JP4991046B2 - アポトーシス誘導剤 - Google Patents
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬の分野で有用であり、より具体的には細胞の新陳代謝等に関係深いアポトーシス誘導剤としての多糖類の利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物体を構成する細胞の死滅は、アポトーシス(apoptosis)とネクローシス(necrosis)の二つに大別される。ネクローシスは、環境の悪化又は細胞の物理的障害により惹起される細胞死であり、一方、アポトーシスは、これと異なり、積極的に制御されている細胞死のことである[ササダ(M.Sasada)：血液フロンティア, 10, 1367-1372(2000)参照]。
【０００３】
近年、このアポトーシスによる細胞死が、生物学、医学等の基礎研究分野、医薬品製造等の工業分野において注目を集めている。その理由は、アポトーシスが胎生期の発達過程における形態器官形成、正常細胞の回転、免疫系の構築と維持、ホルモンに依存した細胞死制御などの生理的現象において、又病理的現象としては放射線や薬物による細胞死、ウイルス感染による細胞死など、さらに種々疾患との深い関連など極めて広範囲かつ重要なことが明らかにされつつあること。各種の抗がん剤がアポトーシスでがん細胞破壊を行うこと、及び最近の遺伝子研究の進展に伴い、アポトーシスそのものがどのような遺伝子で制御されており、アポトーシスに到る情報がどのようにして伝達されるかについての知見が蓄積され、細胞生物学上の基本的興味がもたれたこと、等である[ムラテ(T.Murate)：血液フロンティア、10, 1373-1381(2000)及びユオ(Yuo)：血液フロンティア, 10, 1383-1395(2000)参照]。
【０００４】
以上のような知見は、アポトーシスを誘導することによって、その存在が生体にとって望ましくない細胞、例えば自己免疫疾患患者の自己反応性リンパ球、アレルギー患者のアレルゲンに感作されたリンパ球、がん細胞等を排除することが可能であることを示しており、そのためにアポトーシス誘導剤の果たす役割が期待されている。又外部からの細菌やウイルスのアポトーシスを誘導することにより、細菌からの感染治療を促したり、あるいは、皮膚の表皮細胞のアポトーシスを誘導することにより皮膚の新陳代謝を促進することができると考えられる。従って、アポトーシスを制御する因子や薬剤を開発し、これらの疾患の治療に応用する可能性を探る動きも起こってきている。しかし、その数はまだ少なく、新たな化合物の提供が望まれている。
【０００５】
このうち、多糖類に関係するものとしては、例えばヘパリンがヒトリンパ芽球のアポトーシスを強く誘導すること[エルドラン(E.Erduran)ら：American Journal of Hematology, 61, 90-93(1999)参照]や、海洋微細藻類の生産する硫酸多糖類がヒト白血病培養細胞K562に対しいてアポトーシス誘導作用のあることが知られている[ソガワ(K.Sogawa)ら：Journal of Marine Biotechnology, 6, 241-243(1998)参照]。
【０００６】
電子顕微鏡を用いた形態学的観察によれば、アポトーシスによる細胞死では、染色体の凝集、細胞核の断片化、細胞表面の微絨毛の消失、細胞質の凝縮が観察され、アポトーシスにより死滅した細胞は、速やかにマクロフアージ等に貪食されて処理されることが明らかにされている。また、染色体DNAの断片化等の生化学的特徴を伴うアポトーシスが観察されることが多いことも良く知られている。
【０００７】
一方、構造式(I)で示される硫酸多糖類は、海洋微生物の培養液から分離精製された化合物であり、ある主のウイルスに対して弱い抗ウイルス活性をを示すことが知られている[マツダ(M.Matsuda)ら：日本水産学会誌, 59, 535-538(1993)及びマツダ(M.Matsuda)ら：Marine Biotechnology, 1, 68-73(1999)参照]。しかしながら、その生物活性とくにアポトーシス誘導作用を有することは知られておらず、文献にも記載されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、海洋微生物の培養物から分離精製した多糖類をアポトーシス誘導剤として開発し提供することを目的とす
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、種々の化合物について探索した結果、海洋微生物の生産する多糖類にアポトーシスを誘導する作用を持つことを見出し、本発明を完成した。即ち本発明は、有効成分が構造式(I)で示される化合物又はその塩類を全容積基準で０．１μL以上含むアポトーシス誘導剤を要旨とする。
【化１】
【００１０】
本発明で使用した多糖類は、文献[上記マツダ(M.Matsuda)ら：1993] に記載されている硫酸多糖類と同じもので、場合により薬理及び製薬上容認できるその塩である。
【００１１】
即ち、本発明は上記構造式(I)で表される多糖類又は生理学的に許容されうるその塩のアポトーシス誘導剤としての利用に関するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明で使用する多糖類を生産する能力のある微生物としては、海洋性シユードモナス(Pseudomonas)属の微生物が挙げられ、より具体的にはシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)WAK-1が挙げられる。本株は香川大学農学部生物資源食糧化学科松田研究室に保存されている[マツダ(M.Matsuda)ら：日本水産学会誌, 58, 1735-1741(1992)参照]。
【００１３】
なお、該多糖類の生産株シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)WAK-1に因んで、上記構造式(I)で示される多糖類をを以下WAK-APOと称する。
【００１４】
海洋性シュードモナス(Pseudomonas)属の菌株を栄養源含有培地に接種して発育させることにより、WAK-APOを含む培養物が得られる。培地は前記微生物が資化できる炭素源、窒素源及び生育に必要な各種無機塩等の栄養源を含む液体培地が好ましい。具体的には、例えば、炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース等が挙げられ、単独又は混合物として用いられる。窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、その他の有機物あるいは無機物等が挙げられ、単独又は混合物として用いられる。無機塩としては、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、又は各種リン酸塩等を使用することができる。その他、必要に応じて、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト等の重金属塩を微量添加することもできる。また、海水で調製した培地が好ましいが、人工海水や2〜3重量%の食塩水でも良い。
【００１５】
培養方法としては、一般の微生物の代謝産物生産方法と同様に行えばよく、固体培養でも液体培養でも良いが、液体培養がより好ましい。液体培養の場合は、攪拌培養、振盪培養又は通気培養等のいずれを実施しても良いが、実質的に振盪の条件で培養すれば、培養物中に本発明で使用する硫酸多糖類が選択的に生成蓄積する(特願2000-265079参照)。発泡の激しい場合には、消泡剤として例えば大豆油等の植物油、オクタデカノール等の高次アルコール類、各種シリコン化合物等を適宜添加しても良い。
【００１６】
培養は通常pHは6.0〜8.0、好ましくは6.5〜7.5の範囲で、温度は15〜35℃、好ましくは25〜30℃が適当である。培養時間は本発明で用いる多糖類の生産が最大に達する期間が選ばれるが、通常は48〜144時間、好ましくは72〜96時間である。
【００１７】
このようにして得られた培養物中には、本発明で使用する多糖類が含まれている。該多糖類の採取に当たっては、WAK-APOは菌体外に存在するので、予め培養物中の菌体や他の固形成分を除去した後、通常の分離手段、例えば溶媒沈殿法、イオン交換樹脂法又は吸着若しくは分配クロマトグラフィー法及びゲル濾過法、透析、凍結乾燥法等多糖類を不純物から回収するために通常使用されている手段を単独にあるいは適宜組み合わせることによって分離精製できる。
【００１８】
その一例を示すと、上記固形分を除去して得られた溶液にエタノール等の溶剤を添加して該多糖類を析出せしめる。得られた該多糖類を水に溶解させ、これに第四級アンモニウム塩例えばセチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を加えてセチルトリメチルアンモニウムブロマイドとの複合体として多糖類を沈殿させる。この沈殿物を塩化ナトリウムを含む水に溶解させた後、エタノールによる沈殿を行い、沈殿物を水に溶解させた後、透析、凍結乾燥することにより該多糖類を得ることができる。
【００１９】
このようにして得られた多糖類については、DEAE-セルロースイオン交換カラムクロマトグラフィー、電気泳動法による均一性分析、糖組成分析、硫酸基分析、及び核磁気共鳴分析等により、目的とする多糖類であることが確認できる[上記マツダ(M.Matsuda)ら、(1993)参照]。
【００２０】
得られた多糖類を試験試料としてヒト骨髄性白血病細胞U937を用いてアポトーシス誘導試験を細胞の形態変化と、DNAの断片化分析とにより試験を実施する。
【００２１】
【実施例】
以下に、参考例、試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
参考例 文献[マツダ(M.Matsuda)ら： 1992]の記載に従い、ペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、の組成を有する海水から調製した培地を、121℃にて20分間オートクレーブで滅菌した。シュードモナス・エスピーWAK-1(Pseudomonas sp.WAK-1, 香川大学農学部生物資源食糧化学科松田研究室保存菌株No.WAK-1)の保存用斜面培養から1白金耳を試験管中の上記滅菌培地(10mL)に接種し、28℃にて72時間振盪培養をおこなった。ついで、この前培養液を500mL容の三角フラスコ中の3%ショ糖加上記滅菌培地(200mL)に接種し、28℃にて72時間振盪培養を行った。培養後、培養終了液を遠心分離して菌体を除いた上澄液に2倍量のエタノールを加え、白色沈殿を得た。この沈殿物を採取し、水(200mL)中に溶解し、沈殿が新たに生じなくなるまで5%セチルトリメチルアンモニウムブロマイド水溶液を徐々に加え、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドとの複合体として多糖類を沈殿させた。この複合体を水で洗浄して過剰のセチルトリメチルアンモニウムブロマイドを除いた後、4M塩化ナトリウム水溶液(200ml)中に複合体を溶解した。この溶液に、2倍量のエタノールを加えて多糖類を沈殿させた。得られた沈殿物を水に溶解し、水に対して透析後、凍結乾燥を行い、酸性多糖類(約0.1g)を得た。本多糖類をさらに精製するため、次にこの多糖類(102mg)を0.01Mリン酸塩緩衝液(pH7.0)100mLに溶解し0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡させたDEAE-セルロースカラム(2.3×22.5cm)に充填した。0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)中の0.6M塩化ナトリウムで溶出される画分を除いた後、0.8M塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、透析し、次いで凍結乾燥し多糖類(53mg)を得た。このようにして得られた多糖類については、セルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、糖組成分析、硫酸基含量分析、及び核磁気共鳴分析等により、構造式(I)で示される多糖類であることを確認した[上記マツダ(M.Matsuda)ら：(1993)参照]。
【００２２】
次に、上記で得られたWAK-APOについて本発明の効果を確認するため、以下の試験を行った。アポトーシス誘導作用を検出する際には、細胞壊死であるネクローシスとの違いを明らかにする必要がある。アポトーシスが誘導された細胞は、上述したように、先ず細胞が縮小し、クロマチンが凝縮し、凝縮した核は断片化する。また、細胞表面の微絨毛は消失して平滑化し、自己認識機構を担う細胞表面分子マーカーを徐々に喪失していく。さらに、細胞表面に大小の突起が出現し、やがてアポトーシス小体に断片化する。このアポトーシス小体は、生体内においてはやがてマクロファージのような貪食細胞によって除去される。
【００２３】
そこでこれらの現象に着目して、ヒト骨髄性白血病細胞U937にWAK-APOを添加し、反応終了後、アポトーシスが誘導されたかどうかを検出するため、以下のような複数の方法を用いて実験を行った。
【００２４】
試験例 ヒト培養細胞に対する前記参考例で得たWAK-APOのアポトーシス誘導効果を試験管内で試験した。培養細胞にはヒト単球系白血病細胞U937を用いた。培地は、10%FBSを含むRPMIを用いた。細胞の前培養を行い、対数期に入った細胞を3×105個/mLになるように培地で調整し、24穴培養プレートに1mLずつ分注し、サンプル溶液を10μLずつ最終濃度が、それぞれ10, 1, 0.1, 0.01μg/mLになるように添加し、混和した。培養は、37℃、5%炭酸ガス濃度で行い、 24時間培養した後、各ウエルの細胞について形態変化を顕微鏡写真撮影し観察すると共に、アガロース電気泳動法でDNA断片化分析を行った。
【００２５】
形態変化の観察では、形態変化の全くないものを(-)、多くの細胞に形態変化が認められるものを(+)、細胞が死滅していると思われるものを(++)と判定し、又DNA 断片化分析 では、DNA ladderが見られないものを(-)、DNAの分解が認められるものを(+)とし、DNA ladderがはっきり見られるものを(++)と判定した。試験結果を表1に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
表1に示すように、コントロールにおいては、形態変化、DNAの断片化は見られなかったが、WAK-APOで処理したU937細胞には0.1, 1μｇ/mLの濃度でアポトーシスに特徴的な細胞の形態変化が認められた。又0.1, 1μｇ/mLの濃度で断片化したDNAからなる梯子状の泳動像が見られ、アポトーシスの特徴であるDNAの断片化が観察された。
【００２８】
以上の試験結果が示すように、本参考例で製造したWAK-APOにはアポトーシス誘導作用があることが認められた。
【００２９】
【発明の効果】
本発明に記載する多糖類WAK-APOは、ヒト培養細胞に対してアポトーシス誘導作用を示すことから、細胞サイクルを制御することが可能であり、医薬、例えば悪性腫瘍、自己免疫疾患、炎症等の治療薬としての用途が期待できる。
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬の分野で有用であり、より具体的には細胞の新陳代謝等に関係深いアポトーシス誘導剤としての多糖類の利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物体を構成する細胞の死滅は、アポトーシス(apoptosis)とネクローシス(necrosis)の二つに大別される。ネクローシスは、環境の悪化又は細胞の物理的障害により惹起される細胞死であり、一方、アポトーシスは、これと異なり、積極的に制御されている細胞死のことである[ササダ(M.Sasada)：血液フロンティア, 10, 1367-1372(2000)参照]。
【０００３】
近年、このアポトーシスによる細胞死が、生物学、医学等の基礎研究分野、医薬品製造等の工業分野において注目を集めている。その理由は、アポトーシスが胎生期の発達過程における形態器官形成、正常細胞の回転、免疫系の構築と維持、ホルモンに依存した細胞死制御などの生理的現象において、又病理的現象としては放射線や薬物による細胞死、ウイルス感染による細胞死など、さらに種々疾患との深い関連など極めて広範囲かつ重要なことが明らかにされつつあること。各種の抗がん剤がアポトーシスでがん細胞破壊を行うこと、及び最近の遺伝子研究の進展に伴い、アポトーシスそのものがどのような遺伝子で制御されており、アポトーシスに到る情報がどのようにして伝達されるかについての知見が蓄積され、細胞生物学上の基本的興味がもたれたこと、等である[ムラテ(T.Murate)：血液フロンティア、10, 1373-1381(2000)及びユオ(Yuo)：血液フロンティア, 10, 1383-1395(2000)参照]。
【０００４】
以上のような知見は、アポトーシスを誘導することによって、その存在が生体にとって望ましくない細胞、例えば自己免疫疾患患者の自己反応性リンパ球、アレルギー患者のアレルゲンに感作されたリンパ球、がん細胞等を排除することが可能であることを示しており、そのためにアポトーシス誘導剤の果たす役割が期待されている。又外部からの細菌やウイルスのアポトーシスを誘導することにより、細菌からの感染治療を促したり、あるいは、皮膚の表皮細胞のアポトーシスを誘導することにより皮膚の新陳代謝を促進することができると考えられる。従って、アポトーシスを制御する因子や薬剤を開発し、これらの疾患の治療に応用する可能性を探る動きも起こってきている。しかし、その数はまだ少なく、新たな化合物の提供が望まれている。
【０００５】
このうち、多糖類に関係するものとしては、例えばヘパリンがヒトリンパ芽球のアポトーシスを強く誘導すること[エルドラン(E.Erduran)ら：American Journal of Hematology, 61, 90-93(1999)参照]や、海洋微細藻類の生産する硫酸多糖類がヒト白血病培養細胞K562に対しいてアポトーシス誘導作用のあることが知られている[ソガワ(K.Sogawa)ら：Journal of Marine Biotechnology, 6, 241-243(1998)参照]。
【０００６】
電子顕微鏡を用いた形態学的観察によれば、アポトーシスによる細胞死では、染色体の凝集、細胞核の断片化、細胞表面の微絨毛の消失、細胞質の凝縮が観察され、アポトーシスにより死滅した細胞は、速やかにマクロフアージ等に貪食されて処理されることが明らかにされている。また、染色体DNAの断片化等の生化学的特徴を伴うアポトーシスが観察されることが多いことも良く知られている。
【０００７】
一方、構造式(I)で示される硫酸多糖類は、海洋微生物の培養液から分離精製された化合物であり、ある主のウイルスに対して弱い抗ウイルス活性をを示すことが知られている[マツダ(M.Matsuda)ら：日本水産学会誌, 59, 535-538(1993)及びマツダ(M.Matsuda)ら：Marine Biotechnology, 1, 68-73(1999)参照]。しかしながら、その生物活性とくにアポトーシス誘導作用を有することは知られておらず、文献にも記載されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、海洋微生物の培養物から分離精製した多糖類をアポトーシス誘導剤として開発し提供することを目的とす
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、種々の化合物について探索した結果、海洋微生物の生産する多糖類にアポトーシスを誘導する作用を持つことを見出し、本発明を完成した。即ち本発明は、有効成分が構造式(I)で示される化合物又はその塩類を全容積基準で０．１μL以上含むアポトーシス誘導剤を要旨とする。
【化１】
本発明で使用した多糖類は、文献[上記マツダ(M.Matsuda)ら：1993] に記載されている硫酸多糖類と同じもので、場合により薬理及び製薬上容認できるその塩である。
【００１１】
即ち、本発明は上記構造式(I)で表される多糖類又は生理学的に許容されうるその塩のアポトーシス誘導剤としての利用に関するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明で使用する多糖類を生産する能力のある微生物としては、海洋性シユードモナス(Pseudomonas)属の微生物が挙げられ、より具体的にはシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)WAK-1が挙げられる。本株は香川大学農学部生物資源食糧化学科松田研究室に保存されている[マツダ(M.Matsuda)ら：日本水産学会誌, 58, 1735-1741(1992)参照]。
【００１３】
なお、該多糖類の生産株シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)WAK-1に因んで、上記構造式(I)で示される多糖類をを以下WAK-APOと称する。
【００１４】
海洋性シュードモナス(Pseudomonas)属の菌株を栄養源含有培地に接種して発育させることにより、WAK-APOを含む培養物が得られる。培地は前記微生物が資化できる炭素源、窒素源及び生育に必要な各種無機塩等の栄養源を含む液体培地が好ましい。具体的には、例えば、炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース等が挙げられ、単独又は混合物として用いられる。窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、その他の有機物あるいは無機物等が挙げられ、単独又は混合物として用いられる。無機塩としては、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、又は各種リン酸塩等を使用することができる。その他、必要に応じて、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト等の重金属塩を微量添加することもできる。また、海水で調製した培地が好ましいが、人工海水や2〜3重量%の食塩水でも良い。
【００１５】
培養方法としては、一般の微生物の代謝産物生産方法と同様に行えばよく、固体培養でも液体培養でも良いが、液体培養がより好ましい。液体培養の場合は、攪拌培養、振盪培養又は通気培養等のいずれを実施しても良いが、実質的に振盪の条件で培養すれば、培養物中に本発明で使用する硫酸多糖類が選択的に生成蓄積する(特願2000-265079参照)。発泡の激しい場合には、消泡剤として例えば大豆油等の植物油、オクタデカノール等の高次アルコール類、各種シリコン化合物等を適宜添加しても良い。
【００１６】
培養は通常pHは6.0〜8.0、好ましくは6.5〜7.5の範囲で、温度は15〜35℃、好ましくは25〜30℃が適当である。培養時間は本発明で用いる多糖類の生産が最大に達する期間が選ばれるが、通常は48〜144時間、好ましくは72〜96時間である。
【００１７】
このようにして得られた培養物中には、本発明で使用する多糖類が含まれている。該多糖類の採取に当たっては、WAK-APOは菌体外に存在するので、予め培養物中の菌体や他の固形成分を除去した後、通常の分離手段、例えば溶媒沈殿法、イオン交換樹脂法又は吸着若しくは分配クロマトグラフィー法及びゲル濾過法、透析、凍結乾燥法等多糖類を不純物から回収するために通常使用されている手段を単独にあるいは適宜組み合わせることによって分離精製できる。
【００１８】
その一例を示すと、上記固形分を除去して得られた溶液にエタノール等の溶剤を添加して該多糖類を析出せしめる。得られた該多糖類を水に溶解させ、これに第四級アンモニウム塩例えばセチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を加えてセチルトリメチルアンモニウムブロマイドとの複合体として多糖類を沈殿させる。この沈殿物を塩化ナトリウムを含む水に溶解させた後、エタノールによる沈殿を行い、沈殿物を水に溶解させた後、透析、凍結乾燥することにより該多糖類を得ることができる。
【００１９】
このようにして得られた多糖類については、DEAE-セルロースイオン交換カラムクロマトグラフィー、電気泳動法による均一性分析、糖組成分析、硫酸基分析、及び核磁気共鳴分析等により、目的とする多糖類であることが確認できる[上記マツダ(M.Matsuda)ら、(1993)参照]。
【００２０】
得られた多糖類を試験試料としてヒト骨髄性白血病細胞U937を用いてアポトーシス誘導試験を細胞の形態変化と、DNAの断片化分析とにより試験を実施する。
【００２１】
【実施例】
以下に、参考例、試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
参考例 文献[マツダ(M.Matsuda)ら： 1992]の記載に従い、ペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、の組成を有する海水から調製した培地を、121℃にて20分間オートクレーブで滅菌した。シュードモナス・エスピーWAK-1(Pseudomonas sp.WAK-1, 香川大学農学部生物資源食糧化学科松田研究室保存菌株No.WAK-1)の保存用斜面培養から1白金耳を試験管中の上記滅菌培地(10mL)に接種し、28℃にて72時間振盪培養をおこなった。ついで、この前培養液を500mL容の三角フラスコ中の3%ショ糖加上記滅菌培地(200mL)に接種し、28℃にて72時間振盪培養を行った。培養後、培養終了液を遠心分離して菌体を除いた上澄液に2倍量のエタノールを加え、白色沈殿を得た。この沈殿物を採取し、水(200mL)中に溶解し、沈殿が新たに生じなくなるまで5%セチルトリメチルアンモニウムブロマイド水溶液を徐々に加え、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドとの複合体として多糖類を沈殿させた。この複合体を水で洗浄して過剰のセチルトリメチルアンモニウムブロマイドを除いた後、4M塩化ナトリウム水溶液(200ml)中に複合体を溶解した。この溶液に、2倍量のエタノールを加えて多糖類を沈殿させた。得られた沈殿物を水に溶解し、水に対して透析後、凍結乾燥を行い、酸性多糖類(約0.1g)を得た。本多糖類をさらに精製するため、次にこの多糖類(102mg)を0.01Mリン酸塩緩衝液(pH7.0)100mLに溶解し0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡させたDEAE-セルロースカラム(2.3×22.5cm)に充填した。0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)中の0.6M塩化ナトリウムで溶出される画分を除いた後、0.8M塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、透析し、次いで凍結乾燥し多糖類(53mg)を得た。このようにして得られた多糖類については、セルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、糖組成分析、硫酸基含量分析、及び核磁気共鳴分析等により、構造式(I)で示される多糖類であることを確認した[上記マツダ(M.Matsuda)ら：(1993)参照]。
【００２２】
次に、上記で得られたWAK-APOについて本発明の効果を確認するため、以下の試験を行った。アポトーシス誘導作用を検出する際には、細胞壊死であるネクローシスとの違いを明らかにする必要がある。アポトーシスが誘導された細胞は、上述したように、先ず細胞が縮小し、クロマチンが凝縮し、凝縮した核は断片化する。また、細胞表面の微絨毛は消失して平滑化し、自己認識機構を担う細胞表面分子マーカーを徐々に喪失していく。さらに、細胞表面に大小の突起が出現し、やがてアポトーシス小体に断片化する。このアポトーシス小体は、生体内においてはやがてマクロファージのような貪食細胞によって除去される。
【００２３】
そこでこれらの現象に着目して、ヒト骨髄性白血病細胞U937にWAK-APOを添加し、反応終了後、アポトーシスが誘導されたかどうかを検出するため、以下のような複数の方法を用いて実験を行った。
【００２４】
試験例 ヒト培養細胞に対する前記参考例で得たWAK-APOのアポトーシス誘導効果を試験管内で試験した。培養細胞にはヒト単球系白血病細胞U937を用いた。培地は、10%FBSを含むRPMIを用いた。細胞の前培養を行い、対数期に入った細胞を3×105個/mLになるように培地で調整し、24穴培養プレートに1mLずつ分注し、サンプル溶液を10μLずつ最終濃度が、それぞれ10, 1, 0.1, 0.01μg/mLになるように添加し、混和した。培養は、37℃、5%炭酸ガス濃度で行い、 24時間培養した後、各ウエルの細胞について形態変化を顕微鏡写真撮影し観察すると共に、アガロース電気泳動法でDNA断片化分析を行った。
【００２５】
形態変化の観察では、形態変化の全くないものを(-)、多くの細胞に形態変化が認められるものを(+)、細胞が死滅していると思われるものを(++)と判定し、又DNA 断片化分析 では、DNA ladderが見られないものを(-)、DNAの分解が認められるものを(+)とし、DNA ladderがはっきり見られるものを(++)と判定した。試験結果を表1に示す。
【００２６】
【表１】
表1に示すように、コントロールにおいては、形態変化、DNAの断片化は見られなかったが、WAK-APOで処理したU937細胞には0.1, 1μｇ/mLの濃度でアポトーシスに特徴的な細胞の形態変化が認められた。又0.1, 1μｇ/mLの濃度で断片化したDNAからなる梯子状の泳動像が見られ、アポトーシスの特徴であるDNAの断片化が観察された。
【００２８】
以上の試験結果が示すように、本参考例で製造したWAK-APOにはアポトーシス誘導作用があることが認められた。
【００２９】
【発明の効果】
本発明に記載する多糖類WAK-APOは、ヒト培養細胞に対してアポトーシス誘導作用を示すことから、細胞サイクルを制御することが可能であり、医薬、例えば悪性腫瘍、自己免疫疾患、炎症等の治療薬としての用途が期待できる。
Claims (2)
- 有効成分が構造式(I)で示される化合物又はその塩類を、全容積基準で０．１μｇ／ｍL以上含むことを特徴とするアポトーシス誘導剤。
- 前記構造式(I)で示される化合物又はその塩類を、全容積基準で０．１μｇ／ｍL又は１μｇ／ｍLで含むことを特徴とする請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
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