JP4911280B2 - Organic polymer particles and method for producing the same - Google Patents
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Description
本発明は、ｐ−トルエンスルホニル基を有し、粒径分布がシャープで、タンパクや核酸等の吸着量が少ない、有機ポリマー粒子およびその製造方法に関する。 The present invention relates to organic polymer particles having a p-toluenesulfonyl group, having a sharp particle size distribution, and having a small amount of adsorption of proteins, nucleic acids and the like, and a method for producing the same.
近年、創薬などの分野で、分子間相互作用を利用して、ある特定の分子に特異的な相互作用を有する分子を検出又は分離する試みが盛んに行われている。具体的には、検出等の対象とする分子（以下、「ターゲット分子」という。）と特異的相互作用を有する他方の分子（以下、「リガンド分子」という。）を有機ポリマーからなる粒子等の担体に固定したアフィニティー担体を調製し、該特異的相互作用を利用してターゲット分子を検出等することが広く行われている。 In recent years, in the field of drug discovery and the like, attempts have been actively made to detect or separate molecules having an interaction specific to a specific molecule using intermolecular interaction. Specifically, a molecule to be detected or the like (hereinafter referred to as “target molecule”) and the other molecule having a specific interaction (hereinafter referred to as “ligand molecule”) can be used as a particle made of an organic polymer. It is widely practiced to prepare an affinity carrier immobilized on a carrier and detect a target molecule using the specific interaction.
例えば、アフィニティー担体を利用したアフィニティークロマトグラフィーを用いた免疫抑制剤ＦＫ５０６の細胞内結合タンパク質ＦＫＢＰ１２の発見（非特許文献１）などが知られている。このようなアフィニティー担体としては、リガンド分子を共有結合させたアガロースなどの多孔質ゲルが一般的に用いられている。しかしながら、担体として多孔質ゲルを用いる場合、ターゲット分子以外のタンパクや核酸等の分子がアフィニティー担体に吸着する、いわゆる、非特異吸着と呼ばれる現象が生じるため、ターゲット分子の分離、精製が困難であるという問題が生じる。 For example, the discovery of the intracellular binding protein FKBP12 of the immunosuppressant FK506 using affinity chromatography using an affinity carrier is known (Non-patent Document 1). As such an affinity carrier, a porous gel such as agarose to which a ligand molecule is covalently bonded is generally used. However, when a porous gel is used as a carrier, a phenomenon called so-called non-specific adsorption occurs in which molecules such as proteins and nucleic acids other than the target molecule are adsorbed to the affinity carrier, so that it is difficult to separate and purify the target molecule. The problem arises.
かかる非特異吸着の解決策として、表面がグリシジルメタクリレートで覆われたスチレン−グリシジルメタクリレート共重合体等からなる有機ポリマー粒子にスペーサを介して生理活性物質を結合したミクロスフィア（特許文献１，２）、粒子表面に親水性のスペーサを導入した有機ポリマー粒子（特許文献３，４）などが提案されている。しかしながら、これらはいずれも非特異吸着の低減効果が充分ではなく、さらに非特異吸着の少ない有機ポリマー粒子が求められている。
As a solution for such non-specific adsorption, microspheres in which a physiologically active substance is bound via a spacer to organic polymer particles composed of a styrene-glycidyl methacrylate copolymer whose surface is covered with glycidyl methacrylate (
一方、有機ポリマー粒子にリガンド分子を化学結合させるための担体粒子として、主にカルボキシル基を有するポリスチレン系粒子が広く使用されている。しかしながら、このようなポリスチレン系粒子は一般に、試験検体中に存在するタンパクや核酸等の吸着（非特異吸着）が大きく、これにより感作粒子の性能が阻害されるため、粒子を使用する上での大きな障害になっている。このため、粒子にリガンド分子を結合させた後、残りの粒子表面にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパクを吸着させるブロッキングの手法が用いられているが、非特異吸着を充分に防止することは困難である。また、ポリスチレン粒子に一般式（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨＣＨ３Ｏ）ｍで表されるポリアルキレンオキシド側鎖を有するアクリルエステルを共重合させたり、あるいは有機ポリマー粒子の乳化重合後にアルカリ性水溶液中で加熱処理して粒子に結合した過硫酸塩系開始剤の断片を加水分解させたりすることにより、生理活性物質担体粒子としての性能を向上させることが知られているが、非特異吸着を充分に防止するには至っていない。
本発明の目的は、タンパク質などの吸着量が極めて少ない有機ポリマー粒子およびその製造方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide organic polymer particles having a very small amount of adsorption of proteins and the like and a method for producing the same.
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ね、特定の有機ポリマーを含んでなる有機ポリマー粒子であって、ｐ−トルエンスルホニル基を有し、数平均粒径が０．１〜１５μｍである有機ポリマー粒子により、タンパク質などの非特異吸着が極めて少ない有機ポリマー粒子が得られることを見出し、本発明を完成させた。 In order to achieve the above object, the present inventors have conducted extensive research and are organic polymer particles containing a specific organic polymer, which have a p-toluenesulfonyl group, and have a number average particle size of 0.1 to 0.1. The present inventors have found that organic polymer particles having a non-specific adsorption of proteins and the like can be obtained with organic polymer particles having a size of 15 μm, thereby completing the present invention.
本発明によれば、以下の有機ポリマー粒子、及びその製造方法を提供できる。 According to the present invention, the following organic polymer particles and a method for producing the same can be provided.
本発明の有機ポリマー粒子は、（Ａ）ポリスチレン又はスチレン系共重合体と、（Ｂ）ｐ−トルエンスルホニル基を有し、メタクリル酸メチル及びトリメチロールプロパントリメタクリレートを含有する重合性化合物の共重合体、とを含んでなる有機ポリマー粒子であって、レーザ回折・散乱法により求めた数平均粒径が０．１〜１５μｍである有機ポリマー粒子である。 The organic polymer particle of the present invention is a copolymer of (A) a polystyrene or styrene copolymer and (B) a polymerizable compound having a p-toluenesulfonyl group and containing methyl methacrylate and trimethylolpropane trimethacrylate. And organic polymer particles having a number average particle size of 0.1 to 15 μm determined by a laser diffraction / scattering method.
ここで、上記本発明の有機ポリマー粒子は、磁性体を含有することができる。磁性粒子とすることにより、例えば遠心分離器等を用いずとも磁石を用いて磁性粒子を分離することができるため、ターゲット分子の分離工程を簡素化又は自動化することができるメリットがある。 Here, the organic polymer particles of the present invention may contain a magnetic substance. By using magnetic particles, for example, magnetic particles can be separated using a magnet without using a centrifuge or the like, so that there is an advantage that the process of separating target molecules can be simplified or automated.
また、本発明の有機ポリマー粒子の製造方法は、（１）（Ａ）ポリスチレン又はスチレン系共重合体と、（Ｂ’）メタクリル酸メチル、トリメチロールプロパントリメタクリレート及びグリシジル基を有する重合性モノマーを含有する重合性化合物の共重合体とを含んでなる有機ポリマー粒子１を合成する工程、（２）有機ポリマー粒子１を硫酸処理して水酸基を有する有機ポリマー粒子２を得る工程、及び（３）有機ポリマー粒子２とｐ−トルエンスルホン酸塩とを反応させて、ｐ−トルエンスルホニル基を有する有機ポリマー粒子３を合成する工程とを有することを特徴とする、レーザ回折・散乱法により求めた数平均粒径が０．１〜１５μｍである有機ポリマー粒子３の製造方法である。
The organic polymer particle production method of the present invention comprises (1) (A) a polystyrene or styrene copolymer and (B ′) a polymerizable monomer having methyl methacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate and a glycidyl group. A step of synthesizing
本発明によれば、タンパク質等の吸着量が少ない有機ポリマー粒子、及びその製造方法を提供することができる。また、タンパク質等の吸着量が少ないため、ターゲット分子を高感度で検出し、又は、高純度で分離することができる。このため、ターゲット分子の分離および精製を容易に行なうことができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the organic polymer particle with few adsorption amounts, such as protein, and its manufacturing method can be provided. In addition, since the amount of adsorption of protein or the like is small, the target molecule can be detected with high sensitivity or separated with high purity. For this reason, separation and purification of the target molecule can be performed easily.
１．本発明の有機ポリマー粒子およびその製造方法
本発明の有機ポリマー粒子の数平均粒径（以下、単に「粒径」という。）は、通常、０．１〜１５μｍであり、好ましくは０．３〜１０μｍであり、より好ましくは１〜１０μｍである。粒径は、レーザ回折・散乱法により求める。ここで、粒径が０．１μｍ未満の場合、遠心分離などを用いた分離に長時間を要し、水などの洗浄溶媒と粒子との分離が不十分になるため、目的外の分子（例えば、タンパク質などの生理活性物質）の除去が不十分になり、充分な精製ができない場合がある。一方、粒径が１５μｍを超えると、表面積が小さくなり、ターゲットとするタンパク質などの生理活性物質の捕捉量が少ない場合がある。
1. Organic Polymer Particles of the Present Invention and Method for Producing the Same The number average particle size (hereinafter simply referred to as “particle size”) of the organic polymer particles of the present invention is usually 0.1 to 15 μm, preferably 0.3 to It is 10 micrometers, More preferably, it is 1-10 micrometers. The particle size is determined by a laser diffraction / scattering method. Here, when the particle size is less than 0.1 μm, it takes a long time for separation using centrifugation or the like, and the separation between the washing solvent such as water and the particles becomes insufficient. Removal of physiologically active substances such as proteins) may be insufficient and sufficient purification may not be possible. On the other hand, when the particle diameter exceeds 15 μm, the surface area becomes small, and the amount of captured physiologically active substance such as a target protein may be small.
本発明の有機ポリマー粒子は、そのｐ−トルエンスルホニル基を介して、リガンド分子を化学結合させて、アフィニティー担体として利用することができる。 The organic polymer particles of the present invention can be used as an affinity carrier by chemically bonding a ligand molecule via the p-toluenesulfonyl group.
本発明の有機ポリマー粒子は、通常、適当な分散媒に分散させて用いられる。使用できる分散媒としては、有機ポリマー粒子を溶解したり、有機ポリマー粒子を膨潤させない分散媒が好ましい。有機ポリマー粒子が顕著に膨潤等すると、タンパク質などの生理活性物質の非特異吸着が増加することがあるためである。好ましい分散媒としては、例えば、水系媒体を用いることができる。ここで、水系媒体とは、水、または水と水に混和する有機溶剤（例えば、アルコール類、アルキレングリコール誘導体など）との混合物をいう。 The organic polymer particles of the present invention are usually used after being dispersed in an appropriate dispersion medium. The dispersion medium that can be used is preferably a dispersion medium that does not dissolve organic polymer particles or swell organic polymer particles. This is because when the organic polymer particles are significantly swollen, nonspecific adsorption of physiologically active substances such as proteins may increase. As a preferable dispersion medium, for example, an aqueous medium can be used. Here, the aqueous medium refers to water or a mixture of water and an organic solvent miscible with water (for example, alcohols, alkylene glycol derivatives, etc.).
本発明の有機ポリマー粒子は、（Ａ）ポリスチレン又はスチレン系共重合体と、（Ｂ）ｐ−トルエンスルホニル基を有し、メタクリル酸メチル及びトリメチロールプロパントリメタクリレートを含有する重合性化合物の共重合体とを含んでなる。 The organic polymer particle of the present invention is a copolymer of (A) a polystyrene or styrene copolymer and (B) a polymerizable compound having a p-toluenesulfonyl group and containing methyl methacrylate and trimethylolpropane trimethacrylate. Coalesce.
（Ａ）ポリスチレン又はスチレン系共重合体は、スチレンのホモポリマー（ポリスチレン）又は、スチレンと他のモノマーとの共重合体（スチレン系共重合体）である。スチレン系共重合体に使用できる他のモノマーとしては、特に限定されないが、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、ジビニルベンゼン等のスチレン以外の芳香族ビニルモノマー等を挙げることができる。重合体（Ａ）の中では、ポリスチレン、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体が好ましい。 (A) Polystyrene or a styrene copolymer is a styrene homopolymer (polystyrene) or a copolymer of styrene and another monomer (styrene copolymer). Although it does not specifically limit as another monomer which can be used for a styrene-type copolymer, Aromatic vinyl monomers other than styrene, such as (alpha) -methylstyrene, halogenated styrene, divinylbenzene, etc. can be mentioned. Among the polymers (A), polystyrene, a copolymer of styrene and divinylbenzene are preferable.
（Ｂ）ｐ−トルエンスルホニル基を有し、メタクリル酸メチル及びトリメチロールプロパントリメタクリレートを含有する重合性化合物の共重合体は、メタクリル酸メチル及びトリメチロールプロパントリメタクリレートを必須として、通常、これらにグリシジル基を有する重合性モノマーを加えた重合性化合物の混合物を重合して得られた共重合体に、ｐ−トルエンスルホニル基を導入することにより得られる。ｐ−トルエンスルホニル基の導入方法については、有機ポリマー粒子の製造方法の中で説明する。 (B) A copolymer of a polymerizable compound having a p-toluenesulfonyl group and containing methyl methacrylate and trimethylolpropane trimethacrylate is essentially composed of methyl methacrylate and trimethylolpropane trimethacrylate. It can be obtained by introducing a p-toluenesulfonyl group into a copolymer obtained by polymerizing a mixture of polymerizable compounds to which a polymerizable monomer having a glycidyl group is added. The method for introducing a p-toluenesulfonyl group will be described in the method for producing organic polymer particles.
前記グリシジル基を有する重合性モノマーとしては、特に限定されないが、グリシジル（メタ）アクリレート等を挙げることができる。 Although it does not specifically limit as a polymerizable monomer which has the said glycidyl group, A glycidyl (meth) acrylate etc. can be mentioned.
本発明の有機ポリマー粒子は、磁性体を含有した有機ポリマー粒子（以下、「磁性体含有有機ポリマー粒子」という。）とすることができる。磁性体含有有機ポリマー粒子は、例えば遠心分離器等を用いずとも磁石を用いて磁性粒子を分離することができるため、ターゲット分子の分離工程を簡素化又は自動化することができるメリットがある。 The organic polymer particles of the present invention can be organic polymer particles containing a magnetic substance (hereinafter referred to as “magnetic substance-containing organic polymer particles”). Since the magnetic substance-containing organic polymer particles can separate the magnetic particles using a magnet without using, for example, a centrifuge, there is an advantage that the separation process of the target molecule can be simplified or automated.
磁性体含有有機ポリマー粒子は、磁性体微粒子を有機ポリマーなどの非磁性体の連続相中に分散した粒子、磁性体微粒子の２次凝集体をコアとして有機ポリマーなどの非磁性体をシェルとする粒子、有機ポリマーなどの非磁性体（非磁性核粒子）をコアとして磁性体微粒子の２次凝集体をシェル層するコア・シェル型の粒子に、該シェル層の外側の最外層に有機ポリマー層を形成した粒子などが挙げられる。これらの中では、前記コア・シェル型の粒子の最外層に有機ポリマー層を形成した粒子が好ましい。この場合、コアとする有機ポリマー粒子は、特に限定されないが、ポリスチレン又はスチレン系共重合体からなる有機ポリマー粒子が好ましい。各種構造の磁性体含有有機ポリマー粒子に用いる有機ポリマーは、コア・シェル型粒子のコアとする有機ポリマー粒子に用いる場合を除き、前記（Ａ）ポリスチレン又はスチレン系共重合体と、（Ｂ）ｐ−トルエンスルホニル基を有し、メタクリル酸メチル及びトリメチロールプロパントリメタクリレートを含有する重合性化合物の共重合体とを含んでなることが必要である。 Magnetic polymer-containing organic polymer particles are particles in which magnetic fine particles are dispersed in a continuous phase of a non-magnetic material such as an organic polymer, and a secondary aggregate of magnetic fine particles is used as a core and a non-magnetic material such as an organic polymer is used as a shell. A core-shell type particle having a non-magnetic substance (non-magnetic core particle) such as particles or organic polymer as a core and a secondary aggregate of magnetic fine particles as a shell layer, and an organic polymer layer on the outermost layer outside the shell layer And particles having formed. In these, the particle | grains which formed the organic polymer layer in the outermost layer of the said core-shell type particle | grain are preferable. In this case, the organic polymer particles used as the core are not particularly limited, but organic polymer particles made of polystyrene or a styrene copolymer are preferable. The organic polymer used for the magnetic substance-containing organic polymer particles of various structures is the above (A) polystyrene or styrene copolymer, and (B) p, except when used for the organic polymer particles used as the core of the core-shell type particles. It is necessary to comprise a copolymer of a polymerizable compound having a toluenesulfonyl group and containing methyl methacrylate and trimethylolpropane trimethacrylate.
磁性体の内部組成は均質であってもよいが、上記の好ましい粒径範囲にある均質な磁性体粒子は、常磁性である物質が多く、磁力による分離精製を繰り返すと媒質への再分散が困難になる場合がある。このため、磁性体含有有機ポリマー粒子は、残留磁化の少ない磁性体微粒子を含む、不均質な内部組成を有することがより好ましい。 The internal composition of the magnetic material may be homogeneous, but the homogeneous magnetic particles in the above preferred particle size range are often paramagnetic substances, and re-dispersion in the medium will occur if separation and purification by magnetic force is repeated. It can be difficult. For this reason, it is more preferable that the magnetic substance-containing organic polymer particles have a heterogeneous internal composition including magnetic fine particles having a small residual magnetization.
２．有機ポリマー粒子の製造方法
本発明の有機ポリマー粒子は、（１）（Ａ）ポリスチレン又はスチレン系共重合体と、（Ｂ’）メタクリル酸メチル、トリメチロールプロパントリメタクリレート及びグリシジル基を有する重合性モノマーを含有する重合性化合物の共重合体とを含んでなるベース粒子（以下、「有機ポリマー粒子１」ともいう。）を合成する工程、（２）有機ポリマー粒子１を硫酸処理して水酸基を有する粒子（以下、「有機ポリマー粒子２」ともいう。）を合成する工程、及び（３）有機ポリマー粒子２とｐ−トルエンスルホン酸塩とを反応させて、ｐ−トルエンスルホニル基を有する本発明の有機ポリマー粒子（以下、「有機ポリマー粒子３」ともいう。）を合成する工程とを有する製造方法により得られる。以下に、各工程について、具体的に説明する。
2. Method for Producing Organic Polymer Particle The organic polymer particle of the present invention comprises (1) (A) a polystyrene or styrene copolymer, and (B ′) a polymerizable monomer having methyl methacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, and a glycidyl group. A step of synthesizing base particles (hereinafter also referred to as “
工程（１）有機ポリマー粒子１の合成
磁性体を含有しない場合には、有機ポリマー粒子１は、例えば、乳化重合、ソープフリー重合、懸濁重合などの定法を用いて製造が可能である。より具体的には、有機ポリマー粒子は、例えば、上記ビニル系モノマーの懸濁重合、あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることができる。例えば、有機ポリマー粒子１は、特公昭５７−２４３６９号公報記載のシード粒子を用いる二段膨潤重合法、ジャーナル・オブ・ポリマーサイエンス・ポリマーレター・エディション，９３７頁，第２１巻，１９８３年（Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ．， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌｅｔｔｅｒ Ｅｄ． ２１，９３７（１９８３））記載の重合方法、特開昭６１−２１５６０２号公報、特開昭６１−２１５６０３号公報、および特開昭６１−２１５６０４号公報記載の方法によって作製することができる。
Step (1) Synthesis of
これらの方法の中では、シード粒子を用いる二段膨潤重合法が、粒径の変動係数を小さくすることができるため好ましい。シード粒子は、前述の（Ａ）ポリスチレン又はスチレン系共重合体からなる。そして、二段膨潤重合法により追加されるポリマー部分は、前述の（Ｂ’）メタクリル酸メチル、トリメチロールプロパントリメタクリレート及びグリシジル基を有する重合性モノマーを含有する重合性化合物の共重合体からなる。したがって、このようにして得られた有機ポリマー粒子１は、前記共重合体（Ｂ’）に由来してグリシジル基を有している。
Among these methods, the two-stage swelling polymerization method using seed particles is preferable because the coefficient of variation in particle size can be reduced. The seed particles are made of the above-mentioned (A) polystyrene or styrene copolymer. And the polymer part added by the two-stage swelling polymerization method consists of the copolymer of the polymeric compound containing the polymerizable monomer which has the above-mentioned (B ') methyl methacrylate, a trimethylol propane trimethacrylate, and a glycidyl group. . Therefore, the
また、有機ポリマー粒子１が磁性体を含有する粒子の場合、例えば、非磁性の有機ポリマー粒子１を核粒子として、これに磁性体微粒子を混合し、非磁性核粒子の表面に磁性体微粒子を物理的に吸着させることにより製造が可能である。
Further, when the
また、非磁性の有機ポリマー粒子１と磁性体微粒子の疎水／疎水吸着を利用する方法によって作製することもできる。例えば、非磁性の有機ポリマー粒子１の表面および磁性体微粒子の表面が疎水性のものあるいは疎水化処理されたものを選択し、これらの粒子をドライブレンドするか、あるいは、非磁性の有機ポリマー粒子１および磁性体微粒子の双方を侵すことなく良分散性の溶剤（例えばトルエン、ヘキサン）中で充分分散させた後、混合条件下で溶剤を揮発させる方法が挙げられる。
It can also be produced by a method utilizing hydrophobic / hydrophobic adsorption of nonmagnetic
あるいは、非磁性の有機ポリマー粒子１と磁性体微粒子のドライブレンドして、物理的に強い力を外部から加えることにより双方の粒子を複合化させる方法により作製することもできる。物理的に強い力を負荷する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいはジェットミル、ハイブリダイザーなど高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理的吸着力が強いことが望ましい。その方法としては、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ／秒で実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、非磁性の有機ポリマー粒子１の表面に磁性体微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率などの点から自ずと決定される。
Alternatively, the nonmagnetic
好ましい方法としては、前述の（Ａ）ポリスチレン又はスチレン系共重合体からなる非磁性粒子と磁性体微粒子のドライブレンドして、物理的に強い力を外部から加えることにより双方の複合化粒子を作製した後、この複合化粒子の表面に、前述の（Ｂ’）メタクリル酸メチル、トリメチロールプロパントリメタクリレート及びグリシジル基を有する重合性モノマーを含有する重合性化合物の共重合体からなるポリマー層を設ける方法が挙げられる。この方法で有機ポリマー粒子１を合成すると、磁性体が有機ポリマー粒子１の表層に露出している割合が低いので、非特異吸着を特に有効に低減することができる。
工程（２）有機ポリマー粒子２の合成
有機ポリマー粒子１を硫酸処理することにより、有機ポリマー粒子１が有するグリシジル基が水酸基となる。すなわち、工程（２）は、有機ポリマー粒子１を構成する共重合体（Ｂ）が有するグリシジル基を開環して、水酸基とする工程である。硫酸処理は、例えば、０．０５〜０．３ｍｏｌ／Ｌの硫酸中に有機ポリマー粒子１を分散し、室温〜８０℃で１〜２４時間反応させることにより行う。以上により、有機ポリマー粒子２が得られる。反応後の有機ポリマー粒子２の分散液は、蒸留水に分散し、遠心分離法等により洗浄を繰り返し、有機ポリマー粒子２の水分散体とした後、凍結乾燥法により水を実質的に除去することが好ましい。
As a preferred method, (A) the above-mentioned non-magnetic particles made of polystyrene or styrene copolymer and magnetic fine particles are dry blended, and both composite particles are prepared by applying a physically strong force from the outside. Then, a polymer layer made of a copolymer of a polymerizable compound containing the above-described (B ′) methyl methacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate and a polymerizable monomer having a glycidyl group is provided on the surface of the composite particle. A method is mentioned. When the
Step (2) Synthesis of Organic Polymer Particle 2 By treating the
工程（３）有機ポリマー粒子３の合成
有機ポリマー粒子２をｐ−トルエンスルホン酸塩とを反応させることにより、有機ポリマー粒子２が有する水酸基が、ｐ−トルエンスルホニル基となる。ｐ−トルエンスルホン酸塩としては、特に限定されないが、ｐ−トルエンスルホン酸クロライド等を挙げることができる。工程（３）は、典型的には、有機ポリマー粒子２をピリジン等の有機溶剤に分散した後、有機ポリマー粒子１００重量部当たり１〜５０重量部のｐ−トルエンスルホン酸クロライドを添加し、室温で１〜６時間反応させることにより行う。以上により、有機ポリマー粒子３が得られる。反応後の有機ポリマー粒子３の分散液は、遠心分離法等により、アセトン洗浄と水洗を繰り返し、有機ポリマー粒子３の水分散体とすることが好ましい。
Step (3) Synthesis of Organic Polymer Particle 3 By reacting organic polymer particle 2 with p-toluenesulfonate, the hydroxyl group of organic polymer particle 2 becomes a p-toluenesulfonyl group. Although it does not specifically limit as p-toluenesulfonic acid salt, p-toluenesulfonic acid chloride etc. can be mentioned. In the step (3), typically, after dispersing the organic polymer particles 2 in an organic solvent such as pyridine, 1 to 50 parts by weight of p-toluenesulfonic acid chloride is added per 100 parts by weight of the organic polymer particles, For 1 to 6 hours. The organic polymer particle 3 is obtained by the above. The dispersion of the organic polymer particles 3 after the reaction is preferably made into an aqueous dispersion of the organic polymer particles 3 by repeating acetone washing and water washing by a centrifugal method or the like.
３．用途
本発明の有機ポリマー粒子は、ターゲット分子の検出又は分離、特に、創薬分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子等のアフィニティー担体として利用できる。
3. Use The organic polymer particles of the present invention can be used as an affinity carrier for detection or separation of target molecules, in particular, particles for compound carriers and drug binding carriers for diagnostic agents in the field of drug discovery.
より詳しくは、本発明の有機ポリマー粒子を用いて、解析対象の化学物質（リガンド分子に該当する）を化学結合で固定化し、タンパク物質等との特異的相互作用を用いて当該相互作用を解析および／または測定することによって、被解析化学物質と特異的な相互作用を有するタンパク物質等（ターゲット分子に該当する）を選別し、精製することが可能である。 More specifically, using the organic polymer particles of the present invention, the chemical substance to be analyzed (corresponding to a ligand molecule) is immobilized by chemical bonding, and the interaction is analyzed using specific interactions with protein substances and the like. And / or by measuring, it is possible to select and purify a protein substance or the like (corresponding to a target molecule) having a specific interaction with the chemical substance to be analyzed.
また、本発明の有機ポリマー粒子は、抗体・抗原・酵素・ホルモン等のタンパク質、ＤＮＡ・ＲＮＡ等の核酸物質、脂質あるいは生理活性糖鎖化合物を粒子表面に化学結合法で感作させるアフィニティー担体としても利用できる。 The organic polymer particle of the present invention is used as an affinity carrier for sensitizing a protein surface such as antibody / antigen / enzyme / hormone protein, nucleic acid substance such as DNA / RNA, lipid or bioactive sugar chain compound to the particle surface by a chemical bonding method. Can also be used.
具体的には、粒子に結合させるリガンド分子としては、本発明の有機ポリマー粒子１が有するｐ−トルエンスルホニル基と反応しうる官能基を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、核酸、ペプチド核酸、抗原、ホルモン、分子量５００〜１００万のタンパク質、抗体、糖鎖、多糖類、細胞、アプタマー、ウイルス、酵素、各種のアフィニティー用タグ捕捉物質、ビオチンなどの補酵素、あるいは特定の生理活性作用を持つか、これを持つ可能性のある化学物質などを使用することができる。
Specifically, the ligand molecule to be bonded to the particle is not particularly limited as long as it is a substance having a functional group capable of reacting with the p-toluenesulfonyl group of the
核酸としては、１本鎖若しくは２本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はこれらのアナログが挙げられる。具体的には、ＤＮＡ，ｃＤＮＡ，オリゴＤＮＡ，ＲＮＡ，ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ（micro RNA），ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA），ｓｔＲＮＡ（small temporally regulated RNA）などが挙げられる。 Examples of the nucleic acid include single-stranded or double-stranded DNA or RNA, or analogs thereof. Specific examples include DNA, cDNA, oligo DNA, RNA, mRNA, antisense RNA, miRNA (micro RNA), siRNA (small interfering RNA), and stRNA (small temporally regulated RNA).
分子量５０〜１００万のタンパク質としては、具体的には、合成ペプチド、膜タンパク質、核内受容体、酵素、アビジン，レクチン、キナーゼ、ホスファターゼ，ホルモン、転写因子、輸送蛋白、サイトカイン、リンフォカイン、抗体、あるいはルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリン、蛍光タンパク質等の生物発光機能を有するものなどが挙げられる。 Specific examples of proteins having a molecular weight of 500 to 1,000,000 include synthetic peptides, membrane proteins, nuclear receptors, enzymes, avidin, lectins, kinases, phosphatases, hormones, transcription factors, transport proteins, cytokines, lymphokines, antibodies, Alternatively, those having a bioluminescence function such as luciferin, luciferase, aequorin, fluorescent protein and the like can be mentioned.
脂質としては、具体的には、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトーマンノシド、ウルシオール、各種のガングリオシドなどが挙げられる。 Specific examples of lipids include phosphatidic acid, phosphatidylinositol mannoside, urushiol, and various gangliosides.
アプタマーは、タンパク質、酵素、色素、アミノ酸、ヌクレオチド、成長因子、遺伝子発現調節因子、細胞接着分子、生物個体などと結合能力のある機能性核酸であり、具体的には、トランビンアプタマー、エラスターゼアプタマー、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼアプタマーなどが挙げられる。 Aptamers are functional nucleic acids capable of binding to proteins, enzymes, pigments, amino acids, nucleotides, growth factors, gene expression regulators, cell adhesion molecules, individual organisms, etc., and specifically, aptamers, elastase aptamers And NS3 protease aptamer of hepatitis C virus.
アフィニティータグ捕捉物質としては、分子標識（タグ）に用いる特定の酵素等に特異的に結合しうる低分子等が挙げられ、具体的には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対するグルタチオン、マルトース結合蛋白に対するアミロース、オリゴペプチドタグに対する抗ペプチドモノクロール抗体、ヒチスジンヘキサマータグに対するニッケル錯体・コバルト錯体・マンガン錯体、チオレドキシンタグに対するＰＡＯ（paraaminophenylarsine oxide）、ビオチンリガーゼ（商品名“アビタグ”ＡＶＩＴＡＧ社）に対するストレプトアビジン、カルモデュリン結合性ペフチド融合蛋白質に対するカルモデュリンなどが挙げられる。 Examples of the affinity tag capturing substance include small molecules that can specifically bind to a specific enzyme or the like used for molecular labeling (tag). Specifically, glutathione for glutathione-S-transferase, amylose for maltose-binding protein, and the like. Anti-monoclonal antibody against oligopeptide tag, nickel complex / cobalt complex / manganese complex against histidine hexamer tag, PAO (paraaminophenylarsine oxide) against thioredoxin tag, streptavidin against biotin ligase (trade name “Avitag” AVITAG), And calmodulin for a calmodulin-binding peptide fusion protein.
なお、本発明の有機ポリマー粒子の用途は、上述した創薬分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子に限定されるわけではなく、例えば、生化学分野、塗料、紙、電子写真、化粧品、医薬品、農薬、食品、触媒など広い分野で利用できる。また、これらのプローブあるいはリガンド結合粒子と各種の検体中の特定物質とのアフィニィティーを利用して特定物質の分離／精製、相互作用解析を行うことが出来る。 The use of the organic polymer particles of the present invention is not limited to the compound carrier particles in the drug discovery field and the chemical bond carrier particles for the diagnostic agent described above. For example, biochemical fields, paints, paper, It can be used in a wide range of fields such as electrophotography, cosmetics, pharmaceuticals, agricultural chemicals, foods, and catalysts. Further, separation / purification of specific substances and interaction analysis can be performed by using the affinity between these probes or ligand-binding particles and specific substances in various specimens.
具体的には、粒子担体に結合させたプローブあるいはリガンドを利用しての各種組織、培養細胞、遺伝子組み換え細胞などの検体から特定物質のアフィニティー分離、各種のターゲット蛋白探索、抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ、各種化合物のスクリーニング、化合物／蛋白質の相互作用解析、蛋白質／蛋白質相互作用解析、薬物動態解析、薬物動態パラメーター解析、キナーゼアッセイ、ホスファターゼアッセイ、プロテアーゼアッセイなどに使用することができる。 Specifically, affinity separation of specific substances, various target protein searches, and antigen-antibody reactions were utilized from specimens such as various tissues, cultured cells, and genetically modified cells using probes or ligands bound to particle carriers. It can be used for immunoassay, screening of various compounds, compound / protein interaction analysis, protein / protein interaction analysis, pharmacokinetic analysis, pharmacokinetic parameter analysis, kinase assay, phosphatase assay, protease assay and the like.
４．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、本実施例において、「％」および「部」は重量基準である。
合成例１：（磁性体を含有しない有機ポリマー粒子３の合成）
有機ポリマー粒子１を、シード粒子を用いる二段膨潤重合法で作製した。シード粒子として、ソープフリー重合で重合した粒子径０．９８μｍのポリスチレン粒子を用い、このポリスチレン粒子を水５００ｇに窒素雰囲気下で分散させて水分散体（固形分量５．０ｇ）を調製した。このシード粒子を用いて、二段膨潤重合法を用いて有機ポリマー粒子１を合成した。すなわち、このシード粒子に、一段目として有機溶剤（シェルゾールＴＫ０．１ｇ）、二段目としてメタクリル酸メチル（以下、「ＭＭＡ」という。）５０ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（以下、「ＴＭＰ」という。）１０ｇ、およびグリシジルメタクリレート（以下、「ＧＭＡ」という。）４０ｇ）を加えてそれぞれ吸収させた後、ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）を２ｇ添加して７５℃で２４時間ゆっくり撹拌した。次に、この反応液を冷却した後、５００メッシュ金網でろ過したところ、９９％が通過し、良好な重合安定性であった。重合収率は９９％であった。得られた有機ポリマー粒子１（以下Ａ−１とする）の粒子径は２．６４μｍであり、粒子径の変動係数は２％であった。
4). Examples Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. In this example, “%” and “parts” are based on weight.
Synthesis Example 1: (Synthesis of organic polymer particle 3 containing no magnetic substance)
このＡ−１粒子５．０ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌ（モル／リットル）の硫酸１００ｍｌに分散させ、６０℃で６時間撹拌した。粒子は遠心分離を繰り返すことで蒸留水を用いて洗浄し、凍結乾燥し、有機ポリマー粒子２（以下、Ａ−２とする）を得た。収量は４．５ｇであった。 5.0 g of the A-1 particles were dispersed in 100 ml of 0.1 mol / L (mol / liter) sulfuric acid and stirred at 60 ° C. for 6 hours. The particles were washed with distilled water by repeated centrifugation, and lyophilized to obtain organic polymer particles 2 (hereinafter referred to as A-2). The yield was 4.5g.
次に、このＡ−２粒子１．０ｇを８ｍｌのピリジンに分散させた後、ｐ−トルエンスルホン酸クロライド（和光純薬工業製）０．２ｇを加え２時間室温で撹拌した。反応後、粒子は遠心分離機を用い、アセトンで４回、続いて蒸留水で４回洗浄し、有機ポリマー粒子３（以下、Ａ−３とする）を得た。 Next, after 1.0 g of the A-2 particles were dispersed in 8 ml of pyridine, 0.2 g of p-toluenesulfonic acid chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and stirred at room temperature for 2 hours. After the reaction, the particles were washed four times with acetone and then four times with distilled water using a centrifuge to obtain organic polymer particles 3 (hereinafter referred to as A-3).
得られた有機ポリマー粒子３のｐ−トルエンスルホニル基含量を、エタノールアミンとの反応量から求めた。トシル基含有粒子５ｍｇに０．２ｍｏｌ／Ｌのエタノールアミンを含有するホウ酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．５）溶液５００μｌを加え、３７℃で１６時間撹拌して反応した。反応後、反応によって生じたｐ−トルエンスルホン酸の生成量を反応液の上澄みの吸光度から測定した結果から（ε２６２＝４４０）、この粒子のトシル基量は、０．１５μモル／ｍｇであった。
合成例２：（磁性体を含有する有機ポリマー粒子３の合成）
７５％ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド溶液（日本油脂製「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」２質量部を１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２０質量部に混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒径０．７７μｍのポリスチレン粒子１３質量部と水４１質量部の入ったリアクターに入れ、２５℃で１２時間攪拌した。別の容器でスチレン９６質量部、ジビニルベンゼン４質量部を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液４００質量部に乳化し、前記リアクターに入れ、４０℃で２時間攪拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。これをコア粒子（以下、Ｂ−１とする。）とする（コアの作製）。数平均粒径は１．５μｍであった。
The p-toluenesulfonyl group content of the obtained organic polymer particles 3 was determined from the reaction amount with ethanolamine. To 5 mg of the tosyl group-containing particles, 500 μl of a borate buffer solution (0.1 mol / L, pH 9.5) containing 0.2 mol / L ethanolamine was added, and the mixture was stirred at 37 ° C. for 16 hours to react. After the reaction, the amount of p-toluenesulfonic acid produced by the reaction was measured from the absorbance of the supernatant of the reaction solution (ε 262 = 440), and the amount of tosyl groups of the particles was 0.15 μmol / mg. It was.
Synthesis Example 2: (Synthesis of Organic Polymer Particle 3 Containing Magnetic Material)
2 parts by mass of 75% di (3,5,5-trimethylhexanoyl) peroxide solution (“Perroyl 355-75 (S)” manufactured by NOF Corporation) is mixed with 20 parts by mass of 1% aqueous sodium dodecyl sulfate solution, and ultrasonically dispersed. This was finely emulsified with a machine and placed in a reactor containing 13 parts by weight of polystyrene particles having a particle size of 0.77 μm and 41 parts by weight of water and stirred for 12 hours at 25 ° C. In another container, 96 parts by weight of styrene and divinyl 4 parts by mass of benzene was emulsified in 400 parts by mass of a 0.1% sodium dodecyl sulfate aqueous solution, placed in the reactor, stirred for 2 hours at 40 ° C., then heated to 75 ° C. and polymerized for 8 hours. The particles taken out by centrifugal separation were further washed with water, dried and pulverized, and this was used as core particles (hereinafter referred to as B-1) (production of the core). Was .5μm.
次に、油性磁性流体（商品名：「ＥＸＰシリーズ」，（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０２μｍ）を得た。 Next, acetone is added to an oil-based magnetic fluid (trade name: “EXP series”, manufactured by Ferrotec Co., Ltd.) to precipitate and precipitate particles, which are then dried to have a surface that has been hydrophobized. Ferrite-based magnetic fine particles (average primary particle size: 0.02 μm) were obtained.
次いで、コア粒子（Ｂ−１）１５ｇおよび上記疎水化された磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で５分間処理し、平均数粒子径が２．０μｍの磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する粒子（以下、Ｂ−２とする。）を得た。 Next, 15 g of the core particles (B-1) and 15 g of the above-mentioned hydrophobized magnetic fine particles are mixed well with a mixer, and this mixture is mixed using a hybridization system NHS-0 type (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.). The particles (hereinafter referred to as B-2), which were treated for 5 minutes at a peripheral speed of 100 m / sec (16200 rpm) of the blade (stirring blade) and had a magnetic layer composed of magnetic fine particles having an average number particle diameter of 2.0 μm on the surface. ).
次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５重量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５重量％を含む水溶液３７５ｇを、５００ｍＬセパラブルフラスコに投入し、次いで、前記磁性体層を有する粒子（Ｂ−２）１５ｇを投入し、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱した。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５重量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５重量％を含む水溶液１５０ｇに、ＭＭＡ２７ｇ、ＴＭＰ３ｇ、およびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．６ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした前記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。滴下終了後、６０℃に保持し１時間攪拌した後、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．２５重量％およびノニオン性乳化剤（商品名：「エマルゲン１５０」，花王（株）製）０．２５重量％を含む水溶液７５ｇに、ＭＭＡ７．５ｇ、ＧＭＡ６ｇ、ＴＭＰ１．５ｇ、およびジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド（日本油脂社製；パーロイル３５５）０．３ｇを入れて分散させたプレエマルジョンを、６０℃にコントロールした上記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間３０分かけて滴下した。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。以上により、磁性体を含有する有機ポリマー粒子１の分散液を得た。有機ポリマー粒子１を、磁気を用いて分離し、蒸留水を用いて繰り返し洗浄したあと凍結乾燥してポリマー被覆された磁性粒子（有機ポリマー粒子１。以下、Ｂ−３とする。）を得た。この磁性粒子Ｂ−３の平均数粒子径は２．９μｍであった。
Next, 375 g of an aqueous solution containing 0.25% by weight of sodium dodecylbenzenesulfonate and 0.25% by weight of a nonionic emulsifier (trade name: “Emulgen 150”, manufactured by Kao Corporation) was charged into a 500 mL separable flask. Subsequently, 15 g of particles (B-2) having the magnetic layer were added, dispersed with a homogenizer, and heated to 60 ° C. To 150 g of an aqueous solution containing 0.25% by weight of sodium dodecylbenzenesulfonate and 0.25% by weight of a nonionic emulsifier (trade name: “Emulgen 150”, manufactured by Kao Corporation), 27 g of MMA, 3 g of TMP, and di (3,5 , 5-trimethylhexanoyl) peroxide (manufactured by NOF Corporation; Parroyl 355) was added dropwise to the 500 mL separable flask controlled at 60 ° C. over 1 hour 30 minutes. . After completion of dropping, the mixture was kept at 60 ° C. and stirred for 1 hour, and then 0.25% by weight of sodium dodecylbenzenesulfonate and 0.25% by weight of a nonionic emulsifier (trade name: “Emulgen 150”, manufactured by Kao Corporation) Pre-emulsion in which 0.3 g of MMA 7.5 g, GMA 6 g, TMP 1.5 g, and di (3,5,5-trimethylhexanoyl) peroxide (manufactured by NOF Corporation; Parroyl 355) were added and dispersed in 75 g of the aqueous solution. Was added dropwise to the 500 mL separable flask controlled at 60 ° C. over 1 hour 30 minutes. Thereafter, the temperature was raised to 75 ° C., and then polymerization was continued for another 2 hours to complete the reaction. Thus, a dispersion liquid of
このＢ−３粒子５．０ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌ 硫酸１００ｍｌに分散させ、６０℃で６時間撹拌した。粒子は磁気を用いて分離し、蒸留水で繰り返し洗浄したのち凍結乾燥し、有機ポリマー粒子２（以下、Ｂ−４とする。）を得た。収量は４．８ｇであった。 The B-3 particles (5.0 g) were dispersed in 0.1 mol / L sulfuric acid (100 ml) and stirred at 60 ° C. for 6 hours. The particles were separated using magnetism, washed repeatedly with distilled water, and then lyophilized to obtain organic polymer particles 2 (hereinafter referred to as B-4). The yield was 4.8g.
次に、このＢ−４粒子１．０ｇを８ｍｌのピリジンに分散させた後、ｐ−トシルクロライド０．２ｇを加え２時間室温で撹拌した。反応後、粒子は磁気を用いて分離し、アセトンで４回、続いて蒸留水で４回洗浄し有機ポリマー粒子３（以下、Ｂ−５とする）を得た。 Next, 1.0 g of the B-4 particles was dispersed in 8 ml of pyridine, 0.2 g of p-tosyl chloride was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After the reaction, the particles were separated using magnetism and washed 4 times with acetone and then 4 times with distilled water to obtain organic polymer particles 3 (hereinafter referred to as B-5).
得られたＢ−５粒子のｐ−トルエンスルホニル基含量を、エタノールアミンとの反応から求めた結果、０．１０μｍｏｌ／ｍｇであった。
合成例３：（抗体分子を感作した、磁性体を含有しない有機ポリマー粒子３の合成）
合成例１で得られた有機ポリマー粒子３（Ａ−３）１０ｍｇをホウ酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．５）溶液１．０ｍｌに分散し、腫瘍マーカーであるヒトαフェトプロテイン（以下、「ＡＦＰ」という。）に対する抗体（以下、「抗ＡＦＰ抗体」という。コスモ・バイオ株式会社製）１００μｇを加え１８時間室温で反応した。反応後、粒子を遠心分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、抗ＡＦＰ抗体を感作した有機ポリマー粒子３（以下、Ａ−４とする。）を得た。
合成例４：（抗体分子を感作した、磁性体を含有する有機ポリマー粒子３の合成）
有機ポリマー粒子（Ａ−３）に替えて、合成例２で得られた、磁性体を含有する有機ポリマー粒子３（Ｂ−５）を用いた他は、合成例３と同様に、抗ＡＦＰ抗体を感作した有機ポリマー粒子３（以下、Ｂ−６とする。）を得た。
比較合成例１：（抗体分子を感作した、磁性体を含有しない有機ポリマー粒子１の合成）
合成例１で得られたグリシジル基含有ポリマー粒子（Ａ−１）１０ｍｇを１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム含有ホウ酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．５）溶液１．０ｍｌに分散し、抗ＡＦＰ抗体１００μｇを加え１８時間室温で反応した。反応後、粒子を遠心分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、抗ＡＦＰ抗体を感作した有機ポリマー粒子１（以下、Ｃ−１とする。）を得た。
比較合成例２：（抗体分子を感作した、磁性体を含有する粒子の合成）
カルボキシル基含有磁性粒子として、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（粒子径２．７μｍ；ＤＹＮＡＬ ＢＩＯＴＥＣＨ社）１０ｍｇをテストチューブに取り、１．０ｍｌのＭＥＳ緩衝溶液（５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ５．０）に分散させた。この磁性粒子分散液に、ＥＤＣ塩酸塩（１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩）２ｍｇを加え、２５℃で３０分間転倒混和した。
It was 0.10 micromol / mg as a result of calculating | requiring the p-toluenesulfonyl group content of the obtained B-5 particle | grain from reaction with ethanolamine.
Synthesis Example 3: (Synthesis of organic polymer particle 3 containing no magnetic substance sensitized with antibody molecule)
10 mg of the organic polymer particle 3 (A-3) obtained in Synthesis Example 1 was dispersed in 1.0 ml of a borate buffer (0.1 mol / L, pH 9.5) solution, and human alpha-fetoprotein (hereinafter referred to as a tumor marker) , “AFP”) (hereinafter referred to as “anti-AFP antibody”, Cosmo Bio Co., Ltd.) 100 μg was added and reacted at room temperature for 18 hours. After the reaction, the particles are centrifuged, repeatedly washed with a washing solution (25 mmol / L Tris-HCl, pH 7.4, containing 0.01% Tween 20), and then diluted with a washing solution so that the particle concentration is 0.5%. Organic polymer particles 3 (hereinafter referred to as A-4) sensitized with an anti-AFP antibody were obtained.
Synthesis Example 4: (Synthesis of organic polymer particle 3 containing magnetic substance sensitized with antibody molecule)
An anti-AFP antibody was obtained in the same manner as in Synthesis Example 3 except that the organic polymer particle 3 (B-5) containing a magnetic substance obtained in Synthesis Example 2 was used instead of the organic polymer particle (A-3). Sensitized organic polymer particles 3 (hereinafter referred to as B-6) were obtained.
Comparative Synthesis Example 1: (Synthesis of
10 mg of the glycidyl group-containing polymer particles (A-1) obtained in Synthesis Example 1 are dispersed in 1.0 ml of a 1 mol / L ammonium sulfate-containing borate buffer solution (0.1 mol / L, pH 9.5), and
After repeatedly washing with n20), it was diluted with a washing solution to a particle concentration of 0.5% to obtain
Comparative Synthesis Example 2: (Synthesis of particles containing a magnetic material sensitized with antibody molecules)
As a carboxyl group-containing magnetic particle, 10 mg of Dynabeads M270 Carboxylic Acid (particle size: 2.7 μm; DYNAL BIOTECH) was taken in a test tube and dispersed in 1.0 ml of MES buffer solution (5 mmol / L, pH 5.0). To this magnetic particle dispersion, 2 mg of EDC hydrochloride (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride) was added and mixed by inversion at 25 ° C. for 30 minutes.
この活性化磁性粒子を磁気で回収し、溶媒を１．０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）に置換した。この分散液に、抗ＡＦＰ抗体１００μｇ添加し、２５℃で８時間転倒混和し、抗体感作磁性粒子を得た。得られた抗体感作磁性粒子を洗浄液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、抗ＡＦＰ抗体を感作した有機ポリマー粒子３（以下、Ｄ−１とする。）を得た。 The activated magnetic particles were collected magnetically, and the solvent was replaced with 1.0 ml of HEPES buffer (0.1 mol / L, pH 7.4). To this dispersion, 100 μg of anti-AFP antibody was added and mixed by inverting at 25 ° C. for 8 hours to obtain antibody-sensitized magnetic particles. The obtained antibody-sensitized magnetic particles are repeatedly washed with a washing solution (25 mmol / L, pH 7.4, containing 0.01% Tween 20), and then diluted with the washing solution to a particle concentration of 0.5%, and anti-AFP antibody The organic polymer particles 3 (hereinafter referred to as D-1) were sensitized.
合成例３で得られた、抗体分子を感作した、磁性体を含有しない有機ポリマー粒子３（Ａ−４）を用いて、ＡＦＰ濃度を測定した。得られた各ＡＦＰ濃度の検体の発光量を図１に示した。 The AFP concentration was measured using the organic polymer particles 3 (A-4) obtained in Synthesis Example 3 and sensitized with antibody molecules and containing no magnetic substance. FIG. 1 shows the light emission amount of the obtained specimens having respective AFP concentrations.
ＡＦＰを含まない検体のノイズ強度は５５ＲＩＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｕｎｉｔｓ）であった。ＡＦＰ濃度１０００ｎｇ／ｍＬの時のシグナル強度は４４５９８４（ＲＩＵ）であった。 The noise intensity of the specimen not containing AFP was 55 RIU (Relativistic intensity units). The signal intensity at an AFP concentration of 1000 ng / mL was 445984 (RIU).
有機ポリマー粒子３（Ａ−４）に替えて、合成例４で得られた、抗体分子を感作した、磁性体を含有する有機ポリマー粒子３（Ｂ−６）を用いた他は実施例１と同様にして、ＡＦＰ濃度を測定した。得られた各ＡＦＰ濃度の検体の発光量を図１に示した。 Example 1 except that organic polymer particle 3 (B-6) containing a magnetic substance sensitized with an antibody molecule obtained in Synthesis Example 4 was used instead of organic polymer particle 3 (A-4). In the same manner as above, the AFP concentration was measured. FIG. 1 shows the light emission amount of the obtained specimens having respective AFP concentrations.
ＡＦＰを含まない検体のノイズ強度は６２（ＲＩＵ）であった。ＡＦＰ濃度１０００ｎｇ／ｍＬの時のシグナル強度は３８４２２１（ＲＩＵ）であった。
（比較例１）
有機ポリマー粒子３（Ａ−４）に替えて、比較合成例１で得られた、抗体分子を感作した、磁性体を含有しない有機ポリマー粒子１（Ｃ−１）を用いた他は、実施例１と同様にしてＡＦＰ感度曲線を作成した。結果は図１に示した。
The noise intensity of the specimen not containing AFP was 62 (RIU). The signal intensity at an AFP concentration of 1000 ng / mL was 384221 (RIU).
(Comparative Example 1)
The organic polymer particle 3 (A-4) was replaced with the organic polymer particle 1 (C-1) obtained in Comparative Synthesis Example 1 and sensitized with an antibody molecule and containing no magnetic substance. An AFP sensitivity curve was prepared in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG.
ＡＦＰを含まない検体のノイズ強度は１７０（ＲＩＵ）であった。ＡＦＰ濃度１０００ｎｇ／ｍＬの時のシグナル強度は４２０４５（ＲＩＵ）であった。
（比較例２）
有機ポリマー粒子３（Ａ−４）に替えて、比較合成例２で得られた、抗体分子を感作した、磁性体を含有する粒子（Ｄ−１）を用いた他は、実施例１と同様にしてＡＦＰ感度曲線を作成した。結果は図１に示した。
The noise intensity of the specimen not containing AFP was 170 (RIU). The signal intensity at an AFP concentration of 1000 ng / mL was 42045 (RIU).
(Comparative Example 2)
Example 1 is the same as Example 1 except that instead of the organic polymer particle 3 (A-4), the particle (D-1) containing the magnetic substance sensitized with the antibody molecule obtained in Comparative Synthesis Example 2 was used. Similarly, an AFP sensitivity curve was created. The results are shown in FIG.
ＡＦＰを含まない検体のノイズ強度は５８０（ＲＩＵ）であった。ＡＦＰ濃度１０００ｎｇ／ｍＬの時のシグナル強度は１５７８９８（ＲＩＵ）であった。
評価方法：
［ＡＦＰの感度曲線の作成］
抗ＡＦＰ抗体を感作した各実施例・比較例の有機ポリマー粒子１０μｌ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で段階希釈したＡＦＰ抗原（日本バイオテスト社製）の標準検体５０μｌと混合し、３７℃で１０分間反応した。遠心して粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」という。）で標識した抗ＡＦＰ抗体（富士レビオ株式会社製、ルミパルスＡＦＰ−Ｎに付属の試薬を使用）４０μｌを添加し、３７℃で１０分間反応した。遠心して粒子を分離し上清を除いた後、ＰＢＳで３回遠心洗浄を繰り返し、粒子を５０μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に分散し、新しいチューブに移し替えた。ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応した後、化学発光量を測定した。化学発光の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置、Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７を用いた。
［粒径］
レーザ回折式粒度分布測定装置（（株）島津製作所製）ＳＡＬＤ−２００Ｖにより数平均粒径とその変動係数を測定した。
The noise intensity of the specimen not containing AFP was 580 (RIU). The signal intensity at an AFP concentration of 1000 ng / mL was 157898 (RIU).
Evaluation methods:
[Create AFP sensitivity curve]
Standard of AFP antigen (manufactured by Nippon Biotest Co., Ltd.) 10 μl (corresponding to 50 μg of particles) of organic polymer particles sensitized with anti-AFP antibody in a test tube and serially diluted with fetal calf serum (FCS) The sample was mixed with 50 μl and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. After separating the particles by centrifugation and removing the supernatant, anti-AFP antibody labeled with alkaline phosphatase (hereinafter referred to as “ALP”) as a secondary antibody (manufactured by Fujirebio Inc., Lumipulse AFP-N) is used. Use) 40 μl was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. After the particles were separated by centrifugation and the supernatant was removed, centrifugal washing was repeated 3 times with PBS. The particles were dispersed in 50 μl of 0.01% Tween 20 and transferred to a new tube. After adding 100 μl of ALP substrate solution (Lumipulse substrate solution: manufactured by Fujirebio Inc.) and reacting at 37 ° C. for 10 minutes, the amount of chemiluminescence was measured. For chemiluminescence measurement, a chemiluminescence measuring device, Lumat LB9507 manufactured by Bertol Japan KK was used.
[Particle size]
The number average particle diameter and the coefficient of variation thereof were measured by a laser diffraction particle size distribution analyzer (manufactured by Shimadzu Corporation) SALD-200V.
Claims (4)
（２）有機ポリマー粒子１を硫酸処理して水酸基を有する有機ポリマー粒子２を得る工程、及び
（３）有機ポリマー粒子２とｐ−トルエンスルホン酸塩とを反応させて、ｐ−トルエンスルホニル基を有する有機ポリマー粒子３を合成する工程
とを有することを特徴とする、レーザ回折・散乱法により求めた数平均粒径が０．１〜１５μｍである有機ポリマー粒子３の製造方法。 (1) (A) polystyrene or styrene copolymer as seed particles , and (B ′) a polymerizable monomer having methyl methacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate and glycidyl group added by a two-stage swelling polymerization method A step of synthesizing organic polymer particles 1 comprising a copolymer of a polymerizable compound containing
(2) A step of obtaining organic polymer particles 2 having hydroxyl groups by treating sulfuric acid with organic polymer particles 1, and (3) reacting organic polymer particles 2 with p-toluenesulfonate to form p-toluenesulfonyl groups. And a step of synthesizing the organic polymer particles 3 having a number average particle diameter determined by a laser diffraction / scattering method of 0.1 to 15 μm.
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