3回洗浄し、minimum essential medium（MEM; Invitrogen）中に移した。実体顕微鏡下で眼瞼のマイボーム腺組織を取り囲む脂肪組織および筋組織を除去し、これを、0.475U/mL collagenase A（Roche Diagnostics）および2.4U/mL dispaseII（Roche Diagnostics）を含むMEM中に移して37℃で終夜加温した。加温終了後、酵素処理した組織を再度実体顕微鏡下におき、睫毛および眼瞼結合組織を除去してマイボーム腺組織を単離した。単離した腺組織に1mLのtrypsin-EDTA（Invitrogen）を添加して37℃で5分間加温した。加温後、これに10%のFBSを含むMEMを9mL加えて酵素反応を停止させ、ついで、10mLのピペットを用いて5回、さらに、21Gの注射針を付けた注射筒で5回、吸引排出を繰り返して組織構成細胞を分散させた。細胞分散液は、100μm、ついで、40μmのナイロンフィルター（Cell Strainer; Falcon）に供し、これに含まれる酵素処理できなかった細胞塊などを除去した。フィルターを通過させた細胞懸濁液は50mLの遠沈管に回収し、室温，1,500回転，5分間の遠心分離に供した。遠心分離により得た目的細胞を含む細胞層に、0.5%のbovine serum albumin（BSA; Sigma-Aldrich）を含むD-PBSを80μL添加して細胞を十分に懸濁させた後、これに、20μLのAnti-Fibroblast Microbeads（Militenyi Biotec）を加えて室温で30分間静置した。抗体との反応終了後、これに0.5%のBSAを含むD-PBSを2mL添加して、再度、室温，1,500回転，5分間の遠心分離に供した。遠心分離により得た目的細胞を含む細胞層に、0.5%のBSAを含むD-PBSを1mL添加して細胞を十分に懸濁させ、あらかじめ、カラム洗浄液（2mMのEDTA（同仁化学）および0.5%のBSAを含むD-PBS）を用いて平衡化しておいたLD column（Militenyi Biotec）に、これを滴下した。ついで、2mLのカラム洗浄液をLD columnに滴下した。細胞懸濁液滴下直後からカラム洗浄液滴下終了までの間、カラムに吸着しなかった抗体非標識の目的細胞（非線維芽細胞）を50mL遠沈管に回収した。遠沈管に回収した細胞を、もう一度、室温，1,500回転，5分間の遠心分離に供して上清を除去した。この沈渣に、1mLのDefined Keratinocyte-Serum Free Medium（DK-SFM; Invitrogen）を添加して細胞を懸濁させ、マイボーム腺上皮細胞懸濁液を調製した。調製した細胞は、予めI型コラーゲン溶液（新田ゼラチン）でコーティングを済ませ、3mLのDK-SFMを添加しておいた直径3.5cmの細胞培養用培養皿（IWAKI）に播種した。播種細胞は37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器（SANYO）内で培養し、培養液は試験当日まで48時間ごとに新しいものに交換した。

３．被験物質および調製方法
被験物質として下記の化合物を使用した。
PPARαアゴニスト：fenofibrate（Sigma-Aldrich）
PPARδアゴニスト：L-165041（Sigma-Aldrich）
PPARγアゴニスト：troglitazone (Calbiochem)
それぞれの被験物質は、培養液中での最終濃度の200倍濃度になるようにエタノール（和光純薬）に溶解し、使用直前まで-80℃で保存した。
なお、各被験物質による細胞増殖促進効果の検討には、DK-SFMからこれに添付されたsupplementを除いた培養液を基礎培地として用い、一方、細胞増殖促進効果確認のための陽性対照として、DK-SFM調製プロトコルの指示どおりにsupplementを添加した培地（基礎培地＋supplement）を用いた。

４．試験方法
１）培養皿のコラーゲン処理
細胞増殖促進試験のための培養皿として96穴組織培養用培養皿（Corning）を用いた。試験の前日、培養皿の各穴に0.01%のI型コラーゲン（新田ゼラチン）を50μLずつ分注して試験直前まで4℃でコーティングを行なった。試験当日、I型コラーゲン溶液を除去した後、D-PBSを用いて3度、培養皿底面を洗浄し、これをコラーゲン処理培養皿として試験に用いた。
２）細胞培養および被験物質の添加
試験には、直径3.5cmの培養皿でサブコンフルエントになるまで培養し、液体窒素中で凍結保存しておいたサルマイボーム腺上皮細胞を用いた。セルバンカー（日本全薬工業）に懸濁して凍結保存しておいた細胞を解凍した後、50mL遠沈管に移して10倍量のDK-SFMを添加した。室温，1,500回転，5分間の遠心分離に供して細胞層を回収した後、得られた細胞濃度が3×10⁶細胞／ｍLとなるように適量のDK-SFMを添加して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を、コラーゲン処理した96穴組織培養用培養皿の底面面積（0.32 cm²）あたりの細胞数が6×10⁴細胞／cm²となるよう、各穴に64μLずつ分注した。細胞播種完了後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移し、24時間培養した。細胞播種の24時間後、培養液を廃棄し、新たに培養皿の各穴に下記の培養液を100μLずつ分注した。
〔１〕基礎培地のみ（無添加群）
〔２〕基礎培地＋supplement（陽性対照群）
〔３〕基礎培地＋fenofibrate（最終濃度：1μMおよび10μM）
〔４〕基礎培地＋L-165041（最終濃度：0.1μMおよび1μM）
〔５〕基礎培地＋troglitazone（最終濃度：0.1μMおよび1μM）
なお、全ての培養液中のエタノール濃度を0.5%に統一させるため、培養液〔１〕および〔２〕に対してはそれぞれ1mLあたり5μLのエタノールを添加した。
３）細胞数測定
初回の培養液交換の48時間後、培養液を新たに調製した上記〔１〕〜〔４〕の培養液に交換した。そのさらに48時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に10%のCell Counting Kit-8（DOJINDO）を添加したDK-SFMを100μLずつ分注した。分注後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して2時間加温した。2時間の加温後、マイクロプレートリーダー（大日本製薬）を用いて450nmの吸光度を測定し、これを細胞数増加の指標とした。

５．統計学的解析
無添加群の吸光度の平均値を100%としたときの、無添加群，各被験物質添加群および陽性対照群の各群の値を算出し、無添加群と各被験物質添加群および陽性対照群との比較をDunnettの多重比較検定法（両側）を用いて行なった。検定の結果、危険率5%未満の場合を有意と判定した。

６．試験結果
各群の細胞数増加効果を表３に示した。無添加群の細胞増殖を100%とした場合、PPARαアゴニストであるfenofibrate添加群およびPPARδアゴニストであるL-165041添加群、また、陽性対照群での細胞増殖は無添加群よりも有意（p<0.01）に高く、細胞増殖が亢進していることが示された。一方、PPARγアゴニストであるtroglitazoneは、細胞増殖促進作用を示さなかった。この試験結果より、PPARαアゴニストおよびPPARδアゴニストはマイボーム上皮細胞の細胞数を増加させることが明らかとなった。

培養サルマイボーム腺上皮細胞にPPARαアゴニスト、PPARδアゴニストまたはPPARγアゴニストあるいはsupplement（陽性対照）を添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を100%とした際の値として示している(平均値±標準偏差，N=5)。表中の**は無添加群に対する有意差（p<0.01）を示す。

（試験例４）
角膜上皮細胞およびマイボーム腺上皮細胞でのPPARsの発現
1.使用細胞
ウサギ角膜上皮細胞は（試験例1）と同様の方法で調製、培養したものを用いた。サルマイボーム腺上皮細胞は（試験例3）と同様の方法で調製、培養したものを用いた。ヒト角膜上皮細胞（クラボウ）は正常ヒト角膜上皮細胞増殖用無血清基礎培地（EpiLife; クラボウ）を用いて37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内で培養したものを用いた。

2.試験方法
1)細胞からの全RNAの抽出
TRizol Reagent（Invitrogen）の常法に従って各細胞からの全RNAを抽出した。
2)抽出RNAからのcDNA作製
DNA-free（Ambion）の常法に従って抽出した全RNAのDNase処理を37℃で30分間行ない、ゲノムDNAを除去した。
抽出RNAからのcDNA作製はSuperscript II Reverse Transcriptase（Invitrogen）の常法に従って行なった。すなわち、DNase処理した1μgの全RNAから、ランダムプライマー（Invitrogen）を用いてこれらに相補するcDNAを作製した。
3)PPARs遺伝子の増幅（Polymerase Chain Reaction; PCR）
PPARs遺伝子のPCRはPlatinum PCR SuperMix（Invitrogen）の常法に従って行なった。PPARsプライマーは、既知のヒト，チンパンジー、カニクイザル、ウシ、マウスなどの配列を参考に、PCR産物が約200 bpsとなるように設計した。
PPARα：GTAGAATCTGCGGGGACAAG (sense)（配列番号１）
：GTTGTGTGACATCCCGACAG (antisense)（配列番号２）
PPARδ：TTCCTTCCAGCAGCTACACA (sense)（配列番号３）
：GATCGTACGACGGAAGAAGC (antisense)（配列番号４）
PPARγ：CTCCGTGGATCTCTCCGTAA (sense)（配列番号５）
：GATGCAGGCTCCACTTTGAT (antisense)（配列番号６）
PCR反応は、94℃で2分15秒間反応させた後、94℃で30秒間，55℃で30秒間，72℃で30秒間の3段階の反応を35回繰り返すことで完了させた。PCRの反応後の試料を2%のアガロースゲルを用いた電気泳動に供し、ついでゲル内に分離されたDNAをSYBR Gold（Molecular Probes）を用いて染色した。染色されたDNAをUVトランスイルミネーター上で発光させ、この画像をデジタルデータとして保存した。

3.試験結果
電気泳動後の染色されたDNAのバンドを図1に示す。本試験の結果、ヒト角膜上皮細胞およびサルマイボーム腺上皮細胞にはPPARα、PPARδおよびPPARγの全てが発現していることが確認された。なお、ウサギ角膜上皮細胞ではPPARδの発現のみが確認された。Bonazziらはウサギ角膜上皮細胞にはPPARsのうちPPARαおよびPPARβ（＝δ）が発現すると報告しているが（Bonazzi A. et al., J. Biol. Chem. (2000); 275 (4): 2837-2844）、その報告の中で、彼らはPPARαの検出に特殊な方法を用いている。試験例１に示すとおり、PPARα作動剤がウサギ角膜上皮細胞の増殖を促進させることは明らかであるが、Bonazziらの報告でも特殊な検出方法を用いてPPARαを検出していることから、ウサギ角膜上皮細胞でのPPARα発現量は非常に少ないと推測される。

（試験例５）
正常ヒト角膜上皮細胞を用いた細胞数の増加に対するPPARδアゴニストの効果
1.使用細胞
正常ヒト角膜上皮細胞（KURABO）を用いた。
2.被験物質および調製方法
被験物質として下記の化合物を使用した。
PPARδアゴニスト：L-165041（Sigma-Aldrich），GW-501516（Alexis）
それぞれの被験物質は、培養液中での最終濃度の200倍濃度になるようにエタノール（和光純薬）に溶解し、使用直前まで-80℃で保存した。
なお、各被験物質による細胞増殖促進効果の検討には、細胞培養液として、EpiLife（KURABO）にHCGS増殖添加剤セット（KURABO）に含まれるインスリン、ハイドロコーチゾン、トランスフェリンを添加した培養液（基礎培地）を用いた。また、細胞増殖促進効果確認のための陽性対照として、基礎培地にHCGS増殖添加剤セット（KURABO）に含まれるマウス由来上皮成長因子（mEGF）を添加した培地（基礎培地＋1ng/mL mEGF）を用いた。

3.試験方法
1)細胞培養および被験物質の添加
液体窒素中に凍結保存された正常ヒト角膜上皮細胞を解凍し、その細胞数を計数した後、その全量をHCGS増殖添加剤セット（インスリン、マウス由来上皮成長因子、ハイドロコーチゾン、トランスフェリン、ウシ脳下垂体抽出物）の全てを添加した4mLのEpiLife（完全培地）中に移してよく懸濁した。この細胞懸濁液を、フィブロネクチンコートマルチウェルプレート（24穴，BECTON DICKINSON）に、細胞数が2×10⁴ cells/500μL/穴となるように播種した（底面面積が2cm²であるため、1×10⁴ cells/cm²）。
細胞播種完了後、培養皿を37℃，5% CO₂，95% air，100% humidityに設定した培養器内で24時間培養し、ついで培養液を400μLの基礎培地に交換した。
さらにその24時間後、培養液を下記の培養液、各400μLに交換した。
〔１〕基礎培地のみ（無添加群）
〔２〕基礎培地＋mEGF（最終濃度：1ng/mL；陽性対照群）
〔３〕基礎培地＋L-165041（最終濃度：0.01μMおよび0.1μM）
〔４〕基礎培地＋GW-501516（最終濃度：0.001μMおよび0.01μM）
なお、全ての培養液中のエタノール濃度を0.5%に統一させるため、培養液〔１〕および〔２〕に対してはそれぞれ1mLあたり5μLのエタノールを添加した。
2）細胞数測定
被験物質による刺激開始から24時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に10%のCell Counting Kit-8（DOJINDO）を添加した基礎培地を200μLずつ分注した。分注後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して2時間加温し、反応終了後の上清から各100μLを96穴組織培養用培養皿（Corning）に分取した。96穴培養皿に移した反応液の450nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（大日本住友製薬）を用いて測定し、これを細胞数増加の指標とした。

4.統計学的解析
無添加群の吸光度の平均値を100%としたときの、無添加群，各被験物質添加群および陽性対照群の各群の値を算出し、無添加群と各被験物質群間および陽性対照群との比較をDunnettの多重比較検定法（片側）を用いて行なった。検定の結果、危険率5%未満の場合を有意と判定した。

5.試験結果
各群の細胞数増加効果を表4に示した。無添加群の細胞増殖を100%とした場合、全ての被験物質添加群（p<0.01）および陽性対照群（p<0.05）での細胞増殖は無添加群よりも有意に高く、細胞増殖が亢進していることが示された。この試験結果より、PPARδアゴニストは正常ヒト角膜上皮細胞の細胞数を増加させることが明らかとなった。

培養正常ヒト角膜上皮細胞にPPARδアゴニストあるいはmEGF（陽性対照）を添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を100%とした際の値として示している(平均値±標準偏差，N=3〜4)。表中の*は無添加群に対する有意差（p<0.05）を、また、**は無添加群に対する有意差（p<0.01）を示す。

（試験例６）
正常ヒト角膜上皮細胞を用いた細胞数の増加に対するPPARδアゴニストの効果
1.使用細胞
正常ヒト角膜上皮細胞（KURABO）を用いた。
2.被験物質および調製方法
被験物質として下記の化合物を使用した。
PPARδアゴニスト：GW-501516（Alexis），GW-0742（Sigma-Aldrich）
それぞれの被験物質は、培養液中での最終濃度の200倍濃度になるようにエタノール（和光純薬）に溶解し、使用直前まで-80℃で保存した。
なお、各被験物質による細胞数増加効果の検討には、細胞培養液として、EpiLife（KURABO）にHCGS増殖添加剤セット（KURABO）に含まれるインスリン、ハイドロコーチゾン、トランスフェリンを添加した培養液（基礎培地）を用いた。

3.試験方法
1)細胞培養および被験物質の添加
液体窒素中に凍結保存された正常ヒト角膜上皮細胞を解凍し、その細胞数を計数した後、その全量をHCGS増殖添加剤セット（インスリン，マウス由来上皮成長因子、ハイドロコーチゾン、トランスフェリン、ウシ脳下垂体抽出物）の全てを添加した4mLのEpiLife（完全培地）中に移してよく懸濁した。この細胞懸濁液を96穴組織培養用培養皿（Corning）に、細胞数が1.28×10⁴ cells/100μL/穴となるように播種した（底面面積が0.32cm²であるため、4×10⁴ cells/cm²）。
細胞播種完了後、培養皿を37℃，5% CO₂，95% air，100% humidityに設定した培養器内で24時間培養し、ついで培養液を100μLの基礎培地（HCGS増殖添加剤のうち、インスリン、ハイドロコーチゾン、トランスフェリンを添加したEpiLife）に交換した。
さらにその24時間後、培養液を下記の培養液、各100μLに交換した。
〔１〕基礎培地のみ（無添加群）
〔２〕基礎培地＋GW-501516（最終濃度：0.01μM）
〔３〕基礎培地＋GW-0742（最終濃度：0.01μM）
なお、全ての培養液中のエタノール濃度を0.5%に統一させるため、培養液〔１〕に対しては1mLあたり5μLのエタノールを添加した。
2）細胞数測定
被験物質による刺激開始から48時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に10%のCell Counting Kit-8（DOJINDO）を添加した基礎培地を100μLずつ分注した。分注後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して2時間加温した。各穴の450nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（大日本住友製薬）を用いて測定して、これを細胞数増加の指標とした。

4.統計学的解析
無添加群の吸光度の平均値を100%としたときの、無添加群、各被験物質添加群の値を算出し、無添加群と各被験物質群間および陽性対照群との比較をDunnettの多重比較検定法（片側）を用いて行なった。検定の結果、危険率5%未満の場合を有意と判定した。

5.試験結果
各群の細胞数増加効果を表５に示した。無添加群の細胞増殖を100%とした場合、両被験物質添加群での細胞増殖は無添加群よりも有意に高く、細胞増殖が亢進していることが示された（p<0.01）。この試験結果より、PPARδアゴニストは正常ヒト角膜上皮細胞の細胞数を増加させることが明らかとなった。

培養正常ヒト角膜上皮細胞にPPARδアゴニストを添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を100%とした際の値として示している(平均値±標準偏差，N=4〜5)。表中の**は無添加群に対する有意差（p<0.01）を示す。

（試験例７）
正常ヒト角膜上皮細胞を用いた細胞数の増加に対するPPARγアゴニストの効果
1.使用細胞
正常ヒト角膜上皮細胞（KURABO）を用いた。
2.被験物質および調製方法
被験物質として下記の化合物を使用した。
PPARγアゴニスト：troglitazone（Calbiochem）
被験物質は、培養液中での最終濃度の200倍濃度になるようにエタノール（和光純薬）に溶解し、使用直前まで-80℃で保存した。
なお、正常ヒト角膜上皮細胞に対する各被験物質の影響の検討には、細胞培養液として、EpiLife（KURABO）にHCGS増殖添加剤セット（KURABO）に含まれる添加剤のうちマウス由来上皮増殖因子（mEGF）を除く、インスリン、ハイドロコーチゾン、トランスフェリンを添加した培養液（EpiLife基礎培地）を用いた。

3.試験方法
1)細胞培養および被験物質の添加
正常ヒト角膜上皮細胞
液体窒素中に凍結保存された正常ヒト角膜上皮細胞を解凍し、その細胞数を計数した後、その全量をmEGFを含む全てのHCGS増殖添加剤セットを添加したEpiLife（完全培地）中に移してよく懸濁した。この細胞懸濁液を、試験例1と同様にコラーゲンコート処理を施したマルチウェルプレート（96穴、Costar）に、細胞数が1.28×10⁴ cells/64μL/穴となるように播種した（底面面積が0.32cm²であるため、4×10⁴ cells/cm²）。
細胞播種完了後、培養皿を37℃，5% CO₂，95% air，100% humidityに設定した培養器内で24時間培養し、ついで、培養液を下記の被験物質を含む培養液、各100μLに交換して培養を継続した。
〔１〕EpiLife基礎培地のみ（無添加群）
〔２〕EpiLife基礎培地＋troglitazone（最終濃度：0.1μM）
なお、全ての培養液中のエタノール濃度を0.5%に統一させるため、培養液〔１〕に対しては1mLあたり5μLのエタノールを添加した。なお、被験物質添加開始日から細胞数の測定日までの間は、2日ごとに培養液を上記の被験物質を含むものに交換した。
2）細胞数測定
被験物質による刺激開始から6日後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に10%のCell Counting Kit-8（DOJINDO）を添加したEpiLife基礎培地を100μLずつ分注した。分注後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して2時間加温し、反応終了後の培養皿各ウェルの吸光度（450nm）をマイクロプレートリーダー（大日本住友製薬）を用いて測定し、これを細胞数の指標とした。

4.統計学的解析
無添加群の吸光度の平均値を100%としたときの、無添加群、各被験物質添加群の値を算出し、無添加群と各被験物質群間との比較をDunnettの多重比較検定法（片側）を用いて行なった。検定の結果、危険率5%未満の場合を有意と判定した。

5.試験結果
正常ヒト角膜上皮細胞にPPARγアゴニストが及ぼす影響を表６に示す。この試験結果より、PPARγアゴニストは、角膜上皮細胞の細胞数を増加させる効果は認められなかった。

培養正常ヒト角膜上皮細胞にPPARγアゴニストを添加した際の細胞数を、無添加群の平均値を100%とした際の値として示している(平均値±標準偏差，N=3〜4)。表中の**は無添加群に対する有意差（p<0.01）を示す。

（試験例８）
マイボーム腺上皮細胞の細胞数の増加に対するPPARδアゴニストの効果
1.サルマイボーム腺上皮細胞の調製
サル眼瞼からのマイボーム腺上皮細胞の調製は、試験例３と同様に行なった。細胞はDefined keratinocyte-Serum Free Medium（DK-SFM；Invitrogen，添付されたSupplementを調製プロトコルどおりに添加）を用いて、37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器（SANYO）内で培養し、培養液は細胞がサブコンフルエントに達するまで48時間ごとに新しいものに交換した。

2.被験物質および調製方法
被験物質として下記の化合物を使用した。
PPARδアゴニスト：L-165041（Sigma-Aldrich）およびGW-501516（Alexis）
それぞれの被験物質は、培養液中での最終濃度の200倍濃度になるようにエタノール（ナカライテスク）に溶解し、使用直前まで-80℃で保存した。
なお、各被験物質による細胞増殖促進効果の検討には、DK-SFMからこれに添付されたsupplementを除いた培養液を基礎培地として用い、一方、細胞増殖促進効果確認のための陽性対照として、DK-SFM調製プロトコルの指示どおりにsupplementを添加した培養液（基礎培地＋supplement）を用いた。

3.試験方法
1）培養皿のコラーゲン処理
細胞増殖促進試験のための培養皿は、試験例３と同様に、I型コラーゲン（新田ゼラチン）を用いてコーティングした。
2)細胞培養および被験物質の添加
試験には、サブコンフルエントになるまで培養し、セルバンカー（日本全薬工業）に懸濁して液体窒素中で凍結保存しておいたサルマイボーム腺上皮細胞を用いた。凍結保存しておいた細胞を解凍した後、50mL遠沈管に移して10倍量のDK-SFMを添加した。室温、1,500回転、5分間の遠心分離に供して細胞層を回収した後、得られた細胞濃度が2×10⁶細胞／mLとなるように適量のDK-SFMを添加して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を、コラーゲン処理した96穴組織培養用培養皿の底面面積（0.32cm²）あたりの細胞数が4×10⁴細胞／cm²となるよう、各穴に64μLずつ分注した。細胞播種完了後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移し、24時間培養した。細胞播種の24時間後、培養液を廃棄し、新たに培養皿の各穴に下記の培養液を100μLずつ分注した。
〔１〕基礎培地のみ（無添加群）
〔２〕基礎培地＋supplement（陽性対照群）
〔３〕基礎培地＋L-165041（最終濃度：0.1μMおよび1μM）
〔４〕基礎培地＋GW-501516（最終濃度：0.01μMおよび0.1μM）
なお、全ての培養液中のエタノール濃度を0.5%に統一させるため、培養液〔１〕および〔２〕に対してはそれぞれ1mLあたり5μLのエタノールを添加した。
3）細胞数測定
初回の培養液交換の48時間後、培養液を新たに調製した上記〔１〕〜〔４〕の培養液に交換した。その48時間後、もう一度培養液を新たに調製した上記〔１〕〜〔４〕の培養液に交換した。さらにその48時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各穴に10%のCell Counting Kit-8（DOJINDO）を添加した基礎培地を100μLずつ分注した。分注後、培養皿を37℃, 5% CO₂, 95% air, 100% humidityに設定した培養器内に移して2時間加温した。2時間の加温後、マイクロプレートリーダー（大日本製薬）を用いて450nmの吸光度を測定し、これを細胞数増加の指標とした。

4.統計学的解析
無添加群の吸光度の平均値を100%としたときの、無添加群、各被験物質添加群および陽性対照群の各群の値を算出し、無添加群と各被験物質群間および陽性対照群との比較をDunnettの多重比較検定法（片側）を用いて行なった。検定の結果、危険率5%未満の場合を有意と判定した。

5.試験結果
各群の細胞増殖促進効果を表７に示した。無添加群の細胞増殖を100%とした場合、PPARδアゴニストであるL-165041（10^-6M）添加群およびGW-501516（10^-7M）添加群、また、陽性対照群での細胞増殖は、無添加群よりも有意に高く、細胞増殖が亢進していることが示された。この試験結果より、PPARδアゴニストはマイボーム上皮細胞の細胞数を増加させることが明らかとなった。

培養サルマイボーム腺上皮細胞にPPARδ/βアゴニストあるいはsupplement（陽性対照）を添加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均値を100%とした際の値として示している(平均値±標準偏差，N=5)。表中の*は無添加群に対する有意差（p<0.05）を、また、**は無添加群に対する有意差（p<0.01）を示す。

（試験例９）
PPARδアゴニストによる角膜上皮創傷治癒促進作用の検討
1.使用動物
雄性日本白色種家兎（北山ラベス）を用いた。実験動物の使用にあたっては、動物を用いる生物医学研究に関する原則（International Guiding Principles for Biomedical Research involving Animals）に従った。
2.被験物質および点眼液調製方法
被験物質としてPPARδアゴニストGW-501516（Alexis Biochemicals）を用いた。GW-501516は0.05%になるよう、下記の基剤に懸濁したものを点眼液として使用した。
りん酸二水素ナトリウム二水和物 0.05 g
塩化ナトリウム 0.45 g
超純水 適量
ポリソルベート80 0.05 mL
NaOH 適量
全量 50 mL（pH 7.0）
なお、被験物質投与群の対照として、薬剤を含まない上記の基剤点眼群を設定した。

3.実験方法
1)角膜上皮掻爬
セラクタール（2% xylazine；バイエル）：ケタラール（5% ketamine；三共）＝0.5：1混合液の筋肉内注射（0.9 mL/kg）により動物に全身麻酔を施した後、塩酸オキシブプロカイン点眼液（ベノキシール点眼液0.4%；参天製薬）を点眼し、眼球を脱臼させた。直径6 mmのトレパンを用いて角膜中央部の角膜上皮上に直径6 mmの刻印を施し、実体顕微鏡下、ハンディルーターを用いて刻印した円周内の角膜上皮全層を掻爬した。掻爬後、生理食塩液（大塚製薬工場）を用いて角膜表面を洗浄し、眼球を眼窩内に復位させて角膜上皮掻爬処置を完了した。
2)投与
角膜上皮掻爬当日は1日２回、翌日以降、試験終了までは1日4回、処置眼に対し、被験物質点眼液または点眼液基剤をそれぞれ1回50μLずつ、マイクロピペットを用いて点眼した。
3)評価
全個体の両眼の角膜上皮掻爬が完了した時点を試験開始時間（0時間目）とし、その24、38、48時間後の角膜上皮欠損面積を定量することにより、角膜上皮の修復を評価した。すなわち、各時点で処置眼に0.1%フルオレセインナトリウム（和光純薬）溶液を10μL点眼し、ただちにコバルトフィルターを取り付けたスリットランプを用いて動物の前眼部写真を撮影することにより、染色された角膜上皮欠損領域を記録した。現像された写真をコンピュータにデジタル画像として保存し、画像解析ソフト（Image-Pro Plus）を用いて染色された角膜上皮欠損部の面積を測定した。

4.統計学的解析
各時点で測定された角膜上皮欠損面積について、各個体ごとにその初期値を100%とした際の値を算出し、これを残存する角膜上皮欠損の割合とした。各時点での残存角膜上皮欠損の割合について、基剤点眼群と被験物質点眼群との比較をt-検定によって実施し、危険率5%未満を有意であると判定した。

5.試験結果
基剤点眼群および0.05% GW-501516点眼群の測定各時点での残存する角膜上皮欠損の割合を表８に示す。角膜上皮掻爬の24時間後および38時間後に、角膜上皮欠損の割合が0.05% GW-501516点眼群で有意に小さくなっていることが示された。なお、48時間後には全ての個体で角膜上皮欠損は消失していた。この試験結果から、PPARδアゴニストを点眼することにより、欠損した角膜上皮の修復が促進されることが明らかとなった。

ウサギ眼に対して角膜上皮掻爬処置を施した後、残存する角膜上皮欠損の割合（%）を、各個体ごとにその初期値を100%として算出した値を示している(平均値±標準偏差，N=4)。表中の*は基剤点眼群に対する有意差（p<0.05）を、また、**は基剤点眼群に対する有意差（p<0.01）を示す。

本発明によれば、新規のマイボーム腺上皮細胞増殖促進剤または角膜上皮細胞増殖促進剤が提供され、該促進剤は、マイボーム腺上皮細胞および角膜上皮細胞の増殖を促進する。また、本発明の治療剤は、マイボーム腺機能不全、角膜上皮障害、涙液蒸発亢進型ドライアイなどの疾患の治療・改善に有効に用いることができる。

本発明は、２００５年１１月２８日出願の日本国特許出願、特願２００５−３４２０２５を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims (6)

1. 一般式（ＩＩ）
   [式中、
   Ａは水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
   Ｂは−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｓ−および−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−（式中、ｎは１〜３の整数を表す）からなる群から選択されるリンカーを示し、
   ＸおよびＹは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、
   Ｚは酸素原子、硫黄原子または−ＣＨ_２−を示し、
   Ａｒ_１は１〜３個の置換基を有していてもよい５〜６員環である芳香環基を示し、
   Ｒ_ｌおよびＲ_２は同一または異なって水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
   Ｒ_３は水素、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基を示す]
   で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩であるＰＰＡＲδアゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺上皮細胞の増殖促進剤。
2. 一般式（ＩＩ）
   [式中、
   Ａは水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
   Ｂは−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｓ−および−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−（式中、ｎは１〜３の整数を表す）からなる群から選択されるリンカーを示し、
   ＸおよびＹは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、
   Ｚは酸素原子、硫黄原子または−ＣＨ_２−を示し、
   Ａｒ_１は１〜３個の置換基を有していてもよい５〜６員環である芳香環基を示し、
   Ｒ_ｌおよびＲ_２は同一または異なって水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
   Ｒ_３は水素、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基を示す]
   で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩であるＰＰＡＲδアゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮細胞の増殖促進剤。
3. 一般式（ＩＩ）
   [式中、
   Ａは水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
   Ｂは−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｓ−および−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−（式中、ｎは１〜３の整数を表す）からなる群から選択されるリンカーを示し、
   ＸおよびＹは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、
   Ｚは酸素原子、硫黄原子または−ＣＨ_２−を示し、
   Ａｒ_１は１〜３個の置換基を有していてもよい５〜６員環である芳香環基を示し、
   Ｒ_ｌおよびＲ_２は同一または異なって水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
   Ｒ_３は水素、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基を示す]
   で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩であるＰＰＡＲδアゴニストを有効成分として含有する、マイボーム腺機能不全の治療剤。
4. 一般式（ＩＩ）
   [式中、
   Ａは水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
   Ｂは−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｓ−および−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−（式中、ｎは１〜３の整数を表す）からなる群から選択されるリンカーを示し、
   ＸおよびＹは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、
   Ｚは酸素原子、硫黄原子または−ＣＨ_２−を示し、
   Ａｒ_１は１〜３個の置換基を有していてもよい５〜６員環である芳香環基を示し、
   Ｒ_ｌおよびＲ_２は同一または異なって水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
   Ｒ_３は水素、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基を示す]
   で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩であるＰＰＡＲδアゴニストを有効成分として含有する、角膜上皮障害の治療剤。
5. 一般式（ＩＩ）
   [式中、
   Ａは水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
   Ｂは−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｓ−および−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−（式中、ｎは１〜３の整数を表す）からなる群から選択されるリンカーを示し、
   ＸおよびＹは同一または異なって炭素原子または窒素原子を示し、
   Ｚは酸素原子、硫黄原子または−ＣＨ_２−を示し、
   Ａｒ_１は１〜３個の置換基を有していてもよい５〜６員環である芳香環基を示し、
   Ｒ_ｌおよびＲ_２は同一または異なって水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を示し、
   Ｒ_３は水素、ハロゲン原子または炭素数１〜６のアルキル基を示す]
   で表される化合物、またはそれらの薬理学的に許容される塩であるＰＰＡＲδアゴニストを有効成分として含有する、涙液蒸発亢進型ドライアイの治療剤。
6. ＰＰＡＲδアゴニストが、（４−（３−（４−アセチル−３−ヒドロキシ−２−プロピル）フェノキシ）プロポキシフェノキシ）酢酸、（２−メチル−４−（（（４−メチル−２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−５−チアゾリル）メチル）チオ）フェノキシ）酢酸もしくは（４−(((２−（３−フルオロ−４−(トリフルオロメチル)フェニル）−４−メチル−５−チアゾリル)メチル)チオ)−２−メチルフェノキシ）酢酸、またはそれらの薬理学的に許容される塩である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の剤。