JP5014116B2 - ポリペプチドの精製 - Google Patents
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Description
関連出願
この出願は、2004年3月11日に出願された米国仮出願番号第60/552678号に基づく米国特許法第119条の優先権を主張するものであり、出典明示によりその内容がここに取り込まれる。
本発明は、大腸菌に対して異種性のポリペプチドを産生するための方法に関する。より具体的には、本発明は有機リン酸塩を用いてそのポリペプチドの回収率を改善することに関する。
分子生物学の深い理解と微生物の遺伝的操作性の容易さによって、大腸菌による異種タンパク質の発現は、研究及び産業の両方で非常に意味のあるものであった。一般的に、誘導性プロモータ(例えばアルカリホスファターゼプロモータ、tacプロモータ、アラビノースプロモータなど)は、異種タンパク質発現の調節のために使用される。誘導現象の必要条件により、研究者が標的タンパク質の発現のタイミングを操ることができる。この能力は、宿主が高濃度でも十分な耐性がない異種タンパク質にとって重要である。発現の誘導の前に望ましい細胞密度にすることによって、所望のタンパク質の容積効率は最大になりうる。
本願明細書における本発明では、大腸菌内での異種性のポリペプチドの発現を改良する方法が提供される。野生型glpT遺伝子を有するものと有さないもの、及び野生型phoA遺伝子を有するものと有さないもの、例えば(ugp+ΔglpT phoA-)大腸菌などの、様々な大腸菌宿主にα-グリセロリン酸のような輸送可能な有機リン酸塩を与えると、振とうフラスコ及び10L-発酵糟スケールでの異種タンパク質の発現の改良が見られ、より大きなスケール、例えば10000Lでも同様に実行されると思われる。異種タンパク質の発現のために、tac、T7又はAPプロモータのような誘導性プロモータを含む様々なプロモータを使用した複数のモデル系にわたって産物回収率の利点が観察された。更なる利点は、産物が活性増殖期の早期、すなわち、別の方法より短時間で得られるということである。ある種の実施態様では、より多くの産物は活性増殖期の早期に得られ、有意に生産性が改善されうる。
定義
本明細書で使用する「ポリペプチド」とは、約10より多いアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を指す。「異種の」ポリペプチドは、大腸菌によって産生されるヒトタンパク質のような、利用される宿主細胞にとって外来のポリペプチドである。ポリペプチドは原核生物のものでも真核生物のものでもよいが、好ましくは真核生物のものであり、より好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトのものである。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのDNAに作用可能に結合されている;プロモーターは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている;又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「活性増殖期」とは、細胞が活動的に成長しており、細胞が静止期にあるなどの非常に栄養制限されていない培養工程の時期を指す。
本発明は大腸菌に対して異種性のポリペプチドを産生する方法を提供する。この方法では、ポリペプチドをコードする核酸を含む大腸菌細胞は、核酸を発現するように輸送可能な有機リン酸塩を培養液に供給しながら培養液中で培養される。次いでポリペプチドは細胞から回収される。細胞質、周辺質又は細胞の培養液から回収されてよい。任意の好適な容器で培養してもよく、振とうフラスコ又は発酵糟が好ましく、より発酵糟が好ましい。
培養パラメータを用いて、ポリペプチド産生を従来法、以下に記載する手順で管理してもよい。
核酸が対象のポリペプチドをコードするならば、対象のポリペプチドをコードする核酸は、任意のソースに由来するRNA、cDNA、又はゲノムDNAが適当である。大腸菌で、異種性のポリペプチド(その変異体を含む)の発現に適切な核酸の選択方法は周知である。
モノクローナル抗体を産生する場合、モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましいソースとして役に立つ。一度単離されると、DNAは発現ベクター中に配置され、次いで、微生物宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を行うためにここで示す細菌宿主細胞へ形質転換させる。抗体をコードするDNAの細菌中での組換体発現に関する総説には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)及びPluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)が含まれる。
ヒト化抗体又は親和性成熟抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、免疫結合体を調製するために一又は複数の標的薬剤(類)と随意に結合している抗体断片、例えばFabであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は無傷抗体、例えば無傷IgG1抗体であってもよい。
さらに、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収され、二重特異的抗体を形成するために化学的にカップリングされ得る(Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992))。
ポリペプチド変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、これらに限られないが、天然源からの単離(天然発生アミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、又は該ポリペプチドの初期調製された変異体又は非変異体種のカセット突然変異誘発を含む。
エフェクター機能に関する本発明の抗体を修飾することは、例えばFcレセプター結合性を増強するために、望ましい。このことは、抗体のFc領域に一又は複数のアミノ酸置換を導入することで達成される。あるいは、又は付加的にシステイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。
ここでは、抗体の他の修飾が考慮される。例えば、抗体は種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合してもよい。
異種の核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、適切なプロモーターのコントロールの下、大腸菌中における発現のための複製可能なベクターへ適切に挿入される。多くのベクターは、かかる目的のために利用可能であり、適当なベクターの選択は、主として挿入されるべき核酸のサイズ、及びベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、それが適合する特定の宿主細胞に依存する種々の成分を含む。特定の宿主タイプに依存し、一般にベクター成分には、限定はしないが、以下の一又は複数が含まれる:シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、プロモーター、及び転写終結配列。
ここで対象となるポリペプチドをコードするDNAは、直接発現されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟ポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合体としても産生される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、又はベクターに挿入されたポリペプチドコードDNAの一部であってもよい。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。
天然又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識しない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換できる。
発現ベクターは、一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は様々な細菌に対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大腸菌などの大部分のグラム陰性細菌に好適である。
通常、発現ベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は、培地中で生存できない。この選択可能マーカーは、この発明で利用され、定義されるような遺伝学的マーカーとは区別される。典型的な選択遺伝子は、(a)例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質又はその他の毒素に耐性を付与し、(b)遺伝学的マーカーの存在によって誘導される欠陥以外の栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバチラス菌に対する遺伝子コードD-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
対象のポリペプチドを産生するための発現ベクターは、大腸菌によって認識され、対象のポリペプチドをコードする核酸と作用可能に連結される適切なプロモーターを含む。大腸菌宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系(Chang等, Nature, 275:615 (1978); Goeddel等, Nature, 281:544 (1979))、アラビノースプロモータシステム(Guzman等, J. Bacteriol., 174:7716-7728 (1992))、アルカリホスファターゼ、T7プロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776)、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター(deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))を含む。しかし、他の既知の細菌性プロモーターも適当である。それらのヌクレオチド配列は公表されており、それにより、任意の必要な制限酵素サイトを供給するためのリンカー又はアダプターを用いて、当業者は対象のポリペプチドをコードするDNAにそれらを作用可能に連結する(Siebenlist等, Cell, 20:269 (1980))ことが可能となる。
また、細菌のシステムで使用されるプロモーターも、通常、対象のポリペプチドをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガルノ(S.D.)配列を有する。該プロモーターは、制限酵素による切断により細菌由来のDNAから取り外すことができ、所望のDNAを含むベクター中へ挿入することができる。
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はDNA断片を切断させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
構築されたプラスミド中において正しい配列であることを確認する解析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌K12菌株294(ATCC31446)又は他の株を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、成功した形質転換細胞を選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により解析し、及び/又はSanger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)又はMessing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)の方法により、又はMaxam等, Methods in Enzymology, 65:499(1980)の方法により配列決定を行った。
本明細書中の発現プラスミドの親宿主として好適な大腸菌宿主には、大腸菌W3110(ATCC27,325)、大腸菌294(ATCC31,446)、大腸菌B、及び大腸菌X1776(ATCC31,537)が含まれる。これらの例は制限ではなく例示を目的としている。上述の菌株のうちいずれかの突然変異細胞もまた、開始宿主として使用することができ、この開始宿主はその後変異して、本発明で必要とされる少なくとも最少の遺伝子型を含む。大腸菌株W3110は、組換えDNA産物の発酵に広く用いられる宿主株であるので、好ましい親大腸菌宿主である。親宿主として使用される開始大腸菌宿主の例を、その遺伝子型と共に、下記の表に示す。
ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞へ挿入する。好ましくは、宿主細胞を上述の発現ベクターで形質転換し、種々のプロモーターを誘導するのに適するように変更された通常の栄養培地中で培養することにより達成される。
対象のポリペプチドを生産するのに使用される大腸菌細胞は、一般的に上掲のSambrook等に記載の好適な培地中で培養される。温度、pHなどの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞に以前用いたものであり、通常の当業者に明らかであろう。
細胞は培養液に輸送可能な有機リン酸塩、例として、グリセロリン酸塩、例えばα-グリセロリン酸及び/又はβ-グリセロリン酸、そして、特にグリセロール-2-リン酸塩及び/又はグリセロール-3-リン酸塩を供給しながら培養される。振とうフラスコ又は発酵槽、好ましくは発酵槽において培養されてもよい。ポリペプチドは、細胞質、周辺質又は細胞の培養液から回収されるのが好ましい。
遺伝子の発現は、ポリペプチドをコードする配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来のmRNAの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980))、ドットブロット法(RNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識が使用され、最も一般的なものは、放射性同位体、特に32Pである。しかしながら、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン修飾ヌクレオチドを用いるなど、他の技術も使用してよい。次いで、ビオチンはアビジンまたは抗体と結合するための部位として機能し、広範な種々の標識、例えば放射性核種、蛍光、酵素などで標識されてよい。あるいは、タンパク質の検出のためにアッセイ又はゲルが用いられてもよい。
単独で又は組合せて行われる以下の手順は、適切な精製の手順の例であり、ポリペプチドのタイプに応じて特定の方法を使用する。それらは、免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈降、逆相HPLC、疎水性相互作用クロマトグラフィー、シリカ上のクロマトグラフィー、イオン交換樹脂、例としてS-SEPHAROSETM及びDEAE上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニウム沈降法、及び例えばSEPHADEXTMG-75培地を用いたゲル濾過である。モノクローナル抗体は従来の抗体精製手法、例えばプロテインA-SEPHAROSETM培地、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、透析又は親和性クロマトグラフィによって培養物から単離してもよい。
ラマ抗体断片(重鎖)及びApoLの産生のための振とうフラスコ培養へのG3Pの供給
基礎環境
低リン酸塩培養液(CRAP)あるいは高リン酸塩培養液(THCD)の200mM G3P(終濃度)混合液を、振とうフラスコ培養物中の異種タンパク質の発現についてそれぞれの対照添加液(水)と比較した。この実施例の第一部では、標的異種タンパク質は13kDラマ抗HCGラクダ科モノボディ(monobody)である。ラクダ科抗体は2種、モノボディ(monobody)と称する軽鎖を欠損した2つの軽鎖及び1つの重鎖IgG分子と2つの重鎖から成る標準的なIgG分子を有することが既に示されている。ラクダ科モノボディは、低リン酸塩培養液(CRAP)又は高リン酸塩培養液(THCD)の何れかにおいてtacプロモータを用いてBL21(大腸菌B株)によって発現される。抗体断片コード化配列の前のmalE結合タンパク質シグナル配列は、宿主の周辺質内に発現タンパク質を分泌させる。この実施例の第二部では、G3P添加培地及び無添加CRAP培地中でT7プロモータを用いてHMS174(大腸菌K12株)内でのApo2リガンドの発現を制御した。所望の細胞密度に達するとすぐに、両方の実験で異種タンパク質の産生をIPTGの添加によって誘発した。
pCB36624 86.RIGプラスミド構築
pCB36624_86.RIGは、ベクターpL1602(Sidhu等, J. Mol. Biol., 296:487-495 (2000))を修飾することによって構築した。pTacプロモータ配列及びmalE分泌シグナル配列を有するベクターpS1602は、ファージmuの遺伝子-3微量コートタンパク質(p3)のC末端ドメインに融合したヒト成長ホルモンの1つの配列を含有した。hGHをコードする配列は除去され、結果として生じるベクター配列はラマ抗HCG抗体をコードする合成DNA断片の挿入のためのベクター主鎖として機能した(Spinelli等, Nat. Struct. Biol. 3(9): 752-757 (1996))。結果として生じるファジミド(pCB36624)は、IPTG誘導可能なPtacプロモータの管理下で融合産物をコードした(Amman及びBrosius, Gene, 40: 183-190 (1985))。発現されるポリペプチドには、マルトース-結合タンパク質シグナルペプチド、その後に抗HCGコード領域が続き、FLAGエピトープタグが続き、抑圧停止コドンを含有するGly/Serリッチリンカーペプチドが続き、その後にP3C(ファージコートタンパク質のC末端ドメイン)が含まれる。
NNS17: GCC GTC TAT ACT TGT GGT GCT GGT NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGG GGT CAG GGT (配列番号:3)
5'-GATGTTCAGT TGCAGGAATC AGGCGGTGGC TTGGTACAGG CCGGAGGTTC GTTGCGTTTG TCCTGTGCTG CCTCGGGTGC TACTGGTTCT ACTTATGATA TGGGCTGGTT TCGTCAGGCT CCGGGTAAAG AACGTGAATC GGTTGCCGCC ATTAACTGGG GGTCGGCTGG GACTTACTAT GCTTCGTCCG TCCGTGGTCG TTTTACTATT TCACGTGATA ATGCCAAAAA AACTGTCTAT TTGCAGATGA ATTCATTGAA ACCAGAAGAT ACTGCCGTCT ATACTTGTGG TGCTGGTAGG ATCGGCCGGT CGGTCTTCAA CTTGAGGAGG GAGAGCTGGG TCACGTGGTG GGGTCAGGGT ACCCAGGTCA CTGTCTCCTC TGCCGGTGGT ATGGATTATA AAGATGATGA TGATAAA-3' (配列番号: 5)。
標準的な分子生物学的技術を用いて、Apo2Lコドン114-281をヒト胎盤cDNAから単離した完全長Apo2Lクローンからポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。クローニングを容易にするために制限酵素部位を含有する付加的ヌクレオチドを5'及び3'配列にそれぞれ付加した。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列
5’ GCTTGCTACATATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGA 3’ (配列番号:6)
を有し、下線で示すNdeI制限酵素部位を含有する。3'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列
5’ CTTGAATAGGATCCCTATTAGCCAACTAAAAAGGCCCCAAAA AAACTGGC 3’ (配列番号:7)
を有し、下線で示すBamHI制限酵素部位を含有する。結果として生じた断片を制限酵素部位NdeIとBamHIを用いて、修飾したバキュロウイルス発現ベクターpVL1392(Pharmingen)のHis10タグを含有する配列とエンテロキナーゼ切断部位の下流とフレーム内にサブクローニングした(Pitti等, J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1997))。pVL1392-Apo2LをNdeIとBamHIを用いて消化し、生成されたNdeIからBamHIの断片をpET-19b(Novagen)内にサブクローニングして、NdeIとBamHIにて消化した。その結果生じたプラスミドをpet19b.nohisと命名した。
BL21(Stratagene)及びHMS174(Merck)の受容細胞をそれぞれpCB36624_86.RIG及びpet19b.nohisにより、標準的方法を用いて形質転換した。形質転換体は、50μg/mLカルベニシリン(LB+CARB50TMカルベニシリン)を含有するLBプレート上で生育させた後に回収し、素早く精製し、30℃の恒温器中で50μg/mL CARB50TMカルベニシリンを有するLB培養液中で生育させた。pCB36624_86.RIGは、産生宿主BL21/pCB36624_86.RIGに、pet19b.nohisはHMS174/pet19b.nohisにカルベニシリン耐性を与え、抗生物質存在下で形質転換した宿主を生育させた。
低リン酸塩(CRAP)培養液及び高リン酸塩(THCD)培養液を用いてラマ抗体断片及びApo2リガンド産生を評価した。培地組成物(初期の培地のリットル当たり利用される各々の成分の量)を以下に示す:
200mMのG3P-添加培地を調製するために、5mlの1M DL-α-グリセロリン酸塩(G3P)(Sigma Chem. Co.)を、接種の前に、50μg/mlのカルベニシリンを含む低PO4培地(低PO4培地+CARB50TMカルベニシリン)又は50μg/mlのカルベニシリンを含む高PO4培地(高PO4培地+CARB50TMカルベニシリン)20mlに加えた。無添加の(対照)培地は、G3Pの代わりに5mlの水を用いた。
振とうフラスコ発酵は、対照又はG3P-添加培地を25ml含有する125mlの整流装置上のフラスコにて行った。LB+CARB50TMカルベニシリン中でのBL21/pCB36624_86.RIG又はHMS174/pet19b.nohis生育の終夜培養物を対照又はG3P-添加培地への接種のためにおよそ1:100に逆希釈した。培養物は250回転数/分で振とう装置上で30℃で暖め、細胞密度が培地で担保される潜在的細胞発育のおよそ50−60%に達するときに、1mMのIPTGを添加することによって産物発現を誘発した。誘導因子の添加の直前と接種後およそ24時間に1mlの培養液培養物から取り出した細胞ペレットを調整し、−20℃で保存した。
1mlの培養物試料から調製した凍結(−20℃)細胞ペレットを解凍し、10mM トリス, pH7.6+1mM EDTA, pH8.0(TE)の十分量に再懸濁して細胞懸濁液を1OD/25μl濃度にした。25μlのTE-細胞懸濁液を、25μlのβ-メルカプトエタノールを含有する2Xサンプルバッファと混合した。混合液を95℃より高い温度で5分間熱し、10μl(0.2ODと等量)をNU-PAGETM成形10%Bis-トリスゲル(Novex)上のウェルに流した。電気泳動は、MES緩衝液(1N NaOHなどにより適当なpHに調整した脱イオン化水中の2-(N-モルホリノ)エタンスルホニック酸)にて行った。分析されたゲルを、COOMASSIE BLUE R250TM染色液で染色してから、脱色した。13kD抗体断片のバンド強度は、コダック画像処理システムで湿性ゲルをスキャンした後にコダックDIGITAL SCIENCE 1DTM画像処理ソフトウェアを用いて測定した。
1mlの培養物試料から調製した凍結(−20℃)細胞ペレットを、十分量のTE緩衝液に再懸濁して細胞懸濁液を1OD/25μl濃度にした。20μlの細胞懸濁液を、480μlの6M グアニジンHCl, pH9.0+100mM ジチオトレイトール(DTT)と混合し、1時間室温にてインキュベートし、13,000回転数/分で15分間遠心分離して、上清/抽出物を回収した。抽出物を、MILLIPORETMスピンフィルタにて濾過し、20μlを逆相クロマトグラフィのためにHPLCカラム(PerSeptive Biosystems POROSR R1/10培地)に流した。80℃で1.0ml/分で移動相に流してHPLC分離を行い、混入タンパク質からApo2Lを分離するために20分にわたって0.1%のTFAを含む28%〜35%勾配のアセトニトリルを用いた。280nm波長でピークを検出した。試料に存在する単量体の量は、同じ方法によって分析される5−20μgの精製標準物質に関するピークの下で領域から得られる平均応答因子(mAU/μg)を用いて算出した。
図1は、対照に対して200mMのG3Pを添加した高PO4(THCD)培地と低PO4(CRAP)培地の両方において抗体が高レベルに発現されたことを示す。
図2は、対照に対して200mMのG3Pを添加した低PO4(CRAP)培地においてApo2Lタンパク質が高レベルに発現されたことを示す。
アルカリンホスファターゼプロモーターにより制御されるIGF-Iの産生のための野生型宿主又は(ΔglpT phoA- ugp+)宿主細胞の10L発酵培養物へのG3Pの供給
材料と方法
IGF-Iの発現のためのpBKIGF-2Bプラスミド
米国特許第5,342,763号において詳述されるように、本願明細書においてIGF-Iの発現のために用いるプラスミドpBKIGF-2を構築した。このプラスミドはpBR322の基本的な主鎖から構築した。大腸菌のIGF-I遺伝子の発現に必要な転写及び翻訳配列は、アルカリホスファターゼプロモータ及びtrpシャイン‐ダルガーノ配列によって提供された。転写終末因子に対するラムダを、IGF-I終止コドンに隣接させた。lamBシグナル配列によって細胞質からのタンパク質の分泌を意図した。大多数のrhIGF-Iは、細胞細胞膜周辺腔に見られた。プラスミドpBKIGF-2Bは形質転換宿主にテトラサイクリン耐性を与えた。
IGF-I発酵に用いられる宿主は大腸菌W3110の派生物である (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁)。野生型glpTを有する宿主に関する実験は43E7菌株(大腸菌W3110 fhuA(tonA)Δ(argF-lac)ptr3 degP41ΔompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+phoA)を用いて行い、ΔglpT突然変異を有する宿主に関する実験は43F6菌株(大腸菌W3110 fhuA(tonA)Δ(argF-lac)ptr3 degP41ΔompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+phoAΔglpT)を用いて行った。43E7又は43F6のコンピテント細胞は、標準的方法を用いてpBKIGF-2Bを形質転換した。形質転換体は、20μg/mLテトラサイクリン(LB+TET20TMテトラサイクリン)を含有するLBプレート上で生育した後に回収し、すぐに精製して、37℃の振とう/恒温器中で20μg/mL TET20TMテトラサイクリンを含有するLB培養液中で生育させた後に発酵糟中で試験した。pBKIGF-2Bによって、産生宿主にテトラサイクリン耐性が生じ、形質転換宿主は抗生物質存在下でも成長し得る。
IGF-Iの発現に用いられる発酵培養液組成及び動作手順は、米国特許第5,342,763号に記載されるIGF-I方法で用いられるものと多少類似していた。簡単に言うと、43E7/pBKIGF-2又は43F6/pBKIGF-2の振とうフラスコ種培養物を豊富な産生培養液に植えた。培養液の組成物(初期培地のリットル当たり利用される各々の成分の量)を以下に示す:
G3P供給の有無によるΔglpT突然変異の影響をIGF-I蓄積の違いによって評価した。6M グアニジン+100mM DTTに溶解した試料のIGF-Iの総量を、米国特許第6,559,122号にて詳述されるように、逆相HPLC法で測定した。
図3は、野生型宿主(43E7)でAPプロモータを有し連続的にグルコースを与えたものでG3Pを培養液に与えたものは、与えなかったものよりIGF-Iの分泌量が顕著に高かったことを示す。
図4は、ΔglpT宿主(43F6)及びAPプロモータを有するもので、培養液におよそ8リットル当たり1.18mmol/時又は3.28mmol/時でG3Pを与えたものは、G3Pを与えなかったものよりIGF-Iの分泌量が顕著に高かったが、およそ8リットル当たり8.22mmol/時でG3Pを与えたものはそれほど高くなかった。産物、有機リン酸塩のタイプなどに応じて当分野の技術者は最適な流加速度を容易に測定可能である。記載された発酵方法、IGF-I産生のための10L発酵糟での培養の条件下では、最適なG3P流加速度があり、それはおよそ8ないし10リットル当たり好ましくは約1ないし約7mmol/時の範囲、より好ましくは約1ないし約6mmol/時、より好ましくは約2ないし約6mmol/時、さらにより好ましくは約2ないし約5mmol/時、最も好ましくは約3ないし約4mmol/時である。 この流加速度の範囲のものは対照に対して産生物の量は増加しなかったが、対照と比較して産生の持続時間が延長した。
10L法におけるApo2リガンド蓄積の改良のためのグリセロ-3-リン酸塩の供給
Apo2リガンドの基礎環境
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)(Wiley等, Immunity, 3: 673-682 (1995))とも称するアポトーシス誘発リガンド2(Apo2L)(Pitti等, J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1996))は、タイプII膜タンパク質及びリガンドのTNFファミリのメンバーである。Apo2L/TRAILは、同系の死レセプターに結合することによって、多種多様な癌細胞においてアポトーシスを誘導するがほとんどの正常細胞では誘導しない。(国際公報99/00423;Ashkenazi, FASEB J., 13: (7) A1336 (April 23, 1999);Ashkenazi, Nature Reviews - Cancer, 2: 420-430 (2002))。アミノ酸残基114-281に対応するApo2リガンドの細胞外ドメインの可溶性断片(以降はApo2L/TRAILと称する))は、現在潜在的臨床研究の調査中にあり、大腸菌においてうまく発現された。
発現ベクターは、およそ19.5kDaのポリペプチドの産生を制御するようにアルカリホスファターゼ(AP)プロモータをコード化している。リボソームから放出された発現された新生ポリペプチドは細胞質中で単量体に折り畳まれ、さらに集積して生物学的に活性なホモ三量体になる。発酵の間、方法パラメータは、細胞活性がおよそ3.0mmole/L-分の最大酸素摂取速度で行われるように設定した。培養液を回収した後、細胞質にとどまっている異種タンパク質は物理的な細胞破壊によって回復されうる細胞溶解物内に放出される。
pAPApo2-P2RUプラスミド構築
pAPApo2-P2RUは、2001年1月4日公開の国際公報01/00832に記載される。簡単に言うと、図5に示すコンストラクトのプラスミドは、Apo-2L(アミノ酸残基114-281)とpro2及びargUによってコードされるまれなコドンtRNAとの共発現をコード化する、この共発現はアルカリホスファターゼプロモータによって制御される。pBR322ベースのプラスミド(Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43:77-90 (1978)) であるpAPApo2-P2RUを用いて、大腸菌内でApo-2Lを産生された。プラスミドphGH1について記載のあるように (Chang等, Gene, 55:189-196 (1987))、Apo-2Lの発現に必要な転写及び翻訳配列はアルカリホスファターゼプロモータ及びtrpシャイン‐ダルガーノ配列によって提供される。Apo-2Lのコード配列(114-281に由来)は、プロモータとシャイン‐ダルガーノ配列の下流に位置し、開始メチオニンの後にある。コード配列は、コードするコドンが潜在的な二次構造を取り除くために残基Pro119が「CCT」の代わりに「CCG」に変化されていること以外は、Apo-2Lの残基114-281をコードするヌクレオチド(図6に示す)を含む(図6、配列番号:1及び2はそれぞれヌクレオチド配列及びアミノ酸配列)。転写終末因子に対するラムダをコードする配列(Scholtissek等, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987))を、Apo-2Lコード配列に続けた。
43E7菌株(大腸菌W3110 fhuA(tonA)phoAΔ(argF−lac)ptr3 degP ompT ilvG+))を野生型産生宿主として用いて、43F6、Apo2リガンドの発現のためのglpT突然変異宿主及びまれなコドンtRNAと比較した。43E7又は43F6のコンピテント細胞を調製し、標準的方法を用いてpAPApo2-P2RUにて形質転換した。形質転換体は、20μg/mlのテトラサイクリン(LB+Tet20)を含有するLBプレートから回収し、すぐに精製して、30℃の振とう/恒温器中で20μg/mlのテトラサイクリンを含有するLB培養液において生育させて、DMSO中で−80℃で保存した。
振とうフラスコの種菌は、4−6mM リン酸ナトリウムを含有する無菌のLB培養液に新たに解凍した保存培養物バイアルを接種することによって調製した。適当な抗生物質を培養液に含ませて選択性を与え、プラスミドの保有を確認した。フラスコ培養物は、およそ30℃(28℃−32℃)で14−18時間、浸透しながらインキュベートした。次いで、この培養物を産生用発酵容器に播種した。播種容量は、培養液の初期容積の0.1%と10%の間とした。
回収するまでおよそ34−45時間発酵を行った。
発酵工程後の培養液試料を用いた。細胞密度を20OD550に希釈した発酵液試料の1ミリリットルから遠心分離によって細胞を回収し、結果として生じた細胞ペレットを分析時まで−20℃に保存した。細胞ペレットを解凍して、0.5mlの抽出緩衝液(50mM HEPES, pH8.0、50mM EDTA及び0.2mg/ml 雌鶏卵白リゾチーム)中に再懸濁し、細胞質から産生物を放出させるために機械的に粉砕した。固形物を遠心分離によって細胞溶解物から取り除いて、浄化した溶解物を三量体定量化のためにHPLCカラム(DIONEX PROPACTM IEX培養液)に流した。HPLCアッセイ法により、5%−22%の勾配を付けた1M NaClを含む25mM リン酸塩(pH7.5)緩衝液を0.5ml/分の流速で、25分にわたって用いて、混入している大腸菌タンパク質から産生物を分離した。
新鮮培養液又は予め凍結しておいたものと解凍した試料を用いて総単量体産生物を定量化した。20μlの試料を480μlの100mM DTTを含む6M グアニジン HCl, pH9.0に混合して、室温で1時間インキュベートして、13000rpmで15分間遠心分離して抽出物を回収した。抽出物をスピンフィルターに濾過して、逆相クロマトグラフィのために20μlをHPLCカラム(PerSeptive Biosystems POROS(登録商標) R1/10培養液)に流した。80℃で移動相を1.0ml/分で流し手HPLC分離を行い、混入したタンパク質からのApo2Lの分離のために20分間にわたって0.1%TFAを含む28%から35%のアセトニトリル勾配を用いた。280nm波長でピークを検出した。試料中に存在する単量体の量を、同じ方法で分析した5−20μgの精製標準物質に関するピークの下での領域の平均応答因子(mAU/μg)を用いて算出した。
図7は、ΔglpT宿主(43F6)への最適なG3P流加速度により特異的な産生物タイターが改善されたことを示す(グラフ中の特異的タイター、μg/OD-分で示す)。すべてのG3P供給試料は供給のない対照よりよい結果となった。この実験では、およそ8リットルの培養液を流加速度を6〜12mmol/時間から増やすと、特定の産生物タイターが改善されたが、12mmol/時から18mmol/時以上に流加速度を上げると、特定のタイターは低かった。最適なG3Pの流加速度により、産生物、有機リン酸塩のタイプなどに応じて当分野の技術者により容易に測定できるであろう。これら特異的条件下での、この特定の産生物であるApo2Lを産生させるための10L発酵糟での培養では、およそ8−10リットル当たりのG3Pの好適な流加速度は、好ましくは約4から約17mmol/時、より好ましくは約6から約16mmol/時間、より好ましくは約8から約15mmol/時間、最も好ましくは約10から約14mmol/時間の範囲である。
活性増殖期の間のAPプロモータ制御Apo2L産生物の発現
同じプラスミドコンストラクト、産生宿主菌株、培養液組成、発酵工程及び産生物アッセイ方法を、リン酸塩バッチング及びG3P添加を除いて実施例3にて説明したように用いた。対照工程の塩バッチングに一般的に含まれる一部の無機リン酸塩を、等量モルのG3Pに置換し、播種直後かあるいはバッチした無機リン酸塩がなくなる2、3時間前の何れかの時期に加えた。これらの例では、添加したG3Pは、添加後の重大な細胞発育期間でのリン酸塩の供与源であると思われた。
種菌調製手順は実施例3に記載される通りである。75%又は50%のリン酸塩塩類を初期バッチングから取り除き、播種後のバッチ添加として等量モルのG3Pに置き換えたことを除いては、表1に示す産生培養液中でApo2Lの産生を行った。標準的な手順に従って、およそ30℃(28℃−32℃)で発酵を行い、およそpH7.0(6.5−7.5)に調整した。空気飽和率及び撹拌速度は実施例3に記載される通りである。50%の無機リン酸塩をG3Pに置換する場合、無機リン酸塩は、培養液殺菌の前にバッチ処理したのに対して、グリセロール-3-リン酸塩はバッチ処理したリン酸塩が流れ出すと思われるおよそ1−2時間前(およそ30−40OD550)に置換した。75%の無機リン酸塩をG3Pに置換する場合、無機リン酸塩とG3Pを、発酵槽の播種の直後に加た。発酵工程の間、好気条件を確認しながら、コンピュータアルゴリズムに基づいて一次炭素供給源として細胞培養物にグルコースを与た。Znは、先の項にて説明したように、発酵プロセスの間に添加した。約34−45時間発酵させた。
図9は、50%−75%のPO4バッチを野生型宿主及びglpT突然変異宿主の両方でG3Pに置換した場合、活性増殖期の有意により早い時期に異種タンパク質発現の誘導が起こることを示し、特異的総蓄積曲線はG3P置換を行わなかった野生型宿主を用いて行った2通りの対照が示す曲線の左側にシフトした。これは、発酵工程中のより早い時期に産生物が得られるという点で利点があることを示す。
α-及びβ-グリセロリン酸塩の50/50混合物を用いたプロモータ制御Apo2L産生物の発現
61G1菌株(glpT突然変異宿主)を用いて供給源としてG3Pの代わりにα-及びβ-グリセロリン酸塩のおよそ50:50混合物のより低い等級物を用いること以外は、実施例3に記載のものと同じ手順で行った。
結果
図10は、混合物を用いてもより高い等級のG3P材料を用いても、供給なしの対照に対して同等の回収率の改善が得られたことを示す。α/β混合物の使用により生産結果を損なうことなく原料のコストを抑えることができるであろう。
Claims (30)
- 大腸菌に対して異種性のポリペプチドを産生し、且つ生産量を増大させる方法であって、
(a)輸送可能なグリセロリン酸を培養液に供給しながら培養液中でポリペプチドをコードする核酸を含む大腸菌細胞を培養し、核酸を発現させる工程、及び
(b)細胞からポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドの生産量を増大させる工程
を含む方法。 - グリセロリン酸がα-グリセロリン酸又はβ-グリセロリン酸、又はその混合物である、請求項1に記載の方法。
- グリセロリン酸がグリセロール-2-リン酸塩とグリセロール-3-リン酸塩の混合物であるか又はグリセロール-3-リン酸塩である、請求項2に記載の方法。
- 振とうフラスコ又は発酵槽において培養される、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- ポリペプチドが、細胞質、周辺質又は細胞の培養液から回収される、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 核酸の発現が誘導性プロモータによって調整される、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 誘導性プロモータがアルカリホスファターゼプロモータである、請求項6に記載の方法。
- 誘導性プロモータがtacプロモータである、請求項6に記載の方法。
- 誘導性プロモータがT7プロモータである、請求項6に記載の方法。
- 核酸の発現が培養工程の活発な増殖期の間に発生する、請求項6から9の何れか一項に記載の方法。
- 大腸菌が染色体性phoAを欠損している、請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- 大腸菌が染色体性glpTに関して野生型である、請求項1から11の何れか一項に記載の方法。
- 大腸菌が染色体性glpTを欠損している、請求項1から11の何れか一項に記載の方法。
- 大腸菌が染色体性phoA及びglpTを欠損している、請求項1から11及び13の何れか一項に記載の方法。
- 大腸菌が染色体性ugpを欠損していない、請求項14に記載の方法。
- ポリペプチドが真核生物ポリペプチドである、請求項1から15の何れか一項に記載の方法。
- ポリペプチドが哺乳類のポリペプチドである、請求項1から16の何れか一項に記載の方法。
- ポリペプチドがインスリン様成長因子-1である、請求項1から17の何れか一項に記載の方法。
- グリセロリン酸の流加速度が8から10リットルにつき1から7mmol/時間であり、10リットル発酵糟で培養される、請求項18に記載の方法。
- グリセロリン酸の流加速度が8から10リットルにつき2から6mmol/時間である、請求項19に記載の方法。
- グリセロリン酸の流加速度が8から10リットルにつき3から4mmol/時間である、請求項20に記載の方法。
- ポリペプチドがApo2Lである、請求項1から17の何れか一項に記載の方法。
- グリセロリン酸の流加速度が8から10リットルにつき4から17mmol/時間であり、10リットル発酵糟で培養される、請求項22に記載の方法。
- 流加速度が8から10リットルにつき6から16mmol/時間である、請求項23に記載の方法。
- 流加速度が8から10リットルにつき8から15mmol/時間である、請求項24に記載の方法。
- 流加速度が8から10リットルにつき10から14mmol/時間である、請求項25に記載の方法。
- また、無機リン酸塩が培養工程中に存在する、請求項1から26の何れか一項に記載の方法。
- グリセロリン酸塩に対する無機リン酸塩の比率がおよそ1:10からおよそ1:0.25までの範囲である、請求項27に記載の方法。
- ポリペプチドがApo2Lであり、比率がおよそ1:3からおよそ1:0.5である、請求項28に記載の方法。
- 比率がおよそ1:1である、請求項29に記載の方法。
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