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JP5015949B2 - Ｎｏｇｏを標的とする免疫グロブリン - Google Patents

Ｎｏｇｏを標的とする免疫グロブリン Download PDF

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Description

本発明は、免疫グロブリンに関し、詳細にはＮＯＧＯに結合し、その活性を中和する抗体、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、前記抗体を含む医薬製剤、および神経系疾患の治療および／または予防におけるそのような抗体の使用に関する。本発明の他の態様、目的、および利点は、以下の記述から明確になるであろう。
西側諸国では、脳卒中は、死亡および身体障害の主な原因である。脳卒中を治療するための認められた治療法は、組織プラスミノゲン（ｔ−ＰＡ）以外にはないが、この方法は、出血を除去するために、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）スキャン後、発症３時間以内に投与しなければならない。今までは、急性脳卒中の治療（すなわち神経保護）を標的とするほとんどの治療剤は、急性細胞死に関与することが知られている、グルタミン酸受容体とその下流シグナル伝達経路の標的化を含むものが主流であった。しかし、現在まで、これらのストラテジーは、臨床試験においては良好ではないことが証明され、かつ用量制限的副作用を伴うことが多い（非特許文献１）。従って、血流の停止後、細胞死の改善を標的とした新規な手法が必要とされている。神経保護は、発作または疾患過程に応答した神経細胞の損失を防止しまたは改善するための治療能力である。これは、（オリゴデンドロサイトを含む）グリア細胞の喪失を防止することによって、直接的または間接的にニューロンを標的とすることにより実現しうる。
脳卒中の発症後、多くの患者で、ある程度の自発的な機能回復が観察されるが、これは、損傷後、脳が（限られているとはいえ）修復および／または再構築する能力を有することを示唆している。従って、この回復を高める潜在的能力を有する薬剤によって、脳虚血の発症後かなり遅くなっても（可能性としては数日でも）、治療介入が行えるようになる。急性神経保護をもたらし、かつ機能回復を高めることができる薬剤は、現在の潜在的神経保護ストラテジーよりも顕著な効果をもたらし得る。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、２つの病理診断的特徴の存在を特徴とする。これらは、それぞれ、アミロイド斑、および凝集したβ−アミロイドペプチド（Ａβ４０とＡβ４２）と過剰にリン酸化したタウから成る神経原線維変化である（非特許文献２）。
包括的研究によって、患者で、β−アミロイドの蓄積と認知能の低下の間に強力な関連があることが示されている（非特許文献３）。これは、ＡＰＰおよびプレセニリン遺伝子のいくつかの変異が早発性ＡＤの素因になる可能性があり、それらの変異も、その比率を含めて、Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドのレベルを高めることを示唆する、遺伝子研究および疫学研究とも一致する。
β−アミロイドペプチドの形成には、β−およびγ−セクレターゼと名付けられた２つの別個のプロテアーゼによる、Ｉ型膜貫通型アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断が必要である。β−セクレターゼの分子同一性は、アスパルチル−プロテアーゼ Ａｓｐ２／ＢＡＣＥ１として確認されている（非特許文献４；非特許文献５）。γ−セクレターゼの性質は、ある種の議論の余地を残し、少なくとも次のタンパク質：プレセニリン、Ａｐｈ１、Ｐｅｎ２およびニカストリンからなる、高分子量複合体からなる可能性が高い（非特許文献６に概説される）。
ＣＮＳ内のＡＰＰのプロセッシングは、ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびミクログリアを含む、いくつかの細胞型中で生じている可能性が高い。しかし、これらの細胞でのＡＰＰのプロセッシングの全体的割合は、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１／Ａｓｐ２、プレセニリン−１および−２、Ａｐｈ１、Ｐｅｎ２、およびニカストリンの相対的発現レベルに影響される。
さらに、ＡＰＰの細胞内位置を調節する追加の要因は、そのプロセッシングにも影響を与える可能性があり、それは、そのエンドサイトーシスをブロックする、ＡＰＰ細胞質ドメイン中のＹＥＮＰモチーフの変異が、β−アミロイドの生成を低減するという知見によって示されている（非特許文献７）。形質移入した細胞でアミロイドの生成を減少させるには、ＫＫＱＮ保持モチーフを添加することによって、ＥＲ中にＡＰＰ−β−ＣＴＦを保持することで十分である（非特許文献８）。これに反して、形質移入した細胞からアミロイドの分泌を上昇させるには、Ｒａｂ５を過剰発現させてエンドサイトーシスを上昇させることで十分である（非特許文献９）。
これらの知見に一致して、それ以上の研究によって、細胞コレステロールレベル（ＡＤの周知の危険因子）を減少させると、β−アミロイドの形成が減少することが示された。ドミナントネガティブ型ダイナミン変異体（Ｋ４４Ａ）の使用、およびＲａｂ５ ＧＴＰ加水分解活性化タンパク質ＲＮ−Ｔｒｅの過剰発現によって実証されたように、この変化は、改変されたエンドサイトーシスに依存した（非特許文献１０）。
コレステロールに富んだミクロドメインまたはラフトも、β−アミロイド生成の重要な細胞部位であり、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、およびγ−セクレターゼ複合体成分は全て、ラフト内に一時的に存在するように見えた。コレステロールに富んだラフトを目的としたＡＰＰとＢＡＣＥ１の抗体架橋によって、β−アミロイドの生成を上昇させることができた（非特許文献１０）。排他的に脂質ラフトを標的とした、ＧＰＩアンカーを付けたＢＡＣＥ１の発現によっても、ＡＰＰの切断およびβ−アミロイドの生成を同様に上昇させることができる（非特許文献１１）。
脳卒中、または他の神経損傷（neurodamaging）事象もしくは疾患後の機能回復の根底にある機序は、現在分かっていない。潜在的な一機序として、損傷を受けた軸索または損傷を受けてない軸索発芽が指摘されている。しかし、インビボ研究によって、神経栄養因子によって脊髄損傷または脳卒中を治療すると、機能回復および軸索発芽度が上昇することが示されているが、これらは、軸索発芽度と機能回復程度との間の直接的関連を証明するものではない（非特許文献１２，非特許文献１３，非特許文献１４）。さらに、軸索発芽には、生存可能ニューロンが必要である。従って、広範な細胞死が伴う脳卒中などの疾患では、脳卒中後に与えられる薬剤によってもたらされる機能回復の強化は、軸索発芽以外の機序、例えば、内在性幹細胞の分化、冗長経路の活性化、受容体分布の変化、またはニューロンもしくはグリアの興奮性によるものでありうる（非特許文献１５，非特許文献１６）。
損傷後、中枢神経系（ＣＮＳ）の修復能力が限られていることは、部分的に、軸索発芽（神経突起伸長）に対して阻害効果を有するＣＮＳ環境内の分子によるものと考えられる。ＣＮＳミエリンは、阻害性分子を含むと考えられる（非特許文献１７）。ミエリン関連糖タンパク（ＭＡＧ）およびＮＯＧＯという２つのミエリンタンパク質が、神経突起伸長の仮想阻害薬として、クローン化し同定されている（非特許文献１８; 非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；特許文献１；特許文献２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；特許文献３；特許文献４；特許文献５）。
ヒトＮＯＧＯの３種：１１９２アミノ酸残基を有するＮＯＧＯ−Ａ（GenBank受託番号ＡＪ２５１３８３）、仮想細胞外ドメインの残基１８６〜１００４を欠くスプライスバリアントであるＮＯＧＯ−Ｂ（GenBank受託番号ＡＪ２５１３８４）、および残基１８６〜１００４も欠くが、短い代替のアミノ末端ドメインも有する短いスプライスバリアントであるＮＯＧＯ−Ｃ（GenBank受託番号ＡＪ２５１３８５）［Prinjhaら（２０００）上掲］の形態が同定されている。
ＮＯＧＯなどのＣＮＳ阻害タンパク質を阻害することによって、ニューロンの損傷を改善し、ニューロンの修復および成長を促進し、それによって脳卒中で持続している損傷など、ニューロンの損傷からの回復に潜在的に役立つ治療手段が得られるであろう。そのようなＮＯＧＯ阻害薬の例には、小分子、ペプチド、および抗体が含まれうる。
神経突起成長の強力な阻害薬（続いてＮＯＧＯ−Ａのフラグメントであると見られる）であるミエリンタンパク質ＮＩ−２２０／２５０に対して産生されるマウスモノクローナル抗体ＩＮ−１は、軸索の再生を促進すると報告されている［非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８、および非特許文献２９］。ＮＯＧＯ−ＡはＩＮ−１に対する抗原であることも報告されている［非特許文献３０］。脊髄離断を施したラットに、ＩＮ−１ Ｆａｂフラグメントまたはヒト化ＩＮ−１を投与すると、回復が増強された［非特許文献３１; 非特許文献３２］。
ＮＯＧＯに結合するモノクローナル抗体は、特許文献６および特許文献７に記載されている。国際公開公報第０４／０５２９３２号は、ヒトＮＯＧＯのある種の形態と高親和性で結合するマウス抗体１１Ｃ７を開示している。
特許文献８も、マウスモノクローナル抗体２Ａ１０を含む高親和性モノクローナル抗体を開示し、そのヒト化変異体、例えばＨ１Ｌ１１［Ｈ１およびＬ１１の配列は、それぞれ配列番号３３および３４に示す（ＶＨまたはＶＬ配列のみ）］を概括的に開示している。開示されている抗体は、ヒトＮＯＧＯ−Ａと高親和性で結合する。マウス２Ａ１０抗体（およびＣＤＲを移植したそのヒト化変異体）は、それらの軽鎖および重鎖可変領域内の以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列によって特徴付けられる［KABATの方法を使用して決定される（非特許文献３３）］。
表１：抗体２Ａ１０軽鎖ＣＤＲ
［表１］
Figure 0005015949
表２：抗体２Ａ１０重鎖ＣＤＲ
［表２］
Figure 0005015949
特許文献８は、さらに、上記表１および表２のＣＤＲを含む抗体の「類似体」を開示し、そのような「類似体」は、それらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能力を有する。
国際公開公報第９５２２３４４号 国際公開公報第９７０１３５２号 米国特許第００５２５０４１４号Ａ 国際公開公報第２００００５３６４号Ａ１ 国際公開公報第００３１２３５号 国際公開公報第０４／０５２９３２号 国際公開公報第２００５０２８５０８号 国際公開公報特許出願第０５／０６１５４４号 Hill & Hachinski, The Lancet, 352 : (suppl III) 10-14 (1998) Dawbarn & Allen 2001 Neurobiology of Alzheimer's Disease OUP Naslundら, JAMA, March 22/29, 2000, Vol.283, No;12, page 1571-1577 Hussainら, Mol.Cell.NeuroSci. 16, 609-619 (2000) Vassarら, Science (1999), Oct.22; 286 (5440):735-741 Medina & Dotti Cell Signalling 2003 15(9):829-41 Perezら, 1999 J Biol Chem 274 (27) 18851-6 Malteseら, 2001 J Biol Chem 276 (23) 20267-20279 Grbovicら, 2003 J Biol Chem 278 (33) 31261-31268 Ehehaltら, 2003 J Cell Biol 160 (1) 113-123 Cordyら, 2003 PNAS 100(20) 11735-11740 Jakeman,ら, 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184 Kawamataら, 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94:8179-8184 Ribotta,ら, 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152 Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391 Horner & Gage, 2000, Nature 407 963-970 Schwab ME and Caroni P (1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193 Sato S.ら, (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163,1473-1480 McKerracher Lら, (1994) Neuron 13, 805-811 Mukhopadhyay Gら, (1994) Neuron 13, 757-767 Torigoe KおよびLundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262 Schaferら, (1996) Neuron 16, 1107-1113 Prinjha Rら, (2000) Nature 403, 383-384 Chen MSら, (2000) Nature 403, 434-439 GrandPre Tら, (2000) Nature 403, 439-444 Caroni, PおよびSchwab, ME (1988) Neuron 1 85-96 Schnell, LおよびSchwab, ME (1990) Nature 343 269-272 Bregman, BSら, (1995) Nature 378 498-501 Thallmair, Mら, (1998) Nature Neuroscience 1 124-131 Chenら, (2000) Nature 403 434-439 Fiedler, Mら, (2002) Protein Eng 15 931-941 Brosamle, Cら, (2000) J. Neuroscience 20 8061-8068 Kabatら, (1991) "Sequences of proteins of immunological interest"; 第５版，米国健康福祉省; NIH publication No 91-3242)）
高親和性抗ＮＯＧＯ抗体を提供する技術にもかかわらず、代替物、すなわちヒトＮＯＧＯに結合しその活性を阻害する、改善された治療上有用なモノクローナル抗体を単離し開発するという非常に望ましい目標が依然として残されている。
それだけには限らないが、急性疾患、例えば、（虚血性または出血性）脳卒中、外傷性脳傷害、および脊髄損傷、ならびにアルツハイマー病、前頭側頭型認知症（タウオパチー）、末梢神経障害、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病疾患（ＣＪＤ）、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症、および封入体筋炎含む慢性疾患を含む、多くの神経系疾患／疾病の根底には神経変性疾患の過程がある。従って、本発明の抗ＮＯＧＯモノクローナル抗体などは、これらの疾患／疾病の治療に有用でありうる。上記の疾患／疾病を治療する抗体を本発明は提供し、以下に詳しく記載する。
本発明は、特異的重鎖可変領域、ならびに前記特異的重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む抗体またはそのフラグメントを提供するが、この軽鎖可変領域は、前記重鎖可変領域と対を形成したとき、そのＦｖ二量体がヒトＮＯＧＯ−Ａと高親和性で結合し、それによってヒトＮＯＧＯ−Ａの活性を中和する。
本発明の重鎖可変領域は、軽鎖可変領域と一緒に構成すると、従来の免疫グロブリン方式（例えばヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）で、またはヒトＮＯＧＯ−Ａと結合する、他の任意のそのフラグメントまたは「抗体様」構成［例えば、一本鎖Ｆｖ、ディアボディ、Tandabs（商標）など｛代替の「抗体」構成の概要については、HolligerおよびHudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, NO. 9, 1126-1136を参照されたい｝］で、ヒトＮＯＧＯ−Ａと結合できるようになりうる。
基本的にアミノ酸残基ＧＱＧＹからなる第３ＣＤＲを含む重鎖可変領域であって、該ＣＤＲが、該ＧＱＧＹコア配列中に少なくとも一個の置換を含み、該置換が、第１位置のＧをＲ、Ｉ、Ｗ、またはＭに置き換える置換；第２位置のＱをＤ、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｖ、またはＳに置き換える置換；第３位置のＧをＷ、Ｎ、Ｙ、Ｓ、Ｌ、またはＦに置き換える置換；および第４位置のＹをＷに置き換える置換から選択されている重鎖可変領域。
別の実施形態では、第３重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ Ｈ３）は、以下のＣＤＲ Ｈ３：ＲＱＧＹ（配列番号７５）、ＩＱＧＹ（配列番号７６）、ＭＱＧＹ（配列番号４５）、ＧＤＧＹ（配列番号７７）、ＧＩＧＹ（配列番号７８）、ＧＳＧＹ（配列番号７９）、ＧＱＮＹ（配列番号８０）、ＧＱＹＹ（配列番号８１）、ＧＱＳＹ（配列番号６２）、ＧＱＬＹ（配列番号８２）、ＧＱＦＹ（配列番号８３）、ＧＱＧＷ（配列番号８４）、ＷＱＧＹ（配列番号８６）、ＧＡＧＹ（配列番号８７）、ＧＬＧＹ（配列番号８８）、ＧＶＧＹ（配列番号８９）、ＧＱＷＹ（配列番号９０）を得るためにただ一つの置換を含む。
別の実施形態では、上記重鎖可変領域は、さらに、表２に記載の他のＣＤＲ、すなわちＣＤＲ Ｈ１（配列番号１）およびＣＤＲ Ｈ２（配列番号２）を含む。
本発明の抗体またはそのフラグメントは、ＥＬＩＳＡおよびBiacore実験で測定した活性という点で、ＣＤＲ Ｈ３：ＧＱＧＹを含む抗体のヒトＮＯＧＯ結合活性を保持し、ある場合には、これらの実験でその活性は上昇する。
Ｇ９５Ｍ（KABATによる置換番号）を含むヒトまたはヒト化重鎖可変領域
本発明の一実施形態では、本発明の重鎖可変領域は表３に定義する（KABATにより定義した）ＣＤＲを含む。
［表３］
Figure 0005015949
本発明の一実施形態では、表３に記載したＣＤＲのそれぞれを含む、ヒトまたはヒト化重鎖可変領域が提供される。本発明の別の実施形態では、ヒト重鎖可変領域の長い配列中に、表３に記載したＣＤＲを含むヒト化重鎖可変領域が提供される。さらに別の実施形態では、ヒト化重鎖可変領域は、そのフレームワーク領域において、マウス２Ａ１０ドナー抗体重鎖可変領域（配列番号７）に対して、４０％を超える同一性、あるいは５０％を超え、または６０％を超え、または６５％超える同一性を有する、アクセプター抗体フレームワーク中、表３に示したＣＤＲを含む。
表３のＣＤＲを全て使用した場合、一実施形態では、本重鎖可変領域配列は配列番号６６［Ｈ９８ ＶＨは、ＣＤＲ Ｈ３が、Ｈ１に見られるＧＱＧＹの代わりに、Ｈ９８でＭＱＧＹであるという点でのみ異なる、Ｈ１ ＶＨ（配列番号３３）の等価物である］に示す配列Ｈ９８である。
本発明の一態様では、本抗体は、配列番号６６（Ｈ９８可変領域）のアミノ酸配列を有し、さらに位置３８、４０、４８、６７、６８、７０、７２、７４、および７９の一位置または複数にいくつかの置換を含み、それぞれの置換されたアミノ酸残基が、配列番号７（ドナー抗体２Ａ１０の重鎖可変領域）の同等位置でそのアミノ酸残基により置換されており、置換数が１〜９である重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、置換数は１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９である。
この意味において、記載した置換は、概念では「復帰突然変異」の等価物であり、その場合、Ｈ９８配列中の特定の位置のヒトフレームワークアミノ酸残基は、２Ａ１０ドナー抗体配列中の同等位置のアミノ酸残基に復帰突然変異している。
本明細書で別段そうではないと特に明示しない限り、「位置１２」など、特定の配列中に見られるアミノ酸残基の位置番号が本文書に記載されている場合、当業者は、配列の第１アミノ酸に位置「１」を割り当て、位置１から数えて所望の位置にあるアミノ酸、この例では、配列の１２番目のアミノ酸残基を同定するものとする。当業者は、この番号付与体系が、抗体配列中のアミノ酸位置を定義するのに使用されることが多いKABAT番号付与体系と一致しないことに気づくであろう。
最適の結合親和性には、マウス抗体２Ａ１０（そのＶＨは配列番号７である）のヒト化で、位置４８および６８のアミノ酸残基対は、（それらが２Ａ１０に存在しているので）それぞれＩとＡであり、または（それらがＨ９８に存在しているので）それぞれＭとＶであるべきことが見出された。上記知見は、２Ａ１０のＧ９５Ｍ変異体のヒト化にも関連すると予想される。
下表に、本発明の抗体の一部を形成しうる、３個の異なる重鎖可変（ＶＨ）領域の詳細を含める。開示したＶＨのそれぞれは、表（表４）に記載した置換をさらに含む、Ｈ９８ ＶＨ（配列番号６６）をベースとし、その際、関連する位置のＨ９８残基は、その位置で２Ａ１０の残基に置換されている［表中、「−」は、その位置に置換が存在せず、従ってその残基がＨ９８の配列にそのまま残ることを意味する］
［表４］
Figure 0005015949
本発明の一実施形態では、従って、本発明の重鎖可変領域（ＶＨ）は、Ｈ２６ＶＨ（配列番号４７）、Ｈ２７ＶＨ（配列番号４８）およびＨ２８ＶＨ（配列番号４９）である。
配列番号４７：ＶＨヒト化構築体Ｈ２６
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＮＰＳＮＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＥＬＭＱＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４８：ＶＨヒト化構築体Ｈ２７
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＮＰＳＮＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＥＬＭＱＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号４９：ＶＨヒト化構築体Ｈ２８
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＮＰＳＮＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＥＬＭＱＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
Ｇ１０１Ｓ（KABATによる置換番号）を含むヒトまたはヒト化重鎖可変領域
本発明の別の実施形態では、表５に定義したＣＤＲを含むヒトまたはヒト化重鎖可変領域が提供される。
［表５］
Figure 0005015949
一実施形態では、表５のＣＤＲをヒト重鎖可変領域配列中に組み込む。別の実施形態では、ヒト化重鎖可変領域は、そのフレームワーク領域において、マウス２Ａ１０ドナー抗体重鎖可変領域（配列番号７）に対して、４０％を超える同一性、あるいは５０％を超え、または６０％を超え、または６５％を超える同一性を有する、アクセプター抗体フレームワーク中、表５に示したＣＤＲを含む。
別の実施形態では、表５のＣＤＲをヒト重鎖可変領域に挿入して、次の配列（Ｈ９９）：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＮＰＳＮＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＥＬＧＱＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６１：２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ９９）を得る。
他の実施形態では、Ｈ９９ＶＨ配列の（数的残基位置で示す）位置３８、４０、４８、６７、６８、７０、７２、７４、または７９のどれか一位置に、別の復帰突然変異を加え、その際、それぞれの置換されたアミノ酸残基は、配列番号７（ドナー抗体２Ａ１０の重鎖可変領域）の同等位置でそのアミノ酸残基により置換されており、置換数は１〜９である。他の実施形態では、置換数は、１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９である。Ｈ９９ＶＨは、ＣＤＲ Ｈ３が、Ｈ１に見られるＧＱＧＹの代わりに、Ｈ９９でＧＱＳＹであるという点でのみ異なる、Ｈ１ ＶＨ（配列番号３３）の等価物である。
最適の結合親和性については、マウス抗体２Ａ１０（そのＶＨは配列番号７である）のヒト化で、位置４８および６８のアミノ酸残基対は、（それらが２Ａ１０に存在している場合）それぞれＩとＡであり、または（それらがＨ９８に存在している場合）それぞれＭとＶであるべきことが見出された。上記知見は、２Ａ１０のＧ９５Ｍ変異体のヒト化にも関連すると予想される。
一実施形態では、復帰突然変異は、下表６に示す位置に位置し、その際、関連する位置のＨ９９残基は、その位置で２Ａ１０の残基に置換されている［表中、「−」は、その位置に置換が存在せず、従ってその残基がＨ１の配列にそのまま残ることを意味する］。
［表６］
Figure 0005015949
ヒトまたはヒト化重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗体またはフラグメント
本発明のＶＨ構築体は、軽鎖と対になって、全長（ＦＬ）可変および定常ドメイン重鎖配列を有する従来のＩｇＧ抗体構成を含む任意の構成で、ヒトＮＯＧＯ−Ａ結合単位（Ｆｖ）を形成しうる。本発明のＶＨ構築体を含み、位置２３５および２３７（ＥＵ指標番号付与）の変異を不活性化して抗体を非溶解性にする、全長（ＦＬ）ＩｇＧ１重鎖配列の例は、配列番号５３、５４、および５５である。
配列番号５３：重鎖ヒト化構築体Ｈ２６
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＮＰＳＮＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＥＬＭＱＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
配列番号５４：重鎖ヒト化構築体Ｈ２７
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＮＰＳＮＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＥＬＭＱＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号５５：重鎖ヒト化構築体Ｈ２８
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮＩＮＰＳＮＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＥＬＭＱＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
本発明の重鎖可変領域配列とＦｖを形成する軽鎖可変領域配列は、ＦｖをヒトＮＯＧＯ−Ａに結合できるようにする任意の配列であってよい。
本発明の一実施形態では、軽鎖可変領域は２Ａ１０軽鎖（国際公開公報第０５／０６１５４４号を参照）であり、その軽鎖可変領域は配列番号８またはそのヒト化変異体として本明細書に提供される。２Ａ１０軽鎖のヒト化変異体は、ヒト軽鎖可変領域アクセプターフレームワーク上にグラフトさせて、表１に記載する軽鎖可変領域ＣＤＲの全てを含むのが好ましい。一実施形態では、ヒト化軽鎖可変領域は、Ｌ１１（配列番号３４）、Ｌ１３（配列番号１３）、またはＬ１６（配列番号１４）である。KABAT位置３７および／または４５に特定の置換を含む、Ｌ１３およびＬ１６をベースとする代替の軽鎖可変領域を表７に提供する。
［表７］
Figure 0005015949
別の実施形態では、全長（ＦＬ）軽鎖配列は、Ｌ１１ ＦＬ（配列番号３６）、Ｌ１３ ＦＬ（配列番号１７）、またはＬ１６ ＦＬ（配列番号１８）である。
別の実施形態では、本抗体、そのフラグメントまたは機能性等価物は、次のＶＬ配列：Ｌ１１、Ｌ１３、Ｌ１６、Ｌ１００、Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、およびＬ１０５のどれか一つと組み合せて、Ｈ２６、Ｈ２７、Ｈ２８、Ｈ１００、Ｈ１０１およびＨ１０２から選択されるＶＨ配列を含む。収載した重鎖可変領域と軽鎖可変領域の全ての可能な組合せを具体的に開示することを意図している（例えば、Ｈ２８Ｌ１０４ら）。
特定の実施形態では、本抗体、そのフラグメントまたは機能性等価物は以下の可変領域対を含む。
Ｈ２７Ｌ１６（配列番号４８＋配列番号１４）
Ｈ２８Ｌ１３（配列番号４９＋配列番号１３）
Ｈ２８Ｌ１６（配列番号４９＋配列番号１４）
別の実施形態では、本発明の抗体は以下の全長配列を含む。
Ｈ２７ＦＬＬ１６ＦＬ（配列番号５４＋配列番号１８）
Ｈ２８ＦＬＬ１３ＦＬ（配列番号５５＋配列番号１７）
Ｈ２８ＦＬＬ１６ＦＬ（配列番号５５＋配列番号１８）
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｈ２７Ｌ１６（配列番号４８＋配列番号１４）を含み、または全長抗体Ｈ２８ＦＬ Ｌ１６ＦＬ（配列番号５５＋配列番号１８）である。
別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、Ｈ２８Ｌ１６と同じヒトＮＯＧＯエピトープと結合し、またはヒトＮＯＧＯとの結合においてＨ２８Ｌ１６と競合し、どちらの例でも、その競合する抗体またはフラグメントは、配列ＧＱＧＹ（配列番号３）を有するＣＤＲ Ｈ３、またはＣＤＲ Ｈ３中に一アミノ酸置換を含む配列を含む、マウス抗体２Ａ１０またはそのヒトもしくはヒト化変異体ではないことを特徴とする。
特定の実施形態では、本抗体、そのフラグメントまたは機能性等価物は以下の可変領域対を含む。
Ｈ１００Ｌ１６（配列番号６３＋配列番号１４）
Ｈ１０１Ｌ１３（配列番号６４＋配列番号１３）
Ｈ１０２Ｌ１６（配列番号６５＋配列番号１４）
エピトープマッピングおよび同じエピトープに結合する別の抗体
別の実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイで、ヒトＮＯＧＯタンパク質またはそのフラグメント、例えば、ＧＳＴ−ＮＯＧＯ−Ａ５６タンパク質（配列番号３２）に結合できる抗体またはそのフラグメントであって、ＥＬＩＳＡアッセイで、該抗体またはそのフラグメントと、該ヒトＮＯＧＯタンパク質またはそのフラグメントとの結合が、次の配列：ＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮ（配列番号６０）を有するペプチドの存在下では低減され、そして無関係なペプチド、例えば、配列番号６０（配列番号８５、ＹＥＳＩＫＨＥＰＥＮＰＰＰＹＥＥなど）と重複しないヒトＮＯＧＯ由来のペプチドの存在下では低減されず、該抗体またはそのフラグメントが、アミノ酸残基ＧＱＧＹからなるＣＤＲ Ｈ３を有する重鎖可変ドメイン、またはＣＤＲ Ｈ３中に一アミノ酸置換を有するその類似体を含む抗体ではないことを特徴とする抗体またはそのフラグメントが提供される。あるいは競合するペプチドは、ＴＰＳＰＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮ（配列番号７３）またはＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮＳＡＶＰ（配列番号７４）である。さらに、抗体またはそのフラグメントと同じエピトープに結合する抗体は、表１および表２に記載したＣＤＲの全てを含まない抗体、あるいは表１と表２を合わせて、または表１もしくは表２単独に記載したＣＤＲに、８０％以上の相同性を有するＣＤＲセットを含む任意の抗体であってよい。
本発明の別の実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイで、ポリペプチド配列ＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮ（配列番号６０）からなるヒトＮＯＧＯタンパク質領域と結合できる抗体またはそのフラグメントであって、該抗体またはそのフラグメントが、アミノ酸残基ＧＱＧＹからなるＣＤＲ Ｈ３を有する可変重鎖ドメイン、またはＣＤＲ Ｈ３中に一アミノ酸置換を有するその類似体を含む抗体ではないことを特徴とする抗体またはそのフラグメントが提供される。あるいは、前記抗体またはそのフラグメントは、ＴＰＳＰＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮ（配列番号７３）、またはＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮＳＡＶＰ（配列番号７４）に結合することができる。さらに、抗体またはそのフラグメントと同じエピトープに結合する抗体は、表１および表２に記載したＣＤＲの全てを含まない抗体、あるいは表１と表２を合わせて、または表１もしくは表２単独に記載したＣＤＲに、８０％以上の相同性を有するＣＤＲセットを含む任意の抗体であってよい。
本発明の別の実施形態では、ヒトＮＯＧＯエピトープＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮ（配列番号６０）と結合する抗体またはその結合フラグメントを得る方法であって、哺乳動物を前記ペプチドで免疫化するステップ、および前記ペプチドと結合する抗体を生成できる細胞を単離するステップを含む方法が提供される。本発明の別の実施形態では、ヒトＮＯＧＯエピトープＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮ（配列番号６０）と結合する、単離した抗体またはその結合フラグメントを得る方法であって、複数の抗体またはその結合フラグメントを含むライブラリーをスクリーニングするステップを含む方法が提供され、抗体またはその結合フラグメントと、ＮＯＧＯエピトープＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮ（配列番号６０）との結合によって、抗体またはその結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列と共に、それぞれの抗体またはその結合フラグメントをそのライブラリーから単離することができる。
医薬組成物
本発明の別の態様は、製薬上許容される希釈剤または担体と共に、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体、またはその機能性フラグメントもしくは等価物を含む医薬組成物が提供される。
別の態様では、本発明は、ヒトで、脳卒中（特に虚血性脳卒中）および他の神経系疾患、特にアルツハイマー病を治療しまたは予防する方法、ならびにＣＮＳへの物理的外傷（脊髄損傷など）を患う患者の治療法であって、それを必要とする前記ヒトに、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体またはその機能性フラグメントの有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、脳卒中（特に虚血性脳卒中）および他の神経系疾患、特にアルツハイマー病を治療しまたは予防する薬物、ならびにＣＮＳへの物理的外傷（脊髄損傷など）を患う患者を治療する薬物の調製における、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体またはその機能性フラグメントの使用を提供する。
別の態様では、本発明は、脳卒中（特に虚血性脳卒中）、または他の神経系疾患、特にアルツハイマー病に罹患し、または発症の危険にさらされているヒト患者で、神経変性疾患を抑制し、かつ／または機能回復を促進する方法、ならびにＣＮＳへの物理的外傷（脊髄損傷など）を患う患者の治療法であって、それを必要とする前記ヒトに、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体またはその機能性フラグメントの有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、脳卒中および他の神経系疾患、特にアルツハイマー病に罹患し、または発症の危険にさらされているヒト患者で、神経変性疾患を抑制し、かつ／または機能回復を促進する薬物、ならびにＣＮＳへの物理的外傷（脊髄損傷など）を患う患者を治療する薬物の調製における、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体またはその機能性フラグメントの使用を提供する。
本発明の詳細な説明およびその好ましい実施形態に、本発明の他の態様および利点をさらに記載する。
本発明の重鎖可変領域は、天然抗体またはその機能性フラグメントもしくは等価物の構造に構成することができる。従って、本抗体は、適切な軽鎖と対になったとき、全長抗体、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはその等価物（例えば、ｓｃＦＶ、ビ−、トリ−、またはテトラ体、Tandabなど）中に、本発明のＶＨ領域を構成させて含めることができる。本抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４；ＩｇＭ；ＩｇＡ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＤ、またはその改変変異体であってよい。本抗体重鎖の定常ドメインはそれに応じて選択しうる。その軽鎖定常ドメインはκまたはλ定常ドメインであってよい。さらに、抗体は、ＩｇＧ二量体など、全クラスの改変型、もはやＦｃ受容体に結合せず、またはＣｌｑ結合を媒介しないＦｃ変異体を含みうる。本抗体は、抗原結合領域と非免疫グロブリン領域を含む、国際公開公報第８６／０１５３３号に記載されている型のキメラ抗体であってよい。
定常領域は、必要な機能に応じて選択する。通常、ＩｇＧ１は、補体との結合を通じて溶解能を示し、かつ／またはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）を媒介する。非細胞障害性ブロッキング抗体が必要なときは、ＩｇＧ４が好ましい。しかし、ＩｇＧ４抗体は、生成時不安定であることを示す可能性があり、従って一般的により安定したＩｇＧ１を改変するのがより好ましいであろう。欧州特許第０３０７４３４号に、提案された改変が記載されており、好ましい改変には、位置２３５および２３７におけるものが含まれる。従って、本発明は、本発明による抗体の溶解形または非溶解形を提供する。
従って、好ましい形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載した本重鎖可変領域を有する全長（すなわちＨ２Ｌ２四量体）非溶解性ＩｇＧ１抗体である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載した重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。
「ＮＯＧＯ」は、変異型を含む任意のＮＯＧＯポリペプチドをさす。これには、それらだけには限定されないが、１１９２アミノ酸残基を有するＮＯＧＯ−Ａ（GenBank受託番号ＡＪ２５１３８３）、仮想細胞外ドメインの残基１８６〜１００４を欠くスプライスバリアントであるＮＯＧＯ−Ｂ（GenBank受託番号ＡＪ２５１３８４）、およびさらに残基１８６〜１００４も欠くが、それより短い代替のアミノ末端ドメインも有する、短いスプライスバリアントであるＮＯＧＯ−Ｃ（GenBank受託番号ＡＪ２５１３８５）が含まれる（Prinjhaら（２０００）上掲）。本明細書では「ＮＯＧＯ」についての言及は全て、具体的形態を示さなければ、ＮＯＧＯ−ＡなどのＮＯＧＯおよび記載したスプライスバリアントのあらゆる変異型を含むと理解される。
「中和化」およびその文法変化形は、ニューロンとの結合を含むＮＯＧＯ機能の全体的もしくは部分的阻害、および神経突起の成長の阻害をさす。
Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ）２という用語は、それらの標準的意味で使用される［例えば、Harlowら, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)を参照されたい］。
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域と関連して、ドナー抗体に由来する自然発生の可変領域（軽鎖と重鎖）を含む改変抗体の種類をさす。
「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するＣＤＲを有し、その分子の残りの免疫グロブリン由来部分が、１つ（またはそれ以上）のヒト免疫グロブリンに由来する、改変抗体の種類をさす。さらに、結合親和性を保存するように、フレームワーク支持残基を改変してよい［例えば、Queenら, Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)，Hodgsonら, Bio/Technology, 9:421 (1991)を参照］。適切なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体（この場合はマウスドナー抗体２Ａ１０）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同によって、従来のデータベース、例えば、KABAT（登録商標）データベース、Los Alamosデータベース、およびSwiss Proteinデータベースから選択したものであってよい。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する相同性（アミノ酸基準）によって特徴付けられるヒト抗体は、ドナーＣＤＲ挿入用の重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適切であろう（アクセプターフレームワーク中に挿入するための２Ａ１０のＣＤＲについては、表１を参照されたい）。軽鎖定常領域または可変フレームワーク領域を供与することができる、適切なアクセプター抗体も同様に選択することができる。アクセプター抗体重鎖および軽鎖は、同じアクセプター抗体を起源としなくてもよいことは注目すべきことである。従来技術は、そのようなヒト化抗体を生成する、いくつかの方式について記載している。例えば、欧州特許出願第０２３９４００号および欧州特許出願第０５４９５１号を参照されたい。
「ドナー抗体」という用語は、ヒト化抗体に、可変領域、ＣＤＲ、または他の機能性フラグメント、またはその類似体のアミノ酸配列が寄与し、それによってヒト化抗体に、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性と中和活性を付与する、非ヒト抗体をさす。
「アクセプター抗体」という用語は、ヒト化抗体に、その重鎖および／または軽鎖フレームワーク領域、ならびに／あるいはその重鎖および／または軽鎖定常領域のアミノ酸配列を提供する、ドナー抗体とは異種の抗体をさす。アクセプター抗体は、任意の哺乳動物に由来してよいが、ただしそれはヒトで非免疫原性のものである。好ましくは、アクセプター抗体はヒト抗体である。
あるいは、ヒト化は、「ベニア化（veneering）」過程によって実現することができる。特有のヒトおよびマウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域の統計分析によって、露出している残基の正確なパターンは、ヒトおよびマウス抗体で異なり、ほとんどの個々の表面位置は、少数の異なる残基に対して高い優先性を有することが判明した（Padlan E.A.ら; (1991) Mol.Immunol.28, 489-498およびPedersen J.T.ら, (1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973を参照）。従って、ヒト抗体で通常見られるものとは異なる、そのフレームワーク領域中の露出した残基を置換することによって、非ヒトＦｖの免疫原性を減少させることができる。タンパク質の抗原性は、表面到達性と相関しうるので、表面残基の置換は、ヒト免疫系に対してマウス可変領域を「見えなく」するのに十分でありうる（Mark G.e.ら, (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp105-134を参照）。このヒト化手順は、抗体表面のみが改変され、支持残基は影響を受けずに残るので「ベニア化」と称される。別の代替の手法は、国際公開公報第０４／００６９５５号に記載されている。
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest、第４版、米国健康福祉省、国立衛生研究所（1987）を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には、３個の重鎖ＣＤＲと３個の軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）がある。すなわち、本明細書で使用する「ＣＤＲ」は、全３個の重鎖ＣＤＲ、または全３個の軽鎖ＣＤＲ（あるいは、適切であれば、両方の全ての重鎖ＣＤＲおよび全ての軽鎖ＣＤＲ）をさす。抗体の構造およびタンパク質のホールディングとは、他の残基は、抗原結合領域部分と考えられることを意味してよく、当業者もそのように理解されよう。例えば、Chothiaら, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883を参照されたい。
二重特異性抗体は、少なくとも異なる２個のエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。そのような抗体の製造方法は、当技術分野で公知である。従来、二重特異性抗体の組換え生成は、２対の免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖の同時発現をベースとし、その際、２本のＨ鎖は異なる結合特異性を有する（Millsteinら, Nature 305 537-539 (1983)、国際公開公報第９３／０８８２９号、およびTrauneckerら, EMBO, 10, 1991, 3655-3659を参照されたい）。Ｈ鎖とＬ鎖をランダムに仕分けるために、異なる１０個の抗体構造体の潜在的混合物を生成し、そのうちの一つだけが所望の結合特異性を有する。代替の手法は、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む重鎖定常領域に対する所望の結合特異性を有する複数の可変ドメインを融合するステップを含む。軽鎖の結合に必要な部位を含むＣＨ１領域は、融合体の少なくとも一個に存在させて有するのが好ましい。これらの融合体をコードするＤＮＡと、所望の場合にはＬ鎖とを別々の発現ベクターに挿入し、次いで適切な宿主生物中に同時形質移入する。しかし、２本または全３本の鎖のコード配列を一つの発現ベクター中にを挿入することもできる。好ましい一手法では、二重特異性抗体は、一アーム中に第一の結合特異性を有するＨ鎖と、他方のアーム中に、第２の結合特異性をもたらすＨ−Ｌ鎖対とから成る（国際公開公報第９４／０４６９０号、さらに、Sureshら, Methods in Enzymology 121, 210, 1986を参照されたい）。
本発明の一実施形態では、二重特異性治療抗体が提供され、その際、前記抗体の少なくとも一つの結合特異性は、ヒトＮＯＧＯと、配列番号６０に記載されているエピトープで結合する。本発明の別の実施形態では、二重特異性抗体は、重鎖可変領域ＣＤＲ Ｈ３配列ＭＱＧＹ（配列番号４５）を含む。別の実施形態では、二重特異性抗体は、次の重鎖および軽鎖可変領域対：Ｈ２７Ｌ１６（配列番号４８＋配列番号１４）、Ｈ２８Ｌ１３（配列番号４９＋配列番号１３）、またはＨ２８Ｌ１６（配列番号４９＋配列番号１４）を含む。
本発明の抗体は、宿主細胞に、本発明の抗体のコード配列を有する発現ベクターを形質移入することによって生成しうる。発現ベクターまたは組換えプラスミドは、これらの抗体コード配列と、宿主細胞中での複製と発現、および／または宿主細胞からの分泌を制御することができる従来の調節制御配列とを作動可能に連結して配置することによって産生される。調節配列には、プロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーターおよびシグナル配列が含まれ、それらは公知の他の抗体に由来していても良い。同様に、第２の発現ベクターは、相補的抗体軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を含めて産生させることができる。好ましくは、各ポリペプチド鎖が機能的に発現されるのを可能な限り確実にするために、この第２の発現ベクターは、コード配列と選択マーカーに関する範囲を除いて、第１の発現ベクターと同一である。あるいは、改変した抗体の重鎖および軽鎖のコード配列は、単一のベクター上にあってよい。
選択した宿主細胞に、第一および第２ベクターを従来技術によって同時形質移入して（または単一ベクターにより単純に形質移入して）、組換えまたは合成の軽鎖および重鎖の両方を含む、本発明の形質移入宿主細胞を作成する。次いで形質移入細胞を従来技術によって培養し、本発明の改変抗体を産生させる。ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどの好適なアッセイにより、培地から両組換え重鎖および／または軽鎖の会合を含む抗体をスクリーニングする。他の改変した抗体および分子を構築するために、同様の従来技術を使用することもできる。
有用な一発現系は、グルタミン酸合成酵素系（Lonza Biologics社から市販されているものなど）であり、特に宿主細胞がＣＨＯまたはＮＳ０であるものである（以下を参照）。本抗体をコードするポリヌクレオチドは、従来の手順（オリゴヌクレオチドプローブなど）を使用し、容易に単離し配列決定される。使用しうるベクターには、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニクロムソーム（minichromsomes）が含まれ、その中で、プラスミドが典型的な実施形態である。一般的に、そのようなベクターは、発現を促進するために、さらに、軽鎖および／または重鎖ポリヌクレオチドに機能し得る形で連結されたシグナル配列、複製起点、一個もしくは複数の標識遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、および転写停止配列を有する。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドは、別々のベクター中に挿入し、同じ宿主細胞に（例えば、電気穿孔法によって）導入することができ、所望の場合には、宿主細胞に形質移入するための同じベクター中に、重鎖および軽鎖の両方を挿入することもできる。すなわち、本発明の一実施形態によれば、本発明の治療抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖および／または重鎖をコードするベクターを構築する方法であって、ベクターに、本発明の治療抗体軽鎖および／または重鎖をコードするポリヌクレオチドを挿入するステップを含む方法が提供される。
別の実施形態では、配列番号４７、４８、または４９に記載した配列を有するヒト化重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号５３、５４、または５５に記載した配列を有するヒト化重鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。
遺伝暗号の冗長性により、本明細書に開示したポリヌクレオチドの代替のポリヌクレオチドであって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも入手可能であることは、当業者にとって明らかであろう。
本発明の方法および本発明の組成物の構築で使用される、クローニングおよびサブクローニングステップに適切なベクターは当業者であれば選択できよう。例えば、従来のｐＵＣシリーズのクローニングベクターを使用してよい。一ベクターであるｐＵＣ１９は、メーカー、例えば、Amersham（Buckinghamshire, United Kingdom）またはPharmacia（Uppsala, Sweden）から市販されている。加えて、容易に複製でき、クローニング部位および選択可能遺伝子（例えば抗生物質抵抗性）が豊富なベクターであり、かつ操作が容易である任意のベクターが、クローニングに使用されるであろう。従って、本発明ではクローニングベクターの選択は制限的要因ではない。
他の好ましいベクター配列には、ポリＡシグナル配列、例えばウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来のもの、およびβグロビンプロモーター配列（βグロプロ）が含まれる。本明細書で有用な発現ベクターは、当業者に周知の技術によって合成することができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリン耐性を付与するタンパク質、あるいは（ｂ）栄養要求的欠点を補い、または複合培地で得られない栄養分を供給するタンパク質をコードする。選択スキームは、宿主細胞の増殖抑止を含みうる。本発明の治療抗体をコードする遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、選択マーカーによって付与された薬物耐性などによって生存する。別の例は、いわゆるＤＨＦＲ選択マーカーであり、その際、形質転換体はメトトレキセートの存在下で培養される。ＣＨＯ細胞は、ＤＨＦＲ選択に特に有用な細胞系である。形質転換した宿主細胞を選択し、導入遺伝子の細胞コピー数を増幅する方法には、ＤＨＦＲ系の使用が含まれる。Kaufman R.J.ら, J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621を参照し、概説はWerner RG, Noe W, Kopp K,Schluter M,” Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals”, Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug.を参照されたい。別の例は、グルタミン酸合成酵素発現系（Lonza Biologics）である。酵母で使用するのに適切な選択遺伝子はｔｒｐ１遺伝子でありStinchcombら, Nature 282, 38, 1979を参照されたい。
例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などのベクター成分は、商業的または天然の供給源から得ることも、または選択した宿主で組換えＤＮＡ生成物を発現し、かつ／または分泌することを目的として使用される公知の手順によって合成することもできる。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、および真菌で発現させるのに、当技術分野で知られている多数の種類の発現ベクターのうち、好適な他の発現ベクターもこの目的のために選択することができる。
本発明はまた、本発明の抗体または等価物のコード配列を含む組換えプラスミドを形質移入した細胞系も包含する。クローニングに有用な宿主細胞、およびこれらのクローニングベクターの他の操作も従来式である。しかし、最も望ましくは、クローニングベクターの複製、および本発明の改変した抗体の構築における他のステップには、大腸菌の様々な株の細胞が使用される。
本発明の抗体を発現するのに適切な宿主細胞または細胞系は、哺乳動物細胞、例えば、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（例えば、ＤＧ４４）、ＣＯＳ、線維芽細胞（例えば３Ｔ３）、および骨髄腫細胞が好ましく、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞がより好ましい。ヒト細胞を使用すると、それにより分子をヒトグリコシル化パターンによって改変することができる。あるいは、他の真核細胞系統も使用してよい。適切な哺乳動物宿主細胞の選択、ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、および生成物の生成と精製の方法は当技術分野で公知である。例えば、先に引用したSambrookらを参照されたい。
細菌細胞が、本発明の抗体またはフラグメント（例えば、組換えＦａｂまたはＳｃＦｖ）の発現に好適な宿主細胞として有用であることは証明できよう［例えば、Plueckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)を参照されたい］。しかし、細菌細胞で発現するタンパク質は、アンホールド形もしくは不適切にホールドされた形、または非グリコシル化された形になる傾向があるために、細菌細胞で産生した任意の組換えフラグメントは、抗原結合能力の保持に関してスクリーニングする必要がある。細菌細胞によって発現する分子が、好適にホールドされた形で産生されたならば、その細菌細胞が望ましい宿主のはずである。例えば、発現に使用される大腸菌の様々な株は、生物工学の分野において宿主細胞として良く知られている。枯草菌（B. subtilis）、ストレプトミセス（Streptomyces）、他の桿菌など、様々な株もこの方法で使用してよい。
所望の場合には、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエおよび鱗翅目、およびウイルス発現系と同様に、当業者に公知の酵母細胞株も宿主細胞としても利用することができる。例えば、Millerら, Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)およびその中で引用されている参照文献を参照されたい。
ベクターを構築することができる一般的方法、本発明の宿主細胞を生成するのに必要な形質移入方法、およびそのような宿主細胞から本発明の抗体を産生するのに必要な培養方法は、全て従来技術である。典型的には、本発明の培養方法は、無血清培養方法であり、通常、無血清懸濁液で細胞を培養する方法である。同様に、本発明の抗体は、一度生成したならば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準的手順に従って、細胞培養含有物から精製しうる。そのような技術は、当技術分野の技術の範囲内であり、本発明を制限するものではない。例えば、抗体の調製は、国際公開公報第９９／５８６７９号および国際公開公報第９６／１６９９０号に記載されている。
本抗体のさらに別の発現方法は、米国特許第４，８７３，３１６号に記載されているものなど、遺伝子導入動物での発現を利用しうる。これは、動物のカゼインプロモーターを使用する発現系であって、哺乳動物に遺伝子導入により組み込むと、雌が、その乳に所望の組換えタンパク質を産生できるようになる発現系に関する。
本発明の別の態様では、本発明の抗体の産生方法であって、本発明の抗体軽鎖および／または重鎖をコードするベクターにより形質転換し、またはこれを形質移入した宿主細胞を培養するステップ、およびそのように産生された抗体を回収するステップを含む方法が提供される。
本発明の抗体をコードするベクターをクローニングし、または発現するのに適切な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、またはより高度な真核細胞である。適切な原核細胞には、真正細菌、例えば大腸菌類（Escherichia）などの腸内細菌、例えば大腸菌（E. Coli）（例えば、ＡＴＣＣ ３１，４４６；３１，５３７；２７，３２５）、エンテロバクター（Enterobacter）、エルウィニア（Erwinia）、クレブシエラプロテウス（Klebsiella Proteus）、サルモネラ（Salmonella）、例えばサルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、セラチア（Serratia）、例えばセラチアマルセスカンス（Serratia marcescans）、および赤痢菌（Shigella）、さらに桿菌（Bacilli）、例えばＢ．スブチリス（B. subtilis）およびＢ．リケニホルミス（B. licheniformis）（ＤＤ ２６６ ７１０参照）、シュードモナス（Pseudomonas）、例えばＰ．アエルギノサ（P. aeruginosa）およびストレプトミセス（Streptomyces）が含まれる。酵母宿主細胞の中では、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、スキゾサッカロミセスポンブ（schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）（例えば、ＡＴＣＣ １６，０４５；１２，４２４；２４１７８；５６，５００）、ヤロウィア（yarrowia）（ＥＰ４０２、２２６）、ピキアパストリス（Pichia Pastoris）［欧州特許第１８３，０７０号、さらにPengら, J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192を参照］、カンジダ（Candida）、トリコデルマレエシア（Trichoderma reesia）（欧州特許第２４４，２３４号）、ペニシリン（Penicillin）、トリポクラジウム（Tolypocladium）およびアスペルギルス（Aspergillus）宿主、例えばＡ．ニズランス（A. nidulans）、およびＡ．ニガー（A. niger）も企図される。
原核および酵母宿主細胞が本発明によって具体的に企図されるが、典型的には、本発明の宿主細胞は脊椎動物細胞である。適切な脊椎動物宿主細胞には、哺乳動物細胞、例えば、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＮＯ．ＣＲＬ １６５０）ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚腎系統２９３、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ．１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ ＮＯ：ＣＲＬ １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ ＮＯ．ＣＲＬ １５７３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ ＮＯ：ＣＣＬ ６１、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系、例えばＤＧ４４［Urlaubら, (1986) Somatic Cell Mol.Genet.12, 555-556)を参照］が含まれ、特に、懸濁培養に適応させたＣＨＯ細胞系、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ＨｅｐＧ２、および骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、例えば、ＮＳ０（参照、ＵＳ５，８０７，７１５）、Ｓｐ２／０、Ｙ０が含まれる。
従って、本発明の一実施形態では、本明細書に記載した治療抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖および／または軽鎖をコードするベクターを含む、安定して形質転換した宿主細胞が提供される。典型的には、そのような宿主細胞は、軽鎖をコードする第１ベクターおよび前記重鎖をコードする第２ベクターを含む。
本発明の治療抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするベクターによって形質転換した宿主細胞は、当業者に公知の任意の方法よって培養してよい。宿主細胞は、スピナーフラスコ、ローラーボトル、または中空繊維系で培養することができるが、特に、懸濁培養に攪拌型タンクリアクターを使用する大規模生成が好ましい。典型的には、攪拌型タンカーは、スパージャー、バッフル、または低剪断インペラーなどを使用するエアレーション用に適合される。気泡塔および気泡ポンプ（airlift）リアクターには、空気または酸素気泡による直接エアレーションを使用し得る。無血清培地で宿主細胞を培養する場合、培地にPluronic F-68などの細胞保護剤を添加して、エアレーション過程によって生じる細胞損傷を予防するのに役立てるのが好ましい。宿主細胞の特性に応じて、マイクロキャリアをアンカレッジ依存性細胞系への増殖基質として使用することも、または細胞を懸濁培養に適合させることもできる（それが典型的である）。宿主細胞、特に脊椎動物宿主細胞の培養には、様々な操作方式、例えば、フェッドバッチ法、反復バッチ法（Drapeauら, (1994) cytotechnology 15: 103-109を参照）、伸展バッチ方式、または灌流培養を使用することができる。組換えによって形質転換した哺乳動物宿主細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む血清含有培地で培養してよいが、そのような宿主細胞は、例えば、Keenら, (1995) Cytotechnology 17:153-16に開示される合成無血清培地、または必要な場合にはグルコースなどのエネルギー源、および組換えインスリンなどの合成増殖因子を添加したProCHO-CDMまたはUltra CHO（商標）（CambrexNJ, USA）などの市販の培地で培養するのが好ましい。宿主細胞の無血清培養は、無血清条件でそれらの細胞が増殖するように適合させる必要があるかもしれない。適応させる一つの手法は、そのような宿主細胞を血清含有培地で培養し、培地の８０％を繰り返し無血清培地に交換して、その結果、無血清条件に適合するように宿主細胞をならすことである（例えば、Scharfenberg Kら, (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C.ら編), pp619-623, Kluwer Academic publishersを参照）。
培地に分泌された本発明の抗体は、様々な技術を使用して培地から回収し精製して、意図した用途に適切な精製度にすることができる。例えば、ヒト患者を治療するための本発明の治療抗体の使用には、典型的には、本治療抗体を含む培地と比較して、少なくとも９５％の純度、より典型的には９８％、または９９％の純度が要求される。まず第一に、典型的には培地の細胞残屑を遠心分離を利用し除去し、続いて例えば精密濾過法、限外濾過法、および／または深層ろ過法を使用する上清の清澄ステップを行う。様々な他の技術、例えば、透析、およびゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー法、例えば、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティクロマトグラフィー（必要に応じてポリヒスチジンなどの親和性タギング系を含む）、および／または疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、米国特許第５，４２９，７４６号を参照）が利用可能である。一実施形態では、様々な清澄ステップ後の本発明の抗体は、プロテインＡまたはＧアフィニティクロマトグラフィーを使用し、続いてさらにクロマトグラフィーステップ、例えば、イオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーおよび硫酸アンモニウム沈殿を使用して捕獲する。典型的には、様々なウイルス除去ステップ（例えばＤＶ−２０フィルターを使用するナノ濾過など）も利用する。これらの様々なステップの後には、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを少なくとも７５ｍｇ／ｍｌ以上、例えば１００ｍｇ／ｍｌ以上含む、精製された（典型的にはモノクローナル）調製物が得られ、従って本発明の実施形態が形成される。そのような調製物は、本発明の抗体の凝集形態を実質的に含まないのが適切である。
本発明によれば、ヒトＮＯＧＯ−Ａに特異的に結合しその活性を中和する、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体の産生方法であって、
（ａ） 本抗体重鎖をコードする第１ベクターを提供するステップ、
（ｂ） 本抗体軽鎖をコードする第２ベクターを提供するステップ、
（ｃ） 前記第１および第２ベクターにより、哺乳動物宿主細胞（例えばＣＨＯ）を形質転換するステップ、
（ｄ） 前記宿主細胞から前記培地に抗体が分泌されるようにする条件下で、ステップ（ｃ）の宿主細胞を培養するステップ、
（ｅ） ステップ（ｄ）の分泌された抗体を回収するステップ
を含む産生方法が提供される。
本抗体が、所望の方法により一度発現したならば、次いで好適なアッセイを使用してインビトロ活性を検査する。現在、抗体とＮＯＧＯとの結合を定性的および定量的に評価するのに、従来のＥＬＩＳＡアッセイ構成が使用される。加えて、通常のクリアランス機序にかかわらず、体内での抗体の持続性を評価するヒト臨床研究を実施する前に、中和効力を検証するために、他のインビトロアッセイも使用される。
本発明の抗体に対する他の改変体には、本発明の抗体のグリコシル化変異体が含まれる。それらの定常領域中の保存された位置で抗体のグリコシル化を行うと、抗体機能、特に先に記載したものなどのエフェクター機能に対して、著しい効果を有することが知られている。例えば、Boydら, (1996), Mol.Immunol. 32, 1311-1318を参照されたい。一個または複数の炭水化物部分を添加、置換、欠失、または修飾した、本発明の治療抗体またはその抗原結合フラグメントのグリコシル化変異体が企図される。アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−トレオニンモチーフを導入することによって、炭水化物部分を酵素的に取り付ける潜在的部位が形成され、従って抗体のグリコシル化を操作するのに使用することができる。Rajuら, (2001) Biochemistry 40, 8868-8876では、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアル化が、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび／またはα，２，３シアリルトランスフェラーゼを使用する、再ガラクトシル化処理および／または再シアル化処理によって増大した。末端シアル化が増大すると、免疫グロブリンの半減期を伸張すると考えられる。ほとんどの糖タンパク質と同様に抗体は、通常、天然では糖鎖体（glycoforms）混合物として産生される。この混合物は、真核生物、特に哺乳動物細胞で抗体が産生されたとき特に顕著である。所定の糖鎖体の製造に様々な方法が開発されている。Zhangら, Science (2004), 303, 371, Searsら, Science, (2001) 291, 2344， Wackerら, (2002) Science, 298 1790, Davisら, (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hangら, (2001) Acc.Chem.Res 34, 727を参照されたい。従って、本発明は、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの所定の数（例えば７個以下、例えば５個以下、２個または１個など）の糖鎖体を含む、本明細書に記載した複数の治療（典型的にはモノクローナル）抗体（ＩｇＧ１など、ＩｇＧアイソタイプのものであってもよい）に関する。
本発明の治療剤は、予防剤として、または脳卒中事象／臨床症状の発症の後に、またはそうでないにしても必要とされる場合に投与してよい。治療用量および治療期間は、ヒト循環における本発明の分子の相対的期間に関連し、治療する状態および患者の全身健康状態に応じて、当業者が調節することができる。最大の治療効力を達成するためには、長期間（例えば４〜６ヵ月）にわたる反復投薬（例えば、週１回または２週間毎に１回）をする必要もありうると想定される。
本発明の治療剤の投与方式は、宿主に薬剤を送達する任意の好適な経路であってよい。本発明の抗体および医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下（ｓ．ｃ．）、くも膜下腔内、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内に（ｉ．ｖ．）、または鼻内（ｉ．ｎ．）投与に特に有用である。
本発明の治療剤は、製薬上許容される担体中の活性成分として、本発明の抗体を有効量含む医薬組成物として調製しうる。本発明の予防剤では、好ましくは注射用に準備された形態の生理学的ｐＨで緩衝化された、設計した抗体を含む水性懸濁液または溶液が好ましい。非経口投与用組成物は、一般に、製薬上許容される担体、好ましくは水性担体に溶解している本発明の抗体溶液またはそのカクテルを含む。様々な水性担体、例えば、０．９％生理食塩水、０．３％グリシンなどを使用しうる。これらの溶液は、無菌であり、一般的に粒子状物質を含まない。これらの溶液は、従来の周知の滅菌技術（例えばろ過）によって滅菌することができる。本組成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされる製薬上許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝化剤などを含んでよい。そのような医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、広範に異ってよく、すなわち、約０．５重量％未満から、通常または少なくとも約１重量％から１５重量％または２０重量％ほどであり、選択した特定の投与方式に従って、基本的に液体容量、粘度などに基づいて選択される。
従って、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、無菌緩衝水１ｍＬ、ならびに本発明の抗体を約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、またはより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ含んで調製されよう。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの無菌リンゲル液、およびリンゲル液１ｍｌ当たりに設計された本発明の抗体を約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇ含んで作製されよう。非経口投与用組成物を調製する実際の方法は周知され、または当業者に明らかであり、そして例えばRemington's Pharmaceutical Science,第15版, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaにより詳細に記載されている。本発明の静脈内投与用抗体製剤の調製については、Lasmar UおよびParkins D “The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000)，Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals”, Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992)，Akers,M.J. “Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations”, J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300，Imamura, Kら, “Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state”, J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S. “Excipient crystalinity and
its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying”, J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039，Johnson, R, “Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization”, J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922を参照されたい。
Ha,E Wang W, Wang Y.j. “Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability”, J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)。その内容全体を参照により本明細書に組み込み、読者はとりわけそれを参照されたい。
医薬調製物の場合には、本発明の治療剤は単位用量形中に入れるのが好ましい。好適な治療有効用量は、当業者なら容易に決定されよう。ヒトで脳卒中および他の神経系疾患を効果的に治療するためには、非経口投与、好ましくはｓ．ｃ．、ｉ．ｖ．、またはｉ．ｍ．（筋肉内）投与するのに、体重７０ｋｇ当たり、本発明の抗体７００〜３５００ｍｇの範囲中の一用量が想定される。そのような投薬は、必要に応じて、内科医が適宜選択した適切な時間間隔で繰り返してよい。
本明細書に記載した抗体は、保存用に凍結乾燥し、使用前に好適な担体で復元することができる。この技術は、従来の免疫グロブリンで有効であることが分かっており、当技術分野で公知の凍結乾燥および復元技術を使用することができる。
別の態様では、本発明は、脳卒中および他の神経系疾患を治療し、または予防するための、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体またはその機能性フラグメント、ならびに製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、脳卒中または他の神経系疾患に罹患し、または発症の危険にさらされているヒト患者で、神経変性疾患を抑制し、かつ／または機能回復を促進するための、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体またはその機能性フラグメント、ならびに製薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、ヒトで脳卒中（特に虚血性脳卒中）および他の神経系疾患／疾病、特にアルツハイマー病を治療し、または予防する方法であって、それを必要とする前記ヒトに、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体またはその機能性フラグメントの有効量を投与するステップを含む方法を提供する。本発明の抗体は、ヒト患者で確立された疾患の治療法に加えて（またはその代替法として）、アルツハイマー病の進行および／または発症を緩やかにし、または停止させる治療方法で使用してよい。
さらに、本発明は、脳卒中および他の神経系疾患／疾病、特にアルツハイマー病を治療しまたは予防する薬物の調製における、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体またはその機能性フラグメントの使用を提供する。
本発明は、脳卒中または他の神経系疾患／疾病、特にアルツハイマー病に罹患し、または発症の危険にさらされているヒト患者で、神経変性疾患を抑制し、かつ／または機能回復を促進する方法であって、それを必要とする前記ヒトに、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体またはその機能性フラグメントの有効量を投与するステップを含む方法も提供する。
さらに本発明は、脳卒中および他の神経系疾患／疾病、特にアルツハイマー病に罹患し、または発症の危険にさらされているヒト患者で、神経変性疾患を抑制し、かつ／または機能回復を促進する薬物の調製における、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体またはその機能性フラグメントの使用を提供する。
本発明はさらに、ヒトで、脳卒中または他の神経系疾患／疾病、特にアルツハイマー病を治療し、または予防する方法であって、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体の治療有効量を非経口投与するステップを含む方法を提供する。好ましくは、前記抗ＮＯＧＯ抗体は静脈内投与される。
本明細書上記で使用した神経系疾患または疾病には、それらだけには限定されないが、外傷性脳傷害、脊髄損傷、前頭側頭型認知症（タウオパチー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、特にアルツハイマー病、多発性硬化症、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が含まれる。
本発明は、ヒト軸索と本発明の抗ＮＯＧＯ抗体とを接触させるステップを含む、軸索発芽を促進する方法も提供する。この方法は、インビトロまたはインビボで実施してよく、好ましくはインビボでその方法を実施する。
別の態様では、従って、ヒト患者で、脳卒中（特に虚血性脳卒中）、脳傷害、脊髄損傷、前頭側頭型認知症（タウオパチー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、特にアルツハイマー病を治療する方法であって、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体の治療有効量を静脈内投与するステップを含む方法が提供される。
本発明の別の態様では、ヒト対象（例えば患者）で、中枢神経系内のニューロンの軸索発芽を促進する方法であって、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体の治療有効量を投与（例えば静脈内投与）するステップを含む方法が提供される。
本発明の別の態様では、ヒト患者で、脳卒中（特に虚血性脳卒中）、脳傷害、脊髄損傷、前頭側頭型認知症（タウオパチー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、特にアルツハイマー病、多発性硬化症、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する静脈内投与可能薬物の製造における、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体（例えば、本明細書に記載のＣＤＲを含む抗ＮＯＧＯ抗体）の使用が提供される。
本発明の別の態様では、脳卒中（特に虚血性脳卒中）、脳傷害、脊髄損傷、前頭側頭型認知症（タウオパチー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、特にアルツハイマー病に罹患している（または、それらに罹りやすい）ヒト患者で、中枢神経系のニューロンで軸索を再生する方法であって、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体の治療有効量を（例えば静脈内に）投与するステップを含む方法が提供される。
本発明の別の態様では、脳卒中（特に虚血性脳卒中）、脳傷害、脊髄損傷、前頭側頭型認知症（タウオパチー）、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、特にアルツハイマー病に罹患している（または、それらに罹りやすい）ヒト患者で、中枢神経系のニューロンで軸索を再生する静脈内投与可能医薬組成物の製造における、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体の使用が提供される。
本発明の別の態様では、アミロイド形成ペプチドの生成を調節する方法であって、アミロイド形成ペプチドが由来する前駆体とＮＯＧＯポリペプチド（例えばヒトＮＯＧＯ−Ａ）とを発現している細胞と、本発明の抗ＮＯＧＯ抗体とを接触させるステップを含む方法が提供される。典型的な実施形態では、その前駆体はＡＰＰである。別の典型的な実施形態では、そのアミロイド形成ペプチドは、Ａβ、最も好ましくはＡβ４０、Ａβ４２、または両方の組合せである。
本明細書において「機能回復」という用語は、例えば、虚血性事象、または損傷、または臨床症状の発症の後に、対象で、運動および／または感覚および／または行動が改善されることをさす。ヒトの機能回復は、基本的神経系機能、例えば、運動筋力、感覚、および協調性；認知機能、例えば、記憶、言語、および指示に従う能力、ならびに機能性能力、例えば、日常生活基本動作または手段的日常生活動作を測定するために設計された手段により評価することができる。基本的神経系機能の回復は、ＮＩＨ脳卒中スケール（ＮＩＨＳＳ）などの手段により測定することができ、認知機能の回復は、神経心理学的試験、例えば、ボストン呼称試験、トレイル−メイキング試験、およびカルフォルニア単語記憶学習検査により測定することができ、ならびに日常生活動作は、ＡＤＣＳ／ＡＤＬ（アルツハイマー病臨床研究／日常生活動作）スケール、またはBristol日常生活動作スケールなどの手段により測定することができ、全ての試験およびスケールは当技術分野で公知である。
以下の実施例によって本発明を説明するが、本発明を制限するものではない。
実施例１
ヒト化抗ＮＯＧＯ抗体の構築および発現
ヒトシグナル配列の他に、ＲｌｄおよびＲｌｎ哺乳動物発現ベクター（または哺乳動物細胞中でタンパク質を発現するのに適当な他の任意の発現ベクター）中にクローニングするための制限部位も含む、重複オリゴヌクレオチドを構築することによって、ヒト化ＶＨおよびＶＬ構築体を新規に調製した。ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性（Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ−ＥＵ指標番号付与体系）を妨げることを目的として、ヒトγ１変異定常領域を含むＲｌｄ中にクローニングするために、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｐｅ Ｉ制限部位を導入して、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈシグナル配列を有するＶＨドメインを組み立てた。ヒトκ定常領域を含むＲｌｎ中にクローニングするために、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位を導入して、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈシグナル配列を有するＶＬドメインを組み立てた。
ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈシグナル配列：ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号３１）
ＣＤＲが表２に記載したＣＤＲである、ヒトＩｇＧ重鎖アミノ酸配列をコードするプラスミドを生成した。Quickchangeキット（Stratagene）を使用し、単一点突然変異Ｇ９５Ｍ（KABAT番号）を導入することによって、それらの既存の初期プラスミドから、ＣＤＲが表３に記載したＣＤＲである、ヒトＩｇＧ重鎖アミノ酸配列をコードするプラスミドを生成した。
下表は、対の全長（ＦＬ）重鎖配列のアミノ酸配列の唯一の相違が、可変領域のＣＤＲ Ｈ３中のＧ９５Ｍ（KABAT番号）の置換であったという意味で、プラスミドベクター中に作製されたのはどの全長重鎖タンパク質配列か、およびどの配列が対であったかを開示する。
［表８］
Figure 0005015949
次いで、それらの重鎖をコードするプラスミドを次の全長軽鎖配列：Ｌ１１ ＦＬ（配列番号３６）、Ｌ１３ ＦＬ（配列番号１７）、またはＬ１６ ＦＬ（配列番号１８）の一つと一緒に、ＣＨＯ細胞中に同時形質移入した（詳細については実施例２を参照）。
並行して、ＨｃＬｃと称するキメラ［２Ａ１０｛配列番号９および１０−２Ａ１０マウスのＶＨ（配列番号７）とＶＬ（配列番号８）およびヒトＩｇＧ定常領域を含む全長鎖｝のキメラである］を生成した。
実施例２
ＣＨＯ細胞での抗体発現
それぞれ重鎖および軽鎖をコードするＲｌｄおよびＲｌｎプラスミド（または哺乳動物細胞での使用に適当な他のベクター）をＣＨＯ細胞中に一過的に同時形質移入し、小規模または大規模で発現させて抗体を産生した。あるいは、電気穿孔法によって同じプラスミドをＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞中に同時形質移入し、ヌクレオシド不含培地（ＲｌｄはＤＨＦＲ遺伝子を含み、Ｒｌｎはネオマイシン選択マーカーを含む）を使用し、好適な抗体を発現する安定したポリクローナル細胞集団を選択した。いくつかのアッセイでは、組織培養上清から直接抗体を評価した。他のアッセイでは、プロテインＡセファロースによるアフィニティクロマトグラフィーによって、組換え抗体を回収し精製した。
実施例３
ヒト化抗ＮＯＧＯ抗体がＮＯＧＯと結合する
終夜４℃で、ＰＢＳ中０．０５〜１μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６（実施例５参照）をNunc Immunosorpプレートにコートした（１００μｌ／ウェル）。ウェルをＴＢＳ＋０．０５％ Tween（ＴＢＳＴ）で一回洗浄し、次いで非特異的結合部位をブロッキングするために、ＴＢＳＴ中２％ＢＳＡと共に室温で１時間インキュベートした。抗体をＴＢＳＴ＋２％ＢＳＡで１０μｇ／ｍｌに希釈し、これから１／２希釈を作製した。二つ組のウェルに抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで抗ヒトκペルオキシダーゼコンジュゲート（１：２０００）と共に１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで１００μｌ／ウェルのＯＰＤペルオキシダーゼ基質（Sigma）と共に１０分間インキュベートした。２５μｌの濃Ｈ２ＳＯ４を添加することによって呈色反応を停止させた。プレートリーダーを使用し４９０ｎｍでの光学密度を測定した。抗体を加えないウェルから読み取ったバックグラウンド値を差し引いた。
図１〜４は、ＥＬＩＳＡアッセイで、キメラ［ＨｃＬｃと称する、２Ａ１０のキメラ｛２Ａ１０マウスのＶＨ（配列番号７）およびＶＬ（配列番号８）と、ヒトＩｇＧ定常領域とを含む｝である］と比較して、ＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６とヒト化抗体の用量依存的結合を図示する（詳細については実施例５を参照）。Ｙ軸は、ウェルに捕獲された抗体の定量測定であり、４９０ｎｍで測定した光学密度（ＯＤ）を示す。Ｘ軸は、各データ点でのウェル当たりの使用抗体濃度（ｍｃｇ／ｍｌ）を示す。
図１〜４で使用した抗体物質は、ポリクローナル発現系または大規模一過的形質移入によって得られた精製抗体である。これらの事例では、ＩｇＧレベルは、ＥＬＩＳＡおよび光学密度によって定量した。
図１〜４に示す実験の結果は、Ｇ９５Ｍ変異の包含によって抗体の性能が改善されることを示している。ただ一つの例外は、極めて不首尾に実施された図３、４に示すＨ２７Ｌ１６である。本発明者らは、このデータは、Ｈ２７Ｌ１６アッセイで未確認の技術的問題から生じたと考えている。その他においては、Ｈ２７Ｌ１６は、他のアッセイ［図１と２に示すＥＬＩＳＡ、ならびにBIAcoreアッセイ（表９と１０）］で一貫して良好に実施されているからである。Ｈ２７Ｌ１６は、後の実験でも非常に良好に機能することも分かっている（図１１と１２を参照）。
実施例４
抗体定量プロトコル
Nunc Immunosorpプレートを２μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ鎖捕獲抗体（Sigma #I3382）を含む重炭酸塩緩衝液（Sigma #C3041）でコートし、４℃で終夜インキュベートした。プレートは、０．０５％ Tween 20（ＴＢＳＴ）を含むＴＢＳで２回洗浄し、２％（または１〜３％）ＢＳＡ（ブロッキング緩衝液）を含むＴＢＳＴ２００μｌにより室温で１時間ブロッキングした。プレートをＴＢＳＴで２回洗浄した。抗体を含む組織培養上清を２倍希釈ステップによりブロッキング緩衝液までプレート全体に渡って滴定し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート抗体Ｈ２３（ヤギ抗ヒトκ鎖、Sigma #A7164）をＴＢＳＴに１：２０００で希釈し、１００μｌを各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌのFast-OPD基質（Sigma #P9187）で発色させた。ＥＬＩＳＡを２５μｌの３Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた後、５〜１０分間放置して発色させた。プレートの吸光度を４９０ｎＭで読み取り、検量線を参照することによって抗体濃度を定量した。
実施例５
ＮＯＧＯ−Ａフラグメント（ＮＯＧＯ−Ａ５６、配列番号３２）の生成
ｐＧＥＸ−６Ｐ１のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に、ヒトＮＯＧＯ−Ａのアミノ酸５８６−７８５をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ＧＳＴ−ヒト−ＮＯＧＯ−Ａ５６と名付けたＧＳＴタグ付き融合タンパク質を生成することによって、ヒトＮＯＧＯ−Ａのアミノ酸５８６−７８５とＧＳＴタグを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号３２）を形成した。０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて３７℃で３時間誘導後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加した２ＸＴＹ培地でＢＬ２１細胞中にプラスミドを発現させた。超音波処理して細胞ペレットを溶解し、製造業者の使用説明書に従い、グルタチオン−セファロース（Amersham Pharmacia）を使用し融合タンパク質を精製した。精製したタンパク質を還元グルタチオンを使用して溶出し、ＰＢＳに対して徹底的に透析し、ＢＳＡ基準液とBioRad社クーマシーを基にしたタンパク質アッセイを使用して定量し、次いで−８０℃にてアリコートを貯蔵した。
実施例６
ヒト化抗ＮＯＧＯモノクローナル抗体のBiaCore分析
Biacore 3000バイオセンサーまたはBIAcore T100を使用し、抗ＮＯＧＯモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と、組換えによって発現したＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａとの結合キネティクスを分析した。ｈＮＯＧＯ−Ａチップは、以下のように調製した。
方法
目的とする固定レベル用に設計したBiacore Wizardプログラムを使用し、一級アミン結合によって、ＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６をＣＭ５チップに固定化した。５０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）と２００ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボニド（carbonide）（ＥＤＣ）の溶液を通すことによって、ＣＭ５センサーの表面を活性化させた。次いで、ＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６を含む酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０またはｐＨ４．５）をチップ上に流し固定化した。固定化完了後、依然として活性化しているどんなエステルも、１Ｍエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ８．５）を注入することによってブロッキングした。
BIAcore 3000には、ＨＢＳ−ＥＰ［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．００５％Ｐ−２０界面活性剤］で、またはT100の場合には、ＨＢＳ−ＥＰ＋［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％Ｐ−２０界面活性剤］で抗ＮＯＧＯ ｍＡｂを希釈し、所定の抗体濃度範囲で結合研究を実施した。全てのランは、ブランクのセンサー表面（先に記載したように活性化しブロッキングしたものであり、リガンドは不含）を基準とした。BIAcore 3000用BIAevaluationキネティック分析ソフトウェアバージョン４．１およびT100キネティック分析ソフトウェアバージョン１．０を使用し結合分析を実施した。本発明の他の抗体のBiacore分析は、本質的に、本明細書に記載したのと同じプロトコルに従った。特に明記しない限り、BIAcore実験は、２５℃で実施した。
以下の結果の章では、各データ表は、個々の実験から得られた結果を表す。
結果−表９
［表９］
Figure 0005015949
結果−表１０
［表１０］
Figure 0005015949
結果−表１１
［表１１］
Figure 0005015949
実施例７
オフ率ランキングを使用する、ヒト化抗ＮＯＧＯモノクローナル抗体のBiaCore分析
キネティック分析用にＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６チップを調製した。細胞上清は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過的形質移入物から直接採取した。これらをセンサー表面に直接流し相互作用を測定した。偽形質移入細胞上清は、組織培地によるどんな人工産物も除去するために、ダブルリファレンスで使用した。全てのランは、ブランクのセンサー表面（先に記載したように活性化しブロッキングしたものであるがリガンドは不含）を基準とした。BIAevaluationキネティック分析ソフトウェアバージョン４．１を使用し結合についての分析を実施した。
実施例８
ペプチドマッピング
ＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６ドメイン（配列番号３２）のＮＯＧＯ−Ａ５６部分にかかる４７の重複ペプチドを（MimotopeTMから）得た。それらのペプチドは、Ｃ末端にＧＳＧ−ビオサイチンタグを有する第１ペプチドを除いて、１２個のアミノ酸が隣接ペプチドと重複する（各ペプチドは、Ｎ末端ビオチン−ＳＧＳＧ配列をさらに含む）１６アミノ酸長である。２Ａ１０とＨ２８Ｌ１６の結合部位をエピトープマッピングするために、それらのペプチドを使用した。
エピトープマッピングの方法
Nunc immunosorpプレートに、ストレプトアビジンを５μｇ／ｍｌ含む無菌水を３７℃で終夜コーティングした（１００μｌ／ウェル）。０．０５％ Tweenを含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でプレートを３回漱ぎ、次いで３％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで終夜４℃でブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、約１０μｇ／ｍｌの濃度のペプチド（３％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈）をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで３％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで５μｇ／ｍｌに希釈した抗ＮＯＧＯ抗体と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで抗ヒトまたは抗マウスκペルオキシダーゼコンジュゲート（１：１０００、３％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈）と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで１００μｌ／ウェルのＯＰＤペルオキシダーゼ基質（Sigma）と共に１０分間インキュベートした。３モルのＨ２ＳＯ４を５０μｌ添加して、呈色反応を停止させた。プレートリーダーを使用し４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
図５（Ｈ２８Ｌ１６を使用するエピトープマッピング）、図６（２Ａ１０を使用するエピトープマッピング）に結果を示す。図５および図６は、それぞれ２Ａ１０およびＨ２８Ｌ１６のエピトープマッピングの結果を示す。表示のデータは、２Ａ１０およびＨ２８Ｌ１６が、ペプチド６および７に結合することを示す。それらのペプチドのＮＯＧＯ特異的部分を、それぞれ、配列番号７３および配列番号７４に示すが、そのどちらも、配列ＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮを含む。これらの結果は、ＶＬＰＤＩＶＭＥＡＰＬＮ（配列番号６０）が２Ａ１０とＨ２８Ｌ１６の結合エピトープを含むことを示している。
実施例９
ＣＤＲ Ｈ３のＧ９５Ｍ変異を含むＨｃＬｃとＨｃＬｃとの比較
Quikchangeキット（Stratagene）を使用し、単一点突然変異Ｇ９５Ｍ（KABAT番号）を導入することによって、既存の発現プラスミドからＨｃＬｃの改変変異体を構築した。可変重鎖ドメインＨｃ（Ｇ９５Ｍ）タンパク質のタンパク質配列を配列番号５９に示す。
既に記載した通り、Ｈｃ（Ｇ９５Ｍ）ＬｃはＣＨＯ細胞で発現した。実施例４に記載したように抗体を定量した。図７および図８には、ヒトＮＯＧＯ−Ａ結合ＥＬＩＳＡを使用し定量した、Nunc immunosorpプレートにＮＯＧＯを０．０５μｇ／ｍｌで（図７）、および１μｇ／ｍｌで（図８）コーティングしたときのＨｃ（Ｇ９５Ｍ）ＬｃとＨｃＬｃとの結合活性の比較を示す。下表は、Ｈｃ（Ｇ９５Ｍ）ＬｃとＨｃＬｃの結合親和性の比較を示す。
表１２ 一実験に基づくBiacoreランキングによって測定したオフ率
［表１２］
Figure 0005015949
これらデータは、ＣＤＲ Ｈ３中のＧ９５Ｍ置換が、ヒト化抗体（Ｈ６Ｌ１３）のみならず、マウスドナー抗体２Ａ１０（ＨｃＬｃ）の結合活性も増大させることを示している。
実施例１０
ＣＤＲ Ｈ３中に置換を含むＮＯＧＯ抗体の構築および試験
ＣＤＲ Ｈ３中に含まれた残基中の単一点突然変異、または先行するロイシンの単一点突然変異によって、９０個の重鎖可変領域のパネルを作製した。具体的には、重鎖可変領域をコードするように、（Ｈ６ＦＬ、配列番号１５をベースとする）重鎖をコードするベクターを作製したが、その際、［Quikchangeキット（Stratagene）を使用し］ＣＤＲ Ｈ３中の各アミノ酸残基および先行するロイシンを、システインを除く他の全ての自然発生のアミノ酸に置換し、軽鎖（Ｌ１３ＦＬ、配列番号１７）と一緒に発現させて９０個の異なる抗体を得た。ＮＯＧＯとの結合について、ＥＬＩＳＡおよびBiacore実験でこれらの抗体をアッセイした。
図９および図１０は、Ｈ６ＦＬ Ｌ１３ＦＬと比較したＨ６ＦＬの変異体の結合活性の比較を示す。表１４および表１５は、Biacoreによって測定したオフ率キネティクスの比較を示すが、Biacoreアッセイで測定可能なオフ率を有し、ＥＬＩＳＡでＨ６Ｌ１３に対して匹敵する結合活性を示す抗体の結果のみを示す。
［表１４］
Figure 0005015949
結論
結果から、マウス２Ａ１０と、ＧＱＧＹ含有抗体Ｈ６Ｌ１３とに結合特性を保持する抗体は、次のＣＤＲ Ｈ３を含むものであることが示される：ＲＱＧＹ、ＩＱＧＹ、ＭＱＧＹ、ＧＤＧＹ、ＧＩＧＹ、ＧＳＧＹ、ＧＱＮＹ、ＧＱＹＹ、ＧＱＳＹ、ＧＱＬＹ、ＧＱＦＹ、ＧＱＧＷ、ＷＱＧＹ、ＧＡＧＹ、ＧＬＧＹ、ＧＶＧＹ、ＧＱＷＹ。
実施例１１
ＧＱＧＹ含有ｍａｂ（Ｈ２０Ｌ１６）とＧ９５Ｍ変異体ｍａｂとの比較（Ｈ２７Ｌ１６およびＨ２８Ｌ１３およびＨ２８Ｌ１６）
上記のように表１５に示す抗体を製造した。
表１５−ヒト化２Ａ１０抗Ｎｏｇｏ−Ａ抗体の抗体全体（２×重鎖＋２×軽鎖）の復帰突然変異の総数。
［表１５］
Figure 0005015949
インビトロ結合特性
抗体に順位をつける試みでは、ＥＬＩＳＡ、リバースフォーマットＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、Biacoreを含む様々なアッセイおよびフローサイトメトリーで、それらの結合特性を調べた。
１１．１ ＥＬＩＳＡでの組換えヒトＮＯＧＯ−Ａとの結合
関連する様々のＥＬＩＳＡアッセイにより、組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ（ＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ５６）に結合する抗体の能力を調査した（実施例３に記載したプロトコルと関連するが、わずかに異なるプロトコルで実施した）。第１アッセイでは、様々の異なる抗原濃度で、プレートに組換えＮｏｇｏ−Ａを直接コーティングする。１ｍｃｇ／ｍｌまたは０．０５ｍｃｇ／ｍｌで抗原を添加した場合の直接結合ＥＬＩＳＡの結果を、それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。データから、全ての抗体は、その親抗体（ＨｃＬｃ）のキメラ形と比較したとき、匹敵する組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ結合活性を示すことを確認する。より高い抗原コーティング濃度では、全ての抗体のＥＣ５０値は類似する。それに反して、低い抗原コーティング濃度では、アッセイによって抗体を識別することができた。飽和曲線は得られなかったが、折れ線の傾向分析によって、次の順位序列：Ｈ２７Ｌ１６＞Ｈ２８Ｌ１６、Ｈ２８Ｌ１３、Ｈ２０Ｌ１６が判明した。
並列実験では、アッセイ構成を逆にした。この構成では、プレートに抗体を捕獲し、ＧＳＴタグを使用し、組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ（ＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ−５６）の結合を検出した。リバースフォーマットＥＬＩＳＡの結果を図１２に示す。データから、全ての抗体は、その親抗体（ＨｃＬｃ）のキメラ形と比較したとき、匹敵する組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ結合活性を示すことを確認する。この結合ＥＬＩＳＡ構成では、抗体は識別されなかった。

１１．２ 競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡを使用し、ヒトＮｏｇｏ−Ａの同じエピトープについて、その親抗体と直接競合する抗体の能力を評価した。組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ（ＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ５６）をプレートにコーティングした。プレートに添加する前に、親抗体２Ａ１０とヒト化抗体を事前に混合した。抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（Dakocytomation、#P0260）を使用し、２Ａ１０の結合を定量した。図１３に示す結果から、全４個の抗体が２Ａ１０と競合しうることを確認する。これは、ヒト化抗体および親抗体が、ヒトＮｏｇｏ−Ａの重複エピトープを認識することを示唆している。さらに、ヒト化抗体の活性は、キメラＨｃＬｃに匹敵し、またはそれよりも高い。結果は、Ｈ２７Ｌ１６、Ｈ２８Ｌ１６、およびＨ２８Ｌ１３が、Ｈ２０Ｌ１６よりも強力なことを示している。
１１．３ Biacore親和性測定
異なる２つの方法を使用して、親和性を定量し、抗体に順位をつけるためにBiacoreを利用した。第一の手法では、組換えＮｏｇｏ−Ａをチップ表面に結合し、抗Ｎｏｇｏ−Ａ抗体をこの表面に流した。第二の手法では、チップ表面に抗体を捕獲するためにプロテインＡを使用し、その上に組換えＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ５６を流した。表面に抗原を結合することによって表１６に示す結果が得られ、全４個の抗体が、その親抗体（ＨｃＬｃ）に匹敵する／それよりも高い親和性を示すことを確認する。６個の独立したランの平均に基づき、直接結合ＥＬＩＳＡ（図１１Ｂ）の順位序列と一致して、全体的親和性の点で抗体は次の順序：Ｈ２７Ｌ１６＞Ｈ２８Ｌ１６＞Ｈ２８Ｌ１３＞Ｈ２０Ｌ１６にランク付けされる。Ｈ２７Ｌ１６およびＨ２８Ｌ１６の場合には、ヒト化抗体によって、その親抗体（ＨｃＬｃ）よりも２〜３倍高い親和性が示される。
表１６−Biacore T100を使用し定量した、抗Ｎｏｇｏ−Ａヒト化抗体と、組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ（ＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ５６）との結合キネティクス。一級アミン結合によってＣＭ５チップに抗原を結合させた。様々な濃度（０．１２５〜８ｎＭ）で抗体をその上に流した。値は、二つ組で実施した６回の独立したランの平均および標準偏差（括弧）を示す。平均および標準偏差を計算する前に、終了したデータセットを独立に分析した。＊＊１セットは分析できなかったので、Ｈ２０Ｌ１６について分析した１１セットのデータのみ。
［表１６］
Figure 0005015949
ＥＬＩＳＡについても同様に、抗体と、組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ（ＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ５６）の結合キネティクスもリバースフォーマットで評価した（実施例１１．１を参照）。このアッセイでは、ヒト化抗体をプロテインＡによりＣＭ５チップ上に捕獲した。６回の独立したランの平均結果を表１７に示す。リバースフォーマットＥＬＩＳＡに一致して、リバースフォーマットBiacoreで、全てのヒト化Ｎｏｇｏ−Ａ抗体は、キメラ（ＨｃＬｃ）に対して類似する結合キネティクス示す。
表１７−Biacore T100を使用し定量した、組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ（ＧＳＴＮｏｇｏ−Ａ５＋６）に対する、抗Ｎｏｇｏ−Ａヒト化抗体のリバースフォーマット結合キネティクス。一級アミンによってプロテインＡを約４０００ＲＵｓ固定し、試料抗体２００〜３００ＲＵｓを捕獲するために使用した。組換えヒトＮｏｇｏ−Ａを様々な濃度（０．１２５〜８ｎＭ）でその上に流した。値は、独立した３回の二つ組ランの平均および標準偏差（括弧）を示す。平均および標準偏差を計算する前に、各データセットを独立に分析した。
［表１７］
Figure 0005015949
１１．４ 天然ヒトＮＯＧＯへの結合
その親抗体に匹敵するプロフィールを有する天然ヒトＮｏｇｏ−Ａに、ヒト化抗体が結合することを実証するために、フローサイトメトリーに基づく２つのアッセイが開発された。第１アッセイでは、細胞表面にヒトＮｏｇｏ−Ａ細胞外ドメインを発現するＣＨＯ−Ｋ１をベースとした細胞系を生成した。ＰＥ標識した抗ヒトＩｇＧ（Sigma, #P8047）を使用して、フローサイトメトリーにより、ヒト化抗Ｎｏｇｏ−Ａ抗体の結合を評価した。下図１４は、ＣＨＯ−Ｎｏｇｏ−Ａ細胞系での抗Ｎｏｇｏ−Ａ抗体の典型的プロフィールを示す。アッセイは、抗体を識別するのに十分な感受性があるとはいえないが、結果から、キメラのレベルに匹敵するレベルで、全４個の抗体は、細胞表面に発現したヒトＮｏｇｏ−Ａを認識できることを確認する。親細胞系を認識する抗体はない（ＣＨＯ−Ｋ１−データ非掲示）。
第２のアッセイでは、ヒト神経芽細胞腫細胞系−ＩＭＲ３２を使用し、天然のＮｏｇｏ−Ａと結合するヒト化抗体の能力を評価した。この細胞系は、Ｎｏｇｏ−Ａタンパク質の高細胞内レベル／低細胞表面レベルによって特徴付けられる。結合シグナルを増大させる試みでは、細胞内Ｎｏｇｏ−Ａ（ＥＲ−常在性）を検出するようにアッセイを設定した。ＩＭＲ３２細胞を透過処理し、固定した後、抗Ｎｏｇｏ−Ａヒト化抗体で染色した。抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ標識した二次抗体（Sigma, #P8047）を使用し、抗体とＮｏｇｏ−Ａの結合を検出した。下図１５に示す結果から、全ての抗体は、その親抗体ＨｃＬｃに匹敵するレベル、またはそれより高いレベルで細胞内Ｎｏｇｏ−Ａに結合することを確認する。ＣＨＯ−Ｎｏｇｏ−Ａ細胞系の結果と合わせて、これらのデータから、ヒト化抗体は、キメラＨｃＬｃに匹敵するレベル、またはそれより高いレベルで、Ｎｏｇｏ−Ａタンパク質のより天然形を認識できることを確認する。アッセイは、抗体パネルを順位付けするのに十分な感受性ではない。
１１．５ 神経突起伸張アッセイ
既に記載した神経突起伸張（ＮＯ）の定量に基づくアッセイで、Ｎｏｇｏ−Ａの神経突起伸張（ＮＯ）阻害活性を中和する能力について、ヒト化抗Ｎｏｇｏ−Ａ抗体を試験した。Ｎｏｇｏ−Ａに対する結合キネティクスを基準として、アッセイで試験する抗体を選択した。Ｎｏｇｏ−Ａの中和について、高親和性ヒト化抗体、すなわち、Ｈ２８Ｌ１６、Ｈ２７Ｌ１６、Ｈ２０Ｌ１６、および基準用にそれらの親抗体２Ａ１０（マウスモノクローナル）とＨｃＬｃ（ヒトマウスキメラ）を試験した。アッセイでは比較用に抗体１１Ｃ７（実施例１３を参照）も試験した。
選択したヒト化抗体の中和活性を試験をするために、ヒト組換えＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ５６でウェルをコーティングし、様々な濃度の抗体で３７℃で１時間処理した後、小脳顆粒状ニューロン（ＣＧＮ：cerebellum granular neuron）を加えた。対照ウェルをＨＢＳＳで処理した。各ウェルごとに、神経突起一本当たりの平均神経突起長を測定した。図１６に、アッセイで試験したヒト化抗体の結果を示す。対照抗体パネル（対照ＩｇＧ、精製したマウスＩｇＧ；Campathおよび無関係な別のヒト化抗体）を使用して、活性の特異性を確認した。別の対照として、ＧＳＴをコーティングしたプレート上に同じヒト化抗体を滴定した。結果から、Ｈ２８Ｌ１６、Ｈ２７Ｌ１６、およびＨ２０Ｌ１６が、その親抗体（２Ａ１０およびＨｃＬｃ）で観察されたのと類似する程度で、Ｎｏｇｏ−Ａが媒介する神経突起伸長の阻害を逆転させることを確認する。効果は確実であり安定しているように見え、そしてＨ２８Ｌ１６により、独立した１１回の神経突起伸張実験のうち８回で効果が見られた。それに反して、ヒト化抗体ではＧＳＴをコーティングしたプレートで神経突起伸張は増大することなく、対照抗体パネルでは用量依存性阻害逆転がまったく見られず、ヒト化抗体の効果は、Ｎｏｇｏ−Ａが媒介する阻害に特異的であることを確認する。神経突起伸張で得られたデータは、数回の反復実験から選択される。示していない数回の反復は天然で変化すると思われるが、示したデータは、神経突起伸長アッセイでＮＯＧＯの阻害効果を低減し、本発明の抗体の真の活性を反映していると考えられる。
実施例１２
Ｈ２８Ｌ１６のさらなる特徴づけ
１２．１ 全長組換えＮｏｇｏ−Ａとの結合
全長細胞外ドメイン組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ（ＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ−ＥＣＤ）に結合する抗体の能力を直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにより調査した。この場合は、ＥＣＤは、ヒトＮＯＧＯ Ａのおよそ位置１８６−１００４の領域［ＤＥＴＦＡＬ（配列番号９５）で開始しＥＬＳＫＴＳ（配列番号９６）で終了する部分］内に収まるスプライスバリアントであった。
プレートに、組換えＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ−ＥＣＤを１μｇ／ｍｌで直接コーティングした。図１７に示すデータから、Ｈ２８Ｌ１６が、親（ＨｃＬｃ）またはＨ２０Ｌ１６に匹敵するレベル、またはそれより高いレベルでＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ−ＥＣＤを認識できることを確認する。
１２．２ Ｆｃ機能の阻害
候補の安全プロフィールを改善するために、重鎖定常領域（ＥＵ指標系）のＣＨ２ドメイン中の残基Ｌ２３５とＧ２３７をアラニン残基に変異し、それによって抗体媒介免疫学的エフェクター機能を誘発する尤度を低減させた。低減したヒトＣ１ｑ結合は、Ｆｃ機能を阻害するために代用した。下図１８は、Ｈ２８Ｌ１６のＣ１ｑ結合活性が、Campath-IgG1（野生型）に比較して著しく低く、そして同じ変異（Ｆｃ−変異抗体（Ｆｃ−））を有するCampath IgG1構築体とCampath IgG4に匹敵することを示す。これらのデータは、Ｈ２８Ｌ１６中に存在するＣＨ２ドメイン変異が、Ｆｃ媒介エフェクター機能を誘発する尤度を著しく減少させることを示唆している。
１２．３ オルソログ結合
Ｎｏｇｏ−Ａの様々なオルソログに対するその親抗体（ＨｃＬｃ）の結合活性に匹敵する結合活性をＨ２８Ｌ１６が示すことを確認するために、一連の結合アッセイを実施した。下図１９Ａ〜Ｄに、それぞれ、ラット（配列番号９４）、カニクイザル（配列番号９２）、マーモセット（配列番号９３）およびリスザル（配列番号９１）から得た組換えＮＯＧＯ（ＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ５６）に対する直接結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。全ての場合において、Ｈ２８Ｌ１６は、キメラ抗体（ＨｃＬｃ）と匹敵する、またはそれより高い活性を示す。算出したＥＣ５０値は、ヒト組換えＮｏｇｏ−Ａとの結合で算出した値と非常によく似ている。
Biacoreを使用し、ＨｃＬｃおよび１１Ｃ７と比較して、Ｈ２８Ｌ１６とＮｏｇｏ−Ａの様々なオルソログとの結合キネティクスを定量した。下の表１８および表１９は、２つの異なるアッセイ構成での結合キネティクスを示す。ＣＭ５チップに組換えＮｏｇｏ−Ａを直接結合させた場合（表１８）、ラット、カニクイザル、リスザルおよびマーモセットの結合キネティクスは、ヒトの結合キネティクスと非常に類似する（範囲＝０．３３〜０．６７ｎＭ）。アッセイ構成を逆転し、プロテインＡを使用しチップに抗体を捕獲した場合（表１９）は、Ｈ２８Ｌ１６とラットＮｏｇｏ−Ａとの結合親和性は、ヒトＮｏｇｏ−Ａとの結合親和性の約４分の１である。類似の傾向が、カニクイザルＮｏｇｏ−Ａ（ヒトとの親和性の８．５分の１）および他の霊長類オルソログ（ヒトとの親和性の１２〜１７分の１）でも観察される。キメラ抗体ＨｃＬｃは、両方向のアッセイで、Ｎｏｇｏ−Ａオルソログに対して類似する結合プロフィールを示す。どのアッセイ構成が、インビボ状況を最もよく表すか分かっていないので、この研究から導き出すことができる当初の結論は、１）Ｈ２８Ｌ１６は、キメラ抗体ＨｃＬｃに関連するオルソログ交差反応性プロフィールを保持し、２）ラットおよびカニクイザルＮｏｇｏ−Ａに対するＨｃＬｃの親和性は、ヒトＮｏｇｏ−Ａに対する親和性の４倍以内および８．５倍以内であり、一定の条件下で非常に類似するであろう。
表１８−Biacore T100を使用し定量した、Ｈ２８Ｌ１６、１１Ｃ７、およびＨｃＬｃと、ヒトＮｏｇｏ−Ａの組換えオルソログとの結合キネティクス。一級アミン結合によって、ＣＭ５チップに、約１４０〜１８０ＲＵｓの様々なＮｏｇｏ−Ａオルソログを捕獲した。様々な濃度（０．１２５〜８ｎＭ）の抗体をその上に流した。値は、二つ組で実施した１〜２回の独立したランの平均および標準偏差（括弧）を示し、各データセットは、平均および標準偏差の計算をする前に独立に分析した。＊曲線の１セットを廃棄した。抗体１１Ｃ７の曲線が解釈不可能なためである。
［表１８］
Figure 0005015949
表１９−Biacore T100で定量した、Ｈ２８Ｌ１６、１１Ｃ７、およびＨｃＬｃと、ヒトＮｏｇｏ−Ａ組換えオルソログとのリバースフォーマット結合キネティクス。プロテインＡを表面に約４０００ＲＵｓで固定し、抗Ｎｏｇｏ−Ａ抗体を約３００〜４００ＲＵｓ捕獲した。その上に、構築体に依存して様々な濃度（０．１２５〜６４ｎＭ）で組換えタンパク質（ＧＳＴ−ＮＯＧＯ−Ａ５６）を流した。全てランは二つ組で行った。値は、独立した１〜３回のランの平均および標準偏差（括弧）を示すが、各ランは二つ組で行い、各データセットは、平均および標準偏差を計算する前に独立に分析した。
［表１９］
Figure 0005015949
１２．４ 物性
Ｈ２８Ｌ１６とＨ２０Ｌ１６の物理化学的特性は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、１００ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．８）、およびＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ×ｌ ３０ｃｍ×７．８ｍｍステンレススチールカラムを使用し、１．０ｍｌ／分で実施し、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍで検出した。４〜２０％ Novex Tris−ＨＣＬゲルに、生成物１０μｇを添加してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施しSypro Rubyで染色した。Beckman MDQでｐＨ３．５−１０のアンフォラインを使用し、Ｃ−ＩＥＦを実施した。
以下の結果を得た：
表２０−抗Ｎｏｇｏ−Ａ抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣ分析。示した値は、異なる３種のそれぞれに割り当てられた抗体の％割合である。
［表２０］
Figure 0005015949
表２１−抗Ｎｏｇｏ−Ａ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。示した値は、主要なバンドで見られた抗体の％割合である。
［表２１］
Figure 0005015949
ＳＥＣ−ＨＰＬＣデータは、Ｈ２０Ｌ１６は、Ｈ２８Ｌ１６（Ｈ２８Ｌ１６）よりも凝集への感受性が高いことを示唆する。本明細書で報告するデータが、大規模においても反復されたならば、これは、臨床使用に許容される質の物質（＞９５％モノマー）を生成する製造工程の能力に影響を及ぼしかねない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータは、両候補が、どちらも典型的プロフィールを示して許容可能であることを示す。
実施例１３
Ｈ２８Ｌ１６と１１Ｃ７の比較
１１Ｃ７と名付けられたマウス抗Ｎｏｇｏ−Ａ抗体は、国際公開公報第２００４０５２９３２号に記載されており、これはペプチドエピトープに対して誘発された。国際公開公報第２００４０５２９３２号に提供された配列情報に基づいて、キメラ１１Ｃ７を作製した。２Ａ１０と１１Ｃ７との結合エピトープを比較するために、１１Ｃ７および２Ａ１０が、Ｎｏｇｏ−Ａの重複エピトープを認識した場合は、競合ＥＬＩＳＡを確立して調査する。下図２０に示すように、ＨｃＬｃ（２Ａ１０のキメラ形）は、ヒト組換えＮｏｇｏ−Ａとの結合を求めて、２Ａ１０と競合できるが、１１Ｃ７は、１００ｍｃｇ／ｍｌまでの濃度であっても２Ａ１０との競合を示さなかった。
実施例１４
ＮＯＧＯ Ｈ２８Ｌ１６との結合においてヒトＮＯＧＯ−５＋６と直接競合するペプチドの能力を実証するための競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡの方法
競合ＥＬＩＳＡを使用し、ＮＯＧＯ Ｈ２８Ｌ１６との結合において、ＮＯＧＯ−Ａ（ＧＳＴ−ヒトＮｏｇｏ−Ａ５６）と直接競合するペプチド能力を評価した。Nunc immunosorpプレートに、ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Sigma, #I-9764）を５ｇ／ｍｌ含む重炭酸塩緩衝液を終夜４℃でコーティングした（１００μｌ／ウェル）。０．０５％ Tweenを含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）でプレートを３回漱ぎ、次いで１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで室温で１時間ブロッキングした。次いで、プレート（１μｇ／ｍｌ、１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで希釈したもの、５０μｌ／ウェル）にＨ２８Ｌ１６を室温で１時間捕獲した。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。ペプチド（０〜１００ｇ／ｍｌ）および濃度１μｇ／ｍｌ（１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで希釈）のＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６を事前に混合した後、ウェルに加えて室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、次いでウサギ抗ＧＳＴペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma, #A7340、１：２０００、１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで希釈）と共に１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで５０μｌ／ウェルのＯＰＤペルオキシダーゼ基質（Sigma）と共に１０分間インキュベートした。２５μｌの濃Ｈ２ＳＯ４を加えて呈色反応を停止させた。プレートリーダーを使用し４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
図２１に示す結果から、エピトープマッピングＥＬＩＳＡ（実施例８）で陽性であったペプチド６および７が、Ｈ２８Ｌ１６に結合するＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６と競合できることを確認する。これは、エピトープマッピング研究で陽性であったペプチドが、Ｈ２８Ｌ１６に結合するエピトープを含むことを示唆している。提案するエピトープを含まないペプチド１６および１７（ＮＯＧＯペプチドを含むが、ペプチド６または７とは重複しない）は、ＮＯＧＯ−５＋６とは競合しない。
実施例１５
ＮＯＧＯ抗体変異体Ｇ１０１Ｓ／Ｑ３７Ｒをベースとするヒト化抗ＮＯＧＯモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ分析
上記のように、ＣＤＲ Ｈ３に単一置換Ｇ１０１Ｓ（KABAT番号）を導入することによって、Ｈ６（配列番号１１）の重鎖可変領域の改変変異体であるＧ１０１Ｓ［Ｈ１００（配列番号６３）としても知られている］を生成した。同様に、（Ｌ１００を形成するために）フレームワーク領域に単一置換（KABAT番号Ｑ３７Ｒ）を導入することによって、Ｌ１３（配列番号１３）の軽鎖可変領域の改変変異体であるＱ３７Ｒを生成した。可変軽鎖ドメインＱ３７Ｒのタンパク質配列を配列番号６７に示す。
既に記載したように、Ｇ１０１Ｓ／Ｑ３７Ｒ置換を含む重鎖および軽鎖の全長をコードする遺伝子をＣＨＯ細胞で発現させ、既に記載したように直接結合ＥＬＩＳＡでアッセイした。
抗原を０．０５μｇ／ｍｌで添加した直接結合ＥＬＩＳＡの結果を図２２に示す。データから、抗体Ｈ１００Ｌ１００は、Ｈ２７Ｌ１６と比較したとき、組換えＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６に対して匹敵する結合活性を示し、かつＨ６Ｌ１３と比較した場合、Ｈ１００Ｌ１００の結合プロフィールが改善されることを確認する。対応するＥＣ５０値を下表に示す。
表２２：Ｈ６Ｌ１３およびＨ２７Ｌ１６と比較した、Ｇ１０１Ｓ／Ｑ３７Ｒ変異体のＥＣ５０の測定
［表２２］
Figure 0005015949
実施例１６
ＣＤＲ Ｈ３変異体Ｇ１０１Ｓをベースとするヒト化抗ＮＯＧＯモノクローナル抗体のBiaCore分析
単一置換Ｇ１０１Ｓ（KABAT番号）をＣＤＲ Ｈ３中に導入することによって、Ｈ６（配列番号１１）の重鎖可変領域の改変変異体であるＨ１００を生成した。その可変重鎖ドメインＨ１００タンパク質のタンパク質配列を配列番号６３に示す。同様に、単一置換（それぞれ、KABAT番号Ｑ３７ＲおよびＱ４５Ｒ）をそのフレームワーク領域に導入することによって、Ｌ１３（配列番号１３）の軽鎖可変領域の改変変異体であるＬ１００およびＬ１０１を生成した。可変軽鎖ドメインのＬ１００およびＬ１０１タンパク質のタンパク質配列を、それぞれ、配列番号６７および配列番号６８に示す。
既に記載したように、ＣＨＯ細胞でＨ１００Ｌ１００およびＨ１００Ｌ１０１の全長が発現した。表２３は、Ｈ６Ｌ１３と、Ｈ１００Ｌ１００およびＨ１００Ｌ１０１との結合親和性の比較を示し、そしてＨ１００Ｌ１００およびＨ１００Ｌ１０１の結合親和性が、Ｈ６Ｌ１３と比較して改善していることを示す。この例では、本質的に、実施例６に記載した方法を実施し、その方法では、ＮＨＳとＥＤＣの溶液を５μｌ／ｍｌで７分間チップ上に流すことによってＣＭ５チップを活性化させ、ＮＯＧＯを１０ｎＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に懸濁させてからチップ上に流した。
表２３−Ｈ６Ｌ１３と比較して、Ｌ１３可変軽鎖変異体と組み合せた、Ｈ６可変重鎖のＧ１０１Ｓ変異体のBiacore測定。
［表２３］
Figure 0005015949
ＮＯＧＯ抗体配列の概要（表２４）
［表２４］
Figure 0005015949
Figure 0005015949
配列
配列番号１：２Ａ１０ ＣＤＲ−Ｈ１
SYWMH
配列番号２：２Ａ１０ ＣＤＲ−Ｈ２
NINPSNGGTNYNEKFKS
配列番号３：２Ａ１０ ＣＤＲ−Ｈ３
GQGY
配列番号４：２Ａ１０ ＣＤＲ−Ｌ１
RSSKSLLYKDGKTYLN
配列番号５：２Ａ１０ ＣＤＲ−Ｌ２
LMSTRAS
配列番号６：２Ａ１０ ＣＤＲ−Ｌ３
QQLVEYPLT
配列番号７：２Ａ１０，ＶＨ（マウス）
QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQGYWGQGTTLTVSS
配列番号８：２Ａ１０，ＶＬ（マウス）
DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGAGTKLELK
配列番号９：キメラ重鎖Ｈｃ
MGWSCIILFLVAAATGVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１０：キメラ軽鎖Ｌｃ
MRCSLQFLGVLMFWISGVSGDIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１１：２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ６
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSS
配列番号１２ ２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ１６
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSS
配列番号１３：２Ａ１０ ＶＬヒト化構築体Ｌ１３
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
配列番号１４：２Ａ１０ ＶＬヒト化構築体Ｌ１６
DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
配列番号１５：２Ａ１０ 重鎖ヒト化構築体Ｈ６
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１６：２Ａ１０ 重鎖ヒト化構築体Ｈ１６
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１７：２Ａ１０ 軽鎖ヒト化構築体Ｌ１３
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１８：２Ａ１０ 軽鎖ヒト化構築体Ｌ１６
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１９：２Ａ１０，ＶＨ（マウス）配列番号７をコードするＰＮ
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
配列番号２０：２Ａ１０，ＶＬ（マウス）配列番号８をコードするＰＮ
GATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
配列番号２１：キメラ重鎖Ｈｃ配列番号９をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAGCAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号２２：キメラ軽鎖Ｌｃ配列番号１０をコードするＰＮ
ATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTTCTGGATCTCTGGAGTCAGTGGGGATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号２３：２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ６配列番号１１をコードするＰＮ
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号２４：２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ１６配列番号１２をコードするＰＮ
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号２５：２Ａ１０ ＶＬヒト化構築体Ｌ１３配列番号１３をコードするＰＮ
GATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
配列番号２６：２Ａ１０ ＶＬヒト化構築体Ｌ１６配列番号１４をコードするＰＮ
GATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCAACCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGTCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
配列番号２７：２Ａ１０ 重鎖ヒト化構築体Ｈ６配列番号１５をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号２８：２Ａ１０ 重鎖ヒト化構築体Ｈ１６配列番号１６をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号２９：２Ａ１０ 軽鎖ヒト化構築体Ｌ１３配列番号１７をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号３０：２Ａ１０ 軽鎖ヒト化構築体Ｌ１６配列番号１８をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCCAACCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGTCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTCCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号３１：Campathリーダー配列
MGWSCIILFLVATATGVHS
配列番号３２：GSTに融合させたヒトＮＯＧＯ Ａ（NOGO−Ａ５６）アミノ酸５８６-７８５
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSMQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSSSPLEASSVNYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPAPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMLVKESLTETSFESMIEYENKELERPHRD
配列番号３３：２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ１
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSS
配列番号３４：２Ａ１０ ＶＬヒト化構築体Ｌ１１
DIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
配列番号３５：２Ａ１０ 重鎖ヒト化構築体Ｈ１
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号３６：２Ａ１０ 軽鎖ヒト化構築体Ｌ１１
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号３７：２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ１配列番号３３をコードするＰＮ
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号３８：２Ａ１０ ＶＬヒト化構築体Ｌ１１配列番号３４をコードするＰＮ
GATATTGTGATAACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
配列番号３９：２Ａ１０ヒト化重鎖H１配列番号３５をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号４０：２Ａ１０ヒト化軽鎖構築体L１１配列番号３６をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATAACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
配列番号４１：２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ２０
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSS
配列番号４２：２Ａ１０ 重鎖ヒト化構築体Ｈ２０
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号４３：２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ２０配列番号４１をコードするＰＮ
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号４４：２Ａ１０ 重鎖ヒト化構築体Ｈ２０配列番号４２をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号４５：２Ａ１０ ＣＤＲ−Ｈ３ （Ｇ９５Ｍ）
MQGY
配列番号４６：マーモセットNOGO−Ａフラグメントのアミノ酸配列
VQDSLCPVAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASAVQPSSSPLEASSVNFESVKHEPENPPPYEEAMNVSRKKVSGIKEEIKEPESINAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPDFSSYSEMAKVEQPLPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKETLTETSFESMIEHENK
配列番号４７：ＶＨヒト化構築体Ｈ２６
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS
配列番号４８：ＶＨヒト化構築体Ｈ２７
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS
配列番号４９：ＶＨヒト化構築体Ｈ２８
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS
配列番号５０：ＶＨヒト化構築体Ｈ２６配列番号４７をコードするＰＮ
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号５１：ＶＨヒト化構築体Ｈ２７配列番号４８をコードするＰＮ
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号５２：ＶＨヒト化構築体Ｈ２８配列番号４９をコードするＰＮ
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCA
配列番号５３：重鎖ヒト化構築体Ｈ２６
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
配列番号５４：重鎖ヒト化構築体Ｈ２７
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号５５：重鎖ヒト化構築体Ｈ２８
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号５６：重鎖ヒト化構築体Ｈ２６配列番号５３をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号５７：重鎖ヒト化構築体Ｈ２７配列番号５４をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAACAGCGACCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAAGCCACCCTCACCGTCGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号５８：重鎖ヒト化構築体Ｈ２８配列番号５５をコードするＰＮ
ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATCGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGATGCAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号５９：重鎖Ｈｃ（Ｇ９５Ｍ）
MGWSCIILFLVAAATGVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号６０：エピトープ
VLPDIVMEAPLN
配列番号６１：２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ９９
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS
配列番号６２：ＣＤＲ Ｈ３
GQSY
配列番号６３：ＶＨヒト化構築体Ｈ１００
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSRATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS
配列番号６４：ＶＨヒト化構築体Ｈ１０１
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS
配列番号６５：ＶＨヒト化構築体Ｈ１０２
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCELGQSYWGQGTLVTVSS
配列番号６６ ２Ａ１０ ＶＨヒト化構築体Ｈ９８
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELMQGYWGQGTLVTVSS
配列番号６７
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
配列番号６８
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
配列番号６９
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
配列番号７０
DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
配列番号７１
DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
配列番号７２
DIVMTQSPLSNPVTLGQPVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFRQRPGQSPRLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK
配列番号７３
TPSPVLPDIVMEAPLN
配列番号７４
VLPDIVMEAPLNSAVP
配列番号７５
RQGY
配列番号７６
IQGY
配列番号７７
GDGY
配列番号７８
GIGY
配列番号７９
GSGY
配列番号８０
GQNY
配列番号８１
GQYY
配列番号８２
GQLY
配列番号８３
GQFY
配列番号８４
GQGW
配列番号８５
YESIKHEPENPPPYEE
配列番号８６
WQGY
配列番号８７
GAGY
配列番号８８
GLGY
配列番号８９
GVGY
配列番号９０
GQWY
配列番号９１
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSMQESLYPVAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAVASAVQPSLSPLEASSVNYESVKHEPENPPPYEEAMNVSLKKVSGIKEEIKEPESIKAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPDFSNYSEMAKVEQPLPDHSEIVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKENLTETSFESMIEHENKLERPHRD
配列番号９２
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSKMDLVQTSEVMQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASAVQPSSSPLEASSVNYESIIHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPESINAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVMLVKENLPETSFESMIEHENKEKLSALPPEGGSSGRIVTD
配列番号９３
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSVQDSLCPVAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASAVQPSSSPLEASSVNFESVKHEPENPPPYEEAMNVSRKKVSGIKEEIKEPESINAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPTPDFSSYSEMAKVEQPLPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDEAVILVKETLTETSFESMIEHENKLERPHRD
配列番号９４
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSIQESLYPTAQLCPSFEEAEATPSPVLPDIVMEAPLNSLLPSAGASVVQPSVSPLEAPPPVSYDSIKLEPENPPPYEEAMNVALKALGTKEGIKEPESFNAAVQETEAPYISIACDLIKETKLSTEPSPDFSNYSEIAKFEKSVPEHAELVEDSSPESEPVDLFSDDSIPEVPQTQEEAVMLMKESLTEVSETVAQHKEERL
配列番号９５
DETFAL
配列番号９６
ELSKTS
ＥＬＩＳＡアッセイで、キメラ［ＨｃＬｃと称する、２Ａ１０のキメラ｛２Ａ１０マウスのＶＨ（配列番号７）およびＶＬ（配列番号８）と、ヒトＩｇＧ定常領域とを含む｝である］と比較して、ＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６とヒト化抗体の用量依存的結合を示す図である。 ＥＬＩＳＡアッセイで、キメラ［ＨｃＬｃと称する、２Ａ１０のキメラ｛２Ａ１０マウスのＶＨ（配列番号７）およびＶＬ（配列番号８）と、ヒトＩｇＧ定常領域とを含む｝である］と比較して、ＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６とヒト化抗体の用量依存的結合を示す図である。 ＥＬＩＳＡアッセイで、キメラ［ＨｃＬｃと称する、２Ａ１０のキメラ｛２Ａ１０マウスのＶＨ（配列番号７）およびＶＬ（配列番号８）と、ヒトＩｇＧ定常領域とを含む｝である］と比較して、ＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６とヒト化抗体の用量依存的結合を示す図である。 ＥＬＩＳＡアッセイで、キメラ［ＨｃＬｃと称する、２Ａ１０のキメラ｛２Ａ１０マウスのＶＨ（配列番号７）およびＶＬ（配列番号８）と、ヒトＩｇＧ定常領域とを含む｝である］と比較して、ＧＳＴ−ヒトＮＯＧＯ−Ａ５６とヒト化抗体の用量依存的結合を示す図である。 ２Ａ１０のエピトープマッピングの結果を示す図である。 Ｈ２８Ｌ１６のエピトープマッピングの結果を示す図である。 図７は、ヒトＮＯＧＯ−Ａ結合ＥＬＩＳＡを使用し定量した、Nunc immunosorpプレートにＮＯＧＯを０．０５μｇ／ｍｌでコートしたときのＨｃ（Ｇ９５Ｍ）ＬｃとＨｃＬｃとの結合活性の比較を示す図である。 図８は、ヒトＮＯＧＯ−Ａ結合ＥＬＩＳＡを使用し定量した、Nunc immunosorpプレートにＮＯＧＯを１μｇ／ｍｌでコートしたときのＨｃ（Ｇ９５Ｍ）ＬｃとＨｃＬｃとの結合活性の比較を示す図である。 Ｈ６ＦＬ Ｌ１３ＦＬと比較したＨ６ＦＬ変異体の結合活性の比較を示す図である。 Ｈ６ＦＬ Ｌ１３ＦＬと比較したＨ６ＦＬ変異体の結合活性の比較を示す図である。 予備候補プール抗体と、組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ（ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−Ａ ５＋６）との直接結合ＥＬＩＳＡを示す図である。 予備候補プール抗体と、組換えヒトＮｏｇｏ−Ａ（ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−Ａ ５＋６）とのリバースフォーマット結合ＥＬＩＳＡ示す図である。 親抗体２Ａ１０と予備候補プール抗体との競合ＥＬＩＳＡを示す図である。 抗Ｎｏｇｏ−Ａヒト化抗体と、細胞表面に発現したヒトＮｏｇｏ−Ａとの結合を示す図である。 抗Ｎｏｇｏ−Ａヒト化抗体と細胞内ヒトＮｏｇｏ−Ａとの結合を示す図である。 神経突起伸長アッセイでの抗Ｎｏｇｏ−Ａヒト化抗体の比較を示す図である。 Ｈ２８Ｌ１６と組換え全長ヒトＮｏｇｏ−Ａスプライス（ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−Ａ−Biocat 113015）との直接結合ＥＬＩＳＡを示す図である。 Ｈ２８Ｌ１６のＣ１ｑ結合活性が、Campath-IgG1（野生型）に比較して著しく低く、そして同じ変異（Ｆｃ−変異抗体（Ｆｃ−））を有するCampath IgG1構築体とCampath IgG4に匹敵することを示す図である。 Ｈ２８Ｌ１６、ＨｃＬｃ、および１１Ｃ７と、Ａ）ラットＢ）カニクイザル、Ｃ）マーモセット、およびＤ）リスザルのＧＳＴ−ＮＯＧＯ−Ａ５６との直接結合ＥＬＩＳＡを示す図である。 Ｈ２８Ｌ１６と１１Ｃ７の結合エピトープを比較するための競合ＥＬＩＳＡを示す図である。 ＮＯＧＯ−５＋６（ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−Ａ ５＋６）およびペプチドフラグメントと、Ｈ２８Ｌ１６との結合を比較するための競合ＥＬＩＳＡを示す図である。 Ｈ６Ｌ１３とＨ２７Ｌ１６とを比較したＧ１０１Ｓ／Ｑ３７Ｒ変異体のＥＬＩＳＡデータを示す図である。

Claims (11)

  1. 配列番号４９のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含むヒトＮＯＧＯ−Ａに結合することができる、単離した抗体またはそのフラグメント。
  2. 配列番号５５のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１８のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の単離した抗体。
  3. 請求項１または２に記載の単離した抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  4. 請求項３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  5. 軽鎖をコードする第一のベクターおよび重鎖をコードする第二のベクターを含む、請求項４に記載の宿主細胞。
  6. ヒトＮＯＧＯ−Ａに結合することができる抗体の製造方法であって、該方法が以下：配列番号４９のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする第一のポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする第二のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に形質移入する工程；ならびに該宿主細胞を、宿主細胞より培地への抗体の分泌を促す条件下にて培養する工程、を含む、上記方法。
  7. 分泌された抗体を培地より回収する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
  8. 第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドが単一の発現ベクター中に含まれている、請求項６または７に記載の方法。
  9. 製薬上許容される希釈剤または担体と共に、請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、医薬組成物。
  10. 脳卒中および他の神経系疾患／疾病を治療しまたは予防する薬物、あるいは中枢もしくは末梢神経系への物理的外傷を患う患者を治療する薬物の調製における、請求項１または２に記載の抗ＮＯＧＯ抗体またはそのフラグメントの使用。
  11. 脳卒中および他の神経系疾患／疾病を治療しまたは予防するための、あるいは中枢もしくは末梢神経系への物理的外傷を患う患者を治療するための、請求項１または２に記載の抗ＮＯＧＯ抗体。
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