JP5168607B2 - 大腸菌を用いた酵素反応方法 - Google Patents
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Description
本発明はバイオプロセスに於いて、大腸菌を用いてリン酸化反応を生じさせる方法であって、更に具体的には、大腸菌内でポリリン酸とポリリン酸キナーゼを使って任意の物質をリン酸化する方法である。
生物反応の多くは自由エネルギー変化が正であり、本来自発的には起こらない。しかし、生体エネルギーであるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解が共役することにより、全体の自由エネルギー変化が負になり、自発的に反応が起こるようになることが知られている（ＡＴＰの共役反応）。
酵素を触媒とした物質の工業的生産が可能となっている。しかし、自由エネルギー変化が正であったり、ＡＴＰを利用したリン酸化工程を含む場合、ＡＴＰを再生する反応（ＡＴＰ再生系）が必要である。
容易に化学合成でき,食品添加物としても利用されているポリリン酸はＡＴＰと同じ高エネルギーリン酸結合を持つ物質で、ポリリン酸をリン酸供与体としたＡＴＰ再生系が構築されている。例えば、ポリリン酸をリン酸供与体としてAcinetobacter johnsonii由来のポリリン酸：ＡＭＰリン酸転移酵素によってＡＤＰに変換され、生成した２分子のＡＤＰは大腸菌由来のアデニル酸キナーゼによって1分子のＡＴＰとＡＭＰに変換される（非特許文献１参照）。この再生系を利用し、ガラクトキナーゼによるガラクトース１−リン酸の合成に成功している。
上記非特許文献１に記載の反応方法では、利用される酵素は微生物や組み換え大腸菌から取り出され、精製された酵素が使われている。しかし、この精製工程は煩雑な作業を必要とすることから、大腸菌の中に存在するポリリン酸キナーゼ（ポリリン酸をリン酸供与体としてＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素）を細胞の中から取り出さずに利用する方法も知られている（非特許文献２参照）。即ち、細胞を界面活性剤等で処理し、細胞膜を破砕することにより、ポリリン酸の細胞内への透過を可能にしている。その後、ポリリン酸を添加して、細胞内へ取り込ませ、細胞の中でＡＴＰを再生させている。
この非特許文献２に記載の方法では、ポリリン酸によるＡＴＰ再生系を利用して、ジペプチドを大腸菌内で直接かつ不可逆的に結合させる新製法を開発している。この方法により、安価で大量にジペプチドが供給できるようになっている。
生物工学会誌Vol.80, No.12, Page590 (2002)
バイオサイエンスとインダストリーVol.63, No.8, Page555-556 (2005)
しかしながら、非特許文献２に記載の方法に於いても、いくつかの問題点が残されている。即ち、ポリリン酸を細胞内へ取り込ませるために、界面活性剤や有機溶媒等で細胞を処理する必要がある。この作業は本来細胞内に取り込まないポリリン酸を細胞の中に取り込ませるために必要な工程である。しかしながら、界面活性剤は不純物として生産物に混入すると、問題を引き起こす物質である。
また、細胞の中にはポリリン酸を加水分解する酵素が存在したり、反応を行わせる上で副産物を生成する酵素が多数存在するという問題がある。
本発明に係る酵素反応方法は、好熱菌の酵素の遺伝子を含む大腸菌を、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる条件で、加熱して該大腸菌の細胞膜を破壊した状態で、該細胞内に前記酵素の基質であって、加熱後の細胞壁を透過する基質を透過させて、該酵素と該基質とを反応させ、該酵素が、７０℃，１０分間の処理で活性が消滅しないものであることを特徴としている。
本発明に係る酵素反応方法は、前記大腸菌を、６０℃〜８０℃で加熱することが好ましい。
本発明を用いれば、不純物である界面活性剤を用いなくてもポリリン酸を細胞の中に透過させることができ、かつ細胞内で副産物を生成する酵素が多数存在するという問題を安全に回避できる。また、Ｘキナーゼのみを変えることによって、数多くの物質Ｘのリン酸化にも対応できる汎用宿主となる。この汎用宿主は、安価で安全なポリリン酸をリン酸化の基質として広く工業的に利用することを可能にするという効果をもたらす。
〔ポリリン酸キナーゼ〕
ポリリン酸キナーゼとはＥＣ(enzyme commission)番号がＥＣ2.7.4.1の酵素であり、ポリリン酸とＡＤＰからＡＴＰを合成する。ポリリン酸キナーゼの種類によっては逆反応も起こる場合があるが、本発明に於いては限定されない。
ポリリン酸キナーゼとはＥＣ(enzyme commission)番号がＥＣ2.7.4.1の酵素であり、ポリリン酸とＡＤＰからＡＴＰを合成する。ポリリン酸キナーゼの種類によっては逆反応も起こる場合があるが、本発明に於いては限定されない。
発明者は大腸菌の通常の酵素が活性を失う７０℃で１０分程度の加熱処理でも、活性が維持されるポリリン酸キナーゼを見つけるために、すでに染色体ＤＮＡの配列が決定され、データベース（ＤＤＢＪ）に登録されているThermus thermophilus ＨＢ２７の染色体ＤＮＡの配列をもとに、大腸菌のポリリン酸キナーゼと似ている遺伝子配列を探した。その結果、Thermus thermophilusには大腸菌ポリリン酸キナーゼと約３０％の相同性を有する遺伝子（番号TTC0637）を見いだした。
ここでThermus thermophilusを選んだ理由は、この菌が好熱菌に分類されるからである。一般に好熱菌とは、至適生育温度が４５℃以上の微生物であり、好熱菌の酵素は耐熱性の酵素が多いと言われている。特にThermus thermophilusは６５〜８５℃でも生育可能な微生物であり、目的の耐熱性ポリリン酸キナーゼを持つと期待できた。
Thermus thermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を大腸菌に於いて発現させ、活性を測定した結果、７０℃で１０分程度の加熱処理では活性を失わないことを確認した。Thermus thermophilusのポリリン酸キナーゼは至適温度を７０℃付近に持ち、３７℃における大腸菌のポリリン酸キナーゼと同程度の比活性を持つことを確認した。これにより、高温でのＡＴＰ再生系が構築できると考えられた。
ただし、本発明に用いられるポリリン酸キナーゼは、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる加熱条件で、その活性が維持されるものであれば、その由来は特に限定されず、細菌、酵母、動物、植物など、いずれの生物であっても良い。
〔耐熱性ポリリン酸キナーゼを発現する大腸菌〕
Thermus thermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を大腸菌に於いて発現させた後、７０℃で１０分程度の加熱処理を行い、遠心分離して上清と菌体を含む沈殿物に分けた。上清と沈殿物にそれぞれ、ポリリン酸とＡＤＰを加えた結果、沈殿物にポリリン酸とＡＤＰからＡＴＰを合成する活性が認められた。その結果、Thermus thermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を発現させた大腸菌を、７０℃で１０分程度の加熱処理に晒すことにより、ポリリン酸とＡＤＰを細胞の中に透過させることができるようになることを確認した。
Thermus thermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を大腸菌に於いて発現させた後、７０℃で１０分程度の加熱処理を行い、遠心分離して上清と菌体を含む沈殿物に分けた。上清と沈殿物にそれぞれ、ポリリン酸とＡＤＰを加えた結果、沈殿物にポリリン酸とＡＤＰからＡＴＰを合成する活性が認められた。その結果、Thermus thermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を発現させた大腸菌を、７０℃で１０分程度の加熱処理に晒すことにより、ポリリン酸とＡＤＰを細胞の中に透過させることができるようになることを確認した。
〔加熱条件〕
加熱条件は、７０℃で１０分程度の加熱処理を例示するが、８０℃で５分程度の加熱処理でもよい。逆に６０℃の比較的低温で加熱処理する場合、時間を長くすればよい。加熱条件は、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる条件であれば、特に限定されない。
加熱条件は、７０℃で１０分程度の加熱処理を例示するが、８０℃で５分程度の加熱処理でもよい。逆に６０℃の比較的低温で加熱処理する場合、時間を長くすればよい。加熱条件は、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる条件であれば、特に限定されない。
〔Ｘキナーゼ〕
本発明では物質Ｘをリン酸化する工程を含むことを特徴とする。物質Ｘをリン酸化する酵素をＸキナーゼとする。ＸキナーゼはＡＴＰを利用して物質Ｘをリン酸化し、ＡＤＰを生じさせる。生成したＡＤＰはポリリン酸と耐熱性ポリリン酸キナーゼによってＡＴＰへと再生される。全体の反応を考えた場合、Ｘキナーゼとポリリン酸キナーゼによって、物質Ｘをポリリン酸でリン酸化することになる。
本発明では物質Ｘをリン酸化する工程を含むことを特徴とする。物質Ｘをリン酸化する酵素をＸキナーゼとする。ＸキナーゼはＡＴＰを利用して物質Ｘをリン酸化し、ＡＤＰを生じさせる。生成したＡＤＰはポリリン酸と耐熱性ポリリン酸キナーゼによってＡＴＰへと再生される。全体の反応を考えた場合、Ｘキナーゼとポリリン酸キナーゼによって、物質Ｘをポリリン酸でリン酸化することになる。
本発明では耐熱性ポリリン酸キナーゼを発現する大腸菌の中に導入するＸキナーゼを変えることによって、あらゆる物質Ｘのリン酸化に対応できることを示すために、フルクトース6リン酸を物質Ｘとし、フルクトース６リン酸からフルクトース１,６二リン酸へ変換する工程を例示する。フルクトース１,６二リン酸は虚血性心疾患の薬として期待される物質である。この場合のＸキナーゼはホスホフルクトースキナーゼであるが、物質Ｘとそれに対応したＸキナーゼは特に限定されるものでない。
〔ホスホフルクトースキナーゼ〕
ホスホフルクトースキナーゼとはＥＣ2.7.1.56の酵素であり、ＡＴＰとフルクトース６リン酸からＡＤＰとフルクトース１,６二リン酸を合成する。
ホスホフルクトースキナーゼとはＥＣ2.7.1.56の酵素であり、ＡＴＰとフルクトース６リン酸からＡＤＰとフルクトース１,６二リン酸を合成する。
発明者は大腸菌の通常の酵素が活性を失う７０℃で１０分程度加熱処理でも、活性が維持されるホスホフルクトースキナーゼを見つけるために、Thermus thermophilusのＤＮＡの配列を元に、Propionibacterium freudenreichiiのホスホフルクトースキナーゼ（Ｐ２９４９５）と相同性を有する遺伝子を探した。その結果、約２８％の相同性を有する遺伝子（遺伝子番号ＴＴＣ１５９７）を見いだした。
ここでThermus thermophilusを選んだ理由はこの菌が好熱菌に分類されるからである。特にThermus thermophilusは６５〜８５℃でも生育可能な微生物であり、耐熱性のホスホフルクトースキナーゼを持つと期待できた。
Thermus thermophilusのホスホフルクトースキナーゼ遺伝子を大腸菌に於いて発現させ、活性を測定した結果、７０℃において、ＡＴＰとフルクトース６リン酸からＡＤＰとフルクトース１,６二リン酸を合成することを確認した。
ただし、本発明に用いられるホスホフルクトースキナーゼは、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる加熱条件でも、その活性が維持されるものであれば、その由来は特に限定されず、細菌、酵母、動物、植物など、いずれの生物であっても良い。
〔耐熱性ポリリン酸キナーゼと耐熱性ホスホフルクトースキナーゼ遺伝子を発現する大腸菌〕
Thermus thermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を保持する大腸菌にホスホフルクトースキナーゼ遺伝子を発現するプラスミドを導入した。両遺伝子を発現する大腸菌を、７０℃で１０分程度の加熱処理を行い、ポリリン酸とフルクトース６リン酸を加えた結果、フルクトース１,６二リン酸を生産することを確認した。
Thermus thermophilusのポリリン酸キナーゼ遺伝子を保持する大腸菌にホスホフルクトースキナーゼ遺伝子を発現するプラスミドを導入した。両遺伝子を発現する大腸菌を、７０℃で１０分程度の加熱処理を行い、ポリリン酸とフルクトース６リン酸を加えた結果、フルクトース１,６二リン酸を生産することを確認した。
本発明者は、これらの問題点の全て解決する方法として、好熱菌のポリリン酸キナーゼを利用するものである。即ち、好熱菌のポリリン酸キナーゼ遺伝子を導入した大腸菌を加熱処理（７０℃で１０分程度加熱）することにより細胞膜を破壊し、これにより界面活性剤を使用することなくポリリン酸を外部から細胞内に導入し、ＡＴＰを再生する用にしたものである。
また、リン酸化したい物質（Ｘ）をリン酸化する酵素（以下「Ｘキナーゼ」と記載する。）をポリリン酸キナーゼと同時に発現させることにより、大腸菌の細胞の中でＸをリン酸化させることができる。ここでＸキナーゼ以外の大腸菌由来の酵素は、加熱処理によって活性が消失するので、目的のリン酸化反応だけがポリリン酸で行えるようになる。これにより、副産物を生成する酵素が多数存在するという問題が解決できることになる。
好熱菌のポリリン酸キナーゼとＸキナーゼの遺伝子を導入した大腸菌は、Ｘキナーゼのみを変えることによって数多くの物質Ｘのリン酸化に対応できる。好熱菌のポリリン酸キナーゼを導入した大腸菌は数多くの物質Ｘをリン酸化するための汎用宿主となる。本発明の概略を図１に示す。
〔実施例１：耐熱性ポリリン酸キナーゼを発現するプラスミドの構築〕
先ず、Thermus thermophilusのポリリン酸キナーゼを発現する大腸菌の構築を行った。データベース（ＤＤＢＪ）に登録されているThermus thermophilus ＨＢ２７のＤＮＡの配列の中からＤＤＢＪの遺伝子検索ソフトによって大腸菌のポリリン酸キナーゼと似ている配列を探した。その結果、Thermus thermophilus ＨＢ２７には大腸菌ポリリン酸キナーゼと３０％の相同性を有する遺伝子（ＴＴＣ０６３７）を見いだした。
先ず、Thermus thermophilusのポリリン酸キナーゼを発現する大腸菌の構築を行った。データベース（ＤＤＢＪ）に登録されているThermus thermophilus ＨＢ２７のＤＮＡの配列の中からＤＤＢＪの遺伝子検索ソフトによって大腸菌のポリリン酸キナーゼと似ている配列を探した。その結果、Thermus thermophilus ＨＢ２７には大腸菌ポリリン酸キナーゼと３０％の相同性を有する遺伝子（ＴＴＣ０６３７）を見いだした。
２種のオリゴヌクレオチドプライマーGGAATTCCATATGCACCTCCTTCCCGAAGC（NdeIサイト付加、配列番号３）およびGAAGTCGACTAGCTCCAGGCGCTGGGCGT（SalIサイト付加、配列番号４）を作製し、Thermus thermophilusの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。反応はＫＯＤ Plus ＤＮＡポリラーゼ(タカラバイオ)を用いた。反応条件は、９６℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、６８℃で２分間の反応を１０サイクル繰り返し、さらに９４℃で３０秒間、６８℃で２分間の反応を２５サイクル繰り返した。
PCR産物および発現ベクターpET21-a(Novagen)を制限酵素NdeIおよびSalIにより３７℃で２時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのＤＮＡ断片をLigation High(TOYOBO)により１６℃で２時間ライゲーションし、大腸菌MV1184株に形質転換した。得られたコロニーから目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pETPPKを構築した。図２にpETPPKの構成を示した。
〔実施例２：耐熱性ポリリン酸キナーゼの発現および精製〕
pETPPKによって形質転換したBL21(Rosetta) (Novagen)を、ＬＢ培地でＯＤ６００が０．５になるまで３７℃で培養後、０．２ｍＭ IPTGを添加してさらに２２℃で８時間培養を行った。集菌後、超音波で破砕を行い、７０℃で１０分間熱処理を行った。その後、遠心し、上清をHisTrap HP 1ml（アマシャムバイオサイエンス）カラムにより精製を行った。５０mMのイミダゾールを含む緩衝液Ａ（２０mMリン酸ナトリウム pH７．４，０．５M NaCl，１５%グリセロール）１０mlで洗浄後、０．５Mイミダゾールを含む緩衝液Ａで溶出した。最終的に融合タンパク質を含む１mlのフラクションを得た。
pETPPKによって形質転換したBL21(Rosetta) (Novagen)を、ＬＢ培地でＯＤ６００が０．５になるまで３７℃で培養後、０．２ｍＭ IPTGを添加してさらに２２℃で８時間培養を行った。集菌後、超音波で破砕を行い、７０℃で１０分間熱処理を行った。その後、遠心し、上清をHisTrap HP 1ml（アマシャムバイオサイエンス）カラムにより精製を行った。５０mMのイミダゾールを含む緩衝液Ａ（２０mMリン酸ナトリウム pH７．４，０．５M NaCl，１５%グリセロール）１０mlで洗浄後、０．５Mイミダゾールを含む緩衝液Ａで溶出した。最終的に融合タンパク質を含む１mlのフラクションを得た。
〔実施例３：耐熱性ポリリン酸キナーゼの活性〕
５mMポリリン酸（シグマ社ホスフェートグラスＰ６５）、８０μMＡＤＰ、５０mM HEPES・KOH(pH７．２)、４０mM (NH4)2SO4,4mM MgCl2 pH７．２を含む溶液を７５℃に保温し、精製したポリリン酸キナーゼ（０．５６mg）を添加した。経時的に溶液を分取し、合成されたＡＴＰをバイオルミネッセンスキット（ロッシュ）によって測定した。図３にThermus thermophilusのポリリン酸キナーゼによるATP合成反応を示す。７５℃において、ポリリン酸とＡＤＰからＡＴＰが生成している。
５mMポリリン酸（シグマ社ホスフェートグラスＰ６５）、８０μMＡＤＰ、５０mM HEPES・KOH(pH７．２)、４０mM (NH4)2SO4,4mM MgCl2 pH７．２を含む溶液を７５℃に保温し、精製したポリリン酸キナーゼ（０．５６mg）を添加した。経時的に溶液を分取し、合成されたＡＴＰをバイオルミネッセンスキット（ロッシュ）によって測定した。図３にThermus thermophilusのポリリン酸キナーゼによるATP合成反応を示す。７５℃において、ポリリン酸とＡＤＰからＡＴＰが生成している。
次にThermus thermophilusのポリリン酸キナーゼと大腸菌のポリリン酸キナーゼの最適温度を比較した。上述した条件で温度だけを変更して、各温度でのATP合成速度を測定した。大腸菌のポリリン酸キナーゼでは３０℃〜４０℃で最も活性が高く温度を上げるにつれて活性が低下した。それに対してThermusのポリリン酸キナーゼでは６０〜８０℃、特に７０℃で最も高い活性を示すことが分かる。最適温度を図４に示す。
次にThermus thermophilusのポリリン酸キナーゼと大腸菌のポリリン酸キナーゼの耐熱性を比較した。ＡＤＰを含まない上述条件において、３０〜８０℃の各温度で１０分間保温した後に、ＡＤＰを添加してＡＴＰ合成速度を測定した。加温前のＡＴＰ合成速度を１００％として表した。３０〜４０℃ではあまり差が見られず、５０℃から大腸菌のポリリン酸キナーゼは大きく活性が低下し６０℃以降では完全に活性が消失した。それに対しThermus thermophilusのポリリン酸キナーゼは５０℃以上の温度でも活性が残っていた。各温度での熱処理後の残存活性のグラフを図５に示す。
〔実施例４：耐熱性ホスホフルクトキナーゼ〕
Thermus thermophilusのホスホフルクトキナーゼを発現する大腸菌の構築を行った。データベース（ＤＤＢＪ）に登録されているThermus thermophilus ＨＢ２７のＤＮＡの配列の中からＤＤＢＪの遺伝子検索ソフトによってPropionibacterium freudenreichiiのホスホフルクトースキナーゼ（P29495）と似ている配列を探した。その結果、Thermus thermophilusには大腸菌キナーゼと約２８％の相同性を有する遺伝子（ＴＴＣ１５９７）を見いだした。
Thermus thermophilusのホスホフルクトキナーゼを発現する大腸菌の構築を行った。データベース（ＤＤＢＪ）に登録されているThermus thermophilus ＨＢ２７のＤＮＡの配列の中からＤＤＢＪの遺伝子検索ソフトによってPropionibacterium freudenreichiiのホスホフルクトースキナーゼ（P29495）と似ている配列を探した。その結果、Thermus thermophilusには大腸菌キナーゼと約２８％の相同性を有する遺伝子（ＴＴＣ１５９７）を見いだした。
２種のオリゴヌクレオチドプライマーGGCCATATGAAACGCATCGGGGTGTT（NdeIサイト付加、配列番号５）およびTATAAGCTTGAGGGCCAGCACCTGCGATA（HindIIIサイト付加、配列番号６）を作製し、Thermus thermophilusの染色体DNAを鋳型としてＰＣＲを行った。反応はＫＯＤ Plus ＤＮＡポリラーゼ(タカラバイオ)を用いた。反応条件は、９４℃で２分間保持した後、９４℃で１５秒間、５６℃で３０秒間、６８℃で９０秒間の反応を３５サイクル繰り返し、７２℃で１０分間保持した。
PCR産物および発現ベクターpET21-b(Novagen)を制限酵素NdeIおよびHindIIIにより３７℃２時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのＤＮＡ断片をLigation High(TOYOBO)により１６℃２時間ライゲーションし、大腸菌ＭＶ１１８４株に形質転換した。得られたコロニーから目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pETPFKを構築した。図６にpETPFKの構成を示した。
〔実施例５：耐熱性ホスホフルクトキナーゼの精製と活性〕
pETPFKで形質転換したBL21(Rosetta) (Novagen)を、２ＹＴ培地でＯＤ６００が０．５になるまで２８℃で培養後、０．５mM IPTGを添加して更に７時間培養を行った。集菌後、リゾチームと超音波で破砕を行い、遠心上清をHisTrap HP１ml（アマシャムバイオサイエンス）カラムにより精製を行った。１０mMのイミダゾールを含む緩衝液Ａ（２０mMリン酸ナトリウム pH７．４，０．５M NaCl，１５%グリセロール）１０mlで洗浄後、０．５Mイミダゾールを含む緩衝液Ａで溶出した。最終的に融合タンパク質を含む１mlのフラクションを得た。
pETPFKで形質転換したBL21(Rosetta) (Novagen)を、２ＹＴ培地でＯＤ６００が０．５になるまで２８℃で培養後、０．５mM IPTGを添加して更に７時間培養を行った。集菌後、リゾチームと超音波で破砕を行い、遠心上清をHisTrap HP１ml（アマシャムバイオサイエンス）カラムにより精製を行った。１０mMのイミダゾールを含む緩衝液Ａ（２０mMリン酸ナトリウム pH７．４，０．５M NaCl，１５%グリセロール）１０mlで洗浄後、０．５Mイミダゾールを含む緩衝液Ａで溶出した。最終的に融合タンパク質を含む１mlのフラクションを得た。
１０mMポリリン酸（シグマ社ホスフェートグラスＰ６５）、２０mMフルクトース６リン酸、５mM ＡＤＰ、５０mM MOPS・NaOH(pH ６．５)、２５mM KCl、５mM MgCl2を含む溶液を７０℃に保温し、精製したポリリン酸キナーゼ５mg、ホスホフルクトキナーゼ５mgを添加した。経時的に溶液を分取し、合成されフルクトース１，６二リン酸をExtremophiles, 3, 121-129 (1999)に記載の方法によって測定した。
同反応に於いて、ポリリン酸キナーゼを含まない反応を対象とした。その結果、ポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを含む反応ではフルクトース１，６二リン酸が合成され、ポリリン酸キナーゼを含まずホスホフルクトキナーゼのみを含む反応ではフルクトース１，６二リン酸が合成されないことが分かった。また、ポリリン酸を含まない反応系でもフルクトース１，６二リン酸は合成されない。このことから、ポリリン酸によってＡＴＰが再生され、それによってフルクトース１，６二リン酸が合成されていることがわかった。精製したポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼによるフルクトース１，６二リン酸の合成反応を図７に示す。
〔実施例６：耐熱性ポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを発現する大腸菌の構築〕
pETPPKとpETPFKは、それぞれポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを発現するプラスミドであるが、同じ大腸菌内では共存できない。そこで、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子をｐＥＴベクターと共存できるpACYCプラスミドへ移した。方法は２種のオリゴヌクレオチドプライマーGAAGAATTCAATGAAACGCATCGGGGTGTT（EcoRIサイト付加、配列番号７）およびTATAAGCTTGAGGGCCAGCACCTGCGATA（HindIIIサイト付加、配列番号８）を作製し、pETPFKを鋳型としてPCRを行った。反応はＫＯＤ Plus ＤＮＡポリラーゼ(タカラバイオ)を用いた。反応条件は、９６℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間の反応を１０サイクル繰り返し、更に９４℃で３０秒間、６１℃で３０秒間、６８℃で１分の反応を１５サイクル繰り返した。
pETPPKとpETPFKは、それぞれポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを発現するプラスミドであるが、同じ大腸菌内では共存できない。そこで、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子をｐＥＴベクターと共存できるpACYCプラスミドへ移した。方法は２種のオリゴヌクレオチドプライマーGAAGAATTCAATGAAACGCATCGGGGTGTT（EcoRIサイト付加、配列番号７）およびTATAAGCTTGAGGGCCAGCACCTGCGATA（HindIIIサイト付加、配列番号８）を作製し、pETPFKを鋳型としてPCRを行った。反応はＫＯＤ Plus ＤＮＡポリラーゼ(タカラバイオ)を用いた。反応条件は、９６℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間の反応を１０サイクル繰り返し、更に９４℃で３０秒間、６１℃で３０秒間、６８℃で１分の反応を１５サイクル繰り返した。
ＰＣＲ産物および発現ベクターpACYC(Novagen)を制限酵素EcoRIおよびHindIIIにより３７℃２時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのＤＮＡ断片をLigation High(TOYOBO)により１６℃２時間ライゲーションし、大腸菌MV1184株に形質転換した。得られたコロニーから目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pACYCPFKを構築した。図８にpACYCPFKの構成を示した。
pETPPKを保持する大腸菌BL21 (Novagen)にpACYCPFKを導入した。pETPPKとpACYCPFKを同一菌体内に持つＢＬ２１ (Novagen)を、ＬＢ培地でＯＤ６００が０．５になるまで３７℃で培養後、０．２ｍＭ IPTGを添加して２２℃で８時間培養を行った。
〔実施例７：耐熱性ポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを発現する大腸菌を用いたフルクトース６リン酸からフルクトース１，６二リン酸の合成〕
１０mMポリリン酸（シグマ社ホスフェートグラスＰ６５）、１０mMフルクトース６リン酸、５mM ＡＤＰ、５０mM MOPS・NaOH(pH ６．５)、２５mM KCl,５mM MgCl2を含む溶液を７０℃に保温し、pETPPKとpACYCPFKを同一菌体内に持つBL21(DE3)の細胞（2 x 107）を混合した。
１０mMポリリン酸（シグマ社ホスフェートグラスＰ６５）、１０mMフルクトース６リン酸、５mM ＡＤＰ、５０mM MOPS・NaOH(pH ６．５)、２５mM KCl,５mM MgCl2を含む溶液を７０℃に保温し、pETPPKとpACYCPFKを同一菌体内に持つBL21(DE3)の細胞（2 x 107）を混合した。
経時的に溶液を分取し、合成されフルクトース１，６二リン酸を前記Extremophiles, 3, 121-129 (1999)に記載の方法によって測定した。耐熱性ポリリン酸キナーゼとホスホフルクトキナーゼを発現する大腸菌を用いて、フルクトース１，６二リン酸の合成が起こることを図９に示す。
本発明は、安価で安全なポリリン酸をリン酸化の基質として利用するバイオプロセスに応用可能である。特に煩雑な酵素の精製を必要とせず、かつ不純物である界面活性剤を用いなくてもポリリン酸を細胞の中に透過させることができ、かつ細胞内で副産物を生成する酵素が多数存在するという問題を回避できる点で有利である。
Claims (1)
- 好熱菌の酵素の遺伝子を含む大腸菌を、６０℃〜８０℃で加熱して該大腸菌の細胞膜を破壊した状態で、該細胞内に前記酵素の基質であって、加熱後の細胞壁を透過する基質を透過させて、該酵素と該基質とを反応させ、該酵素が、７０℃，１０分間の処理で活性が消滅しないものであることを特徴とする大腸菌を用いた酵素反応方法。
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