JP5013410B2 - 微粒子測定方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は、微粒子測定方法及び装置に関し、より詳しくは、細胞、血球、微生物、粉体、ダストなどの微粒子を撮像して特性を測定することができる微粒子測定方法及び装置に関する。

流体中に含まれる微粒子を撮像する装置として、例えば特許文献１に開示されたフローサイトメータが知られている。このフローサイトメータは、粒子を含む試料液の流路となるフローセルを備えており、フローセルを通過する試料液を複数の撮像手段で撮像することにより、同一粒子の蛍光画像及び透過光画像を取得できるように構成されている。
特開平６−２３５６９１号公報

ところが、上記従来のフローサイトメータは、フローセル内を所定の速度で搬送される粒子の静止画像を撮像するようにしているため、十分な露光時間を確保することができずに画像情報の出力が微弱になる結果、これを増幅するためのイメージインテンシファイアを必要としており、測定を安価に行うことができないという問題があった。

また、透過光画像の撮像時に照射するフラッシュランプ光によりイメージインテンシファイアに過大な入力が生じるのを防止するため、蛍光画像及び透過光画像の撮像タイミングを時間的にずらす必要があるので、画像同士の比較が困難であるという問題もあった。

そこで、本発明は、同じタイミングで撮像した複数の微粒子画像を容易、安価に取得することができる微粒子測定方法及び装置の提供を目的とする。

本発明の前記目的は、光透過性を有する測定領域を備えた流路管に、微粒子を含む流体を供給する供給ステップと、前記測定領域内の流体の流れを一時的に停止した状態で、複数の撮像手段により前記測定領域内を同時に撮像し、複数の微粒子画像を取得する撮像ステップとを備える微粒子測定方法により達成される。

また、本発明の前記目的は、光透過性を有する測定領域を備え微粒子を含む流体が通過可能な流路管と、前記流路管に流体を供給する供給手段と、前記測定領域内を撮像して微粒子画像を複数取得する複数の撮像手段と、前記供給手段及び撮像手段の作動を制御する制御手段とを備え、前記制御手段は、前記測定領域内の流体の流れを一時的に停止した状態で、複数の前記微粒子画像を同時に撮像する微粒子測定装置により達成される。

本発明の微粒子測定方法及び装置によれば、同じタイミングで撮像した複数枚の微粒子画像を容易、安価に取得することができる。

以下、本発明の実態形態について添付図面を参照して説明する。図１は、本発明の一実施形態に係る微粒子測定装置の概略構成図である。図１に示すように、微粒子測定装置１は、微粒子を含む液体などの流体が通過するフローセル１０と、フローセルの周囲にそれぞれ配置された蛍光画像撮像装置２０及び暗視野画像撮像装置３０と、画像処理装置４０
と、制御装置５０とを備えている。

フローセル１０は、偏平な矩形管からなり、長手方向の両側に流体入口１０ａ及び流体出口１０ｂをそれぞれ備えている。フローセルの中央には、ガラスや透明プラスチックなどの光透過性材料からなる窓部１１が、表裏面にそれぞれ形成されており（図１では一方のみ図示）、蛍光画像撮像装置２０及び暗視野画像撮像装置３０によりフローセル１０の内部を撮像する測定領域１２を、窓部１１の内部に有している。フローセルの形状は、微粒子を含む流体を外部から観察可能である限り特に限定されず、本実施形態のもの以外に、例えば、円管、楕円管、異形管などの他の流路管で、少なくとも一部に光透過性を有する測定領域を備える構成であればよい。但し、測定領域１２内の微粒子全体の撮像が可能となるように、微粒子の通過を妨げない範囲で内部幅がなるべく小さいことが好ましい。

フローセル１０の流体入口１０ａには、透明な供給管２が接続されており、この供給管２には微粒子検出装置１６が配置されている。微粒子検出装置１６は、供給管２にレーザ光などの検出光を照射する光源１７と、検出光を受光する受光部１８とを備えており、供給管２内の微粒子の通過を、検出光の遮断または散乱による受光量の変化により、あるいはまた蛍光の検出により検知し、微粒子像をフローセル１０内で捕捉することができるように微粒子通過信号を出力する。

一方、フローセル１０の流体出口１０ｂには、排出管４が接続されており、この排出管４には、吸引によりフローセル１０の内部に流体を供給するポンプ１４が介在されている。

また、供給管２及び排出管４における流体入口１０ａ及び流体出口１０ｂの近傍には、遮断弁２６，２７がそれぞれ設けられており、遮断弁２６，２７を閉じることで、フローセル１０内における流体の流れを一時的に停止することができる。ポンプ１４は、押し込み圧力によってフローセル１０内に流体を供給するように、フローセル１０の上流側に配置することも可能である。また、フローセル１０への流体の供給手段として、圧縮空気など他の動力源を利用することも可能であり、更には、流体の貯留タンクをフローセル１０の上方に配置する等して、流体が自重でフローセル１０へ供給されるように構成することも可能である。遮断弁２６，２７は、例えばポンプ１４の作動を停止することでフローセル１０内における流体の流れを停止可能な場合には、必ずしも設ける必要はない。

蛍光画像撮像装置２０は、冷却式のＣＣＤカメラ（例えば３０万画素）２１と、フローセル１０内の微粒子に対して励起光を照射する励起光源２２と、微粒子の発光を集光するレンズ２３と、ＣＣＤカメラ２１及びレンズ２３間に配置されて所定の波長域の蛍光のみを選択的に透過させるフィルタ２４とを備えており、フローセル１０の測定領域１２に存在する微粒子の蛍光画像を撮像する。励起光源２２は、リング状部材の内周面に沿って複数のＬＥＤ（例えば波長５３０ｎｍの緑色ＬＥＤ）２２ａを等間隔に配置して構成されており、測定領域１２に対してＣＣＤカメラ２１と同じ側から均一な励起光を照射できるように、測定領域１２の近傍に配置されている。

暗視野画像撮像装置３０は、ＣＣＤカメラ（例えば１４０万画素）３１を備えており、励起光源２２による微粒子の前方散乱光により、フローセル１０の測定領域１２に存在する微粒子の暗視野画像を撮像する。暗視野画像撮像装置３０は、蛍光画像撮像装置２０に対して測定領域１２を挟んで対向するように配置されており、撮像された暗視野画像は、蛍光画像と裏表の関係になる。

画像処理装置４０は、蛍光画像撮像装置２０及び暗視野画像撮像装置３０に接続されており、撮像された蛍光画像及び暗視野画像を重畳して同一粒子を同定することができるよ
うに、画像処理を施す。

制御装置５０は、フローセル１０内を流体が所定の流速で通過するようにポンプ１４の作動を制御し、微粒子検出装置１６から微粒子通過信号が入力されると、所定の時間遅れを持って遮断弁２６，２７を閉じると共にポンプ１４を停止するように制御することで、検出された微粒子をフローセル１０内に含む状態で流体の流れを一時停止する。

また、制御装置５０は、暗視野画像撮像装置３０による撮像が、蛍光画像撮像装置２０の撮像と同時に行われるように、両者の撮像タイミングを制御する。本実施形態においては、制御装置５０が、露光開始時刻及び露光終了時刻の双方が一致するように、蛍光画像撮像装置２０及び暗視野画像撮像装置３０の作動を制御しているが、本明細書において「同時に撮像する」とは、このような場合以外に、複数の撮像装置の露光時間帯が少なくとも一部において重複する場合も含む意味である。

次に、上記構成を備える微粒子測定装置１を用いた微粒子測定方法の一例として、海水中に含まれる植物プランクトンの測定方法を説明する。例えば、植物プランクトンが海洋に固定している炭素量を知りたい場合にはサイズ測定が有効であり、船舶のバラスト水検査においては個体数係数が必要であり、赤潮観測としては、種組成およびその時間変動ならびにその空間分布を調べることが要求される。本発明に係る微粒子測定装置及び微粒子測定方法は、このような植物プランクトンの測定を可能にするものである。

まず、制御装置５０は、ポンプ１４を作動させて、植物プランクトンや懸濁粒子などの微粒子を含む海水をフローセル１０内に供給する。そして、微粒子検出装置１６による植物プランクトンの検出に基づき、ポンプ１４を停止すると共に遮断弁２６，２７を閉じて、フローセル１０の測定領域１２における海水の流れを一時的に停止する。測定領域１２の大きさは、対象とする微粒子のサイズなどを考慮して適宜設定すればよく、例えば、５μｍ〜数ｍｍ程度のサイズを有する植物プランクトンが測定対象の場合、５μｍ以上のプランクトンを計数できる程度の分解能を得るために、測定領域１２の大きさを約０．０１ｃｃに設定することができる。

フローセル１０内における微粒子の移動速度は、流体の停止により直ちに（たとえば０．２秒程度で）低下し、従来の測定時に比べて動きが極めて遅いものになる。このため、蛍光画像撮像装置２０及び暗視野画像撮像装置３０により微粒子を撮像する際に露光時間を十分確保することができるので（例えば０．２秒程度）、複数のＬＥＤ２２ａからなる励起光源２２の励起光を、暗視野画像を撮像するための照明光として利用することができ、構成の簡素化と共に消費電力の低減を図ることができる。また、撮像手段として、高感度カメラを用いなくても、一般或いは冷却型のＣＣＤカメラを用いて、微粒子を十分判別可能な鮮明な画像を得ることができる。

制御装置５０は、蛍光画像撮像装置２０及び暗視野画像撮像装置３０が同時に撮像するように、撮像タイミングを制御する。蛍光画像撮像装置２０は、励起光の照射により植物プランクトンから放出されるクロロフィル蛍光により蛍光画像を撮像する。本実施形態においては、励起光源２２が、測定領域１２に対して蛍光画像撮像装置２０と同じ側から励起光を照射しているため、前方散乱光の影響を受けないため植物プランクトンから放出される蛍光のみを効率良く撮像することができ、鮮明な蛍光画像を得ることができる。

また、暗視野画像撮像装置３０は、励起光による植物プランクトン又は懸濁粒子の前方散乱光により、暗視野画像を撮像する。同時に撮像された蛍光画像及び暗視野画像は、それぞれを重畳して微粒子の測定が可能となるように、画像処理装置４０において画像処理が施される。蛍光画像撮像装置２０のフィルタ２４は、ターゲットとする植物プランクト
ンが放出する蛍光波長に応じて、適宜交換することができる。

画像処理装置４０は、蛍光画像及び暗視野画像の撮像方向を考慮していずれか一方の画像を反転し、暗視野画像上における微粒子のサイズ及び座標から探索範囲を決定し、蛍光画像上の同一粒子を探索する。こうして、蛍光画像及び暗視野画像における各粒子の対応関係を把握した後、撮像装置の幾何学的配置に起因する歪みやレンズの機構に起因する歪みを修正する。例えば、各撮像装置２０，３０の撮像軸の傾きによる歪みについては、基準画像を撮像して２次元画像変換（アフィン変換）により傾きを修正することができ、レンズの縮尺歪みや放射歪みについては、深度方向に動かした基準画像を取得して歪みパラメータを測定することにより修正することができる。

こうして、画像処理装置４０において補正された画像の一例を、図２に拡大して示す。図２において、（ａ）は蛍光画像であり、（ｂ）は暗視野画像である。植物プランクトンは蛍光画像及び暗視野画像の双方に現れるのに対し、植物プランクトン以外の懸濁粒子は暗視野画像にのみ現れるため、両者を比較することで、植物プランクトンとその他の懸濁粒子とを識別することができる。 画像処理装置４０は、蛍光画像と暗視野画像との間で微粒子の濃淡や色調を変える処理を行った上で、画像同士を重畳することにより、植物プランクトンと懸濁粒子とを自動的に識別することができると共に、それぞれのサイズや分布密度も自動的に算出することができる。植物プランクトン及び懸濁粒子をそれぞれサイズ毎に分類して、各サイズに対する個体数密度を測定した結果の一例を、図３に示す。

本実施形態の微粒子測定方法によれば、流体の流れが停止した状態で微粒子の測定が行われるため、露光時間をより長くすることにより、微粒子自体の運動の様子を撮像することもできる。図４は、露光時間を５秒として赤潮プランクトン（学名：Karenia mikimotoi）を撮像した蛍光画像であり、この蛍光画像とプランクトンの形状を測定するために露
光時間を短く（例えば０．２秒）撮影した暗視野画像と比較することにより、運動するプランクトンを特定することができる。螺旋状に延びた軌跡の長さから運動速度を測定することができ、また軌跡の形状特徴からプランクトンの種類などの特徴を知ることができる。このように、２つの撮像装置の露光開始時刻または露光終了時刻を一致させて、露光時間を互いに相違させることにより、微粒子の運動性を測定することができる。

また、励起光源２２に配置されたＬＥＤ２２ａが、それぞれ異なる波長（例えば８波長）の励起光を照射するように構成することも可能であり、測定した蛍光波長もしくは蛍光強度の違いにより、植物プランクトンの種組成を測定することも可能である。

また、図１に示す微粒子測定装置は、耐圧性を有するケーシング内に収容することで、潜行体等に搭載して実海での測定が可能となるように構成することができる。図５は、その概略構成を示しており、耐圧性ケーシング６０の内部に真空容器６１と、フローセル１０、蛍光画像撮像装置２０及び暗視野画像撮像装置３０を備える撮像システム６２と、制御基板６３と、パソコン６４，６５と、バッテリー６６とを収容し、ケーシング６０の外部から真空容器６１内に海水を吸引し、バッテリー６６の駆動により流体の停止、撮像、画像処理、画像保存の一連の作業を自動的に行うことにより、海中での植物プランクトンの測定を行うことができる。

以上、本発明の一実施形態について詳述したが、本発明の具体的な態様は上記実施形態に限定されるものではない。例えば、本実施形態においては、海水に含まれる植物プランクトンの測定を例に説明したが、自己蛍光特性を有する細胞や人為的に蛍光性を付与された細胞などの、分布密度、大きさ、蛍光強度などの測定にも適用することができ、例えば、得られた細胞の大きさから細胞の含有物質の推測を行うことができる。また、微粒子の蛍光性の有無を調べることもできる。フローセル１０を通過する流体は気体であってもよ
く、この場合は、フローセル１０を水平に配置して測定領域１２上に微粒子が静置されるように流体の流れを停止することが好ましい。

また、本実施形態では、蛍光画像及び暗視野画像の重畳を容易にするため、蛍光画像撮像装置２０及び暗視野画像撮像装置３０が測定領域１２を挟んで対向するように配置されているが、それぞれの撮像軸を把握することにより、他の配置で撮像された複数の画像であっても、重畳可能となるように画像処理装置４０で補正することができる。例えば、フィルタ２４の透過波長が異なる３以上の蛍光画像撮像装置２０をフローセル１０の周囲に等間隔に配置して、それぞれの蛍光画像を重畳することも可能であり、多種の植物プランクトンの測定を同時に行うことができる。

また、本実施形態においては、蛍光画像撮像装置２０及び暗視野画像撮像装置３０により蛍光画像及び暗視野画像を撮像しているが、これらの画像以外に、明視野画像、位相差画像、偏光画像、微分干渉画像などを同時に撮像できるように、２以上の撮像装置をフローセル１０の周囲に配置してもよい。これにより、微粒子の形状、光学的特性（例えば分光的性質）、機械的特性（例えば微粒子の密度）、個体数密度、運動性の有無、生理的性質などを測定することができる。各撮像装置は、同じ種類の画像であってもよく、例えば、フローセル１０の表裏面から暗視野画像をそれぞれ撮像して合成することで、各画像の被写界深度が小さい場合でも鮮明な三次元画像を得ることができる。

複数の撮像装置を使用する場合、観察波長領域、露光開始時間、露光終了時間、観察領域（レンズの倍率、視野の大きさ）、観察部位（深さ）などを変えて測定することができる。また、照明光の波長、強度、照明時間、照射角度などを変えた測定を行うこともできる。例えば、２つのカメラ（Ａ，Ｂ）及び２つの照明装置（ａ，ｂ）を使用し、照明装置ａから照明光を照射して、カメラＡ，Ｂで同時に撮像・重畳した画像と、照明装置ａとは照明光の波長、強度、照射時間などが異なる照明光を照明装置ｂから照射して、カメラＡ，Ｂで同時に撮像・重畳した画像とを比較して、微粒子の測定を行うことが可能であり、光合成活性などの光学特性の計測を行うことができる。

本発明の一実施形態に係る微粒子測定装置の概略構成図である。 蛍光画像及び暗視野画像の一例を示す図である。 微粒子のサイズと個体数密度との関係の一例を示す図である。 微粒子の運動状態を撮像した蛍光画像の一例を示す図である。 海中で使用可能な微粒子測定装置の概略構成図である。

符号の説明

１ 微粒子測定装置
１０ フローセル
１２ 測定領域
１４ ポンプ
１６ 微粒子検出装置
２０ 蛍光画像撮像装置
２２ 励起光源
２６，２７ 遮断弁
３０ 暗視野画像撮像装置
４０ 画像処理装置
５０ 制御装置

Claims (6)

1. 光透過性を有する測定領域を備えた流路管に、微粒子を含む流体を供給する供給ステップと、
   前記測定領域内の流体の流れを一時的に停止した状態で、複数の撮像手段により前記測定領域内を同時に撮像し、微粒子画像を複数取得する撮像ステップとを備え、
   前記撮像ステップは、蛍光画像及び暗視野画像をそれぞれ撮像し、
   前記蛍光画像を撮像する撮像手段の露光時間は、微粒子の時間変動が測定できるように、前記暗視野画像を撮像する撮像手段の露光時間よりも長い、微粒子測定方法。
2. 複数の前記微粒子画像を重畳可能となるように補正する画像処理ステップを更に備える請求項１に記載の微粒子測定方法。
3. 前記蛍光画像は、前記測定領域内への励起光の照射により、粒子から蛍光を受光して生成され、
   前記暗視野画像は、前記励起光の照射により、粒子から散乱光を受光して生成される請求項１又は２に記載の微粒子測定方法。
4. 前記測定領域内への励起光の照射が、蛍光画像を撮像する前記撮像手段と前記測定領域に対して同じ側に配置された励起光源により行われる請求項３に記載の微粒子測定方法。
5. 複数の前記撮像手段は、前記測定領域を挟んで対向するように配置される請求項１から４のいずれかに記載の微粒子測定方法。
6. 光透過性を有する測定領域を備え微粒子を含む流体が通過可能な流路管と、
   前記流路管に流体を供給する供給手段と、
   前記測定領域内を撮像して蛍光画像及び暗視野画像を含む複数の微粒子画像を取得する複数の撮像手段と、
   前記供給手段及び撮像手段の作動を制御する制御手段とを備え、
   前記制御手段は、前記測定領域内の流体の流れを一時的に停止した状態で、複数の前記微粒子画像を同時に撮像し、
   前記蛍光画像を撮像する撮像手段の露光時間は、微粒子の時間変動が測定できるように、前記暗視野画像を撮像する撮像手段の露光時間よりも長い、微粒子測定装置。