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JP5060293B2 - 神経機能におけるｔａｊ - Google Patents

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Description

（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、神経生物学、神経学、および薬理学に関する。さらに具体的には、本発明は、ＴＡＪアンタゴニストの投与による神経機能（例えば、ＣＮＳでの、例えば、ニューロンの成長および／または生存の調節、例えば、軸索再生および／または神経突起成長）の調節方法に関する。
（背景技術）
神経細胞の機能は、それらの緊急の環境でのニューロンと他の細胞との間での接触による影響を受ける（非特許文献１）。これらの細胞としては、特化したグリア細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）の乏突起膠細胞、および末梢神経系（ＰＮＳ）のシュワン細胞（これは、神経軸索をミエリンの鞘に収める）（非特許文献２、Ｚ．Ｈａｌｌ編）が挙げられる。
ＣＮＳニューロンは、損傷後に再生する生まれつき備わっている能力を有しているが、これらは、ミエリンの中に存在する阻害性タンパク質によってそのように行うことを阻害される（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。乏突起膠細胞上に見られるいくつかのミエリン阻害性タンパク質が特性決定されている。ミエリン阻害性タンパク質の例としては、ＮｏｇｏＡ（非特許文献６；非特許文献７）、ミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）（非特許文献８；非特許文献９）、および乏突起膠細胞糖タンパク質（ＯＭ−ｇｐ）（非特許文献１０）が挙げられる。これらのタンパク質のそれぞれは、ニューロンＮｇＲ１のリガンドであることが別々に示されている（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献１１；非特許文献１２（２００２年６月２８日にオンラインで公開された））。
Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ，ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９８８年，第６８巻，ｐ．８１９ Ｌｅｍｋｅ，「Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｓｉｎａｕｅｒ，１９９２年，ｐ．２８１ Ｂｒｉｔｔｉｓら，Ｎｅｕｒｏｎ，２００１年，第３０巻，ｐ．１１−１４ Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２年，第２２巻，ｐ．２７９２−２８０３ Ｇｒｉｍｐｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２年，第２２巻，ｐ．３１４４−３１６０ Ｃｈｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０３巻，ｐ．４３４−４３９ Ｇｒａｎｄｐｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０３巻，ｐ．４３９−４４４ ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒら，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９４年，第１３巻，ｐ．８０５−８１１ Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９４年，第１３巻，ｐ．７５７−７６７ Ｍｉｋｏｌら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８８年，第１０６巻，ｐ．１２７３−１２７９ Ｗａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２００２年，第４１７巻，ｐ．９４１−９４４ Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉら，Ｎｅｕｒｏｎ，２００２年
（発明の要旨）
本発明は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであるＴＡＪ（ＴＲＡＩＮ、ＴＲＯＹ、ＴＲＡＤＥ、またはＴＮＦＲＳＦ１９としても知られている、例えば、Ｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５３３６−１５３４２；Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７５：２０７４２−２０７４７を参照のこと）が、神経機能の調節（例えば、ＣＮＳでの、例えば、ニューロンの成長および／または生存、例えば、軸索再生および／または神経突起成長の調節）に関係していることの発見に、一部基づく。理論には束縛されないが、ＴＡＪはＮｏｇｏレセプター（ＮｇＲ１）／ＬＩＮＧＯ−１複合体と会合してＲｈｏの活性化を行い、これが神経突起成長に対するミエリン阻害効果を媒介すると考えられる。したがって、本発明はさらに、とりわけ、神経成長を調節する（例えば、ＣＮＳ損傷または炎症後の、例えば、神経再生を促進する）ようにＴＡＪを調節する物質（例えば、タンパク質またはポリヌクレオチド物質）を使用する方法および組成物を特徴とする。
したがって、１つの態様においては、本発明は、ニューロンの成長および／または生存を調節する、例えば、軸索再生および／または神経突起成長を調節する方法を特徴とする。この方法には、ニューロン（例えば、ＣＮＳニューロン）をＴＡＪ複合体の形成および／またはシグナル伝達を調節する有効量の物質と接触させる工程が含まれる。好ましい実施形態においては、ニューロンはＣＮＳニューロンである。接触は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで行うことができる。
１つの実施形態においては、物質は、ＴＡＪによる情報伝達および／またはＴＡＪ複合体の形成を減少させ（例えば、ブロックし）（例えば、ＴＡＪ／ＮｇＲ１および／またはＴＡＪ／ＬＩＮＧＯ−１複合体の形成を減少させ）、それによって、ニューロンの成長および／または生存を促進させる、例えば、ニューロンの生存、神経突起成長、軸索再生を増大させる、そして／または、神経突起成長のミエリンによって誘導される阻害を減少させる。このような物質は、本明細書中では「ＴＡＪアンタゴニスト」と呼ばれる。例示的なＴＡＪアンタゴニストとしては、特定のＴＡＪポリペプチドおよび融合タンパク質（例えば、可溶性ＴＡＪ−Ｆｃ融合タンパク質またはドミナントネガティブ（例えば、非シグナル伝達）ＴＡＪポリペプチド変異体）、阻害性抗ＴＡＪ抗体（抗原結合フラグメントとそのホモログを含む）、ならびに阻害性ＴＡＪ核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ならびにＲＮＡｉ核酸（例えば、ＴＡＪ特異的ｓｉＲＮＡ）が挙げられる。ＴＡＪによるシグナル伝達およびＴＡＪ複合体の形成もまた、内因性ＴＡＪ遺伝子の発現レベルを減少させることによって、例えば、ＴＡＪ遺伝子の転写を減少させることによって低下させることができる。１つの実施形態においては、ＴＡＪ遺伝子の転写は、内因性ＴＡＪ遺伝子の調節配列を変化させることによって、例えば、ネガティブな調節配列（例えば、転写リプレッサーについてのＤＮＡ結合部位）の付加によって、あるいは、ポジティブな調節配列（例えば、エンハンサー、または転写活性化因子についてのＤＮＡ結合部位）の除去によって減少させることができる。
好ましい実施形態においては、ニューロンの生存、神経突起成長、および／または軸索再生は、参照値（例えば、対照）と比較して、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上増大させられる。
別の実施形態においては、この物質はＴＡＪによるシグナル伝達および／またはＴＡＪ複合体の形成を増大させ、それによってニューロンの生存、軸索再生、または神経突起成長を減少させる。このような物質は、本明細書中では「ＴＡＪアゴニスト」と呼ばれる。このような物質の例としては、全長のＴＡＪポリペプチドまたはその機能的等価物、およびＴＡＪをコードする核酸が挙げられる。ＴＡＪをコードする核酸はゲノム配列である場合も、また、ｃＤＮＡ配列である場合もある。ヌクレオチド配列には、ＴＡＪをコードする領域（例えば、全長のコード領域）に加えて、プロモーター配列（例えば、ＴＡＪ遺伝子に由来するプロモーター配列または別の遺伝子に由来するプロモーター配列）；エンハンサー配列；非翻訳調節配列（例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えば、ＴＡＪ遺伝子に由来する５’ＵＴＲまたは別の遺伝子に由来する５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ（例えば、ＴＡＪ遺伝子に由来する３’ＵＴＲまたは別の遺伝子に由来する３’ＵＴＲ））；ポリアデニル化部位；インシュレーター配列を含めることができる。別の実施形態においては、ＴＡＪタンパク質のレベルは、内因性ＴＡＪ遺伝子の発現レベルの増大によって、例えば、ＴＡＪ遺伝子の転写の増大によって増大させられる。このような実施形態においては、ＴＡＪ遺伝子の転写は、内因性ＴＡＪ遺伝子の調節配列を変化させることによって、例えば、ポジティブな調節エレメント（例えば、エンハンサー、または転写活性化因子についてのＤＮＡ結合部位）の付加；ネガティブな調節エレメント（例えば、転写リプレッサーについてのＤＮＡ結合部位）の欠失、および／または内因性の調節配列もしくはその中のエレメントの別の遺伝子のものでの置換によって増大させることができ、これによって、ＴＡＪ遺伝子のコード領域をより効率よく転写させることができる。
本明細書中に記載される方法は、例えば、ＣＮＳニューロンの成長円錐の崩壊の阻害、ニューロンの生存の促進（例えば、死滅のリスクがあるニューロン）、神経突起成長の促進、軸索再生の促進、ＣＮＳ障害または損傷の部位での髄鞘形成の促進、ミエリン阻害性タンパク質による軸索成長の阻害の減少、および哺乳動物のＣＮＳ症状の処置（例えば、中枢神経系の損傷または障害の処置、例えば、軸索の損傷または切断に関係しているＣＮＳの症状（例えば、外傷性の脳損傷および脊髄損傷）の処置、あるいは、神経変性の症状、例えば、多発性硬化症および他の髄鞘形成の障害（例えば、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、および大脳白質萎縮症）、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、および脳卒中の処置に有用である。
別の態様においては、本発明は、神経成長の調節が必要な被験体（例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト）、例えば、ニューロンの生存、神経突起成長、および／または軸索再生を、好ましくはＣＮＳにおいて、増大させることが必要な被験体を処置する方法を特徴とする。この方法には、被験体に、ＴＡＪによるシグナル伝達を減少させ、そして／またはＴＡＪ複合体の形成を減少させる（例えば、ＴＡＪ／ＮｇＲ１／ＬＩＮＧＯ−１複合体の形成を減少させる）物質を、ニューロンの生存、神経突起成長、および／または軸索再生を増大させるために（例えば、ミエリンまたはＭＡＩＦによって誘導される神経突起成長の阻害を減少させるために）十分な量で投与する工程が含まれる。この物質は、例えば、抗ＴＡＪ阻害抗体（または、その抗原結合フラグメントもしくはホモログ）、可溶性ＴＡＪポリペプチド（例えば、可溶性ＴＡＪ融合タンパク質（好ましくは、ＴＡＪ−Ｆｃ融合タンパク質））、ＴＡＪアンチセンス核酸、あるいはＲＮＡｉ分子であることができる。好ましい物質はタンパク質であり、例えば、可溶性ＴＡＪ−Ｆｃ融合タンパク質であり、例えば、ヒトＩｇ Ｆｃ領域または阻害性抗ＴＡＪ抗体に対して融合させられたヒトＴＡＪの可溶性の細胞外ドメインを含む融合タンパク質であり、好ましくは、ヒト化もしくは完全なヒト抗ＴＡＪ抗体である。
１つの実施形態においては、被験体は、ＣＮＳの神経変性症状、例えば、多発性硬化症（または他の髄鞘形成の障害、例えば、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、および大脳白質萎縮症）、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害を有している。別の実施形態においては、被験体は、軸索の損傷または切断に関係しているＣＮＳの損傷、例えば、外傷性の脳損傷、脳卒中、脊髄損傷、または視神経損傷を有している。いくつかの実施形態においては、物質は、最初の損傷後、短い時間のうちに、例えば、７２時間以内、好ましくは４８時間以内、より好ましくは損傷後２４時間以内に投与することができる。このような実施形態においては、物質は全身的に投与することができるが、損傷部位に、または損傷部位の近くに局所投与されることが好ましい。
１つの実施形態においては、この方法には、全身的、例えば、静脈内または筋肉内経路によって被験体に物質を投与する工程が含まれる。他の実施形態においては、物質は、損傷もしくは障害の部位に、または損傷もしくは障害の部位の近くに局所投与、例えば、髄腔内に、あるいは硬膜外に投与される。
局所投与についてのポリペプチドの治療有効量は、通常は、１０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまでであり、例えば、１０μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまでである。全身投与についてのポリペプチドの治療有効量は、通常は、１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態においては、この方法には、（ａ）ＴＡＪポリペプチドを発現するように遺伝子操作された培養された宿主細胞を提供する工程；および（ｂ）宿主細胞を、被験体のＣＮＳ疾患、障害、もしくは損傷（例えば、脊髄損傷）の部位に、またはその近くに、導入する工程が含まれる。培養された宿主細胞は、自己のものであっても、または同種同系のものであってもよい。１つの実施形態においては、細胞はＴＡＪポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトされている。ＴＡＪポリペプチドは全長のＴＡＪポリペプチドであってもよい。
いくつかの実施形態においては、この方法には、被験体に対して、疾患、障害、もしくは損傷の部位に、またはその近くに、ＴＡＪポリペプチドの発現を引き起こすヌクレオチド配列（例えば、ＴＡＪポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）を投与する工程が含まれる。その結果、ＴＡＪポリペプチドは、被験体のヌクレオチド配列から、損傷部位またはその近くのニューロンによる軸索伸張の阻害を減少させるために十分な量で発現される。ベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはプラスミドベクターであり得る。ベクターは、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、または皮下投与のような投与経路によって投与することができる。
いくつかの実施形態においては、物質は、第２の予防薬または治療薬、例えば、コルチコステロイド、例えば、メチルプレドニソロン；鎮痛剤；抗生物質；第２の生物学的治療薬（例えば、ＬＩＮＧＯ−１活性、ｐ７５活性、またはＮｏｇｏレセプター（ＮｇＲ）活性の調節因子）と組み合わせて投与される。いくつかの場合には、物質は、第２の物質に対して結合させることができる。
典型的な実施形態においては、物質の投与が繰り返され、例えば、少なくとも１回、２回、３回、５回、１０回、２０回、またはそれ以上繰り返される。１つの実施形態においては、物質は、１週間に少なくとも１回の投与を含む治療方針で少なくとも８週間にわたって投与される。他の実施形態（例えば、被験体が急性のＣＮＳ損傷を有している場合）においては、物質は、１週間の間に複数回の投与を含む治療方針で投与される。
１つの実施形態においては、この方法には、神経機能（例えば、ニューロンＲｈｏの活性化、ニューロンの成長、脊髄機能、および／または認知機能）に関係しているパラメーターについて、被験体または被験体に由来する生物学的試料を評価する工程が含まれる。評価は、投与前および／または投与後に行うことができる。
いくつかの実施形態においては、物質は、例えば、徐放デバイス（例えば、生体適合性ポリマー、微粒子、またはメッシュ）を使用して、制御された送達によって被験体に送達される。デバイスは分解を減少させることができ、物質の放出を制御することができる。このような生体適合性の徐放システムは、被験体に対して、例えば、注射または移植によって（例えば、筋肉内、皮下、静脈内）、あるいはＣＮＳ病巣部位もしくはその近くに投与することができる。
別の態様においては、本発明は、ニューロンの生存を調節する（例えば、増強するかまたは減少させる（例えば、神経突起成長および／または軸索再生を調節する））物質のスクリーニング方法を特徴とする。この方法には、ＴＡＪの発現またはレベルを低下させる、そして／あるいは、シグナルを伝達するかまたは複合体（例えば、ＴＡＪ／ＬＩＮＧＯ−１／ＮｇＲ１複合体）を形成するＴＡＪの能力を低下させる物質を同定する工程が含まれる。この方法にはまた、ＴＡＪに対する試験物質の効果を、神経突起成長を促進または増強する試験物質の能力と相関させる工程（例えば、同定された物質またはその使用に関する印刷物またはコンピューターが読み込むことができる媒体（例えば、情報、販売、もしくは操作情報についての印刷物またはコンピューターが読み込むことができる媒体）を提供する工程）も含めることができる。「相関させる」は、神経突起成長を促進または増強する（例えば、軸索再生を促進する）ことができる物質としてＴＡＪの発現、活性、またはレベルを低下させる試験物質を同定することを意味する。相関工程には、例えば、神経成長を促進または増強することができる物質として、ＴＡＪの発現、活性、またはレベルを低下させる試験物質を同定する記録（例えば、印刷物またはコンピューターが読み込むことができる記録（例えば、実験記録またはデータセットまたは電子メール））を作成または提供することが含まれ得る。記録には、他の情報（例えば、特異的な試験物質識別子、日付、この方法の操作者、供給源についての情報、構造、精製方法、または試験物質の生物学的活性を含めることができる。記録または記録から導かれた情報は、例えば、薬学的または治療的な使用についての化合物または候補の物質（例えば、最重要化合物）として試験物質を同定するために使用することができる。同定された物質は、ＣＮＳの症状（例えば、本明細書中に記載されるＣＮＳの症状）の処置のための物質、またはそのような処置について可能性のある物質として同定することができる。この方法によって同定された物質（例えば、化合物）は、例えば、神経成長を調節するための処置（または処置の開発）に使用することができる。
１つの実施形態においては、この方法には、試験物質を提供する工程、および試験物質がＴＡＪまたはＴＡＪリガンドに結合するかどうかを評価する工程が含まれる。１つの実施形態においては、この方法には、試験物質を提供する工程、および試験物質がＬＩＮＧＯ−１およびＮｇＲ１の一方または両方に結合するＴＡＪの能力に影響を与えるかどうかを評価する工程が含まれる。
１つの実施形態においては、この方法には、試験物質を提供する工程、および試験物質がシグナルを伝達する、例えば、ニューロンの中でのＲｈｏの活性化を調節するＴＡＪの能力に影響を与えるかどうかを評価する工程が含まれる。例えば、当業者であれば、ＴＡＪによるシグナル伝達に影響を与える物質をスクリーニングするためにＲｈｏによって駆動されるレポーターシステムを使用することができる。
別の実施形態においては、この方法には、（ａ）レポーターポリペプチド（例えば、光に基づく標識、例えば、比色標識、または蛍光によって検出することができる標識、例えば、蛍光レポーターポリペプチド（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＲＦＰ））をコードするヌクレオチド配列に対して作動可能であるように連結されたＴＡＪの調節領域（例えば、プロモーター）を含む外因性核酸を有している細胞（例えば、本明細書中に記載されるＣＮＳ細胞）、組織またはヒト以外の動物を提供する工程；（ｂ）細胞、組織、またはヒト以外の動物においてレポーターポリペプチドの活性を調節する試験物質の能力を評価する工程；ならびに、（ｃ）それぞれ、ＣＮＳの神経成長を阻害するかまたは促進する物質として、レポーターポリペプチドの活性を増大させるかまたは低下させる試験物質を選択する工程が含まれる。１つの実施形態においては、細胞または組織はニューロンである。別の実施形態においては、ヒト以外の動物は、核酸を有しているトランスジェニック動物であり、例えば、トランスジェニックである齧歯類（例えば、マウス、ラット、またはモルモット）である。別の実施形態においては、ヒト以外の動物は、核酸を有している、ゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）（例えば、ゼブラフィッシュでの軸索成長アッセイについては、Ｈｊｏｒｔｈ，２００２，Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．４６（４）：６０９−１９を参照のこと）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、または他の下等生物である。１つの実施形態においては、細胞はＣＮＳ細胞、例えば、ＣＧニューロン、ＤＲＧニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞である。
いくつかの実施形態においては、評価には、評価する値（例えば、ＴＡＪに対する試験物質の効果についての値）をデータベースまたは他の記録媒体に入力する工程が含まれる。
１つの実施形態においては、この方法には、２つの評価工程が含まれる。例えば、この方法には、第１のシステム（例えば、細胞を含まないシステム、細胞システム、または組織システム）において試験物質を評価する第１の工程と、第２のシステム（例えば、第２の細胞システムもしくは組織システム、またはヒト以外の動物）において試験物質を評価する第２の工程が含まれる。他の実施形態においては、この方法には、同じタイプのシステムでの２回の評価工程が含まれる。例えば、物質は、同じ、または別のヒト以外の動物において、第１回目の評価の後でヒト以外の動物において再度評価される。２回の評価は、少しでも時間を空けて（例えば、数日、数週、数ヶ月、または数年）行われ得る。１つの実施形態においては、試験物質は、ＴＡＪと相互作用する（例えば、ＴＡＪに結合する）その能力について最初に評価され、その後、Ｒｈｏの活性化および／または神経突起成長を調節するその能力について評価される。
試験物質は、粗抽出物である場合も、また、半精製された抽出物（例えば、有機抽出物、例えば、動物抽出物または植物抽出物）である場合も、また、単離された化合物（例えば、低分子、タンパク質、脂質、または核酸）である場合もある。
別の態様においては、本発明は、そのゲノムにＴＡＪ遺伝子を破壊するトランス遺伝子が含まれている、トランスジェニックであるヒト以外の動物、例えば、トランスジェニックであるヒト以外の齧歯類（例えば、マウス、ラット、またはモルモット）を特徴とする。１つの実施形態においては、ヒト以外の動物（または、その動物に由来する細胞）は、以下の１つ以上を示す：神経突起成長の阻害因子（ミエリンおよびＭＡＩＦ）に対して応答する神経突起成長の阻害の減少；および神経突起成長の阻害因子に応答するＲｈｏの活性化の減少。
本明細書中に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料が以下に記載される。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定するようには意図されない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、そして特許請求の範囲から明らかであろう。
（発明の詳細な説明）
軸索の損傷または切断の後、末梢神経系（ＰＮＳ）のニューロンは再生することができ、そして、機能的結合が再度確立される程度にまでそれらの軸索を修復することができる。対照的に、中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンにはこの回復能力はなく、ＣＮＳの再生の阻害を担っている機構は依然として極めて関心が高い研究の対象となっている。重要なことは、ＰＮＳ環境においてそれらの軸索を再生させるＣＮＳニューロンについて記載されている能力は、損傷後の再生について、ＣＮＳニューロンに固有の欠如があるわけではないことである。むしろ、ＣＮＳの軸索修復の阻害は、神経突起とその局所的なＣＮＳ環境との間での相互作用の結果であると考えられる。複数の研究によって、これらのネガティブな相互作用に対する明らかな寄与因子が、ミエリンと会合する阻害性分子のグループ、すなわち、ミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）、Ｎｏｇｏ、および乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ）であることが示唆されている。これらのタンパク質はそれぞれ、成長円錐の伸張および軸索成長に対してネガティブに作用することが示されている。
Ｎｏｇｏ、ＭＡＧ、およびＯＭｇｐ（まとめて、ミエリン結合阻害因子、すなわち、ＭＡＩＦと呼ばれる）に関するさらなる研究により、これらのタンパク質の成長阻害シグナルが共通の多機能レセプター複合体によって伝達されることが示されている。少なくとも３つの異なるサブユニットがＭＡＩＦレセプター複合体に関与している可能性がある：Ｎｏｇｏレセプター１（ＮｇＲ１）、ｐ７５、およびＬＩＮＧＯ−１。Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３４１−３４６（２００１）；Ｍｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）；およびＷａｎｇ，Ｋ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２０：７４−７８（２００２）を参照のこと。一方、これらの３つの分子は結合して機能性のＭＡＩＦレセプターを形成するが、これらは、それらのそれぞれの物理的特徴において互いに大きく異なる。ＮｇＲ１は、分子のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、細胞表面にＧＰＩ結合させられる。Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３４１−３４６（２００１）を参照のこと。ｐ７５は腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、その上、細胞死に関するシグナル伝達において重要な役割を担っていることも同時に明らかにされているので、低親和性の神経向性レセプターとして最初に同定された。Ｒａｂｉｚａｄｅｈ，Ｓ．ａｎｄ Ｂｒｅｄｅｓｅｎ，Ｄ．Ｅ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１４：２２５−２３９（２００３）を参照のこと。ＭＡＩＦレセプター複合体のごく最近になって記載されたメンバーであるＬＩＮＧＯ−１はまた、ＬＲＲファミリーのメンバーでもあり、これにはさらに、チロシンのリン酸化と下流でのシグナル伝達を行うことができる膜貫通ドメインと細胞質ドメインが含まれる。Ｍｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）を参照のこと。
広範囲でのインビトロ分析により、３つのレセプター成分のそれぞれ（ＮｇＲ１、ｐ７５、およびＬＩＮＧＯ−１）が完全に機能性であるＭＡＩＦレセプター複合体に寄与していることが示された。しかし、他の種類の証拠は、ｐ７５はより生理学的な条件下では軸索成長の阻害においては重要な役割は担っていない可能性があることを示唆している。皮質脊髄路の軸索はＭＡＩＦに対して非常に反応性が高いが、皮質脊髄路のニューロンは、通常は、感知できるほどのｐ７５レベルは発現していない。ｐ７５は上行感覚ニューロンによって発現されるが、遺伝子のノックアウトによるこれらのニューロンの中でのｐ７５の欠損によって、これらの軸索の再生を促進することができなくなり、これには脊柱の病変が続く。最後に、ＮｇＲ１に対するｐ７５の結合は、ＬＩＮＧＯ−１／ＮｇＲ１の結合と比べると比較的弱く（本出願）、ｐ７５／ＮｇＲ１の親和性は、リガンドの存在によって驚くほど増大した（例えば、Ｃｏｐｒａｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４１−５３（２００４）；Ｇｉｅｈｌ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：３４９２−３５０２（２００１）；Ｍｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）；Ｓｈａｏ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ４５：３５３−３５９（２００４）；およびＳｏｎｇ，Ｘ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：５４２−５４６（２００４）を参照のこと。
本明細書中に記載される方法および組成物は、ニューロンの生存および／または成長、例えば、ＣＮＳの神経突起成長におけるＴＡＪ（ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのメンバー）の役割に関する。本明細書中に記載されるように、ＴＡＪはＮｇＲ１に結合し、複数の脳領域にある様々な細胞のタイプにおいて発現される。ＴＡＪはＮｇＲ１およびＬＩＮＧＯ−１と共に機能性のＭＡＩＦレセプター複合体を形成する。ＴＡＪの発現が欠損しているマウスから培養したニューロンは、ミエリンおよびＭＡＩＦに応答する成長阻害の減少を示す。それゆえ、ＴＡＪはＭＡＩＦレセプター複合体に加わり、そしてＭＡＩＦの阻害的影響を媒介することにおいて役割を担っている。したがって、ＴＡＪポリペプチド（例えば、可溶性ＴＡＪポリペプチドおよび融合タンパク質）、抗ＴＡＪ抗体、およびＴＡＪ核酸（例えば、ＴＡＪをコードする核酸またはアンチセンスＴＡＪ核酸）のようなＴＡＪ試薬を、神経突起成長を調節するため、例えば、種々のＣＮＳの症状（例えば、外傷性脊髄損傷、脳卒中、および多発性硬化症（ＭＳ））を処置するために使用することができる。
定義
他の場所で明確に定義されていない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本出願が支配する。状況によって特に必要とされていなければ、単数形の用語には複数形の用語が含まれ、そして複数形の用語には単数形の用語が含まれる。本明細書中に言及される全ての刊行物、特許、および他の参考文献は、個々の刊行物または特許出願が詳細に、かつ個別に引用によって組み込まれることが示されているかのように、全ての目的についてそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
本明細書中に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載される。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定するようには意図されない。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、そして特許請求の範囲から明らかであろう。
本発明をさらに定義するために、以下の用語と定義が提供される。
用語「ａ」または「ａｎ」の存在は、１つ以上のその実体を意味する。例えば、「免疫グロブリン分子（ａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１つ以上の免疫グロブリン分子を示すと理解される。このように、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書中ではほとんど同じ意味で使用することができる。
本明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなそのバリエーションは、任意の記載される整数または整数のグループの包含を示すが、特異的な方法、構成、または組成における任意の他の整数または整数のグループの排除を示すものではない。
本明細書中で使用される場合は、用語「〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、または「〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」もしくは「〜から構成されている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のようなそのバリエーションは、本明細書および特許請求の範囲を通して使用される場合には、任意の記載される整数または整数のグループの包含を示すが、特異的な方法、構成、または組成に対して、別の整数または整数のグループが加えられることはないことを示す。
本明細書中で使用される場合には、用語「本質的に〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、または「本質的に〜から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」もしくは「本質的に〜から構成されている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のようなそのバリエーションは、本明細書および特許請求の範囲を通して使用される場合には、任意の記載される整数または整数のグループの包含を示し、そして場合によっては、特異的な方法、構成、または組成についての基本的な特性または新規の特性を大きくは変化させない、任意の記載される整数または整数のグループの状況に応じた包含を示す。
本明細書中で使用される場合は、用語「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、単数形の「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、さらには、複数形の「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」を含むように意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線的に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を意味する。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を意味し、そして特定の長さの生成物を意味するものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖もしくは複数の鎖をいうために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、そして用語「ポリペプチド」は、これらの任意の用語の代わりに、またはこれらの任意の用語とほとんど同じ意味で使用される場合がある。用語「ポリペプチド」はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導、タンパク質分解的切断、または自然界には存在しないアミノ酸による改変を含むがこれらに限定はされない、ポリペプチドの発現後改変の産物を意味するようにも意図される。ポリペプチドは、自然界の生物学的供給源から導くことも、また、組換え技術によって生産することもできるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。これは、化学合成を含む任意の様式で作成することができる。
本発明においては、ポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合によって互いに連結させられたアミノ酸（すなわち、ペプチド等量式）から構成され得、そして、遺伝子によってコードされる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、自然界には存在しないアミノ酸）を含む場合がある。本発明のポリペプチドは、自然界でのプロセス（例えば、翻訳後プロセシング）によって、または当該分野で周知の化学改変技術によってのいずれかで改変することができる。このような改変は、基本となるテキストに十分に記載されており、そして論文に、さらには膨大な量の研究文献にも、さらに詳細に記載されている。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端もしくはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどの場所でも行うことができる。同じタイプの改変が、所定のポリペプチドの中のいくつかの部位で同じ程度で、または異なる程度で存在する場合があることは理解されるであろう。また、所定のポリペプチドには、多くのタイプの改変が含まれる場合もある。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐している場合があり、これらは、分岐を有している環状である場合も、また、分岐を有していない環状である場合もある。環状のポリペプチド、分岐しているポリペプチド、および分岐している環状のポリペプチドは、翻訳後の自然界でのプロセスによって生じる場合があり、また、合成方法によって作成される場合もある。改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーＲＮＡによって媒介されるタンパク質へのアミノ酸の付加（例えば、アルギニル化）、ならびにユビキチン化が含まれる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと。）
本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸の大きさであり得る。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有し得るが、これらは、必ずしもそのような構造を有しているわけではない。定義された三次元構造を有しているポリペプチドは折り畳まれていると言われ、そして定義された三次元構造を有していないポリペプチドは、むしろ、多数の異なる立体構造をとることができ、折り畳まれていないと言われる。本明細書中で使用される場合は、用語「糖タンパク質」は、アミノ酸残基（例えば、セリン残基またはアスパラギン残基）の酸素を含む側鎖または窒素を含む側鎖を介してタンパク質に対して結合させられる、少なくとも１つの炭水化物部分に対して結合させられたタンパク質を意味する。
「単離された」ポリペプチド、またはそのフラグメント、改変体、もしくは誘導体によっては、その自然界での環境にはないポリペプチドが意図される。特定のレベルの精製は必要ではない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然の環境または自然界での環境から取り出すことができる。宿主細胞の中で発現させられた組換えによって生産されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離され、分画され、または部分的もしくは実質的に精製された自然界に存在しているポリペプチドあるいは組換え体ポリペプチドである場合には、本発明の目的については単離されているとみなされる。
本発明においては、「ポリペプチドフラグメント」は、より長いポリペプチドの短いアミノ酸配列を意味する。タンパク質フラグメントは「独立している」場合も、また、そのフラグメントが領域の一部を形成するより大きいポリペプチドに含まれる場合もある。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、約５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、および約１００個のアミノ酸、またはそれ以上の長さを含むフラグメントが挙げられる。
用語「フラグメント」、「改変体」、「誘導体」、および「アナログ」には、本発明のポリペプチドについて言う場合には、少なくともいくらかの生物学的活性を保持している任意のポリペプチドが含まれる。ポリペプチドには、本明細書中に記載される場合は、そのポリペプチドがその機能をなおも果たす限りは、フラグメント、改変体、または誘導体分子がその中に含まれ得るが、限定はされない。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントには、タンパク質分解フラグメント、欠失フラグメント、そして具体的には、動物に投与されると作用部位により早く到達するフラグメントが含まれ得る。ポリペプチドフラグメントにはさらに、自然界に存在しているポリペプチドの抗原性エピトープまたは免疫原性エピトープ（直線状エピトープ、さらには三次元エピトープを含む）を含むポリペプチドの任意の部分がさらに含まれる。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントには、上記のフラグメントを含む改変体領域、およびアミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入が原因で変化したアミノ酸配列を有しているポリペプチドが含まれる場合がある。対立遺伝子変異のような改変体は、自然界に存在している可能性がある。「対立遺伝子改変体」によっては、生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占有している遺伝子の別の形態が意図される。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。自然界には存在しない改変体は、当該分野で公知の突然変異誘発技術を使用して生産することができる。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントには、保存的もしくは非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加が含まれる場合がある。本発明のＮｇＲ１ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントにはまた、誘導体分子も含まれる場合がある。改変体ポリペプチドはまた、本明細書中では、「ポリペプチドアナログ」と呼ばれる場合もある。本明細書中で使用される場合は、ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの「誘導体」は、機能を有している側鎖の反応によって化学的に誘導させられた１つ以上の残基を有している目的のポリペプチドを意味する。２０種類の標準的なアミノ酸の１つ以上の自然界に存在しているアミノ酸誘導体を含むペプチドもまた、「誘導体」として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンを置換することができる。５−ヒドロキシリジンはリジンを置換することができる。３−メチルヒスチジンンはヒスチジンを置換することができる。ホモセリンはセリンを置換することができる。そしてオルニチンはリジンを置換することができる。
本明細書中で使用される場合は、用語「ジスルフィド結合」には、２つの硫黄原子の間で形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインにはチオール基が含まれており、これは、第２のチオール基と共にジスルフィド結合または架橋を形成することができる。
本明細書中で使用される場合は、「融合タンパク質」は、第２のポリペプチドに対してペプチド結合を介して直線的に結合させられた第１のポリペプチドを含むタンパク質を意味する。第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは同一である場合も、また、異なる場合もあり、これらは直接結合している場合も、また、ペプチドリンカーを介して結合している場合もある（下記を参照のこと）。
用語「ポリヌクレオチド」は、１つの核酸と、さらには、複数の核酸を含むように意図され、そして単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を意味する。ポリヌクレオチドには、従来のホスホジエステル結合または従来のものではない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の中で見られるようなアミド結合）が含まれる場合がある。ポリヌクレオチドには、全長のｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列が含まれる場合があり、これには、非翻訳５’配列および非翻訳３’配列、コード配列、さらには、核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメインおよび改変体が含まれる。ポリヌクレオチドは、未改変のＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは、改変されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成される場合がある。例えば、ポリヌクレオチドは、１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖ＤＮＡ、１本鎖と２本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖と２本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖である場合も、またより典型的には、２本鎖である場合も、または１本鎖と２本鎖の領域の混合物である場合もある、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは、ＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドには、安定性または他の理由のために改変された、１つ以上の改変された塩基あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ骨格が含まれる場合もある。「改変された」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基、および珍しい塩基（例えば、イノシン）が挙げられる。種々の改変をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」には、化学改変された形態、酵素的に改変された形態、または代謝的に改変された形態が含まれる。
用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント（例えば、ＤＮＡまたはＤＮＡフラグメント）を意味する。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドによっては、その自然界での環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡが意図される。例えば、ベクターに含まれる本発明のＴＡＪポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードする組換え体ポリヌクレオチドは、本発明の目的については単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞の中に維持されている組換え体ポリヌクレオチド、または溶液の中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸としてはさらに、合成によって生産されたそのような分子が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーター）である場合があり、また、ポリヌクレオチドまたは核酸に、調節エレメントが含まれる場合もある。
本明細書中で使用される場合は、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから構成される核酸の部分である。「終結コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸には翻訳されないが、コード領域の一部とみなすことができるが、任意の隣接配列（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなど）はコード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域が１つのポリヌクレオチド構築物（例えば、１つのベクター）の中に存在する場合があり、また、別のポリヌクレオチド構築物の中（例えば、別の（異なる）ベクター上）に存在する場合もある。さらに、任意のベクターには、１つのコード領域が含まれる場合があり、また、２つ以上のコード領域が含まれる場合もある。例えば、１つのベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードする場合がある。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、異種コード領域をコードする場合があり、これは、本発明のＴＡＪポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントをコードする核酸に対して融合させられている場合も、また、融合させられていない場合も、いずれもある。異種コード領域としては、特定のエレメントまたはモチーフ（例えば、分泌シグナルペプチド、または異種の機能ドメイン）が挙げられるが、これらに限定はされない。
特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合には、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドには、通常、１つ以上のコード領域と作動可能であるように連結されたプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントが含まれ得る。作動可能な連結は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のコード領域が、調節配列（単数または複数）の影響または制御下で遺伝子産物の発現を行うような方法で、１つ以上の調節配列と連結させられている場合である。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドのコード領域と、それと連結させられているプロモーター）は、プロモーター機能の誘導によって所望される遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が生じる場合、および２つのＤＮＡフラグメントの間での連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか、または転写されるＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合には、「作動可能であるように連結されている」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を行うことができる場合には、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能であるように連結されている。プロモーターは、予め決定された細胞の中でのみＤＮＡの実質的な転写を指示する、細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント（例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナル）を、細胞特異的転写を指示するように、ポリヌクレオチドと作動可能であるように連結させることができる。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域は本明細書中に開示される。
種々の転写制御領域は当業者に公知である。これらとしては、脊椎動物細胞の中で機能する転写制御領域（例えば、サイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメント（イントロン−Ａと連結された前期初期プロモーター）、シミアン・ウイルス４０に由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）に由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメントであるが、これらに限定はされない）が挙げられるが、これらに限定はされない。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ−グロビンのような、脊椎動物の遺伝子に由来するもの、さらには真核生物細胞の中で遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびに、リンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導することができるプロモーター）が挙げられる。
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびに、ピコルナウイルスに由来するエレメント（具体的には、内部リボソーム侵入部位、すなわち、ＩＲＥＳ（ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる））が挙げられるがこれに限定はされない。
他の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と連結させることができる。シグナルの仮説にしたがうと、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、粗面小胞体を通過する成長しつつあるタンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有している。当業者は、脊椎動物細胞から分泌されたポリペプチドが、一般的には、ポリペプチドのＮ末端に融合させられたシグナルペプチドを有しており、これが、完全なポリペプチドまたは「全長の」ポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態または「成熟」形態が生じることを認識している。特定の実施形態においては、自然界に存在しているシグナルペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖のシグナルペプチド）が使用されるか、またはポリペプチドの分泌を指示する能力を保持しているその配列の機能的誘導体が、それと作動可能であるように連結される。あるいは、異種哺乳動物のシグナルペプチドまたはその機能的誘導体が使用される場合もある。例えば、野生型リーダー配列が、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換される場合がある。
特定の実施形態においては、本明細書中に開示される方法で使用される物質は、「抗体」もしくは「免疫グロブリン」分子、またはそれらの免疫特異的フラグメントであり、例えば、自然界に存在している抗体、または免疫グロブリン分子、または抗体分子と同様の様式で抗原に結合する操作された抗体分子もしくはフラグメントである。本明細書中で使用される場合は、用語「抗体」は、極めて広い意味で使用され、ポリクローナル抗体、さらにはモノクローナル抗体が含まれる。これには、全長の抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全なヒト抗体、ならびに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントを含むこのような抗体のフラグメント、ダイアボディー、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多特異的抗体が、これらが所望される抗原結合活性を示す限りにおいて含まれる。モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団であるとして抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の生産が必要であるとは解釈されない。
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書中ではほとんど同じ意味で使用される。抗体または免疫グロブリンには、少なくとも重鎖の可変ドメインが含まれ、そして通常は、少なくとも、重鎖の可変ドメインと軽鎖の可変ドメインが含まれる。脊椎動物のシステムにおける基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版．１９８８）を参照のこと。
以下でさらに詳細に議論されるように、用語「免疫グロブリン」には、生化学的に優れている可能性がある種々の広い範囲のクラスのポリペプチドが含まれる。当業者には、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの中にいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）があることは明らかであろう。それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして抗体の「クラス」を決定するものは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（イソ型）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１など）は十分に特性決定されており、機能的な特異性を付与することが知られている。これらのクラスおよびイソ型のそれぞれについての改変されたバージョンは、本発明の開示を参照して当業者であれば容易に認識でき、したがって、本発明の範囲に含まれる。全ての免疫グロブリンのクラスが、本発明の範囲にあることは明確であり、以下の議論は、ほとんどがＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子に関するものである。ＩｇＧに関しては、標準的な免疫グロブリン分子には、およそ２３，０００ダルトンの分子量の２つの同じ軽鎖ポリペプチドと、５３，０００〜７０，０００の分子量の２つの同じ重鎖ポリペプチド含まれる。４つの鎖は、通常は、「Ｙ」構造のジスルフィド結合によって連結されており、ここでは、軽鎖は、「Ｙ」の口の部分で始まり、可変領域を経て続く重鎖を囲む。
軽鎖と重鎖はいずれも、構造的相同性と機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」と「可変」は機能に関して使用される。これに関しては、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）部分の両方が抗原認識および特異性を決定することは明らかであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、分泌、胎盤を通過する運動性、Ｆｃレセプターの結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号は、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより離れるにつれて大きくなる。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である。ＣＨ３ドメインとＣＬドメインには、実際に、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端が含まれる。
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。それぞれの重鎖のクラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合させることができる。一般的には、軽鎖および重鎖は互いに共有結合させられ、２つの重鎖の「テール」部分は互いに共有ジスルフィド結合、または、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって作成される場合には、非共有結合によって結合させられる。重鎖においては、アミノ酸配列はＹ構造のフォークの末端にあるＮ末端からそれぞれの鎖の底部にあるＣ末端に向かって走る。当業者には、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの中にいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）があることは明らかであろう。それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして抗体の「クラス」を決定するものは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（イソ型）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１など）は十分に特性決定されており、機能的な特異性を付与することが知られている。これらのクラスおよびイソ型のそれぞれについての改変されたバージョンは、本発明の開示を参照して当業者であれば容易に認識でき、したがって、本発明の範囲に含まれる。
上記に示されるように、可変領域により、抗体は選択的な認識、そして抗原上のエピトープへの特異的な結合が可能である。すなわち、抗体のＶＬドメインとＶＨドメインが結合して、三次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四次元抗体構造は、Ｙのそれぞれのアームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖のそれぞれの上にある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって定義される。いくつかの例（例えば、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）の種に由来する特定の免疫グロブリン分子、またはラクダ科の免疫グロブリンをベースとして操作された特定の免疫グロブリン分子）においては、完全な免疫グロブリン分子は重鎖だけから構成され、軽鎖を含まない場合がある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照のこと。
１つの実施形態においては、本発明の抗原結合分子には、抗体分子の重鎖または軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つが含まれる。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子には、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも２つのＣＤＲが含まれる。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子には、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも３つのＣＤＲが含まれる。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子には、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも４つのＣＤＲが含まれる。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子には、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも５つのＣＤＲが含まれる。別の実施形態においては、本発明の抗原結合分子には、１つ以上の抗体分子に由来する少なくとも６つのＣＤＲが含まれる。目的の抗原結合分子の中に含めることができる少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子は当該分野で公知であり、そして例示的な分子は本明細書中に記載される。
本発明の方法で使用される抗体またはその免疫特異的フラグメントとしては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、プリマタイズ（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２）、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産されたフラグメント、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書中に開示される結合分子に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定はされない。ＳｃＦｖ分子は当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、および、ＩｇＡ２）、または免疫グロブリン分子のサブクラスのものであり得る。
抗体フラグメント（単鎖抗体を含む）には、単独で、あるいは、以下のものの全体または一部と組み合わせて可変領域（単数または複数）が含まれる場合がある：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを有している可変領域（単数または複数）の任意の組み合わせをもまた含む抗原結合フラグメントもまた本発明に含まれる。本明細書中に開示される診断および治療方法に使用される抗体またはその免疫特異的フラグメントは、鳥類および哺乳動物を含む、任意の動物起源に由来するものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ロバ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、ウマ抗体、またはニワトリ抗体である。別の実施形態においては、可変領域は、起源（例えば、フラスコから）の中でコンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）される場合がある。本明細書中で使用される場合は、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有している抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックである動物から単離された抗体が含まれ、これらは、以下に、そして例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ｅｔ ａｌ．によって米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、内因性免疫グロブリンは発現しない。
本明細書中で使用される場合は、用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含むポリペプチドには、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（上部、中央部、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、あるいはそれらの改変体またはフラグメントの少なくとも１つが含まれる。例えば、本発明で使用される結合ポリペプチドには、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部と、ＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部と、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、あるいは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖が含まれる場合がある。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドには、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖が含まれる。さらに、本発明で使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメイン全体または一部）が欠失している場合がある。上記に示されるように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）を、これらが自然界に存在している免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように改変することができることは、当業者であれば理解できるであろう。
本明細書中に開示される処置方法に使用される特定のＴＡＪアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメントにおいては、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖上の重鎖部分と同じである。あるいは、本発明の方法で使用される重鎖部分を含むモノマーは同じではない。例えば、それぞれのモノマーには異なる標的結合部位が含まれる場合があり、これによって、例えば、二重特異的抗体が形成される。
本明細書中に開示される方法で使用される結合ポリペプチドの重鎖部分は、別の免疫グロブリン分子に由来するものであり得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分には、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域が含まれる場合がある。別の例においては、重鎖部分には、ＩｇＧ分子に一部由来し、ＩｇＧ３分子に一部由来するヒンジ領域が含まれ得る。別の例においては、重鎖部分には、ＩｇＧ１分子に一部由来し、そしてＩｇＧ４分子に一部由来するキメラヒンジが含まれ得る。
本明細書中で使用される場合は、用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、軽鎖部分には、ＶＬドメインまたはＣＬドメインの少なくとも１つが含まれる。
本明細書中に開示される処置方法に使用される抗体またはその免疫特異的フラグメントは、本明細書中に記載されるように、ＴＡＪのアンタゴニストとして作用する。例えば、本発明の方法に使用される抗体は、ＴＡＪポリペプチドの抑制活性をブロックするかまたは阻害するアンタゴニストとして作用する場合がある。
免疫グロブリンに由来するポリペプチド（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）の自然界には存在しない改変体をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列の中に１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を導入することによって作成することができる。変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲによる突然変異誘発）によって導入することができる。好ましくは、保存的なアミノ酸置換が、１つ以上の必須ではないアミノ酸残基に対して行われる。
本明細書中に開示される抗ＴＡＪ抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体は、抗原（例えば、それらが認識するかまたは特異的に結合する標的ポリペプチド（ＴＡＪ））のエピトープ（単数または複数）または一部（単数または複数）に関して記載され、特定される場合がある。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分が「エピトープ」、すなわち、「抗原決定基」である。標的ポリペプチドには１つのエピトープが含まれる場合もあるが、通常は、少なくとも２つのエピトープが含まれ、そして抗原の大きさ、立体構造、およびタイプに応じて、任意の数のエピトープが含まれ得る。さらに、標的ポリペプチド上の「エピトープ」は、ポリペプチド以外のエレメントである場合も、またポリペプチド以外のエレメントを含む場合もあることに注目するべきであり、例えば、「エピトープ」には炭水化物側鎖が含まれる場合がある。
抗体のペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小の大きさは、約４から５個のアミノ酸であると考えられている。ペプチドまたはポリペプチドエピトープには、好ましくは、少なくとも７個、より好ましくは、少なくとも９個、そして最も好ましくは、少なくとも約１５個から約３０個のアミノ酸が含まれる。ＣＤＲは抗原性ペプチドまたはポリペプチドをその三次構造において認識することができるので、エピトープを含むアミノ酸は連続している必要はなく、そして場合によっては、同じペプチド鎖上にすらない場合もある。本発明においては、本発明の抗ＴＡＪ抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドエピトープには、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または約１５個から約３０個の連続しているかまたは不連続なＴＡＪのアミノ酸（例えば、配列番号２）の配列が含まれる。
「特異的に結合する」によっては、通常、その抗原結合ドメインを介して抗体がエピトープに結合すること、およびこの結合により、抗原結合ドメインとエピトープとの間にいくらかの相補性が必然的に伴うことが意味される。この定義にしたがうと、抗体は、それがランダムな無関係なエピトープに対して結合するよりも、その抗原結合ドメインを介してそのエピトープに対して容易に結合する場合に、エピトープに対して「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書中では、特定の抗体がそれによって特定のエピトープに結合する相対的な親和性を限定するように使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所定のエピトープについて高い特異性を有していると考えることができ、また、抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」についてそれが有しているよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われる場合もある。
「優先的に結合する」によっては、抗体が、それが関連するエピトープ、類似のエピトープ、ホモログであるエピトープ、またはアナログであるエピトープに対して結合するよりも容易に１つのエピトープに特異的に結合することが意味される。したがって、「所定のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連するエピトープと交差反応する可能性がある場合にもなお、関連するエピトープに対してよりもそのエピトープに対して結合する可能性が高い。
限定ではない例として、抗体は、それが第２のエピトープに対する抗体の解離定数（ＫＤ）よりも小さい解離定数ＫＤで第１のエピトープに結合する場合には、第１のエピトープに優先的に結合すると考えることができる。別の限定ではない例においては、抗体は、それが第２のエピトープに対する抗体の解離定数ＫＤよりも少なくとも１桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合には、第１の抗原に優先的に結合すると考えることができる。別の限定ではない例においては、抗体は、それが第２のエピトープに対する抗体の解離定数ＫＤよりも少なくとも２桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合には、第１のエピトープに優先的に結合すると考えることができる。
別の限定ではない例においては、抗体は、それが、第２のエピトープに対する抗体の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））よりも小さい解離速度ｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープに結合する場合には、第１のエピトープに優先的に結合すると考えることができる。別の限定ではない例においては、抗体は、それが、第２のエピトープに対する抗体の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））よりも少なくとも１桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合には、第１のエピトープに優先的に結合すると考えることができる。別の限定ではない例においては、抗体は、それが、第２のエピトープに対する抗体の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））よりも少なくとも２桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合には、第１のエピトープに優先的に結合すると考えることができる。
本明細書中で開示される抗体、または抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体は、本明細書中に開示される標的ポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体に対して、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１、または１０−３秒−１未満、あるいはこれらと同等の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、本明細書中に開示される標的ポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体に対して、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１未満、あるいはこれらと同等の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると言うことができる。
本明細書中で開示される抗体、または抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体は、本明細書中に開示される標的ポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体に対して、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、または５×１０４Ｍ−１秒−１を上回るか、あるいはこれらと同等の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、本明細書中に開示される標的ポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体に対して、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、５×１０６Ｍ−１秒−１、または１０７Ｍ−１秒−１を上回るか、あるいはこれらと同等の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合すると言うことができる。
抗体は、それが、エピトープに対する参照抗体の結合をある程度ブロックする程度に、そのエピトープに対して優先的に結合する場合には、所定のエピトープに対する参照抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当該分野で公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって決定することができる。抗体は、所定のエピトープに対する参照抗体の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言うことができる。
本明細書中で使用される場合は、用語「親和性」は、免疫グロブリン分子のＣＤＲとの個々のエピトープの結合の強度の尺度を意味する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）、頁２７〜２８を参照のこと。本明細書中で使用される場合は、用語「親和力」は、免疫グロブリンの集団と抗原との間での複合体の全体的な安定性、すなわち、抗原との免疫グロブリン混合物の機能的結合の程度を意味する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ、頁２９〜３４を参照のこと。親和力は、特異的エピトープを有している集団の中の個々の免疫グロブリン分子の親和力と、また、免疫グロブリンと抗原の原子価の両方に関係する。例えば、二価のモノクローナル抗体と、反復回数の多いエピトープ構造を有している抗原（例えば、ポリマー）との間での相互作用は、高い親和力の１つである。
本発明の抗ＴＡＪ抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体はまた、それらの交差反応性に関して記載または特定することもできる。本明細書中で使用される場合は、用語「交差反応性」は、１つの抗原について特異的である抗体の、第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原性物質の間での関連性の程度を意味する。したがって、抗体は、それがその形成を誘導するもの以外のエピトープに対して結合する場合には、交差反応性である。交差反応性エピトープには、通常、誘導性エピトープと同じ相補性構造の特性の多くが含まれており、場合によっては、実際にはもとのものよりもふさわしい場合もある。
例えば、特定の抗体は、ある程度の交差反応性を有しており、この場合、これらは関連しているが同じではないエピトープ（例えば、参照エピトープに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知であり、本明細書中に記載される方法を計算して使用した場合）を有しているエピトープ）に結合する。抗体は、参照エピトープに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当該分野で公知であり、本明細書中に記載される方法を計算して使用した場合）を有しているエピトープには結合しない場合には、低い交差反応性を有する、または交差反応性を有さないと言うことができる。抗体は、それがそのエピトープの任意の他のアナログ、オルトログ、またはホモログに結合しない場合には、特定のエピトープに対して「高度に特異的である」と考えることができる。
本明細書中に開示される処置方法で使用される抗体またはその免疫特異的フラグメントはまた、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性に関して記載または特定することもできる。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の結合解離定数、すなわち、Ｋｄを有しているものが挙げられる。
本発明の抗ＴＡＪ抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体は、「多特異的」である場合があり、例えば、二重特異的、三重特異的、またはそれ以上の多特異性である場合もある。これは、それが同時に１つ以上の異なる抗原（例えば、タンパク質）上に存在する２つ以上の異なるエピトープを認識し、それらに結合することを意味している。したがって、抗ＴＡＪ抗体が「単特異的」であるかまたは「多特異的」（例えば、「二重特異的」）であるかは、結合ポリペプチドがそれと反応する異なるエピトープの数を意味する。多特異的抗体は、本明細書中に記載される標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的である場合も、また、標的ポリペプチドに特異的であり、さらには、異種ポリペプチドまたは固体支持体物質のような異種エピトープにも特異的である場合もある。
本明細書中で使用される場合は、用語「原子価」は、抗ＴＡＪ抗体、結合ポリペプチド、または抗体中に存在する可能性のある結合ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）の数を意味する。個々の結合ドメインは１つのエピトープに特異的に結合する。抗ＴＡＪ抗体または結合ポリペプチドに１つ以上の結合ドメインが含まれる場合には、個々の結合ドメインは、２つの結合ドメインを有している抗体（「二価の単特異的」と呼ばれる）については同じエピトープに特異的に結合することができ、また、２つの結合ドメインを有している抗体（「二価の二重特異的」と呼ばれる）については異なるエピトープに結合することができる。抗体は、それぞれの特異性について、二重特異的であり、そして二価である場合もある（「二重特異的四価抗体」と呼ばれる）。別の実施形態においては、四価のミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）またはドメイン欠失抗体を作成することができる。
二重特異的二価抗体、およびそれを作成する方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；同第５，８０７，７０６号；同第５，８２１，３３３号；ならびに、米国特許出願公開番号２００３／０２０７３４および同２００２／０１５５５３７に記載されている。これらの全ての開示は、引用により本明細書中に組み入れられる。二重特異的四価抗体、およびそれを作成する方法は、例えば、ＷＯ０２／０９６９４８およびＷＯ００／４４７８８に記載されている。これらの両方の開示は、引用により本明細書中に組み入れられる。一般的には、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
先に記載されるように、種々の免疫グロブリンのクラスの定常領域のサブユニット構造と三次元立体構造は周知である。本明細書中で使用される場合は、用語「ＶＨドメイン」には、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸末端の可変ドメインが含まれ、そして用語「ＣＨ１ドメイン」には、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ酸末端側にある）定常領域ドメインが含まれる。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接しており、これは、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側に存在している。
本明細書中で使用される場合は、用語「ＣＨ２ドメイン」には、通常のナンバリング方法を使用すると、例えば、抗体の約２４４位の残基から３６０位の残基（２４４位から３６０位の残基、Ｋａｂａｔナンバリングシステム；および２３１位〜３４０位の残基、ＥＵナンバリングシステム；Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，ｏｐ．ｃｉｔ．を参照のこと）までにまたがる重鎖分子の部分が含まれる。ＣＨ２ドメインは、これが別のドメインと密接に対合することはないという点で特有である。むしろ、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、完全な野生型のＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に、挿入されている。ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端にまで伸び、そして、これにはおよそ１０８個の残基が含まれることもまた、十分に明らかにされている。
本明細書中で使用される場合は、用語「ヒンジ領域」には、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結させる、重鎖分子の一部が含まれている。このヒンジ領域には、およそ２５個の残基が含まれており、これには柔軟性がある。したがって、２つのＮ末端抗原結合領域は別々に動くことができる。ヒンジ領域は、３つの異なるドメインにさらに分けることができる：上部、中央部、および下部ヒンジドメイン（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））。
本明細書中で使用される場合は、用語「ジスルフィド結合」には、２つの硫黄原子の間で形成された共有結合が含まれる。アミノ酸であるシステインにはチオール基が含まれており、これは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができる。自然界に存在しているほとんどのＩｇＧ分子においては、ＣＨ１領域とＣＬ領域がジスルフィド結合によって連結されており、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用した場合の２３９位および２４２位（ＥＵナンバリングシステムでは２２６位または２２９位）に対応する位置の２つのジスルフィド結合によって連結されている。
本明細書中で使用される場合は、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られるかまたは導かれ、そして定常領域（これは、完全である場合も、一部である場合も、または本発明にしたがって改変される場合もある）は第２の種から得られる、任意の抗体を意味するように適用される。好ましい実施形態においては、標的結合領域または部位はヒト以外の供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、そして定常領域はヒトのものである。
本明細書中で使用される場合は、用語「操作された抗体」は、重鎖および軽鎖のいずれか、または両方の可変ドメインが特異性が既知である抗体に由来する１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置き換えによって変化させられており、そして必要である場合には、部分的なフレームワーク領域の置き換え、および配列の変化によって変化させられている抗体を意味する。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラス、またさらには、同じサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲが種々のクラスの抗体から導かれ、好ましくは、異なる種に由来する抗体から導かれるであろうことが想定される。特異性が既知であるヒト以外の抗体に由来する１つ以上の「ドナー」ＣＤＲが、ヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に繋がれている操作された抗体は、本明細書中では「ヒト化抗体」と呼ばれる。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別のものに移すために、ドナー可変領域に由来する完全なＣＤＲを有しているＣＤＲの全てを置き換えることは、必ずしも必要ではない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために不可欠であるそのような残基を移すことだけが必要であり得る。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号に示されている説明を前提とすると、これが、機能的に操作された抗体またはヒト化抗体を得ることが、日常的に行われている実験を実施することによるか、または試行錯誤の試験によるかのいずれかによることは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。
本明細書中で使用される場合は、用語「連結された」、「融合された」、または「融合」は、ほとんど同じ意味で使用される。これらの用語は、化学結合または組換え手段を含む何らかの手段による２つ以上のエレメントまたは化合物の互いの結合を意味する。「インフレームでの融合」は、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の、もとのＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持する様式での、連続するより長いＯＲＦを形成するための連結を意味する。したがって、得られる組換え体融合タンパク質は、もとのＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含む１つのタンパク質である（そのセグメントは、通常は、自然界において連結されているようには連結していない）。したがって、リーディングフレームは、融合させられたセグメント全体にわたって連続させられるので、セグメントは、例えば、インフレームのリンカー配列によって、物理的または空間的に分離させることができる。
「リンカー」配列は、融合タンパク質の中の２つのポリペプチドコード領域を分ける、１つ以上のアミノ酸の並びである。典型的なリンカーには、少なくとも５個のアミノ酸が含まれる。別のリンカーには、少なくとも１０個、または少なくとも１５個のアミノ酸が含まれる。特定の実施形態においては、ペプチドリンカーのアミノ酸は、リンカーが親水性であるように選択される。リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号７）が好ましいリンカーであり、これは、十分な柔軟性を提供するので、多くの抗体に幅広く適用される。他のリンカーとしては、Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ（配列番号８）、Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｈｒ（配列番号９）、Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｎ（配列番号１０）、Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ（配列番号１１）、Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ（配列番号１２）、Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ（配列番号１３）、およびＧｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ（配列番号１４）が挙げられる。より短いリンカーの例としては、上記のリンカーのフラグメントが挙げられ、より長いリンカーの例としては、上記のリンカーの組み合わせ、上記のリンカーのフラグメントの組み合わせ、および上記のリンカーのフラグメントとの上記のリンカーの組み合わせが挙げられる。
本明細書中で記載される場合は、用語「適切に折り畳まれたポリペプチド」には、ポリペプチドを含む機能的ドメインの全てが明確に活性であるポリペプチド（例えば、抗ＴＡＪ抗体）が含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「不適切に折り畳まれたポリペプチド」には、ポリペプチドの少なくとも１つの機能的ドメインが活性ではないポリペプチドが含まれる。１つの実施形態においては、適切に折り畳まれたポリペプチドには、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されたポリペプチド鎖が含まれ、逆に、不適切に折り畳まれたポリペプチドには、少なくとも１つのジスルフィド結合によっては連結されていないポリペプチド鎖が含まれる。
本明細書中で使用される場合は、用語「操作された」には、合成手段による（例えば、組換え技術による、インビトロでのペプチド合成による、ペプチドの酵素的もしくは化学的なカップリングによる、または、これらの技術のいくつかの組み合わせによる）核酸またはポリペプチド分子の操作が含まれる。
用語「発現」は、本明細書中で使用される場合は、それによって遺伝子が生化学的物質（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）を生じるプロセスを意味する。このプロセスには、遺伝子のノックダウン、さらには、一時的な発現と安定な発現の両方を含むがこれらに限定はされない、細胞内での遺伝子の機能的存在の何らかの発現が含まれる。これには、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物への転写と、そのようなｍＲＮＡのポリペプチド（単数または複数）への翻訳が含まれるが、これらに限定はされない。最終的な所望される産物が生化学的物質である場合には、発現には、その生化学的前駆体および任意の前駆体の作成が含まれる。
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少を意味する。これは、サイレントにさせられた遺伝子の配列に対してその二本鎖領域において相同であるｓｉＲＮＡによって開始される、動物および植物における配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスである。遺伝子は、生物体に対して内因性である場合も、また、外因性である場合もあり、染色体の中に組み込まれて存在する場合も、また、ゲノムには組み込まれずにトランスフェクションベクターの中に存在する場合もある。遺伝子の発現は、完全に阻害されるか、または部分的に阻害されるかのいずれかである。ＲＮＡｉはまた、標的ＲＮＡの機能を阻害すると考えることもできる。標的ＲＮＡの機能は完全である場合も、または部分的である場合もある。
本明細書中で使用される場合は、用語「処置する」または「処置」は、治療的処置、および予防的もしくは防止的手段の両方を意味する。ここでは、目的は、多発性硬化症の進行のような、望ましくない生理学的変化または障害を防ぐまたは遅らせる（少なくする）ことである。有用な、または所望される臨床結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかを問わず、症状の寛解、疾患の程度の縮小、疾患状態の安定化（すなわち、悪化はしない）、疾患の進行の遅延または遅らせること、疾患状態の軽減または緩和、および寛解（部分寛解または完全寛解を問わず）が挙げられるが、これらに限定はされない。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予想される生存と比較した、生存の延長を意味する場合もある。処置が必要なものとしては、症状または障害をすでに有しているもの、さらには、症状または障害になりやすいもの、あるいは、症状または障害を予防したいものが挙げられる。
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」によっては、診断、予後、または治療が所望される任意の被験体、特に、哺乳動物被験体が意味される。哺乳動物被験体としては、ヒト、家畜動物、家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシ）；霊長類（例えば、類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー）；イヌ科（例えば、イヌおよびオオカミ）；ネコ科（例えば、ネコ、ライオン、およびトラ）；ウマ科（例えば、ウマ、ロバ、およびシマウマ）；食用動物（例えば、ウシ、ブタ、およびヒツジ）；有蹄動物（例えば、シカおよびキリン）；齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）などが挙げられるが、これらに限定はされない。特定の実施形態においては、哺乳動物はヒト被験体である。
本明細書中で使用される場合は、「本発明のＴＡＪポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの投与による恩恵を受ける被験体」および「処置が必要な動物」のような表現には、例えば、本発明のＴＡＪポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを用いる検出（例えば、診断手順のため）および／または処置（すなわち、疾患（例えば、ＭＳ）の緩和または予防）のために使用される本発明のＴＡＪポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの投与によって恩恵を受ける被験体、例えば、哺乳動物被験体が含まれる。本明細書中にさらに詳細に記載されるように、ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは、結合させていない形態で使用することができ、また、例えば、薬剤、プロドラッグ、または同位元素に結合させることもできる。
本明細書中で使用される場合には、「治療有効量」は、所望される治療結果を得るために必要な投与量で、そして必要な時間についての、有効である量を意味する。治療結果は、例えば、症状を弱くする、生存を延長させる、運動性を改善するなどであり得る。治療結果は「治癒」である必要はない。
本明細書中で使用される場合は、「予防有効量」は、所望される予防結果を得るために必要な投与量で、そして必要な時間についての、有効である量を意味する。通常は、予防用量は、疾患の前に、または疾患の比較的早い段階で被験体において使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少ない。
ＴＡＪ（ＴＲＯＹ）
本発明は、ＣＮＳの中のＴＡＪシグナル伝達活性の特定の調節因子がニューロンの生存および／または成長に影響を与える場合があることの発見に基づく。
本明細書中で使用される場合は、「ＴＡＪポリペプチド」は、全長のＴＡＪアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントもしくはドメインを含むポリペプチドである。ＴＡＪポリペプチドにはまた、状況に応じて、異種（非ＴＡＪ）アミノ酸配列が含まれる場合もある。
自然界に存在している全長のヒトＴＡＪポリペプチドは４２３アミノ酸の長さであり、４６ｋＤａの計算上の分子量を有している。このヒトＴＡＪポリペプチドのアミノ酸配列は以下に示される（配列番号２）。このヒトＴＡＪポリペプチドは、配列番号１のｃＤＮＡによってコードされる。
Figure 0005060293
 例えば、Ｅｂｙ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５３３６−１５３４２（２０００）を参照のこと。
ヒトＴＡＪの自然界に存在している改変体は公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０４０４３４（配列番号３）を有しているｃＤＮＡによってコードされるＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＢＡＢ０３２６９（配列番号４）、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ２４６９９９（配列番号５）を有しているｃＤＮＡによってコードされるＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＡＫ２８３９６（配列番号６）である。
他の自然界に存在しているヒトＴＡＪポリペプチドとしては、オルタナティブスプライシング形態が挙げられる。自然界に存在しているＴＡＪポリペプチドとしては、同じ遺伝子の異なる形式でスプライシングされた形態が挙げられる。１つのオルタナティブスプライシング形態は、配列番号２の１位から４１７位のアミノ酸に類似している。このスプライシング改変体をコードするメッセンジャーＲＮＡは特有の５’ＵＴＲを有しており、そして配列番号２と比較してコード配列の一部を含む３’末端領域が異なる。得られる改変体は、配列番号２と比較すると異なり、そして短いＣ末端を有している。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＣ０４７３２１（配列番号１５）を有しているｃＤＮＡによってコードされるＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＨ４７３２１（配列番号１６）を参照のこと。
他の関連する配列としては、他の種のホモログ、例えば、マウスＴＲＡＤＥ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ２４７０００（配列番号１７）のｃＤＮＡによってコードされるＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．ＡＡＫ２８３９７（配列番号１８））が挙げられる。
配列番号２のヒトＴＡＪポリペプチドには、シグナルペプチド配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが含まれる。ＴＡＪポリペプチドのシグナルペプチド配列は、配列番号２の１位のアミノ酸から約２５位のアミノ酸までにまたがる。細胞外ドメインは、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約１７３位のアミノ酸までにまたがる。膜貫通ドメインは、配列番号２の約１７４位のアミノ酸から配列番号２の約１９０位のアミノ酸までにまたがる。そして細胞質ドメインは、配列番号２の約１９１位のアミノ酸から４２３位のアミノ酸までにまたがる。もちろん、当業者であれば、予測されるドメインの末端がおおよそであることを理解する。例えば、シグナルペプチド配列には、配列番号２の１位から２０位、１位から２１位、１位から２２位、１位から２３位、１位から２４位、１位から２５位、１位から２６位、１位から２７位、１位から２８位、１位から２９位、または１位から３０位のアミノ酸が含まれる場合がある。したがって、ヒトＴＡＪの細胞外ドメインのＮ末端は、それぞれ、配列番号２の２１位のアミノ酸から３１位のアミノ酸までである。表２に、配列番号２のヒトＴＡＪポリペプチドのおおよそのドメインと他の領域が列挙される。他のＴＡＪポリペプチド（例えば、本明細書中に開示されるもの）についての同様のドメインのフラグメントは、当業者であれば容易に推定できる。
ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの他のメンバーと同様に、ＴＡＪの細胞外ドメインは、システインリッチドメイン（「ＣＲＤ」）の存在を特徴としている。ＣＲＤは、通常６つのシステイン残基を含む擬似的反復である。理論には束縛されないが、ＣＲＤは、リガンドの結合に重要である３つのドメイン内ジスルフィド結合の形成に関与していると考えられる。ＣＲＤにはまた、６個未満のシステインが含まれる場合があり、これによって、不完全なシステインリッチモチーフが形成される。所定のレセプターの中のＣＲＤの数は、１個から４個の間で変化する。Ｂａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９３，７３：４３１−４４５を参照のこと。
ＴＮＦファミリーのレセプターは、機能的なドメイン構造を有しており、その結果、１つのレセプターの細胞外ドメインは複数のＴＮＦレセプタードメイン（すなわち、ＣＲＤ）から構成される。概要については、Ｂｏｄｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２７：１９−２６を参照のこと。１つの実施形態においては、可溶性ＴＡＪポリペプチドには、全長のＴＡＪポリペプチドの、１つ以上（例えば、１つまたは２つ）の、しかし全てではないＴＮＦレセプタードメインが含まれる。このような短縮型の可溶性ＴＡＪポリペプチドには、ＮｇＲ１および／またはＬＩＮＧＯ−１の相互作用部位を形成するために十分である、そのＴＮＦレセプタードメインのサブセットが含まれる。
配列番号２のＴＡＪポリペプチドは、３つのシステインリッチドメインを含むと考えられる。２つのＣＲＤドメインは、その領域の中に６個のシステインを有しており、１つのＣＲＤは４個しかシステインを有していない。したがって、ＴＡＪポリペプチドには、２つの完全なＴＮＦレセプターモチーフ（本明細書中では、ＣＲＤ１およびＣＲＤ２）と、Ｃ２とＣ６が存在しない１つの不完全なモチーフ（ＣＲＤ３）が含まれる。
これらのドメインについてのおおよその座標が表２に示される。
（表２）
Figure 0005060293
 本発明のＴＡＪポリペプチドにはさらに、以下のポリペプチドフラグメント、モチーフ、またはドメインの１つ以上が含まれる場合がある：セリン／スレオニン／プロリン−リッチドメイン（例えば、配列番号２の約１３７位のアミノ酸から約１６８位のアミノ酸まで）、ＴＡＪに関連する死エフェクタードメイン（例えば、配列番号２の約２１８位のアミノ酸から約４２３位のアミノ酸まで）、Ｎ結合グリコシル化部位（例えば、配列番号２の１０５〜１０８位のアミノ酸）、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位（例えば、配列番号２の２００位から２０３位のアミノ酸、または配列番号２の２３８位から２４１位のアミノ酸）、プロテインキナーゼＣリン酸化部位（例えば、配列番号２の２０５位から２０７位のアミノ酸）、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（例えば、配列番号２の２１９位から２２２位のアミノ酸、および／または配列番号２の３２５位から３２８位のアミノ酸）、チロシンキナーゼリン酸化部位（例えば、配列番号２の２０７位から２１３位のアミノ酸）、Ｎミリストイル化部位（例えば、配列番号２の２１５位〜２２０位のアミノ酸）、ＴＲＡＦ結合ドメイン（例えば、配列番号２の１〜３２８位のアミノ酸、または配列番号２の２１８〜３２８位のアミノ酸）、あるいは、ＮＦκＢ活性化シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号２の１〜３６８位のアミノ酸、または、ＴＡＪポリペプチドの細胞質ドメインの中の別のアミノ酸）。Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開番号２００２／００６８６９６Ａ１を参照のこと。また、ＷＯ０１／０５８９５４ Ａ３も参照のこと。これらはいずれも、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
本明細書中で別の場所にさらに詳細に記載されるように、「可溶性ＴＡＪポリペプチド」は、膜貫通ドメインを欠失しており、状況によっては、細胞質ドメインも欠失している、全長のＴＡＪポリペプチドのフラグメントを含むポリペプチドである。典型的な可溶性ＴＡＪポリペプチドには、ＴＡＪポリペプチドの細胞外ドメインの少なくとも一部が含まれる。（ヒトＴＡＪポリペプチドの細胞外ドメインには、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約１７３位のアミノ酸までが含まれる、表２を参照のこと。）用語「約」は、本明細書中に記載されるポリペプチドドメインおよびフラグメントが、例えば、ポリペプチドの実際の配列、または特定のドメインもしくはフラグメントを定義するために使用される基準に応じて、１つ以上のアミノ酸、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上のアミノ酸の大きさで変わる場合があることを示すように意図される。このようなバリエーションは、当業者によって十分に理解される。したがって、特定の実施形態においては、可溶性のヒトＴＡＪポリペプチドとしては、例えば、配列番号２の２０位のアミノ酸と３２位のアミノ酸の間にＮ末端を有しており、配列番号２の１６０位のアミノ酸から２００位のアミノ酸の間のＣ末端に向かって伸びるポリペプチドが含まれる。１つの実施形態においては、可溶性のヒトＴＡＪポリペプチドには、配列番号２の２６位〜１７３位のアミノ酸が含まれる。「可溶性ＴＡＪポリペプチド」にはまた、融合タンパク質も含まれ、ここでは、ＴＡＪの可溶性フラグメントは、ペプチドタグ、ＡＰ、または免疫グロブリンのＦｃ領域（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域）のような異種アミノ酸配列に対して融合させられている。
ヒトＴＡＪポリペプチドは、配列番号２に限定はされない。ヒトＴＡＪポリペプチドには、配列番号２またはその細胞外ドメインに対して、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、９６％、９８％、または９９％同一である配列が含まれ得る。１５個までのアミノ酸の欠失、置換、または付加を有している、配列番号２を含むＴＡＪポリペプチドまたはその細胞外ドメインもまた含まれる。このようなポリペプチドは、ＴＡＪの生物学的活性について、例えば、神経突起成長またはニューロンの生存に影響を与える能力について、容易にアッセイすることができる。
配列番号２の機能的改変体（すなわち、同じ機能を有しているもの）を、例えば、残基または配列の置換を作成する（例えば、保存的置換を作成する）ことによって、あるいは、生物学的活性に必要ではない末端または内部残基もしくは配列を欠失させることによって、構築することができる。どの残基が活性に重要であるか、または重要ではないかに関する多くの指針は、ヒトＴＡＪのどの残基がマウスＴＡＪおよび他のＴＮＦＲファミリーのメンバーと比較して高度に保存されているかの知見から提供される（例えば、Ｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５３３６−１５３４２を参照のこと）。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、生物学的機能に影響を及ぼさない配列番号２の保存的置換を作成することができる。別の例においては、当業者であれば、過度の実験を行うことなく、ＴＡＪの機能（例えば、ドミナントネガティブであるＴＡＪポリペプチドを生産する）を破壊するように重要な残基（例えば、高度に保存されている残基）において非保存的置換を作成することができる。例えば、膜貫通ドメインを通常の疎水性のアミノ酸残基の置換によって不活化させることができ、これには、親水性のアミノ酸残基を有している機能的膜貫通ドメインが含まれる。別の例においては、システイン残基を欠失させることができ、また、再生の際の不必要な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐために、他のアミノ酸で置き換えることもできる。他のアプローチとしては、例えば、選択される発現システムの中での発現を増強させるための、アミノ酸の改変を挙げることができる。
ＴＡＪのアンタゴニストを用いる処置方法
本発明の１つの実施形態によっては、神経突起成長の欠損もしくは神経細胞の死が関係している疾患、障害、または損傷（例えば、多発性硬化症）に罹患している動物において、そのような疾患を処置するための方法が提供される。この方法には、可溶性ＴＡＪポリペプチド、抗ＴＡＪ抗体、およびＴＡＪアンタゴニストポリヌクレオチドからなる群より選択されるＴＡＪアンタゴニストの有効量を動物に投与する工程が含まれるか、または本質的にこの工程から構成されるか、あるいはこの工程から構成される。このようなＴＡＪアンタゴニストにはさらに、上記アンタゴニスト分子のいずれかの機能的フラグメント、改変体、または誘導体が含まれる。
さらに、本発明は、可溶性ＴＡＪポリペプチド、抗ＴＡＪ抗体、およびＴＡＪアンタゴニストポリヌクレオチドからなる群より選択されるＴＡＪアンタゴニストの治療有効量を投与する工程を含む、本質的にこの工程から構成される、またはこの工程から構成される、哺乳動物において神経突起成長を促進するための方法に関する。このようなＴＡＪアンタゴニストにはさらに、上記アンタゴニスト分子のいずれかの機能的フラグメント、改変体、または誘導体も含まれる。
ニューロンを有効量の上記のＴＡＪアンタゴニストと接触させる工程を含む、本質的にこの工程から構成される、またはこの工程から構成される、神経突起成長を促進する方法もまた、本発明に含まれる。加えて、本発明により、ニューロンを有効量の上記のＴＡＪアンタゴニストと接触させる工程を含む、本質的にこの工程から構成される、またはこの工程から構成される、ニューロンの生存を促進する方法が提供される。
本明細書中で開示される処置方法で使用されるＴＡＪアンタゴニスト（例えば、可溶性ＴＡＪポリペプチド、抗ＴＡＪ抗体、およびＴＡＪアンタゴニストポリヌクレオチド、またはそのような分子のフラグメント、改変体、もしくは誘導体）は、ニューロンの成長または再生をネガティブに調節するようにＴＡＪの能力を停止させる、低下させる、妨げる、または阻害する治療薬として調製し、使用することができる。
本発明の方法においては、ＴＡＪアンタゴニストは、患者への可溶性ＴＡＪポリペプチド、抗ＴＡＪ抗体、およびＴＡＪアンタゴニストポリヌクレオチドの直接の投与によって投与することができる。あるいは、ＴＡＪアンタゴニストは、特異的ＴＡＪアンタゴニストを発現する発現ベクターを介して、インビボまたはエキソビボのいずれかで投与することができる。
本発明の方法によって処置または改善することができる疾患または障害としては、軸索再生の死または不足に関係している疾患、障害、または損傷が挙げられる。このような疾患としては、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）、およびウォラー変性が挙げられるが、これらに限定はされない。
本発明の方法によって処置または改善することができる疾患または障害としては、神経変性疾患または障害が挙げられる。このような疾患としては、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、糖尿病性神経障害、およびパーキンソン病が挙げられるが、これらに限定はされない。
本発明の方法によって処置または改善することができるさらなる疾患、障害、または損傷の例としては、脊髄損傷、慢性脊髄症または神経根症、外傷性脳障害、運動ニューロン疾患、軸索ずり応（ａｘｏｎａｌ ｓｈｅａｒｉｎｇ）、打撲傷、麻痺症、放射線照射後の損傷、または化学療法による他の神経系の合併症、脳卒中、ｌａｒｇｅ ｌａｃｕｎｅｓ、中度から大きい血管閉塞、ｌｅｕｋｏａｒｉａｏｓｉｓ、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症（孤立性（ｉｓｏｌａｔｅｄ）欠損症候群、ＡＲ、バッセン・コルンツヴァイク症候群）、Ｂ１２欠乏症、Ｂ６欠乏症（ピリドキシン−ペラグラ欠乏症）、チアミン欠乏症、葉酸欠乏症、ニコチン酸欠乏症、マルキアファーヴァ・ビニャミ病、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、顔面神経麻痺、あるいは軸索再生、再ミエリン化、または乏突起膠細胞の生存もしくは分化／増殖に必要な任意の神経損傷が挙げられるが、これらに限定はされない。
ＴＡＪアンタゴニスト
ＴＡＪアンタゴニストは、ＴＡＪシグナル伝達経路をブロックまたは阻害し、それによって神経成長をネガティブに調節するＴＡＪの能力を阻害する物質である。結果としては、ＴＡＪアンタゴニストは、ニューロンの生存および／または神経突起成長を増大させる、誘導する、または促進する。本明細書中に開示される方法で使用されるＴＡＪアンタゴニストとしては、可溶性ＴＡＪポリペプチド、またはそのフラグメント、改変体、もしくは誘導体；抗ＴＡＪ抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体；ならびに、ＴＡＪアンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスまたはＲＮＡｉポリヌクレオチド）が挙げられるが、これらに限定はされない。ＴＡＪアンタゴニストにはさらに、上記に列挙されるＴＡＪアンタゴニストのいずれかをコードするポリヌクレオチドが含まれる。ＴＡＪアンタゴニストは単独で投与することも、また、本明細書中に列挙される別のＴＡＪアンタゴニストと組み合わせて投与することもでき、あるいは、ＭＡＩＦによって誘導される神経突起成長を調節する任意の他の処置（例えば、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよび／またはＮｏｇｏレセプターアンタゴニスト）と組み合わせて投与することもできる。ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＮｏｇｏレセプターアンタゴニストは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／０８５６４８、同ＷＯ２００５／０１６９５５、同ＷＯ０３／０３１４６２、同ＷＯ２００４／０１４３１１、および同ＷＯ０１／５１５２０に記載されている。これらは全て、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
可溶性ＴＡＪポリペプチド
アンタゴニストとして作用する可溶性ＴＡＪポリペプチド、またはそのフラグメント、改変体、もしくは誘導体は、自然界に存在しているＴＡＪポリペプチドの生物学的機能をブロックする、阻害する、または妨害することができる。
可溶性ＴＡＪポリペプチド、またはそのフラグメント、改変体、もしくは誘導体は、ＴＡＪポリペプチドの膜貫通ドメインを欠失しており、場合によっては、細胞質ドメインも欠失している。特定の可溶性ＴＡＪポリペプチドは、１つ以上のＴＡＪ ＣＲＤ（例えば、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約７３位のアミノ酸までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約１１５位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約１７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約７４位のアミノ酸から約１１５位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約７４位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約７４位のアミノ酸から約１７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約１１６位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約１１６位のアミノ酸から約１７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約１１５位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、および／または、細胞外ドメイン全体（配列番号２の約２６位から約１７３位までのアミノ酸に対応する）から構成される。上記のようなＴＡＪポリペプチドのＣＲＤまたは細胞外ドメイン全体には、用語「約」の使用によって示されるように、フラグメントのＣ末端またはＮ末端のいずれかに、さらなるアミノ酸または数個のアミノ酸が含まれる場合もある。さらに、本明細書中に記載される可溶性ＴＡＪポリペプチドは、置換、挿入、または欠失のような種々の変更を有している場合がある。
可溶性ＴＡＪポリペプチドには、配列番号２の少なくとも６個、例えば、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、１００個、またはそれ以上のアミノ酸のフラグメントが含まれる可能性がある。加えて、可溶性ＴＡＪポリペプチドには、少なくとも１個、例えば、５個、１０個、１５個、または２０個の保存的アミノ酸置換が含まれる場合がある。本明細書中に記載される配列番号２の参照ＴＡＪポリペプチドに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である、可溶性ＴＡＪポリペプチドの対応するフラグメントもまた、想定される。
当該分野で公知であるように、２つのポリペプチドの間での「配列同一性」は、第２のポリペプチドの配列に対して１つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって決定される。本明細書中で議論される場合は、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一
であるかどうかは、当該分野で公知の方法およびコンピュータープログラム／ソフトウェア（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）であるが、これに限定はされない）を使用して決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列の間での相同性について最適なセグメントを見出すために、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用する。特定の配列が、本発明の参照配列に対して、例えば、９５％同一であるかどうかを決定するためにＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムが使用される場合には、パラメーターは当然、同一性の割合が参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列中のアミノ酸の総数の５％までの相同性のギャップが許されるように、設定される。
本発明の方法で使用される可溶性ＴＡＪポリペプチドには、２つ以上の可溶性ＴＡＪポリペプチドの任意の組み合わせが含まれる場合がある。したがって、可溶性ＴＡＪポリペプチド二量体（ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれか）が想定される。本明細書中に記載される２つ以上の可溶性ＴＡＪポリペプチドは、直接結合させることも、また、適切なペプチドリンカーを介して結合させることもできる。このようなペプチドリンカーは、本明細書中の別の場所に記載される。
したがって、ＴＡＪポリペプチド、特に、ヒトＴＡＪを使用する本明細書中に記載される方法は、配列番号２の使用に限定はされない。配列番号２またはその細胞外ドメインに対して少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９８％、または９９％同一である配列を含むＴＡＪポリペプチドもまた含まれる。１５個までのアミノ酸の欠失、置換、または付加を有している、配列番号２を含むＴＡＪポリペプチドまたはその細胞外ドメインもまた含まれる。このようなポリペプチドは、生物学的活性について、例えば、神経突起成長に影響を与える能力について、容易にアッセイすることができる。
本明細書中に記載される本発明の方法で使用される可溶性ＴＡＪポリペプチドは環状である場合もある。可溶性ＴＡＪポリペプチドの環化によって、直鎖状ペプチドの立体構造の自由度が下がり、そして、より構造的に制限された分子が生じる。ペプチドを環化させるための多くの方法は当該分野で公知である。例えば、ペプチドのＮ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基との間でのアミド結合の形成による「骨格対骨格」環化である。「骨格対骨格」環化の方法には、２つのω−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）の間でのジスルフィド架橋の形成が含まれる。本発明の特定の可溶性ＴＡＪペプチドには、環状ＴＡＪポリペプチドを形成させるための、ペプチドのＮ末端およびＣ末端の改変が含まれる。このような改変としては、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分を有しているシステイン残基、およびビオチンが挙げられるが、これらに限定はされない。ペプチド環化のための他の方法は、Ｌｉ ＆ Ｒｏｌｌｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）（これはその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
融合タンパク質および結合体
本発明のいくつかの実施形態には、ＴＡＪポリペプチド部分が融合タンパク質を形成するようにＮ末端またはＣ末端で異種ポリペプチド部分に対して融合させられているＴＡＪポリペプチドの使用が含まれる。このような融合タンパク質は、種々の目的（例えば、血清半減期の延長、生体利用性の改善、特異的な器官または組織のタイプに対するインビボでの標的化、組換え発現の効率の改善、宿主細胞の分泌の改善、精製を容易にすること、および高い親和力）を達成するために使用することができる。達成すべき目的（単数または複数）に応じて、異種部分は不活性である場合も、また生物学的に活性である場合もある。また、これは、ＴＡＪ部分に安定に融合させるようにするか、またはインビトロ、もしくはインビボで切断できるようにするかを選択することができる。種々の目的を達成するための異種部分は、当該分野で公知である。
Ｆｃ融合タンパク質
１つの実施形態においては、可溶性ＴＡＪポリペプチドは、ヒンジおよびＦｃ領域（すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分）に融合させられる。ＴＡＪ−Ｆｃ融合によって得られ得る利点としては、溶解度、インビボでの安定性、および多価（例えば、二量体か）が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのＦｃ領域（ヒンジ−、ＣＨ２−、ＣＨ３）であり得る。あるいは、これは、ＩｇＥまたはＩｇＭ Ｆｃ領域（ヒンジ−、ＣＨ２−、ＣＨ３−ＣＨ４）である場合もある。ＩｇＧ Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）が一般的には使用される。１つの実施形態においては、ＩｇＧ Ｆｃを化学的に定義するパパイン切断部位（すなわち、２１６位の残基であり、Ｋａｂａｔシステムにしたがうと、１１４位である重鎖の定常領域の最初の残基である）のすぐ上流にあるヒンジ領域で始まる配列、または他の免疫グロブリンの中の同様の部位が融合に使用される。その部位で融合体が作成される正確な部位は重要ではない。特定の部位は周知であり、そして分子の生物学的活性、分泌、または結合特性を最適化するために選択することができる。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡを構築し、そして発現させるための材料および方法は当該分野で公知であり、そして、過度の実験を行うことなく可溶性ＴＡＪ融合体を得るために適用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，４２８，１３０号および同第５，５６５，３３５号に記載されている融合タンパク質のようなＴＡＪ融合タンパク質が使用される。
融合タンパク質のＴＡＪ部分は、好ましくは、ＴＡＪの細胞外領域の少なくとも一部を含み、そして好ましくは、膜貫通ドメインが欠失している。その結果、ＴＡＪ部分は可溶性である。可溶性融合タンパク質のＴＡＪ部分のＮ末端は、通常、配列番号２の約２０位から５０位のアミノ酸の間の残基であり、Ｃ末端は、通常、配列番号２の約１３０位から１８５位のアミノ酸の間の残基である。したがって、可溶性Ｆｃ融合タンパク質のＴＡＪ部分の例としては、配列番号２の２０位のアミノ酸から１７３位のアミノ酸、配列番号２の２６位のアミノ酸から１８０位のアミノ酸、および配列番号２の４０位のアミノ酸から１８５位のアミノ酸が挙げられる。
シグナル配列は、小胞体の膜を通過するタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。融合タンパク質の構築に有用なシグナル配列としては、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２５：１９１−２０２）、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８６：５７７４）が挙げられる。あるいは、他のシグナル配列を使用することもできる。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：５１４５を参照のこと）。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体の内腔で切断される。これにより、Ｆｃ領域とＴＡＪ部分を含む融合タンパク質の分泌が生じる。
いくつかの実施形態においては、ＤＮＡ配列は、分泌カセットとＴＡＪ部分との間のタンパク質分解的切断部位をコードする。コードされる融合タンパク質のタンパク質分解的切断のための切断部位が提供され、これにより、標的タンパク質からＦｃドメインが分離される。有用なタンパク質分解的切断部位には、トリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子、またはエンテロキナーゼＫのようなタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列が含まれる。
分泌カセットは、複製可能である発現ベクターの中に組み込むことができる。有用なベクターとしては、直鎖状の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターはｐｄＣであり、ここでは、免疫融合ＤＮＡの転写は、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーターの制御下で起こる。例えば、Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０８８：７１２；およびＬｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００を参照のこと。適切な宿主細胞を、ＴＡＪポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトすることができ、そしてＴＡＪポリペプチドの発現および分泌のために使用することができる。好ましい宿主細胞としては、不死化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
特定の部位を、分泌カセットの構築の間にＦｃ領域から欠失させることができることが好ましい。例えば、軽鎖との同時発現は必要ないので、重鎖結合タンパク質の結合部位であるＢｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ８：１１１−１１４）を、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失させることができ、その結果、この部位は、免疫融合体の効率的な分泌を妨害しない。膜貫通ドメインの配列（例えば、ＩｇＭの中に存在する配列）を欠失させることができる。
ＩｇＧ１ Ｆｃ領域が好ましい。あるいは、免疫グロブリンγ（γ−２、γ−３、およびγ−４）の他のサブクラスのＦｃ領域を、分泌カセットの中で使用することができる。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、ヒンジ領域（少なくとも一部）、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域全体またはその一部を含む分泌カセットにおいてされることが好ましい。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域は、ＣＨ２が欠失しているＦｃであり、これには、ヒンジ領域の一部とＣＨ３領域が含まれているが、ＣＨ２領域は含まれていない。ＣＨ２が欠失しているＦｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，１：４７に記載されている。いくつかの実施形態においては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃ領域が使用される。
ＴＡＪ融合タンパク質は、いくつかの異なる立体配置で構築することができる。１つの立体配置においては、ＴＡＪ部分のＣ末端は、Ｆｃ部分のＮ末端に直接融合させられる。わずかに異なる立体配置においては、短いポリペプチド（例えば、２〜１０個のアミノ酸）が、融合体の中に、ＴＡＪ部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端の間に、組み込まれる。このようなリンカーは、立体構造上の柔軟性を提供することができ、いくつかの状況においては生物学的活性を改善する場合もある。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分の中で維持されている場合には、ＴＡＪ−Ｆｃ融合体は二量体であり、したがって、二価の分子を形成する。単量体Ｆｃ融合体の均質な集団によって、単特異的二価二量体が生じる。それぞれが異なる特異性を有している２つの単量体Ｆｃ融合体の混合物によっては、二重特異的二価二量体が生じる。
他の融合タンパク質
ＴＡＪポリペプチドはまた、ＴＡＪ部分の精製または同定を容易にするために、異種ペプチドに対して融合させることができる。例えば、ヒスチジンタグは、市販されているクロマトグラフィー手段を使用する精製を容易にするために、ＴＡＪポリペプチドに対して融合させることができる。
本発明のいくつかの実施形態においては、ＴＡＪ融合構築物は、細菌の中でのＴＡＪ部分の生産を増強させるために使用される。このような構築物においては、通常、高レベルで発現され、そして／または分泌された細菌タンパク質が、ＴＡＪポリペプチドのＮ末端融合パートナーとして使用される。例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｇｅｎｅ ６７：３１；Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４；Ｌａ Ｖａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１８７を参照のこと。
適切な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端にＴＡＪ部分を融合させることによって、ＴＡＪポリペプチドの二価の形態または四価の形態を得ることができる。例えば、ＴＡＪ部分を、Ｉｇ部分のアミノ末端およびカルボキシ末端に融合させて、２つのＴＡＪ部分を含む二価の単量体ポリペプチドを生じさせることができる。２つのこれらの単量体の二量体化の際には、Ｉｇ部分によって、ＴＡＪタンパク質の四価の形態が得られる。このような多価形態は、標的に対する高い結合親和性を得るために使用することができる。ＴＡＪの多価形態はまたタンデムにＴＡＪ部分を配置して、コンカタマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）を形成させることができ、これは、単独で使用することも、また、ＩｇもしくはＨＳＡのような融合パートナーに融合させることもできる。
結合させたポリマー
対応するアミノ反応基およびチオール反応基を含む任意の数のクロスリンカーを、第２のタンパク質（例えば、血清アルブミン）に対してＴＡＪを連結させるために使用することができる。適切なリンカーの例としては、チオール反応性マレイミド（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ，およびＧＭＢＳ）を挿入するアミノ反応性クロスリンカーが挙げられる。他の適切なリンカーは、チオール反応性ハロアセテート基（例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）を挿入する。還元性の連結を保護するためのスルフヒドリル基との反応のための保護されたまたは保護されていないチオールを提供するリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ，およびＳＡＴＰが挙げられる。このような試薬は市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
結合体には、ＴＡＪポリペプチドのＮ末端、または血清アルブミン上のチオール部分が含まれる必要はない。例えば、ＴＡＪ−アルブミン融合体は、遺伝子操作技術を使用して得ることができる。この場合、ＴＡＪ部分は、そのＮ末端、Ｃ末端、またはこれらの両方で、血清アルブミン遺伝子に対して融合させられる。
ＴＡＪ融合タンパク質の発現の代わりとして、異種部分の選択を行い、そしてＴＡＪ部分に対して化学的に結合させることができる。ほとんどの場合には、選択された異種部分は、どのようなものがＴＡＪ部分に融合または結合させられようと、同様の機能を果たす。したがって、異種アミノ酸配列についての以下の議論においては、特に断りのない限りは、異種配列は、融合タンパク質の形態で、または化学結合体として、ＴＡＪ部分に結合させることができると理解される。
ＴＡＪのような薬理学的に活性なポリペプチドは、多くの場合、迅速なインビボでのクリアランスを示すので、体内で治療有効濃度を得るためには大きい用量が必要である。加えて、約６０ｋＤａ未満のポリペプチドは、糸球体濾過を受ける可能性があり、これは多くの場合に、腎臓毒性を導く。比較的小さいポリペプチド（例えば、ＴＡＪフラグメント）の融合または結合は、このような腎族毒性のリスクを下げる、または回避するために使用することができる。治療用ポリペプチドのインビボでの安定性（すなわち、血清半減期）を増大させるための種々の異種アミノ酸配列（すなわち、ポリペプチド部分または「キャリア」）は公知である。
その長い半減期、インビボでの広範囲の分布、および酵素的機能または免疫学的機能の欠損の理由から、原則的には、全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはＨＳＡフラグメントが好ましい異種部分である。方法および材料（例えば、Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１９０４−１９０８、およびＳｙｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｂｌｏｏｄ ８９：３２４３−３２５２に教示されているもの）の適用により、ＨＳＡを、ＴＡＪ部分による薬理学的活性を提示するが、有意に高い（例えば、１０倍から１００倍高い）インビボでの安定性を示すＴＡＪ融合タンパク質または結合体を形成させるために使用することができる。好ましくは、ＨＳＡのＣ末端は、ＴＡＪ部分のＮ末端に融合させられる。ＨＳＡは自然界においては分泌されるタンパク質であるので、融合タンパク質が真核生物の（例えば、哺乳動物の）発現システムの中で生産される場合には、細胞培養培地へのＴＡＪ融合タンパク質の分泌を得るために、ＨＳＡシグナル配列を利用することができる。
本発明のいくつかの実施形態には、１つ以上のポリマーがＴＡＪポリペプチドに連結させられた（共有結合させられた）ＴＡＪポリペプチドが含まれる。このような結合体に適しているポリマーの例としては、ポリペプチド（上記）、糖ポリマー、およびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。必ずしもそうではないが、通常は、ポリマーは、以下の１つ以上を改善する目的のためにＴＡＪポリペプチドに結合させられる：溶解度、安定性、または生体利用性。例えば、ＴＡＪアンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子、およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素）に対して組換えによって融合または結合させることもできる。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ３９６，３８７を参照のこと。
ＴＡＪポリペプチドへの結合に好ましいポリマーのクラスはポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が特に好ましい。ＰＥＧ部分、例えば、１、２、３、４、または５ ＰＥＧポリマーを、個々のＴＡＪポリペプチドに結合させて、ＴＡＪポリペプチド単独と比較して血清半減期を延長させることができる。ＰＥＧ部分には抗原性はなく、本質的には生物学的に不活性である。本発明の実施に使用されるＰＥＧ部分は分岐している場合も、また分岐していない場合もある。
ＴＡＪポリペプチドに結合させられるＰＥＧ部分の数、および個々のＰＥＧ鎖の分子量は様々であり得る。一般的には、ポリマーの分子量が大きければ大きいほど、少ない数のポリマー鎖がポリペプチドに結合させられる。ＰＥＧ部分は、ポリペプチド上の任意の適切な露出している反応基を介してＴＡＪポリペプチドに連結させることができる。露出している反応基（単数または複数）は、例えば、Ｎ末端アミノ基、または内部リジン残基のεアミノ基、あるいはこれらの両方であり得る。活性化されたポリマーは、ＴＡＪポリペプチド上の任意の遊離のアミノ基で反応し、共有結合することができる。遊離のカルボン酸基、適切に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化された炭水化物部分、およびＴＡＪのメルカプト基（利用できる場合）もまた、ポリマーの結合のための反応基として使用することができる。
好ましくは、結合反応においては、ポリペプチドの濃度に応じて、１モルのポリペプチドあたり約１．０から約１０モルの活性化されたポリマーが使用される。通常、選択される割合は、ＴＡＪ部分の所望される薬理学的活性を損なう可能性がある副反応（多くの場合は非特異的である）の最小化と、反応の最大化との間での平衡を示す。好ましくは、ＴＡＪポリペプチドの生物学的活性（例えば、本明細書中に記載されるアッセイのいずれかに示されるか、または当該分野で公知である）の少なくとも５０％が保持され、そして最も好ましくは、ほぼ１００％が保持される。
ポリマーは、従来の化学反応を使用してＴＡＪポリペプチドに結合させることができる。例えば、ポリアルキレングリコール部分を、ＴＡＪポリペプチドのリジンεアミノ基に結合させることができる。リジン側鎖への結合は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の活性なエステル（例えば、ＰＥＧスクシンイミジルコハク酸（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオン酸（ＳＰＡ−ＰＥＧ））を用いて行うことができる。適切なポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳ、ノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、およびＰＮＰ炭酸塩が挙げられる。これらの試薬は市販されている。別のアミノ反応性ＰＥＧリンカーで、スクシンイミジル部分を置換することができる。これらとしては、例えば、イソチオシアネート、炭酸ニトロフェニル、エピキシド、および炭酸ベンゾトリアゾールが挙げられる。条件は、選択性および範囲、または反応を最大にするように選択されることが好ましい。このような反応条件の最適化は、当業者の範囲内である。
ＰＥＧ化は、当該分野で公知のＰＥＧ化反応のいずれかによって行うことができる。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０，１９９２；欧州特許出願公開番号ＥＰ ０ １５４ ３１６および同ＥＰ ０ ４０１ ３８４を参照のこと。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または、同様の反応性水可溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を使用して行うことができる。
アシル化によるＰＥＧ化は、一般的には、ポリエチレングリコールの活性なエステル誘導体の反応が含まれる。任意の反応性ＰＥＧ分子を、ＰＥＧ化に使用することができる。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧである。本明細書中で使用される場合は、「アシル化」としては、治療用タンパク質と水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間での以下のタイプの連結が含まれるが、これらに限定はされない：アミド、カルバメート、ウレタンなど。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応のパラメーターは、ＴＡＪポリペプチドを損傷させるかまたは不活化する可能性がある温度、溶媒、およびｐＨ条件を避けるように選択されるべきである。
好ましくは、連結結合はアミドである。好ましくは、得られる生成物の少なくとも９５％が、モノ−、ジ−、またはトリ−ＰＥＧ化される。しかし、ＰＥＧ化の程度が高いいくつかの種は、使用される特異的な反応条件に応じた量で形成される場合がある。状況によっては、精製されたＰＥＧ化された種は、混合物から、特に、未反応の種から、従来の精製方法（例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および電気泳動を含む）によって分離される。
アルキル化によるＰＥＧ化には、通常、還元剤の存在下でのＰＥＧの末端アルデヒド誘導体のＴＡＪとの反応が含まれる。加えて、当業者であれば、実質的にＴＡＪのＮ末端アミノ基だけをＰＥＧ化（すなわち、モノ−ＰＥＧ化タンパク質）するために好ましい反応条件を操作することができる。モノ−ＰＥＧ化またはポリ−ＰＥＧ化のいずれの場合においても、ＰＥＧ基は好ましくは、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介してタンパク質に結合させられる。特に−ＣＨ２−基に関しては、このタイプの結合は「アルキル」結合として知られている。
モノ−ＰＥＧ化産物を生じる還元的アルキル化による誘導によっては、誘導に利用できる種々のタイプの１級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の異なる反応性が利用される。この反応は、リジン残基のε−アミノ基と、タンパク質のＮ末端アミノ基のε−アミノ基の間でのｐＫａの差を利用することができるｐＨで行われる。このような選択的な誘導によって、アルデヒドのような反応基を含む水溶性ポリマーの、タンパク質への結合が制御される。高分子との結合は、主にタンパク質のＮ末端で起こり、そして、他の反応基（例えば、リジン側鎖のアミノ基）には有意な改変は生じない。
アシル化とアルキル化の両方のアプローチに使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。選択されるポリマーは、好ましくは、１つの反応基（例えば、アシル化のための活性なエステル、またはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように改変されるべきであり、その結果、重合の程度は本発明の方法について提供されるように制御することができる。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水溶性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであるか、またはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。ポリマーは分岐している場合も、また、分岐していない場合もある。アシル化反応については、選択されるポリマー（単数または複数）は、１つの反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化については、選択されるポリマー（単数または複数）は、１つの反応性アルデヒド基を有するべきである。一般的には、水溶性ポリマーは、自然界に存在しているグリコシル残基からは選択されない。なぜなら、これらは、通常は、哺乳動物の組換え発現システムによってより一般的に行われるからである。
ＰＥＧ化されたＴＡＪを調製するための方法には、一般的に、（ａ）ＴＡＪタンパク質またはポリペプチドをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と、分子が１つ以上のＰＥＧ基に結合する条件下で反応させる工程、および（ｂ）反応産物（単数または複数）を得る工程が含まれる。一般的には、アシル化反応について最適な反応条件は、既知のパラメーターと所望される結果に基づいて個々のケースのそれぞれについて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きければ大きいほど、ポリ−ＰＥＧ化産物の割合は大きくなる。
モノ−ポリマー／ＴＡＪの実質的に均質な集団を生じさせるための還元的アルキル化には、通常は、（ａ）ＴＡＪタンパク質またはポリペプチドを反応性ＰＥＧ分子と、還元的アルキル化の条件下で、ＴＡＪのＮ末端アミノ基の選択的な改変を可能にするために適しているｐＨで反応させる工程；および（ｂ）反応産物（単数または複数）を得る工程が含まれる。
モノ−ポリマー／ＴＡＪの実質的に均質な集団については、還元的アルキル化反応の条件は、ＴＡＪのＮ末端に対する水溶性ポリマー部分の選択的結合が可能な条件である。このような反応条件によって、通常は、リジン側鎖のアミノ基とＮ末端アミノ基との間にｐＫａの差が提供される。本発明の目的については、好ましいｐＨは３〜９の範囲であり、好ましくは、３〜６である。
ＴＡＪポリペプチドには、タグ（例えば、タンパク質分解によって実質的に放出することができる部分）が含まれる場合がある。したがって、リジン部分は、改変されたＨｉｓタグを、低分子量のリンカー（例えば、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）（これはリジンとＮ末端の両方と反応する））と最初に反応させること、その後、このタグを切り離すことによって、選択的に改変することができる。その後、ポリペプチドには遊離のＳＨ基が含まれ、これはマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、または遊離のＳＨもしくは保護されたＳＨのような、チオール反応性頭部基を含むＰＥＧで選択的に改変することができる。
Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬は、ＰＥＧ結合のための特異的部位を構成する任意のリンカーで置き換えることができる。例えば、Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、またはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）で置き換えることができる。同様に、タンパク質を、マレイミドを挿入するアミン反応性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ，ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、またはビニルスルホン基と反応させることができ、そして、得られる生成物を遊離のＳＨを含むＰＥＧと反応させることができる。
いくつかの実施形態においては、ポリアルキレングリコール部分は、ＴＡＪポリペプチドのシステイン基にカップリングさせられる。カップリングは、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、またはチオール基を使用して行うことができる。
状況によっては、ＴＡＪポリペプチドは、不安定な結合を介してポリエチレングリコール部分に結合させられる。不安定な結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解、またはスルフヒドリルによる切断において切断することができる。例えば、この結合は、インビボ（生理学的）条件下で切断することができる。
反応は、反応基がＮ末端のαアミノ基上にある場合には、生物学的に活性な物質を不活性なポリマーと、好ましくは、約５〜８のｐＨ、例えば、ｐＨ５、６、７、または８で反応させるために使用される任意の適切な方法によって行うことができる。一般的には、このプロセスには、活性化されたポリマーを調製する工程、その後、タンパク質を活性化させられたポリマーと反応させて、処方に適している可溶性タンパク質を生じさせる工程が含まれる。
抗体またはその免疫特異的フラグメント
本発明の方法で使用されるＴＡＪアンタゴニストにはまた、ＴＡＪ活性のアンタゴニストである、ＴＡＪ特異的抗体、または抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体が含まれる。例えば、ＴＡＪに対する特定のＴＡＪ抗体の結合は、成体の神経系で発現させられると、ニューロンの成長の阻害をブロックし、それによって、ニューロンの生存、神経突起成長、および／または軸索再生を促進する。
本明細書中に記載される方法で使用される特定のアンタゴニスト抗体は、特定のＴＡＪポリペプチドフラグメントまたはドメインに対して特異的に、または優先的に結合する。このようなＴＡＪポリペプチドフラグメントとしては、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約７３位のアミノ酸までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約１１５位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約１７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約７４位のアミノ酸から約１１５位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約７４位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約７４位のアミノ酸から約１７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約１１６位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約１１６位のアミノ酸から約１７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約１１５位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、および／または、細胞外ドメイン全体（配列番号２の約２６位から約１７３位までのアミノ酸に対応する）のアミノ酸フラグメント、あるいは、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約７３位のアミノ酸までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約１１５位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約３３位のアミノ酸から約１７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約７４位のアミノ酸から約１１５位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約７４位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約７４位のアミノ酸から約１７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約１１６位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約１１６位のアミノ酸から約１７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約７３位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約１１５位までのアミノ酸フラグメント、配列番号２の約２６位のアミノ酸から約１６０位までのアミノ酸フラグメント、および／または、細胞外ドメイン全体（配列番号２の約２６位から約１７３位までのアミノ酸に対応する）のアミノ酸フラグメントに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるＴＡＪ改変体ポリペプチドを含む、本質的にこれらから構成される、またはこれらから構成されるＴＡＪポリペプチドが挙げられるが、これらに限定はされない。
他の実施形態においては、本発明には、ＴＡＪの少なくとも１つのエピトープに特異的または優先的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体が含まれる。この場合、エピトープは、配列番号２の少なくとも約４個から５個のアミノ酸、配列番号２の少なくとも７個、少なくとも９個、または配列番号２の少なくとも約１５個から約３０個のアミノ酸を含む、本質的にこれらから構成される、またはこれらから構成される。記載されるように、配列番号２の所定のエピトープのアミノ酸は、連続している場合も、また、直鎖状である場合があるが、必ずしもそうである必要はない。特定の実施形態においては、ＴＡＪの少なくとも１つのエピトープは、細胞表面上に発現されるかまたは可溶性フラグメントとして発現させられる、（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合させられた）ＴＡＪの細胞外ドメインによって形成される直鎖状ではないエピトープを含む、本質的にこれから構成される、またはこれから構成される。したがって、特定の実施形態においては、ＴＡＪの少なくとも１つのエピトープは、配列番号２の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５個から約３０個の間、または少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、または１００個の連続しているか、もしくは連続していないアミノ酸を含む、本質的にこれから構成される、またはこれから構成される。この場合、連続していないアミノ酸によっては、タンパク質の折り畳みを通じてエピトープが形成される。
他の実施形態においては、本発明には、ＴＡＪの少なくとも１つのエピトープに対して特異的または優先的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体が含まれる。この場合、エピトープには、上記の配列番号２の１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上の連続しているか、もしくは連続していないアミノ酸に加えて、タンパク質を改変するさらなる部分が含まれる、本質的にこれから構成される、またはこれから構成される。例えば、炭水化物部分が、ＴＡＪ抗体が改変されていないバージョンのタンパク質に対して結合するよりも、改変された標的タンパク質に対して高い親和性で結合するように、含まれる場合がある。あるいは、ＴＡＪ抗体は改変されていないバージョンの標的タンパク質には全く結合しない。
特定の実施形態においては、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体は、上記のＴＡＪの少なくとも１つのエピトープ、またはフラグメントもしくは改変体に特異的に結合する、すなわち、それが無関係なまたはランダムなエピトープに対して結合するよりも容易にそのようなエピトープに結合する；上記のＴＡＪの少なくとも１つのエピトープ、またはフラグメント、改変体、もしくは誘導体に優先的に結合する、すなわち、それが、関連する、類似する、ホモログである、またはアナログであるエピトープに結合するよりも容易にそのようなエピトープに結合する；上記のＴＡＪの特定のエピトープ、またはフラグメントもしくは改変体に特異的または優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害する；あるいは、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、または約１０−１５Ｍ未満の結合解離定数ＫＤを特徴とする親和性で、上記のＴＡＪの少なくとも１つのエピトープ、またはフラグメントもしくは改変体に結合する。特定の態様においては、抗体またはそのフラグメントは、マウスのＴＡＪポリペプチドまたはそのフラグメントに対するよりも、ヒトＴＡＪポリペプチドまたはそのフラグメントに優先的に結合する。
抗体の結合解離定数の状況で使用される場合には、用語「約」によって、抗体の親和性を測定するために利用される方法に固有のある程度のバリエーションが可能である。例えば、使用される装置の精度のレベル、測定される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差に応じて、用語「約１０−２Ｍ」には、例えば、０．０５Ｍから０．００５Ｍまでが含まれる場合がある。
特異的な実施形態においては、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体は、ＴＡＪポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体に対して、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１、または１０−３秒−１未満、あるいはこれらと同等の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。あるいは、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体は、ＴＡＪポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体に対して、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１未満、あるいはこれらと同等の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。
他の実施形態においては、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体は、ＴＡＪポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体に対して、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、または５×１０４Ｍ−１秒−１を上回るか、あるいはこれらと同等の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合する。あるいは、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメント、改変体、もしくは誘導体は、ＴＡＪポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体に対して、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、５×１０６Ｍ−１秒−１、または１０７Ｍ−１秒−１を上回るか、あるいはこれらと同等の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合する。
１つの実施形態においては、本発明の方法で使用されるＴＡＪアンタゴニストは抗体分子またはその免疫特異的フラグメントである。他の場所に特に記載されなければ、本明細書中で使用される場合は、抗体に関する「そのフラグメント」は、免疫特異的フラグメント、すなわち、抗原特異的フラグメントを意味する。１つの実施形態においては、本発明の抗体は、二重特異的結合分子、結合ポリペプチド、または抗体であり、例えば、二重特異的抗体、ミニボディー、ドメイン欠失抗体、または１つ以上のエピトープ（例えば、１つ以上の抗原、もしくは同じ抗原上の１つ以上のエピトープ）に対して結合特異性を有している融合タンパク質である。１つの実施形態においては、二重特異的抗体は、ＴＡＪ上の少なくとも１つのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異的抗体は、ＴＡＪの１つのエピトープに特異的な２つの標的結合ドメインと、第２の標的に特異的な２つの標的結合ドメインを有している四価抗体である場合がある。したがって、四価二重特異的抗体は、それぞれの特異性について二価であり得る。
本発明の特定の実施形態には、所望される生化学的特性、（例えば、ほぼ同じ免疫原性である、全体である変化させられていない抗体と比較した場合の、低いエフェクター機能、非共有的に二量体化する能力、ニューロンの部位に局在化する高い能力、短い血清半減期、または長い血清半減期）を提供するように、定常領域ドメインの少なくとも１つ以上の画分が欠失させられているかまたは別の方法で変化させられている、ＴＡＪアンタゴニスト抗体、またはその免疫特異的フラグメントの投与が含まれる。例えば、本明細書中に記載される処置方法で使用される特定の抗体は、ドメイン欠失抗体であり、これには、免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖が含まれているが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部が欠失している。例えば、特定の抗体においては、改変された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失させられ、例えば、ＣＨ２ドメインの全体または一部が欠失させられる。
本明細書中に記載される治療方法に使用される特定のＴＡＪアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメントにおいては、Ｆｃ部分は、当該分野で公知の技術を使用してエフェクター機能を低下させるように変異させられる場合がある。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活化（点変異または他の手段による）によって、循環している改変された抗体のＦｃレセプター結合が減少させられる場合があり、これによって、（特に、ニューロンにおいて）ＣＮＳの局在化が増強される。他の場合には、本発明と一致する定常領域の改変によって、補体結合が和らげられ、これにより、結合した細胞毒素の血清半減期が短縮され、そして非特異的結合が減少させられることが起こり得る。定常領域のなお他の改変を、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を改変するために使用することができ、これにより、高い抗原特異性または抗体柔軟性の理由から局在化の増強が可能となる。生じる改変の生理学的プロフィール、生体利用性、および他の生化学的効果（例えば、ＣＮＳの局在化、生体分布、および血清半減期）は、容易に測定することができ、そして過度の実験を行うことなく、周知の免疫学的技術を使用して定量することができる。
本明細書中に開示される診断方法および治療方法で使用される改変された形態の抗体またはその免疫特異的フラグメントは、当該分野で公知の技術を使用して、前駆体またはもとの抗体全体から作成することができる。例示的な技術は、本明細書中でさらに詳細に議論される。
特定の実施形態においては、本明細書中に開示される処置方法に使用されるＴＡＪアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメントの可変領域および定常領域のいずれもが、完全にヒトのものである。完全なヒト抗体は、当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載される技術を使用して作成することができる。例えば、特異的抗原に対する完全なヒト抗体は、抗原でのチャレンジに応答してそのような抗体を生産するように改変されているが、その内因性遺伝子座が不能にさせられているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。そのような抗体を作成するために使用することができる例示的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号に記載されている。他の技術は当該分野で公知である。完全なヒト抗体は、種々のディスプレイ技術（例えば、本明細書中で別の場所にさらに詳細に記載される、ファージディスプレイ、または他のウイルスディスプレイシステム）によって、同様に作成することができる。
本明細書中で開示される方法に使用されるＴＡＪアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメントは、当該分野で公知である技術を使用して作成する、または製造することができる。特定の実施形態においては、抗体分子またはそのフラグメントは「組換えによって生産される」、すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して生産される。抗体分子またはそのフラグメントを作成するための例示的な技術は、本明細書中で別の場所にさらに詳細に議論される。
好ましい実施形態においては、本明細書中に開示される方法で使用されるＴＡＪアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメントは、処置される動物（例えば、ヒト）においては、有害な免疫応答を誘発することはないであろう。１つの実施形態においては、本明細書中に開示される処置方法に使用されるＴＡＪアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメントは、当該分野で認識されている技術を使用してそれらの免疫原性を低下させるように改変される。例えば、抗体をヒト化させる、霊長類化させる、脱免疫化させることができ、また、キメラ抗体を作成することもできる。これらのタイプの抗体は、元の抗体の抗原結合特性を保持しているか、または実質的に保持しているが、ヒトにおいて免疫原性が低いヒト以外の抗体、通常は、マウスまたは霊長類の抗体に由来する。これは、種々の方法によって行うことができ、これには、（ａ）キメラ抗体を作成するために、ヒト定常領域上にヒト以外の可変ドメインの全体を繋ぐ工程；（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持しているかまたは保持していないヒトフレームワークおよび定常領域に１つ以上のヒト以外の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部を繋ぐ工程；あるいは、（ｃ）表面残基の置き換えによって、ヒト以外の可変ドメインの全体を移植する工程であって、しかし、ヒト様の分泌を有しているものを「覆い隠す」工程が含まれる。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、ならびに、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１９０，３７０号に開示されている。これらの全ては、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
脱免疫化は、抗体の免疫原性を低下させるためにも使用することができる。本明細書中で使用される場合は、用語「脱免疫化」には、Ｔ細胞エピトープを改変するための抗体の変更が含まれる（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２を参照のこと）。例えば、出発抗体に由来するＶＨおよびＶＬ配列が分析され、そして、ヒトＴ細胞エピトープが個々のＶ領域から「マップ」され、これは、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列中の他の重要な残基に関するエピトープの位置を示す。Ｔ細胞エピトープマップによる個々のＴ細胞エピトープは、最終的な抗体の活性を変化させるリスクが低い別のアミノ酸置換を同定するために分析される。アミノ酸置換の組み合わせを含む別のＶＨおよびＶＬ配列の範囲が設計され、そしてこれらの配列は、結合ポリペプチド（例えば、本明細書中に開示される方法に使用されるＴＡＪアンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメント）の範囲に実質的に組み込まれ、その後、これは機能について試験される。通常は、１２個から２４個の改変体抗体が作成され、試験される。その後、改変されたＶおよびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子が、発現ベクターにクローニングされ、続いて、プラスミドが抗体全体の生産のために細胞株に導入される。その後、抗体は、適切な生化学的アッセイおよび生物学的アッセイにおいて比較され、そして最適な改変体が同定される。
本発明の方法に使用されるＴＡＪアンタゴニスト抗体またはそのフラグメントは、当該分野で公知の任意の適切な方法によって作成される場合もある。ポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によって生産することができる。例えば、ＴＡＪ免疫特異的フラグメントは、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生産を誘導するために、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定はされない種々の宿主動物に投与することができる。種々のアジュバントを、宿主の種に応じて、免疫学的応答を増大させるために使用することができる。これには、フロイトのアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油状エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および有用である可能性があるヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）、およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ））が含まれるが、これらに限定はされない。このようなアジュバントもまた当該分野で周知である。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範囲の種々の技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）（上記参考文献はそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に教示されている技術を含むハイブリドーマ技術を使用して生産することができる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合は、ハイブリドーマ技術によって生産された抗体に限定はされない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物のクローン、原核生物のクローン、またはファージクローンを含む１つのクローンに由来する抗体を意味し、そしてそれが生産される方法を意味するものではない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生産された抗体に限定はされない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、および組換え技術、およびファージディスプレイ技術の使用を含む、当該分野で公知の広い範囲の種々の技術を使用して調製することができる。
１つの例においては、当該分野で認識されているプロトコールを使用して、抗体は、関連抗原（例えば、精製されたＴＡＪ抗原、またはそのような抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）とアジュバントの複数回の皮下または腹腔内注射によって、哺乳動物において惹起させられる。この免疫によっては、通常、活性化された脾臓細胞またはリンパ球による抗原反応性抗体の生産を含む免疫応答が誘発される。得られる抗体は、動物の血清から回収してポリクローナル調製物を生じることができるが、多くの場合には、脾臓、リンパ節、または末梢血から個々のリンパ球を単離し、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均質な調製物を生じることが所望される。好ましくは、リンパ球は、脾臓から得られる。
この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）においては、抗原が注射された哺乳動物に由来する、比較的短期間しか生存できないか、または死ぬ運命にあるリンパ球が、不死化腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合させられ、これによって、不死化させられ、なおかつ、Ｂ細胞の遺伝子によってコードされる抗体を生産することができる、ハイブリッド細胞、すなわち、「ハイブリドーマ」が生じる。得られるハイブリッドは、１つの抗体の形成のための特異的な遺伝子を含むそれぞれ別個の株での選択、希釈、および再生によって、１つの遺伝的な株に分離される。これらは、所望される抗原に対して同種であり、そしてそれらの純粋な遺伝的な関係に関して「モノクローナル」と呼ばれる抗体を生産する。
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、融合させられていないもとの骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含む、適切な培養培地の中に播種され、その中で増殖させられる。当業者であれば、ハイブリドーマの形成、選択、および増殖のための試薬、細胞株、および培地が、多数の供給業者によって市販されており、そして標準化されたプロトコールが十分に確立されていることを理解するであろう。一般的には、ハイブリドーマ細胞がその中で増殖している培養培地は、所望される抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、放射免疫測定（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロアッセイによって決定される。所望される特異性、親和性、および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを、限界希釈手順によってサブクローニングすることができ、そして標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５９−１０３（１９８６））によって増殖させることができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水、または血清から、例えば、プロテイン−Ａ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような、通常の精製手順によって分離することができることがさらに理解されるであろう。
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって作成することができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（その結果、Ｆａｂフラグメントが生じる）またはペプシン（その結果、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが生じる）のような酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって生産することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントには可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインが含まれる。
当業者はまた、抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡを抗体ファージライブラリーから誘導することもできることを理解するであろう。具体的には、このようなファージは、レパートリーまたは組み合わせ抗体ライブラリー（例えば、ヒト、またはマウス）から発現された抗原結合ドメインをディスプレイするために利用することができる。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を使用して（例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させられた抗原を使用して）、選択または同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに対して組換えによって融合させられた、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィドによって安定化させられたＦｖ抗体ドメインを有しているファージから発現させられたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。例示的な方法は、例えば、ＥＰ ３６８ ６８４ Ｂ１；米国特許第５，９６９，１０８、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．およびＣｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１５：１０６３（２００２）に示されている。これらのそれぞれは、引用により本明細書中に組み入れられる。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２））には、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の生産、さらには、大きなファージライブラリーの構築のためのストラテジーとしての組み合わせ感染およびインビボでの組換えが記載されている。別の実施形態においては、リボソームディスプレイを、ディスプレイプラットフォームとしてバクテリオファージを置き換えるために使用することができる（例えば、Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１（２００１）を参照のこと）。なお別の実施形態においては、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３：２１１（２０００））。このような手順によっては、モノクローナル抗体の単離と、その後のクローニングのための伝統的なハイブリドーマ技術に代わるものが提供される。
ファージディスプレイ方法においては、機能的な抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有しているファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列は、動物のｃＤＮＡライブラリー（例えば、ヒトまたはマウスの、リンパ組織のｃＤＮＡライブラリー）から、あるいは、合成のｃＤＮＡライブラリーから増幅させられる。特定の実施形態においては、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲによってｓｃＦｖと一緒に連結させられ、ファージミドベクターにクローニングされる（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ ６またはｐＣｏｍｂ ３ ＨＳＳ）。ベクターは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にエレクトロポレーションされ、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はヘルパーファージに感染させられる。これらの方法で使用されるファージは、通常、ｆｄとＭ１３を含む繊維状ファージであり、そしてＶＨまたはＶＬ領域は、通常は、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換えによって融合させられている。目的の抗原（すなわち、ＴＡＪポリペプチドまたはそのフラグメント）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して）選択または同定することができる。
抗体を作成するために使用することができるファージディスプレイ方法のさらなる例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９；同ＷＯ９１／１０７３７；同ＷＯ９２／０１０４７；同ＷＯ９２／１８６１９；同ＷＯ９３／１１２３６；同ＷＯ９５／１５９８２；同ＷＯ９５／２０４０１；ならびに、米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号；および同第５，９６９，１０８号（これらのそれぞれは、その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている方法が挙げられる。
上記参考文献に記載されているように、ファージの選択の後、抗体をコードする領域をファージから単離し、そして抗体全体（ヒト抗体を含む）、または任意の他の所望される抗原結合フラグメントを作成するために使用し、そして任意の所望される宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む）の中で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換えによって生産するための技術はまた、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（上記参考文献は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている方法のような、当該分野で公知の方法を使用して利用することができる。
単鎖Ｆｖｓおよび抗体を生産するために使用することができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号、および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７９９５−７９９９（１９９３）；ならびに、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されている技術が挙げられる。ヒトの中での抗体のインビボでの使用およびインビトロでの検出アッセイを含むいくつかの用途については、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域を有している抗体である。キメラ抗体を生産するための方法は当該分野で周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号を参照のこと。これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。ヒト化抗体は、ヒト以外の種に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有している、所望される抗原に結合するヒト以外の種の抗体分子である。多くの場合は、ヒトフレームワーク領域の中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる（好ましくは、改善する）ＣＤＲドナー抗体に由来する対応する残基で置換されるであろう。これらのフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によって（例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデル化、および特定の位置の珍しいフレームワーク残基を同定するための配列比較によって）同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９９８）を参照のこと、これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。）抗体は、例えば、ＣＤＲの接続（ＥＰ ２３９，４００；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、または新しい表面を作ること（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ ５９２，１０６；ＥＰ ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９６９−９７３（１９９４））、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む当該分野で公知の種々の技術を使用してヒト化することができる。
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上記に記載されたファージディスプレイ方法を含む、当該分野で公知の種々の方法によって作成することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、および同第４，７１６，１１１号；ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／４６６４５、同ＷＯ９８／５０４３３、同９８／２４８９３、同ＷＯ９８／１６６５４、同ＷＯ９６／３４０９６、同ＷＯ９６／３３７３５、および同ＷＯ９１／１０７４１もまた参照のこと。これらのそれぞれは、その全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
ヒト抗体はまた、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して生産することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、マウスの胚性幹細胞に、ランダムに、または相同組換えによって導入することができる。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域は、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウスの胚性幹細胞に導入することもできる。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別々に、またはこれと同時に、機能しないようにすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失によっては、内因性の抗体の生産が妨げられる。改変された胚性幹細胞を増殖させ、そして、キメラマウスを生じるように、胚盤胞にマイクロインジェクションすることができる。キメラマウスは、その後、交配させられて、ヒト抗体を発現するホモ接合型子孫が作成される。トランスジェニックマウスは、選択された抗原（例えば、所望される標的ポリペプチドの全体または一部）を用いて、通常の様式で免疫化される。抗原に対するモノクローナル抗体は、免疫化されたトランスジェニックマウスから、通常のハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスが有しているヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞の分化の間に再配置され、その後、クラスのスイッチおよび体細胞変異を受ける。したがって、このような技術を使用すると、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を生産することができる。ヒト抗体を生産するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのこの技術、ならびにこのような抗体を生産するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／２４８９３、同ＷＯ９６／３４０９６；同ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと。これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）のような会社は、上記に記載されている技術と同様の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することを請け負っている。
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を使用して作成することができる。このアプローチにおいては、選択されたヒト以外のモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を導くために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。米国特許第５，５６５，３３２号もまた参照のこと。
別の実施形態においては、所望されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、配列決定することができる。単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターの中に入れることができる。これは、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような、別の方法で免疫グロブリンを生産することはない原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞にトランスフェクトされる。より具体的には、単離されたＤＮＡ（本明細書中に記載されるように合成することができる）を使用して、１９９５年１月２５日に提出されたＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，６５８，５７０号（これは引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているように、抗体の製造のための定常領域および可変領域配列をクローニングすることができる。本質的に、これにより、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを使用したＰＣＲによる増幅が可能になる。この目的に適しているプライマーはまた、米国特許第５，６５８，５７０号にも記載されている。以下にさらに詳細に議論されるように、所望される抗体を発現する形質転換された細胞は、比較的大量に増殖させ、免疫グロブリンの臨床的な供給源および商業的な供給源を提供することができる。
特異的な実施形態においては、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、当該分野で周知の方法によって（例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列に対して比較することによって）、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定するために調べ、配列超可変性の領域を決定することができる。日常的に行われている組換えＤＮＡ技術を使用して、１つ以上のＣＤＲをフレームワーク領域の中に、例えば、ヒト以外の抗体をヒト化するためにヒトのフレームワーク領域の中に、挿入することができる。フレームワーク領域は、自然界に存在しているフレームワーク領域、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、好ましくは、ヒトフレームワーク領域（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについては、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲの組み合わせによって作成されるポリヌクレオチドは、所望されるポリペプチド（例えば、ＴＡＪ）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換をフレームワーク領域の中に作成することができ、そして、好ましくは、このアミノ酸置換によってその抗原に対する抗体の結合が改善される。加えて、このような方法は、鎖内ジスルフィド結合に関係している１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作成して、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠失している抗体分子を作成するために使用することができる。ポリヌクレオチドに対する他の変更が本発明に含まれ、これらは当業者の能力の範囲内である。
加えて、適切な生物学的活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子とともに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子に由来する遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））を使用することができる。本明細書中で使用される場合は、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域を有している抗体、例えば、ヒト化抗体である。
あるいは、単鎖抗体の生産のための記載されている技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５５４（１９８９））を、単鎖抗体を生産するように適合させることができる。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを連結させて単鎖抗体を生じさせることによって形成される。機能的なＦｖフラグメントの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中でのアセンブリのための技術もまた、使用することができる（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
ＴＡＪアンタゴニスト抗体はまた、内因性免疫グロブリンの生産ができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）の中で作成されたヒト抗体である場合も、または実質的にヒト抗体である場合もある（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号、および同第５，５８９，３６９号（これらのそれぞれは引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。例えば、キメラである生殖系変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域のホモ接合型欠損が、内因性の抗体の生産の完全な阻害を生じることが記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子のアレイのこのような生殖系変異体マウスへの導入によっては、抗原でチャレンジされるとヒト抗体の生産が生じるであろう。ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を作成する別の好ましい手段は、米国特許第５，８１１，５２４号に開示されており、これは、引用により本明細書中に組み入れられる。これらのヒト抗体と会合する遺伝的物質もまた、本明細書中に記載されるように単離し、そして操作することができることは明らかであろう。
組換え抗体を作成するためのなお別の非常に有効な手段は、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。具体的には、この技術によって、サルの可変ドメインとヒト定常配列を含む感作された抗体の作成が生じる。この参考文献は、その全体が引用により本明細書中に組み入れられる。さらに、この技術はまた、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６９３，７８０号、および同第５，７５６，０９６号にも記載されている。これらのそれぞれは、引用により本明細書中に組み入れられる。
別の実施形態においては、リンパ球を顕微操作によって選択し、そして可変遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞は、免疫化した哺乳動物から単離し、そしてインビトロで約７日間培養することができる。培養物は、スクリーニング基準を満たす特異的ＩｇＧについてスクリーニングすることができる。ポジティブなウェルに由来する細胞を単離することができる。個々のＩｇを生産するＢ細胞をＦＡＣＳによって、または補体によって媒介される溶血プラークアッセイにおいてそれらを同定することによって、単離することができる。Ｉｇを生産するＢ細胞は、チューブの中に顕微操作することができ、そしてＶＨおよびＶＬ遺伝子を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクターにクローニングし、発現のための細胞（例えば、真核生物細胞または原核生物細胞）にトランスフェクトすることができる。
あるいは、抗体を生産する細胞株は、当業者に周知の技術を使用して選択し、培養することができる。このような技術は、種々の研究室用のマニュアル、および主要な刊行物に記載されている。この態様においては、以下に記載される本発明での使用に適している技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，編．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）（これは、補遣を含むその全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
本明細書中に開示される治療方法で使用される抗体は、抗体の合成（具体的には、化学合成）のための当該分野で公知の任意の方法によって、または、好ましくは、本明細書中に記載されている組換え発現技術によって生産することができる。
本発明の範囲にはさらに、抗原結合ＤＮＡ配列の対立遺伝子、改変体、および突然変異の全てが含まれることは明らかであろう。
周知であるように、ＲＮＡは、標準的な技術（例えば、グアニジンイソチオシアネート抽出、および沈殿、その後の遠心分離またはクロマトグラフィー）によって、もともとのハイブリドーマ細胞から、または他の形質転換された細胞から単離することができる。所望される場合には、ｍＲＮＡは、標準的な技術（例えば、オリゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィー）によって全ＲＮＡから単離することができる。適切な技術は当該分野でよく知られている。
１つの実施形態においては、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法に従って、逆転写およびＤＮＡポリメラーゼを使用して、同時にまたは別々にのいずれかで、作成することができる。ＰＣＲは、コンセンサスな定常領域プライマーによって、または公開されている重鎖および軽鎖のＤＮＡならびにアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって、開始させることができる。上記で議論されるように、ＰＣＲはまた、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用することもできる。この場合、ライブラリーを、コンセンサスプライマー、またはより大きな相同プローブ（例えば、マウス定常領域プローブ）によってスクリーニングすることができる。
ＤＮＡ（通常は、プラスミドＤＮＡ）を、当該分野で公知の技術を使用して細胞から単離し、そして（例えば、組換えＤＮＡ技術に関する上記の参考文献に）詳細に示されている標準的な周知の技術にしたがって、制限マップし、配列決定することができる。もちろん、ＤＮＡは、単離プロセスまたはその後の分析の間の任意の時点で、本発明にしたがって合成することもできる。
抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくはアナログ（例えば、ＴＡＪアンタゴニストである抗体の重鎖または軽鎖）の組換えによる発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチド、あるいはその一部（好ましくは、重鎖または軽鎖可変ドメインを含む）が得られると、抗体分子の生産のためのベクターを、当該分野で周知の秘術を使用する組換えＤＮＡ技術によって、生産することができる。このように、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現によりタンパク質を調製するための方法が本明細書中に記載される。当業者に周知である方法を、抗体をコードする配列、ならびに、適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法には、例えば、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明によっては、プロモーターに作動可能であるように連結された、本発明の抗体分子、その重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製ベクターが提供される。このようなベクターには、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）が含まれる場合があり、そして、抗体の可変ドメインが、重鎖または軽鎖全体の発現のためのそのようなベクターにクローニングされる場合もある
発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞に導入され、そしてその後、トランスフェクトされた細胞は、本明細書中に記載される方法に使用される抗体を生産させるために従来技術によって培養される。したがって、本発明には、異種プロモーターに作動可能であるように連結された、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が含まれる。二本鎖抗体の発現について好ましい実施形態においては、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを、以下に詳細に記載されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞の中で同時に発現させることができる。
種々の宿主発現ベクターを、本明細書中に記載される方法に使用される抗体分子を発現させるために利用することができる。このような宿主発現システムは、目的のコード配列がそれによって生産され、続いて、精製される媒体を提示するが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、インサイチュで本発明の抗体分子を発現する細胞もまた提示する。これらとしては、抗体をコードする配列を含む組換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチラス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え体酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体をコードする配列を含む組換え体ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させられた昆虫細胞システム；抗体をコードする配列を含む、組換え体ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させられたか、または組換え体プラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞システム；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え体発現構築物を有している哺乳動物細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、そしてより好ましくは、真核生物細胞（特に、組換え体抗体分子全体の発現のためのもの）が、組換え体抗体分子の発現のために使用される。例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中期初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、抗体についての効率のよい発現システムである（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
細菌システムにおいては、多数の発現ベクターを、発現させられる抗体分子について意図される用途に応じて、有利であるように選択することができる。例えば、多量のこのようなタンパク質が生産される場合には、抗体分子の薬学的組成物の作成のために、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルでの発現を指示するベクターが所望される場合がある。このようなベクターとしては、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））（ここでは、抗体をコードする配列を、ｌａｃＺコード領域とともにインフレームでベクターの中に個別に連結することができ、その結果、融合タンパク質が生産される）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定はされない。ｐＧＥＸベクターはまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用することもできる。一般的には、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、その後の遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって、溶解させた細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物を、ＧＳＴ部分から切り離すことができる。
昆虫システムにおいては、核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、通常は、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスはヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞の中で増殖する。抗体をコードする配列は、ウイルスの必須ではない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）の中に別々にクローニングすることができ、そして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置することができる。
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルスをベースとする発現システムを利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、目的の抗体をコードする配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列）に連結させることができる。このキメラ遺伝子は、その後、インビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの必須ではない領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入によっては、感染させられた宿主の中で生存可能であり、そしてその中で抗体分子を発現することができる組換え体ウイルスが得られるであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特異的な開始シグナルが、挿入された抗体をコードする配列の効率のよい翻訳に必要である場合もある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入フラグメント全体の翻訳を確実にするためには、所望されるコード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源のものであり、自然界に存在しているものであっても、合成のものであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強させることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、あるいは、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変しそしてプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要である場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変について、特徴的であり、そして特異的である機構を有する。適切な細胞株または宿主システムは、発現させられる外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択することができる。この目的のためには、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞性機構を有している真核生物宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および特に、乳ガン細胞株（例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄ）、ならびに正常な乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
組換え体タンパク質の長期間の多量の生産のためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株を操作することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡと選択マーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を、富化培地の中で１〜２日間増殖させることができ、その後、選択培地に移すことができる。組換え体プラスミドの中の選択マーカーによって選択に対する耐性が付与され、そして、細胞に、それらの染色体にプラスミドを安定に組み込ませることができ、そして次いでクローニングし、細胞株へと拡大させることができる遺伝子座を形成するように増殖させることができる。この方法は、抗体分子を安定に発現する細胞株を操作するように有利に使用することができる。
多数の選択システムを使用することができ、これには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７ １９８０）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。これらは、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞において使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択基準として使用することができる：ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を付与する）（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ（これは、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月）；ならびに、ｈｙｇｒｏ（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。使用することができる組換えＤＮＡ技術についての当該分野で公知である一般的な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；ならびに、第１２章および１３章，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９８１）（これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅によって増大させることができる（概要については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｉｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクターシステムの中のマーカーを複製させることができる場合には、宿主細胞の培養物中に存在している阻害因子のレベルの増大によって、マーカー遺伝子のコピー数が増加させられるであろう。増幅された領域は抗体遺伝子と関係するので、抗体の生産もまた増大するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクターで同時トランスフェクトすることができ、第１のベクターは、重鎖由来のポリペプチドをコードし、そして第２のベクターは軽鎖由来のポリペプチドをコードする。２つのベクターには、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同じ選択マーカーが含まれる場合がある。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードする１つのベクターが使用される場合もある。このような状況では、軽鎖は、毒性のない重鎖の過剰を回避するために、重鎖の前に配置されることが有効である（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列には、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが含まれる場合がある。
一旦、本発明の抗体分子が組換えによって発現されると、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当該分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（具体的には、プロテインＡの後の特異的抗原に対する親和性による）、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）によって、遠心分離、溶解度の差、あるいは、タンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製することができる。あるいは、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法は、ＵＳ ２００２ ０１２３０５７ Ａ１に開示されている。
１つの実施形態においては、本発明の方法で使用される結合分子または抗原結合分子には、１つ以上のドメインが部分的または完全に欠失させられている合成の定常領域が含まれる（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態においては、適合するように改変された抗体には、ＣＨ２ドメイン全体が除去されているドメイン欠失構築物または改変体（ΔＣＨ２構築物）が含まれるであろう。他の実施形態については、短い結合ペプチドで欠失させられたドメインを置き換え、これによって、可変領域の移動の柔軟性および自由度が提供される。当業者であれば、抗体の代謝速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性の理由からこのような構築物が特に好ましいことを理解するであろう。
特定の実施形態においては、本明細書中に開示される方法で使用される改変された抗体はミニボディーである。ミニボディーは当該分野において記載されている方法を使用して作成することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号、またはＷＯ９４／０９８１７Ａ１を参照のこと）。
別の実施形態においては、本明細書中に開示される方法で使用される改変された抗体は、当該分野で公知であるＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄによる）を使用して導くことができる（例えば、ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２を参照のこと）。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失させ、そしてドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するように操作された。
１つの実施形態においては、本明細書中に開示される処置方法で使用されるＴＡＪアンタゴニスト抗体またはそのフラグメントには、数個、もしくはそれ以上の１アミノ酸の欠失または置換を有している免疫グロブリン重鎖が、それが単量体サブユニット間で会合する限りは含まれる。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域での１アミノ酸の変異が、Ｆｃ結合を実質的に減少させ、それによって腫瘍の局在化を増大させるために十分である場合がある。同様に、調節されるエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの一部を単に欠失させることが望ましい場合もある。定常領域のこのような部分的な欠失によって、抗体の選択される特性（血清半減期）を改善し、一方では、目的の定常領域ドメインに伴う他の望ましい機能は完全なままにする。さらに、上記に指摘されているように、開示される抗体の定常領域は、得られる構築物のプロフィールを増強させる１つ以上のアミノ酸の変異または置換によって合成することができる。この態様においては、保存された結合部位によって提供される活性（例えば、Ｆｃ結合）を破壊し、一方では、改変された抗体の立体配置および免疫原性プロフィールは実質的に維持することが可能であり得る。なお他の実施形態には、所望される特性（例えば、エフェクター機能）を増強させるため、または、さらなる細胞毒性もしくは炭水化物結合を提供するための定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加が含まれる。このような実施形態においては、選択される定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入するまたは置き換えることが所望される場合がある。
本発明により、また、本明細書中に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の改変体（誘導体を含む）を含む、本質的にこれから構成される、またはこれから構成される抗体の使用が提供される。この抗体またはそのフラグメントは、ＴＡＪポリペプチドに対して免疫特異的に結合する。当業者に公知の標準的な技術は、結合分子をコードするヌクレオチド配列に変異（アミノ酸置換を生じる部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲによって媒介される突然変異誘発）が含まれるが、これらに限定はされない）を導入するために使用することができる。好ましくは、改変体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３と比較して、５０個未満のアミノ酸の置換、４０個未満のアミノ酸緒置換、３０個未満のアミノ酸の置換、２５個未満のアミノ酸の置換、２０個未満のアミノ酸の置換、１５個未満のアミノ酸の置換、１０個未満のアミノ酸の置換、５個未満のアミノ酸の置換、４個未満のアミノ酸の置換、３個未満のアミノ酸の置換、または２個未満のアミノ酸の置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の電荷を有している側鎖を含むアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の電荷を有している側鎖を含むアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を含むアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を含むアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を有していない極性側鎖を含むアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を含むアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を含むアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を含むアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あるいは、変異は、コード配列全体または一部に沿ってランダムに（例えば、飽和突然変異誘発によって）導入することができ、得られる変異体を、活性を保持している変異体を同定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。
例えば、抗体分子のフレームワーク領域だけ、またはＣＤＲ領域だけに変異を導入することが可能である。導入された変異は、サイレントである場合も、また中性のミッセンス変異（すなわち、抗原に結合する抗体の能力に対しては全く影響を及ぼさないかほとんど影響を及ぼさない）である。これらのタイプの変異は、コドン使用を最適化するため、またはハイブリドーマ抗体の生産を改善するために有用であり得る。あるいは、非中性のミッセンス変異によって、抗原に結合する抗体の能力が変化する場合もある。ほとんどのサイレントな中性のミッセンス変異の位置はフレームワーク領域の中にあるようであるが、ほとんどの非中性のミッセンス変異の位置はＣＤＲの中にあるようである。しかし、これは絶対条件ではない。当業者は、抗原結合活性に変更を生じない、または結合活性の変更（例えば、抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）のような所望される特性を有している変異体分子を設計し、そして試験することができるであろう。突然変異誘発の後、コードされるタンパク質を日常的に行われているように発現させることができ、コードされるタンパク質の機能的および／または生物学的活性を、本明細書中に記載されている技術を使用して、または当該分野で公知である日常的に行われている改変技術によって決定することができる。
本明細書中に記載されている方法で使用される抗体には、ポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体が含まれ、これには、全長の抗体、抗体ホモログ（例えば、多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体））、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全なヒト抗体、ならびに上記のいずれかのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントを含む）、ダイアボディー、直鎖状抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成された多特異的抗体が、これらが所望される生物学的活性を示す限りにおいて含まれる。モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団であるとして抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の生産が必要であるとは解釈されない。
例えば、モノクローナル抗体としては、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成された抗体が挙げられ、また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作成することもできる。モノクローナル抗体は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。モノクローナル抗体にはまた、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）（ここでは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、一方、鎖（単数または複数）の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一であるかまたは相同である）、ならびに、そのような抗体のフラグメントも、それらが所望される生物学的活性を示す限りにおいて含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
ヒト化モノクローナル抗体も含まれる。ほとんどの部分については、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、その中のレシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有しているヒト以外の種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはヒト以外の霊長類）の超可変領域に由来する残基によって置き換えられている。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が対応するヒト以外の残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体には、レシピエント抗体の中、またはドナー抗体の中には見られない残基が含まれる場合がある。これらの改変は、抗体の能力にさらに磨きをかけるために作成される。一般的には、ヒト化抗体には、少なくとも１つ（通常は、２つ）の可変ドメインの実質的に全てが含まれ、ここでは、ヒト以外の免疫グロブリンのものに対応する超可変ループの全てもしくは実質的に全て、またはＦＲ領域の全てもしくは実質的に全てに対する、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体には、状況に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（通常は、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部も含まれるであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
「単鎖Ｆｖ」、すなわち「ｓＦｖ」抗体フラグメントには、抗体のＶＨおよびＶＬドメインが含まれる。ここでは、これらのドメインは、一本鎖であるポリペプチド鎖の中に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドにはさらに、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーが含まれ、これによって、ｓＦｖが抗原結合のための所望される構造を形成することができる。ｓＦｖの概要については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
用語「ダイアボディー」は、２つの抗原結合部位を有している小さい抗体フラグメントを意味する。このフラグメントには、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が含まれている。同じ鎖の上にある２つのドメインの間で対合させるには短すぎるリンカーを使用することによって、これらのドメインは別の鎖の相補ドメインと対合するように向けられ、２つの抗原結合部位が作成される。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに完全に記載されている。
表現「直鎖状抗体」は、本出願を通じて使用される場合は、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載されている抗体を意味する。簡潔に説明すると、これらの抗体には、タンデムなＦｄセグメントの対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）が含まれており、これは、抗原結合領域の対を形成する。直鎖状抗体は二重特異的である場合も、また単特異的である場合もある。
抗体または抗体フラグメントを発現させるためには、軽鎖および重鎖の一部または全長をコードするＤＮＡが、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来のエピソームなどの発現ベクターに挿入される。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子と抗体の重鎖遺伝子は、別のベクターに挿入することができる。いくつかの実施形態においては、両方の遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。
便利なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードするものである。好ましくは、任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し、発現することができるように、制限部位が操作される。このようなベクターにおいては、スプライシングは、通常、挿入されたＪ領域の中のスプライシングドナー部位と、ヒトＣ領域の前にあるスプライシングアクセプター部位の間で生じ、また、ヒトＣＨエキソンの中に存在するスプライシング領域でも生じる。ポリアデニル化および転写の終結は、コード領域の下流にある自然界に存在している染色体部位で生じる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。
いくつかの実施形態においては、ＴＡＪ抗体（または抗原結合抗体フラグメント）は、予め形成させられたポリペプチドとして直接、または核酸ベクターを通じて間接的に投与することができ、これによって、ＴＡＪによるシグナル伝達またはＴＡＪの複合体の形成をブロックし、有効な軸索成長を可能にすることができる。
抗体および抗体フラグメントならびにホモログを作成し、使用するための技術は、例えば、Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｔｏ Ｂｅｎｃｈ），１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００．ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；およびＯｓｂｏｕｒｎ（２００３）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ ８（１８）：８４５−５１に見ることができる。
ＴＡＪポリヌクレオチドアンタゴニスト
特異的な実施形態には、ＴＡＪをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸分子を含む有効量のＴＡＪポリペプチドアンタゴニストを投与する工程を含む、神経突起成長を増大させる方法が含まれる。ＴＡＪポリヌクレオチドはＴＡＪの発現を妨げる（ノックダウン）。ＴＡＪポリヌクレオチドアンタゴニストとしては、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉが挙げられるが、これらに限定はされない。通常、このような結合分子は動物に別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）が、このような結合分子は、宿主細胞によって取り込まれたポリヌクレオチドからインビボで発現させることも、またインビボで発現させることもできる。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）もまた参照のこと。
ＲＮＡｉは、標的化されたｍＲＮＡの発現を妨害するＲＮＡの発現を意味する。具体的には、ＲＮＡｉによって、ｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ）を介した特異的ｍＲＮＡ（例えば、ＴＡＪ）との相互作用によって標的化遺伝子をサイレンスにする。ｄｓＲＮＡ複合体は、その後、細胞による分解の標的とされる。さらなるＲＮＡｉ分子としては、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；また、短い干渉ヘアピンも挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子には、ループによって繋がれた標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列が含まれる。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡとともに分解される。Ｐｏｌ ＩＩＩまたはＵ６プロモーターは、ＲＮＡｉのＲＮＡを発現させるために使用することができる。
ＲＮＡｉは、それらの「標的」ｍＲＮＡに対する配列特異的相同性を有している二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：９７４２−９７４７，２００１）。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の細胞を含まない溶解物中での生化学的実験は、ＲＮＡ依存性の遺伝子サイレンシングの媒介因子が２１〜２５個のヌクレオチドの「小さい干渉」ＲＮＡ二本鎖（ｓｉＲＮＡ）であることを示している。したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、本発明の方法において有利に使用される。ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲとして知られているＲＮａｓｅによるｄｓＲＮＡのプロセシングによって誘導される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６，２００１）。ｓｉＲＮＡ二本鎖産物はＲＩＳＣ（ＲＮＡによって誘導されるサイレンシング複合体（ＲＮＡ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ））と呼ばれる多タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体に動員されることが明らかである。いずれの特定の理論によっても束縛されることは望ましくないが、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡに導かれ、ここでは、ｓｉＲＮＡ二本鎖が触媒様式での切断を媒介するように配列特異的に相互作用すると考えられる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：１７７６−１７８０，２００１）。
ＲＮＡｉは、遺伝子機能を分析するため、および限定的ではない例としてニューロン（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１１９２６−１１９２９，２００２）を含む哺乳動物細胞の中の必須の遺伝子を同定するために使用されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６：１９９−２１３，２００２；Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１４：４５５７−４５６５，２００１）。ＲＮＡｉはまた、治療手順（例えば、ポリオウイルス（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３７９−３８０，２００２）およびＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：５１９６−５２０１，２００２）を含むがこれに限定はされないウイルスの感染、複製、および／もしくは増殖の阻害またはブロック、ならびに、腫瘍遺伝子（例えば、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子；Ｓｃｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｐ ２６ ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ，２００２）の発現の低下）についても評価される。ＲＮＡｉは、哺乳動物（マウス）および両生類（ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ））の胚（それぞれ、Ｃａｌｅｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３６−１４２４０，２００２；およびＺｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：１６６４−１６６９，２００２）、ならびに、出生後のマウス（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３２：１０７−１０８，２００２）の中で遺伝子発現を調節するために、そして、成体であるトランスジェニックマウスの中でトランス遺伝子の発現を低下させるために（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３８−３９，２００２）使用されている。細胞培養物中で、およびインビボで、ｓｉＲＮＡの効率および特異性を決定するための複数の方法が記載されている（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９６：１０００−１００４，２００２；Ｌａｓｓｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ ＳＴＫＥ ２００２（１４７）：ＰＬ１３，２００２；およびＬｅｉｒｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９５：７４４−７４８，２００２を参照のこと）。
ｓｉＲＮＡを含むがこれに限定はされないＲＮＡｉを媒介する分子は、化学合成によって（Ｈｏｈｊｏｈ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５２１：１９５−１９９，２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解によって（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９９４２−９９４７，２００２）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写によって（Ｄｏｎｚｅｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ４６，２００２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：６０４７−６０５２，２００２）、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅ ＩＩＩのようなヌクレアーゼを使用する二本鎖ＲＮＡの加水分解によって（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９９４２−９９４７，２００２）、インビトロで生産することができる。
ｓｉＲＮＡ分子はまた、互いに、２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって形成させることもでき、これは、通常は、以下の一般的構造を有する。これには、二本鎖部分と一本鎖部分の両方が含まれる：
Figure 0005060293
 式中、Ｎ、Ｘ、およびＹはヌクレオチドであり；ＸはＹに対する水素結合であり；「：」は２つの塩基の間での水素結合を示し；ｘは１から約１００の間の値を有している自然数であり；そしてｍとｎは、０から約１００の間の値を独立して有している整数である。いくつかの実施形態においては、Ｎ、Ｘ、およびＹは、独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴまたはＵである。自然界には存在しない塩基およびヌクレオチドもまた、特に、合成のｓｉＲＮＡ（すなわち、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリング産物）の場合には存在する可能性がある。二本鎖の中心部分は「コア」と呼ばれ、尺度として塩基対（ｂｐ）を有している。一本鎖部分は突出であり、これは、尺度としてのヌクレオチド（ｎｔ）を有している。示される突出は３’突出であるが、５’突出を有している分子もまた本発明の範囲に含まれる。突出を有していないｓｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍ＝０、そしてｎ＝０）、およびコアの一方に突出を有しており、他方には有していない（すなわち、ｍ＝０、そしてｎ＞１、もしくはその逆）ｓｉＲＮＡ分子もまた、本発明の範囲に含まれる。
最初に、ＲＮＡｉ技術は、哺乳動物システムに容易に適用することはできないようである。これは、哺乳動物においては、ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡによって活性化されるプロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化し、それによってアポトーシスのカスケードおよび細胞死を生じる（Ｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：３２７９−３２８３，１９９７）ことが原因である。加えて、ｄｓＲＮＡは哺乳動物細胞の中のインターフェロンカスケードを活性化し、これはまた、異なる細胞生理学を導くことができることは以前から知られている（Ｃｏｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：３３３，１９７１；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：５１７，１９７２；Ｌａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５８Ｌ７８２，１９６７；Ｌｏｍｎｉｃｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８：５５，１９７０；およびＹｏｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９２：８６２，１９６６）。しかし、ＰＫＲおよびインターフェロンカスケードのｄｓＲＮＡによって媒介される活性化には、約３０塩基対未満の長さのｄｓＲＮＡが必要である。対照的に、３０塩基対未満の長さのｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞の中でＲＮＡｉを生じることが明らかにされている（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：９７４２−９７４７，２００１）。したがって、より長いｄｓＲＮＡ分子に伴う望ましくない非特異的効果は、より長いｄｓＲＮＡを実質的に含まない短いＲＮＡを調製することによって回避することができると予想される。
ｓｉＲＮＡについての参考文献：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：１７７６−１７８０，２００１；Ｃｕｌｌｅｎ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９，２００２；Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：９７４２−９７４７，２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０−９５２，１９９９；Ｎａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．６：６３−７０，１９９９；Ｎａｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９，１９９０；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ １３：６７−７３，２００２；Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６：１０７７−１０８７，２０００；Ｒｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：３３４３−３３５３，１９９２；Ｔａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９９：１２３−１３２，１９９９；およびＴｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５，２００１。
Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８，２００２）では、ＲＮＡｉを生じるための手段として、ヘアピンの中に折り畳まれた小さいＲＮＡ分子が使用された。したがって、このような短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた、本発明の方法において有利に使用される。機能性のｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは様々である；ステムの長さは、約２５〜約３０ｎｔまでの範囲のどの長さであってもよく、ループの大きさは、４から約２５の間の範囲であり得、これによってはサイレンシング活性には影響は及ぼさない。いずれの特定の理論によっても束縛されることは望ましくないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ ＲＮａｓｅのｄｓＲＮＡ産物に似ており、そしていずれにしても、特異的遺伝子の発現の阻害について同じ能力を有していると考えられる。
本発明のいくつかの実施形態においては、ｓｈＲＮＡはレンチウイルスベクター（例えば、ｐＬＬ３．７）から発現させられる。
アンチセンス技術を、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介して、または、三本鎖ヘリックスの形成を介して遺伝子発現を制御するために使用することができる。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）の中で議論されている。三本鎖ヘリックスの形成は、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｃｅｎｃｅ ２５１：１３００（１９９１）の中で議論されている。この方法は、相補ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。
例えば、ＴＡＪをコードするポリヌクレオチドの５’非コード部分を、約１０から４０塩基対までの長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関係している遺伝子の領域に相補的であるように設計され、それによって、標的タンパク質の転写および生産を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そして標的ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳をブロックする。
１つの実施形態においては、ＴＡＪ遺伝子に特異的なアンチセンス核酸が、外因性配列からの転写によって細胞内で生産される。例えば、ベクターまたはその一部が転写されて、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）が生産される。このようなベクターは、それが所望されるアンチセンスＲＮＡを生産するように転写される限りは、エピソームのままであっても、また、染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的である組換えＤＮＡ技術の方法によって構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞の中での複製および発現のために使用される、プラスミド、ウイルス、または当該分野で公知の他のものであり得る。アンチセンス分子の発現は、脊椎動物（好ましくは、ヒト細胞（例えば、本明細書中で別の場所に記載されているもの））において作用することが当該分野で公知である任意のプロモーターによって行わせることができる。
アンチセンス分子の絶対的な相補性が好ましいが、これは必要条件ではない。ＴＡＪをコードするＲＮＡの少なくとも一部に相補的である配列は、ＲＮＡとハイブリダイズすることができる十分な相補性を有している配列を意味し、これによって、安定な二本鎖が形成される。または、三本鎖の形成がアッセイされる場合がある。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度と、アンチセンス核酸の長さの両方に依存するであろう。一般的には、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、より多くの塩基の不適合が含まれ、そしてこれはなおも安定な二本鎖（または場合によっては三本鎖の場合もある）を形成することができる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順を使用することにより、寛容化することができる不適合の程度を特定することができる。
メッセンジャーＲＮＡの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチド（例えば、５’非翻訳配列までであり、ＡＵＧ開始コドンを含む）は、翻訳の阻害について最も効率よく作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も、同様に、ｍＲＮＡの翻訳を阻害することに有効であることが示されている。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ、Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５（１９９４）を参照のこと。したがって、５’または３’の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的であるオリゴヌクレオチドを、ＴＡＪの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドとしては、ＡＵＧ開始コドンの相補物が挙げられるはずである。ｍＲＮＡコード領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり有効ではない翻訳阻害因子であるが、本発明にしたがって使用することができる。アンチセンス核酸は少なくとも、６ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、６から約５０ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドである。特異的な態様においては、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
本明細書中に開示される治療方法に使用されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそのキメラ混合物、もしくは誘導体、もしくは改変されたバージョン、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改変し、これによって、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善することができる。オリゴヌクレオチドには、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜を通過する輸送を促進する物質（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：６４８−６５２（１９８７））；１９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液−脳関門（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断物質（例えば、Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、あるいは、挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）のような、他の付加基が含まれる場合がある。この目的を達成するためには、オリゴヌクレオチドは別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発される架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションによって誘発される切断剤など）に結合させられる場合がある。
本明細書中に開示される治療方法で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドには、以下を含むがこれらに限定されない基からなる群より選択される少なくとも１つの改変された塩基部分が含まれる場合がある：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルエオシン、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウェイブトキソシン、シュードウラシル、エオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
本明細書中に開示される治療方法で使用されるアンチセンスオリゴには、また、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むがこれらに限定はされない群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分が含まれる場合がある。
なお別の実施形態においては、本明細書中に開示される治療方法で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはそれらのアナログが含まれるがこれらに限定はされない群より選択される、少なくとも１つの改変されたリン酸骨格が含まれる。
なお別の実施形態においては、本明細書中に開示される治療方法で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補ＲＮＡと共に特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは、通常の状況とは反対であり、鎖は互いに平衡に走る（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））である。
本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているものなど）の使用によって、合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）の方法によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された有孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：７４４８−７４５１（１９８８））などの使用によって調製できる。
本明細書中に開示される治療方法で使用されるポリヌクレオチド組成物としては、触媒ＲＮＡ、またはリボザイムがさらに挙げられる（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３６４；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）を参照のこと）。ハンマーヘッド型のリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型のリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補性塩基対を形成する隣接領域によって示される位置でｍＲＮＡを切断する。標的ｍＲＮＡが２つの塩基：５’−ＵＧ−３’の配列を有することだけが必要である。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生産は当該分野で周知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８）にさらに完全に記載されている。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に存在するように；すなわち、効率を最大にし、非機能性ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小にするように操作される。
アンチセンスアプローチの場合と同様に、本明細書中に開示される診断方法および治療方法で使用されるリボザイムは、（例えば、安定性、標的化などの改善のために）改変されたオリゴヌクレオチドから構成される場合があり、また、インビボでＴＡＪを発現する細胞に送達される場合もある。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、アンチセンスをコードするＤＮＡの導入について上記に記載した様式と同じ様式で細胞に導入することができる。好ましい送達方法には、例えば、ｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターのような、強力な構成的プロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することが含まれ、その結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性ＴＡＪのメッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するために十分な量のリボザイムを生産するであろう。リボザイムはアンチセンス分子とは異なり、触媒性であるので、低い細胞内濃度が効率には必要である。
アンチセンス
いくつかの実施形態においては、ＴＡＪの発現は、標的化されたｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション、およびタンパク質の翻訳を妨げることによってｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするためにアンチセンス核酸を使用することによって阻害することができる。
「アンチセンス」核酸には、成分（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるもの、またはｍＲＮＡ配列に相補的であるもの）をコードする「センス」核酸に相補的であるヌクレオチド配列が含まれる。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合を形成することができる。アンチセンス核酸は、コード鎖全体に対して、またはその一部だけに対して相補的である場合もある。例えば、成分をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスであるアンチセンス核酸分子を使用することができる。
ＴＡＪをコードするコード鎖の配列は公知である。したがって、当業者は、Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｃｒｉｃｋ塩基対合の規則にしたがってアンチセンス核酸を設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡのコード領域全体に対して相補的であることができるが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部だけに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的である場合がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用する化学合成および酵素による連結反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、自然界に存在しているヌクレオチドを使用して化学合成することができ、また、分子の生物学的安定性を増大させるため、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二本鎖の生理学的安定性を増大させるために設計された様々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体、およびアクリジンで置換されたヌクレオチド）を使用することもできる。
アンチセンス核酸を作成するために使用することができる改変されたヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウェイブトキソシン、シュードウラシル、エオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、その中に核酸がアンチセンス方向（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）でサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的に生産させることができる。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的な標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のエンドヌクレアーゼでの切断によって作用する。可能性があるＲＮＡ標的の中の特異的リボザイム切断部位は、公知の技術によって同定することができる。さらなる詳細については、例えば、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４，４６９−４７１（１９９４）、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３３５５を参照のこと。
それがＣＮＳ疾患に関係している場合のアンチセンス治療の概要は、Ｊａｅｇｅｒ，２００４，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．９：１７２０−７に提供されている。
ＲＮＡｉ
ＴＡＪ遺伝子の発現はまた、いくつかの実施形態においては、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）を使用して阻害される場合もある。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の細胞への導入によって相同であるｍＲＮＡの分解が引き起こされる表現形である。線虫であるシノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）において最初に発見されたＲＮＡｉは、それ以来、広い範囲の生物において作動することが明らかにされている。「ＲＮＡｉ核酸」は、本明細書中で使用される場合は、通常は５０ヌクレオチドよりも短い長さの核酸配列であり、これによって、ｍＲＮＡレベルで遺伝子のサイレンシングが引き起こされる。ＲＮＡｉ核酸には、遺伝子特異的である短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が含まれる。
例えば、哺乳動物細胞においては、長いｄｓＲＮＡ（＞３０ヌクレオチド）の導入によって、タンパク質合成の非特異的阻害およびＲＮＡ分解によって例示される、強力な抗ウイルス応答を開始させることができる。ＲＮＡ干渉によっては、ｍＲＮＡレセプターレベルでの遺伝子のサイレンシングの機構が提供される。近年、ＲＮＡｉは、インビボでの分解について特定の転写物をマークするために、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用する内因性および強力な遺伝子特異的サイレンシング技術となっている。これはまた、遺伝子のノックアウトのための効率のよい、広く適用することができるアプローチをも提供する。加えて、ＲＮＡｉ技術は、治療目的のために利用することができる。例えば、ＲＮＡｉが標的化するＦａｓによって媒介されるアポトーシスは、劇症肝炎からマウスを防御することが示されている。ＲＮＡｉ技術は、多数の刊行物、例えば、米国特許第５，９１９，６１９号、同第６，５０６，５５９号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１４３４６、同ＷＯ０１／７０９４９、同ＷＯ０１／３６６４６、同ＷＯ００／６３３６４、同ＷＯ００／４４８９５、同第ＷＯ０１／７５１６４、同ＷＯ０１／９２５１３、同ＷＯ０１／６８８３６、および同ＷＯ０１／２９０５８に開示されている。
ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現を阻害することができる配列は、任意の長さであり得る。例えば、配列は、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、またはそれ以上の連続しているヌクレオチドを有し得る。配列は、その配列が標的ｍＲＮＡの転写を破壊させる機能性のサイレンシング複合体を形成することができる限りにおいては、ｄｓＲＮＡであっても、また任意の他のタイプのポリヌクレオチドであってもよい。
１つの実施形態においては、配列には、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれるか、またはこれから構成される。ｓｉＲＮＡは、１９〜２５個のヌクレオチドを有しているｄｓＲＮＡであり得る。ｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ関連ヌクレアーゼによってより長いｄｓＲＮＡ分子の分解によって内因的に生産させることができる。ｓｉＲＮＡはまた、細胞に外部から、または発現構築物の転写によって、導入することもできる。一旦形成されると、ｓｉＲＮＡはＲＮＡによって誘導されるサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られているエンドリボヌクレアーゼを含む複合体になるように複数のタンパク質成分とともにアセンブリする。ｓｉＲＮＡのＡＴＰによって生じる巻き戻しによってＲＩＳＣが活性化され、これは次いで、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合によって相補的なｍＲＮＡの転写物を標的とし、これによってｍＲＮＡの切断および分解が生じる。ｍＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ鎖によって結合させられた領域の中央部分の近くで起こる。この配列特異的ｍＲＮＡの分解によって遺伝子のサイレンシングが生じる。
少なくとも２つの方法を、ｓｉＲＮＡによって媒介される遺伝子のサイレンシングを行うために使用することができる。最初に、ｓｉＲＮＡをインビトロで合成し、遺伝子発現を一時的に抑制するために細胞に導入することができる。合成のｓｉＲＮＡが，ＲＮＡｉを生じるための容易であり、効率のよい方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、例えば、対称な２ヌクレオチドの３’突出を有している１９個のＲＮＡヌクレオチドを含むことができる、短い混合されたオリゴヌクレオチドの二本鎖である。合成の２１ｂｐのｓｉＲＮＡ二本鎖（例えば、ＵＵまたはｄＴｄＴ ３’突出が続く１９個のＲＮＡ塩基）を使用して、配列特異的遺伝子サイレンシングを、哺乳動物細胞の中で行うことができる。これらのｓｉＲＮＡは、より長いｄｓＲＮＡによるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性化を伴うことなく、哺乳動物細胞において標的化された遺伝子の翻訳を特異的に抑制することができる。これは、多くのタンパク質の翻訳の非特異的抑制を生じる場合もある。第２に、ｓｉＲＮＡは、ベクターからインビボで発現させることができる。
ベクター
ＴＡＪアンタゴニストをコードする核酸を含むベクターもまた、本発明の方法で使用されるアンタゴニストを生産させるために使用することができる。ベクターと、そのような核酸に対して作動可能であるように連結される発現制御配列の選択は、所望される機能特性（例えば、タンパク質発現）および形質転換される宿主細胞に応じて様々である。
典型的な実施形態においては、本明細書中に記載される組成物および方法において有用であるＴＡＪポリペプチドは、タンパク質をコードする外因性核酸を有している細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）によって生産される組換え体タンパク質である。他の実施形態においては、組換え体ポリペプチドは、遺伝子の活性化として一般的に知られているプロセスによって生産され、ここでは、細胞は、ポリペプチドをコードする内因性核酸に作動可能であるように連結されたプロモーターまたはエンハンサーを含む外因性核酸を含む。
組換え体ポリペプチド（例えば、組換え体ＴＡＪまたはそのフラグメント）を作成するための日常的に行われている技術を、適切な転写／翻訳制御シグナル、およびタンパク質コード配列を使用して目的のポリペプチドをコードする発現ベクターを構築するために使用することができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｉｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ２００１）を参照のこと。）これらの方法としては、インビトロでの組換えＤＮＡおよび合成技術、インビボでの組換え（例えば、インビボでの相同組換え）を挙げることができる。ポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、ポリペプチドをコードする配列に対して作動可能であるように連結された第２の核酸配列によって調節することができ、その結果、ポリペプチドは、組換え体ＤＮＡ分子で形質転換された宿主の中で発現させられる。
作動可能であるように連結されたコード配列の発現を調節するために有用な発現制御エレメントは当該分野で公知である。例として、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントが挙げられるが、これらに限定はされない。誘導性プロモーターが使用される場合には、これは、例えば、宿主細胞培地中の栄養状態の変化、または温度の変化によって制御することができる。
細菌宿主または真核生物宿主の中で複製させることができる、ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターは、宿主をトランスフェクトし、それによってポリペプチドを生じるようにそのような核酸の発現を指示させるために使用される。その後、タンパク質を単離することができる。好ましい哺乳動物発現ベクターには、細菌の中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞の中で発現させられる１つ以上の真核生物の転写ユニットの両方が含まれる。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇに由来するベクターが、真核生物細胞のトランスフェクションに適している哺乳動物発現ベクターの例である。外因性ＤＮＡ配列での細胞のトランスフェクションのための日常的に行われている技術を、本発明に使用することができる。トランスフェクション方法としては、化学的手段（例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、またはリポソーム）；または物理的手段（例えば、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーション）を挙げることができる。トランスフェクトされた細胞は、日常的な技術によって増殖させられる。例えば、Ｋｕｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙを参照のこと。発現産物はそれらのシステムの細胞培地から（ここでは、タンパク質が宿主細胞から分泌される）、または宿主細胞システムの破壊後の細胞懸濁液から、例えば、日常的に行われている機械的、化学的、もしくは酵素的手段によって、単離される。
これらの方法はまた、遺伝子の標的化および遺伝子の活性化（引用により本明細書中に組み入れられるＴｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９５／３１５６０を参照のこと；Ｓｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９３／０９２２２もまたを参照のこと）を含む他の手順によって遺伝子改変されている細胞を使用して行うこともできる。
ベクターには、原核生物のレプリコン（すなわち、細菌宿主細胞において染色体外での組換え体ＤＮＡ分子の自律複製および維持を指示する能力を有しているＤＮＡ配列）が含まれる場合がある。このようなレプリコンは当該分野で周知である。加えて、原核生物のレプリコンを含むベクターにはまた、その発現によって薬剤耐性のような検出可能なマーカーを付与する遺伝子も含まれる場合がある。細菌の薬剤耐性遺伝子の例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子である。
原核生物のレプリコンを含むベクターにはまた、細菌宿主細胞の中でコード遺伝子配列の発現を指示するための原核生物またはバクテリオファージプロモーターが含まれる場合もある。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、通常、発現させられるＤＮＡセグメントの挿入のための通常の制限部位を含むプラスミドベクターの中に提供される。このようなプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬ、およびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適切な原核生物宿主を、本発明の方法で使用されるタンパク質をコードする組換え体ＤＮＡ分子を発現させるために使用することができる。
本発明の目的については、多数の発現ベクターシステムを使用することができる。例えば、１つのクラスのベクターでは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルス）に由来するＤＮＡエレメントが利用される。他には、内部リボソーム結合部位を有している多シストロン性システムの使用が含まれる。さらに、それらの染色体にＤＮＡが組み込まれた細胞を、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対するプロトトロフィー（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅のような重金属に対する耐性を提供する。選択マーカー遺伝子は、発現させられるＤＮＡ配列に直接連結させることができるか、または、同時形質転換により同じ細胞の中に導入することができるかのいずれかである。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子が選択マーカー遺伝子の例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。さらなるエレメントもまた、ｍＲＮＡの最適な合成に必要である場合もある。これらのエレメントとしては、シグナル配列、スプライシングシグナル、さらには、転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを挙げることができる。
１つの実施形態においては、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＢｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の特許品である発現ベクター（米国特許第６，１５９，７３０号）を使用することができる。このベクターには、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーが含まれ、マウスβ−グロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、ならびに、リーダー配列が含まれる。このベクターは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションされると非常に高いレベルの発現、その後の、Ｇ４１８を含む培地の中での選択、およびメトトレキセート増幅を生じることが明らかにされている。もちろん、真核生物細胞の中で発現を誘発することができる任意の発現ベクターを、本発明において使用することができる。適切なベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手できる）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手できる）が挙げられるが、これらに限定はされない。さらなる真核生物細胞発現ベクターは当該分野で公知であり、市販されている。通常、このようなベクターには、所望されるＤＮＡセグメントの挿入のための便利な制限部位が含まれる。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターが挙げられる。他の例示的なベクターシステムは、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
一般的には、アンタゴニストを高いレベルで適切に発現する細胞についての多数の形質転換された細胞のスクリーニングは、例えば、ロボットによるシステムによって行うことができる日常的に行われている実験である。
哺乳動物宿主細胞での発現のために頻繁に使用される調節配列としては、哺乳動物細胞の中での高いレベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント（例えば、レトロウイルスＬＴＲに由来するプロモーターおよびエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルスに由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマおよび強い哺乳動物プロモーター（例えば、自然界に存在している免疫グロブリンおよびアクチンのプロモーター）が挙げられる。ウイルスの調節エレメントおよびその配列のさらなる記載については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉ，米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌ，米国特許第４，５１０，２４５号；およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ，米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。
組換え体発現ベクターには、宿主細胞の中でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子が含まれる場合がある。選択マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ａｘｅｌ，米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、通常は、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。頻繁に使用される選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅と共にｄｈｆｒ−細胞において使用される）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。
ＴＡＪアンタゴニストをコードするベクターは、適切な宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は任意の適切な方法によって行うことができる。哺乳動物細胞に外因性ＤＮＡを導入するための方法は当該分野で周知であり、そしてこれには、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームの中へのポリヌクレオチド（単数または複数）のカプセル化、および核へのＤＮＡの直接のマイクロインジェクションが含まれる。加えて、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入することができる。
宿主細胞の形質転換は、使用されるベクターおよび宿主細胞に適している従来の方法によって行うことができる。原核生物宿主細胞の形質転換については、エレクトロポレーション、および塩処理方法を使用することができる（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換については、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理方法を使用することができる。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：１３７３−７６（１９７９）を参照のこと。
タンパク質発現のために使用される宿主細胞株は、最も好ましくは、哺乳動物を起源とするものである。当業者によって、その中で発現させられる所望される遺伝子産物に最も適している特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力が認識される。例示的な宿主細胞株としては、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ−）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸ガン）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を有しているＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）が挙げられるがこれらに限定はされない。宿主細胞株は、通常は、市販によって、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または公開されている文献から入手することができる。
生産細胞株からのポリペプチドの発現は、公知の技術を使用して増強させることができる。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）システムは、一般的には、特定の条件下での発現を増強させるために使用される。例えば、欧州特許第０ ２１６ ８４６号、同第０ ２５６ ０５５号、および同第０ ３２３ ９９７号、ならびに欧州特許出願番号８９３０３９６４．４を参照のこと。
宿主細胞
本発明の方法で使用されるＴＡＪアンタゴニストの発現のための宿主細胞は、原核生物のものである場合も、また、真核生物のものである場合もある。例示的な真核生物宿主細胞としては、酵母および哺乳動物の細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５８）、およびベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）が挙げられるがこれらに限定はされない。他の有用な真核生物宿主細胞としては、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。例示的な原核生物宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）である。
本明細書中に記載されるように培養された細胞によって生産されたポリペプチドは、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収することができ、また、細胞によって分泌されない場合は、これは、宿主細胞溶解物から回収することもできる。ポリペプチドの単離の最初の工程として、培養培地または溶解物が、一般的には遠心分離されて、微粒子状の細胞の破片が除去される。その後、ポリペプチドが、混入している可溶性タンパク質および他の細胞性成分から、適切な精製手順の例である以下の手順を用いて、単離され、好ましくは、精製される：免疫アフィニティーカラムまたはイオン交換カラム上での分画；エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ；シリカ上または陽イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥ）上でのクロマトグラフィー；クロマト分画；ＳＤＳ ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；ならびにゲル濾過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる）。プロテアーゼ阻害因子が、精製の間のタンパク質分解的分解を阻害するために使用される場合がある。当業者は、目的のポリペプチドに適している精製方法に、組換え体細胞培養物中で発現された際のポリペプチドの特性の変化の主な原因である改変が必要である場合があることを理解するであろう。
ポリペプチドの精製には、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、通常のイオン交換クロマトグラフィー、サイジングクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、または他の通常のタンパク質精製技術の使用が必要とされる場合がある。例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．（１９９０）「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２を参照のこと。
細胞療法
本発明のいくつかの実施形態においては、可溶性ＴＡＪポリペプチドが処置方法において投与される。処置方法には、（１）核酸（例えば、ＴＡＪポリペプチドを発現するベクター）で移植可能な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程；および（２）哺乳動物に、疾患、障害、または損傷の部位に、形質転換された宿主細胞を移植する工程が含まれる。例えば、形質転換された宿主細胞は脊髄損傷の部位に移植することができる。本発明のいくつかの実施形態においては、移植可能な宿主細胞が哺乳動物から取り出され、一時的に培養され、ＴＡＪポリペプチドをコードする単離された核酸で形質転換されるかまたはトランスフェクトされ、そしてそれが取り出された同じ哺乳動物に移植して戻される。細胞は、移植される部位と同じ部位から取り出すことができるが、これは必要条件ではない。エキソビボ遺伝子治療として知られる場合もあるこのような実施形態によって、限られた時間の間、作用部位に局在化させられた、ＴＡＪポリペプチドの持続的な供給が提供される。
遺伝子治療
ＴＡＪアンタゴニストは、軸索伸張の阻害を減少させることが治療上有効である神経系の疾患、障害、または損傷の処置のための遺伝子治療アプローチを使用して、哺乳動物（例えば、ヒト患者）においてインビボで生産させることができる。これには、適切な発現制御配列に作動可能であるように連結された適切なＴＡＪアンタゴニストをコードする核酸の投与が含まれる。一般的には、これらの配列は、ウイルスベクターに組み込まれる。このような遺伝子治療に適切なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクターであることもできる。そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子の中に欠失を有しているアデノウイルスベクターが、通常は使用される。アデノウイルスベクターが使用される場合は、ベクターは通常、選択マーカー遺伝子は有さない。
ＴＡＪポリペプチドの発現構築物は、任意の生物学的に有効である担体（例えば、インビボで細胞にＴＡＪ遺伝子を効率よく送達することができる任意の処方物または組成物）において投与することができる。アプローチには、組換え体レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１、または組換え体である細菌もしくは真核生物のプラスミドを含むウイルスベクターへの目的の遺伝子の挿入が含まれる。ウイルスベクターは、細胞に直接トランスフェクトされ；プラスミドＤＮＡは、例えば、陽イオン性リポソーム（リポフェクチン）、または、誘導された（例えば、抗体が結合させられた）、ポリリジン結合体、グラマシジンＳ、人工のウイルスエンベロープ、または他のそのような細胞内担体、さらには、遺伝子構築物の直接の注入、あるいは、インビボで行われるＣａＰＯ４沈殿の助けを借りて送達することができる。
細胞への核酸のインビボでの導入のための好ましいアプローチは、核酸（例えば、ＴＡＪポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、またはＴＡＪアンチセンス核酸）を含むウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターでの細胞の感染は、標的化された細胞の大部分が核酸を受け取ることができる利点を有している。加えて、例えば、ウイルスベクターの中に含まれるｃＤＮＡによってウイルスベクターの中にコードされる分子は、その中にウイルスベクター核酸が取り込まれた細胞の中で効率よく発現させられる。
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを、インビボでの外因性遺伝子の導入（特に、ヒトへの）のための組換え体遺伝子送達システムとして使用することができる。これらのベクターによって、細胞への遺伝子の効率のよい送達が提供され、そして導入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる。複製欠損レトロウイルスだけを生じる特殊化された細胞（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発によって、遺伝子治療へのレトロウイルスの用途が拡大され、そして欠損レトロウイルスが、遺伝子治療プロセスのための遺伝子の導入での使用について特性決定される。複製欠損レトロウイルスは、標準的な技術によるヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞を感染させるために使用することができるビリオンの中にパッケージすることができる。組換え体レトロウイルスの生産、およびそのようなウイルスでのインビトロまたはインビボでの細胞の感染のためのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（編）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．１０−９．１４、および他の標準的な研究室用マニュアルに見ることができる。適切なレトロウイルスの例としては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが挙げられ、これらは当業者に公知である。同種指向性レトロウイルスシステムおよび両種性レトロウイルスシステムの両方を調製するために適しているパッケージングウイルス株の例としては、．ｐｓｉ．Ｃｒｉｐ，．ｐｓｉ．Ｃｒｅ，．ｐｓｉ．２および．ｐｓｉ．Ａｍ．が挙げられる。レトロウイルスは、種々の遺伝子を多くの異なる細胞型（上皮細胞を含む）に、インビトロおよび／またはインビボで導入するために使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９２／０７５７３を参照のこと）。
本発明に有用である別のウイルス遺伝子送達システムでは、アデノウイルスに由来するベクターが利用される。アデノウイルスのゲノムは、それが目的の遺伝子産物をコードし、それを発現するが、正常な溶解性ウイルスのライフサイクルにおいて複製するその能力に関して不活化されるように操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ ｄ１３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは当業者に公知である。組換え体アデノウイルスは、それらが分裂していない細胞を感染させることはできない特定の状況において有効であり得、そして上皮細胞を含む広い範囲の様々な細胞のタイプを感染させるために使用することができる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）、前出）。さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮の影響を受けやすく、そして上記のように、感染のスペクトルに影響を生じるように改変することができる。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、エピソームのまま維持され、それによって、導入されたＤＮＡ（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）が宿主のゲノムに組み込まれるインサイチュでの挿入突然変異の結果として起こり得る可能性のある問題を回避することができる。さらに、外来ＤＮＡについてのアデノウイルスゲノムの保有能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較すると高い（８キロ塩基まで）（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。
目的の遺伝子の送達に有用であるなお別のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。Ａｌｉ，２００４、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ．２２５：１６５−７８；およびＬｕ，２００４，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．１３（１）：１３３−４５にまとめられている。アデノ随伴ウイルスは、自然界に存在している欠損性ウイルスであり、これには、効率のよい複製および生産的なライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような別のウイルスが必要である（概要については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９を参照のこと）。これはまた、分裂していない細胞にそのＤＮＡを組み込むことができ、そして安定な組み込みを高い頻度で示すいくつかのウイルスの１つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照のこと）。ＡＡＶのうちの３００塩基対程度の小さい部分を含むベクターをパッケージすることができ、そして組み込むことができる。外因性ＤＮＡについてのスペースは、約４．５ｋｂに限られる。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０に記載されているベクターのようなＡＡＶベクターを、細胞にＤＮＡを導入するために使用することができる。種々の核酸が、ＡＡＶベクターを使用して様々な細胞のタイプに導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照のこと）。
上記で説明された方法のようなウイルス導入方法に加えて、非ウイルス方法もまた、動物の組織の中でＴＡＪポリペプチド、フラグメント、またはアナログの発現を引き起こすために使用することができる。遺伝子の導入のためのほとんどの非ウイルス方法は、マイクロ分子の取り込みおよび細胞内輸送のための、哺乳動物細胞によって使用される通常の機構による。好ましい実施形態においては、本発明の非ウイルス遺伝子送達システムは、標的化された細胞による目的のＴＡＪ遺伝子の取り込みのためのエンドサイトーシス経路による。このタイプの例示的な遺伝子送達システムとしては、リポソームによって誘導されるシステム、ポリリジン結合体、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。他の実施形態としては、Ｍｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１６（１）：１３１−１３５；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７（２２）：１８９６−９０５；またはＴａｍ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７（２１）：１８６７−７４に記載されているような、プラスミド注入システムが挙げられる。
代表的な実施形態においては、ＴＡＪポリペプチド、活性のあるフラグメント、またはアナログをコードする遺伝子は、それらの表面（例えば、リポフェクチン）上に正電荷を有しているリポソームの中に捕捉させることができ、そしてこれは、（状況に応じて）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグを付けることができる（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｇｅｋａ ２０：５４７−５５１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６３０９；日本国特許出願番号１０４７３８１；および欧州特許公開番号ＥＰ−Ａ−４３０７５）。
臨床条件では、治療用ＴＡＪ遺伝子の遺伝子送達システムを、多数の方法のいずれかによって患者に導入することができる。これらの方法のそれぞれは、当該分野でよく知られている。例えば、遺伝子送達システムの薬学的調製物は、全身的に（例えば、静脈内注射によって）導入することができ、そして、標的細胞の中でのタンパク質の特異的な形質導入が、遺伝子送達媒体、レセプター遺伝子の発現を制御する転写調節配列が原因である細胞型もしくは組織型の発現、またはそれらの組み合わせによって提供されるトランスフェクションの特異性によって優先的に生じる。他の実施形態においては、組換え体遺伝子の最初の送達は、極めて限局化された動物への導入によってさらに限定される。例えば、遺伝子送達媒体は、カテーテルによって（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位固定注射によって（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３０５４−３０５７）導入することができる。
遺伝子治療構築物の薬学的調製は、本質的に、許容可能な希釈剤の中の遺伝子送達システムから構成され得るか、または、遺伝子治療構築物の薬学的調製には、遺伝子送達媒体がその中に埋め込まれる徐放マトリックスが含まれ得る。あるいは、完全な遺伝子送達システムを、組換え体細胞（例えば、レトロウイルスベクター）から完全な状態で生産させることができる場合には、薬学的調製物には、遺伝子送達システムを生じる１つ以上の細胞が含まれ得る。
特に、本明細書中に記載されるようなＣＮＳの症状または障害を処置するための、遺伝子治療に関する指針は、例えば、米国特許出願番号２００２／０，１９３，３３５（神経組織への、遺伝子治療用ベクターまたは形質転換された細胞の送達方法が提供されている）；米国特許出願番号２００２／０，１８７，９５１（哺乳動物の脳または神経系の標的細胞についての、レンチウイルスベクターを使用して神経変性疾患を処置するための方法が提供される）；米国特許出願番号２００２／０，１０７，２１３（遺伝子治療用媒体と、神経変性疾患の処置および予防においてそれを使用するための方法が開示されている）；米国特許出願番号２００３／０，０９９，６７１（ＣＮＳに遺伝子を送達するために適している変異させられた狂犬病ウイルスが開示されている）；および米国特許第６，４３６，７０８号（脳全体で長期間発現を生じる、遺伝子送達システムが開示されている）；米国特許第６，１４０，１１１号（種々の疾患の処置でのヒト遺伝子治療に適しているレトロウイルスベクターが開示されている）；ならびに、Ｋａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．５：５０−６’Ｓｕｈｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．５６：２８７−９２；およびＷｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５：６３３−６３９に見ることができる。
薬学的組成物
本発明の方法で使用されるＴＡＪアンタゴニストは、ヒトを含む哺乳動物に投与される薬学的組成物に処方することができる。本発明の方法で使用される薬学的組成物には、薬学的に許容される担体（例えば、イオン交換体、ミョウバン、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、塩、もしくは電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂を含む）が含まれる。
本発明の方法で使用される組成物は、任意の適切な方法で（例えば、非経口的に、脳室内に、経口で、吸入噴霧によって、局所的に、直腸に、鼻腔に、舌下に、膣に、または、埋め込まれたレザーバーから）投与することができる。用語「非経口」には、本明細書中で使用される場合には、皮下、序脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内、および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。先に記載されたように、本発明の方法で使用されるＴＡＪアンタゴニストは、神経系で、ニューロンの生存、神経突起成長、および／または軸索再生を促進するように作用する。したがって、本発明の方法においては、ＴＡＪアンタゴニストは、それらが血液−脳関門を通過する方法で投与される。この通過は、ＴＡＪアンタゴニスト分子自体に固有である物理化学的特性によって、薬学的処方物中の他の成分によって、または血液−脳関門を破る、針、カニューレ、または外科手術用の器具のような機械的デバイスの使用によって生じ得る。ＴＡＪアンタゴニストが血液−脳関門を通過することが先天的にできない分子（例えば、通過を促進する部分に対する融合体）である場合には、適切な投与経路は、例えば、髄腔内または頭蓋内に、例えば、ＭＳの慢性的な病変の中への直接である。ＴＡＪアンタゴニストが血液−脳関門を先天的に通過できる分子である場合には、投与経路は、以下に記載される種々の経路の１つ以上であり得る。
本発明の方法で使用される組成物の滅菌の注射可能な形態は、水性懸濁液である場合も、また、油性懸濁液である場合もある。これらの懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤と、懸濁剤を使用して当該分野で公知の技術にしたがって処方することができる。滅菌の注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒の中の滅菌の注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオールの中の懸濁液）である場合もある。中でも、使用することができる許容される媒体および溶媒は、水、リンガー溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌の不揮発性油を、溶媒または懸濁媒体として使用することができる。この目的については、合成のモノグリセリドとジグリセリドを含む、任意の混合された（ｂｌａｎｄ）不揮発性油を使用することができる。脂肪酸（例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体）が、これが自然界に存在している薬学的に許容される油（例えば、オリーブ油またはヒマシ油）であるので、特に、それらのポリオキシエチレン化バージョンが、注射可能な調製物において有用である。これらの油剤または懸濁液にはまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、もしくは、乳濁液および懸濁液を含む薬学的に許容される投与形態の処方物において一般的に使用される同様の分散剤）も含まれる場合がある。他の一般的に使用される界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓ、および他の乳化剤）または生体利用性増強剤（薬学的に許容される固体、液体、または他の投与形態の製造において一般的に使用されるもの）もまた、処方の目的のために使用することができる。
本明細書中に記載される物質（例えば、ＴＡＪポリペプチド、抗ＴＡＪ抗体、または抗ＴＡＪ抗体の抗原結合フラグメント）を含む組成物には、適切な薬学的に許容される担体が含まれる場合がある。例えば、これらには、作用部位への送達のために設計された調製物への活性のある化合物の処理を容易にする、賦形剤および／または助剤が含まれる場合がある。非経口投与に適している処方物としては、水溶性形態（例えば、水溶性の塩）の活性のある化合物の水溶液が挙げられる。加えて、活性のある化合物の懸濁液は、適切な油状の注射用懸濁液として投与される場合がある。適切な親油性溶媒または媒体としては、脂肪酸（例えば、ゴマ油、または合成の脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル、またはトリグリセリド））が挙げられる。水性の注射用懸濁液には、懸濁液の粘度を高める物質が含まれる場合があり、これには、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、およびデキストランが含まれる。状況に応じて、懸濁液にはまた安定剤も含まれる場合がある。リポソームは、細胞または間質腔への送達のために本発明の分子をカプセル化するためにも使用することができる。例示的な薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗生物質、および抗真菌剤、等張性の吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。いくつかの実施形態においては、組成物には、等張化剤（例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウム））が含まれる。いくつかの実施形態においては、組成物には、薬学的に許容される物質（例えば、湿潤剤、または主要ではない量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝液（これらは、有効成分の保存期間または有効性を高める）））が含まれる。
非経口処方物は、１回のボーラス用量、注入または負荷ボーラス用量、それに続く維持用量であり得る。これらの組成物は、特定の固定された間隔または可変の間隔（例えば、１日に１回、または「必要に応じた」基準で投与することができる。
本発明の方法で使用される特定の薬学的組成物は、許容される投与形態（例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または溶液を含む）で経口投与することができる。特定の薬学的組成物はまた、鼻腔エアゾールまたは吸入によって投与される場合もある。このような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、生体利用性を高めるための吸収促進剤、および／または他の通常の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
本発明の組成物は種々の形態であり得、これには例えば、液体（例えば、注射可能な溶液および注入可能な溶液）、分散剤、懸濁剤、半固形および固形の投与形態が含まれる。好ましい形態は、投与形式および治療用途に応じて様々である。中枢神経系の組織を処置するためには、投与は、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）の中への注射または注入によって行うことができる。投与はまた、血液−脳関門を通過するＴＡＪポリペプチドの浸潤を促進することができる１つ以上の物質を用いて行うこともできる。
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム、または高い薬剤濃度に適している他の規則構造として処方することができる。滅菌の注射可能な溶液は、必要量の有効成分を適切な溶媒の中に、必要に応じて上記の成分の１つまたは組み合わせと共に配合すること、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般的には、分散液は、有効成分を、塩基性分散媒体と上記のものから必要な他の成分を含む滅菌の媒体の中に配合することによって調製される。滅菌の注射可能な溶液の調製用の滅菌の粉末の場合には、好ましい調製方法は、減圧乾燥および凍結噴霧であり、これによって先の滅菌濾過された溶液から、有効成分と任意のさらなる所望される成分の粉末が得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物の中に、吸収を遅らせる物質（例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチン）を含めることによってもたらすことができる。
有効成分は、徐放処方物またはデバイスとともに処方することができる。このような処方物およびデバイスの例としては、移植物、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムが挙げられる。生体分解性、生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）を使用することができる。このような処方物およびデバイスの調製のための方法は当該分野で公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
注射可能なデポー処方物は、生体分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸−ポリグリコール酸）の中に薬剤のマイクロカプセル化させられたマトリックスを形成させることによって作成することができる。ポリマーに対する薬剤の割合、および使用されるポリマーの性質に応じて、薬剤の放出速度を制御することができる。他の例示的な生体分解性ポリマーは、ポリオルトエステルおよびポリ無水物である。注射可能なデポー処方物もまた、リポソームまたはマイクロエマルジョンの中に薬剤を捕捉することによって調製することができる。
補助活性のある化合物を、組成物に配合することができる。いくつかの実施形態においては、ＴＡＪポリペプチド、抗ＴＡＪ抗体またはそのフラグメントが、抗ＮｇＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントとともに同時投与される。
単回投与形態を生じさせるために担体物質と混合することができるＴＡＪアンタゴニストの量は、処置される宿主、使用されるアンタゴニストのタイプ、および特定の投与形態に応じて様々であろう。組成物は、単回投与、複数回投与、または設定された時間の間の注入として投与することができる。投与レジメンはまた、最適な所望される応答（例えば、治療応答または予防応答）を生じるように調節することもできる。
本発明の方法では、ＴＡＪアンタゴニストの「治療有効量」または「予防有効量」が使用される。このような治療または予防有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重のような要因にしたがって変わる場合がある。治療または予防有効量はまた、治療上有用である効果があらゆる毒性または有害な作用を上回る量である。
任意の特定の患者についての特異的な投与および処置レジメンは、使用される特定のＴＡＪアンタゴニスト、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食事療法、ならびに、投与のタイミング、排出速度、薬剤の併用、および処置される特定の疾患の重症度を含む様々な要因に依存して変わるであろう。医学的な介護者によるそのような要因の判断は当業者の能力の範囲内である。この量はまた、処置される個々の患者、投与経路、処方物のタイプ、使用される化合物の特性、疾患の重症度、および所望される効果に応じても変わるであろう。使用される量は、当該分野で周知の薬理学的および薬物動態的法則によって決定することができる。
投与レジメンは、最適な所望される応答を提供するように調節することができる。例えば、単回のボーラスが投与される場合があり、複数回に分けられた用量が長時間投与される場合があり、また、用量が治療の状況の緊急性によって示されるように比例的に減少させられる場合も、増大させられる場合もある。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、投与単位形態で非経口用組成物を処方することが有利である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９８０）を参照のこと。
活性のある化合物に加えて、液体の投与形態には、水、エチルアルコール、カルボン酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルのような不活性な成分が含まれる場合がある。
本発明の方法においては、ＴＡＪアンタゴニストは、通常、神経系に直接、脳室内に、または髄腔内に（例えば、ＭＳの慢性の病変に）投与される。本発明の方法にしたがって投与される組成物は、１日あたり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量のＴＡＪアンタゴニストポリペプチドが投与されるように処方することができる。本発明のいくつかの実施形態においては、投与量は、１日あたり０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの実施形態においては、投与量は、１日あたり０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重である。
ＴＡＪアンタゴニスト抗体での処置については、投与量は、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重、より通常は、約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得、好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。上記の範囲の中間の用量もまた、本発明の範囲に入ると意図される。被験体は、このような用量を毎日、一日おき、１週間おき、または実証的分析によって決定された任意の他のスケジュールにしたがって投与することができる。例示的な処置には、長期（例えば、少なくとも６ヶ月間）にわたる複数回投与での投与が必然的に伴う。さらなる例示的な処置レジメンには、２週間に１回、１ヶ月に１回、または３から６ヶ月に１回の投与が必然的に伴う。例示的な投与スケジュールとしては、連日の１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、一日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、または１週間おきに６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。いくつかの方法においては、異なる結合特異性を有している２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与される。この場合、投与される個々の抗体の投与量は、示される範囲に入る。
特定の実施形態においては、被験体は、ＴＡＪアンタゴニストポリヌクレオチドをコードする核酸分子で処置することができる。核酸の用量は、１人の患者について約１０ｎｇから１ｇ、１００ｎｇから１００ｍｇ、１μｇから１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、１回の投与について１０〜１００ビリオン、またはそれ以上で変化する。
補助活性のある化合物もまた、本発明の方法で使用される組成物に配合することができる。例えば、可溶性ＴＡＪポリペプチドまたは融合タンパク質を、１つ以上のさらなる治療薬と一緒に処方することができ、そして／または一緒に投与することもできる。
本発明には、選択された標的組織へのＴＡＪアンタゴニストの任意の適切な送達方法が含まれ、これには、水性溶液のボーラス注射、または徐放システムの埋め込みが含まれる。徐放移植物の使用によっては、繰り返し注射することの必要性が減少させられる。
本発明の方法で使用されるＴＡＪアンタゴニストは、脳に直接注入される場合がある。化合物の脳への直接の注入のための様々な移植物が知られており、これらは、神経障害に罹患しているヒト患者への治療用化合物の送達に有効である。これらには、ポンプを使用する脳への長期にわたる注入、定位固定されて埋め込まれた一時的な間質カテーテル、永久的な頭蓋内カテーテル移植物、および外科的に埋めこまれた生体分解性移植物が挙げられる。例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｓｃｈａｒｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｇｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｏｄｉｎｅ−１２５ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｉｍｐｌａｎｔ Ｆｏｒ Ｇｌｉｏｍａｓ，」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）５８３−５９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ １２５Ｉ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ，」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；第６６章、５７７−５８０頁、Ｂｅｌｌｅｚｚａ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ」，Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；およびＢｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｔｒｉａｌ，」Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６：１１１−２３（１９９５）を参照のこと。
組成物にはまた、化合物について適切な送達または支持システムとしての役割を担う、生体適合性担体物質に分散させられたＴＡＪアンタゴニストが含まれる場合がある。徐放担体の適切な例としては、坐剤またはカプセルのような成型された製品の形態での、半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。移植可能な、またはマイクロカプセル徐放マトリックスには、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，３１９号；ＷＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態においては、ＴＡＪアンタゴニストは、脳の適切な領域への直接の注入によって患者に投与される。例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｉｒｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ，」Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）を参照のこと。別の技術を利用することができ、本発明のＴＡＪアンタゴニストを投与するために適応させることができる。例えば、カテーテルおよび移植物の定位固定設置を、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）の多目的局在化ユニットを使用して行うことができる。コントラストを強くしたコンピューター断像撮影法（ＣＴ）スキャン、１２０ｍｌのオムニパークの注入、３５０ｍｇのヨウ素／ｍｌ（２ｍｍのスライスの厚みを有する）によって、三次元多平面処理プラニング（ＳＴＰ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が可能になる。この機器によって、磁気共鳴画像試験をベースとするプラニングが可能であり、対象の立体構造を明確にするためのＣＴおよびＭＲＩ対象情報と比較併合される。
ＧＥ ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用して改良されたＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）をこの目的のために使用することができる。したがって、移植の朝に、ＢＲＷ定位固定フレームの輪状のベースリング（ａｎｎｕｌａｒ ｂａｓｅ ｒｉｎｇ）を患者の頭蓋骨に取り付けることができる。連続するＣＴセクションは、基部プレートにクランプで取り付けたグラファイト製のロッドローカライザーフレームを用いて（標的組織）領域全体を３ｍｍの間隔で得ることができる。コンピューターで処理されるプラニングプログラムを、ＶＡＸ １１／７８０コンピューター（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ．）上で、ＣＴ空間とＢＲＷ空間の間をマップするためのグラファイト製のロッドイメージのＣＴ座標を使用して、実行することができる。
本明細書中に記載されるＣＮＳ障害の処置方法は、通常、ヒトで使用される前に、所望される治療活性または予防活性について、インビトロで試験され、その後、許容される動物モデルにおいてインビボで試験される。適切な動物モデル（トランスジェニック動物を含む）は当業者に公知であろう。例えば、ＴＡＪアンタゴニストの分化と生存に対する効果を実証するためのインビトロでのアッセイが本明細書中に記載される。軸索の再生に対するＴＡＪアンタゴニストの効果は、実施例に記載されるようにインビトロで試験することができる。最後に、インビボでの試験は、ＴＡＪアンタゴニストを発現するトランスジェニックマウスを作成すること、またはＴＡＪアンタゴニストをマウスに投与することによって行うことができる。
本発明は、以下の実験による実施例によってさらに説明される。実施例は、説明の目的のためだけに提供され、いかなる方法においても本発明の範囲または内容を限定するようには解釈されない。
実施例１
ＴＡＪ融合タンパク質の生産
ヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域に融合させたマウスＴＡＪの１位から１６８位の残基をＣＨＯ細胞の中で発現させ、そしてＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の上で精製した。精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させると、還元条件下ではＭｒ＝５０ｋＤａ、そして非還元条件下ではＭｒ＝Ｄ ＫＤａであった。ＡＰ−ＴＡＪ（ヒトＴＡＪの２６位〜１６８位の残基に対してそのＣ末端で融合させられたＮ末端６ヒスチジンタグを有しているヒト胎盤ＡＰ）をＣＨＯ細胞の中で発現させた。タンパク質をＴＭＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）およびＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）上で精製した。同様のストラテジーを、ＡＰ−ｐ７５、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（これは２９３細胞の中で発現させた）の構築、発現、および精製に使用した。ミエリン調製物を、標準的なプロトコール（Ｎｏｒｔｏｎ ａｎｄ Ｐｏｄｕｌｓｏ，１９７３）を使用して野生型Ｃ５７Ｂ１６マウスおよびウシの脳から精製した。
実施例２
ＴＡＪはＮｇＲ１およびＬＩＮＧＯ−１に結合する
本実施例では、多数の種々の生化学的アプローチを使用して、ＮｇＲ１およびＬＩＮＧＯ−１とのＴＡＪの結合を示す。
ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、１０μｇ／ｍｌの可溶性ＮｇＲ１（ラットＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃに対して融合させたラットＮｇＲ１エクトドメインの１位〜３１０位または１位〜３４４位の残基）または全長のＮｇＲ１でコーティングした。プレートをブロックし、多数のＴＮＦＲスーパーファミリー／Ｆｃ融合タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）（ＴＡＪ−Ｆｃ、ＣＤ４０−Ｆｃ、Ｆｎ１４−Ｆｃ、ＴＮＦＲ１−Ｆｃ、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、およびＢａｆｆＲ−Ｆｃを含む）とともに４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄し、結合した融合タンパク質を、ＨＰＲと結合させた抗ヒトＩｇで検出した。Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ−Ｆｃを、特異性対照として使用した。図１Ａに示すように、スクリーニングした全ての候補のうち、ＴＡＪ−ＦｃだけがＮｇＲ１に結合した。
９０％のコンフルエンスのＣＯＳ−７細胞に、Ｆｕｇｅｎｅ ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してヒトＮｇＲ１発現プラスミドをトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクトした細胞をＨＢＨ（ハンクスの平衡塩緩衝液、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．０）で洗浄し、２３℃で１．５時間、４μｇ／ｍｌのＡＰ−ＴＡＪまたは他のＡＰ−融合体とともにＨＢＨの中でインキュベートし、記載されているように処理した（Ｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。結合したＡＰ−ＴＡＪを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ）とのインキュベーション、その後の、細胞の溶解物の抽出によって、直接検出した（Ｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。選択した試験においては、ＣＯＳ−７細胞を、ＮｇＲ１、ｐ７５、およびＬＩＮＧＯ−１の種々の組み合わせでトランスフェクトし、上記のようにＡＰ−ＴＡＪ結合について分析した。
ＮｇＲ１に対するＴＡＪの結合を、発現させたＡＰ−ＴＡＪ融合タンパク質を用いてその後の分析において確認した（図１Ｂ、１Ｃ）。ＭＡＩＦレセプター複合体の他の同定された成分のＴＡＪ結合もまた、個別に、そして種々の組み合わせにおいての両方で評価した。ＮｇＲ１／ＬＩＮＧＯ−１とＮｇＲ１／ＬＩＮＧＯ−１／ｐ７５を同時に発現するＣＯＳ細胞に対するＴＡＪの結合は、ＮｇＲ１だけに対してよりもわずかに低く、これはおそらく、競合または立体障害が原因である。注目すべきは、ＴＡＪがｐ７５よりも明らかに高い親和性でＮｇＲ１に結合することである（図１Ｂ）。
ＴＡＪが結合したＮｇＲ１の領域を同定するために、ＮｇＲ１の可溶性短縮形態を作成し、ＡＰ−ＴＡＪによる結合についてＥＬＩＳＡプレートをコーティングするために使用した。アミノ末端から３４４個のアミノ酸を含む短縮型ＮｇＲ１構築物は、全長のＮｇＲ１と同様の効率で、ＴＡＪに結合された。しかし、Ｎ末端の３１０個のアミノ酸を含むわずかに短い構築物は、ＡＰ−ＴＡＪに対してはるかに低い親和性を示し、これは、ＮｇＲ１の３１０位〜３４４位のアミノ酸がＴａｊ／Ｎｇｒ１結合に重要であることを示唆している（図３）。
ＣＯＳ−７細胞（１００ｍｍの皿）を、ヒトＴＡＪとヒトＮｇＲ１、ヒトＴＡＪ、ヒトＬＩＮＧＯ−１、ヒトＮｇＲ１／ラットｐ７５、およびヒトＮｇＲ１／ＢａｆｆＲの組み合わせでトランスフェクトした。ＢａｆｆＲは特異性対照として使用した。細胞を４８時間後に回収し、１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１０％のグリセロール）の中で４℃で３０分間溶解させた。１４，０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、上清を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）とともに４℃で１時間インキュベートし、その後、抗ＮｇＲ１抗体、抗ＴＡＪ抗体とＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、またはｍｙｃタグ化抗ＬＩＮＧＯ−１と抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）アガロースビーズとともに、４℃で１時間インキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で沸騰させ、４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＮｇＲ１抗体、または抗ＬＩＮＧＯ−１抗体、または抗ＴＡＪ抗体（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてウェスタンブロットによって分析した。ヒトＴＡＪの２６位から４１６位の残基を、ＰＶ９０ ＨＡタグ発現ベクターに挿入した。
ヒトＴＡＪによるＮｇＲ１およびＬＩＮＧＯ−１の結合を、ＴＡＪをＮｇＲ１またはＬＩＮＧＯ−１と混合した免疫沈降実験によって確認した（図２）。ＴＡＪとＮｇＲ１、またはＴＡＪとＬＩＮＧＯ−１の同時発現、その後の抗ＮｇＲ１抗体または抗ＬＩＮＧＯ−１抗体での免疫沈降によって、ウェスタンブロットにおいて抗ＴＡＪ免疫反応性のバンドが生じた。同様に、抗ＴＡＪ抗体での反応混合物の免疫沈降によってもウェスタンブロット上にバンドが生じ、これは、ＮｇＲ１またはＬＩＮＧＯ−１抗体によって容易に検出できた。これらのデータは、ＴＡＪがＮｇＲ１およびＬＩＮＧＯ−１と結合することを示している。
実施例３
脳内でのＴＡＪの発現
本実施例は、ＴＡＪが脳の中で高度に、広い範囲で発現されていることを示す。
ヒトの複数の組織およびヒトの脳のブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のノーザン分析を、標準的なプロトコールとＰＣＲを使用して作成したヒトＴＡＪプローブ（４１９ｂｐのフラグメント、正方向プライマー（５’−ｔａｔｇｇｇｇａｇｇａｔｇｃａｃａｇｔｇｔｇｔｇ−３’（配列番号１９））および逆方向プライマー（５’−ａｇａｃｃａｇｃｔｇｇｇｔｔｔｃｔｔｃｔｃｃａｔ−３’（配列番号２０）））を使用して行った。
マウスの組織のｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とラットｃＤＮＡを、正方向プライマー（５’−ｔａｔｇｇｇｇａｇｇａｔｇｃａｃａｇｔｇｔｇｔｇ−３’（配列番号１９））および逆方向プライマー（５’−ａｇａｃｃａｇｃｔｇｇｇｔｔｔｃｔｔｃｔｃｃａｔ−３’（配列番号２０））を使用して半定量的ＰＣＲによって分析した。これによっては、４１９ｂｐのＴＡＪフラグメントが増幅された。ＧＡＰＤＨの増幅を、正規化の目的のために平衡して行った。個々のラットの細胞型のＰＣＲ分析のために、生後６〜７日（Ｐ６〜７）の小脳の顆粒状ニューロン、Ｐ２小脳乏突起膠細胞、Ｐ４小脳星状細胞、および胚性期１４日目（Ｅ１４）の後根ガングリオンニューロンの精製した培養物を、記載したように調製し（参考文献をここに挿入する、または方法論をここに挿入する）、そしてＴｒｉｚｏｌ試薬と製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡを回収した。精製したＲＮＡを使用して、ＧｅｎｅＡｍｐキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して細胞型特異的ｃＤＮＡを作成した。
ｍＲＮＡを、胚性期１４日目（Ｅ１４）、Ｅ１８、生後０日目（Ｐ０）、Ｐ４、Ｐ８、Ｐ２３、および成体マウスの脳から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出した。これらのＲＮＡについてＴａｑｍａｎ ＲＴ−ＰＣＲを行って、ＴＡＪ、ｐ７５、ＬＩＮＧＯ−１、およびＮｇＲ１メッセージのレベルを定量した。
半定量的ＰＣＲによる転写分析によっては、高いレベルのＴＡＪ ｍＲＮＡがマウスの脳の中で見られ、より穏やかな発現が、心臓、肺、肝臓、骨格筋、および精巣で見られた。ＴＡＪ ｍＲＮＡの発現は複数の脳領域に及んで広く分布しており、皮質、小脳、海馬、および視床の中で最も高かった。
ＴＡＪがニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞の中で発現されているかどうかを決定するために、生後６〜７日目（Ｐ６〜７）の小脳の顆粒状ニューロン、Ｐ２小脳乏突起膠細胞、Ｐ４小脳星状細胞、および胚性期１４日目（Ｅ１４）後根ガングリオンニューロンの精製した培養物を調製し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによってＴＡＪ ｍＲＮＡについて分析した。ほぼ匹敵するレベルのメッセージがそれぞれの細胞の中で見られた。
ＴＡＪの相対的な発現レベルを、発達段階にある脳および成体の脳の中でのＭＡＩＦレセプター複合体の可能性のある組成物についての知見を得るために比較した。定量的実時間ＰＣＲを、Ｅ１４、Ｅ１８、Ｐ０、Ｐ４、Ｐ８、Ｐ１１、Ｐ２３、および成体の範囲の発生の時間的経過にわたって採取したラットの全脳のホモジネートのＴＡＪについて行った。これらのデータは、ＴＡＪの発現がＰ２３および成体のラットにおいては劇的に減少していたことを示している（図６）。
Ｐ６〜７小脳の顆粒状ニューロンの精製した培養物をインビトロで２４時間増殖させ、その後、抗ＴＡＪ抗体、抗ｐ７５抗体、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体、および抗ＮｇＲ１抗体を使用して染色した。免疫組織化学的データは、ＴＡＪ、ＬＩＮＧＯ−１とＮｇＲ１が小さい細胞の中に一緒に局在化していることを示している。
実施例４
ＴＡＪはＲｈｏの活性化を誘導する
本実施例は、ＴＡＪが神経突起成長の阻害因子に応答するＲｈｏの活性化を媒介することを示す。
Ｎｏｇｏ、Ｏｍｇｐ、またはＭＡＧによるＭＡＩＦレセプターの結合によって、神経突起成長に対するミエリンの阻害効果に重要であるＭＡＩＦレセプターによるシグナル伝達経路の中の１つの工程である、ＲｈｏＡの活性化が導かれる。ＴＡＪとＮｇＲ１の相互作用が実際に機能的に活性なＭＡＩＦレセプター複合体の指標であるかどうかを決定するために、ＣＯＳ細胞をＴＡＪ、ＮｇＲ１、およびＬＩＮＧＯ−１の様々な組み合わせでトランスフェクトし、ＡＰタグ化Ｏｍｇｐ、または無関係なＡＰタグ化対照タンパク質で処理した。その後、細胞中の活性化されたＲｈｏＡのレベルを測定した。ＣＯＳ−７細胞をＡＰ−ＯＭｇｐリガンドで１０分間処理し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、およびプロテアーゼ阻害因子の中で溶解させた。ＧＴＰ結合タンパク質および全ＲｈｏＡタンパク質を、抗ＲｈｏＡ ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用してウェスタンブロッティングによって検出した。
ＴＡＪのみ、ＴＡＪとＬＩＮＧＯ−１、またはＴＡＪとＮｇＲ１でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞は、活性化されたＲｈｏＡの増大を示さなかった。しかし、３つの成分の全てでのトランスフェクションによっては、ＡＰ−Ｏｍｇｐでの処置の後にＲｈｏＡの活性化の増大が導かれ（示さない）、このことは、ＴＡＪ、ＬＩＮＧＯ−１、およびＮｇＲ１の発現が、シグナル伝達をダウンレギュレートさせることができる機能的なＭＡＩＦレセプターの再構成に十分であることを示している。
実施例５
ＴＡＪノックアウトマウスの作成
ＴＡＪ遺伝子の最初の２つのコードエキソンを相同組換えによって欠失させたＴＡＪノックアウトマウスを作成した。ＴＡＪノックアウトマウスを、混合１２９ Ｓｖ／Ｃ５７Ｂ１６バックグラウンドについて作成した。ＴＡＪの最初のコードエキソンの最初の６６個のアミノ酸を、ヒトＣＤ２−ネオマイシン融合構築物での相同組換えによって欠失させた（図４）。Ｔａｊについては少なくとも２つのスプライシング改変体が存在している；しかし、いずれも、同じ開始メチオニンを使用し、ＣＤ２−ｎｅｏ構築物には２つの終結コドンが含まれ（１つのフレームに１つ、一方にはない）、これによって、ＴＡＪの欠失が完了したと考えた。ＴＡＪ ｍＲＮＡの発現がないことを、ＴＡＪノックアウトマウスの脳ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって確認した。使用したプライマーは、野生型上流−５’−ＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号２１）、ノックアウト上流５’−ＣＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣ−３’（配列番号２２）、および野生型／ノックアウト下流５’−ＡＧＣＧＣＣＴＣＧＴＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号２３）であり、それぞれ、１９５ｂｐおよび２７７ｂｐの野生型増幅フラグメントおよびノックアウト増幅フラグメントが得られた。
これらのマウスは極めて正常であり、明らかな生理学的な異常、または性質、移動運動、または繁殖力の変化はなかった。そのＴＡＪ遺伝子ノックアウトを確認するために、マウスの脳組織を使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。
初代ＣＧまたはＤＲＧニューロン培養物を、０．１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングしたＬａｂｔｅｋ培養スライド（８ウェル）を使用して調製し、その後、３００ｎｇ／３μｌのＡＰ−Ｎｏｇｏ６６を、または５００ｎｇ／３μｌのミエリンのみを、またはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（３００μｇ／３μｌ）の存在下で１μｇ／３μｌのＴＡＪ−Ｆｃもしくは対照Ｆｃ（融合タンパク質のヒトＩｇＧ１−ヒンジ−ＣＨ２ＣＨ３部分）をスポットした。スライドを室温で２時間乾燥させた。ｐ７のラットからＣＧニューロン（１×１０５細胞／８ウェル）または５０００ ＤＲＧ／９６ウェルを分離し、スライド上に播種し、そして５％のＣＯ２の中で３７℃で２４時間インキュベートした。スライドを４％のパラホルムアルデヒド／２０％のスクロースの中で固定し、抗βＩＩＩ−チューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ ＴＵＪ１）で染色した。
実施例６
ＴＡＪが欠失しているニューロンは神経突起の阻害に対して低い応答性を示す
ＭＡＩＦに対するニューロンの応答に対するＴＡＪの欠失の効果を分析するために、ＴＡＪノックアウトマウスおよび野生型マウスに由来するＰ８小脳の顆粒状ニューロン（ＣＧＮ）を、ミエリンをコーティングしたスライド上にプレートし、神経突起成長を、プレーティングの翌日に測定した（図５Ａおよび５Ｂ）。応答性の用量応答曲線におけるＴＡＪノックアウトＣＧＮからの神経突起の長さの定量は、ＴＡＪが欠失しているＣＧＮが野生型ＣＧＮよりもミエリンによって誘導される阻害に対する応答性が低いことを示している（図５Ｃ）。
ミエリンに対する阻害性の応答は、ＴＡＪ−Ｆｃ融合タンパク質でＭＡＩＦレセプター複合体を破壊することによって正常なＣＧＮにおいて減少させることができた。ＴＡＪ−Ｆｃの添加によっては、より長いＣＧＮ成長が導かれ、このことは、ＭＡＩＦレセプター複合体が傷つけられたことを示唆している（図５Ａ、５Ｂ）。
神経突起成長に対するＴａｊ−Ｆｃの劇的な効果は、生後７日のラットから取り出したＤＲＧニューロンを使用して見られた。ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）の基質およびＡＰ−Ｎｏｇｏ６６基質上で増殖させると、通常はインビトロで２４時間後に見られる多数の神経突起成長が、ＰＤＬのみの上での増殖と比較して劇的に減少した。しかし、ＴＡＪ−Ｆｃもまた基質に加えた場合には、ＤＲＧ成長はほぼ対照レベルにまで回復した（図５Ｄ）。試験した他のＴＮＦＲ−Ｆｃファミリーのメンバー：ＣＤ４０−Ｆｃ、ＴＮＦＲ１−Ｆｃ、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ、Ｆｎ１４−Ｆｃ、およびＬＴβＲ−Ｆｃは、ＤＲＧ神経突起成長に対しては効果がなかった（データは示さない）。この結果は、ＴＡＪが軸索の成長の調節に特異的に関与していることを示している。
図１Ａ〜Ｃは、様々な結合アッセイの結果を示している。（Ａ）は、可溶性ＮｇＲ１（１０μｇ／ｍｌ）に対する種々のタンパク質の結合についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している棒グラフである。（Ｂ）は、示したタンパク質を発現するトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＡＰ−ＴＡＪの結合を示している柱状グラフのセットである。（Ｃ）は、ＮｇＲ１を発現するＣＨＯ細胞に対するＡＰ−ＴＡＪの結合についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示しているグラフである。 図１Ａ〜Ｃは、様々な結合アッセイの結果を示している。（Ａ）は、可溶性ＮｇＲ１（１０μｇ／ｍｌ）に対する種々のタンパク質の結合についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している棒グラフである。（Ｂ）は、示したタンパク質を発現するトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＡＰ−ＴＡＪの結合を示している柱状グラフのセットである。（Ｃ）は、ＮｇＲ１を発現するＣＨＯ細胞に対するＡＰ−ＴＡＪの結合についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示しているグラフである。 図１Ａ〜Ｃは、様々な結合アッセイの結果を示している。（Ａ）は、可溶性ＮｇＲ１（１０μｇ／ｍｌ）に対する種々のタンパク質の結合についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している棒グラフである。（Ｂ）は、示したタンパク質を発現するトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＡＰ−ＴＡＪの結合を示している柱状グラフのセットである。（Ｃ）は、ＮｇＲ１を発現するＣＨＯ細胞に対するＡＰ−ＴＡＪの結合についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示しているグラフである。 図２は、一連の免疫沈降実験のウェスタンブロットである。示した様々なタンパク質の組み合わせを同時に発現させ、細胞抽出物を示した抗体（上段のパネル：抗ＴＡＪ；下段のパネル：抗ＬＩＮＧＯ−１）で免疫沈降させた。 図３は、全長のＮｇＲ１（ｓＮｇＲ１−４３２）と短縮型ＮｇＲ１（ｓＮｇＲ１−３４４およびｓＮｇＲ１−３１０）に対するＡＰ−ＴＡＪの結合についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示しているグラフである。 図４は、ＴＡＪノックアウト構築物の図である。 図５Ａ〜Ｄは、神経突起成長に対するＴＡＪの効果を示している柱状グラフとグラフのセットである。（Ａ）ミエリンでコーティングしたスライド上にプレートしたＴＡＪノックアウトマウスおよび野生型マウスに由来するＰ８小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）。（Ｂ）プレーティングの翌日のＴＡＪが存在しない条件下およびＴＡＪの存在下での野生型ＣＧＮの神経突起成長の測定。（Ｃ）それぞれのミエリン用量応答曲線における、ＴＡＪ野生型ＣＧＮおよびＴＡＪノックアウトＣＧＮからの神経突起の長さの測定。（Ｄ）ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）およびＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（示したようにＴＡＪ−Ｆｃを含むものおよび含まないもの）の基質上で増殖させた生後７日のラットから分離したＤＲＧニューロン中での神経突起成長の測定（インビトロで２４時間後）。 図５Ａ〜Ｄは、神経突起成長に対するＴＡＪの効果を示している柱状グラフとグラフのセットである。（Ａ）ミエリンでコーティングしたスライド上にプレートしたＴＡＪノックアウトマウスおよび野生型マウスに由来するＰ８小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）。（Ｂ）プレーティングの翌日のＴＡＪが存在しない条件下およびＴＡＪの存在下での野生型ＣＧＮの神経突起成長の測定。（Ｃ）それぞれのミエリン用量応答曲線における、ＴＡＪ野生型ＣＧＮおよびＴＡＪノックアウトＣＧＮからの神経突起の長さの測定。（Ｄ）ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）およびＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（示したようにＴＡＪ−Ｆｃを含むものおよび含まないもの）の基質上で増殖させた生後７日のラットから分離したＤＲＧニューロン中での神経突起成長の測定（インビトロで２４時間後）。 図５Ａ〜Ｄは、神経突起成長に対するＴＡＪの効果を示している柱状グラフとグラフのセットである。（Ａ）ミエリンでコーティングしたスライド上にプレートしたＴＡＪノックアウトマウスおよび野生型マウスに由来するＰ８小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）。（Ｂ）プレーティングの翌日のＴＡＪが存在しない条件下およびＴＡＪの存在下での野生型ＣＧＮの神経突起成長の測定。（Ｃ）それぞれのミエリン用量応答曲線における、ＴＡＪ野生型ＣＧＮおよびＴＡＪノックアウトＣＧＮからの神経突起の長さの測定。（Ｄ）ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）およびＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（示したようにＴＡＪ−Ｆｃを含むものおよび含まないもの）の基質上で増殖させた生後７日のラットから分離したＤＲＧニューロン中での神経突起成長の測定（インビトロで２４時間後）。 図５Ａ〜Ｄは、神経突起成長に対するＴＡＪの効果を示している柱状グラフとグラフのセットである。（Ａ）ミエリンでコーティングしたスライド上にプレートしたＴＡＪノックアウトマウスおよび野生型マウスに由来するＰ８小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）。（Ｂ）プレーティングの翌日のＴＡＪが存在しない条件下およびＴＡＪの存在下での野生型ＣＧＮの神経突起成長の測定。（Ｃ）それぞれのミエリン用量応答曲線における、ＴＡＪ野生型ＣＧＮおよびＴＡＪノックアウトＣＧＮからの神経突起の長さの測定。（Ｄ）ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）およびＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（示したようにＴＡＪ−Ｆｃを含むものおよび含まないもの）の基質上で増殖させた生後７日のラットから分離したＤＲＧニューロン中での神経突起成長の測定（インビトロで２４時間後）。 図６は、発達の経時的スパンＥ１４、Ｅ１８、Ｐ０、Ｐ４、Ｐ８、Ｐ１１、Ｐ２３、および成体（Ｅ＝胎生期日数、およびＰ＝生後日数）で採取したラットの全脳ホモジネートの中でのＴＡＪの発現の相対的なレベルを示しているグラフである。

Claims (24)

  1. 神経突起成長を増大させるための組成物であって、該組成物は、ニューロンの中でのＴＡＪによるシグナル伝達を減少させる物質の有効量を含み、該物質が、可溶性ＴＡＪポリペプチドであり、該ニューロンがＣＮＳニューロンであり、該可溶性ＴＡＪポリペプチドが、配列番号２の細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含むＴＡＪアンタゴニストであり、そして、該可溶性ＴＡＪポリペプチドがＮｇＲ１に結合し得る、組成物。
  2. 前記可溶性ＴＡＪポリペプチドが、（ａ）配列番号２の細胞外ドメインに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｂ）１５個までのアミノ酸の欠失、置換、または付加を有している、配列番号２の細胞外ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記可溶性ＴＡＪポリペプチドに、配列番号２の２０位〜５０位のアミノ酸の間のＮ末端から、配列番号２の１３０位〜１７６位のアミノ酸の間のＣ末端までを有しているポリペプチドが含まれる、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記可溶性ＴＡＪポリペプチドに異種アミノ酸配列がさらに含まれている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記異種アミノ酸配列に免疫グロブリンのＦｃ領域が含まれている、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記ＣＮＳニューロンがヒトのＣＮＳニューロンである、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記ヒトのＣＮＳニューロンが、ＣＧニューロン、ＤＲＧニューロン、星状細胞、および乏突起膠細胞からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
  8. 神経突起成長を増大させる必要がある被験体を処置するための組成物であって、該被験体がＣＮＳ神経変性症状を有するか、または、該被験体が、軸索の損傷または切断に関係しているＣＮＳ損傷を有し：
    該組成物は、ニューロンの中でのＴＡＪによるシグナル伝達またはＴＡＪの複合体の形成を減少させる物質を、神経突起成長を増大させるために十分な量で含み、該物質が、可溶性ＴＡＪポリペプチドであり、該ニューロンがＣＮＳニューロンであり、該可溶性ＴＡＪポリペプチドが、配列番号２の細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含むＴＡＪアンタゴニストであり、そして、該可溶性ＴＡＪポリペプチドがＮｇＲ１に結合し得る、
    組成物。
  9. 前記可溶性ＴＡＪポリペプチドが、（ａ）配列番号２の細胞外ドメインに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および（ｂ）１５個までのアミノ酸の欠失、置換、または付加を有している、配列番号２の細胞外ドメインを含むポリペプチドからなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記可溶性ＴＡＪポリペプチドに、配列番号２の２０位〜５０位のアミノ酸の間のＮ末端から、配列番号２の１３０位〜１７６位のアミノ酸の間のＣ末端までを有しているポリペプチドが含まれる、請求項８に記載の組成物。
  11. 前記可溶性ＴＡＪポリペプチドに異種アミノ酸配列がさらに含まれている、請求項９または１０に記載の組成物。
  12. 前記異種アミノ酸配列に免疫グロブリンのＦｃ領域が含まれている、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記ＣＮＳニューロンがヒトのＣＮＳニューロンである、請求項８に記載の組成物。
  14. 前記ヒトのＣＮＳニューロンが、ＣＧニューロン、ＤＲＧニューロン、星状細胞、および乏突起膠細胞からなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記被験体がヒトである、請求項８に記載の組成物。
  16. 前記被験体がＣＮＳ神経変性症状を有している、請求項８または１５に記載の組成物。
  17. 前記神経変性の症状が、多発性硬化症、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、または糖尿病性神経障害である、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記被験体が軸索の損傷または切断に関係しているＣＮＳ損傷を有している、請求項８または１５に記載の組成物。
  19. 前記ＣＮＳの損傷が、外傷性の脳損傷、脳卒中、脊髄損傷、または視神経の損傷である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記損傷後７２時間以内に投与されることが意図される、請求項１８に記載の組成物。
  21. 前記損傷の部位に局所的に、または該損傷の部位の近くに投与されることが意図される、請求項１８に記載の組成物。
  22. 第２の予防用組成物または治療用組成物と組み合わせて投与されることが意図される、請求項８に記載の組成物。
  23. 前記第２の予防用組成物または治療用組成物が、鎮痛剤、抗生物質、またはコルチコステロイドである、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記被験体を、神経機能について評価することが意図される、請求項８に記載の組成物。
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