JP5039027B2 - 結腸癌および膵臓癌のための、組換え型モノクローナル抗体および対応する抗原 - Google Patents

Description

（関連出願）
本願は、２００５年４月１５日に出願された、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｓ」という名称の、米国仮特許出願第６０／６７１，４８１号に関連し、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）の下その利益を主張する。

（発明の分野）
本発明は、組換え型モノクローナル抗体およびペプチドならびに診断手順を含む臨床的および科学的手順、特にこのようなプロセスが、ヒト結腸直腸癌および膵癌関連抗原（ＣＰＡＡ）の検出ならびに前記組換え型モノクローナル抗体およびペプチドにより認識されたエピトープの特性決定を含む手順におけるこれらの使用の分野に関する。本発明はまた、結腸直腸癌および膵癌に関連する病理を診断および／または治療するための、本発明の診断法および／または治療法に有用な診断用化合物および／または医薬組成物の形態の抗ＣＰＡＡ抗体およびペプチドを提供する。

（発明の背景）
世界保健機構からの最新のデータによれば、２０００年に世界中で１０００万人が前記の癌と診断され、６００万人がこの癌で死亡した。さらに、統計は世界中で、癌の発生率が増加傾向にあることを示している。例えば、アメリカでは、予測によると今日生存している人々の４０パーセントが、その一生のある時点で何らかの形の癌と診断されるであろうと示唆している。２０１０年までに、その数は５０パーセントまで増加するであろう。すべての癌の中で、結腸直腸癌はアメリカにおける癌関連死因の第２位であるが、膵癌は、１１番目に頻度の高い癌で、男女共に癌死因の第４位である。この厳しいシナリオは、新規の癌の診断法および治療法に対する甚大な需要を示している。

ハイブリドーマの使用を含むものなどの先進技術により、一般的な診断手順および臨床手順に有用な高度に特異的で効力のあるモノクローナル抗体の供給源を研究者および臨床医が利用できるようになった。例えば、現在、転移性乳癌用のハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）および結腸直腸癌の治療に対してドイツで承認されたパノレックス（Ｐａｎｏｒｅｘ）（登録商標）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）などの癌治療用の治療抗体がある。

ノーベル賞受賞者でフレッドハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）の所長であるＬｅｌａｎｄ Ｈａｒｔｗｅｌｌ博士は、それでも癌と闘う際の大変重要な課題は、依然として早期診断の探究であると言う。Ｔｈｅ Ｅｃｏｎｏｍｉｓｔ（２００４年１０月４日）。診断時に癌が進行しているほど、治療が有効である可能性は低い。

したがって、癌研究の進歩にもかかわらず、結腸癌および膵癌の早期診断および治療に有用な組換え型モノクローナル抗体が必要とされている。

（発明の要旨）
本発明の目的は、ヒト結腸直腸癌および膵癌関連抗原（ＣＰＡＡ）の抗原ならびにエピトープに対して特異性を有する、組換え型モノクローナル抗体または組換え型モノクローナル抗体の部分（ペプチド）を提供することである。したがって、本発明の目的は、ＣＰＡＡタンパク質およびペプチドに特異性を有する組換え型モノクローナル抗体またはその部分を提供することである。

本発明のさらなる目的は、ヌクレオチド配列（遺伝子）が、上述した組換え型抗体の重鎖および軽鎖の一部または全体をコードするｃＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドを提供することである。したがって、本発明の１つの態様では、ＣＰＡＡを特異的に認識する、特にすべてのＣＰＡＡに通常存在している決定基またはエピトープを特異的に認識する、モノクローナル抗体の可変領域をコードする遺伝子を提供する。

本発明のさらなる目的は、上記の遺伝子を含む組換え型ベクターを提供することである。本発明のさらなる目的は、上記の組換え型ベクターを用いて得た形質転換体を提供することである。

本発明のなおさらなる目的は、ＣＰＡＡに対し特異的な組換え型抗体であって、前記抗体はマーカーで標識され、研究、診断および臨床目的で前記抗体を用いる際に、抗体の分離を容易にするばかりでなく汎用性をも与える抗体を提供することである。本発明の別の態様では、それぞれヒト免疫グロブリンガンマ−１およびカッパの定常領域に連結されたＣＰＡＡに特異的なマウス抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含むキメラ抗体を提供する。

本発明の別の目的は、研究、診断、および臨床用途のために、本明細書で開示されている組換え型抗体を用いる方法を提供することである。特に、本発明の１つの目的は、おそらく疾患症状のない患者で、癌を早期発見するための診断手段を提供することである。別の態様では、進行の遅い膵癌と悪性度の高い膵癌とを識別するための免疫組織化学的手段を提供する。

本発明の別の目的は、その必要のある患者に、ＣＰＡＡ抗原に結合する抗体、抗体の部分、フラグメント、ペプチドまたは誘導体を投与することを含み、前記抗体が、腫瘍を退縮するかまたは細胞死を促進するために充分な量で投与される、腫瘍退縮を促進するまたは形質転換細胞死を誘発するための方法を提供することである。

本発明のさらに１つの目的は、抗ＣＰＡＡ抗体および／または抗ＣＰＡＡペプチドを用いる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでのＣＰＡＡの存在と関連した動物の細胞、組織または病理の診断および／または治療に有用性を有する方法を提供することである。本発明はまたＣＰＡＡ関連病理を診断し、かつ／または治療するための本発明の診断法および／または治療法に有用な医薬化合物および／または診断用化合物および／または組成物の形態で、抗ＣＰＡＡ抗体およびペプチドを提供する。

本発明はまた、２つの軽鎖と２つの重鎖を含み、それぞれ鎖は、ヒト定常領域の少なくとも一部およびＣＰＡＡに特異性を有する非ヒト由来の可変（Ｖ）領域の少なくとも一部を含み、ＣＰＡＡ関連細胞の阻害および／または中和エピトープに、高親和性および／または高結合力で結合する抗ＣＰＡＡキメラ抗体を対象とする。本発明はまた、このような抗体のフラグメントまたは誘導体、例えば重鎖の定常、連結、多様性もしくは可変領域、または軽鎖の定常、連結もしくは可変領域などの抗体鎖の１つまたは複数の部分を含む。

本発明のさらなる目的は、モノクローナル抗体またはその部分により同定される、ＣＰＡＡペプチドと関連した特異的エピトープを同定することである。このような抗原の配列は、別の抗原結合性リガンドの生成に役立ち得るか、またはワクチンもしくは他の免疫賦活性手段として使用し得る。

本発明の種々の用途、例えば、限定するものではないが、本発明による抗ＣＰＡＡ抗体または抗ＣＰＡＡペプチドを産生するためのハイブリドーマ、組換えまたは化学的合成方法；溶液中でまたは細胞でＣＰＡＡを検出すること；このようなＣＰＡＡ−含有細胞の殺傷を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎ ｖｉｖｏでのＣＰＡＡ−含有細胞の１つまたは複数の生物活性を阻害するなどの抗ＣＰＡＡ抗体およびペプチドの作製および使用の方法を提供する。したがって、このような阻害および殺傷には、悪性疾患などのＣＰＡＡ含有細胞が関わる症状または病理を軽減するための本発明の治療法を含むことができる。

（発明の詳細な説明）
本発明は、本明細書に記載されている特定の方法、プロトコル、および試薬などに限定されず、変化し得ることを理解すべきである。本明細書において使用される用語は特定の実施形態を説明する目的のみで使用され、請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。

本明細書および請求の範囲で使用される単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、本文が特に明記していない限り複数形を含む。したがって、例えば抗体に対する言及は、当業者には周知のこれらと同等なものを含む、１種または複数のこのような抗体に対する言及である。実施形態以外では、あるいは特に指示される場合を除き、ここに使用される内容物の量または反応条件を示すすべての数字は、すべての例において「約」という用語により修飾されているものと理解されたい。「約」なる語は、パーセンテージに関連して用いられる場合、±１％を意味する。

特定されたすべての特許およびその他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用することができるこのような刊行物において記載した方法を説明および開示する目的で、特に参考文献として本明細書の一部を構成する。これらの刊行物は、本出願の出願日より前にそれらの開示があったことを示すためだけに提供される。これに関して、先行発明またはその他の理由によって、本発明者らがそのような開示よりも先であるという権利を与えられないことを認めるものと解釈されるべきでない。日付に関するすべての記載またはこれらの文書の内容に関する表現は、本出願人に利用可能な情報に基づき、日付の正確さまたはこれらの文書の内容に関していかなる承認も構成しない。

特に明記していない限り、本明細書において用いた技術および科学用語はすべて、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。任意の既知の方法、装置、および材料は、本発明の実践または試験において用いることができるが、これに関する方法、装置、および材料をここに記述する。

本発明は、組換え型モノクローナル抗体およびペプチドならびに診断手順を含む臨床的および科学的手順、特にこのようなプロセスが、ヒト結腸直腸癌および膵癌関連抗原（ＣＰＡＡ）の検出ならびに前記組換え型モノクローナル抗体およびペプチドにより認識されたエピトープの特性決定を含む手順におけるこれらの使用を提供する。本発明はまた、結腸直腸癌および膵癌関連病理を診断および／または治療するための本発明の診断法および／または治療法に有用な診断用化合物および／または医薬組成物の形態の抗ＣＰＡＡ抗体およびペプチドを提供する。

一般にモノクローナル抗体は、診断における非常に重要な試薬として使われている。実際に、モノクローナル抗体は、謎めいた生合成経路での種々の生体分子の機能の解析において大きな役割を果たしてきた。これらは、腫瘍特異性抗原の同定と特性決定に選択される試薬にもなって、癌の分類の有用な手段になっている。

分子生物学の方法と組換技術の出現により、組換え手段によって抗体分子を生成し、それにより、抗体のポリペプチド構造に認められる特異的アミノ酸配列をコードする遺伝子配列を作製することが現在では可能である。このような抗体は、前記抗体のポリペプチド鎖をコードする遺伝子配列をクローニングすることによってか、または前記ポリペプチド鎖の直接的な合成によって、特異的エピトープおよび抗原決定基に対する親和性を有する活性な四量体（Ｈ_２Ｌ_２）構造を形成するために、合成した鎖の集合を用いて作製することができる。これにより、異なる種および供給源由来の中和抗体の配列特性を有する即時の抗体産生が可能となった。

抗体の供給源に関係なく、すなわち抗体の組換え構築の方法やトランスジェニック動物、研究室もしくは商業的規模の大きな細胞培養を用いる、トランスジェニック植物を用いる、または処理のいかなる段階でも生物体を用いない直接的な化学合成によるｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでの、抗体を合成する方法に関係なく、すべての抗体は、類似した全体的な三次元構造を有する。この構造は、Ｈ_２Ｌ_２としてしばしば示され、抗体は一般に２つの軽い（Ｌ）アミノ酸鎖と２つの重い（Ｈ）アミノ酸鎖を含むことを意味する。両方の鎖は、構造的に相補的な抗原標的と相互作用し得る領域を有する。標的と相互作用する領域は、「可変」または「Ｖ」領域と呼ばれ、異なる抗原特異性の抗体とのアミノ酸配列の差異によって特徴づけられる。重鎖または軽鎖のどちらの可変領域も、抗原標的に特異的に結合し得るアミノ酸配列を含む。

本明細書中で用いられる用語「抗原結合領域」とは、抗原と相互作用し、抗体に抗原に対する抗体の特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含む抗体分子の結合領域部分を意味する。抗体領域は、抗原結合残基の適切な構造の維持に必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。

抗原結合領域を提供する重鎖または軽鎖の可変領域の中に、特異性の異なる抗体間で配列の極端な多様性のため「超可変」と呼ばれるさらに小さな配列がある。このような超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」領域とも呼ばれる。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的特異性を説明する。

ＣＤＲは、可変領域中の非連続のアミノ酸の範囲を表すが、種に関係なく、可変重鎖および軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列の位置的な部位は、可変鎖のアミノ酸配列中で類似の部位を有することが認められた。すべての抗体の可変重鎖および軽鎖それぞれは、それぞれの軽い（Ｌ）鎖および重い（Ｈ）鎖に関して、それぞれ他のものとは非連続な（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と呼ばれる）３つのＣＤＲ領域を有する。認められているＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔらによって、２５２巻 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．６６０９〜１６頁（１９７７年）に記載され、直鎖状のアミノ酸配列の検討を通じて、これらの規則を適用してＣＤＲループは同定され得る。しかし、ＣＤＲ−Ｈ３ループを定義する規則は、変更することができ（Ｃｈａｐｔｅｒ ４， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｌｏ編．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００４年）を参照）、いくつかのＣＤＲ−Ｈ３ループの実際の境界は、円二色性、核磁気共鳴、またはＸ線結晶学などの実験技術なしには同定されない場合もある。

すべての哺乳類の種で、抗体ペプチドは、定常（すなわち、高度に保存された）領域および可変領域を含み、可変領域の中に、ＣＤＲ（複数）および重鎖または軽鎖の可変領域の内部であるがＣＤＲの外部にあるアミノ酸配列で構成されているいわゆる「フレームワーク領域（複数）」がある。

抗体のＣＤＲ領域によって認識される抗原決定基に関して、これは「エピトープ」とも呼ばれる。言い換えればエピトープは、抗体により認識されて結合され得る任意の分子の部分を表す（対応している抗体結合領域は、パラトープと呼ばれ得る）。一般に、エピトープは、アミノ酸や糖側鎖などのような分子の化学的に活性な表層分子グループから成り、特異的荷電の特徴だけでなく、特異的な三次元構造上の特徴を有する。

「抗原」は、抗体によって結合され得る分子または分子の一部であり、さらに動物にその抗原のエピトープに結合できる抗体の産生を誘発できる。抗原は、１つまたは２つ以上のエピトープを有してもよい。上述の特異反応は、抗原は選択性の高い様式で、その抗原に対応する抗体と反応し、他の抗原により誘起される他の多数の抗体とは反応しないということを意味している。

したがって、用語「抗体」とは、完全な免疫グロブリン分子ならびに免疫グロブリン分子の部分、フラグメント、ペプチドおよび誘導体、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ＣＤＲ領域、または抗原もしくはエピトープと結合できる抗体の任意の部分もしくはペプチド配列の両方を含むことを意味する。抗体が分子と特異的に反応することにより、抗体に分子を結合することができる場合、抗体は分子を「結合できる」と言われる。

抗体はまた任意の既知の技術、例えば、これに限らないが、酵素による切断、ペプチド合成、または組換え技術によって提供されるキメラ抗体、可溶形態もしくは結合形態で標識することが可能である抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびにこれらのフラグメント、一部分、領域、ペプチドまたは誘導体を含む。本発明のこのような抗体は、ＣＰＡＡの部分またはＣＰＡＡ含有細胞を結合できる。抗体フラグメントまたは部分は、完全な抗体のＦｃフラグメントを欠いていてもよく、循環系からより迅速に除去され、完全な抗体よりも低い非特異的な組織との結合を有する可能性がある。抗体の例は、当業者に周知の方法を用いて、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するための）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを生成するための）などの酵素を用いるタンパク質分解性切断によって、完全な抗体から生成することができる。例えば、Ｗａｈｌら、２４巻 Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１６〜２５頁（１９８３年）を参照。抗体の部分は、任意の上記の方法により作製できるか、または組換え分子の一部を発現することにより作製できる。例えば、組換え型抗体のＣＤＲ領域（複数可）は、分離でき、適切な発現ベクターにサブクローニングできる。例えば、米国特許第６，６８０，０５３号を参照。

ＮＰＣ−１オリゴヌクレオチドおよびアミノ酸配列
本発明は、その範囲内に、本発明の抗ＣＰＡＡ抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列を含む。ＮＰＣ−１の軽鎖の可変領域をコードする核酸配列を図２に示す（配列番号１）。ＮＰＣ−１の重鎖の可変領域をコードする核酸配列を図４に示す（配列番号４）。

本発明は、その範囲内に、図３（配列番号３）に示すペプチドを含むＮＰＣ−１の軽鎖のアミノ酸配列および図５（配列番号６）のペプチドを含むＮＰＣ−１重鎖のアミノ酸配列を含む。さらに、本発明は、ＣＤＲ１（配列番号７）：

ＣＤＲ２（配列番号８）：

およびＣＤＲ３（配列番号９）：

のアミノ酸配列を含む図６のカッパ軽鎖について示されたＣＤＲ領域を含む。本発明は、ＣＤＲ１（配列番号１０）：

ＣＤＲ２（配列番号１１）：

およびＣＤＲ３（配列番号１２）：

のアミノ酸配列を含む図７の重鎖のＣＤＲ領域を同様に特定する。

本発明の範囲内には、またＮＰＣ−１またはそのペプチドのアミノ酸配列をコードするすべてのオリゴヌクレオチド配列が含まれる。遺伝暗号が縮重しているため、２つ以上のコドンを用いて特定のアミノ酸をコードすることができる。遺伝暗号を用いて、１つまたは複数の異なるオリゴヌクレオチドを特定することができ、このそれぞれがアミノ酸をコードすることでできる。実際、特定のオリゴヌクレオチドが実際のＸＸＸ−コード配列を構成する可能性は、異常塩基対の関係および特定のコドンが、抗ＣＰＡＡ抗体または部分を発現する真核または原核細胞で（特定のアミノ酸をコードするために）実際に使われる頻度を考慮することにより見積もることができる。このような「コドン使用規則」は、Ｌａｔｈｅら、１８３巻 Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．１〜１２頁（１９８５年）により開示される。Ｌａｔｈｅの「コドン使用規則」を用いて、抗ＣＰＡＡ配列をコードし得る理論的に「最も可能性が高い」ヌクレオチド配列を含む１つのオリゴヌクレオチドまたは１組のオリゴヌクレオチドを同定する。

アミノ酸配列がただ１つのオリゴヌクレオチドのみによってコードされ得ることもあるが、アミノ酸配列は１組の類似のオリゴヌクレオチドのうちの任意のものでコードできることが多い。重要なことは、この組のメンバーのすべてが、ペプチドフラグメントをコードできるオリゴヌクレオチドを含み、したがって、ペプチドフラグメントをコードする遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を含む可能性があるが、この組の中のただ１つのメンバーだけが、遺伝子のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含むことである。このメンバーはこの組内に存在し、この組の他のメンバーの存在下でもＤＮＡとハイブリッド形成できるので、単一のオリゴヌクレオチドを用いて、このタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする同じ方法で、この未分画のオリゴヌクレオチドの組を使用することは可能である。

可変領域もしくは定常領域を含む抗ＣＰＡＡ抗体またはペプチドをコードできる理論的に「最も可能性が高い」配列を含むオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの組を用いて、「最も可能性が高い」配列または配列の組とハイブリッド形成できる相補的なオリゴヌクレオチド配列またはオリゴヌクレオチドの組を同定する。このような相補的配列を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、抗ＣＰＡＡ遺伝子可変領域または定常領域を同定し、分離することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）。

ＮＰＣ−１のペプチドをコードできる（またはこのようなオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの組に相補的な）、適切なオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの組を、（上記の方法を用いて）同定し、合成し、当分野において周知の方法により、抗ＣＰＡＡ抗体またはこれらの可変領域もしくは定常領域を発現できる細胞由来のＤＮＡまたはｃＤＮＡ調製物に対してハイブリッド形成する。「最も可能性の高い」抗ＣＰＡＡ領域ペプチドコード配列に相補的な１本鎖のオリゴヌクレオチド分子を、当業者にはよく知られている方法を用いて合成できる。Ｂｅｌａｇａｊｅら、２５４巻Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．５７６５〜８０頁（１９７９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｎｉｅｒｌｉｃｈら、編、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７６年）；Ｗｕら、１９７８年；Ｋｈｏｒａｎａ、２０３巻 Ｓｃｉｅｎｃｅ ６１４〜２５頁（１９７９年）を参照。

さらに、ＤＮＡ合成は、自動合成装置を用いて達成できる。核酸ハイブリッド形成技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、およびＨａｙｒｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｄ．Ｃ．１９８５年）によって開示されている。ハイブリッド形成洗浄条件には、０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳの洗浄液および室温で１０分間、回転下でのインキュベーション、（低ストリンジェンシー洗浄液）、予熱（４２℃）した０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ洗浄液および４２℃、１５分間、回転下でのインキュベーション（中位のストリンジェンシー洗浄液）および予熱（６８℃）した０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄液および６８℃、１５分間、回転下でのインキュベーション（高ストリンジェンシー洗浄液）を含むことができる。Ａｕｓｕｂｅｌら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ 編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，１９８８年）を参照。上記のようなまたは類似の技術は、ヒトアルデヒド脱水素酵素（Ｈｓｕら、８２巻Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ３７７１〜７５頁（１９８５年））、フィブロネクチン（Ｓｕｚｕｋｉら、４巻 Ｂｕｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｏｒｇａｎ．Ｊ．２５１９〜２４頁（１９８５年））、ヒトエストロゲンレセプター遺伝子（Ｗａｌｔｅｒら、８２巻 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８８９〜９３頁（１９８５年））、組織プラスミノーゲン活性化物質（Ｐｅｎｎｉｃａら、３０１巻 Ｎａｔｕｒｅ ２１４〜２１頁（１９８３年））およびヒト胎盤のアルカリ性ホスファターゼ相補的ＤＮＡ（Ｋｅｕｎら、８２巻 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７１５〜１９頁（１９８５年））に対する遺伝子のクローニングを可能にすることに成功した。

本明細書に記載されている抗体およびペプチドの改変体（アゴニスト）をもたらす標準的な分子生物学的技術を用いて、本発明に用いられる抗体コード領域を、既存の抗体遺伝子を変更することによりまた提供できることも意図する。このような改変体には、限定されるものではないが、抗ＣＰＡＡ抗体またはペプチドのアミノ酸配列における欠失、付加および置換が含まれる。

例えば、置換の１つのクラスには、保存されたアミノ酸の置換がある。このような置換は、抗ＣＰＡＡ抗体ペプチドにおける所定のアミノ酸を、類似した特性の別のアミノ酸で置き換える置換である。保存的置換として一般的にみられるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間で、１つを他のものへの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ等間の置換である。どのアミノ酸の変化が、表現型的にサイレントである可能性があるかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら、２４７巻Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０６〜１０頁（１９９０年）に見られる。

改変体またはアゴニスト抗ＣＰＡＡ抗体もしくはペプチドは、十分に機能的であるかまたは１つまたは複数の活性において機能を欠いている可能性がある。十分に機能的な改変体は、保存的変異のみまたは重要ではない残基もしくは重要ではない領域における変異を含むのが一般的である。機能的な改変体は、変化を生じないかまたは機能において重要でない変化を生じる類似したアミノ酸の置換も含み得る。あるいは、このような置換は、機能にある程度までポジティブまたはネガティブに影響を及ぼす可能性がある。

非機能的改変体は、重要な残基もしくは重要な領域における、１つまたは複数の非保存的アミノ酸の置換（複数）、欠失（複数）、挿入（複数）、逆位（複数）、またはトランケーションもしく置換、挿入、逆位、または欠失を含むのが一般的である。

機能にとって不可欠であるアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発などの当分野で周知の方法によって同定することができる。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、２４４巻 Ｓｃｉｅｎｃｅ １０８１〜８５頁（１９８９年）。後者の方法は、分子のすべての残基の位置において単一アラニン突然変異を導入する。次いで、得られた変異体分子を、エピトープ結合またはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣ活性などの生物活性について試験する。リガンド−レセプター結合に重要である部位もまた、結晶学、核磁気共鳴、または光アフィニティー標識化などの構造分析により決定できる。Ｓｍｉｔｈら、２２４巻 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９９〜９０４頁（１９９２年）；ｄｅ Ｖｏｓら、２５５巻 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６〜１２頁（１９９２年）。

さらに、ポリペプチドは２０種の「天然」アミノ酸以外のアミノ酸を含むことが多い。その上、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシングおよび他の翻訳後修飾などの天然プロセスにより、または当該技術分野で周知の化学的修飾技術により修飾され得る。既知の修飾には、限定されるものではないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン化などの、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ仲介付加が含まれる。

このような修飾は、当業者に周知であり、科学文献に非常に詳しく記載されている。いくつかの特に一般的修飾、例えばグリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル化は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（第２版、Ｔ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９３２年）等のほとんどの基礎的なテキストに記載されている。多くの詳細な総説が、例えばＷｏｌｄによる、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１〜１２頁（Ｊｏｈｎｓｏｎ，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８３年）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、１８２巻Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６２６〜４６頁（１９９０年）；およびＲａｔｔａｎら、６６３巻 Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４８〜６２頁（１９９２年）が、この主題について利用できる。

したがって、本発明の抗体およびペプチドは、置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によりコードされていないアミノ酸残基であり、上記のように置換基群がＰＥＧ化アミノ酸残基を含む誘導体または類似体も包含する。

同様に、変異のみならずアミノ酸配列における付加および置換、ならびに上記した修飾もまた、ＣＰＡＡ抗原のアミノ酸配列および／またはこれらのエピトープもしくはペプチドにも等しく適用可能であり、したがって本発明に包含される。上記のように本発明によるモノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ＣＰＡＡの認識に特に有効である。

抗体の組換え型の発現
従来は、モノクローナル抗体は、マウスのハイブリドーマ株で天然の分子として産生されてきた。以下に概説したこの技術に加えて、本発明はモノクローナル抗体の組換えＤＮＡの発現を提供する。これは選択した宿主種での抗体誘導体および融合タンパク質の諸形態に加えてヒト化抗体の産生も可能にする。より最近では、細菌、酵母、トランスジェニック動物および鶏卵での抗体産生が、ハイブリドーマに基づく産生系の有望な代替手段として出現している。トランスジェニック動物の主な利点は、再生可能な資源からの潜在的な高収量である。

本発明の少なくとも１つの抗ＣＰＡＡ抗体、部分またはポリペプチドをコードする核酸配列は、ライゲーション用の平滑末端または付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要であれば、付着末端の充填、望ましくない接合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼによるライゲーションを含む通常の技術にしたがってベクターＤＮＡと組換えできる。これらの操作技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ １９８９年）、およびＡｕｓｕｂｅｌ、１９８７年、１９９３年により開示されており、モノクローナル抗体分子またはこれらの抗原結合領域をコードする核酸配列を作製するため使用できる。

ＤＮＡなどの核酸分子は、それが転写および翻訳の調節情報を含むヌクレオチド配列を含む場合、ポリペプチドを「発現することができる」と言われ、このような配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結」されている。作動可能な連結とは、調節ＤＮＡ配列および発現しようとするＤＮＡ配列が、回収可能な量で抗ＣＰＡＡペプチドまたは抗体部分として遺伝子発現ができるように連結されている連結である。遺伝子発現に必要な制御領域の正確な性質は、類似の技術分野でよく知られているように、生物ごとに異なる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７年〜１９９３年を参照。

したがって、本発明は原核細胞または真核細胞のいずれかでの、抗ＣＰＡＡ抗体またはペプチドの発現を包含する。適切な宿主としては、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕまたは哺乳動物、昆虫、トリもしくは酵母由来の宿主細胞のいずれかにおける、細菌、酵母、昆虫、真菌、トリおよび哺乳動物細胞を含む細菌または真核生物宿主が含まれる。哺乳動物細胞または組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌまたはネコに由来するものであってもよいが、他の哺乳動物細胞も用いることができる。

さらに、例えばユビキチン−膜貫通ポリペプチド融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの合成は、酵母ユビキチン加水分解酵素系を用いることにより達成できる。こうして生成した融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで加工できるかまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで精製して加工でき、指定されたアミノ末端配列を有する本発明の抗ＣＰＡＡ抗体またはポリペプチドの合成を可能にする。さらに、酵母（または細菌）での直接的な発現における、開始コドン由来のメチオニン残基の残存に関連する問題を、おそらく避けることができるであろう。Ｓａｂｉｎら、７巻（７号）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７０５〜０９頁（１９８９年）；Ｍｉｌｌｅｒら、７巻（７号）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．６９８〜７０４頁（１９８９年）。

酵母をグルコース豊富な培地で発育させると多量に産生される糖分解酵素をコードする、活発に発現された遺伝子由来のプロモーターおよび終結エレメントを組み込んでいる任意の一連の酵母遺伝子発現系を、本発明の抗ＣＰＡＡ抗体またはペプチドを得るために利用することができる。既知の解糖系遺伝子も、非常に有効な転写調節シグナルを提供することができる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターおよびターミネーターシグナルが利用できる。

昆虫での抗ＣＰＡＡ抗体またはこれらのペプチドもしくは機能的な誘導体の産生は、例えば、当業者に周知の方法を用いて膜貫通のポリペプチドを発現するように遺伝子操作したバキュロウイルスを、昆虫宿主に感染することによって達成できる。Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７年、１９９３年を参照。

１つの実施形態では、導入したヌクレオチド配列は、レシピエント宿主中での自律的な複製が可能なプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれる。任意の様々なベクターが、この目的のために使用できる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７年、１９９３年を参照。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する上での重要な要素には、ベクターを含むレシピエント細胞が認識でき、ベクターを含まないこれらのレシピエント細胞からの選択が容易であり得ること；特定の宿主の中での所望するベクターのコピーの数；およびベクターを、種の異なる宿主細胞間で「往復させる」ことができるのが望ましいかどうかということが含まれる。

当分野で周知の原核生物ベクターの例には、プラスミド、例えば大腸菌で増殖できるプラスミド（ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ １８４、πＶＸなどの）が含まれる。このようなプラスミドは、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７年、１９９３年により開示されている。バチルスプラスミドには、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などが含まれる。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａｎ、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ ３０７〜３２９頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ １９８２年）により開示されている。適切なストレプトミセスプラスミドには、ｐＩＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌら、１６９巻 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４１７７〜８３頁（１９８７年））、およびφＣ３１などのストレプトミセスバクテリオファージ（Ｃｈａｔｅｒら、Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ’ｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４５〜５４頁（Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ １９８６年）が含まれる。シュードモナスプラスミドは、Ｊｏｈｎら、８巻 Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．６９３〜７０４頁（１９８６年）；Ｉｚａｋｉ、３３巻 Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７２９〜４２頁（１９７８年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８７年、１９９３年により概説されている。

あるいは、抗ＣＰＡＡ抗体またはペプチドをコードするｃＤＮＡの発現に有用な遺伝子発現エレメントには、限定されるものではないが、（ａ）ウイルス転写プロモーターおよびそれらのエンハンサーエレメント、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Ｏｋａｙａｍａら、３巻 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０頁（１９８３年））、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（Ｇｏｒｍａｎら、７９巻Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ６７７７頁（１９８２年））、およびモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、４１巻 Ｃｅｌｌ ８８５頁（１９８５年））；（ｂ）例えば、ＳＶ４０後期領域に由来するスプライス領域およびポリアデニル化部位（Ｏｋａｙａｒｅａら、１９８３年）、ならびに（ｃ）例えばＳＶ４０におけるポリアデニル化部位（Ｏｋａｙａｍａら、１９８３年）が含まれる。

免疫グロブリンｃＤＮＡ遺伝子を、Ｌｉｕら、下記およびＷｅｉｄｌｅら、５１巻 Ｇｅｎｅ ２１頁（１９８７年）に記載のように、発現エレメントとしてＳＶ４０初期プロモーターおよびそのエンハンサー、マウス免疫グロブリン重鎖プロモーターエンハンサー、ＳＶ４０後期領域ｍＲＮＡスプライシング、ウサギＳ−グロビン介在配列、免疫グロブリンおよびウサギＳ−グロビンポリアデニル化部位、ならびにＳＶ４０ポリアデニル化エレメントを用いて発現することができる。

一部ｃＤＮＡ、一部ゲノムＤＮＡからなる免疫グロブリン遺伝子に関しては（Ｗｈｉｔｔｌｅら、１巻Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４９９頁（１９８７年））、転写プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスであることができ、プロモーターエンハンサーは、サイトメガロウイルスであることができ、マウス／ヒト免疫グロブリン、ならびにｍＲＮＡスプライシングおよびポリアデニル化領域は、天然の染色体の免疫グロブリン配列であることができる。

１つの実施形態では、げっ歯類細胞においてｃＤＮＡ遺伝子を発現させるための、転写プロモーターはウイルスＬＴＲ配列であり、転写プロモーターエンハンサーは、マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーおよびウイルスＬＴＲエンハンサーのいずれかまたは両方であり、スプライス領域は３１ｂｐを超えるイントロンを含み、ポリアデニル化領域および転写終止領域は、合成する免疫グロブリン鎖に対応する天然の染色体配列から由来する。他の実施形態では、他のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列が、前述の発現エレメントと組み合わされて、哺乳動物細胞で前記タンパク質の発現を達成する。

それぞれの融合した遺伝子は、発現ベクター中に集められるかまたは挿入される。次いでキメラ免疫グロブリン鎖遺伝子産物を発現できるレシピエント細胞を、抗ＣＰＡＡペプチド単独でまたはキメラ重鎖もしくはキメラ軽鎖−コード遺伝子でトランスフェクトするか、またはキメラ重鎖およびキメラ軽鎖遺伝子で同時トランスフェクトする。トランスフェクトしたレシピエント細胞を、組み込まれた遺伝子の発現ができる条件下で培養し、発現した免疫グロブリン鎖または完全な抗体またはフラグメントを、培養液から回収する。

１つの実施形態では、抗ＣＰＡＡペプチドをコードする融合遺伝子もしくはキメラ重鎖および軽鎖、またはこれらの部分を、その後にレシピエント細胞を同時トランスフェクトするのに用いる別々の発現ベクター中に集める。

それぞれのベクターは、２つの選択可能な遺伝子、細菌系での選択のために設計された第１の選択可能な遺伝子および真核生物系での選択のために設計された第２の選択可能な遺伝子を含むことができ、それぞれベクターは異なる一対の遺伝子を有する。このストラテジーでは、細菌系でまず融合遺伝子の産生を導き、この遺伝子の増幅を可能にするベクターをもたらす。細菌宿主において、このように産生され増幅された遺伝子を、続いて真核細胞に同時トランスフェクトするのに用いて、所望のトランスフェクトした遺伝子を持つ同時トランスフェクトした細胞の選択を可能にする。

細菌系で用いるための選択可能な遺伝子の例には、アンピシリンに耐性を与える遺伝子およびクロラムフェニコールに耐性を与える遺伝子がある。真核生物のトランスフェクタントで用いるための選択可能な遺伝子には、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔと呼ばれる）およびＴｎ５由来のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏと呼ばれる）が含まれる。

ｇｐｔを発現する細胞の選択は、この遺伝子によってコードされる酵素は、プリンヌクレオチド合成の基質としてキサンチンを利用するが、類似の内因性の酵素は利用することができないという事実に基づいている。（１）イノシン一燐酸のキサンチン一リン酸塩への変換を妨げるミコフェノール酸、および（２）キサンチンを含む培地中では、ｇｐｔ遺伝子を発現している細胞のみが生存できる。ｎｅｏの産物は、抗生物質Ｇ４１８およびネオマイシンクラスの他の抗生物質によるタンパク質合成阻害をブロックする。

２つの選択方法を同時にまたは連続して用いて、２つの異なるＤＮＡベクター上で真核細胞に導入した免疫グロブリン鎖遺伝子の発現に関して選択することができる。真核細胞に関して異なる選択可能なマーカーを含む必要はない。すなわちそれぞれが同じ選択可能なマーカーを含む重鎖および軽鎖ベクターを、同時トランスフェクトすることができる。適切な耐性細胞の選択後、クローンの大部分は、重鎖および軽鎖ベクターの両方および／または抗ＣＰＡＡペプチドが組み込まれたコピーを含む。

あるいは、キメラ重鎖および軽鎖をコードする融合遺伝子を、同じ発現ベクター上にを集めることができる。

発現ベクターのトランスフェクションおよびキメラ抗体の産生のためには、レシピエント細胞株は、骨髄腫細胞であってもよい。骨髄腫細胞は、トランスフェクトされた免疫グロブリン遺伝子によりコードされた免疫グロブリンを合成し、集合し、分泌することができ、免疫グロブリンのグリコシル化する機構を備えている。例えばレシピエント細胞は、組換え型のＩｇ産生骨髄腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ ８２８７）である。ＳＰ２／０細胞は、トランスフェクトした遺伝子によりコードされた免疫グロブリンのみを産生する。骨髄腫細胞は、培養によるかまたは分泌された免疫グロブリンを腹水液から得ることができるマウスの腹腔内で増殖できる。他の適切なレシピエント細胞には、ヒトもしくは非ヒト由来のＢリンパ球、ヒトもしくは非ヒト由来のハイブリドーマ細胞、または異種間のヘテロハイブリドーマ細胞などのリンパ球が含まれる。

本発明のキメラ抗体構成体または抗ＣＰＡＡポリペプチドを保持する発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、およびポリカチオン、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストランを用いた処理などの生化学的な手段、ならびに電気穿孔法、直接的なマイクロインジェクション、および微粒子銃などの機械的な手段を含む、任意の種々の適切な手段により適切な宿主細胞に導入することができる。Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、２４０巻、Ｓｃｉｅｎｃｅ １５３８頁（１９８８年）。

リンパ球様細胞にＤＮＡを導入するもう１つの方法は、電気穿孔法である。Ｐｏｔｔｅｒら、８１巻 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７１６１頁（１９８４年）；Ｙｏｓｈｉｋａｗａら、７７巻 Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１２２〜３３頁（１９８６年）。この方法では、組み込むＤＮＡの存在下でレシピエント細胞に電気パルスをかける。一般的には、トランスフェクション後、細胞を完全培地中で約２４時間回復させ、次いで選択培地の存在下で９６穴培養プレートに播種する。Ｇ４１８選択を、約０．４〜０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて実施する。ミコフェノール酸選択には、約６μｇ／ｍｌと約０．２５ｍｇ／ｍｌのキサンチンを用いる。電気穿孔法技術では、Ｓｐ^２／０細胞の場合、約１０^−５〜約１０^−４のトランスフェクション頻度を生じることが予期される。プロトプラスト融合法では、キメラ抗体遺伝子を含むカタル性保有の組換えプラスミドから細胞壁を取り除くためにリゾチームが用いられる。得られたスフェロプラストを、ポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合する。

本発明の免疫グロブリン遺伝子は、非リンパ系の哺乳動物細胞中であるいは酵母などの他の真核細胞中で、または原核細胞、特に細菌中で発現することもできる。

免疫グロブリン重鎖および軽鎖の産生に関して、酵母は、細菌よりも実質的な利点を提供する。酵母は、グリコシル化を含む翻訳後のペプチド修飾を行う。今では、酵母で所望のタンパク質産生に用いることができる強力なプロモーター配列および高コピー数プラスミドを利用する、多数の組換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母は、クローニングした哺乳類の遺伝子産物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を持つペプチド（すなわちプレペプチド）を分泌する。Ｈｉｔｚｍａｎら、１１ ｔｈ Ｉｎｔ’ｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｙｅａｓｔ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｎｔｐｅｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ，１９８２年）。

酵母遺伝子発現系は、産生レベル、抗ＣＰＡＡペプチド、抗体と集合されたマウスおよびキメラ抗体、これらのフラグメントおよび領域の分泌ならびに安定性について日常的に評価することができる。酵母をグルコース豊富な培地で発育させると多量に産生される糖分解酵素をコードする、活発に発現された遺伝子由来のプロモーターおよび終結エレメントを組み込んでいる、任意の一連の酵母遺伝子発現系を利用することができる。既知の解糖の遺伝子も、非常に効率的な転写調節シグナルを提供できる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターおよびターミネーターシグナルを利用できる。酵母でクローニングした免疫グロブリンｃＤＮＡの発現のための最適な発現プラスミドを評価する多くの方法を選ぶことができる。ＩＩ巻ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、４５〜６６頁、（Ｇｌｏｖｅｒ、編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８５年）を参照。

細菌株も本発明により記載される抗体分子またはペプチドの産生の宿主として利用することができ、大腸菌Ｋ１２株、例えば大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）、ならびに他の腸内細菌、例えばネズミチフス菌またはセラチアマルセスセンス、および種々のシュードモナス種を用いることができる。

宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの細菌宿主と共に用いられる。ベクターは、複製部位ならびに形質転換細胞で表現型選択を提供できる特異的遺伝子を有している。細菌で、マウス抗体ならびにキメラ抗体、クローニングした免疫グロブリンｃＤＮＡによりコードされたフラグメントおよび領域または抗体鎖の産生のための発現プラスミドを評価する多くの方法を選ぶことができる（Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５年；Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８７年、１９９３年；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９年；Ｃｏｌｌｉｇａｎ、１９９２〜１９９６年を参照）。

宿主哺乳動物細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖できる。哺乳動物細胞は免疫グロブリンタンパク質分子に、リーダーペプチドの除去、重鎖および軽鎖の折畳みと分子集合、抗体分子のグリコシル化、ならびに機能的な抗体タンパク質の分泌を含む翻訳後修飾をもたらす。

上記のリンパ系由来の細胞に加えて、抗体タンパク質産生のために宿主として有用であり得る哺乳動物細胞には、ベロ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８１）またはＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ６１）などの線維芽細胞由来の細胞が含まれる。

多くのベクター系が、哺乳動物細胞でクローニングした抗ＣＰＡＡペプチド重鎖および軽鎖遺伝子の発現のために利用できる（Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５年を参照）。異なる方法を、完全なＨ_２Ｌ_２抗体を得るために用いることができる。上記のように、同じ細胞中で重鎖および軽鎖を同時発現して、重鎖および軽鎖の細胞内対合および連結を、完全な四量体Ｈ_２Ｌ_２抗体および／または抗ＣＰＡＡペプチドに達成することは可能である。同一宿主中で、同じまたは異なるプラスミドのいずれかを用いて、同時発現を生じることができる。重鎖および軽鎖の両方および／または抗ＣＰＡＡペプチドに対する遺伝子を、同じプラスミドに配置することができ、次いで細胞にトランスフェクトし、これにより両方の鎖を発現する細胞を直接選択する。あるいは、細胞を最初に１つの鎖、例えば軽鎖をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、引き続いて得られた細胞株を第２の選択可能なマーカーを含む重鎖プラスミドを用いてトランスフェクションすることができる。どちらかの方法による抗ＣＰＡＡペプチドおよび／またはＨ_２Ｌ_２分子を産生している細胞株を、別の選択可能なマーカーと共にペプチドの追加されたコピー、重鎖、軽鎖、または重鎖＋軽鎖をコードするプラスミドでトランスフェクトして、集合したＨ_２Ｌ_２抗体分子の産生増大またはトランスフェクトした細胞株の向上した安定性などの増強された特性を有する細胞株を作製することができる。

さらに、微生物または動物細胞の大量培養に基づく組換え型抗体産生のための、便利で安全でかつ経済的な代わりの主流の発現系として、最近植物が出現している。抗体は、植物細胞培養または普通に育てた植物で発現されてもよい。植物での発現は、植物体の全体にわたっても、細胞下の植物細胞小器官に限られても、または種子に限られてもよい（胚乳）。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１６７５３１号；米国特許番号第６，０８０，５６０号および第６，５１２，１６２号；およびＷＯ ０１／２９２４２を参照。いくつかの植物由来の抗体が、臨床試験を含む実用化に近い段階に達している（例えば、Ｂｉｏｌｅｘ，ＮＣを参照のこと）。

ハイブリドーマ技術
本発明は、ＣＰＡＡに対する高度な特異性と親和性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。本発明は、また自然発生的に生じるかまたは既知の方法を用いて人工的に産生でき、依然として出発物質の特性を有する、つまり依然とし本発明による抗体またはこれらの誘導体を産生でき、周囲の培地にそれらを分泌できる、上記の詳しい説明で特徴づけられるハイブリドーマ細胞株の改変体および変異体に関する。

本発明は、前記ハイブリドーマ細胞株の産生方法および前記モノクローナル抗体の産生方法も含む。ハイブリドーマ細胞株のクローンおよびサブクローンは、反復したクローニングにより出発クローンから産生され、依然として本発明に必須である出発クローンの特徴を有するハイブリドーマであると理解すべきである。

より具体的には、本発明の核酸、タンパク質またはペプチド分子を、ＣＰＡＡを結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を開発するために利用できる。本発明のＣＰＡＡ−結合抗体を調製するために、培養で連続継代細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することができる。例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁、１９７５年）を使用することができる。米国特許第４，３７６，１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．１９８８年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｃｏｌｌｉｇａｎら、編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃ．＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｎ．Ｙ．，１９９２〜１９９６年）も参照。

米国特許第６，５３７，８０９号に記載されているように、高親和性および／または高結合活性のヒト抗体を作製するための他の好都合な方法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで天然ヒト脾細胞を抗原でプライミングすること、得られたｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原感作した脾細胞を免疫不全ドナー、例えばＳＣＩＤマウスへ転移すること、抗原で免疫不全ドナーを追加免疫すること、ドナーからヒト抗体を分泌するＢ細胞（ＩｇＧを分泌する）を分離すること、分離したヒト抗体分泌細胞を、ＥＢＶ−形質転換することを含む。

キメラヒト化および完全ヒト化抗体
本発明の抗体は、ヒト抗体由来の定常領域が、マウス由来のＬおよび重鎖可変領域にクローニングされた一部ヒトならびに一部マウス抗体から成るキメラ抗体を含む。場合によっては、ヒト配列の７０％が保持されている。ヒト化抗体は、ヒト抗体フレームワークのおおよそ９０％が保持され、マウスの相補性決定領域のみと組み合わせたキメラ抗体である。本発明で、完全ヒト化抗体もまた意図される。

ＣＰＡＡのアミノ酸配列に含まれたエピトープを結合する組換えマウス抗体またはキメラマウス−ヒト抗体またはヒト−ヒト抗体は、本明細書で提供される開示に基づく既知の技術を用いて、本発明に従って提供することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８７年，１９９２年，１９９３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ １９８９年）を参照。例えばＥＰ０２３９４００に従って、所望のＣＤＲをヒトフレームワークに融合させることにより、抗体をヒト化できる。

本発明の抗ＣＰＡＡ抗体をコードするＤＮＡは、重鎖定常領域（Ｈ_ｃ）、重鎖可変領域（Ｈ_ｖ）、軽鎖可変領域（Ｌ_ｖ）および軽鎖定常領域（Ｌ_ｃ）の少なくとも１つをコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。マウス可変領域抗原結合セグメントをコードするＤＮＡの供給源としての、染色体遺伝子フラグメントの使用に代わる便利な代替物は、キメラ免疫グロブリン遺伝子の作製のためのｃＤＮＡの使用である。例えば、Ｌｉｕら、８４巻 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ３４３９頁（１９８７年）；１３９巻 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５２１頁（１９８７年）を参照。ｃＤＮＡを使用するためには、所望のタンパク質の合成を達成するために、宿主細胞に関して適切な遺伝子発現エレメントが遺伝子と組み合わされていることを必要とする。細菌または適切なＲＮＡスプライシングシステムを欠く他の宿主でｃＤＮＡ配列を発現できるという点で、ｃＤＮＡ配列の使用はゲノム配列（イントロンを含む）に比べ有利である。

例えば、図２〜図５（配列番号１〜２、４〜５）に示したＤＮＡ配列の使用に基づく既知の方法を用いて、抗ＣＰＡＡ活性を有するマウスのＶおよびＣ領域抗原結合セグメントをコードするｃＤＮＡを得ることができる。既知の方法により本発明に従う明細書に示すように、図２（配列番号１）または図４（配列番号４）に示したＤＮＡ配列の一部を結合するプローブを、抗ＣＰＡＡ抗体、フラグメントまたは領域を発現するハイブリドーマからＤＮＡを分離するために用いることができる。

図２〜図５（配列番号１〜２、４〜５）に示した、ＣＰＡＡ−結合抗体Ｌおよび重鎖を表すオリゴヌクレオチドは、相同遺伝子の存在に関してスクリーニングするためにおよび抗ＣＰＡＡ抗体可変領域または定常領域をコードするこのような遺伝子をクローニングするために有用である。このようなプローブは、通常、ＣＰＡＡのエピトープを結合する重鎖または軽鎖ＣＤＲ領域に対する、図６（配列番号３）および図７（配列番号６）に示したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは他のあらゆるＤＮＡ）に結合する。このようなオリゴヌクレオチドを合成するための、このような技術は周知である。例えば、Ｗｕら、２１巻 Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１０１〜４１頁（１９７８年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７年、１９９３年を参照。

抗ＣＰＡＡ可変または定常領域をコードするポリヌクレオチドをクローニングする別の方法では、発現ベクターのライブラリーは、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ（抗ＣＰＡＡ抗体または可変もしくは定常領域を発現できる細胞由来の）を、発現ベクターにクローニングすることにより調製する。次いで、Ａ２またはｃＡ２などの抗ＣＰＡＡ抗体の結合を競合的に阻害し、抗ＣＰＡＡ抗体またはそれらのフラグメントと同じアミノ酸配列を有するペプチドをコードし得るヌクレオチド配列を有するタンパク質を発現できるメンバーに関して、前記ライブラリーをスクリーニングする。この実施形態では、ｃＤＮＡなどのＤＮＡを、抗ＣＰＡＡ抗体またはフラグメントを発現できる細胞から抽出して精製する。精製されたｃＤＮＡを、（剪断、エンドヌクレアーゼ消化などにより）断片化してＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントのプールを作製する。次いでこのプールからのＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを、メンバーがそれぞれλファージライブラリーなどのユニークなクローニングしたＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントの、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞（例えば、哺乳動物、酵母、昆虫あるいは真菌）での発現を含む発現ベクターのゲノムライブラリーを作製するために、発現ベクター中にクローニングする。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８７年、１９９３年；Ｈａｒｌｏｗ，１９８８年；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，１９９２〜１９９６年；Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎら、１１巻Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５９１〜９５頁（１９９３年）；Ｍａｒｋｓら、１１巻Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１４５〜４９頁（１９９３年）を参照。

このような可変または定常抗ＣＰＡＡ領域をコードする核酸が一旦分離されると、阻害活性を伴ってＣＰＡＡと結合する組換え型モノクローナル抗体を提供するするために、核酸をコードする他の定常もしくは可変重鎖または軽鎖と共に、前記核酸を宿主細胞で適切に発現できる。このような抗体は、抗原結合を担う相補性決定残基を有するフレームワーク残基を含むマウスまたはヒトの抗ＣＰＡＡ可変領域を含むことができる。１つの実施形態では、上記のように核酸によりコードされた抗ＣＰＡＡ可変軽鎖または重鎖は、少なくとも５つのアミノ酸のエピトープと結合する。このような抗ＣＰＡＡ可変軽鎖または重鎖のアミノ酸配列を、図６（配列番号３）および図７（配列番号６）に示す。

本発明のマウスの定常（Ｃ）領域ならびにキメラ抗体、フラグメントおよび領域をコードするヒト遺伝子は、既知の方法によりヒト胎生期肝臓ライブラリー由来であり得る。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト免疫グロブリンを発現して産生するヒト細胞を含む任意のヒト細胞由来であり得る。ヒトＣ_Ｈ領域は、いずれか既知のγ、μ、α、δもしくはεを含むヒト重鎖のクラスまたはアイソタイプならびにＧ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４などのヒト重鎖サブタイプ由来であり得る。重鎖アイソタイプは抗体の種々のエフェクター機能を担うので、Ｃ_Ｈ領域の選択は、補体結合などの所望のエフェクター機能または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）における活性によって選択されるであろう。例えば、Ｃ_Ｈ領域はガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）、ガンマ４（ＩｇＧ４）、またはμ（ＩｇＭ）に由来する。ヒトＣ_Ｌ領域は、いずれかのヒト軽鎖アイソタイプ、カッパまたはラムダに由来することができる。

ヒト免疫グロブリンＣ領域をコードする遺伝子は、標準的なクローン技術によりヒト細胞から得られる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７年、１９９３年）。ヒトＣ領域遺伝子は、軽鎖の２つのクラス、重鎖の５つのクラスおよびこれらのサブクラスを表す遺伝子を含む既知のクローンから容易に入手可能である。キメラ抗体フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）_２およびＦａｂは、適切に切り詰めたキメラ重鎖遺伝子を設計することにより調製できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントの重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ_１ドメインおよび重鎖のヒンジ領域に続いて短縮した分子を生ずる翻訳終止コドンをコードするＤＮＡ配列を含むであろう。

一般に、本発明のマウス、ヒトまたはマウスおよびキメラ抗体、フラグメントおよび領域を、ＣＰＡＡ−特異的抗体の重鎖および軽鎖抗原結合領域をコードするＤＮＡセグメントをクローニングすることにより産生し、これらのＤＮＡセグメントを、Ｃ_ＨおよびＣ_Ｌ領域をそれぞれコードするＤＮＡセグメントに結合して、マウス、ヒトまたはキメラ免疫グロブリン−コード遺伝子を産生する。

したがって、１つの実施形態では、少なくともヒトＣ領域の一部をコードする第２のＤＮＡセグメントに連結した、少なくとも非ヒト由来の抗原結合領域、例えば結合（Ｊ）セグメントを有する機能的に再構成した可変領域をコードする第１のＤＮＡセグメントを含む融合したキメラ遺伝子が作られる。

したがって、抗体ＶおよびＣ領域をコードするｃＤＮＡで、本発明によるキメラ抗体を産生する方法は、以下に概説するいくつかのステップを含む：
１．抗ＣＰＡＡ抗体を産生する細胞株から、ならびにＨおよびＬ定常領域を供給する任意の別の抗体からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分離；クローニングおよびそれからのｃＤＮＡ産生；
２．軽鎖および重鎖遺伝子の適切なＶおよび／またはＣ領域遺伝子セグメントが、（ｉ）適切なプローブで同定し得る、（ｉｉ）配列決定し得る、および（ｉｉｉ）キメラ抗体用の他の抗体由来のＣまたはＶ遺伝子セグメントに適合するようにし得る、精製ｍＲＮＡ由来の完全長ｃＤＮＡライブラリーの調製；
３．上記のように、クローニングした特異的な可変領域遺伝子セグメントを、クローニングしたＣ領域遺伝子に連結することによる完全な重鎖または軽鎖コード配列の作製；
４．マウス−マウス、ヒト−マウス、ヒト−ヒトまたはヒトマウス抗体を提供するための原核および真核細胞を含む選択した宿主での軽鎖および重鎖の発現および産生。

すべての免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子ならびにこれらにコードされたｍＲＮＡの１つの共通の特徴は、Ｊ領域である。重鎖および軽鎖のＪ領域は異なる配列を有するが、各グループ間で、特にＣ領域近傍で高い配列相同性（８０％を超える）が存在する。この方法では、この相同性を利用して、引き続くＶ領域セグメントをヒトＣ領域セグメントへ連結用のＪ領域に有用な制限酵素認識部位を導入するためのプライマーとして用いるために、重鎖および軽鎖のＪ領域の共通配列を、オリゴヌクレオチドを設計するために用いることができる。

ヒト細胞から調製したＣ領域ｃＤＮＡベクターは、部位特異的突然変異誘発により改変してヒト配列の類似の位置に制限酵素認識部位を配置することがでる。例えば、完全なヒトカッパ鎖Ｃ（Ｃ_ｋ）領域および完全なヒトガンマ−１Ｃ領域（Ｃ_γ−１）をクローニングできる。この場合、Ｃ領域ベクターの供給源としてのゲノムのＣ領域クローンに基づく別の方法では、介在配列を除去するために必要な酵素を欠く細菌系でのこれらの遺伝子の発現を妨げるだろう。クローニングした可変領域セグメントを切り取り、Ｌまたは重鎖Ｃ領域ベクターに連結する。あるいは、ヒトＣ_γ−１領域は終止コドンを導入することにより改変でき、それによりＦａｂ分子の重鎖部分をコードする遺伝子配列を作製することができる。次いで、原核生物または真核生物の適切な宿主での発現のために、連結したＶおよびＣ領域を有するコード配列を適切な発現ビヒクルに移す。

トリプレット読み枠の変更または中断なしに、連結が連続的な翻訳可能な配列をもたらす場合、２つのコードＤＮＡ配列は、「作動可能に連結された」といわれる。連結によりその遺伝子発現エレメントの適切な機能を生じ、コード配列の発現をもたらす場合、ＤＮＡコード配列は、遺伝子発現エレメントに作動可能に連結される。

発現ビヒクルは、プラスミドまたは他のベクターを含む。これらの中には、適切な付着末端を有する任意のＶ_ＨまたはＶ_軽鎖配列をその中に容易に挿入できるように操作された適切な制限酵素認識部位を有する、機能的に完全なヒトＣ_ＨまたはＣ_軽鎖配列を持つビヒクルがある。したがって、ヒトＣ_ＨまたはＣ_軽鎖配列を含むビヒクルは、任意の適切な宿主における任意の所望する完全なＨまたは軽鎖発現のための中間体として役立つ。

マウス−ヒトまたはヒト−ヒトなどのキメラ抗体は、一般的に構成体に用いたマウス重鎖および軽鎖可変領域本来の染色体の遺伝子プロモーターによって作動する遺伝子から合成される；スプライシングは通常は、マウスＪ領域のスプライスドナー部位とヒトＣ領域に先行するスプライス受容部位間で生じるか、さらにヒトＣ領域の内に存在するスプライス領域でも生じる；ポリアデニル化および転写終結は、ヒトコード領域の下流の本来の染色体の部位で生じる。米国特許第６，８３５，８２３号を参照。

ＣＰＡＡに対する「完全ヒト化抗体」も本発明において意図される。完全ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの可変および定常領域の両方を含む分子である。完全ヒト化抗体は、自己免疫疾患などの慢性および再発性疾患に対する反復した治療が必要である治療用途に潜在的に用いることができる。完全ヒト抗体の調製のための１つの方法は、マウスの体液性免疫系の「ヒト化」、すなわちヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）座位を内在性のＩｇ遺伝子を失活させたマウスに導入することにより、ヒトＩｇを産生することができるマウス系統（ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｉｃｅ））の作製を含む。それらの物理的構造ならびに幅広い免疫応答を最終的に生ずるために必要な遺伝子の再構成および発現のプロセスの双方の点で、Ｉｇ座位は非常に複雑である。抗体の多様性は、主としてＩｇ座位に存在する異なるＶ、ＤおよびＪ遺伝子間の組合せ再配列により生成される。これらの座位は、抗体発現、対立遺伝子排除、クラススイッチおよび親和性成熟を制御する散在性の調節エレメントも含む。再配置されていないヒトＩｇトランスジーンをマウスへ導入することにより、マウスの組換え機構はヒト遺伝子に適合することが示された。さらにまた、種々のアイソタイプの抗原特異的ｈｕ−ｍＡｂｓを分泌するハイブリドーマは、抗原でゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｉｃｅ）を免疫して得ることができる。完全ヒト化抗体およびこれらを産生する方法は、当分野で公知である。例えば、米国特許第６，８３５，８２３号を参照。

本発明の一態様では、ヒト化抗体の軽鎖をコードする第１発現ベクターおよびヒト化抗体の重鎖をコードする第２の発現ベクターで形質転換した宿主を、それぞれの鎖が発現し、このように発現された鎖の集合により形成されたヒト化抗体を分離するような条件下で維持することを含むプロセスにより、本発明に従って作製するヒト化抗体の生産を提供する。第１および第２発現ベクターは、同じベクターであってもよい。本発明はさらに、ヒト化抗体の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列；前記ＤＮＡ配列を組み込む発現ベクター；および前記発現ベクターで形質転換した宿主を提供する。

本明細書で提供された配列からのヒト化抗体の作製は、過度の実験を行わずに当業者により実施できる。モノクローナル抗体のヒト化には４つの一般的なステップが存在する。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；第６，８３５，８２３号；および第６，８２４，９８９号を参照。それらは、（１）出発抗体のＬおよびＨ可変ドメインのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を決定すること；（２）ヒト化抗体を設計すること、すなわちどの抗体フレームワーク領域をヒト化の過程で使うかを決定すること；（３）実際のヒト化の方法／技術；および（４）トランスフェクションおよびヒト化抗体の発現である。

ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列に関して、所定の抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインｃＤＮＡをクローニングする２つの一般的な方法、すなわち（ａ）通常のｃＤＮＡライブラリーによる方法、または（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）による方法がある。これらの方法は共に広く知られている、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１６６８７１号を参照。ｃＤＮＡのヌクレオチド配列において、この情報を抗体可変ドメインの推定アミノ酸配列に翻訳することは容易である。ここではＮＰＣ−１抗体のＬおよび重鎖のヌクレオチド配列ならびに推定アミノ酸配列を、それぞれ図２（配列番号２〜３）および図５（配列番号５〜６）に示す。

ヒト化抗体の設計に関して、どのヒト抗体配列をヒト化の過程で用いるかの決定において、考慮すべきいくつかの要素がある。Ｌおよび重鎖のヒト化は、互いに独立して考慮されるが、それぞれに対する理由は基本的に類似している。この選択過程は、以下の理論的根拠に基づく、すなわち所定の抗体の抗原特異性および親和性は、主として可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列により決定される。可変ドメインフレームワーク残基は、ほとんどまたは全く直接的な寄与をしない。フレームワーク領域の主要な機能は、抗原を認識するその適正な空間的定位にＣＤＲを維持することである。したがって、ヒト可変ドメインフレームワークが、そのフレームワークが由来するげっ歯類可変ドメインと極めて高い相同性を示す場合、げっ歯類ＣＤＲのヒト可変ドメインフレームワークへの置換、例えば図６および配列番号７〜９または図７および配列番号１０〜１２に示された置換は、その適切な空間的定位の維持を最ももたらしやすい。それゆえに、げっ歯類可変ドメイン（複数可）に対して極めて高い相同性を示すヒト可変ドメインを選択すべきである。

適切なヒト抗体可変ドメイン配列は、次のように選択することができる。すなわち、
１．コンピュータプログラムを用いて、げっ歯類抗体可変ドメインに対して最も高い相同性を示すヒト抗体可変ドメイン配列に関するすべての利用可能なタンパク質（およびＤＮＡ）データベースを検索する。適切なプログラムのアウトプットは、げっ歯類抗体に最も相同性を示す配列、各配列に対するパーセント相同性、およびげっ歯類配列に対する各配列のアラインメントのリストである。これは、それぞれ独立して重鎖および軽鎖可変ドメイン配列の双方に対して行われる。ヒト免疫グロブリン配列のみが含まれる場合、上記の分析はより容易に達成される。

２．ヒト抗体可変ドメイン配列をリストし、相同性を比較する。先ず、非常に可変性の重鎖のＣＤＲ３を除くＣＤＲ全長に対して比較を実施する。ヒト重鎖ならびにカッパおよびラムダ軽鎖は、サブグループに分けられる。すなわち、重鎖は３つのサブグループ、カッパ鎖は４つのサブグループ、ラムダ鎖は６つのサブグループに分けられる。各サブグループ中のＣＤＲサイズは類似しているが、サブグループ間で変動する。げっ歯類抗体ＣＤＲを、相同性の一次近似によってヒトサブグループの１つに適合させることは通常可能である。次いで、類似した長さのＣＤＲを持つ抗体を、アミノ酸配列相同性に関して、特にＣＤＲの内で、しかし周囲のフレームワーク領域中でも比較する。最も相同であるヒト可変ドメインを、ヒト化用のフレームワークとして選択する。

実際のヒト化方法および技術もまた当業者の理解の範囲内である。したがって、所望の再構築した抗体をコードするＤＮＡ配列を、再構築したいヒトＤＮＡのＣＤＲから開始して作製できる。所望のＣＤＲを含むげっ歯類の可変ドメインアミノ酸配列を、選択したヒト抗体可変ドメイン配列のＣＤＲと比較する。ヒト可変領域にげっ歯類ＣＤＲを組み込むために、ヒト可変ドメインの残基を、げっ歯類で対応する残基に変える必要がある残基として記録する。ヒト配列中で置換、添加または欠失させる必要のある残基があってもよい。

所望の残基を含有するために、ヒト可変ドメインフレームワークの変異誘発に用いることができるオリゴヌクレオチドを合成する。それらのオリゴヌクレオチドは、任意の都合よいサイズであり得る。利用できる特定の合成装置の性能により、オリゴヌクレオチドは、通常は長さで制限されるだけである。オリゴヌタレオチド指定ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発の方法は周知である。

あるいはヒト化は、米国特許第５，８５８，７２５号のリコンビナントポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて達成してもよい。この方法を用いて、ＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域間に挿入してもよい。一般に、米国特許第５，８５８，７２５号の技術は、２つのヒトフレームワーク領域ＡＢおよびＣＤ、ならびにこれらの間のドナーＣＤＲにより置換されるＣＤＲを含むテンプレートを用いて実施できる。プライマーＡおよびＢを、フレームワーク領域ＣＤを増幅するために用いる。しかし、プライマーＢおよびＣはそれぞれその５’末端に、ドナーＣＤＲ配列のすべてまたは少なくとも一部に対応する付加された配列も含む。プライマーＢおよびＣは、ＰＣＲを実施可能な条件下で、その５’末端を相互にアニーリングできる十分な長さで部分的に重なる。これによって、増幅された領域ＡＢおよびＣＤは、１回の反応でヒト化産物を産生するためにオーバーラップエクステンションにより遺伝子スプライシングを行うことができる。

抗体を再構築するための突然変異誘発反応に続き、突然変異誘発されたＤＮＡを、Ｌまたは重鎖定常領域をコードする適切なＤＮＡに連結することができ、発現ベクターにクローニングして、哺乳動物細胞などの宿主細胞にトランスフェクトできる。これらのステップは、定型の方法で行うことができる。したがって、再構築した抗体は、
１．少なくともＩｇＨまたは軽鎖の可変ドメイン、ヒト抗体由来のフレームワーク領域を含む可変ドメインならびに本発明のヒト化抗体に必要なＣＤＲをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された適切なプロモーターを含む、第１の複製可能な発現ベクターの調製；
２．少なくとも相補的ＩｇＬまたは重鎖の可変ドメインそれぞれをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された適切なプロモーターを含む、第２の複製可能な発現ベクターの調製；
３．第１のまたは両方の調製したベクターを用いて細胞株を形質転換すること；および
４．前記形質転換細胞株を培養して、前記変更した抗体を産生することを含むプロセスにより調製することができる。

ステップ（ａ）のＤＮＡ配列は、ヒト抗体鎖の両方の可変ドメインおよび／またはそれぞれの定常ドメインをコードすることができる。ヒト化抗体は、任意の適切な組換え型の発現系を用いて調製することができる。変更した抗体を産生するために形質転換した細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株または好適には骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマ細胞株などのリンパ系由来の不死化哺乳類細胞株であってもよい。細胞株は、ＥＢウイルスなどのウイルスでの形質転換により不死化したＢ細胞などの正常リンパ球を含むこともできる。例えば不死化細胞株は、骨髄腫細胞株またはそれらの派生株である。

本発明の抗体の発現に用いられるＣＨＯ細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）を欠損し、したがって、増殖はチミジンおよびヒポキサンチン依存性であってもよい。Ｕｒｌａｕｂら、７７巻 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４２１６〜２０頁（１９８０年）を参照。親ｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞株を、ｄｈｆｒ陽性表現型のＣＨＯ細胞トランスフェクタントの選択を可能にする抗体およびｄｈｆｒをコードするＤＮＡでトランスフェクトする。選択は、チミジンとヒポキサンチンを欠く培地でコロニーを培養し、これらの欠如により非形質導入細胞の生育および形質転換細胞の葉酸経路の再サルベージを妨げ、これによって選択系を迂回することにより実施する。これらのトランスフェクタントは、トランスフェクトした所望のＤＮＡおよびｄｈｆｒをコードするＤＮＡの同時組み込みにより、通常所望のＤＮＡを低レベルで発現する。抗体をコードするＤＮＡの発現レベルは、メトトレキセート（ＭＴＸ）を用いる増幅により増加できる。この薬剤は、酵素ｄｈｆｒの直接的な阻害剤であり、これらの条件下で生存に十分なコピー数のｄｈｆｒ遺伝子を増幅した耐性コロニーの分離を可能にする。ｄｈｆｒおよび抗体をコードするＤＮＡ配列は、元のトランスフェクタントでは密接に連結しているので、通常同時に増幅が生じ、したがって所望の抗体の発現増加が生じる。

ＣＨＯまたは骨髄腫細胞で使用される別の発現系は、米国特許第５，１２２，４６４号に記載のグルタミン合成酵素（ＧＳ）増幅系である。この系は、酵素ＧＳをコードするＤＮＡおよび所望の抗体をコードするＤＮＡでの細胞のトランスフェクションを含む。次いでグルタミンを含まない培地で生育する細胞が選択され、したがってＧＳをコードするＤＮＡを組み込んだと仮定できる。その後これらの選択されたクローンは、メチオニンスルフォキシミン（Ｍｓｘ）を用いる酵素ＧＳの阻害を受ける。生存するために、細胞は抗体をコードするＤＮＡの同時増幅を伴うＧＳをコードするＤＮＡを増幅する。

ヒト化抗体を産生するために用いた細胞株は、哺乳類の細胞株であり得るが、他のあらゆる適切な細胞株、例えば細菌細胞株または酵母細胞株を代わりに用いることができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳後修飾を必要としない場合（例えば、グリコシル化を必要としない場合）、大腸菌由来の細菌菌株を用いることができると考えられる。得られる抗体は、機能について検査される。機能が失われている場合、ステップ（２）に戻り、抗体のフレームワークを変更することが必要である。

一旦発現されると、本発明の完全な抗体、それらの二量体、個々のＬおよび重鎖、または他の免疫グロブリンの形態は、既知の技術、例えば免疫吸着法もしくは免疫アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）などのクロマトグラフィー法、硫安沈殿、ゲル電気泳動、またはこれらの任意の組合せによって回収して精製できる。一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ， ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２年）を参照。少なくとも約９０％〜９５％均質な実質的に純粋な免疫グロブリンが好都合であり、特に医薬用途のためには、９８％〜９９％またはそれ以上に均質なものが好都合である。部分的にまたは所望の均質さに精製された後、ヒト化抗体は治療に、またはアッセイ方法、免疫蛍光染色などの開発、実施に使用できる。一般的には、Ｖｏｌｓ． Ｉ ＆ ＩＩ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，（ＬｅｆｋｏｖｉｔｓとＰｅｒｎｉｓ、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７９年 および１９８１年）を参照。

ファージライブラリーおよび代替組換え型発現系
上記の産生技術、完全ヒト抗体のファージディスプレイ方法などのｉｎ ｖｉｔｒｏ系および抗体ペプチドに加えて、診断薬および治療薬としての両方でヒト抗体の利点の多くが現在理解されている。

本発明の組換え型抗体およびその配列は、無数の誘導体および抗ＰＣＡＡ結合活性を有するリガンド結合分子の作製を可能にする。例えば、ＣＤＲをｎ−ＣｏＤｅＲヒトｓｃＦＶライブラリーなどの抗体ライブラリーと組み換えて高度に特異的で機能的な抗体フラグメントを作製できる。Ｍｏｏｒｅ、４２６巻 Ｎａｔｕｒｅ、７２５〜３１頁（２００３年）を参照。

完全ヒト抗体またはこれらの部分のライブラリーを、米国特許出願公開第２００３／０２３２３３３号に記載のように、１本鎖ＤＮＡの部位特異的切断に基づくクローニング法に従って作製することもできる。

本明細書に含まれるＤＮＡ配列情報および本発明明細書によって提供されるＰＣＡＡエピトープについて得られた関連する知識から作製できる別のリガンド結合分子には、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮＳ（登録商標）の作製が含まれる。ＡＮＴＩＣＡＬＩＮＳ（登録商標）は、化学的に感受性であるか不溶性の化合物の生理学的な運搬または貯蔵に通常含まれる、小型で頑丈なタンパク質の広範なグループであるリポカリン（ｌｉｐｏｃａｌｉｎｓ）から由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織または体液に存在する。低い相互の配列相同性にもかかわらず、リポカリンは、結合ポケットへの入口を形成する一端で４つのループを支える、構造的に保存されたβ−バレルを共有する。ループは、個々のリポカリン間で大きな立体配置的差異を示し、種々の天然リガンド特異性を生じる。このタンパク質構造は、強固なフレームワーク上にその高頻度の可変性ループを有する免疫グロブリンを暗示する。抗体またはいくつかの抗体フラグメントと異なり、リポカリンは、１つの免疫グロブリンドメインよりごくわずかに大きい１６０〜１８０のアミノ酸残基を有する単一のポリペプチド鎖で構成される。４つのループの組は、結合ポケットを構成し、種々の側鎖を許容する構造的な可塑性を示す。したがって、高親和性と特異性を有する異なる形状の指定した標的分子を認識するために、結合部位を再構築できる。ハプテン様化合物、ペプチド、およびタンパク質標的、例えば細胞表面レセプターの細胞外ドメインを認識するＡＮＴＩＣＡＬＩＮＳ（登録商標）を設計した。酵素およびさらに二重特異性結合タンパク質（いわゆるＤＵＯＣＡＬＩＮＳ（登録商標））を有する融合タンパク質も首尾良く調製された。前臨床実験を実施した。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｆｅｒら、３３０巻 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８５〜９６頁（２００３年）を参照。

本明細書に記載されている本発明への応用を有する別の抗体のタイプには、機能的な重鎖を持ち、軽鎖を欠くカミリド（ｃａｍｉｌｉｄ）免疫グロブリンが含まれる。これらの抗体は、専用のＶおよびＣガンマ遺伝子から組立てられる。ファージディスプレイ技術を用いて、固有の高安定性を有する抗原特異的単一ドメイン抗体フラグメントを産生するために、この抗体をクローニングして改造した。米国特許出願公開第２００３／００８８０７４号。

別の関連する誘導体は、抗原およびＰｅｐｂｏｄｉｅｓ（商標）と呼ばれる抗体エフェクター分子（Ｆｃ−領域分子）を架橋することができる細菌で産生された抗体フラグメントを提供する新技術を利用する。米国特許出願公開第２００４／０１０１９０５号。したがって、抗ＰＣＡＡ部位の抗原結合部位を含む結合分子を、Ｆｃ−領域と関連した１つまたは複数のエフェクター機能を示すペプチドに遺伝的に融合し、細胞レセプターでの相互作用および補体活性化などの機能を提供する。

サメ由来の新規の抗原レセプター（ＩｇＮＡＲ）分子は、「誘導体」抗体分子とみなすこともできる。ＮＡＲは、２つのタンパク質鎖がジスルフィド結合した二量体であり、それぞれ１つの可変部分および５つの定常領域を含み、抗体として機能する。Ｎｕｔｔａｌｌら、２７０巻 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５４３〜５４頁（２００３年）。合成ＣＤＲ領域を組み込むｉｎ ｖｉｔｒｏライブラリーを作製するために、本発明のＰＣＡＡ−結合抗体の配列を、ＮＡＲ可変領域に作製できる。これは、単一ドメイン結合試薬をもたらす。

癌細胞生物学での最近の進歩の１つは、癌細胞マーカーを示すことができる始原細胞株の発見を伴う。例えば、ヒト膵臓上皮始原細胞が、同定されて培養で育てられた。その後これらの細胞を、モノクローナル抗体開発のためにとりわけ有用な抗原産生に使うことができる。米国特許第６，４３６，７０４号。したがってＰＣＡＡ−結合抗体は、始原細胞を同定するために用いることができる。これらの始原細胞は、さらに別のＰＣＡＡ−結合抗体系統の誘導のために、マウスなどの異種レシピエントに投与する免疫原として用いることができる。

結論として、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＣＰＡＡ−結合活性を有する無数の可能な分子を与え、本発明の範囲はそれらの分子を達成する方法により制限されない。

抗体誘導体
抗体の「誘導体」は、通常はタンパク質の一部でないさらなる化学的部分を含む。タンパク質の共有結合による修飾も、本発明の範囲内に含まれる。抗体の標的にしたアミノ酸残基と、選択した側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化剤とを反応することによって、このような修飾を分子に導入できる。例えば、当分野では周知である二官能性薬剤を用いる誘導体化は、抗体またはフラグメントを、非水溶性支持マトリックスまたは他の巨大分子の担体に架橋結合するために有用である。

誘導体には、放射ラベルした、例えば、放射性ヨウ素（^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）等でラベルしたモノクローナル抗体；ビオチンもしくはアビジン、酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カルボン酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼまたはグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼとモノクローナル抗体との結合体；およびまたは生物発光薬剤（例えばルシフェラーゼ）、化学ルミネセンス薬剤（例えばアクリジンエステル）または蛍光薬剤（例えばフィコビリンタンパク質）とモノクローナル抗体との結合体も含む。本発明の抗体の誘導体の例には、細胞毒性活性を示す抗体−マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）結合体などの、抗体−小分子薬剤結合体がある。米国特許出願公開第２００４／００３９１７６号を参照。前臨床評価では、この結合体は、異種移植モデルで強力な抗腫瘍活性を示す腫瘍−活性プロドラッグとして作用することを示した。さらに別の細胞毒性抗体誘導体については後述する。

本発明の別の誘導体二価抗体は、２つの異なる抗原のグループを認識する２つの別々の抗体の一部を組み合わせて作製した二重特異性抗体である。これは架橋または組換え技術によって達成される。さらに、機能部分を抗体またはその部分に添加してｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加させることができる（例えば、血液流からのクリアランス時間を長くすることによって。このような技術は、例えばＰＥＧ部分の添加（またはＰＥＧ化と呼ばれる）を含み、当分野で周知である。米国特許出願公開公報第２００３／００３１６７１号を参照。

抗イディオタイプＡｂ
モノクローナルまたはキメラ抗ＣＰＡＡ抗体に加えて、本発明はまた、本発明の抗ＣＰＡＡ抗体特異的抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体に関する。抗Ｉｄ抗体は、一般に別の抗体の抗原結合領域に関連する特有な決定基を認識する抗体である。ＣＰＡＡ特異的抗体は、イディオタイプ抗体またはＩｄ抗体と呼ばれる。Ｉｄ抗体またはそれらの抗原結合領域を有するＩｄ抗体の供給源として、同種で同じ遺伝子型の動物（例えば、マウス系統）を免疫して、抗Ｉｄを調製できる。免疫された動物は、免疫する抗体のイディオタイプ決定基を認識して応答し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体はまた、さらに別の動物で、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生する免疫応答を誘発するための「免疫原」として用いることもできる。抗抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘発した本来の抗体にエピトープ的に同一であり得る。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いて、同一特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することができる。

したがって、本発明によるＣＰＡＡに対して作製したモノクローナル抗体を、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの適切な動物で、抗Ｉｄ抗体の誘発に用いることができる。このような免疫されたマウス由来の脾臓細胞を、抗Ｉｄ ｍＡｂｓを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを産生するために用いることができる。さらに抗Ｉｄ ｍＡｂｓを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体に結合することができ、別のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫するのに用いることができる。これらのマウス由来の血清は、ＣＰＡＡエピトープに特異的な本来のｍＡｂの結合特性を有する抗抗Ｉｄ抗体を含む。

イディオタイプ、抗イディオタイプ
さらに、ＣＰＡＡに対する抗体、その類似体、それらの部分、フラグメント、ペプチドまたは誘導体を、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの適切な動物で、抗Ｉｄ抗体を誘発すために用いることができる。このような免疫されたマウス由来の脾臓細胞を、抗Ｉｄモノクローナル抗体を分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを産生するために用いる。さらに抗Ｉｄ抗体を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体に結合することができ、別のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫するために用いることができる。これらのマウス由来の血清は、ＣＰＡＡ、またはそれらの類似体、フラグメントおよび誘導体のエピトープに特異的な本来のモノクローナル抗体の結合特性を有する抗抗Ｉｄ抗体を含む。したがって抗Ｉｄ抗体は、それ自体のイディオタイプエピトープまたは評価するエピトープに構造的に類似する「イディオトープ」を有する。

抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位に一般に関連する特有な決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されるｍＡｂを用いて、ｍＡｂの供給源として同種で同じ遺伝子型の動物（例えば、マウス系統）を免疫することにより調製できる。免疫された動物は、免疫した抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生して応答する。例えば、米国特許第４，６９９，８８０号および第６，８３５，８２３号を参照。抗Ｉｄ抗体はまた、さらに別の動物でいわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生する免疫応答を誘発するための「免疫原」として用いることもできる。抗抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘発した本来のｍＡｂにエピトープ的に同一であり得る。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いて、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定するこができる。

抗ＣＰＡＡ抗体の構造類似体および抗ＣＰＡＡペプチド
本発明の抗ＣＰＡＡ抗体の構造類似体およびペプチドは、本明細書で示された教示とガイダンスに基づく既知の方法のステップにより提供される。

タンパク質の三次元構造についての知識が、これらがどのように機能するのか理解する上で重要である。数百のタンパク質の三次元構造が、現在タンパク質構造データベースで利用できる（配列データベースの何千もの既知のタンパク質配列とは対照的に）。これらの構造の解析は、これらはモティーフの識別可能なクラスに分類されることを示す。したがって、既知の構造の関連したタンパク質に対するタンパク質の相同性に基づくタンパク質の三次元構造をモデル化することができる。比較的低い配列相同性を有する２つのタンパク質が、非常に類似した三次元構造またはモティーフを有することができる多くの例が知られている。

近年、核磁気共鳴（ＮＭＲ）により、約１５ｋＤａまでのタンパク質の三次元構造を決定することが可能になった。この技術は、純粋なタンパク質の濃縮溶液を必要とするだけである。結晶または同型の誘導体を必要としない。多くのタンパク質の構造が、この方法により決定された。ＮＭＲ構造の決定の詳細は、当分野では周知である。例えば、Ｗｕｔｈｒｉｃｈ， ＮＭＲ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８６年）；Ｗｕｔｈｒｉｃｈ， ２４３巻 Ｓｃｉｅｎｃｅ ４５〜５０頁（１９８９年）；Ｃｌｏｒｅら、２４巻 Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４７９〜５６４頁（１９８９年）；Ｃｏｏｋｅら、８巻 Ｂｉｏａｓｓａｙｓ ５２〜５６頁（１９８８年）を参照。

この方法を適用するに当たり、種々の^１Ｈ ＮＭＲ二次元データセットが、本発明の抗ＣＰＡＡ抗体および／または抗ＣＰＡＡペプチドに関して集められる。これらは、２つの主なタイプのデータセットである。１つのタイプ、ＣＯＳＹ（相関スペクトル法）は、化学結合によって連結されたプロトン共鳴を同定する。これらのスペクトルは、３つ以下の共有結合によって連結されるプロトンに関する情報を提供する。ＮＯＥＳＹ（核オーバーハウザー増強分光法）では、空間的に近い（０．５ｎｍ未満）プロトンを同定する。完全なスピン系の以下の割当で、二次構造がＮＯＥＳＹにより定義される。交差ピーク（核オーバーハウザー効果またはＮＯＥ）が、ペプチドの一次配列で隣接している残基間に認められ、０．５ｎｍ未満離れたプロトンに関して認められる。アミドプロトンカップリング定数および二次構造で隣接する非隣接アミノ酸からのＮＯＥを組み合わせた経時的なＮＯＥから集めたデータを、ペプチドの二次構造を特徴づけるために用いる。二次構造の予測のほかにも、ＮＯＥは一次アミノ酸配列および二次構造の両方における空間にプロトンが存在する距離を示す。三次構造の予測は、すべてのデータを考慮後に、「最も良く適合する」外挿によって決定する。

アミノ酸のタイプを、結合を貫く結合性を用いて最初に同定する。次に、特異的アミノ酸を、既知のアミノ酸配列と共に隣接残基に対する空間経由結合性を用いて割り当てる。次いで構造的情報を一覧表にする、そして情報には３つの主な種類がある。すなわち、ＮＯＥは、空間的に近くに存在するプロトン対を同定し、結合定数は、二面角に関する情報を与え、緩徐なアミドプロトン交換は、水素結合位置に関する情報を与える。束縛条件を、束縛条件付き分子動力学法を用いる改良に従うディスタンスジオメトリー計算法を用いて構造算出に用いる。これらのコンピュータプログラムのアウトプットは、実験データでの適合する構造のファミリー（すなわちペアをなす＜０．５ｎｍ距離束縛のセット）である。構造がデータによって定義されればされるほど、構造のファミリーを良好に重ね合せることができる（すなわち構造の解像度が優れる）。ＮＭＲを用いて良好に定義された構造では、バックボーンの多くの位置（すなわちアミド、Ｃαおよびカルボニル原子）ならびに分子のコアに埋没するそれらのアミノ酸側鎖が、結晶学によって得られる構造と同程度に明確に定義できる。しかし、表面に露出したアミノ酸残基の側鎖は、十分に定義されない場合が多い。これはおそらく、これらの表面残基は可動性が高く、固定された位置を有さないという事実を反映している。（結晶構造において、拡散した電子密度と考えることができる）。

したがって、本発明に従いＮＭＲ分光学的なデータの使用を、コンピュータモデリングと組み合わせて、トポグラフィーの構造的な理解に基づく抗ＣＰＡＡ抗体およびペプチドの少なくとも部分の構造類似体に到達する。この情報を使用して、当業者には、ＣＰＡＡ結合親和性または結合活性が、分子の予想される治療的または診断的使用の要件に従って調節されるペプチドの生産を可能にする合理的なアミノ酸置換などによって、どのように抗ＣＰＡＡ抗体またはペプチドの構造類似体を達成するについて、例えば、ＣＰＡＡ結合に対する高い特異性を達成する方法がわかるであろう。

あるいは、抗ＣＰＡＡ治療および診断として適切な構造的ならびに化学的特徴を有する化合物は、選択的なＣＰＡＡ親和性を有する構造類似体を提供する。ＭＡＣＲＯＭＯＤＥＬ（登録商標）、ＩＮＳＩＧＨＴ（登録商標）、およびＤＩＳＣＯＶＥＲ（登録商標）などのプログラムを使用する、ＣＰＡＡ結合化合物例えばＣＰＡＡレセプター、抗ＣＰＡＡ抗体、または他のＣＰＡＡ結合分子の分子モデリング研究は、本発明による抗ＣＰＡＡ Ａｂｓおよび／またはペプチドのこのような空間要件および配向を提供する。したがって、本発明のこのような構造類似体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける選択的な定性的および定量的抗ＣＰＡＡ活性を提供する。

診断的用途
本発明はまた、膵臓もしくは結腸癌が判明したかまたは疑いのある患者におけるＣＰＡＡを検出する診断用の上記の抗ＣＰＡＡ抗体およびペプチドを提供する。本発明のもう１つの態様では、抗体は形態学的に正常な細胞で分子マーカーを検出して、無症候個体の早期発見スクリーニングを提供できる。

本発明の抗ＣＰＡＡ抗体および／またはペプチドは、試料中のＣＰＡＡあるいは抗ＣＰＡＡ抗体を検出するかまたは定量化するイムノアッセイに有用である。一般的にＣＰＡＡに対するイムノアッセイは、ＣＰＡＡに選択的に結合でき、試料と結合する標識したペプチドまたは抗体を検出できる、本発明の検出可能的に標識した高親和性（または高結合活性）抗ＣＰＡＡ抗体またはポリペプチドの存在下で、臨床または生体試料をインキュベートすることを含む。種々の臨床的アッセイ方法が、当分野では周知である。例えば、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ８０’ｓ（Ｖｏｌｌｅｒら、編、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ、１９８１年）を参照。このような試料は、組織バイオプシー、血液、血清、および大便サンプル、または浣腸または経口下剤溶液に続いて結腸直腸経路から集めた液体を含み、以下に記載のようにＥＬＩＳＡ分析に供された。

したがって、抗ＣＰＡＡ抗体またはポリペプチドは、細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を不動化できるニトロセルロースまたは別の固体支持体に固定することができる。次いで支持体を適切な緩衝液で洗浄後、検出可能的に標識したＣＰＡＡ特異的ペプチドまたは抗体で処理できる。それから固相支持体を、緩衝液で２回目の洗浄をおこなって結合していないペプチドまたは抗体を除去できる。既知の方法のステップにより、固体支持体上の結合した標識の量を検出できる。

「固相支持体」または「担体」は、ペプチド、抗原、または抗体を結合できる任意の支持体を意味する。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフッ化ビニル（ＰＶＤＦ）、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびに磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、本発明の目的のためには、ある程度まで可溶または不溶のいずれでもあり得る。支持体材料は、結合した分子がＣＰＡＡまたは抗ＣＰＡＡ抗体に結合できる限り、実質的にはどのような構造的外形を有していてもよい。したがって、支持体の形状は、ビーズなどの球形、または試験管の内表面もしくは棒の外表面などの円筒形であり得る。また、その表面は、シート、培養皿、試験ストリップなどのように平坦であり得る。例えば、支持体は、ポリスチレンビーズを含み得る。当業者は、抗体、ペプチドまたは抗原を結合するのに適したその他多くの担体を知っており、または常套的な実験によりそれらを突きとめることができるであろう。

周知の方法のステップにより、所与の群の抗ＣＰＡＡペプチドおよび／または抗体の結合活性を決定することができる。当業者は、常套的な実験によって有効かつ最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。

エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）用に、検出可能な標識化ＣＰＡＡ特異的ペプチドおよび／または抗体を、酵素に結合して達成できる。結合した酵素は、露出した基質と反応して、例えば、分光光度法、蛍光光度法、または視覚化手段によって検出することができる化学部分を生成する。本発明のＣＰＡＡ−特異的抗体を検出可能に標識化するために用いられ得る酵素としては、限定するものではないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオース燐酸イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。

ＣＰＡＡ特異的抗体を放射性標識化することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いてＣＰＡＡを検出することができる。Ｗｏｒｋら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ＆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９７８年）を参照。放射性同位元素は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーを用いるような手段で検出することができる。本発明の目的に特に有用な同位元素は、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、および^１２５Ｉである。

蛍光化合物でＣＰＡＡ−特異的抗体を標識化することも可能である。蛍光標識抗体が適当な波長の光に曝すと、その存在が蛍光により検出できる。最も通常に使用される蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンが挙げられる。

ＣＰＡＡ−特異的抗体は、^１２５Ｅｕ、またはランタニド系列のその他の金属などの蛍光放出金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート化団を用いてＣＰＡＡ−特異的抗体に結合させることができる。

また、ＣＰＡＡ−特異的抗体を化学発光化合物に結合することにより検出可能に標識することもできる。この場合、化学発光的に標識化した抗体の存在は、化学反応過程に生じるルミネッセンスの存在を検出することによって測定される。有用な化学発光の標識化化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。

同様に、生物発光化合物を用いて本発明のＣＰＡＡ−特異的抗体、部分、フラグメント、ポリペプチド、または誘導体を標識することも可能である。生物発光は、生体系に認められる化学発光の一種であり、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって測定される。標識化の目的に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。

ＣＰＡＡ−特異的抗体、部分、フラグメント、ポリペプチド、または誘導体の検出は、例えば検出可能な標識がガンマ放射体である場合はシンチレーションカウンターで、または例えば標識が蛍光物質である場合は蛍光光度計で達成することができる。酵素標識の場合には、検出は酵素に対する基質を用いる比色方法により達成することができる。また、検出は基質の酵素反応の程度を、同様に調製した標準物質と視覚的に比較することによっても達成することができる。

本発明の目的のために、上記のアッセイにより検出されるＣＰＡＡは、生体試料中に存在することができる。ＣＰＡＡを含む任意の試料を使用することができる。例えば、試料は、血液、血清、リンパ、尿、大便、炎症性滲出液、脳脊髄液、羊水、組織抽出物またはホモジネートその他などの体液である。しかし、本発明は、ただこれらの試料のみを用いるアッセイに限定されることなく、他の試料を使用できる適当な条件を決定することは、当業者には可能である。

Ｉｎ ｓｉｔｕでの検出は、患者から組織標本を取り出し、本発明の標識した抗体の組合せをこのような標本に提供することにより達成できる。抗体（またはフラグメント）を生体試料に適用するか、または標識した抗体（またはフラグメント）を上にのせることによって提供してもよい。このような方法を用いることにより、調べた組織でＣＰＡＡの存在のみならずＣＰＡＡの分布も決定することができる。当業者は、本発明を用いて、そのようなｉｎ ｓｉｔｕでの検出を行うために広範な組織学的方法（染色手順など）のいずれかを変更することができるということに容易に気づくであろう。

本発明の抗体、フラグメントまたは誘導体は、「２−部位」または「サンドイッチ」アッセイとしても知られているイムノメトリック（免疫計量）アッセイおける利用に適し得る。典型的なイムノメトリックアッセイでは、或る量の非標識抗体（または抗体フラグメント）を、テストする液体中で不溶性の固体支持体に結合し、ある量の検出可能に標識した可溶性抗体を、固相−抗体、抗原、および標識した抗体の間に形成された三重複合体の検出および／または定量化ができるように添加する。

典型的なイムノメトリックアッセイでは、「フォワード」アッセイを含み、このアッセイでは、２成分からなる固相と抗体−ＣＰＡＡ複合体形成により試料からＣＰＡＡを抽出するために、先ず固相に結合した抗体を、テストする試料と接触する。適当なインキュベーション期間の後、固体支持体を、あるとすれば未反応のＣＰＡＡを含む液体試料の残渣を除去するために洗浄後、既知量の標識した抗体（「リポーター分子」として機能する）を含む溶液と接触する。非標識抗体を介して固体支持体に結合した標識した抗体がＣＰＡＡと複合体形成を可能にする第２回目のインキュベーション期間の後、固体支持体の第２回目の洗浄を行って、未反応の標識した抗体を除去する。このタイプのフォワードサンドイッチアッセイは、ＣＰＡＡが存在するかどうか決定する簡単な「イエス／ノー」アッセイであり得るか、または標識した抗体の量と、既知量のＣＰＡＡを含む標準試料について得られた量とを比較することにより定量的にもすることもできる。このような「２−部位」または「サンドイッチ」アッセイは、Ｗｉｄｅ， Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９〜２０６頁（Ｋｉｒｋｈａｍ、編、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、１９７０年）により記載されている。

またＣＰＡＡで有用であり得る他のタイプの「サンドイッチ」アッセイは、いわゆる「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」アッセイおよび「リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）」アッセイである。同時アッセイは、１回のインキュベーションステップを含み、固体支持体に結合した抗体および標識した抗体の両方を、テストする試料に同時に添加する。インキュベーション終了後、固体支持体を洗浄して、液体試料および複合体未形成の標識した抗体の残渣を除去する。次いで固体支持体に結合した標識した抗体の存在を、通常の「フォワード」サンドイッチアッセイと同様に測定する。

「リバース」アッセイでは、先ず標識した抗体溶液を液体試料へ段階的に添加後、適当な期間インキュベーション後に固体支持体に結合した非標識抗体の添加が用いられる。２回目のインキュベーション後、固相を通常の様式で洗浄して、テストする試料および未反応の標識した抗体溶液の残渣を固相から遊離する。次いで、固体支持体と結合した標識した抗体の測定が、「同時」および「フォワード」アッセイと同様に行われる。１つの実施形態では、異なるエピトープに特異的な本発明の抗体の組合せを、高感度三部位イムノラジオメトリックアッセイの作製に使用できる。

さらに、例示的な抗体は、Ｔ細胞タイピングに、特異的なＣＰＡＡ−含有細胞またはフラグメントの分離に、ワクチンの調製などに利用できる。抗体は、定量的にあるいは定性的に試料中のＣＰＡＡの検出にまたはＣＰＡＡを発現する細胞の存在の検出に用いることができる。これは蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光測定と結合させた蛍光標識した抗体（下記参照）を用いる免疫蛍光法により達成することができる。診断目的には、抗体は標識または非標識のいずれであってもよい。非標識の抗体を、ヒト免疫グロブリン定常領域に特異的な抗体などのヒト化抗体と反応する他の標識した抗体（第２抗体）と組み合わせて用いることができる。あるいは抗体を直接標識することができる。様々な標識、例えば放射性核種、蛍石、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、リガンド（特にハプテン）等を用いることができる。上述のイムノアッセイの多数のタイプが利用可能であり、当業者には周知である。

本発明の有用な抗体を、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡の場合と同様に、本発明のＣＰＡＡのｉｎ ｓｉｔｕでの検出のために組織学的に使用できる。ｉｎ ｓｉｔｕでの検出は、患者から組織標本を摘出し、このような標本に、本発明の標識した抗体を提供することにより達成できる。抗体（またはフラグメント）を生体試料に適用するか、または標識した抗体（またはフラグメント）を上にのせることによって提供してもよい。このような方法を用いることにより、調べた組織で、ＣＰＡＡの存在のみならずＣＰＡＡの分布も決定することができる。当業者は、本発明を用いて、そのようなｉｎ ｓｉｔｕでの検出を行うために広範な組織学的方法（染色手順など）のいずれかを変更することができるということに容易に気づくであろう。

重要なことは、本発明の抗体は、結腸直腸癌および膵臓癌の特定のタイプの侵襲性を診断する際に有用であり得ることである。より詳細には、本発明の抗体により、非常に速く進行する悪性の癌とは対照的に、数年にわたって増殖する進行の遅い癌の患者に存在するＣＰＡＡを同定することができる。したがって、本発明の抗体は、重要な免疫組織化学の手段を提供することができる。

本発明の抗体は、翻訳後修飾を含む遺伝子発現プロフィールを測定するために非常に適している抗体アレイで使用でき、またペプチドホルモンおよび炭水化物などのより小さな分子の検出にも有用である。最近、抗体アレイの適合性および有効性を判定するいくつかのアプローチが使用されている。場合によっては、ファージディスプレイ法による抗体をアレイの調製に使用でき、検出および分析は、ＳＥＬＤＩ（表面増強レーザー脱離／イオン化）によるか、またはハイスループット形式で、フィルター濾過に基づく酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により実施される。検出システムの他の例には、蛍光タグおよびナノ電極が含まれ、より小型アレイの場合、表面プラスモン共鳴およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間）マススペクトル分析が含まれる。プロテオーム分析は、最初に抗原の結合したアレイの作製、これに続く検出プローブに結合したプロテインＬまたはプロテインＡなどのアフィニティーリガンドを用いる抗体の捕捉および検出により実施することもできる。

第３のアプローチは、フィルター上に抗体遺伝子を含む細菌の高密度グリッドを含み、次にアフィニティーリガンドまたはＥＬＩＳＡなどの検出プローブを取り付けた抗原を含む別のフィルターとの相互作用を含む。この方法は液体の取扱いを不要にし、多数の抗原に対する何万もの抗体の平行スクリーニングを行い、最終的に発現の異なるタンパク質を同定することができる。最後の方法は、コンビナトリアルケミストリーを用いて、チップ上で直接的に抗体を合成する可能性を含む。しかし現在の技術では、事前に合成されたポリペプチド構築物を使って抗体のフレームワークを作製した後、個々のアミノ酸を添加しない限り、最小でも１２０のアミノ酸から構成される抗原結合抗体ドメインの合成でさえ多少無理がある。

抗ＣＰＡＡ活性を測定するスクリーニング法も本発明で提供される。詳細には、実施例６でさらに説明するように、本発明の抗体は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性に関連している。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕまたはｉｎ ｖｉｖｏでＣＰＡＡ含有細胞の細胞死を誘発する抗体またはそれらのフラグメントあるいは部分、ペプチド、ペプチド模倣体化合物または有機模倣体化合物からなる群から選択され得る抗ＣＰＡＡ化合物が本発明に包含される。抗ＣＰＡＡ化合物のＡＤＣＣ活性の測定に用いることができるスクリーニング法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを含むことができる。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ＣＰＡＡ中和化合物が同時に存在することにより、細胞死の程度または割合を減少させる、分離したまたは組換えた形状でのチンパンジーまたはヒトＣＰＡＡなどのＣＰＡＡとの接触による細胞死の減少を測定するラジオイムノアッセイなどの、ＣＰＡＡ細胞毒性アッセイを含むことができる。

診断キット
キットは、細胞活性に対する予防あるいは検出または選択した抗原の存在に関する対象抗体の使用に提供することもできる。したがって、本発明の抗体は通常、単独または所望の細胞型に特異的な別の抗体との組合せのいずれかで、容器入りの凍結乾燥形態で提供できる。標識または毒素に結合していてもよく、結合していなくてもよい抗体を、トリス、リン酸、炭酸などの緩衝液、安定剤、生物致死剤、血清アルブミンなどの不活性タンパク質等と共にキットに含む。一般にこれらの物質は、活性抗体量に対して５重量％未満存在し、そして通常抗体濃度に対して少なくとも約０．００１重量％の合計量で存在する。しばしば活性成分を希釈するために不活性増量剤または賦形剤を含むことが望ましく、この場合賦形剤は組成物全体の約１％〜９９重量％で存在することができる。第１抗体に結合できる第２抗体をアッセイで用いる場合、通常これは別々のバイアル中に存在する。一般的に第２抗体は標識と結合し、上記抗体の製剤形態と類似の様式で製剤化する。このキットは、一般に１組の使用説明書も含む。

医薬適用
本発明の抗ＣＰＡＡ抗体またはペプチドは、例えば癌および関連症状の治療に用いることができる。より詳細には、本発明はさらに、薬学的に許容し得る担体または希釈剤および、活性成分として、本発明の抗体またはペプチドを含む医薬組成物を提供する。免疫毒素の送達成分は、本発明によるヒト化抗体である。完全な免疫グロブリンまたはＦａｂなどのこれらの結合フラグメントもまた想定される。典型的には、免疫毒素の抗体は、ヒト免疫グロブリンＡ、ＩｇＭまたはＩｇＧアイソタイプであるが、所望により他の哺乳動物の定常領域を利用できる。本発明による組成物は、免疫毒素を含むこともできる。本発明のヒト化抗体、免疫毒素およびそれらの医薬組成物は、非経口的に、すなわち皮下、筋肉内または静脈内に投与するのに有用である。

本発明の抗ＣＰＡＡ抗体および／またはペプチドは、個別の治療薬としてまたは他の治療薬と組み合わせて投与することができる。それらは単独でも投与できるが、一般に、選択した投与経路および標準的な薬務に基づいて選択された製薬担体と共に投与する。

非経口投与用に、抗ＣＰＡＡ抗体またはペプチドを、薬学的に許容し得る非経口ビヒクルと共に、溶液、懸濁液、乳化液または凍結乾燥した粉末として製剤化できる。例えば、ビヒクルは、水溶性担体などの受容可能な担体に溶解した抗体溶液またはそれらのカクテルであってもよく、このようなビヒクルは水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、または５％ヒト血清アルブミン、０．４％食塩水、０．３％グリシンその他である。リポソームおよび不揮発性油などの非水系ビヒクルを用いることもできる。これらの溶液は、無菌で一般に粒子状物質を含まない。これらの組成物は、通常の周知の滅菌技術により滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤その他などの、生理学的条件に近似するために必要とするような薬学的に許容し得る補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含むことができる。これらの製剤形態での抗体濃度は広範に、例えば約０．５重量％未満から、通常約１重量％または少なくとも約１重量％〜１５または２０重量％まで変更することができ、選択した投与の特定の態様に従って、液量、粘度などに基づき主として選択されるであろう。ビヒクルまたは凍結乾燥した粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（例えば、緩衝液および防腐剤）を維持する添加物を含むことができる。製剤は、通常用いられる技術により滅菌される。

したがって、筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は、１ｍｌの無菌緩衝水および５０ｍｇの抗体を含むように製造することができる。静脈内注入液用の典型的な組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル液および１５０ｍｇの抗体を含むように製造することができる。非経口投与できる化合物を調製するための実際の方法は、当業者に知られているか、または明らかであり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、１９８０年）により詳細に記載されている。

本発明の抗体は、貯蔵のために凍結乾燥でき、使用前に適切な担体で再構成できる。この技術は、通常の免疫グロブリンで有効であることが示されている。任意の適切な凍結乾燥および再構成技術を用いることができる。凍結乾燥および再構成は、様々な程度の抗体活性の喪失をもたらす（例えば、通常の免疫グロブリンであるＩｇＭ抗体では、ＩｇＧ抗体よりも活性喪失が大きい傾向がある）可能性があり、その使用レベルを補償するために調整しなければならないことを、当業者は理解するであろう。

本ヒト様抗体またはそれらのカクテルを含む組成物を、既存の疾患に対する再発予防および／または治療処置のために投与することができる。適切な製薬担体は、当技術分野の標準的な参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。例えば、注射による投与に適した非経口組成物は、活性成分１．５重量％を０．９％塩化ナトリウム溶液中に溶解して調製する。本発明の抗ＣＰＡＡペプチドおよび／または抗体を、細胞表面と結合したＣＰＡＡを有する細胞に対する抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、および／またはアポトーシス、および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介するそれらの能力により、治療効果を得るために改造することができる。これらの活性のために、エフェクター細胞（ＡＤＣＣに関する）または補体成分（ＣＤＣに関する）の内部供給源または外来供給源のいずれもが利用できる。

医療適用においては、組成物を疾患を既に有している患者に、疾患およびその合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に阻止するかまたは軽減するのに十分な量で投与する。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効量」として定義される。この使用のために有効な量は、悪性疾患の重篤度および患者自身の免疫系の一般的な状態に依存するが、一般には、１投与量当たり抗体約１ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲であり、そして患者当たり５ｍｇ〜２５ｍｇの投与量がより通常には使用される。本発明の物質は、多くの場合、致命的なあるいは命が危なくなる可能性がある重篤な病状において、一般に使用してもよいことを心に留めておくべきである。そのような場合、本発明のこのヒト様抗体により達成される外来物質の最小化および「生体異物」拒絶反応の低い確率の観点において、実質的に過剰量のこれらの抗体を投与することは可能であり、治療者により所望されると思われる。

もちろん、投与量は既知の因子、例えば特定の薬剤の薬理学的消長、投与の態様および経路；受容者の年齢、健康状態、および体重；症状の性状および程度、同時に行われる処置の種類、治療頻度ならびに所望される効果にしたがって変動する。通常１日、１週間、隔週の活性成分の投与量は、４時間〜６時間の期間にわたって送達された体重の約１００ｍｇ／ｍ^２〜２５０ｍｇ／ｍ^２であり得る。

非限定的な例として、ヒトまたは動物ＣＰＡＡ関連症状の治療は、１日、１週間、隔週当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投与量範囲で、本発明の抗ＣＰＡＡペプチド、キメラモノクローナルおよび／またはマウスの抗体の１日、１週間、隔週の供与量として提供することができる。

ヒトの治療的使用のための例示的な抗体は、本発明による強いｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＣＰＡＡ活性を有するマウスの高親和性（これらは、高結合活性でもあり得る）およびキメラ抗体、ならびにフラグメント、領域および誘導体である。

体内投与に適する剤形（組成物）は、一般に１単位当たり約０．１ミリグラム〜約５００ミリグラムの活性成分を含む。これらの医薬組成物には、活性成分は通常、組成物の全重量を基準として約０．５〜９５重量％存在する。

組成物の１回または複数回の投与が実施でき、投与量レベルおよびパターンは治療者により選択でき得る。いずれにしても、本医薬製剤は、患者を効果的に治療するのに十分な本発明の抗体（複数可）の量を提供しなければならない。

本抗体は、化学療法剤または免疫抑制因子と共に与えられる別個に投与される組成物として用いることもできる。典型的には、薬剤はシクロスポリンＡまたはプリン類似体（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリンなど）を含むが、当業者に周知の多数の別の薬剤（例えば、シクロホスファミド、プレドニゾンなど）も用いることができる。

本発明の抗体は、免疫毒素の一部を形成していてもよい。免疫毒素は、２つの成分により特徴づけられ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで選択した細胞を殺すために有用である。１つの成分は、付着または吸収したとき通常細胞に致命的である細胞毒性薬剤である。「送達ビヒクル」として知られている第２の成分は、癌を含む細胞などの特定の細胞型に毒物を送達する手段を提供する。一般に２つの成分は、様々な周知の化学的方法のいずれかによって、互いに化学的に結合している。例えば、細胞毒性薬剤がタンパク質で、第２の成分が完全な免疫グロブリンである場合、結合は、ヘテロ二機能性架橋剤、例えば、ＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどを介してもよい。種々の免疫毒素の産生は、当該分野で周知であり、例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｉｍｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｇｉｃ Ｂｕｌｌｅｔ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６８〜１９０頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８２年）に見出される。

種々の細胞毒性薬剤が、免疫毒素での使用に適している。細胞毒性薬剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質合成を含む重要な細胞プロセスを妨げる。細胞毒性薬剤は、放射性核種、例えば、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１８８Ｒｅ、および^９０Ｙ；多くの化学療法剤、例えばビンデシン、メトトレキセート、アドリアマイシン、およびシスプラチン；ならびに細胞毒性タンパク質、例えばヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質などのリボソーム阻害タンパク質、シュードモナスエキソトキシンＡ、リシン、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖など、または細胞表面で活性な薬剤、例えばホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）を含むことができる。一般的には、ＯｌｓｎｅｓとＰｈｉｌ「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｔｏｘｉｎｓ」、２５巻、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，３３５〜８１頁（１９８２年）；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ」、１５９〜７９頁、２２４〜６６頁（Ｂａｌｄｗｉｎ ＆ Ｂｙｅｒｓ 編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８５年）を参照。

抗体またはペプチドおよび誘導体は、免疫複合体として治療的に使用できる。Ｄｉｌｌｍａｎ，１１１ Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．５９２〜６０３頁（１９８９年）を参照。このような抗体またはポリペプチドは、リシン−Ａ、シュードモナス毒素およびジフテリア毒素を含むがこれに限定されるものではない細胞毒性タンパク質に結合することができる。抗体に結合した毒素または他のリガンドまたはペプチドは、当分野では周知である。例えば、Ｏｌｓｎｅｓら、１０巻 Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ２９１〜９５頁（１９８９年）を参照。植物および細菌毒素は、一般的にタンパク質合成機構を乱すことにより細胞を殺す。抗ＣＰＡＡペプチドおよび／または抗体に結合でき、その後ｉｎ ｖｉｖｏでの治療に用いることができる細胞毒性薬剤には、限定されるものではないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびマイトマイシンＣが含まれる。当分野で周知である薬剤のこれらの種類およびその作用機序の説明については、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、１９９０年）を参照。

さらに、本発明の抗体は、化学療法剤、例えばオキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、ロイコボリン、カルムスチン、ビンクリスチン、フルオロウラシル、ストレプトゾシン、およびゲムシタビンと組み合わせて送達することができる。他の抗体およびこのような化合物の組合せが、進行性の結腸直腸癌患者で用いられた。例えば米国特許出願公開第２００２／０１８７１４４号を参照。

本発明の抗ＣＰＡＡ抗体および／またはペプチドは、他のモノクローナル、もしくはマウスならびにキメラ抗体、フラグメントおよび領域、または抗体と相互作用してエフェクター細胞の数または活性を増加させるために役立つリンホカインもしくは造血性増殖因子などと組み合わせて、都合よく利用することができる。例えば、本発明の抗体は、疾患の原因となる細胞上の他のマーカーと反応するヒトモノクローナル抗体と同時投与できる。例えば、ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ（Ｂｅｒｎａｒｄら、編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、１９８４年）で名づけられたように、適切なＴ細胞マーカーは、いわゆる「分化抗原群」にグループ分けしたマーカーを含むことができる。

癌ワクチン
本発明の他の態様では、癌ワクチンを提供する。「ワクチン」とは、生物の免疫系を刺激するために用いる作用剤を意味する。この点に関して、免疫応答は、予防を提供できるか、または疾患を有する生物において、例えば既存の状態を軽減することによるプラスの効果を提供することができる。詳細には、癌ワクチンは、既存の悪性疾患を治療的に処置することおよび／または既存の悪性疾患の進行または転移を妨げることを意味する。

その特異的能動免疫療法は、腫瘍関連抗原を用いて達成できることが広く知られている。実際に、ここに示したさらに別の発明を可能にしたモノクローナル抗体を得るために用いた最初の粗精製の抗原標品は、ヒトで防御免疫を提供することを示した。Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄら、１９８５年。そのとき、患者は腫瘍切除を受けた後、追加のフロイントアジュバント０．２ｍｌと混合した０．２ｍｌの分散液中、２００μｇ、３００μｇまたは５００μｇの量で、腫瘍膜由来の抗原物質でワクチン接種を受けた。３カ月間、毎月投与した３００μｇの投与量は、安全であることが示された。

本明細書に記載されている組換え型抗体を用いて、これらの癌に対するワクチンに関してさらに適切なＣＰＡＡの高度に精製した抗原またはエピトープペプチドを定義することが現在では可能である。例えば、ＮＰＣ−１を用いて、ＣＰＡＡタンパク質およびその対応するアミノ酸配列が、多数の良く知られた技術のいずれかにより同定できる組織または細胞試料に結合できる。エピトープは、さらにマップされ、見事な詳細さで分子的性質が決定され得る。例えば、Ｂａｅｒｇａ−Ｏｒｉｔｚら、「Ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｂｙ Ｈ／Ｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｍｅｔｒｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｉｖｅｒｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」、１１巻Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１３００〜０８頁（２００２年）；Ｊｅｍｍｅｒｓｏｎ， ＆ Ｐａｔｅｒｓｏｎ， 「Ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、４巻 ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８〜３１頁（１９８６年）を参照。

有効な抗原ペプチドを同定する代替技術は、抗体により認識される模倣体タンパク質またはミモトープに関する発現ライブラリー（例えばファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングするための、ＮＰＣ−１抗体またはペプチドの使用を伴う。この技術は、ｉｎ ｖｉｖｏで防御免疫応答をもたらす抗原ペプチドの同定に用いられた。Ｂｅｅｎｈｏｕｗｅｒら、１６９巻 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．６９９２〜９９頁（２００２年）参照；米国特許第５，８３７，５５０号；Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎら、４８巻 Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，７３７〜４５頁（２００３年）；Ｓａｔｏら、３７１巻 Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．６０３〜０８頁（２００３年）も参照。この技術は、天然の炭水化物相対物よりも免疫原性が高いことが分かったこのタンパク質バージョンである、炭水化物および糖タンパク質抗原のタンパク質模倣体の同定に用いられたことに留意されたい。実際に生産能力、安全性、半減期、またはその他の問題を含む要因のために、既知の抗原に比べ有利である模倣体を分離し得る。

ＣＰＡＡ免疫原性タンパク質は調製でき、例えば、単独で皮下もしくは粘膜ワクチンとして、またはアジュバントもしくは担体と結合してまたはアジュバントもしくはタンパク複合体の一部のいずれかとして送達され得る。リポソーム微小粒子、ウイルス様粒子、ＤＮＡワクチン、ネズミチフス菌およびあるいはＩＳＣＯＭなどの生きた組換えベクターによる送達が考えられる。これらのシステムのすべては、当業者には周知であり、過度の実験を行わずに実施できる。例えばＭｉｃｈａｌｅｋら、「Ａｎｔｉｇｅｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉ：Ｎｏｎｌｉｖｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｌｉｐｏｓｏｍｅ， ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ（ＩＳＣＯＭｓ）」、Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｓｔｅｃｋｙら、編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２００５年）を参照。

さらに、ＣＰＡＡペプチドは、遺伝的にまたは化学的にトキソイド担体、例えばコレラ、エンテロまたはリシントキソイドに結合できる。例えば、米国特許第６，８４６，４８８号を参照。細菌由来の別の好都合なタンパク質担体は、ＰｏｒＢタンパク質担体である。例えば、米国特許第６，６１３，３３６号を参照。別の有望なタンパク質に基づく粘膜アジュバントは、ネズミチフス菌由来のフラゲリンタンパク質である。本発明のある実施形態では、ＣＰＡＡタンパク質は、例えば粘膜の鼻腔内ルートを経由して、フラゲリンタンパク質（ＦｌｊＢ）と同時投与される。アヒル肝炎コア抗原を含む好都合なタンパク質プラットフォームは、米国特許出願公開第２００４／０２１９１６４号にも記載されている。

本発明のＣＰＡＡは、免疫原構成体のｉｎ ｖｉｖｏでの発現のために、ＤＮＡワクチンとして送達することもできる。例えば鼻腔内ワクチン投与でＤＮＡ発現カセットを送達するために、陽イオン性微小粒子を使用することができる。このようなシステムで、例えばＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質をコードするＤＮＡを含むワクチンの鼻腔内送達後に、免疫応答を誘発した。Ｍｉｃｈａｌｅｋら、２００５年。本発明のある実施形態では、ＣＰＡＡ免疫原性ペプチドは、その後ｉｎ ｖｉｖｏで発現するＤＮＡ発現カセットで送達される。

さらに、免疫原の標品を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏで樹状細胞由来のドナーに「チャージ」後、ドナーを患者に戻し、そこでドナーはリンパ系臓器に向かい、有効な免疫応答開始することができる。例えば、Ｂａａｒ， Ｊ． 「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、４巻（２号）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１４０〜４４頁（１９９９年）を参照。このワクチンによるアプローチは、現在、例えば黒色腫の治療のためのヒトにおける臨床試験中である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｄａｒｔｍｏｕｔｈ．ｅｄｕ／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ／ｔｒｉａｌｓ／Ｄ９９３５．ｓｈｔｍｌ．を参照。あるいは、上記のＤＮＡワクチンを、ランゲルハンス細胞に、皮膚パッチを介して送達でき、次いでこの細胞は、樹状細胞に成熟してリンパ系臓器に向う。米国特許第６，４２０，１７６号。

本発明の免疫原性組成物の送達は、非経口、皮下、もしくは筋肉内注射、静脈内注射、腸内、皮内、挿管、もしくは経鼻、経口または直腸ワクチン投与によるものであってよい。またワクチンは、鼻腔内、口蓋扁桃上、または唾液腺への送達を含み、局所的に送達されてもよい。本発明によって考慮される患者へのワクチンの投与は、いずれの公知のまたは標準的技術によるものであってよい。

ここで本発明について、非限定例を用いてさらに詳しく説明する。

（実施例１）
ヒト腫瘍標本由来の膵臓および結腸直腸癌関連抗原（ＣＰＡＡ）の調製
免疫原性腫瘍関連抗原組織標本は、Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄら、５６巻 Ｃａｎｃｅｒ ４８０頁（１９８５年）、米国特許第５，６８８，６５７号によって記載された方法に従って、プールした結腸直腸癌細胞膜から得た。この抗原物質を、膜分画がＨＬ−Ａ抗原を含まず、非免疫原性糖タンパク質分画の多くから分離される程度にまで精製した。

生理食塩水中の腫瘍細胞懸濁液は、新鮮な手術室標本から調製した。固形腫瘍を細かく切り刻んで得た単一細胞浮遊液を、４００×Ｇで１０分間遠心分離し、上清を保持した。細胞ペレットを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、再度遠心分離した。細胞膜物質を、電子顕微鏡で調べて、細胞膜物質（完全な細胞でなく）のみ存在することを確かめ、タンパク質含量をローリー法で測定した。細胞膜物質は、次に連続した低周波超音波にかけ、膜タンパク質の可溶性プールとして再懸濁した。可溶性の超音波処理物を、セファデックス−６２００のゲル濾過により分離した。２ミリリットル（ｍｌ）の分画を採取し、２２０および２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度プロフィールを記録した。個々のタンパク質のピークを含む分画をプールし、Ｄｉａｆｌｏ限外濾過によりプールを濃縮した。Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄら、１９８５年、により定義されているセファデックス−Ｇ２００分画ＩＢおよびＩＩＡを、濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりさらに精製した。結腸直腸癌の患者で陽性の遅延型皮膚過敏症反応を誘発する能力に関して、分画をテストした。免疫原性活性を有するこれらの分画は、結腸直腸癌関連抗原を含むといわれ、モノクローナル抗体の調製において、免疫原およびスクリーニング薬剤として用いた。

濃度勾配ＰＡＧＥにより、癌胎児性抗原の抗原とは異なる二重−バンドの抗原（Ｇｏｌｄら、１２２巻 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．４６７〜８１頁（１９６５年）；Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄら、１９８５年）が、同定され分離された。この抗原を含むバンドは、６．３ｃｍおよび６．６ｃｍ追跡用色素から離れて移動した。抗原の生化学的分析では、このタンパク質は糖タンパク質であることを示した。抗原の分子量が、７６．５ｋＤａの分子量を有するトランスフェリンの電気泳動移動度（６．４〜６．５ｃｍ）に基づいて推定された。

（実施例２）
免疫およびハイブリドーマの調製
ヒト結腸直腸および膵臓癌関連抗原（ＣＰＡＡ）に対するモノクローナル抗体は、マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４と上記のＣＰＡＡで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞との融合で得られたハイブリッドの産生とクローニングにより得た。ハイブリッドクローンが確立され、ＥＬＩＳＡアッセイで、ＣＰＡＡならびに２つの結腸癌細胞株（ＳＷ４８０およびＳＷ６２０）と強く反応した。

Ａ．免疫と細胞融合：
Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄら、１９８５年）に記載のように、完全フロインドアジュバントで乳化した上記のＣＰＡＡの５０μｇを腹腔内注射してＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。１０日後、マウスに生理食塩水中で同量のＣＰＡＡの静脈へのブースター注射を行った。マウスを３日後に屠殺し、単一脾細胞懸濁液を調製した。細胞融合は、４０％のポリエチレングリコール（ＭＷ＝１５００）中で、５ｅ７のマウス脾臓細胞を、１０ｅ７のｓＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞とインキュベートすることにより実施した。

Ｂ．ハイブリッドクローンのスクリーニング：
Ｔｓａｎｇら、７７巻 ＪＮＣＩ １１７５頁（１９８６年）により記載された酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、ＣＰＡＡに特異的な抗体を産生するハイブリドーマクローンの検出に用いた。ＣＰＡＡ（１００ｎｇ／ウェル）を、ポリスチレンマイクロプレート上に固定した。テストする上清に存在する抗体を、固定化抗原に１時間結合させた。結合したマウスｍＡｂｓの存在を、マウス免疫グロブリンに特異的なペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて検出した。ウェルを洗浄し、次いでペルオキシダーゼの色原体基質、Ｏ−フェニルジアミンを添加した。０．５００単位より大きいかまたは等しい吸光度を生ずる呈色反応を示すウェルを、陽性と記録した。陰性対照は、０．０１〜０．０９吸光度単位の値を与えた。ＥＬＩＳＡにより陽性判定されるハイブリドーマのウェルを、増殖のために選択し、限界希釈クローニング法により細胞クローニング手順を繰り返した。ｍＡｂ産生陽性のハイブリドーマ細胞の選択は、ＥＬＩＳＡにより判定した。陽性モノクローナル細胞を培養で増殖させ、細胞のアリコートを長期貯蔵のために液体窒素で凍結した。

（実施例３）
ＮＰＣ−１モノクローナル抗体のアイソタイプ
マウス免疫グロブリンは、重鎖（５５ｋＤ）および軽鎖（２５〜２９ｋＤ）をコードする別々の遺伝子から発現する。再構成してマウスの免疫グロブリンのレパートリーを生成できる、ＩｇＧサブクラスの４つの重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）および２つの軽鎖（カッパ、ラムダ）が存在する。

ＮＰＣ−１ｍＡｂのアイソタイプは、市販のマウスアイソタイピングキット（カタログ番号 ＲＰＮ２９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（以前は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて判定した。アッセイは、テストするハイブリドーマ上清を、スティックのマークした領域に予めブロットした抗マウスＩｇ特異的抗体を含むアイソタイピングスティックとインキュベートすることを含む。テスト物質の検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇ抗体およびペルオキシダーゼ基質（ＯＰＤ）の発現による。陽性の呈色反応は、ハイブリドーマによって発現される重鎖および軽鎖を示し、したがって、ｍＡｂのＩｇアイソタイプを示した。ＮＰＣ−１ｍＡｂは、ＩｇＧ１ 重鎖およびカッパ軽鎖であることが判明した。

（実施例４）
ＤＮＡ配列およびＮＰＣ−１抗体のユニーク性
ｍＡｂの直鎖アミノ酸配列は、本出願人の知るすべての配列と比較して、特有であるとしてＮＰＣ−１を同定した。最初にポリペプチド分子をコードするＤＮＡの直鎖状配列を決定することで、直鎖アミノ酸配列を決定した。ＮＰＣ−１ｍＡｂをコードするＤＮＡ配列を決定し、オープンリーディングフレームを、ユニバーサル哺乳類コドン使用頻度表を用いてアミノ酸配列に翻訳し、これによってＮＰＣ−１分子の直鎖配列のアイデンティティを示した。

マウスＩｇＧ１ 重鎖の逆転写、ＰＣＲ、および配列決定反応に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＢ０９７８４９）に記載の重鎖定常−１領域に由来した。マウスカッパ軽鎖の逆転写、ＰＣＲ、および配列決定反応に用いたプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＢ０９７８４８）に記載の軽鎖の定常領域に由来した。

Ａ．ＮＰＣ−１の核酸の分離
製造業者の指示に従い市販のＲＮｅａｓｙ−Ｍｉｄｉキット（カタログ番号７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＮＰＣ−１を産生しているハイブリドーマ細胞からＲＮＡを分離した。４００万のハイブリドーマ細胞を、円錐チューブ中で遠心分離し、細胞を溶解して、核およびＲＮＡを含む細胞基質の核酸を遊離した。次いで、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙスピンカラムを用いて、溶解物から精製した。次にＲＮＡを水で溶出し、分光光度計を用いて２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度により、収量および純度を分析した。ＲＮＡは−８０℃で保存した。

Ｂ．ｃＤＮＡの調製
デオキシヌクレオチド三リン酸エステルｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、ｃＤＮＡ合成緩衝液、ＲＮＡ分解酵素阻害剤、逆転写酵素、およびＮＰＣ−１アイソタイプのＨ（ＩｇＧ１）およびＬ（カッパ）鎖に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、最初にＲＮＡ（２μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。試薬は、５’／３’ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（カタログ番号０３−３５３、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で提供された。反応を、５５℃で６０分間進行した後、８５℃で５分進行した。次いでｃＤＮＡを、スピンカラム（カタログ番号１−７３２−６６８、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製し、３７℃で３０分間、ｄＡＴＰおよびターミナルトランスフェラーゼを用いてポリアデニル化した。ポリアデニル化試薬は、５’／３’ＲＡＣＥ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で提供された。最後に、目標のＤＮＡ（マウスＩｇＧ１ 重鎖およびカッパ軽鎖）を、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって、以下の反応で定めるように増幅した、すなわち、ポリＡテールのｃＤＮＡ鋳型、オリゴｄＴアンカープライマー、ｄＮＴＰ混合液、反応緩衝液、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ酵素、およびＩｇＧ 重鎖またはカッパ軽鎖のいずれにも特異的なオリゴヌクレオチドで配列決定のために増幅した。ＰＣＲ用の試薬は、市販品（カタログ番号１−７３２−６４１、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）として入手した。混合液を、９４℃２分間、次いで９４℃、１５秒間、５５℃、３０秒間、７２℃、４０秒間を１０サイクル、続いて９４℃、１５秒間、５５℃、３０秒間、７２℃、６０秒間を２５サイクルに付した。これに続いて反応液を、７２℃で７分間インキュベートした後、４℃に冷却した。次いで、増幅した重鎖および軽鎖のＤＮＡフラグメントを、１％アガロースゲルで精製した。目標のＤＮＡバンドをゲルから切り出した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（カタログ番号２８７０４、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、アガロースから精製した。

Ｃ．ＤＮＡ塩基配列決定と分析
増幅した目標のＤＮＡを、ジデオキシヌクレオチド取り込み方法を用いる配列決定反応に付した。ＩｇＧ１ 重鎖およびカッパ軽鎖の全配列を、前述したプライマーおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ，Ｐａｒｔ ４３４６７７６）の試薬を用いて決定した。自動化した配列決定分析は、ＡＢＩ−３７７およびＡＢＩ−３１０ ＤＮＡ配列決定装置を用いて実施した。ＤＮＡ配列は３つの読み枠およびストップコドンのない読み枠に翻訳され、他のマウスの重鎖および軽鎖に相同的に整列配置した配列は、本当の読み枠であると決定された。軽鎖に対するｃＤＮＡ配列を、図２（配列番号１）に示し、対応するアミノ酸配列を図３（配列番号３）に示す。重鎖のｃＤＮＡ配列を、図４（配列番号４）に示し、対応するアミノ酸配列を、図５（配列番号６）に示す。軽鎖の可変、定常、およびＣＤＲ領域を図６に示し、重鎖の可変、定常、およびＣＤＲ領域を図７に示す。

本ＤＮＡ配列を、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベース（全ＧｅｎＢａｎｋ＋ＲｅｆＳｅｑ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ配列）を検索するための、問い合わせ配列として用いた。ＢＬＡＳＴ検索では、ＮＰＣ−１の問い合わせ配列に対してヌクレオチド配列類似性を有する１５までのデータベースエントリーを返した。ＤＮＡ配列のいずれもＮＰＣ−１ ＤＮＡ配列と同一でなく、本明細書に記載のＮＰＣ−１モノクローナル抗体のユニーク性を示していた。

（実施例５）
ＮＰＣ−１の特異的細胞結合
ハイブリドーマにより産生されたＮＰＣ−１ｍＡｂは、プロテインＬ−アガロースマトリックスを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したＮＰＣ−１は、下記の表１の同定された種々の腫瘍細胞を用いて、当分野では周知の間接免疫蛍光法によって特徴づけた。すべての腫瘍細胞株はＡＴＣＣから得た。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に希釈した精製ＮＰＣ−１と共に、４℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フルオレセイン標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体と共にインキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ解析ソフトウェアを用いてフローサイトメトリーで検査した。結果を表１（ＦＡＣＳデータ）に記載する。データは、ＮＰＣ−１の結腸直腸および膵臓腫瘍細胞株に対する特異的結合を示すが、卵巣または乳癌細胞株に対しては特異的結合を示さない。

種々の培養腫瘍細胞株でのフローサイトメトリー抗体結合データ。細胞は１００，０００細胞当たり２．５μｇのＮＰＣ−１で染色した。

（実施例６）
抗腫瘍性細胞毒性を示すＮＰＣ−１のＡＤＣＣ活性
免疫原性腫瘍抗原に特異的な治療上有用なモノクローナル抗体は、１つまたは複数の以下の特性を有し得る。すなわち、（ａ）高い腫瘍組織特異性、（ｂ）正常ヒト組織に対する交差反応性の欠如、および（ｃ）腫瘍の破壊に関連する生物活性、例えば抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有し得る。ＮＰＣ−１のＡＤＣＣ活性を、標的細胞として結腸ＬＳ１７４Ｔおよび膵臓ＣＦＰＡＣ−１癌系でテストした。卵巣細胞株ＯＶＣＡＲ−３を特異性対照とした。ＡＤＣＣは、エフェクター細胞として正常ヒトＰＢＭＣを用い、通常の４時間のインジウム−１１１遊離アッセイを用いてアッセイして、結果を表２（ＡＤＣＣデータ）にパーセント同位元素放出（％細胞溶解）として示す。

種々の腫瘍細胞株での抗体依存性細胞傷害性アッセイ。アッセイはウェル当たり５μｇ ＮＰＣ−１抗体を用いて実施した。

（実施例７）
ＮＰＣ−１のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
マウス免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ１）の天然の構成は、それぞれ重鎖および軽鎖の２つのポリペプチドを有する４つのポリペプチドを含んでいる。１つの重鎖（５５キロダルトン）は、１つの軽鎖（２５〜２９キロダルトン）と結合し、この二量体は、ジスルフィド結合を介して同一の二量体に結合して機能的な四量体巨大分子を完成する。ＩｇＧ分子は、その成分の重鎖および軽鎖に解離でき、変性剤（ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム）および２つのヘテロ二量体を結合するジスルフィド架橋を還元する試薬（ＤＴＴ、ジチオスレイトール）の存在下で、ポリアクリルアミドゲルマトリックス上でサイズにより分離できる。ゲル電気泳動は、抗体などのタンパク様物質の分子量の決定に用いる一般的な分析法である。

精製したＮＰＣ−１を、還元剤（ＤＴＴ）の存在下で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析に付した。３マイクログラムの精製したＮＰＣ−１を、ＤＴＴならびにＳＤＳ、グリセリン、およびブロモフェノールブルー色素を含む４×サンプル緩衝液と混合した。混合液を２分間９５℃に加熱し、氷上で冷却後、ＳＤＳ密度勾配ポリアクリルアミドゲル（４％〜２０％の勾配）上へロードし、電流をかけてＮＰＣ−１調整品中の分子種を分離した。電気泳動法後、ゲルをクーマシーブルー色素で染色し、ゲル上のタンパク質を可視化し、水で脱染色して、多孔性プラスチックシートの間で乾燥した。データ（図示せず）により、それぞれ重鎖を示す分子量５５キロダルトンおよび軽鎖分子種を示す２８キロダルトンの２つのタンパク質バンドが明らかになった。これらのデータは、精製標品は、マウスＩｇＧ１に対する既知の分子の大きさに対応することを示す。

（実施例８）
キメラ化ＮＰＣ−１（ＮＰＣ−１Ｃｈｉ）抗体を用いる前臨床的抗腫瘍効力研究デザイン
４〜６カ月齢の胸腺欠損ヌードマウスを、この研究で用いる。ＬＳ１７４Ｔ結腸直腸腫瘍細胞およびＡｓＰＣ−１ヒト膵臓腫瘍細胞を、腫瘍モデルとして用いる。マウスの側腹皮下に２ｅ６個の腫瘍細胞を移植することにより、腫瘍を樹立する。固形腫瘍は１０〜１４日で約２００ｍｍ３に増殖し、この時点でマウスを再度ケージ分けし、１０（ｎ＝１０）の試験群に無作為に分ける。マウスの腹腔内に、ＮＰＣ−１Ｃｈｉおよびヒトエフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、合計３サイクルの注射のために３日毎に注射する。マウスの全身の健康状態を毎日観察し、腫瘍を週２回、約２８〜４０日間、デジタルカリパスで測定する。２０００ｍｍ３を超える腫瘍体積を有する対照マウスを、ローカルＩＡＣＵＣガイドラインに従ってＣＯ２吸入または頚椎脱臼により犠牲にする。腫瘍増殖をプロットし、統計分析をＡＮＯＶＡを用いて実施する。

（実施例９）
キメラ化ＮＰＣ−１Ｃｈｉ（ＮＰＣ−１Ｃｈｉ）抗体を用いる前臨床薬理学毒性試験デザイン
２つのマウス系統を、この試験に用いる。第１のものは、腫瘍を有する動物における薬物代謝−薬物動態（ＤＭＰＫ）を調べるための、および腫瘍部位で抗体の局在化を調べるための、皮下ＡｓＰＣ−１膵臓腫瘍を有する胸腺欠損ヌードマウスである。第２のモデルは、免疫能力のある動物におけるＤＭＰＫ反応を調べるための、腫瘍を持たない正常マウスである。４〜６カ月齢マウスが本試験で使われる。マウス側腹皮下に２ｅ６個の腫瘍細胞を移植することにより、ＡｓＰＣ−１膵臓腫瘍が樹立される。固形腫瘍は、１０〜１４日で約２００ｍｍ３に増殖し、この時点でマウスを再度ケージ分けし、８（ｎ＝４／群／時点）の試験群に無作為に分ける。研究の１日目に、血液および血清の治療前の分析のためにマウスから採血する。研究の１日目に、すべてのマウスに、ＮＰＣ−１Ｃｈｉまたは対照ＩｇＧを腹腔内注射する。さらに腫瘍を有するヌードマウスの腹腔内に、ヒトエフェクター細胞または生理食塩水を注射する。研究の４日目（注射後７２時間）に、群当たり４匹のマウスをＤＭＰＫ分析のために犠牲にする。研究の日１１目に、残存する群当たり４匹のマウスをＤＭＰＫ分析のために犠牲にする。ＤＭＰＫ分析は、血液試験（全血球計算／分画）、血清分析（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＢＩＬＩ、ＣＰＫ、ＣＫ、ＣＲＥＡＴ、ＣＢＡリンホカインビーズ分析）、組織的分析（肝臓、脾臓、膵臓、肺、腎臓のＨ＆Ｅ染色）、およびＮＰＣ−１の局在および定量の免疫組織化学的分析を含む。数値は、ｔ検定により群間で統計的に分析する。

（実施例１０）
ＮＰＣ−１の第１相試験
ｍＡｂ ＮＰＣ−１のキメラバージョンを用いるこの試験で、４回週投与量の周期で与える３つの投与量レベル（１週間に１０ｍｇ／Ｍ^２、２５ｍｇ／Ｍ^２および５０ｍｇ／Ｍ^２）を検討する。すべての有意な腸管毒性を記録する。すべての患者で、便中の潜血をモニターする。結腸スコープを用いてすべての出血を調べ、患者の大腸粘膜のランダムなバイオプシーにより、特異的な異常を判定し得る。

治療は６カ月間続ける。抗癌活性をすべて３つの投与量レベルでモニターする。ＣＰＡＡの血清中の濃度をモニターし、ＣＴ検査で結腸、膵臓、肺、肝臓およびリンパ節転移の部分寛解が明らかになり得る。患者安定性を１年間モニターする。

（実施例１１）
マウスＮＰＣ−１抗体（ＮＰＣ−１Ｃ）のキメラ化
癌患者を治療する治療薬としてモノクローナル抗体が用いられる場合、マウスの抗体を再設計して、ヒトにおける抗体の免疫原性を減少させることは、多くの場合有益である。すなわち、ヒトに対する１００％マウス抗体の投与により、抗体の治療的価値を著しく減少させ、毒性を誘発する可能性のあるヒト抗マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）が誘発されることが示された。ヒトでの使用を意図する免疫原性のより少ない抗体は、上記のように大部分のマウス免疫グロブリン配列を、ヒト免疫グロブリン配列で置換することにより作製され得る。このような置換により、ヒトでの使用を意図する治療薬の免疫原性および毒性が激減する。キメラ化は、マウス抗体の免疫原性を減少させる１つの方法であり、抗原認識特異性の維持に関して、最も保存的なアプローチである。キメラ化の過程では、マウス免疫グロブリン配列の約６６％が、ヒト免疫グロブリンフレームワーク配列で置換される。意図する使用および結果として得られる抗体の作用機序に応じて、既知の特異的活性を有するヒト免疫グロブリンアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）を選択することができる。さらに、マウスのＣＤＲループをヒト免疫グロブリンフレームワーク中のフレームワークに単に移植する、さほど保存的でないステップを実施することができる。このプロセスは、「ＣＤＲ移植」または「ヒト化」として知られている。このプロセスは、９０％〜９５％のヒトタンパク質が存在する抗体をもたらす。あるいは、ラムダファージディスプレイまたは変更された抗原結合特異性を生じるヒト抗体のＣＤＲループ中の特異的なアミノ酸の置換などの、さほど保存的でない方法でも、マウス抗体を「完全ヒト化」できる。

組換え発現系で産生されるマウス抗体を再構成することのもう１つの利点は、完全に組立てられた抗体を構成する重鎖および軽鎖分子をコードする遺伝子を、この段階で変更できることである。抗体産生に用いられる細胞の種類でタンパク質の発現レベルを増強するために、コドン使用に変更を加えることができる。例えば、ヒト細胞と比べハムスター細胞で特異的なアミノ酸に使われるコドンのパーセントに差があることが知られている。あるいは、産生細胞で異なる炭水化物のプロセシングを有する抗体をもたらす代替のアミノ酸を導入することができる。このような異なる炭水化物組成は、抗体産物の活性を変更することができる。さらに抗体の定常領域に代替のアミノ酸の導入、または別のヒト免疫グロブリンアイソタイプの使用により、最終的な抗体産物の生物活性を変更することができる。例えば、主として細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）から主として補体媒介の細胞毒性（ＣＤＣ）に、抗体の細胞毒性の機構を変えることができる。これはヒト用に意図された抗体の特異的な機能または発現を増強するため、抗体を作製し得る変更の部分的なリストを示す。

ＮＰＣ−１Ｃキメラ抗体は、それぞれヒト免疫グロブリンガンマ−１およびカッパ定常領域に結合した、マウスＮＰＣ−１の重鎖および軽鎖の可変領域を含むように設計した。マウスのジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子（Ｂｉｏｆａｃｔｕｒａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を含む哺乳類の発現ベクターは、選択可能なマーカー（ｐＢＦ−ｄｈｆｒ）としてＬおよび重鎖遺伝子ならびにｄｈｆｒ遺伝子を効率的に転写するために、ｈＣＭＶプロモーター／エンハンサー領域を利用する。このベクターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で、高レベルの抗体産生を提供する。ヒト定常領域に結合したＮＰＣ−１の重鎖および軽鎖に対するマウス配列をコードする遺伝子を、ＣＨＯ細胞に最適化したコドン配列を用いて化学的に合成した。この遺伝子は、ｐＢＦ−ｄｈｆｒ哺乳動物発現ベクターへの扱い易く直接的なクローニングに用いる５’および３’末端の適切な制限酵素部位を含んでいる。この遺伝子を、配列を確認後にｐＵＣシャトルプラスミドに提供した。

二段階のプロセスを、ＮＰＣ−１をコードする重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含む二重遺伝子ベクターを構築するために用いた。それぞれの鎖を、ｐＢＦ−ｄｈｆｒベクターに別々にクローニングした。ＮＰＣ−１ｃｈｉ 重鎖をｐＢＦ−ｄｈｆｒベクターのＫｐｎＩ部位に連結して、適切な読み枠中にクローン１９を作製した。ＢｇｌＩＩ末端を含むＮＰＣ−１ｃｈｉ ＬＣを、ｐＢＦ−ｄｈｆｒベクターのＢａｍＨＩ部位に連結して、適切な読み枠中にクローン１を作製した。クローン１ＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ末端およびｈＣＭＶプロモーターおよびＮＰＣ−１ｃｈｉ ＬＣを含むＮＰＣ−１ ＬＣカセットのＰＣＲでの増幅に用いた。下記のプライマーを、ＢｇｌＩＩ末端を含むＮＰＣ−１ｃｈｉ ＬＣカセットの増幅に使用した。すなわち５’ ＣＭＶカセットプライマー：

（配列番号１３）および３’ＢＧＨｐＡカセットプライマー：

（配列番号１４）であり、製造業者の指示に従いＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼを用いた。簡単に述べると、テンプレートである２００ｎｇのクローン１ＤＮＡを、９５℃で２分間変性後（ホットスタート）、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、および６８℃で２分間を３０サイクル実施した。ＰＣＲ生成物を分析し、１％のアガロースＴＡＥゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル溶出システム（Ｑｉａｇｅｎ）で溶出し、末端をＢｇｌＩＩで切断した。

ゲルで精製したフラグメントを、ＢｇｌＩＩで切断した重鎖を含むクローン１９に連結した。化学的にコンピテントにしたＤＨ５ａｌｐｈａ大腸菌細胞を、連結したＤＮＡで形質転換し、コロニーをＮｄｅＩでスクリーニングした。小さいＮｄｅＩフラグメント（０．７５ｋｂ）を有するクローンは、対向するＬＣおよびＨＣカセットを有する構築物を含んでいた。大きいＮｄｅＩフラグメント（１．９ｋｂ）は、縦列したＬＣおよびＨＣカセットを有する構築物を含んでいた。それぞれのタイプの６つのクローンを用いて、ヒト２９３Ｔの細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトした。

（実施例１２）
ＮＰＣ−１Ｃの発現と精製
キメラ化抗体ＮＰＣ−１Ｃを、ｐＢＦ−ｄｈｆｒと呼ばれる哺乳類の発現プラスミドＤＮＡにクローニングした。得られたＤＮＡを、ＮＰＣ−１Ｃ−ｐＢＦ−ｄｈｆｒと名づけた。抗体を産生する安定なＣＨＯ細胞株を開発するために１３−０（対抗する配向）および９Ｔ（縦列配向）の２つのクローンを選択した。プラスミドを、ＬＢ−アンピシリン（１リットル）中で増殖し、ＣｓＣｌ超遠心分離（２×）により精製して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＣＨＯ−ＤＧ４４細胞にトランスフェクトした。安定にＮＰＣ−１Ｃを発現するＣＨＯ細胞株を、メトトレキセート濃度を増加させる増殖法によって開発した。高レベルの機能的な抗体を発現するクローンを選択して増殖した。

ＣＨＯ細胞または２９３Ｔの細胞のいずれかをトランスフェクションした後、ＮＰＣ−１Ｃ抗体を培地から精製した。この抗体を、キメラ抗体の生物学的機能の特性決定に用いた。発現プラスミドでトランスフェクションした時点から４日のインキュベーション後に、細胞培養培地を採取した。プロテインＡに対し効率的に結合できるよう培地の塩濃度およびｐＨを調整するために、培地を１０×ＰＢＳで希釈して最終１×ＰＢＳ濃度を得る。培地をガラスカラムでプロテインＡ−セファロース樹脂にかけた。樹脂をＰＢＳでの十分に洗浄した後、結合した抗体を、０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出し、タンパク質のピークを含む分画をプールして、ＰＢＳ ｐＨ７．４に対して十分に透析した。精製したキメラ抗体を、後の特性決定および試験のために４℃で保存した。

４％〜２０％濃度勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いる標準的なゲル電気泳動により精製したＮＰＣ−１Ｃ抗体の特性を決定した。ＮＰＣ−１Ｃ−ｐＢＦ−ｄｈｆｒプラスミドの組換え発現系で発現した、重鎖（５０ｋＤ）および軽鎖（２５ｋＤ）タンパク質の量に対する無傷の完全に組立てられた四量体抗体（１５０ｋＤ、Ｈ_２Ｌ_２を示す）の量を評価するために、抗体を非還元および還元状態下の両方で泳動した。

（実施例１３）
ＮＰＣ−１Ｃの腫瘍細胞結合特性
２９３Ｔの細胞の一過性トランスフェクションにより産生されるキメラＮＰＣ−１Ｃ ｍＡｂを、プロテインＡ−セファロースマトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したＮＰＣ−１Ｃは、下記の表３に列挙した種々の腫瘍細胞を用いて、間接免疫蛍光法によって特性決定した。すべての腫瘍細胞株は、ＡＴＣＣから得た。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈した精製ＮＰＣ−１Ｃと共に、４℃で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フルオレセイン標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体と共にインキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ分析ソフトウェア用いて、フローサイトメトリーで調べた。結果を表３に記載する（ＦＡＣＳデータ）。データは、扁平上皮または前立腺腫瘍細胞株に対してではなく、一部の結腸直腸および膵臓腫瘍細胞株に対するＮＰＣ−１Ｃの選択的な結合を示す。表３のデータは、一般的にこのアッセイ形式でテストされる濃度より約１６倍低い抗体濃度で作製されたことに留意されたい。したがって、最適化した抗体濃度を用いる典型的な細胞結合試験では、抗体の実際の細胞結合能力を過小評価している可能性があるＮＰＣ−１Ｃ抗体の最適用量以下の量を用いて、陽性に染色した細胞のパーセントおよび染色の強度（平均蛍光強度、ｍｆｉ）をここでは報告する。

種々の培養腫瘍細胞株によるフローサイトメトリー抗体結合データ。１００，０００細胞当たり１６０ｎｇのＮＰＣ−１Ｃで細胞を染色した。

（実施例１４）
抗腫瘍細胞毒性を示すＮＰＣ−１ＣのＡＤＣＣ活性
免疫原性腫瘍抗原に対しての特異的な治療的に有用なｍＡｂは、１つまたは複数の次の特性を有していなければならない。すなわち、（ａ）高い腫瘍組織特異性、（ｂ）正常ヒト組織に対する交差反応がないこと、および（ｃ）腫瘍の破壊に関与する生物活性、例えば抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有していなければならない。ＮＰＣ−１ＣのＡＤＣＣ活性を、標的細胞として結腸および膵癌系で試験した。黒色腫および前立腺腫瘍細胞株を、特異性対照として含めた。ＡＤＣＣを、エフェクター細胞として活性化した正常ヒトＰＢＭＣを用いて、通常の４時間^１１１インジウム放出アッセイを用いてアッセイし、結果をパーセント特異的同位元素放出（％細胞溶解）として表４（ＡＤＣＣデータ）に示す。データは、ＮＰＣ−１Ｃ抗体により特異的に媒介された結腸直腸および膵臓腫瘍細胞株の活発なｉｎ ｖｉｔｒｏでの殺傷を示している。対照的に、細胞毒性はアッセイで試験した黒色腫または前立腺腫瘍系統の対照に対しては測定されず、特異的なＮＰＣ−１Ｃ依存性の認識および結腸直腸および膵臓腫瘍細胞の殺傷を示した。表４のデータは、一般的にこのアッセイ形式で試験される濃度よりも、約１６倍低い抗体濃度で作製されたことに留意されたい。最適用量以下のＮＰＣ−１Ｃの濃度を用いて、活発でかつ特異的な細胞毒性が観察されたが、これらのデータは、最適化された抗体濃度を用いる典型的なＡＤＣＣ実験における抗体の実際の細胞毒性の能力を過小評価している可能性がある。

種々の腫瘍細胞株を用いた抗体依存性細胞傷害性アッセイ。アッセイはウェル当たり２５０ｎｇのＮＰＣ−１Ｃで実施した。

（実施例１５）
特異的癌細胞結合を示すＮＰＣ−１Ｃによるヒト組織の免疫組織化学的染色
癌の診断およびモニターする抗体としての有用性を実証するために、ＮＰＣ−１Ｃ抗体を、多数のヒト組織を特異的に染色する能力に関して試験した。これらの組織は、凍結およびパラフィンブロックの両方で、多数のサンプルを含むマイクロアレイのコレクションおよび個々のバイオプシー組織切片の両方で試験した。免疫組織化学的染色により、有用な研究または商品として抗体の適応性を明らかにすることができる。

ヒト組織の染色にヒト抗体を用いた場合に生じることが知られているバックグラウンドの染色を抑制するために、精製したＮＰＣ−１Ｃ抗体を、市販キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて最初にビオチン標識した。ビオチン標識したＮＰＣ−１Ｃ抗体を、ＰＢＳ緩衝液で希釈して５μｇ／ｍＬで、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）の組織切片および組織アレイスライドに対して試験した。パラフィン組織は、最初にパラフィンを除去した。凍結組織は、解凍してＰＢＳで洗浄した。パラフィン組織は、Ｐｅｒｏｘｏ Ｂｌｏｃｋ（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ Ｆｒａｃｉｓｃｏ、ＣＡ）で、１．５分間インキュベートした。凍結組織は、Ｐｅｒｏｘｏ Ｂｌｏｃｋ（Ｚｙｍｅｄ）で、３０秒間インキュベートした。両方のサンプルを、ＰＢＳで３回リンスした後、アビジンと共に１０分間インキュベートした。次いで、サンプルをＣＡＳ Ｂｌｏｃｋ（Ｚｙｍｅｄ）で１０分間インキュベートし、サンプルを振って落とした（洗浄しない）。ＮＰＣ−１Ｃを組織と共に１時間インキュベート後、ＰＢＳで３回リンスした。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を１：４００に希釈して３０分間作用させた後、ＰＢＳでの３回洗浄した。ＤＡＢ基質（Ｚｙｍｅｄ）を１分間添加した後、ＰＢＳで３回洗浄した。次いでサンプルをヘマトキシリンで３分間対比染色した後、リンスして光学顕微鏡での分析のためにガラススライド上にマウントした。ＮＰＣ−１Ｃ抗体によって特異的に免疫染色される数および強度に関して、サンプルを記録した。切片で陽性に染色する細胞数および細胞当たりの褐色斑点の強度の両方を反映する０−１−２−３システムで、サンプルを記録した。

試験したサンプルは、結腸癌、正常結腸、膵癌、正常膵臓、または子宮癌もしくは前立腺癌として病理学者により独立に診断された組織であった。ＮＰＣ−１Ｃによる免疫組織化学的染色のデータを下記の表５に示す。ＮＰＣ−１Ｃ抗体は、結腸癌（試験したすべてのサンプルの４３％、ｎ＝４８）および膵癌（すべてのサンプルの３２％、ｎ＝１１）の両方に由来する組織を染色するが、ＮＰＣ−１Ｃは、正常膵臓とは交差反応しないで、試験した正常結腸組織の２５％とのみ交差反応したことをデータは示す。ＮＰＣ−１Ｃを他の癌のタイプに対する染色に関して試験した場合、正常子宮組織ではなくて、子宮癌サンプル（２４％、ｎ＝４２）で発現された抗原および正常前立腺サンプルではなく、２４％の前立腺癌サンプル（ｎ＝４０）で発現された抗原に対して、ＮＰＣ−１Ｃは多少の免疫反応性を示した。データは、子宮および前立腺癌組織に対する若干の反応性を伴い、結腸および膵癌組織に対するＮＰＣ−１Ｃの選択的な結合特異性を示す。しかし膵臓、子宮または前立腺、および正常結腸組織の小断片由来の正常組織との、ＮＰＣ−１Ｃの交差反応性は存在しなかった。表５のデータは、一般的にこのアッセイ形式で試験される、約１６倍低い抗体濃度で作製されたことに留意されたい。したがって、典型的な実験における最適化した抗体濃度を用いる実際の免疫組織化学的染色能力を過小評価している可能性がある、ＮＰＣ−１Ｃ抗体の最適用量以下の量を用いて、染色の染色パターンおよび強度を本明細書で報告する。

本発明を十分に説明してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、過度の実験を行わずに、広範な同等なパラメータ、濃度、および条件の範囲内で、同じものを実施することができることが当業者には理解されるであろう。

この発明を、その特定の実施例との関連で説明したが、さらなる変更が可能であることは理解できよう。この出願は、本発明の請求の範囲内であれば、上述の基本的な特徴に適用可能なものとして、本発明の属する技術分野における常識または慣用の技術内でなされるものとして、本開示を逸脱する部分を含む本発明の理論に一般的に従う本発明のいかなる変形、使用または適応をも包含することを理解されたい。

図１は、結腸直腸癌および膵癌の細胞膜の部分的に精製された調製物である、ホリンシェッド（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ）「ワクチン」のＨＰＬＣ溶出プロフィールを示すトレーシングである。 図２は、ＮＰＣ−１カッパ軽鎖の全ｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。 図３は、ＮＰＣ−１カッパ軽鎖の核酸配列（配列番号２）および対応するアミノ酸配列（配列番号３）を表す。 図４は、ＮＰＣ−１重鎖の全ｃＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。 図４は、ＮＰＣ−１重鎖の全ｃＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。 図５は、ＮＰＣ−１重鎖の核酸配列（配列番号５）および対応するアミノ酸配列（配列番号６）を表す。 図５は、ＮＰＣ−１重鎖の核酸配列（配列番号５）および対応するアミノ酸配列（配列番号６）を表す。 図６は、軽鎖配列におけるＮＰＣ−１のＣＤＲ １（配列番号７）、ＣＤＲ ２（配列番号８）、およびＣＤＲ ３（配列番号９）を表す。 図７は、重鎖配列におけるＮＰＣ−１のＣＤＲ １（配列番号１０）、ＣＤＲ ２（配列番号１１）、およびＣＤＲ ３（配列番号１２）を同定する。

Claims (15)

1. 抗体の軽鎖が、
   （ａ）配列番号１の核酸配列によってコードされるか、
   （ｂ）配列番号２の核酸配列によってコードされるか、
   （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むか、あるいは
   （ｄ）配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされ、
   ならびに、抗体の重鎖が、
   （ｅ）配列番号４の核酸配列によってコードされるか、
   （ｆ）配列番号５の核酸配列によってコードされるか、
   （ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を含むか、あるいは
   （ｈ）配列番号６のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされ、
   ここで、軽鎖構成成分は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および／または配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、
   重鎖構成成分は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および／または配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. キメラ抗体である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
3. それぞれヒト免疫グロブリンガンマ-1およびカッパ定常領域に結合した、請求項１または２に記載の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含む、キメラ抗体またはその抗原結合フラグメント。
4. 前記フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、またはＦｖである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
5. 細胞毒性剤に結合体化される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
6. 標識に結合体化される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
7. 標識が、蛍光物質、蛍光放出金属、生物発光物質、化学発光物質、または放射能標識である、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
8. ２つの軽鎖成分および２つの重鎖成分を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖または重鎖をコードする単離されたヌクレオチドであって、
   該抗体の軽鎖をコードするヌクレオチドが、配列番号１の核酸配列、配列番号２の核酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、
   該抗体の重鎖をコードするヌクレオチドが、配列番号４の核酸配列、配列番号５の核酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、ヌクレオチド。
9. 請求項８に記載のヌクレオチドを含む、単離された発現ベクター。
10. 請求項９に記載の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
11. 結腸直腸癌または膵癌関連症状の治療のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を含む医薬組成物。
12. 結腸直腸癌または膵癌を検出する方法であって、
    （ａ）人体から採取された試験サンプルと、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントとを接触させる工程、および
    （ｂ）該抗体またはその抗原結合フラグメントによって特異的に結合されるヒト結腸直腸癌または膵癌関連タンパク質抗原の発現をアッセイする工程を包含し、
    該ヒト結腸直腸癌または膵癌関連タンパク質抗原の存在が、該結腸直腸癌または膵癌を示す、方法。
13. 前記サンプルが、組織バイオプシー、血液、血清、大便サンプル、または浣腸または経口下剤溶液に続いて結腸直腸経路から集めた液体である、請求項１２記載の方法。
14. 請求項１〜７のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、結腸直腸癌または膵癌関連症状の診断のためのキット。
15. 結腸直腸癌細胞および膵臓癌細胞に特異的にADCC活性を示す、請求項１記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

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